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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS ASOCIACIÓN DE POLIMORFISMOS EN EL GEN ADIPOQ CON LA PRESENCIA DE OBESIDAD EN NIÑOS MEXICANOS TESIS QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBETENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS QUÍMICOBIOLÓGICAS PRESENTA EMILIO ESPINOZA SIMÓN DIRECTORES DE TESIS: DR. MIGUEL CRUZ LOPEZ DRA. ETHEL AWILDA GARCIA LATORRE MÉXICO DF A 12 DE DICIEMBRE DEL 2008. Esta tesis fue realizada en laboratorio de Inmunoquímica I del departamento de Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas bajo la tutela de la Dra. Ethel Awilda García Latorre y en la Unidad de Investigación Médica en Bioquímica bajo la tutela del Dr. Miguel Cruz López. Durante este trabajo el alumno recibió beca CONACYT (No. Registro 217450/206875) y beca IMSS ( No. Becario 99093377) AGRADECIMIENTOS. Al Dr. Miguel Cruz López del Instituto Mexicano del Seguro Social por el apoyo y la paciencia que me ha brindado durante estos 2 años A la Dra Ethel A. García Latorre del Instituto Politécnico Nacional: por la esmerada asesoría que me ha dado durante este tiempo A la Dra Rebeca García Macedo del Instituto Mexicano del Seguro Social, por asesorarme durante estos dos años A mi comité tutoral, por su contribución a este trabajo A la Dra Celia Aradillas García de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí por su invaluable contribución al desarrollo de este proyecto A la Dra Elva Leticia Pérez-Luque de la Universidad de Guanajuato por su también invaluable contribución a el desarrollo de este proyecto DEDICATORIAS. A dios, por caminar a mi lado este sendero. A mis padres, por creer en mi, apoyarme cada jornada y por el ejemplo que me han dado siempre. A mi hermana, una vez mas.......... si se puede¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡ A mi Naye, por ser mi apoyo incondicional durante todo este tiempo, por lo que hemos pasado juntos, lo que vivimos ahora y lo que viviremos. Gracias mi niñita. A mis amigos, Marlene, Leobardo y Belén. .......porque el pan del mercenario, es siempre el pan mas amargo INDICE. INDICE DE ABREVIATURAS...............................................................................i INDICE DE TABLAS...........................................................................................iv INDICE DE FIGURAS.........................................................................................vi RESUMEN.........................................................................................................vii ABSTRACT.......................................................................................................viii I. INTRODUCCIÓN..............................................................................................1 OBESIDAD.........................................................................................................1 CLASIFICACIÓN DE LA OBESIDAD.................................................................3 ETIOLOGIA DE LA OBESIDAD COMÚN...........................................................8 TEJIDO ADIPOSO............................................................................................16 ADIPONECTINA...............................................................................................23 JUSTIFICACIÓN...............................................................................................38 HIPÓTESIS.......................................................................................................39 OBJETIVOS......................................................................................................39 II. MATERIAL Y MÉTODOS..............................................................................40 III. RESULTADOS.............................................................................................46 IV. DISCUSIÓN.................................................................................................65 V. CONCLUSIONES........................................................................................68 VI. PERSPECTIVAS.........................................................................................68 VII. BIBLIOGRAFIA...........................................................................................69 ABREVIATURAS UTILIZADAS - MSH: hormona estimulante de los melanocitos ACC: acetil coenzima A carboxilasa ACE: gen codificante para la acetil colinesterasa ACTH: gen codificante para la hormona adenocorticotropica ADA: gen codificante para la adenosina desaminasa ADIPOQ: gen codificante para adiponectina AdipoR: receptor de adiponectina ADR: gen codificante para la receptor adrenérgico AGT: gen codificante para la angiotensinógeno Ala: alanina AMP: adenosina monofosfato APOA: gen codificante para la apolipoproteína A ARNm: Ácido ribonucleico mensajero ASP: proteína estimuladora de acilación ATP: adenosina trifosfato CAP10: gen codificante para la calpaina 10 CCKAR: gen codificante para la receptor de colecistocinina cDNA: DNA complementario COMT: gen codificante para la metiltranferasa de catecolaminas CRHR: gen codificante para la receptor de la hormona liberadora de corticotropina CYP: citocromo P450 DF: gen codificante para la factor del complemento tipo D DRD: gen codificante para la receptor de dopamina DRD2: gen codificante para la receptor de dopamina DT2: diabetes tipo 2 ENSN: Encuesta Nacional de Salud y Nutrición ESR: gen codificante para la receptor de estrógenos FABP: proteína de unión a ácidos grasos i GAD: gen codificante para la glutamato descarboxilasa GHRL: gen codificante para la ghrelina Gly: glicina GNB : gen codificante para la proteína de unión a nucleótidos de guanina GRL: gen codificante para la receptor de glucocorticoides GTO: Guanajuato GH: hormona del crecimiento HMW: adiponectina de alto peso molecular Homa-IR: Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance HSP: proteína de choque térmico HTR: gen codificante para la receptor de serotonina ICC: índice cintura cadera IGF: factor de crecimiento insulinoide IL: Interleucina IMC: índice de masa corporal LDL: lipoproteína de baja densidad LDLR: receptor de LDL LEP: gen codificante para la leptina LEPR: gen codificante para el receptor de leptina LIPE: gen codificante para la lipasa sensible a hormonas LMNA: gen codificante para la laminina A LMW: adiponectina de bajo peso molecular LPL: lipasa de lipoproteínas MAO: gen codificante para la monoamino oxidasa MC4R: receptor de melanocortina MMW: adiponectina de mediano peso molecular NPR: gen codificante para la receptor C del péptido atrionatriuretico NPY: neuropéptido Y Ob-R. gen codificante para el receptor de leptina p: probabilidad PAI: Inhibidor del activador del plasminógeno ii PCR: reacción en cadena de la polimerasa PEPCK: fosfoenol piruvato carboxilasa PGR: gen codificante para el receptor de progesterona PHF6: gen codificante para proteína de dedos de Zn PLIN: gen codificante para la perilipina POMC: propiomelanocortina PPARG: receptor proliferador de peroxisomas activado gama Pro: prolina PTPRF: gen codificante para el receptor de tirosina fosfatasas RETN: gen codificante para la resistina SBB: Sindrome de Bardet-Biedl SBFL: Síndrome de Börjesson-Forssman-Lehmann SCAR: gen codificante para el receptor “carroñero” SGK: gen codificante para la cinasa reguladora de glucocorticoides SLC: gen codificante para el transportador de dopamina SLP: San Luis Potosí SNP: polimorfismo de un solo nucleótido SPW: síndrome de Prader-Willi TA: tejido adiposo TG: triglicéridos TGF: factor de crecimiento transformante Thr: treonina TNF: factor de necrosis tumoral UCP: proteína desacoplante de protones USA: Estados Unidos de América VDR: gen codificante para el receptor de vitamina D VIH: virus de la inmunodeficiencia humana iii INDICE DE TABLAS. TABLA 1. Comparación de las características bioquímicas y antropométricas de los niños participantes por estado de origen ........................................................ 46 TABLA 2. Comparación de las características bioquímicas y antropométricas de los niños participantes por género .........................................................................48 TABLA 3. Clasificación de los niños participantes en función del estado nutricio y la entidad federativa de origen ...............................................................................49 TABLA 4. Clasificación de los niños participantes en función del estado nutricio y del género...............................................................................................................50 TABLA 5. Comparación de las características bioquímicas y antropométricas de los niños participantes por estado nutricio .............................................................51 TABLA 6. Distribución genotípica del SNP G276T en la población estudiada..... 52 TABLA 7. Distribución genotípica del SNP A-10069G en la población estudiada..53 TABLA 8. Distribución genotípica del SNP C-19169T en la población estudiada..54 TABLA 9 Evaluación del efecto del genotipo, edad, centro y género en el estado nutricio de la muestra de infantes ..........................................................................57 TABLA 10 Distribución genotípica del SNP G276T en la muestra de niñas estudiada ...............................................................................................................57 TABLA 11 Evaluación del efecto del genotipo, edad y centro en el estado nutricio de la muestra de niñas ...........................................................................................58 iv TABLA 12 Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP G276T presente en los infantes estudiados..............................59 TABLA 13 Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP G276T presente en las niñas estudiadas.................................60 TABLA 14 Evaluación del efecto del genotipo del SNP A-10069G, edad, centro y género en el estado nutricio de la muestra de infantes..........................................61 TABLA 15 Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP A-10069G presente en las niñas estudiadas.............................62 TABLA 16 Evaluación del efecto del genotipo del SNP C-19169T, edad, centro y género en el estado nutricio de la muestra de infantes..........................................63 TABLA 17 Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP C-19169T presente en las niñas estudiadas.............................64 v INDICE DE FIGURAS. Figura 1. Comparación de la conformación estructural del tejido adiposo ............17 Figura 2. Diversos multímeros de adiponectina......................................................26 Figura3. Mecanismo de acción de la adiponectina en músculo............................ 29 Figura 4. Mecanismo de acción de la adiponectina en hígado.............................. 30 vi RESUMEN. Actualmente, los estilos de vida de las personas incluyendo los niños, se caracterizan porque ingieren alimentos con mayor contenido energético, realizan cada vez menos ejercicio y pasan muchas horas laborales y recreativas en posición sedentaria; esto, a pesar del estricto control molecular, al paso del tiempo termina produciendo obesidad. En los últimos años, la obesidad infantil se ha incrementado de manera alarmante en nuestro país. Este padecimiento en el niño y en el adolescente, además de generar un adulto obeso, constituye un factor de riesgo para su desarrollo. Diversos estudios realizados en los últimos años han demostrado la fuerte influencia del factor genético. Uno de estos genes es ADIPOQ, el cual codifica para la proteína Adiponectina. SNPs en este gen, han sido asociados al desarrollo de obesidad, DT2, enfermedades arterioscleróticas y cáncer en poblaciones asiáticas, europeas y anglosajonas, sin embargo aún no se conoce el efecto de estas variaciones en la población infantil mexicana. El objetivo de este trabajo es determinar la relación existente entre cuatro polimorfismos en el gen ADIPOQ y la presencia de obesidad en una muestra de niños mexicanos de entre 6 y 12 años provenientes de la ciudades de San Luís Potosí y de León Guanajuato. Con el uso de la técnica de la PCR en tiempo real mediante el uso de sondas TAQMAN®, la caracterización bioquímica y antropométrica de los infantes y con el análisis estadístico correspondiente, se demostró que existe asociación débil entre la presencia del genotipo G/G en el SNP G276T del gen ADIPOQ y el desarrollo de obesidad en las niñas de las muestras poblacionales estudiadas. También se demostró que la presencia del genotipo C/C en el SNP C-19169T ó del genotipo A/A en el SNP A-10069G en las regiones promotoras del gen ADIPOQ contribuyen de manera discreta con un incremento en el índice cintura cadera (ICC) en la muestra poblacional obtenida de las niñas de las ciudades de San Luis Potosí y León, Guanajuato. vii ABSTRACT. Currently, the lifestyles of people including children, are characterized as food eaten in greater energy content, are becoming less and less exercise and spend many hours at work and at leisure sedentary position: that, despite the strict molecular control, ends to produce obesity.…………………………………………... In recent years, childhood obesity has increased dramatically in our country. This illness in children and adolescents, in addition to generating an obese adult, is a risk factor for their development.……………………………………………………….. Various studies in recent years have demonstrated the strong influence of genetic factor. One of these genes is ADIPOQ, which encodes the protein Adiponectin. SNPs in this gene have been associated with the development of obesity, DT2, arteriosclerotic diseases and cancer in Asian populations, European and AngloSaxon, though not yet know the impact of these changes in the child population in Mexico. The aim of this study is to determine the relationship between four polymorphisms in the ADIPOQ gene and the development of obesity in a sample of Mexican children between 6 years and 12 years recluted from several elementary schools from San Luis Potosi City and León, Guanajuato. … Weight, heigth, waist and hip circumferences perimeter and systolic and diastolic pressure were measured and blood samples were collected from all the children after an overnight fast. Glucose, total colesterol, triglycerids, HDL and LDL were measured by enzimatics assays kits. The SNPs T45G, G276T, A-10069G and C19169T were genotyped using the fluorescent 5’ nuclease Taqman assay on an ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System. (Aplied Biosystems; Foster City, CA, USA). We showed the next: an weak association between the presence of the G276T of the gene ADIPOQ and obesity was obtained, and the A-10069G and C19169T variations were associated with an WHR increase in the studied girls. viii I. INTRODUCCIÓN 1.1 OBESIDAD Actualmente, el estilo de vida de las personas incluyendo los niños, se caracteriza por ingerir alimentos con mayor contenido energético, realizar cada vez menos ejercicio y pasar mucho tiempo en posición sedentaria; esto, a pesar del estricto control molecular, al paso del tiempo termina produciendo obesidad. Posteriormente, esta condición predispone a los individuos a padecer numerosas enfermedades crónicas y degenerativas principalmente cardiovasculares, responsables de la mayor mortalidad en la edad adulta. La obesidad se asocia con numerosas enfermedades entre las que se encuentran trastornos neurológicos y psicosociales, pulmonares, cardiovasculares, gastrointestinales, endocrinos y metabólicos, renales, ortopédicos, además de algunas formas de cáncer y estereotipos sociales negativos . La prevalencia de obesidad a nivel mundial ha aumentado como resultado de cambios drásticos en el estilo de vida, mayor disponibilidad de alimentos, y una progresiva disminución de la actividad física. En el año 2005, aproximadamente mil millones de personas en el mundo padecían esta enfermedad y se calcula que para el 2015 aumentará un 50% (WWW.WHO.INT 2007). En México, según la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición 2006, el 39.7% de las personas presentan sobrepeso y un 29.6 % tienen obesidad (www.insp.mx/ensanut/ 2007). En los últimos años la obesidad infantil se ha incrementado de manera alarmante en nuestro país, datos obtenidos de la ENSN del 2006 muestran que de 1999 al 2006 la obesidad en niñas se incrementó 47%, mientras que en niños aumentó 77%. Este padecimiento en el niño y en el adolescente, además de generar un adulto obeso, constituye un factor de riesgo para su desarrollo, ya que está propenso a enfermedades respiratorias, cardiacas, digestivas, dislipidemias, y endócrinas (Troyo-Barriga 2004; Daniels 2006; Aronne and Isoldi 2007; CastroRodriguez 2007). 1 Diversas son las definiciones existentes para la obesidad, a continuación se mencionarán las más significativas a consideración del autor de este trabajo: La obesidad, en términos simples, puede ser definida como un estado nobalanceado entre las calorías ingeridas frente a las calorías gastadas lo cual puede llevar a una acumulación excesiva de grasa (Nammi, Koka et al. 2004). La obesidad es un estado fisiológico, donde hay un desbalance entre la ingestión de alimentos, la cual es regulada por un complejo sistema fisiológico que requiere la integración de varias señales periféricas y la coordinación central del cerebro (Bell, Walley et al. 2005). La obesidad se define como un depósito excesivo de grasa debido a un desbalance crónico positivo en la ecuación energética resultando en un incremento en el almacén de energía, un decremento en el gasto energético o ambos (Martinez 2000). La obesidad definida como un incremento de la masa del tejido adiposo, constituye un factor de riesgo para el desarrollo de alteraciones cardiovasculares y metabólicas como diabetes, hiperlipidemia, y enfermedad arterial coronaria (Tsuchida, Yamauchi et al. 2005). La obesidad puede ser definida como una enfermedad en la cual el exceso de grasa corporal se ha acumulado de tal manera que puede resultar adversa para la salud (Kopelman 2000). La obesidad, un desorden principal en el mundo “industrializado” e “industrializante”, puede ser considerado un desbalance energético asociado con un incremento en el riesgo a desarrollar hipertensión, enfermedades del corazón y diabetes (Eikelis and Esler 2005). En resumen, la obesidad puede ser definida como una enfermedad crónica, heterogénea y compleja que suele iniciarse en la infancia ó adolescencia, caracterizada por un desbalance energético positivo producto de la interacción de una serie de factores genéticos, ambientales y de estilo de vida que constituye un factor de riesgo para el desarrollo de numerosas comorbilidades como: diabetes mellitus II, hipertensión arterial, dislipidemias y algunas neoplasias. 2 1.2 CLASÍFICACIÓN DE LA OBESIDAD La obesidad puede ser clasificada de diversas formas, en función del campo de estudio. Desde una perspectiva genética, la obesidad se puede clasificar en tres tipos: a) Obesidad monogénica Los pacientes que cursan con este tipo de obesidad presentan alteraciones mutagénicas en un solo gen, que generalmente codifica para una proteína esencial en la regulación de la ingestión de alimentos. Es importante mencionar que en algunos casos, estas alteraciones pueden tratarse con una terapia farmacológica adecuada, por ejemplo: -Deficiencia congénita de leptina. La leptina es un péptido glicosilado de 16 kDa, constituido por 167 aminoácidos, producido por el tejido adiposo. Esta hormona es codificada por el gen Ob, el cual se encuentra en el cromosoma 6 en el caso del ratón y en el locus 7q31.3 en el humano (Zhang, Proenca et al. 1994). El efecto de esta hormona es mediado por receptores (Ob-R) ubicados en su mayoría, en el hipotálamo (Ahima and Flier 2000). La leptina es considerada una hormona homeostática que regula la ingestión de alimentos y el peso corporal. Actúa a nivel de los núcleos hipotalámicos disminuyendo el apetito e incrementando el gasto energético a través de la activación parasimpática, lo cual lleva finalmente a una disminución del tejido adiposo y por consecuencia del peso corporal. Los niveles de esta hormona disminuyen durante el ayuno y se incrementan durante la ingestión. También se ha encontrado que la leptina está asociada a la regulación de procesos hemodinámicos renales (Haynes, Morgan et al. 1997; Vecchione, Maffei et al. 2002), tono de los vasos sanguíneos (Fernandez-Alfonso 2004; Juan, Chuang et al. 2008) y regulación de la presión sanguínea (Galletti, D'Elia et al. 2008; Imatoh, Miyazaki et al. 2008). En 1997 se reportó el caso de dos gemelos de origen Pakistaní con obesidad mórbida, procedentes de una familia con una elevada consanguineidad. Clínicamente, estos pacientes presentaron baja concentración sérica de leptina y 3 una elevada hiperfagia, así como un envejecimiento prematuro a nivel óseo. Genéticamente, los sujetos afectados son homocigotos para una mutación con cambio en el marco de lectura del gen ob, la cual genera una proteína trunca que no es secretada, lo cual impide el adecuado funcionamiento de esta vía de regulación del apetito (Montague, Farooqi et al. 1997; Rau, Reaves et al. 1999). En el 2002 Farooqi y su grupo reportaron el efecto benéfico de la administración subcutánea de leptina para reducir el peso corporal y la proporción de grasa corporal en tres niños con deficiencia congénita de leptina. El ejemplo más dramático de esta terapia farmacológica se ejemplifica en un niño de 3 años, el cual tenía un peso inicial de 48 Kg y después de 48 meses de tratamiento se redujo a 32 kg (Farooqi, Matarese et al. 2002). - Deficiencia del receptor de leptina En 1998 se reportó una mutación en el receptor de leptina en tres sujetos consanguíneos. Los individuos afectados son homocigotos para una mutación que trunca al receptor antes de su dominio transmembranal. Fenotipicamente, presentan características similares a los sujetos con deficiencia congénita de leptina; peso normal al nacer, sin embargo, exhibieron una ganancia considerable de peso en los primeros meses de vida, con severa hiperfagia y comportamiento agresivo ante la restricción de alimento (Clement, Vaisse et al. 1998). A diferencia de la patología anterior, los sujetos con deficiencia en el receptor de leptina padecen retraso mental, lo que sugiere que esta alteración genética resulta en un fenotipo más severo que la pérdida de leptina en si. A diferencia de la deficiencia anterior, no existe tratamiento farmacológico que beneficie a estos sujetos - Mutación en el gen codificante para propiomelanocortina (POMC) La POMC es un precursor de péptidos melanotrópicos, corticotrópicos y opioides como la hormona estimulante de los melanocitos ( -MSH) y hormona adenocorticotrópica (ACTH), producidas por las neuronas hipotalamicas del núcleo arqueado. Uno de los productos de este precursor, la -MSH, participa en el control del apetito. En 1998, se reportó el caso de dos niños alemanes sin 4 parentesco con mutaciones en el gen POMC, ambos niños presentaban hiperfagia y una ganancia de peso acelerada, presumiblemente, debido a una señalización deficiente de la melanocortina en el hipotálamo. Otra característica notable es que los niños tenían la piel pálida y el cabello rojo, debido a la deficiencia de MSH en la piel (Krude, Biebermann et al. 1998). b) Obesidad Sindrómica Genéticamente se caracteriza por presentar un patrón de herencia mendeliano, sin embargo, clínicamente presentan un cuadro heterogéneo, las principales características son el retraso mental, malformaciones físicas y obesidad. A continuación, se mencionan algunos ejemplos. - Síndrome de Prader-Willi (SPW) Este síndrome fue descrito en 1956 por los doctores suizos Andrea Prader, Alexis Labarth y Heinrich Willi, cuando estudiaron a nueve pacientes que presentaban un cuadro clínico de obesidad, baja estatura, criptorquidia ( situación clínica en la cual el testículo no desciende de manera normal al escroto), hipotonía muscular y alteraciones en el aprendizaje (Burman, Ritzen et al. 2001). De los 12 a los 18 meses el infante desarrolla hiperfagia, lo que provoca un problema serio de obesidad de predominio troncal, que combinada con la hiperfagia provocan la aparición temprana de insulinorresistencia. Físicamente, los pacientes con SPW se caracterizan por una cara estrecha con ojos en forma de almendra, alteraciones craneofaciales con boca triangular y paladar ojival. También presentan una escasa mímica debido a la hipotonía generalizada, hipoplasia de genitales externos y tamaño pequeño de manos, pies y dedos (acromicria) (Wattendorf and Muenke 2005). Los genes afectados en el SPW están ubicados generalmente en el cromosoma 15 heredado por el padre. Los genes ubicados en este locus heredados de la madre, generalmente están inactivos. Habitualmente, los niños afectados por SPW, presentan una deleción o inactivación debido a un defecto en la metilación de un segmento cromosómico heredado del padre o han heredado dos copias de 5 esta región cromosómica provenientes de la madre, esta situación en particular, es denominada disomía uniparental materna (Mann and Bartolomei 1999). Los datos clínicos demuestran que en los pacientes con SPW se encuentran reducidos los niveles de hormona de crecimiento. Se ha desarrollado una terapia con ésta hormona, la cual ha mostrado efectos benéficos, como un incremento en la masa muscular y una disminución en la cantidad de tejido adiposo, lo que contribuye a retardar la aparición de patologías asociadas a la obesidad como DT2 y enfermedades cardiovasculares (Burman, Ritzen et al. 2001). - Síndrome de Bardet-Biedl (SBB) Los primeros casos de este síndrome fueron reportados en 1920 por el Dr. George Bardet, el cual caracterizó a esta enfermedad en función de cuatro criterios: retinosis pigmentaria, polidactilia, obesidad e hipoplasia genital. La incidencia en el mundo de este raro síndrome es relativamente baja; en Norteamérica y Europa, la prevalencia es de 1:140,000 a 1:160,000 respectivamente, sin embargo, en Kuwait y Newfoundland (isla en la costa oeste de Canadá) la prevalencia es más elevada: 1:13,500 a 1:17,500 correspondientemente (Teebi 1994). Clínicamente, los individuos afectados por SBB muestran un conjunto ligeramente características primarias son: obesidad, heterogéneo de síntomas, las distrofia de los conos y bastones (fotorreceptores del sistema visual humano), polidactilia, hipogonadismo, retraso mental y anomalías renales. Otras características no siempre presentes incluyen fibrosis hepática, DT2, diabetes insípida nefrogénica, ataxia, dientes pequeños, hipertrofia ventricular izquierda, anormalidades reproductivas y estatura corta (Katsanis, Lupski et al. 2001). Una de las características principales de este síndrome es la obesidad, la cual tiene un rango de frecuencia del 76 % al 90 % (Beales, Elcioglu et al. 1999). Las personas que sufren de este síndrome, comienzan con un incremento progresivo de masa corporal desde los primeros años de vida, con una distribución de la grasa corporal amplia en el organismo, hasta la edad adulta, cuando el mayor porcentaje de grasa se acumula en el tronco. 6 El SBB se transmite genéticamente en las familias siguiendo un patrón autosómico recesivo. La relativa constancia del fenotipo, llevó a la teoría de que este síndrome se debía a un locus específico, sin embargo, hasta la fecha se han relacionado seis loci genéticos con el desarrollo de esta enfermedad; SBB1 en el locus 11q13, SBB2 en 16q21, SBB3 en 3p 12-13, SBB4 en 15q23, SBB5 en 2q31, SBB6 en 20p12 y SBB7, cuyo locus aún se desconoce (Katsanis, Lupski et al. 2001). - Síndrome de Börjesson-Forssman-Lehmann (SBFL) Este síndrome fue descrito por Börjensson en 1962, en una pareja de hermanos. Entre las características descritas están el retraso mental severo, epilepsia, hipogonadismo, hipometabolismo, obesidad, edema en el rostro y orejas largas (Borjeson, Forssman et al. 1962). Mulley y colaboradores, en 1989, localizaron el locus específico relacionado con SBFL en la región Xq26-Xq27 (Turner, Gedeon et al. 1989). Recientemente, Lower descubrió el gen asociado al SBFL, denominado PHF6. Este gen codifica para una proteína de once exones denominada “proteína de dedos de zinc” (proteína que interviene durante el proceso de trascripción). En este trabajo también se describe que la mutación C1024T es asociada con el desarrollo del síndrome (Lower, Solders et al. 2004). Todos los estudios ya mencionados demostraron que SBLF tiene un patrón de herencia mendeliano ligado al cromosoma X. c) Obesidad poligénica u obesidad común La obesidad poligénica suele ser de origen multifactorial, donde hay una interacción importante entre el fondo genético del individuo y del ambiente circundante. Ésta es también, la forma más frecuente de obesidad humana. Hasta el momento, se han descrito más de 430 genes con funciones diversas en el organismo, asociados al desarrollo de obesidad en los seres humanos, entre estos genes podemos mencionar a los codificantes para la adiponectina, los receptores adrenérgicos alfa-2A, alfa-2B, beta-1, beta-2, beta-3, el receptor de glucocorticoides, receptor proliferador de peroxisomás activado gama (PPARG) y 7 las proteínas desacoplantes mitocondriales transportadoras de protones 1, 2 y 3 entre otros. Desde una perspectiva antropométrica, la obesidad puede ser clasificada en función de la distribución del tejido adiposo a nivel corporal. Los sujetos con obesidad central, vísceral o androide se caracterizan por presentar una acumulación excesiva de grasa a nivel abdominal. Los sujetos con obesidad subcutánea o ginoide, en cambio, presentan una mayor acumulación de grasa en las caderas y muslos. El exceso de tejido adiposo vísceral predispone a alteraciones en la homeostasis de la glicemia, incrementa la concentración de triglicéridos (Tg) plasmáticos y de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) que contribuyen al desarrollo de diabetes tipo 2 y síndromes cardiovasculares (Lafontan and Girard 2008). La obesidad ginoide, sin embargo, se asocia más al desarrollo de alteraciones circulatorias, como disfunción linfática y a disfunciones óseas, como la artrosis. (L'Hermitte, Behar et al. 2003). 1.3 ETIOLOGÍA DE LA OBESIDAD COMÚN a) Factores ambientales La obesidad común es resultado de la interacción compleja de una serie de factores genéticos y ambientales. Los factores ambientales actúan al promover un incremento en la ingestión calórica y una disminución en el gasto energético debido a una disminución en la actividad física. La mayor oferta de productos elevados en carbohidratos, así como una preferencia elevada por este grupo nutricional también tiene un papel fundamental en el aumento del riesgo al desarrollo de obesidad. Otros hábitos de consumo, como el tabaquismo y el alcoholismo contribuyen a un incremento en el peso corporal. La influencia de la dieta como factor en el desarrollo de obesidad se ha estudiado desde mediados del siglo XX. En los primeros artículos científicos encontrados se estudia la influencia de la dieta en la disminución del peso corporal (Anderson 1949; Marriott 1949; Hostomska, Strakova et al. 1951). En 1988, Frank E Speizer, 8 estudió el efecto de la dieta, actividad física, alcoholismo y tabaquismo en 141 enfermeras estadounidenses. El encontró que la ganancia de peso correlaciona directamente con la edad, la ingestión de calorías y la proporción de grasas en la dieta, mientras que se observó una relación inversamente proporcional entre la obesidad y la actividad física o el consumo de alcohol. También se ha encontrado que el tabaquismo es menos frecuente en mujeres que hacen ejercicio, por lo tanto, el tabaquismo de manera indirecta, es directamente proporcional a la ganancia de peso corporal (Romieu, Willett et al. 1988). Años después se postuló que el hábito de fumar durante el embarazo puede generar sobrepeso y obesidad en los niños gestados. En el 2002, un estudio realizado en 6 centros de salud pública en Alemania demostró una correlación dependiente de la dosis entre sobrepeso u obesidad y el hábito de fumar en las madres gestantes (von Kries, Toschke et al. 2002). Otro estudio demostró que la exposición intrauterina al tabaco durante los primeros tres meses de gestación produce obesidad en los infantes (Toschke, Montgomery et al. 2003). En 1989, un estudio realizado en 1638 sujetos, sobre la influencia del tiempo frente al televisor como determinante en el desarrollo de obesidad, demostró que las personas que veían la televisión más de tres horas al día son dos veces más propensas a ser obesas en comparación con las personas que ven la televisión menos de una hora al día (Tucker and Friedman 1989). El mismo autor, tres años después estudió el efecto del tiempo frente al televisor en el estado nutricio de 4771 mujeres y encontró que las mujeres que ven más de cuatro horas la televisión tienen el doble de prevalencia de obesidad (Tucker and Bagwell 1991). En el 2008, se encontró que el tiempo frente el televisor es un factor de riesgo independiente en el desarrollo de síndrome metabólico en la población taiwanesa (Tucker and Bagwell 1991). Otro factor asociado al desarrollo de obesidad es el estado socioeconómico, en 1977, un estudio realizado en familias americanas demostró que los hombres con más escolaridad tienden a desarrollar más obesidad, además, se demostró que en las mujeres este efecto es inverso (Garn, Bailey et al. 1977). Otro estudio en 1963 9 en niños de Francia demostró una mayor prevalencia de obesidad en aquellos de clase social baja (Romon, Duhamel et al. 2005). Un estudio realizado en 3010 niños de Indonesia de comunidades rurales, urbanas pobres y urbanas de clase acomodada demostró que los niños que crecieron en ambientes económicamente más cómodos tenían mayor prevalencia de obesidad en comparación con los otros dos grupos, lo cual nos muestra que la obesidad en Indonesia, esta asociada a un mejor nivel socioeconómico (Julia, van Weissenbruch et al. 2004). En México, en el 2007 se realizó un estudio a 4605 personas de comunidades rurales y urbanas de México y se encontró que los sujetos con menor nivel educacional tienen menor riesgo de padecer obesidad (Ruiz-Arregui, CastilloMartinez et al. 2007). Resulta evidente la dificultad de establecer una correlación entre el nivel socioeconómico y la propensión al desarrollo de obesidad, es necesario realizar estudios más significativos y más controlados para poder establecer una asociación precisa entre estas dos variables. Un factor asociado al desarrollo de obesidad es el consumo de alcohol. En 1994, en un estudio realizado a 573 suizos demostró que los bebedores asiduos presentan una mayor predisposición al desarrollo de obesidad que los sujetos abstemios (Meyer, Suter et al. 1999). Otro estudio realizado en 1491 hombres y 1563 mujeres españolas demostró que el consumo superior a 30 g de etanol por día se asocia de manera significativa con el riesgo de obesidad abdominal (Schroder, Morales-Molina et al. 2007). El factor más evidente relacionado con el desarrollo de obesidad es la ingestión excesiva de alimentos ricos en grasas y carbohidratos. Diversos estudios realizados han demostrado la asociación de un ingestión calóricamente elevada con el desarrollo de obesidad. El efecto del consumo de bebidas gaseosas y del tiempo frente al televisor se evaluó en 385 niños en California, USA. Se observó que los niños obesos consumían más de 3 bebidas gaseosas al día en comparación con los niños de 10 peso normal que consumían menos de 3. También se observó que los niños obesos tienden a pasar más tiempo frente al televisor. Otro resultado interesante obtenido mostró que los niños latinos tienden a pasar más tiempo frente al televisor y a consumir mas bebidas gaseosas que los niños asíáticos y que los niños blancos no hispánicos (Giammattei, Blix et al. 2003). En España, se evaluó el efecto de la modificación gradual en la dieta en 4700 individuos de 10 a 75 años, en este estudio se observó una disminución en la ingestión de vegetales y un aumento en la ingestión de comida rápida y más importante aún, se demostró que esta modificación en los hábitos alimentarios correlacionó con un incremento en el índice de mása corporal en estos sujetos (Serra Majem, Ribas Barba et al. 2007). Un estudio realizado en 1072 niñas en edad escolar en Arabia Saudita, demostró que en prácticamente todas las niñas obesas existía el habito frecuente del consumo de comida rápida y bebidas gaseosas. Además, el 97 % de las niñas obesas veía televisión con mayor frecuencia en comparación con el grupo control (Alam 2008). b) Factores genéticos Resulta evidente la contribución del factor ambiental al desarrollo de la obesidad, sin embargo, diversos estudios realizados en los últimos años han demostrado la fuerte influencia del factor genético. Un estudio trascendental que demostró lo anterior fue realizado en Columbia, donde se estudió a 53 pares de gemelos criados de manera separada. Sorprendentemente, este estudio demostró una correlación de 0.63 para gemelos Finlandeses, 0.73 para gemelos Japoneses y 0.85 para los gemelos Americanos. Esto finalmente demostró que existe una correlación aproximada del 50 % al 70 % entre la carga genética y la propensión al desarrollo de obesidad (Allison, Kaprio et al. 1996). De manera paralela, se ha documentado que los hijos de padres con DT2 tienen un exceso de tejido adiposo y mayor riesgo de alteraciones metabólicas cuando adultos jóvenes (Srinivasan, Frontini et al. 2003) 11 En este mismo año, se publicó el mapa de genes asociados a obesidad en humanos, de manera breve, se reportó lo siguiente: a esa fecha, se habían encontrado 12 loci ligados a trastornos con patrón de herencia mendelianos que tenían a la obesidad como principal característica clínica. También, se conocían hasta ese momento seis loci que causaban obesidad en modelos murinos. Además, se describieron diez genes candidato que exhibieron asociación significativa con IMC o con niveles de grasa corporal. Resulta importante mencionar que en este estudio se llegó a la conclusión de la necesidad de desarrollar herramientas informáticas adecuadas para realizar un análisis fino de los resultados obtenidos (Bouchard and Perusse 1996). En 1999, se resumieron los avances obtenidos hasta el momento en el campo de los genes asociados a la presencia de obesidad en el ser humano. En ese informe se notifica la asociación entre el IMC y el peso corporal con los polimorfismos en los genes codificantes para las proteínas desacoplantes de protones UCP2 y 3, el factor de transcripción (PPAR ), el receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2), la apolipoproteína 4 (APOA4), el receptor “carroñero” CD36L1, el sustrato del receptor de insulina (IRS), la proteína de unión a nucleótidos de guanina (GNB) y la adenosina desaminasa (ADA). El porcentaje de grasa corporal mostró asociación con SNPs de los genes codificantes para el receptor adrenérgico beta 3 (ADRB3), el factor de crecimiento insulinoide (IGF1) y el angiotensinógeno (AGT), mientras que porcentajes bajos de masa corporal fueron asociados con los genes codificantes para el receptor de leptina (LEPR) y la proteína desacoplante de protones 1 (UCP1). La ganancia de peso durante en el embarazo fue asociada con variaciones en el gen codificante para el receptor adrenérgico beta 3 (ADRB3). Esta publicación resalta el efecto de la interacción gen-ambiente, ya que se observó asociación significativa entre el peso corporal, IMC y circunferencia de cintura y cadera con el polimorfismo Gln27Glu del gen codificante para el receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2) solo en hombres sedentarios, ya que el polimorfismo no tuvo efecto en los hombres físicamente activos (Chagnon, Perusse et al. 2000). 12 En el año 2000, se mostró el efecto de las variaciones genéticas en los genes codificantes para las proteínas laminina A (LMNA), el receptor 5 del neuropéptido Y (NPY5R), la insulina (INS), el factor de necrosis tumoral alfa (TNFA), el receptor de LDL (LDLR), el receptor de melanocortina tipo 4 (MC4R) y el receptor de colecistocinina CCKAR en el desarrollo de obesidad. De manera importante, se observó que las variaciones genéticas en los genes codificantes para el neuropéptido Y (NPY) y para la proteína de unión a nucleótidos de guanina tipo 3 (GNB3) se asociaban de manera significativa con el peso al nacer. La obesidad vísceral fue asociada con SNPs en los genes codificantes para el receptor de leptina (LEPR), laminina A (LMNA), el factor de transcripción PPARG, el prepropéptido CART, el receptor de glucocorticoides (GRL), el receptor adrenenérgico beta 2 (ADRB2), el neuropéptido Y (NPY), el receptor adrenérgico beta 3 (ADRB3) y el receptor adrenérgico alfa 2 (ADRA2). Interacciones gen - gen y gen - ambiente también fueron observadas en este año. En Canadá, se observó una interacción significativa entre los genes codificantes para el receptor adrenérgico alfa 2 (ADRA2A) y el receptor adrenérgico beta 3 (ADRB3) y la acumulación de grasa subcutánea y grasa abdominal total. Del mismo modo, se publicó un estudio donde se demostró que las mujeres alemanas portadoras de variaciones genéticas en el receptor adrenérgico beta 3 (ADRB3) y el sustrato del receptor de insulina (IRS1) pierden peso con más lentitud en comparación con las mujeres no portadoras (Perusse, Chagnon et al. 2001). En el 2001, se reportó la asociación de varios genes con la presencia de obesidad, sobrepeso e IMC, entre los genes reportados podemos mencionar a los codificantes para el receptor de leptina (LEPR), laminina A (LMNA), la ghrelina (GHRL), la proteína de choque termico de 70 KDa (HSPA1B), la lipoproteín lipasa (LPL), el dominio que contiene SH3 de la sorbina SH3D5, la insulina (INS), el receptor de vitamina D (VDR) y la lipasa sensible a hormonas (LIPE). El índice cintura cadera y la distribución corporal de grasa fueron asociados con variaciones en los genes codificantes para laminina A (LMNA), la apolipoproteina A2 (APOA2), el receptor de glucocorticoides (GRL), el receptor de estrógenos 1 (ESR1), la lipasa sensible a hormonas (LIPE), la APOE y el receptor de dopamina D 2 (DRD2). 13 También, se publicó un estudio donde se observó influencia del gen codificante para el receptor 5-HTB1B de serotonina en la capacidad de bajar de peso en mujeres con bulimia nerviosa. Respecto a la interacción gen gen, se encontró que las interacciones entre el gen codificante para el receptor adrenérgico beta 3 (ADRB3) y el factor de trascripción PPAR ejercen influencia en la concentración plasmática de leptina. Respecto a la interacción gen ambiente, se reportó que variaciones genéticas en el gen PPAR en conjunto con la ingestión de ácidos grasos polinsaturados/saturados en la dieta determinan el IMC (Rankinen, Perusse et al. 2002). Entre los genes que presentaron asociación con la obesidad reportados en el 2002 se encuentra el gen codificante para el inhibidor del activador del plasminógeno SERPINE1, el prepropéptido CART, el factor de trascripción insulinoide 2 (IGF2), la cadena media de la acetil coenzima A sintetasa (SAH) y la resistina (RETN). SNPs en el gen APM1 (adiponectina) se reportan por primera vez asociados con alteraciones en la distribución de grasa corporal. Por otro lado, se reportaron polimorfismos en el gen codificante para calpaína 10 (CAP10), leptina (LEP) y la proteína de unión a nucleótidos de guanina (GNB3), los cuales influyen en el proceso de lipólisis en el adipocito. El gen codificante para el receptor de serotonina 5-HT2C mostró asociación con la ganancia de peso inducida por fármacos antipsicoticos en pacientes psiquiátricos (Chagnon, Rankinen et al. 2003). En el 2003, se reportó que los genes codificantes para acetilcolinesterasa (ACE), la proteína homóloga relacionada con agouti (AGRP), la apolipoproteina A 1 (APOA1), la apolipoproteina A 4 (APOA4), el transportador dependiente de ATP (ATP1A2), el receptor de estrógenos tipo 1 (ESR1), el factor de transcripción (FOXC2), la deshidrogenasa (HSD11B1), la Interleucina 6 (IL6), el receptor de Interleucina 6 (IL6R), la lipasa hepática (LIPC), la lipasa sensible a hormonas (LIPE), la cadena media de la acetil coenzima A sintetasa (MACS2), el coactivador de receptores nucleares tipo 3 (NCOA3), el receptor de progesterona (PGR), el receptor “carroñero” B1 (SCARB1), el transportador de dopamina (SLC6A3) y el factor regulador de la producción de interferón (TCF1) mostraron asociación con 14 obesidad, IMC y sobrepeso. También se supo que los genes codificantes para el citocromo C 450 de la familia 19 y subfamilia A (CYP19A1), el factor del complemento D (DF), el receptor de estrógenos 1 (ESR1), y la cadena media de la acetil coenzima A sintetasa (lMACS2), tienen influencia en la distribución de grasa corporal. Asimismo, establecieron que las variaciones genéticas en el receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2) determinan en parte la respuesta eficiente a los programas de reducción de peso por ejercicio (Snyder, Walts et al. 2004). En el reporte correspondiente al 2004, se publicó que los genes codificantes para el transportador (ABCG5), la adiponectina (ADIPOQ), la acetilcolinesterasa (ACE), el receptor de la hormona liberadora de corticotropina (CRHR1), el receptor de dopamina 4 (DRD4), la glutamato descarboxilasa (GAD2), el receptor de serotonina 5-HT2C, la monoamina oxidasa (MAOA), el receptor C del péptido atrionatriurético (NPR3), la perilipina (PLIN), la paraoxonasa 1 (PON1), el receptor de tirosina fosfatasas (PTPRF), la resistina (RETN), la cinasa reguladora de glucocorticoides (SGK), y el receptor de vitamina D (VDR) mostraron asociación significativa con el incremento en IMC, sobrepeso y obesidad. En este año, también se encontró que los genes codificantes para el péptido atrionatriurético (NPR3), el receptor de tirosina fosfatasas (PTPRF), la resistina (RETN) y el inhibidor del activador del plasminógeno (SERPINE1) determinan en parte el fenotipo relativo a la distribución de grasa corporal. Los genes metiltransferasa de catecolaminas (COMT) y el citocromo CYP19A1, por otro lado, mostraron tener efecto en la pérdida de peso inducida por ejercicio, mientras que el incremento en los niveles de grasa abdominal en respuesta a una sobrealimentación a largo plazo se asocio a variaciones genéticas en el gen codificante para resistina (RETN). Relativo a la interacción gen-gen, se reportó que las interacciones múltiples entre los genes codificantes para los receptores adrenérgicos alfa 2 (ADRA2B), beta 2 y 3 (ADRB2) y (ADRB3) tienen efecto en la pérdida de grasa inducida por ejercicio en hombres y mujeres de la tercera edad (Perusse, Rankinen et al. 2005). 15 1.4 TEJIDO ADIPOSO El tejido adiposo (TA) se encuentra distribuido en distintas localizaciones en el organismo, principalmente, podemos decir que el tejido adiposo se distribuye de manera dérmica, subdérmica, subcutánea, mesentérica, perigonadal, perirrenal y retroperitoneal. Tradicionalmente, se ha considerado que el principal papel del tejido adiposo es albergar la mayor parte de la reserva energética del organismo, sin embargo, también tiene actividad metabólica y endocrina (autocrina, paracrina y endocrina). El tejido adiposo está constituido por adipocitos, algunos macrófagos y tejido intercelular. La proporción de estos tipos celulares varia en función de la condición nutricia. El tejido adiposo de sujetos con obesidad contiene una mayor proporción de macrófagos, así como adipocitos de mayor tamaño y por ende, un aumento en el número de capilares sanguíneos (Fig. 1). En cuanto a los tipos de tejido adiposo, podemos mencionar dos básicamente: el tejido adiposo café y el tejido adiposo blanco. El tejido adiposo café suele encontrarse en gran cantidad en recién nacidos y disminuye conforme el infante crece, en los animales es frecuente encontrarlo en especies hibernantes, esto es, debido a su capacidad de almacenar calor. Estructuralmente, el tejido adiposo café presenta adipocitos multiloculares con mitocondrias abundantes, que expresan de manera elevada a la proteína desacoplante 1 (UCP1), esta proteína es la responsable de la actividad termogénica de este tipo de tejido adiposo (Sell, Deshaies et al. 2004). El tejido adiposo blanco está formado por adipocitos uniloculares, que contienen mitocondrias con características diferentes a las mencionadas anteriormente (Cinti 2005). Los adipocitos que componen al tejido adiposo blanco, pueden secretar hormonas como leptina, la cual informa al cerebro del estado nutricional del individuo para regular la saciedad. La principal función endocrina de este tejido es en resumen, la de controlar la ingestión de energía y la distribución de la misma a otros tejidos en los periodos interdigestivos (Ailhaud G 1998). 16 Figura 1. Comparación de la conformación estructural del tejido adiposo. En sujetos con obesidad, los adipocitos están hipertróficos y hay una mayor acumulación de macrófagos. Modificado de (Tilg and Moschen 2006) El balance entre estos tejidos puede verse modificado en respuesta a diversos factores tales como el frío, el calor y la obesidad. Además, en animales aclimatados a bajas temperaturas, se encuentra una mayor proporción de tejido adiposo café, también, la cantidad de UCP1 en los adipocitos maduros se incrementa (Morroni, Barbatelli et al. 1995). Los adipocitos están adaptados para almacenar ácidos grasos bajo la forma de triglicéridos en una gota citoplasmática. Histológicamente, se puede observar que el núcleo del adipocito frecuentemente queda ubicado en la periferia de la célula. El tamaño del adipocito oscila entre 10 y 100 m de acuerdo al estado nutricional, ya que esta célula presenta una plasticidad tal que le permite adaptarse según la cantidad de triglicéridos que tenga que almacenar. Debido a esto, el adipocito puede almacenar hasta 1.2 g de triglicéridos en un sujeto obeso, sin embargo un sujeto de peso normal contiene aproximadamente 0.4 g de los mismos por célula. En sujetos delgados, el tejido adiposo contiene 18 % de agua, 80 % de triglicéridos y 2 % de proteínas, mientras que en los sujetos obesos el contenido de grasa aumenta, disminuyendo proporcionalmente la cantidad de agua. 17 La capilarizacion e innervación del tejido adiposo están adaptadas a cambios metabólicos. El flujo sanguíneo en el tejido adiposo subcutáneo es de 3 a 4 ml/100g/min, mucho mayor que la irrigación en tejido muscular (1.5 ml/100g * min), lo que indirectamente nos muestra la importancia de este tejido en el metabolismo. El tejido adiposo tiene la capacidad de sintetizar y secretar una gran diversidad de compuestos de diversa naturaleza química, con lo cual crea una red molecular de comunicación intercelular. A continuación se revisarán brevemente las principales moléculas sintetizadas por el tejido adiposo, su función metabólica y la participación de éstas en la fisiopatología de la obesidad. a) Moléculas participantes en el metabolismo de triglicéridos a1. Lipoprotein lipasa (LPL). Esta enzima regula el ingreso de los ácidos grasos libres que provienen de las lipoproteínas circundantes, al interior del adipocito, esta enzima por ende, se encuentra en al superficie celular. La expresión génica de LPL se encuentra disminuida en ratones con obesidad vísceral e hiperlipidemia postprandial (Hikita, Bujo et al. 2000). Lo anterior ha llevado a postular que la modulación en la actividad de LPL puede ser una estrategia para prevenir o para tratar la obesidad central (McCarty 2001). Otra alternativa terapéutica dirigida a modificar la actividad de LPL consistió en la administración de testosterona en hombres obesos, con lo cual se observó una disminución en la actividad de LPL así como la disminución de la obesidad vísceral (Marin 1995). a2. Proteína estimuladora de la acilación (ASP). Ésta es una proteína sérica con un peso aproximado de 14 kDa, que ejerce un potente efecto en la estimulación de la síntesis de ácidos grasos. A medida que la LPL introduce los ácidos grasos libres, se produce de manera simultanea la ASP, la cual, promueve la síntesis y el depósito de triglicéridos en el adipocito (Cianflone, Maslowska et al. 1999). Se ha observado que en la fase postprandial, la secreción de ASP y el aclaramiento de los triglicéridos circulantes ocurren de manera simultánea, lo que sugiere un efecto paracrino de esta proteína (Sniderman, Maslowska et al. 2000). 18 Se ha demostrado que la ASP se encuentra elevada en sujetos obesos diabéticos en comparación a sujetos diabéticos delgados (Yang, Lu et al. 2006) y se ha demostrado que algunos fármacos dirigidos al tratamiento de la diabetes tipo 2, específicamente las rosiglitazonas y la metformina disminuyen la concentración de ASP (Oktenli, Ozgurtas et al. 2007; Tahiri, Karpe et al. 2007). a3. Proteína de unión a ácidos grasos (FABP). Esta proteína se localiza en el citosol del adipocito y se expresa durante la diferenciación del mismo y su función principal es la de movilizar los ácidos grasos libres en la fase acuosa del citosol y dirigirlos a los organelos membranosos intracelulares, para su esterificación u oxidación posterior (Chmurzynska 2006). A la fecha, un polimorfismo en este gen (Ala54Trh), ha mostrado asociación con un incremento en el flujo de ácidos grasos de la dieta a la circulación, incremento en la circulación de insulina en ayunas, incremento en la oxidación de ácidos grasos y alteraciones en la captación de glucosa (Albala, Jimenez et al. 2006). b). Moléculas que participan en la coagulación sanguínea b1. Inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1). Aúnque esta proteasa dependiente de serina es producida principalmente en el hepatocito y en las células endoteliales, una fracción de ésta también es producida por el adipocito. PAI-1 es uno de los principales reguladores del sistema fibrinolítico. En individuos obesos se ha encontrado que existe una correlación importante entre la concentración circulante de PAI-1 y la cantidad de grasa vísceral. Como consecuencia de lo anterior, los sujetos obesos tienen más riesgo de desarrollar complicaciones tromboembólicas. También se sabe, que la disminución de peso correlaciona positivamente con la disminución del PAI-1 circulante (Alessi and Juhan-Vague 2006). Un estudio reportó que el factor de necrosis tumoral alfa (TNF- ) estimula la secreción de PAI, contribuyendo así, al incremento en su concentración. (Plomgaard, Keller et al. 2005). Finalmente, podemos decir que el incremento en la secreción y concentración circulante de PAI es sugerido como el mecanismo fisiopatológico que correlaciona a la 19 obesidad con los padecimientos cardiovasculares (Ma, Mao et al. 2004; Vaughan 2005; De Taeye, Novitskaya et al. 2006). c). Moléculas con función endocrina c1. Hormonas esteroideas. Se sabe que el tejido adiposo es un sitio extraglandular relevante en la producción de hormonas esteroideas. El TA posee dos enzimas importantes para el metabolismo de los esteroides sexuales: la 17 hidroxiesteroide óxido-reductasa y la aromatasa dependiente de citocromo P-450 (Yamada and Harada 1990; Bujalska, Walker et al. 2002). Actualmente, se sabe que algunas tiazolinedionas inhiben a estas enzimas y se postula que este es un mecanismo auxiliar durante el incremento en la sensibilidad a insulina (Arlt, Neogi et al. 2004). Por otro lado, se sabe que la androstenediona producida en corteza adrenal se convierte en testosterona por la óxido-reductasa y esta misma enzima convierte estrógenos y estrona en estradiol. La aromatización de andrógenos a estrógenos ocurre de manera importante en el TA. La enzima responsable de la conversión de androstenediona en estrona es la aromatasa, la cual incrementa su tasa de conversión con la edad y con la obesidad (Taxel, Kennedy et al. 2001). El TA produce, además, 11-hidroxiesteroide- deshidrogenasa, la cual tiene la función de ínter convertir cortisol y cortisona. Se ha observado un incremento en la expresión del gen de esta enzima en tejido adiposo vísceral, lo que sugiere que esta enzima contribuye a la presencia de obesidad androide (Mussig, Remer et al. 2008). c2. Angiotensinógeno. A través de la acción de la renina, el angiotensinógeno es convertido a angiotensina I, precursora de angiotensina II. Aúnque se sintetiza principalmente en hígado, también se ha encontrado expresión del RNAm en TA, aunque aún no se conoce su función fisiológica especifica en este tejido (Lu, Boustany-Kari et al. 2007). Algunos autores sugieren que interviene en el proceso de diferenciación del adipocito (Matsushita, Wu et al. 2006). En sujetos obesos se observa generalmente un incremento en la expresión de angiotensinógeno (Weisinger, Begg et al. 2007). Durante los periodos de inanición, disminuye la 20 expresión del mensajero, el cual se normaliza después de la ingestión de alimentos. En base a lo mostrado anteriormente, también se ha sugerido que el angiotensinógeno interviene en la regulación del tamaño de la reserva grasa durante alteraciones nutricionales (Jones, Standridge et al. 1997). d). Moléculas reguladoras del crecimiento del tejido adiposo d1. Receptor gamma activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR ). Los PPARs son factores transcripcionales, que pertenecen a la superfamilia de los receptores nucleares de hormonas (Heikkinen, Auwerx et al. 2007). En el TA, PPARG es el más abundante. Entre los ligandos conocidos para este factor podemos enumerar al ácido araquidónico y los ácidos grasos libres (Alaoui-ElAzher, Wu et al. 2002). PPAR modifica el patron de trascripción de diversos genes, entre los que podemos mencionar al gen del GLUT4, de la LPL, de la FABP y de la cRNAitin palmitoil transferasa (Lapsys, Kriketos et al. 2000). Se ha encontrado que PPAR induce apoptosis en los adipocitos con hipertrofia e induce la proliferación de los adipocitos de tamaño pequeño (efecto benéfico). La expresión del mensajero del PPAR en TA es inducida por insulina y por glucocorticoides. En seres humanos, se ha observado que la expresión del PPAR es modulada por el consumo energético y por el incremento en el consumo de grasas, lo cual sugiere que este factor interviene en la patogénesis de la obesidad. d2. Factor de crecimiento transformante beta (TGF ). Esta citocina es producida en diferentes linajes celulares, participa en al producción de proteínas de matriz extracelular y en los procesos de adhesión y migración celular. También tiene un papel fundamental en los procesos de crecimiento y diferenciación celular. En modelos animales de obesidad, se ha reportado un incremento en la expresión de TGF en el TA, donde estimula la proliferación de preadipocitos, con lo cual ayuda a incrementar la celularidad en los depósitos de grasa (Horie, Ono et al. 2008). También se ha observado que TGF incrementa la expresión del RNAm de PAI-1 en las células adiposas (Alessi, Bastelica et al. 2000). 21 Por estas observaciones se ha postulado que el TGF podría estar implicado en el fenotipo característico de la obesidad. d3. Factor de crecimiento insulinoide. El cortisol, la insulina y la hormona del crecimiento inducen en el preadipocito la expresión de IGF-1, al igual que la de su receptor. Este factor que activa la proliferación de preadipocitos y su diferenciación en adipocitos, actúa de manera autocrina y paracrina (Grohmann, Sabin et al. 2005). d4. Hormona del crecimiento (GH). Esta hormona es importante en la regulación del crecimiento corporal, la deficiencia de esta, causa alteraciones en la composición corporal, tanto en niños como en adultos, donde se observa un incremento en la acumulación de depósitos grasos subcutáneos y viscerales. Estas alteraciones se normalizan con la terapia hormonal correspondiente. El adipocito presenta en su superficie, receptores para GH, donde ejerce efectos metabólicos, como el incremento en la lipólisis y la inhibición de la captación de glucosa (Wei, Rhani et al. 2006). e). Moléculas reguladoras del sistema inmunológico e1. Interleucina 6 (IL-6). Esta citocina es producida bajo condiciones de estrés y tiene diversos efectos en diversos tejidos, incluyendo el cerebro, donde puede actuar como pirógeno endógeno, estimulando de manera indirecta la termogénesis en el organismo. Al existir receptores de IL-6 en el hipotálamo, se ha postulado que puede interferir en la vía de la leptina (Cintra, Ropelle et al. 2007). De manera interesante, se ha observado que esta citocina tiene una correlación positiva con el IMC (Qi, Zhang et al. 2007). Aproximadamente un tercio de la IL-6 circulante se produce en el tejido adiposo, donde tiene efectos autocrinos y paracrinos. IL-6 estimula el eje hipotalámico – pituitaria – adrenales, y reduce la expresión de LPL. La IL-6 secretada por el tejido omental llega directamente al hígado, donde incrementa la secreción hepática de triglicéridos, contribuyendo así a la hipertrigliceridemia que caracteriza a la obesidad vísceral (Chan, Cheung et al. 2002). 22 e2. Factor de necrosis tumoral alfa. (TNF ). El adipocito maduro del TA subcutáneo y visceral tiene la capacidad de secretar TNF en respuesta a la señalización inducida por los triglicéridos y los AGL (Good, Newell et al. 2006). La expresión de esta citocina se incrementa en sujetos obesos y la pérdida de peso correlaciona positivamente con una disminución en los niveles de RNAm de esta citocina. A la inversa, se puede observar una correlación positiva entre el incremento de la expresión de esta citocina y la ganancia de peso además de la hiperinsulinemia, debido a que estimula el eje hipotalámico – pituitaria – adrenales, y reduce la expresión de LPL, además de interferir en la vía de señalización de la insulina (Kern, Saghizadeh et al. 1995). Sin embargo, otros investigadores han obtenido resultados opuestos a lo anterior. Se ha observado que el TNF también estimula el eje hipotalamico – pituitaria – adrenales, y reduce la expresión de LPL, lo que impide que el tejido adiposo capte los triglicéridos de las lipoproteínas plasmáticas, lo que paradójicamente impide la hiperplasia del adipocito antiadipogénica del TNF (Hube and Hauner 1999). Otra característica es que activa la lipólisis, además de suprimir genes que codifican para proteínas que normalmente regulan la lipogenesis en el adipocito, tales como la sintetasa de ácidos grasos, la acetil coenzima A carboxilasa y la proteína aP2. Estos efectos antiadipogénicos de TNF se explican en base al efecto inhibitorio sobre la expresión de dos factores transcripcionales relevantes en la diferenciación del adipocito: la proteína que se une al sitio CAAT del C/EBP y PPAR- -2 (Hausman 2000). 1.5 ADIPONECTINA La adiponectina es una de las adipocinas (citocina producida por el tejido adiposo) más estudiadas en los últimos años. Alteraciones en esta adipocina han sido correlacionadas con obesidad, diabetes, alteraciones ateroscleróticas e incluso, cáncer de mama (Kaklamani, Sadim et al. 2008). El descubrimiento de esta adipocina se remonta a los años 1995 y 1996, cuando cuatro grupos pioneros, de manera independiente la clonaron y describieron utilizando metodologías distintas. El primer grupo en publicar sus resultados, fue el perteneciente al Instituto de 23 Tecnología de Massachussets dirigido por Phillip Scherer en 1995, cuando aislaron cDNA de ratón mediante técnicas de hibridación sustractiva, a partir de RNA expresado durante la diferenciación a adipocito de los fibroblastos 3T3-L1. A la proteína codificada por este mensajero se le denominó Acrp 30 ( Adipocyte complement – related protein of 30 kDa). Encontraron que esta proteína está compuesta básicamente por un segmento globular que presenta una elevada homología con el factor C1q del complemento en su extremo carboxilo terminal, mientras que el extremo amino terminal está formado por un dominio colágenoso rico en repeticiones aminoacídicas Gly-X-Pro. También mostraron que esta proteína se expresaba específicamente en tejido adiposo y que su concentración en suero oscila entre 5 μg/ ml y 40 μg/ ml (Scherer, Williams et al. 1995) (Scherer et al, 1995). El siguiente grupo en publicar sus resultados fue el dirigido por Maeda del Instituto de Biología Celular y Molecular de Osaka, ellos describieron la secuencia del cDNA y la estructura de la adiponectina humana a partir de técnicas de secuenciación en masa de bibliotecas de cDNA, y la denominaron apM1 (Adipose Most Abundant Gene Transcript 1). También observaron que esta proteína presenta gran homología secuencial y estructural con la proteína murina, además de que también se expresa de manera exclusiva en tejido adiposo (Maeda, Okubo et al. 1996). En este mismo año, Hu, investigador del Instituto Dana-Farber describió un gen que se expresaba de manera exclusiva en tejido adiposo, que notoriamente se encontraba disminuido en ratones y humanos obesos, en esta caso, este gen fue denominado AdipoQ (Hu, Liang et al. 1996). Finalmente, en este año se logró purificar a la adiponectina de plasma humano por técnicas de cromatografía de afinidad y fue posteriormente secuenciada, por un grupo de investigadores de la Escuela de Ciencias Farmacéuticas de Showa en Japón encabezado por Nakano, el cual la denominó GBP 28 (gelatin binding protein) (Nakano, Tobe et al. 1996). Estructura de la adiponectina La adiponectina humana es codificada por el gen ADIPOQ, el cual se localiza en la banda 27 del brazo largo del cromosoma 3 (Takahashi, Arita et al. 2000). El gen 24 tiene una extensión aproximada de 17 kb y estructuralmente esta formado por 3 exones y 2 intrones. Esta proteína pertenece a la superfamilia de las proteínas solubles que son homólogas a los colágenos VIII y X y al factor del complemento C1q. La adiponectina humana, tiene una secuencia de 247 aminoácidos y un peso molecular de 30 kDa. Estructuralmente, la adiponectina posee 4 dominios, un extremo amino terminal donde se encuentra la secuencia señal (que permite la secreción de esta adipocina), una región sin homología, un dominio colagenoso y en su extremo carboxilo terminal, tiene un dominio globular (Scherer, Williams et al. 1995). Mediante cristalografía, se ha determinado que el dominio globular de la adiponectina presenta una elevada homología estructural con el TNFα (Shapiro and Scherer 1998). La adiponectina forma un homotrímero con una topología característica y en la que el extremo amino terminal y el carboxilo terminal se encuentran próximos. Después de ser traducida, esta adipocina es objeto de modificaciones posttraduccionales, que incluyen la O-glucosidación con ácido disiálico (Sato, Yasukawa et al. 2001), la hidroxilación y la glucosilación de cuatro residuos de lisina conservados en la región amino terminal formada por el dominio colágeno. Se ha observado que si estos residuos de lisina se sustituyen por arginina disminuyen sus efectos, esto puede ser un mecanismo de regulación de esta adipocina. (Wang, Xu et al. 2002). Los monómeros de adiponectina forman homotrimeros y estructuras más complejas mediante la formación de puentes disulfuro. Estas estructuras complejas incluyen a la adiponectina de bajo peso molecular (LMW), formada por hexámeros de un peso aproximado de 180 kDa, y la adiponectina de alto peso molecular (HMW) de un peso aproximado de 400 kDa, compuesta por 12-18 monómeros (Figura 2). Se ha demostrado, tanto in vitro como in vivo, que los adipocitos pueden secretar tanto HMW como LMW. Ambas formas multiméricas se encuentran de manera predominante en suero, mientras que los trímeros se encuentran en baja concentración. Se ha analizando el efecto farmacológico de los diversos componentes estructurales de la adiponectina. El dominio globular aislado 25 mediante digestión con proteasas, fue el primero en ser utilizado en experimentación terapéutica. Esto ha generado controversia ya que excepto el grupo de investigación dirigido por Fruebis, nadie ha demostrado la presencia de este dominio globular en humanos ni en animales (Fruebis, Tsao et al. 2001; Yamauchi, Kamon et al. 2001). En un modelo in vitro, se mostró que una línea celular monocítica secreta una elastasa que genera adiponectina globular (Waki, Yamauchi et al. 2005). Figura 2. Diversos multímeros de adiponectina. Se muestra la conformación de los multimeros de adiponectina, así como su patrón de bandeo en un gel de acrilamida, donde se ilustran la adiponectina de bajo peso molecular (LMW), adiponectina de peso medio molecular (MMW) y finalmente, la adiponectina de alto peso molecular (HMW). Tomado de (Kadowaki and Yamauchi 2005). La función de la adiponectina depende de la oligomerización de la misma (Tsao, Murrey et al. 2002), experimentos con las diversas formas mutantes recombinantes de adiponectina que sólo pueden generar la forma trimérica, han mostrado que el trímero es la molécula que posee la mayor actividad biológica (Pajvani, Du et al. 2003). 26 Receptores de adiponectina En el 2003, T Kadowaki y T Yamauchi de la universidad de Tokio, reportaron la clonación de 2 receptores de adiponectina (AdipoR1 y AdipoR2). (Yamauchi, Kamon et al. 2003). Estructuralmente se caracterizan por presentar siete dominios transmembranales sin tener relación funcional alguna con las proteínas G. Se ha observado que en ratón ambos receptores se expresan de manera ubicua, con AdipoR1 de manera abundante en músculo esquelético, mientras que AdipoR2 se expresa principalmente en hígado. La forma globular de la adiponectina se une principalmente a AdipoR1 y la forma completa se une a AdipoR2. Sin embargo, AE Cevitaresse y E Ravussin del Centro de Investigación Biomédica de Pennington USA mediante RT-PCR y Northern Blot demostraron que en el músculo de humanos no existe esta diferencia en el patrón de expresión en sujetos México-Americanos sanos (Civitarese, Jenkinson et al. 2004). Tambien HF Lodish y C Hug demostraron que la adiponectina recombinante se une a T-cadherina, sin embargo, aún no se ha establecido la relevancia biológica de este hecho (Hug, Wang et al. 2004). Mecanismos de acción de la adiponectina A pesar de que se conocen los efectos de la adiponectina en el organismo, los mecanismos de acción aún no son del todo claros. El conocimiento parcial de lo anterior se resume en lo siguiente: La adiponectina puede regular la fosforilación de tirosinas del receptor de insulina, (Stefan, Vozarova et al. 2002) y disminuir su fosforilación en serinas, (Wang, Mao et al. 2007) lo cual nos muestra un efecto directo de la adiponectina en la cascada de señalización a insulina. Un hecho que refuerza este concepto es que en el ratón genosuprimido para el gen de adiponectina sometido a una alimentación rica en lípidos y en carbohidratos, se observa un incremento en la resistencia a insulina y una menor fosforilación del sustrato del receptor de insulina (IRS-1), lo cual se puede asociar a un descenso en la actividad de la fosfatidil inositol 3 cinasa (PI3-K)(Maeda, Shimomura et al. 2002). Los datos anteriores demuestran 27 el efecto benéfico de la adiponectina en la sensibilización de las células frente a la insulina, sin embargo, este no es el único mecanismo relacionado. Varios autores han relacionado el efecto sensibilizador a insulina de la adiponectina con el incremento en la oxidación de ácidos grasos (Fruebis, Tsao et al. 2001). Esto es debido a un aumento en la actividad de la cinasa dependiente de AMPc (AMPKc) (Yamauchi, Kamon et al. 2002), así como un incremento en la expresión del PPAR (Yamauchi, Kamon et al. 2003). Cuando la adiponectina activa a AMPK ocurre la fosforilación de la acetil-coA carboxilasa (ACC), lo que incrementa la oxidación de ácidos grasos, la captación de glucosa y la producción de lactato en el músculo esquelético, mientras que en hígado la activación de AMPK promueve la fosforilación de ACC, así como una disminución en la expresión de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPCK) y de glucosa-6- fosfatasa (G-6-Pasa) que disminuye el proceso de gluconeogénesis en este órgano (Combs, Wagner et al. 2002; Yamauchi, Kamon et al. 2002). Desde el punto de vista farmacológico, se han realizado diversos estudios de la administración exógena de adiponectina en modelos murinos. Estos ensayos se han enfocado a administrar ya sea la parte globular de la adiponectina o la adiponectina completa. Fruebis y Lodish obtuvieron el fragmento globular mediante la digestión con tripsina de adiponectina recombinante bacteriana. Ellos observaron que al administrar tanto el fragmento globular como la proteína completa ocurre una disminución de los niveles circulantes de glucosa, ácidos grasos y triglicéridos, estos resultados también han sido observados por otros grupos. (Fruebis, Tsao et al. 2001; Yamauchi, Kamon et al. 2001). Estos efectos se han atribuido in vitro, al incremento en la captación de glucosa y a la oxidación de ácidos grasos en las células musculares mediante la activación de AMPK (Fig. 3) (Tomas, Tsao et al. 2002; Yamauchi, Kamon et al. 2002). También se ha postulado que el incremento en la oxidación de los lípidos en el músculo conlleva a una mejora en la sensibilidad a la insulina a nivel sistémico. Comparando los efectos de la administración de los diversos segmentos de la adiponectina, se ha observado un mayor efecto de la adiponectina globular en el músculo esquelético, teóricamente, esto podría ser debido que el dominio globular 28 al ser más pequeño, puede interaccionar de manera más fácil con su receptor (Shapiro and Scherer 1998). A diferencia del músculo, en el hígado la forma completa de la adiponectina tiene un mayor efecto que la forma globular. Algunos estudios realizados con adiponectina sintetizada en mamíferos, han mostrado que es en el hígado y no en el músculo, donde esta adipocina ejerce principalmente su actividad (Berg, Combs et al. 2001) (Fig 4). La administración de adiponectina LMW y HMW obtenida en un sistema de expresión de mamífero in vitro a ratones normales, diabéticos u obesos conduce a una disminución en los niveles de glucosa circulante,(Berg, Combs et al. 2001). Figura 3. Mecanismo de acción de la adiponectina en músculo. La adiponectina ejerce sus efectos biológicos interaccionando con su receptor AdipoR1 en músculo, incrementando el metabolismo lipídico Modificado de (Kadowaki and Yamauchi 2005). 29 Figura 4. Mecanismo de acción de la adiponectina en hígado. La adiponectina ejerce sus efectos biológicos interaccionando con su receptor AdipoR2 en hígado, disminuyendo la gluconeogénesis y disminuyendo la lipogenesis. Modificado de (Kadowaki and Yamauchi 2005) Las modificaciones postraduccionales de la adiponectina juegan un papel fundamental en la función que puede ejercer esta adipocina, en el 2002, Wang y col, demostraron que para que la adiponectina ejerza su efecto en el hígado, requiere de una hidroxilación y glucosilación previa en el dominio colagenoso (Wang, Xu et al. 2002). Esto podría explicar porque los experimentos realizados con adiponectina recombinante no afectan la producción de glucosa o la sensibilidad a la insulina en el hígado. De manera global, los experimentos realizados con adiponectina completa han demostrado que los efectos observados en los diversos tejidos no se asocian a la adiponectina HMW o a la LMW, sino a la proporción de ambos complejos (Pajvani, Hawkins et al. 2004). 30 Patologías asociadas a la adiponectina 1. Obesidad Como ya se mencionó, la adiponectina se produce principalmente en el tejido adiposo, lo que llevaría a suponer que en una persona obesa, la concentración de adiponectina circulante es mayor, paradójicamente esto no es así (Hu, Liang et al. 1996; Arita, Kihara et al. 1999). Esta relación inversa entre la concentración de adiponectina circulante y la grasa corporal se observa también en individuos con niveles de grasa corporal muy bajos, como en personas anoréxicas, las cuales muestran niveles elevados de esta adipocina (Delporte, Brichard et al. 2003; Pannacciulli, Vettor et al. 2003). A nivel poblacional, se ha demostrado una relación inversa entre la expresión del RNAm de adiponectina o sus concentraciones en suero con el IMC (Arita, Kihara et al. 1999; Weyer, Funahashi et al. 2001). Esta correlación es mayor si se correlaciona la cantidad de adiponectina (proteína o transcrito) con la cantidad de grasa corporal, que se puede medir mediante impedancia bioeléctrica o tomografía computarizada (Kern, Di Gregorio et al. 2003). De manera interesante, se ha encontrado que las concentraciones plasmáticas de adiponectina presentan un dimorfismo sexual, es decir, existen normalmente concentraciones diferentes de esta adipocina entre machos y hembras. La concentración de adiponectina total y HMW son superiores en hembras. Esto resulta más sorprendente aún, ya que las hembras presentan normalmente una mayor cantidad de grasa corporal respecto a los machos con el mismo IMC. En este caso, las diferencias en la cantidad de grasa corporal no explican este dimorfismo sexual, lo que conduce a pensar que existen otros factores que regulan la cantidad de adiponectina circulante (Combs, Berg et al. 2003). Cuando ocurre un incremento en el peso corporal en primates, se observa una disminución proporcional de la cantidad de adiponectina circulante (Hotta, Gustafson et al. 1998). Este proceso es reversible, tal como se ha mostrado en pacientes humanos sometidos a cirugía bariátrica (Yang, Lee et al. 2001; Faraj, Havel et al. 2003). Cabe mencionar que este incremento en las concentraciones de adiponectina se acompaña de un incremento en la sensibilidad a la insulina. 31 La reducción en el peso corporal mediante una dieta hipocalórica incrementa los niveles de insulina y mejora la sensibilidad a la misma (Bruun, Lihn et al. 2003). De manera más específica, se ha observado que la adiponectina correlaciona inversamente de manera más estrecha con los niveles de grasa abdominal que con los niveles de grasa subcutánea (Cnop, Havel et al. 2003; Gavrila, Chan et al. 2003) Análisis en tejido adiposo de sujetos delgados y obesos han demostrado que los primeros presentan niveles más altos de adiponectina y de su RNAm que los sujetos obesos en el tejido adiposo omental en comparación con el tejido subcutáneo (Statnick, Beavers et al. 2000; Fisher, McTernan et al. 2002). 2. Resistencia a la insulina Existe un consenso general que postula que la adiponectina estimula la sensibilidad a la insulina disminuyendo la producción hepática de glucosa. Se ha observado una fuerte correlación entre los niveles de adiponectina y la supresión basal de la producción de glucosa mediada por insulina (Stefan, Stumvoll et al. 2003). También se ha mostrado que la hipoadiponectinemia se asocia con la resistencia a la insulina en humanos (Weyer, Funahashi et al. 2001; Kern, Di Gregorio et al. 2003), la resistencia a la insulina en diabetes gestacional, la diabetes tipo 2 y la lipodistrofia asociada al VIH (Kosmiski, Kuritzkes et al. 2003; Ranheim, Haugen et al. 2004). Se ha mostrado que niveles bajos de adiponectina predicen el riesgo al desarrollo de diabetes tipo 2, incluso, en ausencia de otros marcadores de resistencia a la insulina, como un incremento en el IMC ó la concentración de hemoglobina glucosilada (Lindsay, Funahashi et al. 2002; Spranger, Kroke et al. 2003). Otras evidencias de la relación entre la adiponectina y la sensibilidad a la insulina son los efectos de la insulina sobre los niveles de adiponectina circulante. Se ha demostrado in vivo que la sensibilidad a la insulina diminuye los niveles de adiponectina tanto en humanos como en ratones (Combs, Berg et al. 2001). Lo mismo se ha observado en estudios in vitro, al tratar adipocitos con insulina (Fasshauer, Klein et al. 2000; Halleux, Takahashi et al. 2001). 32 Por otro lado, se ha encontrado que los pacientes diabéticos tipo 1, los cuales se caracterizan por tener bajos niveles de insulina, presentan niveles mayores de adiponectina (Imagawa, Funahashi et al. 2002). Estos datos nos muestran que la hiperinsulinemia podría tener un impacto negativo en los niveles de adiponectina circulante, lo cual llevaría a resistencia a la insulina. También lo anterior, conduce a un circulo vicioso que no permite aclarar si los niveles bajos de adiponectina preceden a la resistencia a la insulina o viceversa. Sin embargo, un estudio realizado en primates mostró que el descenso en los niveles de adiponectina precede al desarrollo de hiperinsulinemia (Hotta, Gustafson et al. 1998; Hotta, Funahashi et al. 2001). Estas evidencias que relacionan a la hipoadiponectinemia con el desarrollo de resistencia a la insulina y la diabetes vienen además confirmadas, por estudios genéticos. En estos estudios, se ha demostrado la asociación entre diferentes polimorfismos, que provocan hipoadiponectinemia, con el desarrollo de resistencia a la insulina y por consecuencia, de diabetes. 3. Aterosclerosis Existe evidencia importante que muestra que la adiponectina tiene un efecto protector ante el desarrollo de aterosclerosis. Ratones modificados genéticamente o genosuprimidos, en este caso, para el gen de adiponectina presentan un mayor engrosamiento de la neointima en respuesta a daño vascular inducido (Kubota, Terauchi et al. 2002). También se ha observado que la inducción de la expresión de adiponectina en ratones apoE-/-, los cuales tienden al desarrollo de lesiones ateroscleróticas, conduce a una menor susceptibilidad a desarrollar esta enfermedad (Okamoto, Kihara et al. 2002). Existen diversas explicaciones que fundamentan lo anterior. Se ha postulado, que la adiponectina ejerce su efecto protector gracias a su capacidad para disminuir los factores de adhesión vascular en células endoteliales (Ouchi, Kihara et al. 1999). También, se ha descrito que la adiponectina tiene la capacidad de inhibir la formación de células espumosas, así como la migración de estas al músculo liso (Arita, Kihara et al. 2002; Matsuda, 33 Shimomura et al. 2002) y ejerce efectos antiinflamatorios en macrófagos (Yokota, Oritani et al. 2000). También, la adiponectina puede ejercer sus efectos antiaterogénicos a través de la modulación del metabolismo de los lípidos. Clínicamente, se ha demostrado que los niveles de adiponectina están correlacionados de manera inversa con los niveles en sangre de triglicéridos y de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), y de manera directa con las lipoproteínas de alta densidad (HDL) (Hotta, Funahashi et al. 2000; Hulthe, Hulten et al. 2003). De manera importante, resta mencionar que la hipoadiponectinemia podría explicar en parte el porqué algunos grupos étnicos tienen más tendencia a desarrollar diabetes tipo 2 y enfermedades coronarias (Degawa-Yamauchi, Dilts et al. 2003; Hulver, Saleh et al. 2004; Retnakaran, Hanley et al. 2004). Variaciones polimorficas en el gen ADIPOQ y su asociación con alteraciones metabólicas En el 2002, se reporta por vez primera el efecto de los SNPs T45G y G276T sobre la susceptibilidad al desarrollo de DT2 en población japonesa, donde se observó que los sujetos portadores del genotipo G/G para la primera variación tuvieron un riesgo superior a los demás grupos de desarrollar DT2. También se demostró que los portadores del genotipo G/G para la segunda variante mencionada tuvieron elevada resistencia a la insulina y bajas concentraciones de adiponectina plasmática respecto a los controles (Hara, Boutin et al. 2002). Estos resultados fueron replicados en población caucásica, donde observaron un efecto aditivo del haplotipo de ambas variantes sobre el desarrollo de resistencia a la insulina, mayor obesidad, elevada presión sistólica y diastólica, además de presentar bajas concentraciones de colesterol HDL en plasma (Menzaghi, Ercolino et al. 2002). También en este año, se reportó la asociación de variaciones polimórficas en la región promotora y el exón 3 del gen codificante para adiponectina con bajas concentraciones plasmáticas de adiponectina y con predisposición al desarrollo de DT2 (Vasseur, Helbecque et al. 2002). 34 En el 2004, se evaluó el efecto de la presencia de los SNPs T45G y G276T en población italiana. Aquí se observó que el SNP T45G no mostró asociación significativa con un incremento en la resistencia a la insulina, sin embargo, el SNP G276T mostró asociación con el incremento del IMC y con el aumento en la resistencia a la insulina (Filippi, Sentinelli et al. 2004). En este mismo año, se demostró que las mujeres portadoras del genotipo C/C del SNP A-4034C presentaron un menos riesgo de desarrollar DT2 en comparación con las portadores del genotipo A/A (Hu, Doria et al. 2004). En suizos, se demostró que los portadores de los genotipos C/C y G/G para el SNP G-11377C tenían un mayor IMC en comparación con los portadores del genotipo C/C (Gu, Abulaiti et al. 2004). Las mutaciones reportadas hasta ese momento, no modifican el patrón de aminoácidos de la proteína, sin embargo, también en el 2004, se reportó que la mutación I164T disminuía las concentraciones plasmáticas de adiponectina, además de ser un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares en población japonesa (Ohashi, Ouchi et al. 2004). En el 2005, se reportó la asociación de los SNPs T45G y G276T con un incremento en el riesgo a desarrollar DT2 en población finlandesa. Esta asociación fue más significativa en las mujeres que en los hombres de este país (Zacharova, Chiasson et al. 2005). Otro artículo publicado muestra que los hombres finlandeses portadores del genotipo T/T del SNP G276T tuvieron la presión diastólica sanguínea más elevada en comparación a los otros genotipos de la misma variante (Mousavinasab, Tahtinen et al. 2006). Un proyecto enfocado a determinar si las variaciones T45G y G276T ejercen algún efecto sobre la preclamsia, demostró que las mujeres portadoras del genotipo T/T para el SNP G276T presentaron menos probabilidad de desarrollar esta complicación durante el embarazo en comparación a las mujeres con los otros genotipos para esta variante. Además se demostró que las mujeres con el haplotipo G-G para ambas variaciones tienen más riesgo de preclamsia que los controles para este haplotipo (Saarela, Hiltunen et al. 2006). 35 En el 2005 también se reporto el efecto sinérgico de los SNPs G-11391A y C11377G con bajos niveles plasmáticos de adiponectina y con una baja sensibilidad a la insulina en franceses con obesidad mórbida (Vasseur, Helbecque et al. 2005). Un estudio realizado en población coreana, demostró que los SNPs T45G y G276T no se asociaron de manera significativa con resistencia a la insulina o con concentraciones plasmáticas de adiponectina (Lee, Lee et al. 2005). También en el 2005, se publicó el primer estudio realizado en familias hispánicas radicadas en USA, donde se observó que la inserción CA-11156 y otros 13 SNPs analizados en la región promotora correlacionaron con la presencia de obesidad y con la acumulación de grasa (Sutton, Weinert et al. 2005) . Un estudio realizado en población diabética coreana demostró que los portadores del genotipo G/G para el SNP G276T responden con menos eficacia a la reducción de glucosa plasmática en ayunas mediante la administración de rosiglitazonas comparados con el grupo control, lo que sugiere que las variaciones genéticas en el gen ADIPOQ pueden afectar la eficacia de los tratamientos farmacológicos enfocados a controlar las complicaciones ocasionadas por la DT2 (Kang, Park et al. 2005). En población española, los SNPs T45G y G276T muestran asociación significativa con bajos niveles de adiponectina plasmática y con intolerancia a la glucosa (Gonzalez-Sanchez, Zabena et al. 2005). En el 2006, se demostró la asociación del SNP A-11391G con altos niveles de adiponectina en niños obesos franceses, lo que sugiere una participación de la hiperadiponectinemia en la ganancia de peso. Complementando este estudio poblacional, los investigadores demostraron que esta variante incrementa la actividad del gen ADIPOQ in vitro (Bouatia-Naji, Meyre et al. 2006). En este mismo año, se realizó un estudio en niños italianos, que demostró que los SNPs G-11391A y G-11377G predisponen a una mayor concentración de glucosa e insulina en ayunas y por ende al incremento en la resistencia a la insulina, así como una mayor concentración de triglicéridos y una baja concentración de adiponectina (Petrone, Zavarella et al. 2006). Un estudio realizado en mujeres coreanas, demostró que las portadoras del genotipo G/G para el SNP T45G tienen una menor densidad mineral ósea lumbar 36 que las mujeres con las otras variantes, lo cual nos muestra la influencia de la adiponectina en el posible desarrollo de complicaciones óseas (Lee, Rhee et al. 2006). También se demostró en este año que los caucásicos portadores del alelo A en la variante ADIPOQ_prom2GA tenían un riesgo mayor de padecer nefropatía diabética en comparación al grupo control (Vionnet, Tregouet et al. 2006). En este año, se estudiaron las variables A-10069G y C-19169T en MéxicoAmericanos radicados en Texas y se demostró la asociación de estas variantes polimórficas con el incremento en el IMC (Richardson, Schneider et al. 2006) Ya en el 2007, se demostró que los hombres austriacos portadores del genotipo C/C del SNP C-11377G tenían mayor prevalencia de estenosis coronaria, bajas concentraciones de adiponectina plasmática y de manera prospectiva, un mayor número de eventos vasculares en comparación con los sujetos control (Hoefle, Muendlein et al. 2007). También en este año, se demostró que los japoneses portadores del genotipo G/G en el SNP G276T, tenían una menor capacidad de mejorar sus concentraciones de adiponectina en respuesta al entrenamiento físico diario en comparación con los sujetos con los genotipos G/T y T/T (Huang, Tada Iida et al. 2007). En el 2008, se reportó la asociación de variantes polimorficas en el gen ADIPOQ y en su receptor ADIPOR1 con el riesgo de desarrollar cáncer de mama (Kaklamani, Sadim et al. 2008) y cáncer colorrectal (Kaklamani, Wisinski et al. 2008). 37 1.6 JUSTIFICACIÓN La obesidad en la edad infantil incrementa el riesgo de aparición de comorbilidades como: diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, hipertensión arterial y aterosclerosis, entre otras. Alteraciones metabólicas e inmunológicas diversas presentes en estas patologías son consecuencia de alteraciones en la expresión o concentración de la proteína adiponectina, codificada por el gen ADIPOQ. Actualmente, se reconoce el efecto de varios SNPs en el gen ADIPOQ en la predisposición a padecer obesidad, resistencia a la insulina, diabetes tipo 2 y aterosclerosis en población negra, caucásica y oriental. En base a lo anterior, resulta evidente que el análisis de las variaciones genéticas en el gen ADIPOQ nos permitirá identificar un posible factor de susceptibilidad al desarrollo de obesidad en la población infantil mexicana. 38 1.7 HIPÓTESIS Los polimorfismos T45G, G276T, C-19169T y A-10069G en el gen ADIPOQ se asocian de manera significativa a la presencia de obesidad en una muestra de la población infantil mexicana. 1.8 OBJETIVOS Objetivo general Determinar la relación existente entre los posibles polimorfismos en el gen ADIPOQ y la presencia de obesidad en una muestra de niños mexicanos. Objetivos particulares • Detectar la presencia de polimorfismos en el gen ADIPOQ. • Demostrar la asociación existente entre los polimorfismos localizados y la presencia de obesidad. • Determinar el riesgo relativo al desarrollo de obesidad en función de la carga genética presente. 39 2.0 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio Se trabajó con la ciudad de San Luís Potosí en el estado de San Luis Potosí y con la ciudad de León en Guanajuato. Los infantes seleccionados provinieron de escuelas primarias públicas seleccionadas de manera aleatoria en las ciudades ya mencionado. Este estudio fue de casos y controles, por lo que al inicio se reclutó un niño obeso por cada niño de peso normal. Los casos fueron niños con un percentil de obesidad mayor o igual a 95, ajustado en función del género y la edad del infante. Los controles fueron niños con un percentil ajustado por edad y género menor a 75 (www.cdc.gov/ 2000). Tamaño de la muestra Para el polimorfismo del gen se han descrito prevalencias desde 10% hasta 37% y se ha informado una razón de momios desde 1.4 hasta 2.37 veces. El número de sujetos participantes se obtuvo usando la siguiente fórmula considerando un 95% de confianza (1-α): n Z 21 α/2 1/ P1 (1 P1 ) 1/ P2 (1 P2 ) ln 2 (1 ε) En donde: P1 Probabilidad de tener el gen candidato si se es caso. 37% P2 Probabilidad de tener el gen candidato si se es control. 10% 2.37 Razón de posibilidades (Odds ratio anticipado) 2.37 Z1- α/2 Nivel de confianza: (0.05) 1.96 Ε Precisión relativa 0.03 Aplicando los parámetros mencionados se obtuvo un tamaño de muestra de 470 niños para cada grupo de estudio, casos y controles que serán la muestra total independientemente de la cantidad de niños invitados a participar. 40 Criterios de selección Criterios de inclusión. Niños aparentemente sanos, de cualquier sexo, con edades de 6 a 12 años, que acudan a una escuela primaria de la Secretaría de Educación Pública cuyo percentil de obesidad fue menor a 75 o mayor al percentil 95 ajustado para su edad y género. Criterios de no inclusión. Niños que al momento del estudio se encontraron con: 1) alguna enfermedad infecciosa aguda que modificaría el patrón de citocinas. 2) que cursaron con alguna enfermedad crónica como alergias y enfermedades autoinmunes y 3) que estuvieron participando en un programa de reducción de peso, con o sin tratamiento farmacológico. La estrategia de trabajo fue la siguiente: Etapa I. 1. Se obtuvo el permiso de las autoridades de la Secretaría de Educación Pública, para trabajar en las escuelas. 2. Se obtuvo el asentimiento del (a) director (a) de la escuela. 3. Se elaboró conjuntamente con las autoridades de la escuela un plan para realizar la intervención. 4. Se realizó una junta con los padres para información de los propósitos del estudio y de los procedimientos que se hicieron con sus hijos, los cuales se describen en el punto 6, de esta misma lista. Se explicó la importancia de que den por escrito el permiso para que sus hijos participaran, firmando lo que se llama Carta de Consentimiento Informado. 5. Se envió a los padres de familia con cada uno de sus hijos, el cuestionario de Identificación y datos generales, así como de las Cartas de Consentimiento Informado para su firma. 6. Se programó el día en que se hicieron las mediciones, de los niños cuyos padres dieron su consentimiento. 41 a. Peso y composición corporal por impedancia b. Estatura c. Circunferencia de cintura d. Presión arterial 7. Se envió a los padres una semana después, una carta que informó la condición nutricia de su hijo y su presión arterial. Etapa II 1. Se envió una carta personalizada a los padres de niños cuyo IMC fué <75 o ≥95 en cada uno de los grados escolares (1º-6º), para invitarlos a participar en este estudio explicando los motivos de la invitación. En esta misma carta se convocaron a una junta informativa que se realizó en la escuela. Cuando fue necesario, se llamó telefónicamente para ratificar la invitación. 2. Conjuntamente con las autoridades de la escuela, se convocó a los padres de familia a una nueva junta que se realizaron en la escuela, para: a. Información y explicación detallada tanto oral como escrita de los procedimientos que se realizaron en los niños. El propósito fué informar a los padres los objetivos del estudio así como los procedimientos que se realizaron, las molestias y los posibles beneficios del estudio. Para este propósito se hizo una presentación usando una computadora y se entregó un díptico. b. Invitación formal a los padres para la participación de sus hijos en el estudio, obteniendo la firma de la Carta de Consentimiento Informado 2. En esta carta se mencionaron con detalle los procedimientos, destacando la toma de muestra de sangre de 12 ml, para la que se requirió un ayuno de 12 h, lo que significó no tomar alimento desde las 20 h del día anterior. c. Invitación formal a los niños y obtención de Carta de Asentimiento. 42 Etapa III En la fecha programada se citó en la escuela a padres y a los niños que reunieron los requisitos de participación previo consentimiento informado de la fase II, para lo siguiente: Obtención de 20 ml de sangre, usando tubos vacutainer, verificando que el niño estuviera en ayuno de 12 horas. La muestra de sangre se conservó en frío, hasta separar el suero y plasma, los cuales se utilizaron para analizar el perfil bioquímico de los infantes. Del paquete globular se extrajo DNA mediante el uso de columnas QIAGEN®. Se cuantificó la concentración de DNA y su pureza mediante espectroscopia UV a 260 nm y 280 nm. Se verificó la integridad del DNA mediante geles de agarosa. Definición de variables Variables dependientes: condición nutricia (normalidad u obesidad general y central) y distribución de grasa corporal. Concentraciones plasmáticas de glucosa, colesterol total, LDL, HDL, triglicéridos y presión arterial sistólica y diastólica. Variables independientes: polimorfismos del gen ADIPOQ, estilo de vida (dieta habitual y ejercicio), antecedentes de diabetes e hipertensión arterial en los padres. Variables de confusión: edad y sexo. Descripción operativa de las variables Condición nutricia normal u obesidad: El peso se midió en una báscula marca Seca con precisión de 0.1 kg, y la talla con una estadímetro con precisión de 0.1 cm, siguiendo procedimientos estandarizados de uso internacional. Con estos datos se calculó el IMC (kg/m2) y se clasificó a los niños de acuerdo a su percentil de IMC tomando como referente las tablas del CDC 2000. Se clasificó como condición nutricia normal si el IMC del niño es < del percentil 75. Se clasificó como obeso al niño cuyo IMC sea ≥ del percentil 95. 43 Circunferencia de cintura. Se midió colocando una cinta métrica sobre una línea que se encuentre en el punto medio entre la cresta iliaca anterior y superior y el borde costal inferior, al final de una espiración normal, subiendo al niño o niña sobre un banco antropométrico de 60 cm de altura para que coincidan la altura de la cinta con la altura de los ojos del lector, con el propósito de evitar errores de paralaje. Presión arterial. Con un esfingomanómetro de mercurio se obtuvo en el brazo derecho 4 mediciones de la presión arterial. Se tomaron después de 5 minutos de reposo, estando el niño sentado y con los pies apoyados. Entre una y otra medición hubo al menos un minuto de diferencia. El valor de la presión arterial sistólica y diastólica, fué el promedio de las últimas tres. Antecedentes heredo familiares. Estos se recabaron sólo en línea directa incluyendo abuelos maternos, paternos y padres relacionados con obesidad, DT2, cardiopatía isquémica e hipertensión arterial. Identificación de SNP´s en los genes asociados con fenotipo de obesidad Aislamiento del DNA genómico. El aislamiento del DNA se hizo de las células mononucleares de sangre periférica por el método basado en la separación selectiva del DNA en columnas (QIAamp DNA Blood Midi/ Kit, Qiagen, Alemania). La integridad, pureza y concentración se evaluaron por espectrofotometría a 260/280 nm y fraccionamiento electroforético en geles de agarosa al 1.0 % teñidos con bromuro de etidio. Detección de SNP´s. Los SNPs en el gen ADIPOQ, fueron detectados por fluorescencia utilizando tecnología de Applied Biosystems (www.appliedbiosystems.com), haciendo uso del equipo ABI Prism 7900HT y sondas TaqMan que detectan el alelo 1 o el alelo 2. Los datos se analizaron por medio del software del equipo para obtener frecuencia de homocigotos para alelo 1 ó 2 o heterocigotos 1,2. 44 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Análisis exploratorio. Se efectuó un análisis exploratorio con todas las variables a fin de identificar la naturaleza de su distribución. Aquellas variables continuas que no tuvieron una distribución normal serán sometidas a distintas transformaciones hasta obtener una distribución normal, cuando esto no fue posible se analizaron con métodos no paramétricos. Para los datos obtenidos de SNP´s se evaluó si existe equilibrio de Hardy–Weinberg con el programa Popgene v1.32 (University of Alberta, Canada). Análisis descriptivo. Se elaboraron tablas y gráficos con medidas de resumen (proporciones e intervalos de confianza al 95%, para datos categóricos, promedios y desviación estándar o sus equivalentes no paramétricos, medianas e intervalos intercuartílicos) de toda variable incluyendo, frecuencias génicas y alélicas de los SNP´s desagregadas por género y edad, de acuerdo con el IMC en las 2 categorías (normal y obesidad). Comparación divariada. Se determinó el grado de asociación de los distintos SNP´s comparando proporciones en sujetos con IMC normal y anormal, estimado la razón de momios y su correspondiente intervalo de confianza al 95%. Además se compararon los resultados de las mediciones bioquímicas entre los sujetos según su condición nutricia, usando pruebas “t” de Student y análisis de varianza de dos vías (o equivalentes no paramétricos, Mann-Whitney o Kruskal-Wallis). Se estimó la correlación entre el IMC y el perímetro de la cintura con los datos de laboratorio, por el coeficiente de correlación de Pearson. Análisis multivariado. Se construyeron modelos que permitan analizar en forma conjunta el efecto de las diferentes variables que participan en este problema de salud. En estos se integraron los distintos SNP´s, los estilos de vida y la historia familiar de obesidad y DT2 los cuales se analizaron mediante regresión logística. En el modelo se integraron también los resultados del perfil bioquímico, presión arterial, IMC y perímetro de la cintura. Todos estos análisis se llevaron a cabo con el programa SPSS (SPSS Inc, Chicago Ill.). Se consideraron significativos los valores de p < 0.05. 45 3.0 RESULTADOS A) Recolección de infantes y características bioquímicas y antropométricas de los mismos. El numero total de infantes estudiados fue de 531, siendo 243 de San Luís Potosí y 288 de León, Guanajuato. Las características antropométricas y bioquímicas de los niños se muestran en la siguiente tabla: Tabla1. Comparación de las características bioquímicas y antropométricas de los niños participantes por estado de origen. Los datos se presentan como media desviación estándar. La prueba estadística realizada fue T de Student. San Luis Potosí Género 79 M / 91 H Delgados Guanajuato Obesos Guanajuato p 0.21 San Luis Potosí 43 M / 30 H 32 M / 39 H 0.06 p 91 M / 126 H Edad (años) 9.18 1.60 9.17 1.52 0.94 9.14 1.68 9.12 1.55 0.93 Peso al nacer (kg) 3.18 0.51 3.19 0.55 0.79 3.33 0.53 3.38 0.55 0.54 Talla (m) 1.31 0.10 1.29 0.10 0.16 1.37 0.11 1.36 0.09 0.56 Peso (kg) 29.95 7.75 28.31 6.03 0.02 45.55 12.4 46.63 10.7 0.57 Presión sistólica 103.38 10.36 101.33 10.94 0.06 113.12 13.39 0.98 71.47 14.08 0.40 (mm Hg) Presión diastólica 113.16 17.09 68.15 7.38 63.42 10.19 < 0.001 (mm Hg) 73.18 10.29 Insulina 9.12 6.42 8.25 6.11 0.17 16.49 8.95 16.83 9.04 0.82 Glucosa (mg/dL) 82.86 8.30 87.92 7.65 < 0.001 85.19 7.36 90.04 8.86 < 0.001 Homa IR 1.88 1.4 1.80 1.3 0.57 3.51 2.0 3.74 2.0 0.50 157.25 27.98 0.16 139.21 81.47 0.98 95.34 23.70 0.87 41.24 8.43 0.42 0.933 0.058 0.27 Colesterol total 142.76 26.46 154.49 28.53 < 0.001 (mg/dL) 150.86 26.40 Triglicéridos 88.40 40.7 88.47 33.28 0.98 (mg/dL) 138.89 78.61 Colesterol LDL 91.34 22.59 89.42 19.97 0.37 (mg/dL) 94.77 20.96 Colesterol HDL 46.04 9.97 48.79 10.99 0.01 (mg/dL) 39.99 10.33 ICC 0.866 0.062 0.871 0.045 0.31 0.922 0.062 2 IMC (kg/m ) 16.88 1.73 16.56 1.40 0.04 24.96 3.63 24.82 2.84 0.80 IMC pct 54.39 22.12 50.50 21.00 0.07 97.68 1.26 97.75 1.33 0.74 46 Antes de evaluar el efecto de la carga genética sobre los diversos parámetros bioquímicos y antropométricos, es esencial conocer si las variables de confusión género y origen geográfico tienen influencia sobre las parámetros estudiados. Debido a lo anterior se realizó el análisis comparativo entre las dos entidades federativas participantes. Conforme a los datos colectados en la tabla 1. se puede observar que en el estado de Guanajuato , los niños delgados tienen una mayor glucosa en ayunas, una mayor colesterol total y una mayor concentración de colesterol HDL. En la comparación de los niños obesos provenientes de San Luis Potosí y Guanajuato en cambio, solo la glicemia en ayunas mostró diferencias significativas. Para evaluar de manera indirecta la resistencia a la insulina, el parámetro utilizado por consenso es el HOMA IR (del ingles Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) y se considera que un valor superior a 2.4 indica resistencia a la insulina (Stumvoll, Mitrakou et al. 2000). En base a este parámetro, podemos observar que los niños obesos de ambas ciudades participantes, presentan resistencia a la insulina. Diversos grupos de investigación han reportado que los sujetos que en la infancia inician con alteraciones metabólicas como una respuesta alterada a la insulina, esto aunado a un incremento gradual en la concentración de triglicéridos y una baja concentración de colesterol HDL. o glucosa elevada generará en el futuro adulto, predisposición al desarrollo de DT2 (Morrison, Friedman et al. 2008), 47 A fin de conocer si existe variación asociada al género, se compararon las diferencias entre los niños y las niñas de ambos estados. Tabla 2. Comparación de las características bioquímicas y antropométricas de los niños participantes por género. Los datos se presentan como media desviación estándar. La prueba estadística realizada fue T de Student. Edad (años) Peso al nacer Niñas (170) 9.11 1.59 Delgados Niños (217) 9.22 1.52 P 0.50 Niñas (75) 9.22 1.61 Obesos Niños (69) 9.03 1.62 p 0.47 3.23 0.53 3.15 0.53 0.14 3.42 0.57 3.29 0.51 0.16 Talla (m) 1.30 0.09 1.30 0.10 0.80 1.37 0.11 1.36 0.10 0.46 Peso (Kg) 28.49 6.24 29.10 7.35 0.81 46.11 11.9 46.05 11.3 0.97 Presión sistólica 102.46 9.8 102.05 11.4 0.71 112.29 15.4 114.06 15.1 0.49 66.31 10.14 64.87 8.66 0.13 72.13 14.03 72.56 10.17 0.83 Insulina 7.85 5.69 9.25 6.61 0.03 15.50 8.88 17.91 8.95 0.10 Glucosa (mg/dL) 87.26 7.93 84.48 8.43 0.001 88.46 8.77 86.63 8.07 0.19 Homa IR 1.71 1.2 1.94 1.4 0.09 3.40 2.0 3.88 2.0 0.16 28.49 0.92 154.79 153.17 27.94 0.72 134.67 69.04 0.52 (Kg) (mm Hg) Presión diastólica (mm Hg) Colesterol total 149.18 27.93 149.46 (mg/dL) 26.83 Triglicéridos 83.20 35.8 92.53 36.88 0.01 (mg/dL) 143.08 88.74 Colesterol LDL 90.03 21.11 90.44 21.24 0.84 94.94 21.33 95.18 23.41 0.94 48.62 10.86 46.76 10.39 0.08 40.77 8.92 40.43 10.01 0.82 0.878 0.051 0.861 0.055 0.002 0.946 0.059 0.908 0.055 0.001 IMC (Kg/m ) 16.69 1.40 16.71 1.68 0.89 24.64 2.94 25.16 3.57 0.33 IMC pct 54.60 20.31 50.34 22.35 0.05 97.83 1.20 97.59 1.38 0.26 (mg/dL) Colesterol HDL (mg/dL) ICC 2 Podemos observar que las niñas, tanto obesas como delgadas, tienen un mayor índice cintura cadera. Nótese también, que los niños delgados tienen una concentración mayor de triglicéridos y de insulina en comparación con las niñas delgadas, lo que sugiere que los niños tienen una mayor riesgo a desarrollar las 48 complicaciones mencionadas a lo largo de este trabajo. En la tabla anterior, se observa que las niñas reclutadas para el estudio presentan un ligero incremento en el peso al nacer en comparación a los niños. Actualmente se sabe que el peso al nacer es un factor para el desarrollo de obesidad en la adolescencia y en la edad adulta (Botton, Heude et al. 2008; Druet and Ong 2008), esto nos muestra que las niñas de las entidades estudiadas tienen un mayor riesgo de desarrollar obesidad en cuando sean adultas. En la tabla ya mencionada también se puede observar que las niñas tienden a presentar una concentración más elevada de glucosa, así como un mayor índice cintura cadera (ICC) en comparación con los niños. El ICC es un parámetro que nos permite evaluar la acumulación de grasa en la parte central del cuerpo. Actualmente, se reconoce que la obesidad central es un factor de predisposición a DT2 y a enfermedades arterioscleróticas (Bray, Jablonski et al. 2008). Lo anterior nos permite observar que las niñas estudiadas tienen predisposición al desarrollo de complicaciones asociadas a la obesidad en la edad adulta. En función del estado nutricio, se reclutaron 387 niños delgados y 144 niños obesos, los cuales se distribuyeron en las dos ciudades estudiadas de la siguiente manera: Tabla 3. Clasificación de los niños participantes en función del estado nutricio y la entidad federativa de origen. (p= 0.098; prueba estadística San Luis Potosí León, Guanajuato Total 2 ). Niños con peso normal Niños obesos 170 73 (43.9%) (50.6%) 217 71 (56.1%) (49.4%) 387 144 (100%) (100%) 49 Como se puede observar en la tabla, se reclutaron más niños en el estado de GTO, sin embargo, al realizar el análisis estadístico pertinente se obtuvo un valor de probabilidad de 0.09, este valor nos indica que la variación entre los grupos no es significativa, sin embargo se deberá uniformar la distribución en las dos ciudades aumentando el numero de niños participantes de SLP. De los 531 niños estudiados, 286 pertenecen al género femenino y 245 al masculino. La distribución del estado nutricio en relación con el género de los infantes siguió el siguiente comportamiento. Tabla 4. Clasificación de los niños participantes en función del estado nutricio y del género. ( p= 0.057; prueba estadística 2 ). Niños con peso normal Niños obesos Total Femenino Masculino 217 170 (75.8%) (69.3%) 69 75 (24.2%) (30.7%) 286 245 (100%) (100%) Podemos observar que la proporción de hombres obesos es ligeramente mayor al de mujeres obesas, estadísticamente esta diferencia no fue significativa, pero si es notorio que existe un sesgo en cuanto a la distribución por genero, por lo que es recomendable reclutar a mas niños para éste estudio 50 A fin de conocer la magnitud en la que difieren los dos estados nutricios, se realizó una comparación entre los diversos parámetros bioquímicos y antropométricos estudiados. Tabla 5. Comparación de las características bioquímicas y antropométricas de los niños participantes por estado nutricio. Los datos se presentan como media desviación estándar. La prueba estadística realizada fue T de Student. Parámetro Niños con peso normal Niños obesos N 387 144 P Edad (años) 9.17 1.55 9.13 1.61 0.75 Peso al nacer (Kg) 3.19 0.53 3.36 0.54 0.002 Talla (m) 1.30 0.10 1.36 0.10 < 0.001 Peso (Kg) 29.03 6.81 46.08 11.61 <0.001 Presión sistólica (mm Hg) 102.23 10.72 113.14 15.32 <0.001 Presión diastólica (mm Hg) 65.5 9.35 72.34 12.29 <0.001 Insulina 8.63 6.25 16.63 8.96 <0.001 Glucosa (mg/dL) 85.7 8.32 87.59 8.46 0.037 Homa IR 1.84 1.37 3.63 2.06 <0.001 Colesterol total (mg/dL) 149.34 28.18 154.01 27.29 0.024 Triglicéridos (mg/dL) 88.44 36.67 139.05 79.75 <0.001 Colesterol LDL (mg/dL) 90.26 21.16 95.05 22.28 0.007 Colesterol HDL (mg/dL) 47.58 10.62 40.61 9.43 <0.001 ICC 0.8692 0.053 0.9284 0.06 <0.001 IMC (Kg/m2) 16.70 1.56 24.89 3.25 <0.001 IMC pct 52.21 21.55 97.71 1.29 <0.001 Como se esperaba, los niños obesos tienen mayor peso, mayor presión sistólica y diastólica, una mayor concentración de insulina, colesterol y triglicéridos, así como una menor concentración de colesterol de alta densidad. Estos valores, aunque no están fuera de los valores normales clínicamente, nos muestran que los niños (as) 51 obesos (as) empiezan a desarrollar problemas de hiperglucemia, hipertensión e hiperceolesterolemia. B) Frecuencias genotípicas de los niños en estudio. B1. T45G Los resultados experimentales obtenidos con la sonda prediseñada para este ensayo fueron deficientes; la sonda hibridó de manera inespecífica y como consecuencia de esto, no se obtuvo una discriminación alélica confiable. B2. G276T La sonda adquirida para este ensayo permitió obtener resultados confiables respecto al genotipo de los individuos analizados. La distribución de los genotipos en la muestra infantil estudiada se presenta en la siguiente tabla: Tabla 6. Distribución genotípica del SNP G276T en la población estudiada ( p= 0.29 obtenida con la prueba 2 ). T/T T/G G/G Total Niños con peso Niños con normal obesidad 23 14 (5.9%) (9.7%) 139 47 (35.9%) (32.6%) 225 83 (58.2%) (57.6%) 387 144 (100%) (100%) 52 Total 37 186 308 531 B3. A-10069G La sonda adquirida para este ensayo permitió obtener resultados confiables respecto al genotipo de los individuos analizados. La distribución de los genotipos en la muestra infantil estudiada se presenta en la siguiente tabla: Tabla 7. Distribución genotípica del SNP A-10069G en la población estudiada ( p= 0.42 obtenida con la prueba 2 ). G/G A/G A/A Total Niños con peso Niños con normal obesidad 90 36 (23.2%) (25%) 183 77 (47.3%) (53.5%) 114 31 (29.5%) (21.5%) 387 144 (100%) (100%) Total 150 260 121 531 B4. C-19169T La sonda adquirida para este ensayo permitió obtener resultados confiables respecto al genotipo de los individuos analizados. La distribución de los genotipos en la muestra infantil estudiada se presenta en la siguiente tabla: 53 Tabla 8. Distribución genotípica del SNP C-19169T en la población estudiada ( p= 0.68 obtenida con la prueba 2 ). Niños con peso Niños con normal obesidad 93 33 (24%) (22.9%) 183 74 (47.3%) (51.4%) 111 37 (28.7%) (25.7%) 387 144 (100%) (100%) T/T C/T C/C Total Total 126 257 148 531 Evaluación de los parámetros genéticos. Cuando se trabaja con variaciones en un solo nucleótido o SNPs, es imperativo verificar que los genotipos están en equilibrio de Hardy- Weinberg. El principio del equilibrio de Hardy-Weinberg determina qué frecuencias deben observarse en la población para cada genotipo en función de las frecuencias de los alelos. En condiciones habituales. Si la transmisión de los alelos de los progenitores a los descendientes es independiente y no ocurren fenómenos distorsionadores, como la aparición frecuente de nuevas mutaciones o la selección de alelos, la probabilidad de observar una combinación de alelos concreta, es decir un genotipo, depende del producto de las probabilidades (frecuencia) de cada alelo. Por ejemplo, llámese p a la frecuencia del alelo A y q a la frecuencia del alelo B, partiendo de la hipótesis de que solo haya dos alelos, las frecuencias que se esperan de cada alelo son: Np2AA, 2NpqAB, Nq2BB Donde N es el tamaño de la muestra. Para realizar el test de Hardy-Weinberg debemos sustituir p y q con los valores estimados en nuestra muestra de estudio, con lo que se obtienen las frecuencias esperadas. 54 Estas frecuencias esperadas se pueden comparar con las observadas utilizando el test de la 2 con la siguiente formula: 2 = (O-E)2/E con 1 grado de libertad donde O es la frecuencia observada y E es la frecuencia esperada. Para asegurar que los genotipos obtenidos se encuentran en equilibrio de Hardy-Weinberg la p obtenida del análisis estadístico debe ser superior a 0.05 Antes de realizar un análisis de asociación se debe comprobar si se cumple con el principio de equilibrio de Hardy-Weinberg. En el caso de que se observara una desviación del equilibrio se debe revisar el método de genotipificación, pues en ocasiones se producen sesgos al interpretar los resultados por ser más fácil detectar un genotipo que otro. Otras posibilidades son que los individuos no sean independientes, es decir, que sean consanguíneos o que se dé la selección de un alelo al ser un rasgo que le de ventaja evolutiva a un individuo. También puede existir la posibilidad de que la muestra no este en equilibrio de Hardy-Weinberg porque el polimorfismo este asociado a la enfermedad estudiada, en el caso de enfermedades con un patrón de herencia mendeliano, por ejemplo. Se realizó la prueba de Hardy-Weinberg para analizar la distribución de los genotipos obtenidos. En el caso de los genotipos para el SNP G276T mostrados en la tabla 6, se obtuvo una p mayor a 0.1. Para los genotipos del SNP A-10069G mostrados en la tabla 7, la p fue superior a 0.5. Finalmente, para los resultados obtenidos para el SNP C-19169T mostrados en al tabla 8, la p fue mayor de 0.1. Los resultados obtenidos mediante la prueba de Hardy-Weinberg nos muestran que experimentalmente, la genotipificación se realizó de manera adecuada y avalan los análisis que se realizarán a continuación. A fin de conocer si la carga genética tiene efecto sobre la presencia de obesidad en los niños estudiados, se realizó una prueba de 2 a fin de evaluar si las frecuencias genotípicas de los niños se encuentran en mayor proporción y de manera significativa. El uso de la prueba ya mencionada nos permite tener una aproximación a la influencia del factor genético en el estado nutricio, sin embargo, esta prueba no debe ser utilizada como parámetro para obtener conclusiones 55 finales, ya que en el caso del problema abordado en este trabajo, existen otras variables que evidentemente afectan los resultados y las llamaremos variables de confusión o confusores. Uno de los confusores más importantes que debe ser considerado es el género, ya que la existencia de un dimorfismo sexual en las concentraciones de adiponectina predispone a un efecto de diferente nivel de esta adipocina en los infantes estudiados. Otro factor que debemos tomar en cuenta es que los participantes se encuentran en el limite de la niñez e inicio de la pubertad, por lo que el desarrollo hormonal de cada niño influirá en sus parámetros antropométricos y metabólicos. Finalmente, la entidad de origen también podría generar un sesgo en la distribución de los grupos en este estudio. La prueba estadística indicada para evaluar el efecto del genotipo sobre el estado nutricio tomando en cuenta los confusores ya mencionados, es la regresión logística multinomial. Básicamente, los modelos de regresión son modelos estadísticos que nos permiten conocer la relación entre una o más variables independientes o covariables, ya sean estas del tipo cualitativo o cuantitativo. A fin de evaluar si existe un efecto significativo del genotipo en las variables antropométricas ICC, presión arterial sistólica, presión arterial diastólica y peso al nacer, así como para las variables bioquímicas estudiadas, se realizará la prueba ANOVA de un factor. En base a lo anterior, se realizarán tres análisis estadísticos a los resultados obtenidos; la 2 para evaluar si existe un efecto evidente del genotipo, la regresión logística multinomial para evaluar si el efecto observado esta influido por algún confusor y la ANOVA a fin de evaluar si los parámetros bioquímicos se ven afectados por el genotipo observado. G276T En el caso de la asociación del SNP G276T con el estado nutricio de los niños estudiados, se obtuvo una p de 0.29 con la prueba de 2 , lo que nos indica que desde un punto de vista general, no existe asociación entre este SNP y la presencia de obesidad en la muestra estudiada. Para evaluar la influencia de los 56 confusores antes mencionados, se aplico una regresión logística multinomial. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Tabla 9. Evaluación del efecto del genotipo del SNP G276T, edad, centro y género en el estado nutricio de la muestra de infantes. Factor a evaluar Significación del efecto Combinación de factores 0.232 Género 0.112 Edad 0.847 Centro 0.202 Efecto real del genotipo 0.309 Como se muestra en la tabla anterior, el efecto real del genotipo es de 0.309, el género en cambio, tiene un mayor efecto en la presencia de obesidad en la muestra analizada. Por esto, se realizó un análisis de 2 para cada género, independientemente del lugar de origen Tabla 10. Distribución genotípica del SNP G276T en la muestra de niñas estudiada ( p= 0.01 obtenida con la prueba 2 ). Genotipos T/T T/G G/G Total Niñas con peso Niñas con normal obesidad 12 8 (5.5%) (11.6%) 84 14 (38.7%) (20.3%) 121 47 (55.8%) (68.1%) 217 69 (100%) (100%) Total 20 98 168 286 Como podemos observar, existe un efecto significativo del genotipo en el estado nutricio en la muestra de niñas estudiadas. Considerando la posible influencia de 57 los confusores ya mencionados, se realizó el análisis estadístico pertinente, obteniendo el siguiente resultado: Tabla 11. Evaluación del efecto del genotipo, edad y centro en el estado nutricio de la muestra de niñas. Factor a evaluar Significación del efecto Combinación de factores 0.035 Edad 0.390 Centro 0.935 Efecto real del genotipo 0.008 Esto nos muestra que existe un efecto significativo de la variante genética en las niñas, sin embargo, en los niños, el efecto no fue significativo ( p= 0.224) En base a el análisis realizado anteriormente, podemos ver que el genotipo G/G del SNP G276T tiene un efecto moderado en el desarrollo de obesidad en los niños, en comparación con el efecto que tiene en las niñas. En relación con los parámetros antropométricos y bioquímicos abordados en este estudio, la correlación que tienen estos con el genotipo se resume en el siguiente cuadro. 58 Tabla 12. Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP G276T presente en los infantes estudiados. Genotipo T/T G/T G/G P Edad (años) 8.89 1.74 9.24 1.50 9.14 1.59 0.467 Peso al nacer (Kg) 3.17 0.56 3.24 0.55 3.24 0.53 0.764 Talla (m) 1.32 0.11 1.32 0.11 1.32 0.10 0.979 P. sistólica (mm Hg) 103.51 P. diastólica (mm Hg) 12.21 105.9 14.17 104.96 12.47 0.531 66.28 7.84 67.39 10.96 67.46 10.80 0.816 Insulina 10.72 8.01 10.75 8.42 10.86 7.64 0.987 Glucosa (mg/dL) 84.70 7.69 86.03 8.10 86.50 8.65 0.439 Homa-IR 2.24 1.80 2.30 1.88 2.35 1.71 0.929 Colesterol (mg/dL) 152.43 29.46 151.65 28.57 149.76 27.55 0.706 Triglicéridos (mg/dL) 99.97 48.49 101.32 64.38 102.98 52.51 0.923 LDL (mg/dL) 91.82 24.94 91.14 21.89 91.78 20.98 0.947 HDL (mg/Dl) 46.19 12.62 46.46 9.93 45.16 11.01 0.412 ICC 0.8781 0.05 0.8776 0.06 0.8906 0.06 0.060 Como se puede observar en la tabla anterior, el único parámetro que muestra una ligera asociación con el genotipo G/G es el índice cintura cadera, mostrando en concordancia con las observaciones anteriores. A fin de determinar si el género influyó en estos resultados, se analizó a los géneros por separado obteniendo las siguiente..tabla: 59 Tabla 13. Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP G276T presente en las niñas estudiadas. Genotipo T/T G/T G/G P Edad (años) 8.87 1.67 9.15 1.50 9.22 1.57 0.61 Peso al nacer (Kg) 3.16 0.71 3.16 0.56 3.20 0.48 0.82 Talla (m) 1.33 0.12 1.31 0.05 1.32 0.10 0.58 P. sistólica (mm Hg) 104.95 P. diastólica (mm Hg) 13.21 105.1 14.51 104.84 12.86 o.98 66.68 8.02 65.95 11.06 67.19 8.87 0.60 Insulina 12.54 9.76 10.66 8.15 11.59 7.92 0.52 Glucosa (mg/dL) 83.40 7.92 84.54 7.41 84.99 8.39 0.47 Homa-IR 2.61 2.21 2.24 1.8 2.48 1.78 0.52 Colesterol (mg/dL) 156.35 31.44 151.68 30.05 148.87 26.98 0.45 Triglicéridos (mg/dL) 115.00 56.76 93.77 40.06 106.43 53.66 0.07 LDL (mg/dL) 96.01 25.90 92.01 23.28 90.81 20.49 0.58 HDL (mg/dL) 43.52 8.62 47.06 9.65 44.37 11.29 0.10 ICC 0.8720 0.05 0.8641 0.06 0.8782 0.05 0.16 Podemos observar que ningún parámetro es influenciado de manera significativa por el genotipo, sin embargo, el ICC demuestra un incremento en las niñas con el genotipo G/G, sin embargo, los niveles de triglicéridos de estas portadoras son mas bajos que los de los otros genotipos. A-10069G De la tabla 7, podemos observar que la distribución de genotipos en los dos estados nutricios estudiados no muestra asociación significativa ( p= 0.42). Para determinar el efecto de los confusores, se realizó el análisis estadístico pertinente, obteniendo los siguientes resultados. 60 Tabla 14. Evaluación del efecto del genotipo del SNP A-10069G, edad, centro y género en el estado nutricio de la muestra de infantes. Factor a evaluar Significación del efecto Combinación de factores 0.43 Género 0.128 Edad 0.754 Centro 0.246 Efecto real del genotipo 0.543 De la tabla anterior, podemos observar que el efecto del confusor género ejerce más influencia en la significación obtenida en la tabla 7 que el genotipo por si mismo. En vista de lo anterior, se analizó la asociación existente entre el genotipo y los niños separándolos por género. Los resultados obtenidos no fueron significativos en niñas (p= 0.38) ni en niños (p= 0.118). Para evaluar el efecto del SNP A-10069 G en los parámetros bioquímicos y antropométricos evaluados, se realizó el estadístico correspondiente en todas las muestras estudiadas, sin embargo, ningún parámetro mostró asociación con el genotipo. A fin de determinar si el género podría ser un confusor significativo, se realizo el análisis a las niñas y los niños por separado, obteniendo los siguientes resultados: 61 Tabla 15. Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP A-10069G presente en las niñas estudiadas. Genotipo A/A A/G G/G P Edad (años) 9.29 1.49 9.04 1.47 9.27 1.76 0.43 Peso al nacer (Kg) 3.28 0.45 3.18 0.55 3.06 0.55 0.05 Talla (m) 1.33 0.10 1.31 0.10 1.31 0.11 0.32 P. sistólica (mm Hg) 104.84 P. diastólica (mm Hg) 13.43 105.6 13.96 103.66 12.40 0.60 66.98 8.62 67.19 10.38 65.47 9.26 0.47 Insulina 11.63 7.70 10.88 8.05 11.87 8.85 0.66 Glucosa (mg/dL) 85.01 7.58 85.14 8.52 84.70 9.17 0.94 Homa IR 2.45 1.67 2.31 2.54 2.02 0.67 Colesterol (mg/dL) 151.59 26.53 150.49 28.80 148.51 30.03 0.79 Triglicéridos (mg/dL) 102.62 43.17 105.73 52.94 96.76 52.06 0.48 LDL (mg/dL) 93.27 22.38 90.76 20.75 91.06 23.41 0.69 HDL (mg/dL) 45.82 11.61 45.00 10.48 44.93 9.73 0.82 ICC 0.8757 0.06 0.8780 0.05 0.8592 0.04 0.08 1.81 De la tabla anterior, podemos observar que las niñas con el genotipo G/G tienen un ICC menor que el de las niñas con los otros genotipos, aunque la asociación no llega a ser estadísticamente significativa. En el caso de los varones, no hubo significación en las comparaciones realizadas. Otro parámetro que muestra asociación con el genotipo es el peso al nacer, ya que observamos que las niñas con el genotipo A/A tienen más peso al nacer en comparación con las niñas con los otros genotipos, sin embargo este resultado no es significativo estadísticamente. Es posible que el genotipo G/G en el SNP A-10069G contribuya a disminuir el riesgo de acumulación de grasa vísceral , aunque esto, evidentemente, debe ser corroborado con investigaciones poblacionales más extensas y con un análisis in vitro del SNP. 62 C-19169T. La distribución genotípica de este SNP en relación con el estado nutricio de los infantes, se muestra en la tabla 8. Del análisis estadístico aplicado a estos datos, se obtuvo una p no significativa (0.68). A fin de determinar el efecto de los confusores en este estudio, se realizó la siguiente tabla: Tabla 16. Evaluación del efecto del genotipo del SNP C-19169T, edad, centro y género en el estado nutricio de la muestra de infantes. Factor a evaluar Significación del efecto Combinación de factores 0.42 Género 0.126 Edad 0.755 Centro 0.225 Efecto real del genotipo 0.805 En la tabla anterior, podemos observar que el confusor género tiene un efecto más notorio en la distribución de la obesidad que el SNP C-19169T, sin embargo, al realizar el análisis por separado de los géneros, no hubo asociación significativa en las niñas (p= 0.224) ni en los niños (p= 0.473). Para evaluar el efecto del SNP C-19169T en los parámetros bioquímicos y antropométricos evaluados, se realizó el estadístico correspondiente en todas las muestras estudiadas, sin embargo, ningún parámetro mostró asociación con el genotipo. A fin de determinar si el género podría ser un confusor significativo, se realizo el análisis a las niñas y los niños por separado, obteniendo los siguientes resultados: 63 Tabla 17. Asociación de parámetros bioquímicos y antropométricos con el genotipo del SNP C-19169T presente en las niñas estudiadas. Genotipo T/T C/T C/C P Edad (años) 9.30 1.72 9.08 1.49 9.21 1.50 0.60 Peso al nacer (Kg) 3.07 0.54 3.19 0.55 3.27 0.47 0.06 Talla (m) 1.32 0.11 1.31 0.10 1.33 0.10 0.41 P. sistólica (mm Hg) 103.52 P. diastólica (mm Hg) 12.17 105.6 13.94 105.05 13.68 0.55 65.25 9.43 67.13 9.85 67.34 9.38 0.32 Insulina 12.5 9.18 10.68 7.72 11.56 7.80 0.40 Glucosa (mg/dL) 84.64 9.01 85.32 8.59 84.80 7.59 0.83 Homa-IR 2.62 2.08 2.27 2.44 1.70 0.42 Colesterol (mg/dL) 148.97 30.67 150.43 28.67 151.38 26.12 0.87 Triglicéridos (mg/dL) 98.14 53.28 105.50 53.38 102.23 41.28 0.60 LDL (mg/dL) 90.52 23.41 90.77 20.88 93.69 22.01 0.56 HDL (mg/dL) 45.16 10.33 45.24 10.58 45.28 11.08 0.99 ICC 0.8586 0.05 0.8779 0.06 0.8773 0.05 1.73 0.06 El genotipo, según figura en la tabla anterior, se asocia de manera importante, aunque no significativa al ICC, donde podemos observar que las niñas con el genotipo T/T aparece como un factor protector al incremento en el ICC e indirectamente, podría ser protector frente las complicaciones asociadas a la obesidad vísceral. Otro factor que parece asociarse significativamente con el genotipo es el peso al nacer. Observamos que las niñas con el genotipo T/T tienen un menor peso al nacer en comparación con los otros dos grupos. En los niños, ninguna comparación fue significativa estadísticamente. 64 4.0 DISCUSIÓN Una de las principales problemáticas al desarrollar este proyecto, fue la falta de parámetros de clasificación del estado de nutrición en los niños mexicanos. Actualmente, los criterios utilizados para la clasificación antropométrica de los niños son los desarrollados por la CDC en niños norteamericanos. Resulta evidente que existen diferencias fenotípicas entre los niños americanos y los mexicanos, ya que nuestra población tiende a ser de estatura mas baja y con mas peso corporal, por lo que es necesario establecer los puntos de corte para la definición de obesidad en nuestra población mediante un muestreo significativo en cada estado de la republica. La panorámica al analizar los parámetros bioquímicos es mas desoladora aún. Los criterios utilizados en este estudio son lo que se aplican actualmente en población adulta. Resulta evidente que las hormonas en los adultos modifican algunos parámetros bioquímicos, como el perfil lipídico, por ejemplo. Al realizar el estudio en estas dos ciudades, no se pudo establecer la etapa hormonal de los infantes mediante la clasificación de Tañer, debido a la negación de la exploración física de los participantes. Esto nos impide determinar si los niños estudiados son prepuberes o ya están en la pubertad. Estos factores influyen en algunos parámetros estudiados, como la distribución de grasa subcutánea, ya que las niñas al entrar en la pubertad, acumulan mayor cantidad de grasa en las caderas, lo que modifica de manera importante su ICC. Sin embargo, este estudio nos da un panorama general del estado nutricio de los infantes en estas ciudades, donde observamos que un porcentaje considerable de los niños es obeso. Esto se atribuye al ambiente industrializante de estas ciudades, sin embargo, para determinar la influencia de este factor, se deberá realizar un protocolo similar en niños de comunidades rurales de estos estados, a fin de determinar la fuerza del factor ambiental en el desarrollo de obesidad. Por otro lado, pudimos observar que los niños obesos de las dos ciudades participantes, empiezan a desarrollar cuadros de resistencia a la insulina e hiperlipidemia, por lo que es necesario realizar un seguimiento clínico a estos 65 pacientes, a fin de evaluar el efecto de la obesidad infantil en el desarrollo de complicaciones asociadas a la misma. En la muestra de niños mexicanos estudiada, observamos que los niños con el genotipo G/G para el SNP G276T tienden a presentar obesidad, con mayor frecuencia que los niños con los otros genotipos (p=0.01, para el caso de las niñas), así como un incremento no significativo en el índice de resistencia a la insulina. Por otra parte, los resultados obtenidos en otras poblaciones, por ejemplo, Menzaghi en el 2002 reporto que los sujetos portadores del haplotipo G/G para 276 y T/T para la variante 45 presentan mayor peso corporal (p=0.03), mayor resistencia a la insulina (p= 0.003) y mayor presión diastólica (p= 0.003) (Menzaghi, Ercolino et al. 2002). En población japonesa, se encontró que los portadores del genotipo G/G para la variante 276 tienen un mayor índice de resistencia a la insulina (p=0.001). Es importante observar que el nivel de asociación que presenta nuestra población es menor e inclusive, cuando se analizó en conjunto a ambos géneros, la asociación no fue significativa. En el 2006, un estudio realizado en población México Americana, demostró que esta variante no asociaba significativamente con algún parámetro relacionado con la obesidad (Richardson, Schneider et al. 2006). El factor que posiblemente sea el que determine la heterogeneidad en los resultados obtenidos es la población en estudio. La población mexicana actual, es producto de un proceso de mestizaje entre población caucásica, indígena, negra y asíática en diversas proporciones. En cambio, las poblaciones caucásica, negra o asíática no presentan este elevado grado de mestizaje. En los últimos años, se ha demostrado que la población indígena mexicana tiene un mayor riesgo a desarrollar obesidad y diabetes (Arroyo, Fernandez et al. 2007; Canizales-Quinteros, Aguilar-Salinas et al. 2007), sin embargo, al parecer el mestizaje disminuye esta predisposición. Para que los resultados de este estudio sean más confiables, es necesario caracterizar el fondo genético de la muestra estudiada, a fin de conocer el grado de mestizaje de los participantes, además de 66 caracterizar las variantes trabajadas en este estudio en las diversas etnias de nuestro país. Las variantes A-10069G y C-10169T mostraron un comportamiento similar a los mostrado por Richardson en población México Americana (Richardson, Schneider et al. 2006), siendo estos, los únicos dos estudios que reportan la asociación de esta variables con parámetros relacionados con la obesidad. Esta respuesta biológica a la variación genotípica en los diversos SNPs estudiados, es la esperada por nosotros. La importancia de estudiar variaciones en un solo nucleótido radica en conocer la pequeña aportación que tiene cada variación genotípica a algún parámetro biológico a fin de conocer en un futuro inmediato la influencia que tienen el conjunto de esas pequeñas variaciones en diversos genes sobre el fenotipo del individuo. Ahí radica la importancia de este estudio, ahora tenemos evidencia del efecto de los SNPs estudiados en algunos parámetros bioquímicos y antropométricos asociados a la obesidad y sus complicaciones. 67 5.0 CONCLUSIONES Existe asociación de baja intensidad entre la presencia del alelo G en el SNP G276T del gen ADIPOQ y el desarrollo de obesidad en las niñas de la muestra poblacional obtenida de SLP y León. La presencia del alelo C en el SNP C-19169T del gen ADIPOQ contribuye de manera discreta con un incremento en el índice cintura cadera (ICC) en la muestra poblacional obtenida de las niñas de SLP y León. La presencia del alelo A en el SNP A-10069G en las regiones promotoras del gen ADIPOQ contribuyen de manera discreta con un incremento en el índice cintura cadera (ICC) en la muestra poblacional obtenida de las niñas de SLP y León. 6.0 PERSPECTIVAS Evaluar in vitro el efecto de los SNPs estudiados en cultivos celulares de adipocitos para conocer las posibles alteraciones bioquímicas que estos generen. Realizar un estudio prospectivo con los niños reclutados para el estudio, a fin de conocer la influencia de estos SNPs en el desarrollo de comorbilidades asociadas a la obesidad como alteraciones ateroscleroticas y diabetes tipo II 68 7.0 BIBLIOGRAFIA Ahima, R. S. and J. S. Flier (2000). "Leptin." Annu Rev Physiol 62: 413-37. Ailhaud G, H. H. (1998). Development of white adipose tissue. New York, W.P.T. James, editores Alam, A. A. (2008). "Obesity among female school children in North West Riyadh in relation to affluent lifestyle." Saudi Med J 29(8): 1139-44. 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