Download Efectos del solvente y del ambiente

Efectos del solvente y del entorno local
sobre la
fluorescencia
Temario
C6
C7
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Efectos generales del solvente
Efectos específicos del solvente
Efectos de la temperatura
Transferencia interna de carga y reacciones del estado excitado
Efectos de la transición de fases en biomembranas
Viscosidad
Interacciones entre fluoróforos
Cambios en el rendimiento cuántico
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Procesos en el estado excitado
Espectros de emisión resueltos en el tiempo (TRES)
Relajación espectral en proteínas
Relajación espectral en membranas
Relajación en solventes en la escala de los picosegundos
Medidas de relajación multiexponenciales
Distinción de relajación del solvente y la interconversión rotamérica
Espectros de emisión resueltos el tiempo de vida del estado excitado
Corrimientos por excitación en el borde rojo
Transferencia interna de carga y reacciones del estado excitado
[email protected]
El solvente y el entorno pueden afectar el rendimiento cuántico
Nº de fotones
Vida intrínseca o natural
Vida media (“promedio”)
“Mean lifetime” ( = t1/e)
(Constante de tiempo o
tiempo característico)
Media vida (t½)
Half-life
(también es un “promedio”)
t ½ = Ln2
Rendimiento cuántico
t ½ = Ln2/( +knr)
El solvente y el entorno pueden afectar el corrimiento de Stokes
Energía de los fotones
c
Frecuencia
1
Número de onda
Corrimiento de Stokes
Ecuación de Planck
E
h
Energía disipada
E
hc (
hc
A
F
)
Efectos del solvente y del entorno
Muchos fenómenos, oportunidades …e interpretaciones
Cuidadosa inspección de las propiedades moleculares
del fluoróforo y del entorno
Efectos del solvente y del entorno
k
1/
k >> 1/
Corrimientos de Stokes dinámicos
Ecuación de Lippert-Mataga
hc
2 f
(
3
a
E
2
)
const
G
El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio
continuo de constante dieléctrica (permitividad)
uniforme
Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos
Solvatación de iones
Saturación dieléctrica en las cercanías del ión
Polaridad del solvente y del fluoróforo
Momento dipolar eléctrico


qr
Momento dipolar eléctrico molecular
en el estado basal (0 ó G) y excitado
Momento dipolar de la transición
1 D = 3.33564x10-30 Cm
-e


G


01
e
0.2 Ǻ

E
1

0
es importante porque explica acoplamiento: REM, Eint y Ext
Energía
|2>,
|1>,

01
|0>,
Polarizabilidad, polarización y constante dieléctrica
del entorno
Polarizabilidad (tensor )
Polarización

P
N 
V
Constante dieléctrica relativa
(cantidad empírica)

0

E

0E

D
0
(

1) E
La permitividad relativa o constante dieléctrica relativa ( ) mide el alineamiento
de los dipolos del solvente y la producción de dipolos inducidos por un campo
eléctrico (polarizabilidad del solvente).
Ecuación de Lippert-Mataga
2 f
(
3
a
hc
Se aplica a corrimientos de Stokes estáticos
Se basa en la teoría de campos reactivos de Onsager
2
)
const
G
E
JACS, 1936, 58, p 1486.
Campo eléctrico reactivo
La energía de un dipolo (U ó E)
Es el campo eléctrico que
experimenta el fluoróforo
que es fruto de la polarización
de las moléculas del entorno
por el dipolo del fluoróforo
(es paralelo y se orienta en sentido opuesto)
Depende de , de E y del cos del ángulo theta
¿En el vacío?
Edipolo
 
0
0
A
Ecuación de Lippert-Mataga
Se basa el el principio de Franck-Condon
hc
2 f
(
3
a
E
G
) 2 const
Polarizabilidad de
baja frecuencia
Polarizabilidad de
alta frecuencia
Espectroscopía de dieléctricos
Polarizabilidad orientacional ( f)
Ecuación de Lippert-Mataga
hc
2 f
(
3
a
E
G
) 2 const
Algunos usos
Corrimiento de Stokes
Gráfico de Lippert
En vesículas de DPPC
Determinar la polaridad de un sitio de unión a
una sonda por comparación de la fluorescencia
de la sonda unida con su fluorescencia en
solventes de polaridad conocida.
Determinar constantes de unión de un ligando si
este es fluorescente y su fluorescencia cambia
con la unión o si la fluorescencia intrínseca
cambia por efecto de la unión de un ligando
Efectos específicos del solvente
P de H
T, viscosidad
Transferencia interna de carga
Prodan
Viscosidad
Entorno proteico
Entorno proteico
Art. S61