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NUEVOS GENES IDENTIFICADOS EN EL MERCOSUR PARA EL MEJORAMIENTO DE LA RESISTENCIA DE LA SOJA A LA ROYA ASIÁTICA. Expositores: Javier Gilli (INTA Marcos Juárez, Córdoba), Mariano Bulos (NIDERA) y Mayra Carbalho (EMBRAPA SOJA, Brasil). Otras instituciones participantes: INTA Cerro Azul, Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC), INTA Castelar, Universidad Nacional de Buenos Aires (UBA), Instituto Paraguayo de Tecnología Agraria (IPTA) de Paraguay, Universidad Federal de Rio Grande do Sul (UFRGS) de Brasil, y de Uruguay: Universidad de la República (UdelaR), Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA) e Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IBCE). Antecedentes La roya asiática de la soja es causada por el hongo Phakopsora pachyrhizi. Esta enfermedad fue reportada por primera vez en Japón en 1902 y posteriormente fue detectada en varios países asiáticos (Bromfield & Hartwig, 1980), causando pérdidas de rendimiento de hasta un 80% (Poonpolgul, 1997). En Suramérica fue encontrada en Paraguay en 2001, en Brasil y Argentina en 2002 y en Bolivia en 2003 (Rossi, 2003; Yorinori et al., 2005). Originalmente se describieron cuatro genes de resistencia dominantes (Rpp1, 2, 3 y 4), en los genotipos de soja PI200492, PI230970, PI462312 y PI459025, respectivamente (McLean & Bryth, 1980; Hartwig & Bronfield, 1983; Hartwig, 1986). Recientemente se han localizado en el mapa de soja cinco regiones asociadas con la resistencia a la roya. Hyten et al. (2007) y Ray et al., (2009) mapearon el gen Rpp1 dentro del grupo de ligamiento (GL) G; Yamanaka et al., (2008) y Garcia et al., (2008) localizaron el gen Rpp2 en el GL J; Hyten et al., (2009) y Monteros et al. (2007) mapearon Rpp3 en el GL C2, y Garcia et al. (2008) mapeó Rpp5 en el GL N. El objetivo de este trabajo fue identificar nuevos genes y / o tecnologías derivadas del análisis funcional de los mismos, que permitan mejorar el comportamiento de la soja frente al estrés provocado por la roya asiática, utilizando herramientas de mapeo genómico, genotecas de expresión diferencial, análisis de perfiles metabólicos, secuenciación masiva de genes en lesiones aisladas por captura láser y caracterización molecular de aislados del patógeno. 1. Genómica funcional: interacción del transcriptoma soja / Phakopsora pachyrhizi. Se realizaron en Embrapa Soja, Londrina, Brasil, inoculaciones con esporas de un aislado del Mato Grosso (Brasil) sobre genotipos de soja con distintos niveles de resistencia / susceptibilidad a la roya. Se tomaron muestras a diferentes tiempos de inoculación y se procesaron con diferentes aproximaciones que se detallan a continuación: 1.1. Captura Láser y secuenciación masiva de transcriptos en EMBRAPA Soja, Londrina (Brasil): para la microdisección se utilizaron los equipos PixCell II LCM system y CapSure Macro LCM (Arcturus). Las células parenquimáticas se aislaron de los sitios de la lesión y se purificó el RNA con el Kit PicoPure RNA isolation (Arcturus). Este RNA purificado se utilizó en reacciones de amplificación conforme al kit RiboAmp HS Plus (Arcturus). Cerca 18µg de aRNA de cada muestra se secuenciaron con la plataforma Illumina Genome Analyzer GAAIIx, utilizando la estrategia de “paired-ends”. Se generaron aproximadamente 15 millones de “reads” por genotipo. Los “reads” se alinearon contra el genoma de la soja en http://www.phytozome.net/soybean. Las secuencias que no alinearon con el genoma de soja pasaron por un montaje de novo usando los programas EDENA (Hernandez et al, 2008) y CAP3 (Huang and Madan, 1999). Esos contigs se anotaron con el programa BLAST contra 4 bancos de datos: (i) proteínas de hongos biotróficos obligados: Melampsora laricipopulina y Puccinia graminis f. sp. tritici en http://jgi.doe.gov/Melampsora y -1Workshops http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/puccinia_group, respectivamente; (ii) banco de proteínas del NCBI (NR); (iii) banco de nucleotídeos del NCBI (NT) y (iv) secuencias de clones BAC de Phakopsora pachyrizi del NCBI. Las secuencias que no presentaron similitud con las proteínas de otros hongos o microorganismos y tuvieron similitud solamente con secuencias de plantas en NR (ii) o NT (iii) fueron descartadas. Se encontraron 18.034 posibles genes de Phakopsora pachyrizi. Estos 18.034 contigs fueron buscados entre las proteínas secretadas de Puccinia spp. y Melampsora spp. en el banco de datos “Fungal Secretome Database” http://fsd.snu.ac.kr (Choi et al, 2010), para la identificación de genes candidatos a efectores del patógeno. El gran número de transcritos detectados sugiere fuertemente que la captura de células específicamente localizadas en los sitios de lesiones fue representativa del transcriptoma del hongo ya que se estima una variación de 6.500 a 18.000 genes que codifican para proteínas en hongos biotróficos obligados (Kämper et al., 2006; Duplessis et al., 2011). Otro resultado que apoya esta idea es el alto porcentaje de contigs (12.446 o 69%) alineados con las secuencias genómicas de P. phachyrhizi (Tabla 1). Tabla 1. Resumen de los resultados de las diferentes estrategias de Blast utilizadas en la anotación de los 18034 contigs identificados como expresados por P. phachyrhizi en los sitios de infección. Estrategias para anotación Contigs con Hit (evaule ≤ 10-5) Contigs sin Hit Blast(x) contra NR ncbi 4095 (22,7%) 13939 Blast(n) contra NT ncbi 4053 (22,5%) 13981 Blast(n) contra Genoma Phakopsora 12446 (69,0%) 5588 tBlast(x) contra Melampsora e Puccinia 4627 (25,7%) 13407 1.2. La técnica de cDNA-AFLP (EEAOC, Argentina): se colectaron muestras en distintos momentos de los tratamientos inoculados y testigos, indicados arriba. Se realizó la extracción del RNA total y posteriormente, en la EEAOC, se hizo la limpieza del RNA y se sintetizó cDNA. Actualmente, se están analizando los perfiles diferenciales con AFLP. 1.3. Expresión diferencial de genes en respuesta a Phakopsora pachyrhizi (Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Facultad de Ciencias, Uruguay): se obtuvo una biblioteca de expresión diferencial utilizando los genotipos resistentes y susceptibles a P. pachyrhizi. También aprovechando el experimento descrito en 1.1, se construyeron bibliotecas de expresión diferencial mediante la técnica “Suppressive Subtractive Hybridization” (SSH). A partir de las SSH se obtuvieron 1.500 clones de cDNAs de soja, los cuales fueron secuenciados. Se realizó la distribución de los genes identificados según su función putativa. Para confirmar la expresión diferencial se realizaron Northern-blot reversos. Se seleccionaron aquellos genes relacionados con respuestas de defensa y cuya expresión aumentaba en las plantas inoculadas con respecto al control sin inocular. El objetivo final fue detectar genes que se inducen en plantas resistentes en respuesta a la infección con P. pachyrhizi. 1.4. Análisis de perfiles metabólicos (INTA Castelar): se ajustaron los protocolos para la identificar y cuantificar metabolitos primarios y secundarios por GC-MS, en la respuesta de genotipos resistentes y susceptibles a P. pachyrhizi. Se detectaron 199 metabolitos en el sistema soja / P. pachyrhizi, de los cuales 98 fueron identificados por comparación con bases de datos de metabolitos y por comparación individual de espectros para cada uno de ellos. Se obtuvieron perfiles diferenciales entre los genotipos resistentes y susceptibles para metabolitos como el shikimato, glutamato, salicílico, azucares relacionados a la disponibilidad de fuentes carbonadas como sacarosa y glucosa, y aminoácidos que reflejan regulación diferencial de fuentes de nitrógeno. La identificación de patrones de metabolitos diferenciales entre genotipos contribuirá a la selección de genes candidatos robustos, a través de la integración de perfiles metabólicos y perfiles transcripcionales, así como a una mayor comprensión de las vías metabólicas involucradas en la respuesta al patógeno, lo que puede -2Workshops permitir la generación de herramientas alternativas para la obtención de genotipos resistentes, a través de estrategias de ingeniería metabólica. 1.5. Análisis bioinformático de secuencias que se expresan en Phakopsora pachyrhizi (INDEAR): se analizaron las bibliotecas públicas de secuencias que se expresan (ESTs) en Phakopsora Pachyrhizi disponibles en la base de datos dbEST (NCBI-GenBank Octubre 2007). A partir de las 5.543 secuencias disponibles se buscaron secuencias homólogas en la base de datos GenBank (NCBI non-redundant DB) usando el programa BLAST. Se hallaron 3.066 secuencias con homologías a otras secuencias previamente reportadas, las cuales fueron anotadas funcionalmente, mientras que no se obtuvo homología para otras 2.477 secuencias. Las secuencias homólogas encontradas, que en su mayoría correspondían a secuencias de otros hongos, se analizaron con los parámetros de filtrado correspondientes y se logró finalmente la anotación de un 44% de las secuencias totales disponibles en la base de datos. 2. Mapeo de un nuevo gen de resistencia a la resistencia a la roya asiática en soja (INTA Marcos Juárez, Nidera, EEAOC, INTA Cerro Azul, INIA Uruguay, CRIA Paraguay). El objetivo de este trabajo fue localizar en el mapa genético de soja un nuevo gen de resistencia a la roya asiática. Con ese propósito, se generaron poblaciones F2 y F2:3 a partir del cruzamiento entre un PI como fuete de resistencia y un genotipo susceptible a la enfermedad pero con características agronómicas deseables. Para la evaluación con el patógeno se realizaron ensayos en la EEA del INTA Cerro Azul, Misiones, Argentina y en el CRIA, Itapúa, Paraguay. Para ambos ensayos se siguió el mismo protocolo de evaluación y se registró la severidad, el porcentaje de superficie foliar afectada, tipo de lesión (susceptible o TAN y resistente o RB) y esporulación (utilizando una escala donde 0 es ausencia y 3 máxima esporulación). Para el análisis molecular se utilizaron 28 microsatélites (SSRs) y un SNP (“Single-Nucleotide Polymorphism”) correspondiente a cuatro regiones del mapa de soja con antecedentes de contener genes de resistencia a la roya asiática. El análisis de ligamiento de los marcadores evaluados permitió identificar cuatro GL (C2, J, N y G) acorde a lo esperado. Los análisis de mapeo genético de la resistencia se realizaron para las dos localidades evaluadas, obteniéndose dos mapas (GL G, A y B). En ambos casos el carácter de resistencia fue localizado en la misma región del GL G. En esta región del mapa fue localizado previamente el gen Rpp1, lo cual podría estar indicando que la resistencia encontrada puede ser debida a este gen, a una variante alélica del mismo o a uno distinto pero muy cercano en el mapa de ligamiento. 3. Caracterización de germoplasma de soja con resistencia a la roya asiática en Paraguay (CRIA Paraguay). Durante los últimos tres años y como parte de un trabajo que permitió elegir fuentes de resistencia a la enfermedad de la roya asiática de la soja, en el CRIA de Capitán Miranda (Paraguay) se llevó a cabo una intensa labor de fenotipado o evaluación tanto de cultivares como de introducciones (PI). Estos experimentos fueron realizados en condiciones de invernáculo con inoculación artificial y de campo bajo infección natural. 4. Polimorfismo a nivel molecular de aislamientos suramericanos de Phakopsora pachyrhizi mediante el uso de la técnica de AFLPs (EEOC). Se conoce el impacto negativo causado por P. pachyrhizi en la producción mundial de soja, pero hay mucha discrepancia acerca de la diversidad genética de este patógeno. En un trabajo realizado con marcadores SSRs (Twizeyimana et al., 2011) fue posible observar una elevada diversidad molecular dentro de las zonas geográficas pero no entre las zonas donde -3Workshops se realizaron las recolecciones. Otro trabajo realizado con regiones ITS también mostraba un nivel bajo de variabilidad entre aislamientos (Freire et al., 2008). En este proyecto se buscó estimar la diversidad patogénica a través de aislamientos realizados por el Consorcio en el Mercosur. Se colectaron hojas infectadas a partir de cultivares locales infectados naturalmente en Brasil, Argentina, Paraguay y Uruguay durante la campaña 2008/2009. Se obtuvieron un total de 23 aislamientos en forma directa a partir de las muestras de campo. Los obtenidos mediante AFLPs, permitieron discriminar dentro y entre zonas de muestreo: Paraguay y Brasil presentaron la mayor diversidad del patógeno respecto de Uruguay y Argentina, lo que coincide con las zonas del Mercosur que son más favorables para el desarrollo de la enfermedad. Bibliografía BERNARD, R.L., NELSON, R.L. & CREMEENS, C.R. 1991. USDA Soybean Genetics Collection: Isoline Collection. Soybean Genetics News. 18: 27-57. BONDE, M.R.; NESTER, S.E.; AUSTIN, C.N.; STONE, C.L.; FREDERICK, R.D.; HARTMAN, G.L. & MILES, M.R. 2006. Evaluation of virulence of Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae isolates. Plant Dis. 90:708-716. BROMFIELD, K.R. & HARTWIG, E.E. 1980. Resistance to soybean rust and mode of inheritance. Crop. Sci. 20:254255. GARCÍA A.; SANCHES CALVO E., AFONSO DE SOUZA Kiihl R.; HARADA A.; MINORU HIROMOTO D.; GONZAGA ESTEVES VIEIRA L. (2008). Molecular mapping of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) resistance genes: discovery of a novel locus and alleles. Springer – Verlag 117: 545.553. HARTWIG, E.E. 1986. Identification of a fourth major gene conferring resistance to soybean rust. Crop Sci. 26:11351136. HARTWIG, E.E. & BROMFIELD, K.R. 1983. Relationships among three genes conferring specific resistance to rust in soybeans. Crop Sci. 23, 237–239. HYTEN D. L.; SMITH J. R.; FREDERICK R. D.; TUCKER M. L.; SONG Q., and CREGAN P. B. (2009). Bulked Segregant Analysis Using the GoldenGate Assay to Locate the Rpp3 Locus that Confers Resistance to Soybean Rust in Soybean. Crop Sci. 49: 265.271. HYTEN D.L.; HARTMAN G.L.; NELSON R.L.; FREDERICK R.D.; CONCIBIDO V.C.; NARVEL J.M.; CREGAN P.B. (2007). Map Location of the Rpp 1 Locus that confers resistance to Soybean Rust in Soybean. Crop Science 47: 837.840. MCLEAN, R.J. & BYTH, D.E. 1980. Inheritance of resistance to rust (Phakopsora pachyrhizi) in soybeans. Australian Journal Agriculture Research 31:951-956. MONTEROS M.J.; MISSAUOI A.M.; PHILLIPS D.V.; WALKER D.R.; BOERMA H.R. (2007). Mapping and confirmation of the ‘Hyuuga’ Red – Brown Lesion Resistance Gene for Resistance Asian Soybean Rust. Crop Science 47: 829.834. POONPOLGUL, S. 1997. Physiological races of soybean rust fungus, Phakopsora pachyrhizi and inheritance of resistance in soybean. Ph. D. Thesis, Kasetsart University, Bangkok, Thailand. RAY J. D.; MOREL W.; SMITH J. R.; FREDERICK R. D.; MILES M. R. (2009). Genetics and mapping of adult plant rust resistance in soybean PI587886 and PI587880A. TAG. Volume 119, Number 2: 271.280. ROSSI, R.L. 2003. First report of Phakopsora pachyrhizi, the causal organism of soybean rust in the Province of Misiones, Argentina. Plant Disease 87:102. YAMANAKA, N.; DA SILVA, D.C.G.; de L. PASIANOTTO, A.L.; NOGUEIRA, L.M.; POLIZEL, A.M.; DOS S. PEREIRA, S.; DOS SANTOS, J.V.M.; BROGIN, R.L.; ARIAS, C.A.A.; HOFFMAN-CAMPO, C.B; NEPOMUCENO, A.L. & ABDELNOOR, R.V. (2008). Identification of DNA Markers and Characterization of the Genes for Resistance against Soybena Rust. En: Kudo, H.; Suenaga, K.; Soares, R.M. & Toledo, A. (Eds.), Facing the Challenge of Soybean Rust in South America. JIRCAS Working Report Nº 58. pp. 99-107. YORINORI et al., 2005 Epidemics of Soybean Rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003. Plant Disease 89:675-677 FREIRE et al., 2008). Evolutionary history of Phakopsora pachyrhizi (the Asian soybean rust) in Brazil based on nucleotide sequences of the internal transcribed spacer region of the nuclear ribosomal DNA. Genet. Mol. Biol. 31: 920-931 TWIZEYIMANA et al, 2011 Genetic structure and diversity of Phakopsora pachyrhizi isolates from soyabean. Plant Patology 60 (4): 719-729. -4Workshops