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NUEVOS GENES IDENTIFICADOS EN EL MERCOSUR PARA EL MEJORAMIENTO DE LA
RESISTENCIA DE LA SOJA A LA ROYA ASIÁTICA.
Expositores: Javier Gilli (INTA Marcos Juárez, Córdoba), Mariano Bulos (NIDERA) y Mayra
Carbalho (EMBRAPA SOJA, Brasil). Otras instituciones participantes: INTA Cerro Azul,
Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC), INTA Castelar,
Universidad Nacional de Buenos Aires (UBA), Instituto Paraguayo de Tecnología Agraria
(IPTA) de Paraguay, Universidad Federal de Rio Grande do Sul (UFRGS) de Brasil, y de
Uruguay: Universidad de la República (UdelaR), Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias
(INIA) e Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IBCE).
Antecedentes
La roya asiática de la soja es causada por el hongo Phakopsora pachyrhizi. Esta
enfermedad fue reportada por primera vez en Japón en 1902 y posteriormente fue detectada
en varios países asiáticos (Bromfield & Hartwig, 1980), causando pérdidas de rendimiento de
hasta un 80% (Poonpolgul, 1997). En Suramérica fue encontrada en Paraguay en 2001, en
Brasil y Argentina en 2002 y en Bolivia en 2003 (Rossi, 2003; Yorinori et al., 2005).
Originalmente se describieron cuatro genes de resistencia dominantes (Rpp1, 2, 3 y 4), en
los genotipos de soja PI200492, PI230970, PI462312 y PI459025, respectivamente (McLean
& Bryth, 1980; Hartwig & Bronfield, 1983; Hartwig, 1986).
Recientemente se han localizado en el mapa de soja cinco regiones asociadas con la
resistencia a la roya. Hyten et al. (2007) y Ray et al., (2009) mapearon el gen Rpp1 dentro del
grupo de ligamiento (GL) G; Yamanaka et al., (2008) y Garcia et al., (2008) localizaron el gen
Rpp2 en el GL J; Hyten et al., (2009) y Monteros et al. (2007) mapearon Rpp3 en el GL C2, y
Garcia et al. (2008) mapeó Rpp5 en el GL N.
El objetivo de este trabajo fue identificar nuevos genes y / o tecnologías derivadas del
análisis funcional de los mismos, que permitan mejorar el comportamiento de la soja frente al
estrés provocado por la roya asiática, utilizando herramientas de mapeo genómico, genotecas
de expresión diferencial, análisis de perfiles metabólicos, secuenciación masiva de genes en
lesiones aisladas por captura láser y caracterización molecular de aislados del patógeno.
1. Genómica funcional: interacción del transcriptoma soja / Phakopsora pachyrhizi.
Se realizaron en Embrapa Soja, Londrina, Brasil, inoculaciones con esporas de un aislado
del Mato Grosso (Brasil) sobre genotipos de soja con distintos niveles de resistencia /
susceptibilidad a la roya. Se tomaron muestras a diferentes tiempos de inoculación y se
procesaron con diferentes aproximaciones que se detallan a continuación:
1.1. Captura Láser y secuenciación masiva de transcriptos en EMBRAPA Soja, Londrina
(Brasil): para la microdisección se utilizaron los equipos PixCell II LCM system y CapSure
Macro LCM (Arcturus). Las células parenquimáticas se aislaron de los sitios de la lesión y se
purificó el RNA con el Kit PicoPure RNA isolation (Arcturus). Este RNA purificado se utilizó en
reacciones de amplificación conforme al kit RiboAmp HS Plus (Arcturus). Cerca 18µg de
aRNA de cada muestra se secuenciaron con la plataforma Illumina Genome Analyzer GAAIIx,
utilizando la estrategia de “paired-ends”. Se generaron aproximadamente 15 millones de
“reads” por genotipo. Los “reads” se alinearon contra el genoma de la soja en
http://www.phytozome.net/soybean. Las secuencias que no alinearon con el genoma de soja
pasaron por un montaje de novo usando los programas EDENA (Hernandez et al, 2008) y
CAP3 (Huang and Madan, 1999). Esos contigs se anotaron con el programa BLAST contra 4
bancos de datos: (i) proteínas de hongos biotróficos obligados: Melampsora laricipopulina y
Puccinia
graminis
f.
sp.
tritici
en
http://jgi.doe.gov/Melampsora
y
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http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/puccinia_group, respectivamente; (ii) banco
de proteínas del NCBI (NR); (iii) banco de nucleotídeos del NCBI (NT) y (iv) secuencias de
clones BAC de Phakopsora pachyrizi del NCBI. Las secuencias que no presentaron similitud
con las proteínas de otros hongos o microorganismos y tuvieron similitud solamente con
secuencias de plantas en NR (ii) o NT (iii) fueron descartadas. Se encontraron 18.034
posibles genes de Phakopsora pachyrizi. Estos 18.034 contigs fueron buscados entre las
proteínas secretadas de Puccinia spp. y Melampsora spp. en el banco de datos “Fungal
Secretome Database” http://fsd.snu.ac.kr (Choi et al, 2010), para la identificación de genes
candidatos a efectores del patógeno. El gran número de transcritos detectados sugiere
fuertemente que la captura de células específicamente localizadas en los sitios de lesiones
fue representativa del transcriptoma del hongo ya que se estima una variación de 6.500 a
18.000 genes que codifican para proteínas en hongos biotróficos obligados (Kämper et al.,
2006; Duplessis et al., 2011). Otro resultado que apoya esta idea es el alto porcentaje de
contigs (12.446 o 69%) alineados con las secuencias genómicas de P. phachyrhizi (Tabla 1).
Tabla 1. Resumen de los resultados de las diferentes estrategias de Blast utilizadas en la
anotación de los 18034 contigs identificados como expresados por P. phachyrhizi en los
sitios de infección.
Estrategias para anotación
Contigs con Hit (evaule ≤ 10-5) Contigs sin Hit
Blast(x) contra NR ncbi
4095 (22,7%)
13939
Blast(n) contra NT ncbi
4053 (22,5%)
13981
Blast(n) contra Genoma Phakopsora
12446 (69,0%)
5588
tBlast(x) contra Melampsora e Puccinia
4627 (25,7%)
13407
1.2. La técnica de cDNA-AFLP (EEAOC, Argentina): se colectaron muestras en distintos
momentos de los tratamientos inoculados y testigos, indicados arriba. Se realizó la extracción
del RNA total y posteriormente, en la EEAOC, se hizo la limpieza del RNA y se sintetizó
cDNA. Actualmente, se están analizando los perfiles diferenciales con AFLP.
1.3. Expresión diferencial de genes en respuesta a Phakopsora pachyrhizi (Instituto de
Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Facultad de Ciencias, Uruguay): se obtuvo
una biblioteca de expresión diferencial utilizando los genotipos resistentes y susceptibles a P.
pachyrhizi. También aprovechando el experimento descrito en 1.1, se construyeron
bibliotecas de expresión diferencial mediante la técnica “Suppressive Subtractive
Hybridization” (SSH). A partir de las SSH se obtuvieron 1.500 clones de cDNAs de soja, los
cuales fueron secuenciados. Se realizó la distribución de los genes identificados según su
función putativa. Para confirmar la expresión diferencial se realizaron Northern-blot reversos.
Se seleccionaron aquellos genes relacionados con respuestas de defensa y cuya expresión
aumentaba en las plantas inoculadas con respecto al control sin inocular. El objetivo final fue
detectar genes que se inducen en plantas resistentes en respuesta a la infección con P.
pachyrhizi.
1.4. Análisis de perfiles metabólicos (INTA Castelar): se ajustaron los protocolos para la
identificar y cuantificar metabolitos primarios y secundarios por GC-MS, en la respuesta de
genotipos resistentes y susceptibles a P. pachyrhizi. Se detectaron 199 metabolitos en el
sistema soja / P. pachyrhizi, de los cuales 98 fueron identificados por comparación con bases
de datos de metabolitos y por comparación individual de espectros para cada uno de ellos. Se
obtuvieron perfiles diferenciales entre los genotipos resistentes y susceptibles para
metabolitos como el shikimato, glutamato, salicílico, azucares relacionados a la disponibilidad
de fuentes carbonadas como sacarosa y glucosa, y aminoácidos que reflejan regulación
diferencial de fuentes de nitrógeno. La identificación de patrones de metabolitos diferenciales
entre genotipos contribuirá a la selección de genes candidatos robustos, a través de la
integración de perfiles metabólicos y perfiles transcripcionales, así como a una mayor
comprensión de las vías metabólicas involucradas en la respuesta al patógeno, lo que puede
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permitir la generación de herramientas alternativas para la obtención de genotipos resistentes,
a través de estrategias de ingeniería metabólica.
1.5. Análisis bioinformático de secuencias que se expresan en Phakopsora pachyrhizi
(INDEAR): se analizaron las bibliotecas públicas de secuencias que se expresan (ESTs) en
Phakopsora Pachyrhizi disponibles en la base de datos dbEST (NCBI-GenBank Octubre
2007). A partir de las 5.543 secuencias disponibles se buscaron secuencias homólogas en la
base de datos GenBank (NCBI non-redundant DB) usando el programa BLAST. Se hallaron
3.066 secuencias con homologías a otras secuencias previamente reportadas, las cuales
fueron anotadas funcionalmente, mientras que no se obtuvo homología para otras 2.477
secuencias. Las secuencias homólogas encontradas, que en su mayoría correspondían a
secuencias de otros hongos, se analizaron con los parámetros de filtrado correspondientes y
se logró finalmente la anotación de un 44% de las secuencias totales disponibles en la base
de datos.
2. Mapeo de un nuevo gen de resistencia a la resistencia a la roya asiática en soja (INTA
Marcos Juárez, Nidera, EEAOC, INTA Cerro Azul, INIA Uruguay, CRIA Paraguay).
El objetivo de este trabajo fue localizar en el mapa genético de soja un nuevo gen de
resistencia a la roya asiática. Con ese propósito, se generaron poblaciones F2 y F2:3 a partir
del cruzamiento entre un PI como fuete de resistencia y un genotipo susceptible a la
enfermedad pero con características agronómicas deseables. Para la evaluación con el
patógeno se realizaron ensayos en la EEA del INTA Cerro Azul, Misiones, Argentina y en el
CRIA, Itapúa, Paraguay. Para ambos ensayos se siguió el mismo protocolo de evaluación y
se registró la severidad, el porcentaje de superficie foliar afectada, tipo de lesión (susceptible
o TAN y resistente o RB) y esporulación (utilizando una escala donde 0 es ausencia y 3
máxima esporulación). Para el análisis molecular se utilizaron 28 microsatélites (SSRs) y un
SNP (“Single-Nucleotide Polymorphism”) correspondiente a cuatro regiones del mapa de soja
con antecedentes de contener genes de resistencia a la roya asiática.
El análisis de ligamiento de los marcadores evaluados permitió identificar cuatro GL (C2, J,
N y G) acorde a lo esperado. Los análisis de mapeo genético de la resistencia se realizaron
para las dos localidades evaluadas, obteniéndose dos mapas (GL G, A y B). En ambos casos
el carácter de resistencia fue localizado en la misma región del GL G. En esta región del mapa
fue localizado previamente el gen Rpp1, lo cual podría estar indicando que la resistencia
encontrada puede ser debida a este gen, a una variante alélica del mismo o a uno distinto
pero muy cercano en el mapa de ligamiento.
3. Caracterización de germoplasma de soja con resistencia a la roya asiática en
Paraguay (CRIA Paraguay).
Durante los últimos tres años y como parte de un trabajo que permitió elegir fuentes de
resistencia a la enfermedad de la roya asiática de la soja, en el CRIA de Capitán Miranda
(Paraguay) se llevó a cabo una intensa labor de fenotipado o evaluación tanto de cultivares
como de introducciones (PI). Estos experimentos fueron realizados en condiciones de
invernáculo con inoculación artificial y de campo bajo infección natural.
4. Polimorfismo a nivel molecular de aislamientos suramericanos de Phakopsora
pachyrhizi mediante el uso de la técnica de AFLPs (EEOC).
Se conoce el impacto negativo causado por P. pachyrhizi en la producción mundial de soja,
pero hay mucha discrepancia acerca de la diversidad genética de este patógeno. En un
trabajo realizado con marcadores SSRs (Twizeyimana et al., 2011) fue posible observar una
elevada diversidad molecular dentro de las zonas geográficas pero no entre las zonas donde
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se realizaron las recolecciones. Otro trabajo realizado con regiones ITS también mostraba un
nivel bajo de variabilidad entre aislamientos (Freire et al., 2008). En este proyecto se buscó
estimar la diversidad patogénica a través de aislamientos realizados por el Consorcio en el
Mercosur. Se colectaron hojas infectadas a partir de cultivares locales infectados
naturalmente en Brasil, Argentina, Paraguay y Uruguay durante la campaña 2008/2009. Se
obtuvieron un total de 23 aislamientos en forma directa a partir de las muestras de campo. Los
obtenidos mediante AFLPs, permitieron discriminar dentro y entre zonas de muestreo:
Paraguay y Brasil presentaron la mayor diversidad del patógeno respecto de Uruguay y
Argentina, lo que coincide con las zonas del Mercosur que son más favorables para el
desarrollo de la enfermedad.
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