Download Identificación de Nuevos Factores de Transcripción

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD IRAPUATO
LABORATORIO NACIONAL DE GENÓMICA PARA LA
BIODIVERSIDAD VEGETAL Y MICROBIANA
Identificación de Nuevos Factores de Transcripción
Involucrados en el Desarrollo del Fruto de Arabidopsis
thaliana
Tesis que presenta
I.B.Q. Victor Manuel Zuñiga Mayo
Para Obtener el Grado de
Maestro en Ciencias
En la Especialidad de
Biotecnología de Plantas
Director de la Tesis: Dr. Stefan de Folter
Irapuato, Guanajuato.
Agosto del 2009
El
presente
Laboratorio
Desarrollo
trabajo
de
de
fue
realizado
Genómica
Plantas,
en
Funcional
perteneciente
el
del
al
LABORATORIO NACIONAL DE GENÓMICA
PARA
LA
BIODIVERSIDAD
VEGETAL
Y
MICROBIANA, bajo la asesoría del Doctor
Stefan de Folter.
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico
otorgado para la realización de este proyecto (Beca No. 210100)
Al Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad Vegetal y Microbiana y
al Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN Unidad Irapuato, por
proporcionar los recursos materiales y humanos necesarios para mi formación en
éste posgrado.
Al Dr. Stefan de Folter por permitirme trabajar en su laboratorio, por su asesoría y
paciencia durante mi estancia.
A los doctores June
Kilpatrick Simpson Williamson y Plinio Antonio Guzman
Villate por formar parte del comité evaluador, así como, por las críticas
constructivas y sugerencias para la realización de este trabajo.
A la Dra. Nayelli Marsch Martinez, por su asesoría, comentarios
y paciencia
durante mi estancia.
A todos los integrantes del laboratorio de Genómica Funcional del Desarrollo de
Plantas, por formar parte de esta experiencia.
DEDICATORIAS
A mi Papá, Mamá y Hermanos por su apoyo moral, económico y sobre todo por su
amor y por creer siempre en mí.
A Kena Casarrubias Castillo por su ayuda, consejos y por estar siempre a mi lado.
A la banda y la camioneta, por su ayuda en diversas ocasiones por su compañía y
amistad valiosa a lo largo de estos dos años.
ÍNDICE
1.- RESUMEN…………………………………………………………………………… 1
2.- INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………. 3
2.1 Factores de transcripción
2.2 Arabidopsis thaliana
2.2.1 Taxonomía
2.2.2 Modelo de estudio
2.3 RNA interferente
2.4 Mutagénesis insercionales mediante T-DNA
2.5 Tecnología GATEWAY™
2.6 Desarrollo del fruto
2.6.1 Generalidades
2.6.2 Genes involucrados en el desarrollo del fruto
3.- OBJETIVO…………………………………………………………………………. 20
3.1 Objetivo general
3.2 Objetivos específicos
4.- MATERIALES Y MÉTODOS.……………………………………………………. 21
4.1 Selección de genes
4.2 Diseño de las construcciones antisentido.
4.3 Transformación de Arabidopsis thaliana mediante Agrobacterium
tumefaciens
4.4 Selección de plantas transformadas
4.5 Análisis de las líneas insercionales
4.6 Análisis de expresión mediante RT-PCR
I 5.- RESULTADOS……..……………………………………………………………. 32
5.1 Selección de genes posiblemente involucrados en el desarrollo del fruto
5.2 Obtención de las construcciones antisentido.
5.3 Obtención de fenotipos con defectos en el desarrollo del fruto
5.3.1 Segregación de fenotipos de las plantas transformadas con las
construcciones antisentido y la línea insercional.
5.3.2 Fenotipo del gen At4g00870 (bHLH14)
5.3.3 Fenotipo del gen At4g29080 (IAA27)
5.3.4 Fenotipo del gen At4g17460 (HAT1)
5.4 Análisis molecular de las plantas transformadas.
6.- DISCUSIONES…….………………………………………………………………. 50
7.- CONCLUSIONES………………………………………………………………….. 56
8.- PERSPECTIVAS……..……………………………………………………………. 57
9.- REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA………………………………………………… 58
10.- APÉNDICES……………………………………………………………………….63
APÉNDICE I. Análisis de genotipificación de las líneas insercionales para
los
genes seleccionados.
APÉNDICE II. Oligonucleótidos para amplificar fragmentos
aproximadamente 300 pares de bases para cada gen seleccionado.
de
APÉNDICE III. Oligonucleótidos utilizados para la genotipificación de las
líneas insercionales.
APÉNDICE IV. Oligonucleótidos utilizados para los RT-PCR.
APENDICE V. Oligonnucleótidos utilizados para secuenciar las clonas
antisentido en el vector Hellsgate8 rearreglado.
II ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Genes seleccionados.
Tabla 2: Protocolo de PCR para amplificar los fragmentos necesarios para las
construcciones antisentido.
Tabla 3. Número de plantas transformantes y con fenotipo obtenidas para cada
gen.
Tabla 4. Segregación de fenotipos de las plantas transformadas con las
construcciones antisentido.
Tabla 5. Segregación de fenotipos de las plantas de la línea insercional
SALK_069162.
III ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Arabidopsis thaliana
Figura 2. Factores de transcripción en Arabidopsis.
Figura 3. Comparación de las diferentes rutas de pequeños RNAs utilizadas para
silenciamiento de genes en plantas.
Figura 4. Reacciones de clonación del sistema GATEWAY™.
Figura 5. Representación esquemática del pistilo y el fruto maduro.
Figura 6. Modelo propuesto de la distribución de auxinas y su papel en el
desarrollo del fruto.
Figura 7. Modelo del patrón de formación a lo largo del eje lateral en el ovario de
Arabidopsis.
Figura 8. Matriz del perfil de expresión de factores de transcripción durante el
desarrollo del fruto (silicua) en Arabidopsis.
Figura 9. Amplificación de los fragmentos de 300 pares de bases de seis genes
seleccionados, necesario para las construcciones antisentido.
Figura 10. PCR de colonia del vector pENTR/D-TOPO.
Figura 11. Digestión del vector de entrada con el fragmento de interés.
Figura 12. PCR de colonia del vector Hellsgate8.
Figura 13. Digestión del plásmido Hellsgate8 después de la recombinación con el
vector pENTR/D-TOPO.
Figura 14. Vector pHellsgate8.
Figura 15. Genotipificación de línea insercional SALK_069162 mediante PCR.
Figura 16. Comparación de frutos de Arabidopsis WT vs antisentido At4g00870
(bHLH14).
Figura 17. Comparación en tiempos de floración floración entre WT vs antisentido
At4g29080 (IAA27).
Figura 18. Comparación de inflorescencia WT vs antisentido At4g29080 (IAA27).
Figura 19. Comparación de frutos WT vs antisentido At4g29080 (IAA27).
IV Figura 20. Comparación de frutos WT, construcción antisentido y línea insercional
del gen At4g17460 (HAT1).
Figura 21. Análisis de expresión mediante RT-PCR de las plantas transformadas
con las construcciones antisentido.
Figura 22. El gen HAT1 con sus diferentes versiones de “splicing”.
Figura 23. Amplificación de las versiones cortas de “splicing” alternativo del gen
HAT1.
Figura 24. Análisis de expresión del gen At4g17460 (HAT1) mediante RT-PCR.
Figura 25. Dominios conservados en las proteínas predichas de los diferentes
“splincing” alternativos del gen HAT1.
Figura 26. Diferencias entre los frutos de la línea insercional y los frutos de la
construcción antisentido para el gen HAT1.
Figura 27. Inflorescencia terminal de las plantas transformadas con la construcción
antisentido y la línea insercional para el gen HAT1.
Figura 28. Análisis de expresión de genes involucrados en el desarrollo de óvulos
y pistilo, en inflorescencias terminales de las plantas transformadas con la
construcción antisentido y la línea insercional para el gen HAT1 y en WT.
V 1.- RESUMEN
En el trabajo que se presenta a continuación se lograron identificar nuevos
genes que están involucrados en el desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana.
Para conseguir dicho objetivo, se seleccionaron 15 genes a partir de un análisis de
perfil de expresión de 1304 factores de transcripción previamente realizado (de
Folter, et al 2004). Para cada gen seleccionado se hizo
una construcción
antisentido, con el fin de causar silenciamiento. Después de transformar plantas
de Arabidopsis, ecotipo Columbia, con las construcciones antisentido mediante
Agrobacterium, su progenie fue seleccionada y analizada fenotípicamente,
buscando algún fenotipo donde el desarrollo del fruto estuviese afectado, después
del análisis se lograron identificar fenotipos para tres de los genes seleccionados:
At4g00870 (bHLH14), At4g29080 (IAA27) y At4g17460 (HAT1). De manera
paralela se analizaron las líneas insercionales (SALK) para cada uno de los genes
seleccionados, encontrando un fenotipo en la línea SALK_069162. En general,
tanto las plantas de las construcciones antisentido, como la línea insercional
presentaron defectos en el desarrollo del fruto en diferentes grados de severidad.
Para el gen HAT1 se logró identificar a nivel transcripcional tres diferentes
versiones, dos de las cuales serían versiones proteicas truncadas de la versión
mayor según un análisis de traducción de secuencias en busca de dominios
conservados. Además al parecer, una disminución en la expresión del gen HAT1
es capaz de causar cambios de identidad de los diferentes órganos florales como:
la aparición de óvulos ectópicos y la transformación de sépalos a estructuras
carpeloides.
1
ABSTRACT
In this work new transcription factors involved in fruit development of
Arabidopsis thaliana were identified. In order to accomplish this aim, 15 genes
specifically expressed in fruit were selected for further study from an expression
profile analysis previously published (de Folter et al., 2004). In order to silence the
chosen genes an antisense construct was developed for each one of them. These
constructs were used to transform Arabidopsis plants (ecotype Columbia) and the
transformed progeny was analyzed for abnormal fruit development. Three genes
showed abnormal phenotype: At4g00870 (bHLH14), At4g29080 (IAA27) and
(HAT1). In addition, insertional T-DNA lines were analyzed for each one of the
genes. Only one line showed an abnormal phenotype for the At4g17460 gene.
Plants containing the antisense construct, as well as, T-DNA line SALK_069162
showed defects in fruit development with different severity levels.
Three different versions of the HAT1 transcript were identified. Two of which
seem to be truncated versions of the longest protein according to in silico analysis.
Furthermore, down regulation of the HAT1 gene is able to change floral organ
identity, such as, the formation of ectopic ovules and the transformation of sepals
into carpeloid structures.
2
2.- INTRODUCCIÓN
2.1 Factores de transcripción
La regulación de la expresión génica, se lleva a cabo a través de
mecanismos complejos, que involucran una gran diversidad y número de
proteínas, las cuales deben ser reguladas cuidadosamente para hacer posible la
diversificación de patrones de expresión requeridos para controlar los diferentes
procesos biológicos.
En las plantas, al ser un organismo eucariótico, el DNA se encuentra
empaquetado formando la cromatina, lo cual bloquea el reconocimiento de los
promotores por la maquinaria de transcripción basal; este efecto hace necesario la
actividad de proteínas modificadoras de cromatina. Así, la transcripción génica en
plantas requiere de complejas redes regulatorias, siguiendo combinaciones
específicas, dependiendo del tipo de gen que se desea expresar.
Las proteínas involucradas en la transcripción, pueden ser clasificadas en
cuatro grupos funcionales (Riechmann, 2002):
1. Maquinaria de transcripción basal y factores asociados: En plantas hay
cuatro diferentes RNA polimerasas que sintetizan los diferentes RNAs,
rRNA (Pol I), mRNA (Pol II), tRNA y 5S rRNA (Pol III) y RNA pequeños (Pol
IV), además de complejos de factores de transcripción generales como:
TFIIA, TFIIB, TFIID que contiene la Proteína de Unión a la Caja TATA ( TBP
por sus siglas en ingles), entre otros.
2. Coactivadores
y
otros
cofactores:
Estas
proteínas
regulatorias
interactúan con los factores de transcripción de unión al DNA de secuencia
específica, modulando su unión al DNA o su interacción con la maquinaria
basal.
3. Proteínas relacionadas a la cromatina: En este grupo se encuentran las
proteínas que modifican covalentemente a las histonas y complejos
remodeladores de cromatina que hidrolizan ATP como: SWI/SNF y ISWI.
En general la acetilación de histonas está asociada a la transcripción y la
3
deacetilación es una característica de represión. Este tipo de proteínas,
usualmente se encuentran formando complejos.
4. Factores de transcripción de unión al DNA de secuencia específica: A
partir de ahora nos enfocaremos a este grupo en particular. Este tipo de
factores son definidos como proteínas que contienen uno o más sitios de
unión al DNA de secuencia específica y son capaces de activar y/o reprimir
la transcripción de un determinado gen o grupo de genes.
Estos factores de transcripción regulan muchos de los procesos biológicos en
plantas, tales como: diversas rutas metabólicas, establecimiento de relaciones
simbióticas, fotosíntesis, respuesta a diferentes condiciones ambientales y
estreses (luz, temperatura, disponibilidad de nutrientes, ataque de patógenos), en
otras palabras, son responsables del desarrollo general de la planta.
Frecuentemente son expresados de forma dependiente de estímulos o de
manera específica en algún tejido, tipo de célula, en un estadío de desarrollo
determinado, donde actúan como “switches” de cascadas regulatorias. Además,
una de las mayores fuentes de diversidad y cambios que experimentan las plantas
a lo largo de la evolución, se debe a la alteración en la expresión de genes que
codifican para factores de transcripción, evidenciando así su importancia
(Riechmann et al., 2000).
Los factores de transcripción contienen dominios diferentes y separables
funcionalmente; estos pueden ser dominios de activación o de unión al DNA, los
cuales son utilizados por los científicos para poder ser agrupados en diferentes
familias, pudiendo distinguir unos de otros (Luscombe
et al., 2000). Estas
proteínas moduladoras son capaces de interactuar directamente con diferentes
componentes de la maquinaria basal de transcripción y con Coactivadores,
afectando la formación del complejo o bien pueden interactuar con complejos
remodeladores de cromatina, dando como resultado en ambos casos, la
regulación de la expresión génica.
4
2.2 Arabidopsis thaliana
2.2.1 Taxonomía
Arabidopsis thaliana es una especie de planta con flores. Esta planta es
nativa de Europa, Asia y el noroeste de África, sin embargo, actualmente se
encuentra esparcida por todo el mundo.
El género arabidopsis cuenta con 9 especies y 8 subespecies. La
clasificación taxonómica de A. thaliana es la siguiente:
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Orden: Capparales
Familia: Brassicaceae
Género: Arabidopsis
Especie: thaliana
A. thaliana es una planta herbácea, que normalmente crece de 20 a 30 cm
de largo. Su tallo es recto con ramificaciones secundarias (saliendo de la base) y
terciarias (saliendo del tallo), cuenta con dos tipos diferentes de órganos
fotosintéticos, las llamadas hojas verdaderas, que presentan un margen dentado,
se encuentran en la base de la planta formando una roseta, miden entre 2-3 cm de
largo y 0.5-1 cm de ancho y las hojas caulinas, que se encuentran a lo largo del
tallo, carecen de peciolo y son más pequeñas, ambas cuentan con numerosos
pelos sobre su superficie llamados tricomas (Figura 1).
Las inflorescencias forman racimos en los extremos de cada rama, al
principio son compactos, pero se separan a medida que crece el tallo, por lo que
los frutos maduros quedan dispuestos un centímetro uno de otro. Las flores son
del tipo hermafrodita (presentan ambos sexos), miden aproximadamente de 3 a 5
milímetros de diámetro, normalmente cuentan con cuatro sépalos de color verde,
cuatro pétalos de color blanco, seis estambres, cuatro de ellos más largos que los
5
otros dos, y un pistilo o gineceo a partir del cual se desarrolla el fruto.
El fruto es una silicua de forma alargada, cilíndrica y un poco arqueado,
mide de 2 a 3 centímetros de largo y 1 milímetro de ancho aproximadamente,
estos presentan dos cavidades a todo lo largo, donde se encuentran las semillas
arregladas en hilera, que al madurar se abren dispersando las semillas. Cada fruto
contiene de 40 a 50 semillas en promedio (Bowman, 1994).
Figura 1. Arabidopsis thaliana. Esta planta está compuesta de diversos órganos, las hojas
situadas en la base llamada roseta, las hojas caulinas colocadas debajo de cada inflorescencia
secundaria, la inflorescencia principal, y los frutos o silicuas .
2.2.2 Modelo de estudio
A. thaliana no es una planta de importancia económica desde el punto de
vista de cultivo, sin embargo está emparentada con canola, col y brócoli, que si lo
son. Esta planta cuenta con diversas características como: periodo de vida
relativamente corto, requiere espacios pequeños para desarrollarse, produce
6
muchas semillas, crece fácilmente en invernaderos o cámaras de crecimiento,
tiene un genoma relativamente pequeño comparado con las de mas plantas,
además ya se conoce su secuencia genómica; lo cual la convierten en un
excelente
modelo
de
estudio
para
la
investigación
fitobiológica;
estas
características, permiten a los científicos manipular mediante ingeniería genética,
de manera más fácil y rápida, el genoma de A thaliana.
Muchos de los conocimientos adquiridos sobre ingeniería genética en
plantas se ha logrado a través de estudios realizados en A. thaliana; los cuales, a
partir de la secuenciación de su genoma, se han multiplicado.
El genoma de A. thaliana cuenta con aproximadamente 125 millones de
bases o 125 megabases, dentro del cual, se encuentran 33,518 genes (TAIR v9),
27 379 de los cuales codifican para proteínas pertenecientes a mas de 11 000
familias, este material genético se encuentra distribuido dentro de 5 cromosomas,
que presentan densidad génica, niveles de expresión y distribución de repetidos
semejantes, (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), esta planta es diploide por
lo que el número total de cromosomas que tiene es n= 10.
La duplicación de todo el genoma es un evento común en plantas con
flores, estudios recientes sugieren que A. thaliana ha experimentado dos o
posiblemente tres eventos de este tipo a lo largo de su historia (Duarte et al.,
2006), por esta razón, su genoma presenta numerosas duplicaciones, que
incluyen duplicaciones de genes en “tandem” y duplicaciones a gran escala en sus
diferentes cromosomas, afectando más del 40% del total de los genes (The
Arabidopsis Genome Initiative, 2000), todo esto trae como consecuencia una
potencial redundancia funcional génica.
Dentro de los más de 33 000 genes en el genoma de A. thaliana, se
encuentra un número considerable de factores de transcripción, alrededor del 7%
de todo el genoma codifica para factores de transcripción, indicando al menos
2,290 proteínas de este tipo (An-Yuan et al., 2008). Dichos factores de
transcripción están agrupados en familias de acuerdo a sus dominios de unión al
DNA.
Actualmente se conocen al menos 45 familias diferentes, de las cuales las
7
tres más extensas son: MYB, AP2/EREBF
y bHLH cada una representando
aproximadamente el 9% del total (Figura 2). También existen familias que son
exclusivas del reino de las plantas como: NAC, WRKY, proteínas Aux/IAA,
AP2/EREBP entre otras, las cuales representan aproximadamente el 45% del total
de los factores de transcripción en A. thaliana.
Figura 2. Factores de transcripción en Arabidopsis. En el genoma de Arabidopsis a
proximadamente el 6% de sus genes son factores de transcripción, estos están agrupados en 45
familias, de las cuales el 45% son exclusivos de plantas.
2.3 Silenciamiento mediante RNA.
Los organismos eucarióticos a lo largo de su evolución han desarrollado
diversas estrategias para mantener y establecer funciones celulares básicas, una
de ellas es la regulación génica mediada por RNAs pequeños, los cuales
participan en el silenciamiento de genes a través de interacciones RNA-RNA y
posiblemente RNA-DNA desencadenando fenómenos como: silenciamiento
transcripcional de heterocromatina y/o regulación post-transcripcional de RNA
mensajero.
En general el silenciamiento por RNA se refiere a diversos procesos
basados en RNA que resulta en la inhibición de la expresión de genes a nivel de
secuencia especifica, estos procesos comparten tres características bioquímicas:
(1) Formación de RNA de doble cadena; (2) El procesamiento del RNA de doble
8
cadena generando segmentos de 20 a 26 nucleótidos de longitud con los
extremos metilados; y (3) La acción inhibitoria de un RNA de cadena sencilla
asociado a un complejo enzimático (Figura 3) (Brodersen y Voinnet, 2006).
Los RNAs pequeños de doble cadena son producidos en el núcleo por RNA
Polimerasas de tipo III pertenecientes a la familia DICER en un proceso de corte
de dos pasos; en A thaliana son conocidas como DICER LIKE (DCL), donde se
han caracterizado 4 miembros DCL 1, 2, 3 y 4 (Xie et al., 2004); el fragmento
liberado es modificado en la ribosa terminal 3’ de cada extremo por HUA
ENHANCER 1 (HEN 1) la cual es una enzima metriltransferasa (Yu et al., 2005),
este paso estabiliza al segmento de RNA previniendo la uridilación (Li et al., 2005).
Posteriormente una de las dos cadenas de RNA se une al Complejo de
Silenciamiento Inducido por RNA (RISC por sus siglas en ingles) el cual contiene
un miembro de la familia ARGONAUTA (AGO), este tipo de proteínas media el
corte del RNA mensajero del gen blanco, desencadenando el silenciamiento por
RNA (Figura 3) (0ssowski et al., 2008).
Figura 3. Comparación de las diferentes rutas de pequeños RNAs utilizadas para silenciamiento de
genes en plantas. Las diferentes rutas comparten algunas proteínas en común como HEN1 sin embargo,
otras como las DCL y AGO se especializan en algún proceso en particular.
9
Existen varias estrategias para la aplicación del silenciamiento por RNA,
una de ellas, desarrollada recientemente es conocida como Silenciamiento PostTranscripcional de Genes por Repetidos Invertidos (IR PTGS, siglas en ingles) u
Horquilla de RNA Interferente (hpRNAi, siglas en ingles), la cual consiste en una
construcción que contiene RNAs sentido y antisentido separados por un pequeño
intrón, que facilita la formación de una estructura de doble cadena en forma de
horquilla que posteriormente es procesada por la maquinaria de la célula,
mencionada anteriormente(Watson, et al. 2005; Ossowki, et al. 2008), aunque
también se han reportado otras formas como construcciones antisentido, donde la
secuencia del gen a silenciar se introduce a la planta de forma antisentido,
mediante este método se han logrado obtener silenciamientos que van desde un
10 hasta más del 90% (Tieman et al., 1992, D’Aoust et al., 1999, Jorgensen et al.,
2006, Fagoaga et al., 2007).
2.4 Mutagénesis insercionales mediante T-DNA
Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar plantas de forma natural,
durante la infección este tipo de bacteria transfiere un segmento de DNA
plasmídico denominado DNA de transferencia (T-DNA) al genoma nuclear de la
planta hospedera, este T-DNA contiene la maquinaria génica necesaria para
causar tumores en las plantas y obligue a las células vegetales a producir alimento
para la bacteria.
Esta característica peculiar ha sido aprovechada por los científicos en la
ingeniería genética de plantas, utilizándola como herramienta de transformación
genética para generar plantas transgénicas. Para lograr esto, los genes nativos del
T-DNA son removidos y reemplazados con algún gen de interés o gen marcador.
Bajo este principio, se han generado varias colecciones de plantas transgénicas
de Arabidopsis con inserciones del T-DNA en diferentes posiciones. Cada
inserción potencialmente produce una mutación y el proceso ha sido denominado
mutagénesis insercional. Al generar estas colecciones, se introduce una o más
10
copias de T-DNA con algún gen marcador y posteriormente el T-DNA es
localizado en el genoma de la planta, entre las colecciones más importantes
destacan: SALK (Alonso et al., 2003), SAIL (Sessions et al., 2002), GABI (Rosso
et al., 2003), FLAG FST (Brunaud et al., 2002).
Actualmente el Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, cuenta con una
gran colección de plantas transgénicas por mutagénesis insercional, las cuales
están disponibles un su sitio web T-DNA Express: signal.salk.edu, donde se puede
visualizar la localización del T-DNA en el genoma de Arabidopsis y los usuario
pueden ordenar las semillas de las plantas transgénicas de interés mediante
internet.
2.5 Tecnología GATEWAY™
En el campo de la biología molecular, la tecnología de clonación se ha
convertido en una herramienta indispensable permitiendo el análisis funcional y/o
de expresión de genes; en los últimos años esta tecnología ha tenido avances
considerables, al desarrollarse un nuevo sistema de clonación llamado
GATEWAY® (Invitrogen), que provee una forma más fácil, rápida y eficiente para
clonar genes o fragmentos de DNA de interés.
El sistema de clonación GATEWAY® reemplaza las endonucleasas de
restricción y la ligasa, por una serie de recombinaciones de sitios específicos, a
través de las cuales se pueden transferir segmentos de DNA entre diferentes
vectores. Este sistema se basa en las reacciones de recombinación que el
bacteriófago λ lleva a cabo en la bacteria E. coli, mediadas por enzimas
codificadas por ambos microorganismos. Los sitios de recombinación se
denominan attP, attB, attR y attL, dichos sitios solo se pueden recombinar en una
forma específica: los sitios attB se recombinan con los sitios attP, y los sitios attL
se recombinan con los sitios attR; por lo que las reacciones de recombinación se
conocen como: reacción BP y reacción LR respectivamente.
La reacción LR es la recombinación entre un vector DE ENTRADA y un
11
vector DESTINO, realizada por una mezcla de enzimas llamadas CLONASA LR,
esta reacción transfiere fragmentos de DNA del vector DE ENTRADA al vector
DESTINO para crear un vector DE EXPRESIÓN (Figura 4). El vector DESTINO
además del gen de resistencia a algún antibiótico, contiene un gen letal para
E.coli denominado ccdB, la proteína codificada por éste gen interfiere con el
reconocimiento de la DNA girasa, causando que el cromosoma se corte en
pedazos por lo que, al no ser llevada a cabo de manera correcta la recombinación,
las bacterias transformadas morirán, garantizando una eficiencia de hasta el 99%.
La reacción BP es lo inverso a la reacción LR, transfiriendo fragmentos de
DNA de un vector DE EXPRESIÓN a un vector DONADOR, para producir
nuevamente un vector DE ENTRADA, creando de esta manera un ciclo (Figura 4).
Esta reacción es catalizada por una mezcla de enzimas llamada CLONASA BP.
Figura 4. Reacciones de clonación del sistema GATEWAY™. Este sistema consta de 2 reacciones
de recombinación de sitios específicos, la reacción LR se lleva a cabo entre un vector de entrada y un
vector destino para dar lugar a un vector de expresión, la reacción BP se realiza entre un vector de
expresión y un vector donador resultando un vector de entrada, de esta manera se crea un ciclo entre
estas dos reacciones.
12
Además de la reacción BP existen otras formas para generar un vector DE
ENTRADA: (1) Clonando un producto de PCR en un vector TOPO que ya contiene
los sitios attL1 y attL2; (2) Clonando segmentos de DNA en vectores DE
ENTRADA utilizando métodos de recombinación estándar con enzimas de
restricción y ligasa, o (3) Preparando una librería de cDNA en un vector DE
ENTRADA.
Este sistema de clonación cuenta con ventajas interesantes como: transferir
uno o más fragmentos de DNA dentro de diferentes tipos de vectores de manera
paralela, mantiene el marco de lectura y la orientación del segmento de DNA
transferido, debido a su alta eficiencia minimiza la necesidad de chequeo de
colonias transformadas; prácticamente cualquier vector se puede convertir en un
vector compatible con este sistema creando un vector DESTINO; el proceso de
clonación es más fácil y rápido.
Todas estas características hacen del sistema GATEWAY® una herramienta
útil en el proceso de clonación, por lo que actualmente, es empleado ampliamente
en la biología molecular.
13
2.6 Desarrollo del fruto
2.6.1 Generalidades
El fruto es un órgano exclusivo de las plantas con flor conocidas como
angiospermas, donde marca un avance clave en su evolución. Este órgano puede
definirse como ovario maduro y tiene dos funciones que son indispensables para
la sobrevivencia de las especies que lo producen: proteger la semilla durante su
desarrollo y asegurar su dispersión una vez que estas maduran.
Los frutos presentan diversos tamaños y formas dependiendo de su hábitat;
pueden desarrollar estructuras exquisitas, para llamar la atención de animales que
al comérselas aseguran la dispersión de sus semillas, este evento es fundamental
en el ciclo de vida de las plantas con frutos.
Los frutos representan un componente importante en la dieta de los
humanos o como materia prima en diversos procesos, por lo que tienen
importancia económica, agrícola y hasta sociocultural. De acuerdo a su
consistencia se pueden clasificar en: carnosos y secos, estos últimos se dividen
en dehiscentes si se abren, dispersando la semilla al madurar o indehiscentes si
no lo hacen (Seymour et al., 2008).
Este órgano se desarrolla a partir del gineceo o pistilo. En A. thaliana el
gineceo se compone de diversas partes: el estigma se encuentra en la parte más
elevada, está compuesto de células elongadas especializadas llamadas “papilas”
donde llega el polen antes de la germinación; en seguida esta el estilo, un cilindro
sólido que conecta al estigma con el ovario; este último se divide en tres zonas en
la parte exterior: (1) Los carpelos o valvas que protegen a los óvulos, (2) El replum
y (3) El margen de las valvas que consta de la capa de separación y de
lignificación, ambas importantes en el proceso de dehiscencia (figura 5) ;en el
interior del ovario se encuentran los óvulos que darán lugar a las semillas, el
septum conecta el replum y divide al ovario a la mitad, en la parte central interna, a
lo largo de todo el fruto se encuentra el tubo de transmisión , a través del cual
crece el tubo polínico que conduce al polen hasta los óvulos para su fecundación y
14
finalmente en la base del gineceo se encuentra el ginóforo que conecta al fruto
con el resto de la planta (Roeder y Yanofsky, 2006) .
Figura 5. Representación esquemática del pistilo y el fruto maduro. En el pistilo de
Arabidopsis se pueden distinguir tres zonas: la zona apical compuesta por el estigma (stigma) y el
estilo (style), la zona media llamada ovario (ovary), compuesta por dos carpelos o valvas (valve), el
replum, el septo (septum), el tubo de transmisión (transmitting tract) y los óvulos (ovule), finalmente
la zona basal formada por el ginóforo (gynophore), a medida que el fruto se desarrollo se diferencia
el margen de la valva (valve margin) formada principalmente por la capa de separación (separation
layer) y la capa de lignificación (lignified layer).
El desarrollo del fruto se ve influenciado por fitohormonas. Las auxinas
juega un papel esencial en el diseño correcto de los diferentes tejidos que
conforman el gineceo, de forma natural, este proceso es desencadenado por
señales posteriores a una fertilización exitosa, por lo que se propuso que esta
fitohormona actúa como un morfógeno a través de un gradiente, controlando el
modelado del gineceo en A. thaliana, de esta manera la concentración mas alta de
auxina se encuentra en la región apical, promoviendo el desarrollo del estigma y el
estilo; concentraciones moderadas de auxinas estimulan el desarrollo del ovario,
incluyendo las valvas y los óvulos, mientras que las concentraciones más bajas de
auxina promueve el desarrollo del ginóforo (Figura 6) (Nemhauser et al., 2000).
15
Figura 6. Modelo propuesto de la distribución de auxinas y su papel en el desarrollo del
fruto. Nemhauser et al. proponen que las auxinas actúan como un morfógeno, donde los
diferentes tejidos se desarrollan de manera dependiente a la concentración de auxinas en el pistilo.
De esta forma una concentración mayor es necesaria para el correcto desarrollo de la parte apical
del pistilo, una concentración moderada se requiere para el adecuado desarrollo de la parte media
y una concentración baja es requerida para el desarrollo de la parte basal del pistilo.
Las giberelinas, a diferencia de las auxinas, están involucradas en procesos
post-fertilización, estimulando la elongación del fruto a través del control de
división y expansión celular. Recientemente se ha descrito que en óvulos la
respuesta a auxinas dependiente de la fertilización desencadena el desarrollo del
fruto a través de la modulación del metabolismo de giberelinas (Dorcey et al.,
2009).
Además,
la
aplicación
exógena
de
citoquininas,
produce
frutos
partenocárpicos (frutos desarrollados sin fertilización), en muchas especies de
importancia agrícola, al igual que en A. thaliana (Roeder y Yanofsky, 2006). Estos
datos sugieren que una red compleja de interacciones hormonales ocurre en el
desarrollo normal del fruto.
El fruto es uno de los órganos más complejos de las plantas por lo que
representa un excelente modelo en el estudio del desarrollo y diferenciación
celular de forma general en plantas.
16
2.6.2 Genes involucrados en el desarrollo del fruto.
En los últimos 15 años se han logrado identificar factores de transcripción
involucrados en el desarrollo del fruto. SHATTERPROOF 1/2 (SHP), factores de
trascripción tipo MADS-box (Liljegren et al., 2000), junto con dos genes rio abajo,
ALCATRAZ (ALC) (Rajani y Sundaresan, 2001), INDEHISCENT (IND) (Liljegren et
al., 2004), y ambos factores de transcripción tipo bHLH; están involucrados en el
desarrollo del margen de la valva; SHP 1/2 y IND controlan conjuntamente el
desarrollo de las capas de separación y de lignificación, mientras SHP 1/2 y ALC
son necesarios solo para la formación de la capa de separación (Dinneny y
Yanofsky, 2004a).
La expresión de SHP 1/2 está regulada negativamente por diferentes
genes de manera específica de acuerdo al tejido del fruto; FRUITFULL (FUL)
(Ferrandiz et al., 2000), factor de transcripción tipo MADS-box, los reprime en la
valva (Liljegren et al., 2004) y REPLUMLESS (RPL), factor de transcripción tipo
Homeobox, en el replum (Dinneny et al., 2005).
Figura 7. Modelo del patrón de formación a lo largo del eje lateral en el ovario de Arabidopsis. Los
gradientes de expresión de dos factores antagonistas hacen posible la formación de tres dominios
diferentes: los factores de la valva (azul) y los factores del replum (amarillo). De esta forma la actividad
de FIL/JAG especifican la formación de la valva, los genes tipo KNOX clase I determinan el replum y el
margen de la valva (verde) es formada en la región en la cual ambos factores son expresados.
17
Los genes FUL y SHP 1/2 son inducidos por JAGGED (JAG) (Dinneny et
al., 2004b), un factor de transcripción con dominio dedo de zinc tipo C2H2 YABBY
3 (YAB 3) (Siegfried et al., 1999) y FILAMENTOUS FLOWER (FIL) (Chen et al.,
1999), los dos últimos miembros de la familia YABBY. JAG, YAB 3 y FIL son
reprimidos por genes de la familia KNOX clase I y estos a su vez, son regulados
negativamente en la valva por ASYMMETRIC LEAVES 1/2 (AS), factores de
transcripción de la familia MYB (Figura 7) (Alonso et al., 2007).
Por otro lado el gen ETTIN (Nemhauser et al., 2000) un factor de
transcripción con dominio de Factor de Respuesta a Auxina (ARF, siglas en ingles)
actúa interpretando las señales hormonales, para establecer los límites de los
diferentes tejidos a lo largo del gineceo. Además de factores de transcripción,
transportadores de eflujo de auxinas como PINFORMED 1 (PIN 1), están
involucrados en el desarrollo del pistilo (Reinhardt et al., 2000).
Como se puede apreciar el fruto es un órgano muy complejo, al igual que la
red de interacciones génicas necesarias para su adecuado desarrollo, la cual
apenas comienza a ser dilucidada. Los genes antes mencionados solo
representan la punta del iceberg y aun queda mucho por realizar.
En el 2004 de Folter y colaboradores, realizaron un estudio de perfil de
expresión de 1304 factores de transcripción de Arabidopsis, con la finalidad de
identificar aquellos factores que estuvieran involucrados en el desarrollo del fruto
en sus diferentes estadíos (Figura 8), en el momento que se realizó este trabajo,
estaban anotados 1 572 proteínas de este tipo (Riechmann, 2002).
Debido a que es difícil diferenciar entre genes involucrados en el desarrollo
de óvulos y genes involucrados en el desarrollo del fruto, pues de forma natural el
desarrollo del fruto es dependiente del desarrollo de los óvulos, ellos utilizaron
como referencia una mutante denominada empty siliques (Marsch-Martinez et al.,
2002), la cual produce frutos sin semillas, para poder diferenciar entre genes
involucrados en estos dos procesos.
El trabajo que aquí se presenta se basa en dicho perfil de expresión, del
cual se seleccionaron diferentes genes, tomando en cuenta, diversos criterios.
18
Figura 8. Matriz del perfil de expresión de factores de transcripción durante el desarrollo del
fruto (silicua) en Arabidopsis. Para éste estudio se utilizaron frutos WT en los estadíos: 0, 4, 8,
12 y 16 DAP ( días después de polinización, por sus siglas en inglés) y la mutante partenocárpica
empty siliques. Los genes co-expresados se clasificaron como pertenecientes a cierto proceso de
desarrollo denominados: desarrollo del pistilo (grupo I), embriogénesis (grupo II-a y II-b),
maduración de semillas (grupo III), maduración del fruto (grupo IV) y desarrollo del fruto ( grupo V).
La barra colocada abajo del análisis de clusters, indica la escala de color de los valores de
expresión de log2 , verde indica expresión baja y rojo expresión alta.
19
3.- OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Identificación nuevos factores de transcripción involucrados en el desarrollo del
fruto en Arabidopsis thaliana.
3.2 Objetivos específicos
1.- Selección de 15 factores de transcripción posiblemente involucrados en el
desarrollo del fruto, en base a su expresión específica en fruto.
2.- Clonación molecular en vectores para silenciamiento.
3.- Transformación de plantas silvestres ecotipo Columbia de Arabidopsis thaliana
mediante Agrobacterium tumefaciens y buscar fenotipos de su descendencia.
4.- Análisis de las líneas insercionales de los genes seleccionados.
5.- Inicio del estudio funcional de un factor de transcripción seleccionado.
20
4.- MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Selección de genes
Los genes con los cuales se trabajó durante este proyecto, se
seleccionaron a partir de un estudio de perfil de expresión de aproximadamente
1100 factores de transcripción de Arabidopsis realizado por de Folter y
colaboradores en el 2004, con la finalidad de identificar aquellos factores que
estuvieran involucrados en el desarrollo del fruto en sus diferentes estadíos.
Dichos genes se seleccionaron tomando en cuenta los siguientes criterios:
Primero, aquellos genes que tuvieran un nivel de expresión más alto entre si,
después de esto obtuvimos 250 genes aproximadamente, de los cuales se checó
que su nivel de expresión fuese mayor en fruto respecto a semillas; esto se realizó
utilizando
los
sitios
web:
www.genevestigator.ethz.ch, (Genevestigator)
y
www.bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi, (Arabidopsis eFP Browser) después
de este chequeo quedaron 23 genes, finalmente se descartaron aquellos
previamente reportados, y se obtuvieron 15 genes.
Tabla 1. Genes seleccionados. Los genes seleccionados pertenecen a diferentes familias de
factores de transcripción, además de una enzima.
LOCUS
DESCRIPCIÓN
At1g68200
Factor de transcripción de la famila: dedo de zinc tipo CCCH
At1g68520
Factor de transcripción de la familia: dedo de zinc tipo B-box
At1g75390
Factor de transcripción de la familia:basic leu-zipper
At1g75410
Factor de transcripción de la familia:Bel1-like homeodomain
At1g76890
Factor de transcripción de la familia: trihelix
At2g32370
Factor de transcripción de la familia: homeobox leu-zipper
At2g44745
Factor de transcripción de la familia:WRKY12
At3g04730
Proteína inducida por acido indolacético: IAA16
At4g00870
Factor de transcripción de la familia: basic helix-loop-helix
21
At4g17460
Factor de transcripción de la familia: homeobox leu-zipper
At4g29080
Proteína inducida por acido indolacético: IAA27
At4g34590
Factor de transcripción de la familia: basic leu-zipper
At4g39330
Enzima: putativa manitol deshidrogenasa
At5g15310
Factor de transcripción de la familia: MYB, (AtMYB16)
At5g46830
Factor de transcripción de la familia :basic helix-loop-helix
4.2 Diseño de las construcciones antisentido.
Para el diseño de las construcciones antisentido se obtuvieron las
secuencias de los genes seleccionados del sitio web TAIR: www.arabidopsis.org,
a partir de las cuales se diseñaron los oligonucleótidos necesarios para amplificar
un fragmento de aproximadamente 300 pares de bases de cada uno de los genes
(Apéndice II).
Los fragmentos se amplificaron mediante PCR utilizando como templado
cDNA obtenido a partir de RNA mensajero de inflorescencia, la reacción se llevó a
cabo en un volumen final de 50µl con los siguientes componentes: 10µl de buffer
para PCR, 1.5µl de 10mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1µl de
50mM de sulfato de magnesio (MgSO4), 3µl de 10mM del par de oligonucleótidos
adecuado, 1µl de cDNA, 0.4 µl de enzima DNA Polimerasa Platinum® Pfx
(Invitrogen™, Carlsbad, California) y 33.1µl de agua libre de DNAsa y RNAsa; con
el siguiente programa:
Tabla 2: Protocolo de PCR para amplificar los fragmentos necesarios para las
construcciones antisentido.
Paso
Temperatura en °C
Desnaturalización
Alineamiento
Elongación
Número de ciclos
94
50
68
Tiempo en
segundos
30
40
30
Ciclos
35
22
Figura 9. Amplificación de los fragmentos de 300 pares de bases de seis genes
seleccionados, necesario para las construcciones antisentido. Con los oligonucleótidos
correctos mediante PCR se amplificaron fragmentos para cada uno de los genes seleccionados, en
esta imagen se muestran 6 de ellos, para los otros 9 genes seleccionados los fragmentos son
similares.
Posteriormente los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa
al 1% (Figura 9), y se purificaron utilizando el kit: PureLink™ PCR Purification Kit
(Invitrogen™) de acuerdo al protocolo del fabricante, con este kit el producto de
PCR se purificó directamente sin necesidad de utilizar un gel de agarosa.
Los fragmentos purificados se clonaron en el vector de entrada pENTR™/DTOPO® siguiendo las instrucciones del manual del kit: pENTR™ Directional
TOPO® Cloning Kit (Invitrogen™). Con la finalidad de reproducir el vector, se
transformaron células electrocompetentes E. coli de la cepa DH5-α con el vector
de entrada; se mezclaron 40µl de células más 1µl del vector, la mezcla se pasó a
una celda de electroporación Gene Pulser® (BIO-RAD, México, D.F.) con una
abertura entre electrodos de 0.2 centímetros, previamente enfriada en hielo,
23
utilizando un electroporador MicroPulser ™ (BIO-RAD), se aplicó un pulso eléctrico
de 1.80 kV a la celda (programa Ec 1), inmediatamente después se adicionó 1ml
de medio LB, las células se incubaron durante 1 hora a 37°C con una agitación de
250 r.p.m., finalmente se sembraron por extensión en superficie 150µl de las
células en una placa con medio LB complementadas con 50mg/L de kanamicina y
se incubaron durante 12 horas a 37°C. Este procedimiento se realizó para cada
uno de los genes seleccionados.
Para verificar si las colonias celulares contenían el vector de entrada con el
fragmento deseado se realizaron PCR de colonia para seis colonias individuales
de cada uno de los genes seleccionados (Figura 10), la reacción se llevó a cabo
en un volumen de 25µl con: 2.5µl de buffer para PCR, 0.5µl de 10mM de cada
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.5µl de 50mM de cloruro de magnesio
(MgCl2), 2µl de 10mM del par de oligonucleótidos adecuado, 0.025 µl de Taq DNA
Polimerasa, 19.48µl de agua libre de DNAsa y RNAsa y para el templado se tomó
una pequeña porción de cada una de las colonias con la ayuda de un palillo de
madera previamente esterilizado.
Figura 10. PCR de colonia del vector pENTR/D-TOPO. Una vez clonado el fragmento en
el vector de entrada se realizó un PCR de colonia para verificar que el vector tuviera el fragmento
de interés, la imagen muestra la amplificación de un fragmento de aproximadamente 300 pb
correspondiente al esperado, en este caso se trata del gen At2g32370
24
Después de la verificación por PCR se realizaron extracciones de DNA
plasmídico de las colonias positivas para cada uno de los genes seleccionados,
utilizando el kit: PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen™) de acuerdo
al protocolo del fabricante. Cada una de las muestras se digirió con la enzima NotI
para linearizar el plásmido (Figura 11), en una mezcla que contenía: 2µl de
plásmido, 0.5µl de enzima, 2µl de buffer REACT® 3 10X, y 15.5µl de agua
desionizada, la mezcla se incubó a 37°C por una hora y se visualizó en un gel de
agarosa al 1%; con lo cual se rectificó el contenido del fragmento de interés.
Figura 11. Digestión del vector de entrada con el fragmento de interés. Después del PCR de
colonia, de las colonias positivas se realizaron extracciones de DNA plasmídico, el plásmido de
entrada contiene un sitio de corte para la enzima Not I, por lo que al ser digerido se espera una
solo banda de aproximadamente 2.9 kb, si el vector contiene el fragmento de interés (carriles 1, 2,
3, 4 y 5) en el carril C se muestra el vector sin digerir.
Una muestra plasmídica para cada gen seleccionado se mandó a
secuenciar, con lo que se corroboró la fidelidad del fragmento amplificado.
Una vez verificado el contenido del fragmento de interés en el vector de
entrada pENTR™/D-TOPO® se realizó la reacción de recombinación con el vector
destino pHellsgate8 (Helliwell et al., 2002) basado en el sistema GATEWAY™
denominada reacción LR, la recombinación se hizo en un volumen de 5µl: 1µl del
vector pHellsgate8, 1µl del vector pENTR™/D-TOPO®, 1µl de buffer LR clonasa
25
5X, 1µl de enzima LR clonasa y 1µl de TE pH 8.0. La mezcla se incubó por 12
horas a 25° C, se adicionó 0.5µl de Proteinasa K en cada tubo y se incubó por 10
minutos a 37°C para desactivar la LR clonasa. Se transformaron células
electrocompetentes de E. coli de la cepa DH5-α con el vector destino, como se
especificó anteriormente, modificando la cantidad de la mezcla de recombinación
a 2µl y el antibiótico de selección a 100mg/L de espectinomicina.
Figura 12. PCR de colonia del vector Hellsgate8. Después de la reacción de recombinación LR
entre el vector de entrada y el vector destino, se transformó E. coli y se realizó un PCR de colonia
para verificar que el vector tuviera el fragmento de interés, la imagen muestra la amplificación de
un fragmento de aproximadamente 300 pb correspondiente al esperado, en este caso se trata de
los genes At4g17460 y At4g29080.
Se verificó el contenido del vector destino pHellsgate8 en las colonias obtenidas
por PCR (Figura 12) y se extrajo DNA plasmídico como se especificó
anteriormente. Con dicho plásmido se transformaron células competentes de
Agrobacterium tumefaciens de la cepa GV3101 como se especificó anteriormente
modificando la temperatura de incubación a 28°C por dos horas, sin agitación; se
sembraron 300µl de las células en una placa con medio LB complementadas con
25mg/L de rifampicina y 100mg/L de espectinomicina, se incubaron a 28°C
durante 60 horas.
26
Figura 13. Digestión del plásmido Hellsgate8 después de la recombinación con el vector
pENTR/D-TOPO. La digestión se llevó a cabo con las enzimas y, primero se incubó una hora con
Xho I, después otra hora con Bam HI. Aquí se muestra para tres de los genes seleccionados.
Se verificó el contenido del vector destino pHellsgate8 en las colonias
obtenidas digiriendo el vector con las enzimas Xho I, y Bam HI.
Inicialmente el vector pHellsgate8 fue diseñado para construcciones de
RNA interferente del tipo Horquilla, sin embargo, al realizar las reacciones de
recombinación LR, las construcciones resultantes presentaban un patrón de
digestión diferente al esperado, el patrón de bandeo esperado cuando el vector
contiene dos veces el fragmento de interés es de 12 529, 1 615, 824 y 350 pares
de bases; sin embargo, al realizar la digestión sólo se obtuvieron dos bandas de
12 529 y 1 590 pares de bases (Figura 13), el patrón de bandeo obtenido es
posible si al momento de la recombinación el vector pierde uno de los dos
fragmentos de interés más el intrón que los separa, y solo queda un fragmento de
interés; al perderse esa parte del vector, también se perderían dos sitios de
restricción por lo que el resultado serían dos bandas en lugar de cuatro, para
corroborar esta hipótesis se mandó a secuenciar el vector después de la
recombinación, utilizando los oligonucleótidos de la figura 14 (Apéndice V), la
secuencia confirmó la hipótesis, el vector había sufrido un rearreglo, donde el
fragmento en dirección sentido y el intrón salen del vector quedando solo el
27
fragmento en dirección antisentido, además del promotor 35S, una característica
interesante en este rearreglo es que, fue el mismo en las 15 construcciones
realizadas, por lo que se nos hizo una buena oportunidad para probar este vector
como un vector para construcciones antisentido utilizando el sistema Gateway,
además de probar si estas construcciones funcionan para factores de
transcripción, ya que para otros tipos de genes se han reportado silenciamientos
que van desde un 10 hasta más del 90% (Tieman et al., 1992, D’Aoust et al.,
1999, Jorgensen et al., 2006, Fagoaga et al., 2007).
B
A
Figura 14. Vector pHellsgate8. Para secuenciar el vector se utilizaron el oligo directo que se une
a la parte media del promotor 35S y el oligo reverso P27-3 que se une a la parte inicial del
terminador OCS, el panel A muestra el vector original y el panel B muestra el vector rearreglado
donde se encuentra el promotor 35S (azul) y el fragmento antisentido (rojo).
28
4.3 Transformación de Arabidopsis thaliana mediante Agrobacterium
tumefaciens.
Plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia fueron crecidas en un
cuarto a 22°C bajo condiciones de luz de día largo (16 horas de luz y 8 horas de
oscuridad) en una mezcla de sustratos compuesta por: tres parte de sunshine, una
parte de perlita y una parte de vermiculita (mezcla para Arabidopsis). Las plantas
de seis semanas de edad fueron transformadas con Agrobacterium conteniendo el
vector destino pHellsgate8 con el fragmento deseado para cada gen seleccionado
por el método de “floral dip” (Clough. y Bent, 1998) modificado, cada inflorescencia
se sumergió por separado en la mezcla de transformación que contenía 50% de
medio MS, 5% de sacarosa, 0.02% de Silwet L-77 y células transformadas de
Agrobacterium.
4.4 Selección de plantas transformadas.
25 días después de la transformación de las plantas con Agrabacterium las
semillas se recolectaron y se seleccionaron las plantas transformadas, sembrando
las semillas en placas con medio MS al 50% sin sacarosa, complementadas con
50mg/L de kanamicina (como antibiótico de selección), se incubaron 22°C bajo
condiciones de luz de día largo (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad), en una
cámara de crecimiento, transcurridos 15 días las plantas transformadas se
transfirieron a una mezcla de sustrato para Arabidopsis, donde completaron su
ciclo de vida. Durante el desarrollo de las plantas transformadas se buscaron
fenotipos donde el desarrollo del fruto estuviera afectado.
29
4.5 Análisis de las líneas insercionales.
Para cada uno de los genes seleccionados se compraron líneas
insercionales obtenidas a través de T-DNA, almacenadas en el Salk Institute
Genomic Analysis Laboratory (SALK), las cuales se analizaron (genotipificación) a
través de PCR. Para esto, se sembraron las semillas compradas, a las cuatro
semanas de edad se extrajo DNA de una muestra de hoja de cada planta,
mediante el protocolo de SHORTY BUFFER (Edwards et al., 1991), el DNA
extraído se utilizó como templado para los PCR’s de la genotipificación, utilizando
oligonucleótidos específicos para cada línea insercional (Apéndice III). Primero se
verifica que las plantas contengan el T-DNA para lo cual se diseñaron
oligonucleótidos para amplificar un segmento que comprenda parte del T-DNA y
parte de la región genómica adyacente donde posiblemente cayó dicho T-DNA, las
plantas en las que se logró amplificar una banda con estos oligonucleótidos fueron
al menos heterocigotas para la inserción correspondiente, para identificar plantas
homocigotas, posteriormente se trató de amplificar el gen en cuestión dándole el
tiempo necesario para amplificar, cuando el gen amplificó significa que un alelo no
está interrumpido por el T-DNA y si no amplificó, los dos alelos del gen están
interrumpidos, por lo tanto esas plantas fueron homocigotas.
La línea insercional SALK_069162 tiene al menos una inserción al inicio del
segundo exón del gen At4g17460 (HAT1), de esta línea se lograron identificar 3
plantas homocigotas (Figura 15), las cuales presentaron el mismo fenotipo en
fruto. Existen otras dos líneas insercionales para este gen, las cuales ya se
pidieron y serán analizadas en un futuro próximo.
30
Figura 15. Genotipificación de línea insercional SALK_069162 mediante PCR. De las 15
plantas analizadas 5 fueron WT (1, 2, 11, 13 y 14), 7 fueron heterocigotas para la inserción (3, 4, 5,
8, 10, 12 y 15) y 3 fueron homocigotas para la inserción (6, 7 y 9).
4.6 Análisis de expresión mediante RT-PCR.
Para verificar si los fenotipos observados eran consecuencia de la
disminución de expresión del gen en cuestión se checó el nivel de expresión del
gen afectado en las plantas transformadas mediante RT-PCR, para lo cual se
seleccionaron 6 plantas para cada una de las tres construcciones antisentido que
presentaron fenotipo, de estas 6 plantas, 2 presentaron fenotipo severo, 2 fenotipo
medio y dos fenotipo WT. Se extrajo RNA total de inflorescencia mediante el
método de cloruro de litio (Verwoerd et al., 1989) el cDNA se obtuvo utilizando la
enzima transcriptasa reversa M-MLV (de Moloney Murine Leukemia Virus por sus
siglas en inglés) (Invitrogen™) de acuerdo al protocolo del fabricante. Además se
realizaron RT-PCR de genes involucrados en el desarrollo de óvulos y pistilo
como: STK, SHP1/2, AG y SEP3, utilizando oligos específicos (Apendice IV).
31
5.- RESULTADOS
5.1 Selección de factores de transcripción posiblemente involucrados en el
desarrollo del fruto
Como primer paso para llevar a cabo este trabajo se seleccionaron factores
de transcripción que posiblemente están involucrados en el desarrollo del fruto de
Arabidopsis, estos genes se seleccionaron a partir de un trabajo previo realizado
por de Folter y colaboradores en el 2004, ellos realizaron un estudio de perfil de
expresión de 1 304 genes la gran mayoría factores de transcripción; dicho trabajo
logró identificar genes que están involucrados en las diferentes etapas del
desarrollo del fruto, los genes se seleccionaron considerando tres criterios
importantes.
La primera depuración se realizó considerando aquellos genes que
presentaran un mayor nivel de expresión entre los 1100 genes del estudio,
después de este paso obtuvimos 250 genes aproximadamente, de estos genes
restantes se verificó que su nivel de expresión fuese mayor en el fruto respecto a
las
semillas,
esto
se
www.genevestigator.ethz.ch,
logró
con
la
ayuda
(Genevestigator)
bin/efpWeb.cgi, (Arabidopsis eFP Browser)
y
de
las
páginas
web:
www.bar.utoronto.ca/efp/cgi-
esto redujo el número de genes
candidato a solo 23; dentro de estos genes se encontraban genes involucrados en
el desarrollo del fruto previamente reportados como :FUL, SHP1, YAB3 y FIL, los
cuales fueron descartados; esta selección dio como resultado 15 genes, los cuales
se muestran en la Tabla 1.
5.2 Obtención de las construcciones antisentido.
Las secuencias de los genes seleccionados se obtuvieron del sitio web
TAIR: www.arabidopsis.org, a partir de las cuales se diseñaron un par de
oligonucleótidos para cada uno de los genes, para amplificar fragmentos de
32
aproximadamente 300 pares de bases. A cada oligonucleótido directo se le
adicionó cuatro bases (CACC) en el extremo 5’, con lo cual se logró clonar los
fragmentos de forma direccional en el vector de entrada pENTR™/D-TOPO®
(Invitrogen™).
Después de poner en práctica el procedimiento descrito en la sección de
Materiales y Métodos, finalmente se obtuvieron 15 construcciones antisentido una
para cada gen seleccionado. Posteriormente con el vector destino se
transformaron células de Agrobacterium de la cepa GV3101, se obtuvieron
colonias en placas de medio LB suplementadas con rifampicina y espectinomicina,
de las cuales al menos 2 colonias dieron positivas al PCR y la digestión.
5.3 Obtención de fenotipos con defectos en el desarrollo del fruto.
Las semillas obtenidas de la transformación de plantas de Arabidopsis con
Agrobacterium se seleccionaron en placas con medio MS suplementadas con
50mg/L de kanamicina, después de dos semanas las plantas resistentes
(transformadas) se pasaron a sustrato y se crecieron en invernadero, durante su
desarrollo se realizaron chequeos visuales con lo cual se lograron identificar varios
fenotipos donde las plantas transformadas presentaron defectos en el desarrollo
del fruto, para confirmar que los fenotipos eran heredables las semillas de las
plantas transformadas se cosecharon, se sembraron y durante su desarrollo se
verificaron los fenotipos antes observados.
De los 15 genes seleccionados para tres de ellos se observaron fenotipos
con defectos en el desarrollo del fruto, en la Tabla 3 se muestra el número de
plantas transformadas obtenidas para cada gen y el número de plantas que
presentaron fenotipo. El porcentaje de incidencia de fenotipos varia del 12 al 20%,
estos valores caen dentro de los parámetros reportados que van de un 10 a un
36% (Lee et al., 1997, Bariola et al., 1999 y Lunkenbein et al., 2006).
33
Tabla 3. Número de plantas transformantes y con fenotipo obtenidas para cada gen. Las
plantas se seleccionaron en medio MS con kanamicina a 50µg/ml, posteriormente se pasaron a
suelo y se crecieron en invernadero, estas plantas presentaron fenotipos con diferente grado de
severidad.
5.3.1 Segregación de fenotipos de las plantas transformadas con las
construcciones antisentido y la línea insercional.
Para cada uno de los tres genes que presentaron fenotipo, se escogieron al
azar 3 plantas para el análisis de segregación de fenotipo. De cada una de las
plantas se sembraron 32 semillas en sustrato para Arabidopsis, y se contabilizaron
las plantas que presentaron fenotipo, los resultados se muestran en la Tabla 4.
Según la segregación de fenotipo de las plantas 1 y 2 para el gen
At4g17460, 1 y 3 para el gen At4g2908 y 3 para el gen At4g00870, éstas plantas
cuentan con una inserción de la construcción antisentido en cuestión, las de mas
plantas cuentan con más de una inserción de dichas construcciones antisentido.
Para la línea insercional SALK_069162, se sembraron todas las semillas de
las tres plantas homocigotas identificadas por la genotipificación, además de 32
semillas provenientes de dos plantas identificadas como heterocigotas, todas
estas semillas se sembraron en sustrato para Arabidopsis, los datos obtenidos se
muestran en la tabla 5.
34
Tabla 4. Segregación de fenotipos de las plantas transformadas con las construcciones
antisentido. Las semillas fueron germinadas en una cámara de crecimiento y crecidas en
invernadero
Tabla 5. Segregación de fenotipos de las plantas de la línea insercional SALK_069162. Las
semillas fueron germinadas en una cámara de crecimiento y crecidas en invernadero
35
De las plantas homocigotas para la inserción toda la progenie presentó el fenotipo
observado inicialmente, para el caso de las heterocigotas, al menos el fenotipo
parece segregar con la inserción. Para reforzar aún más la hipótesis de que el
fenotipo observado se debe a la inserción mencionada con anterioridad, es
necesario realizar experimentos de segregación utilizando el gen de selección,
aunque existe la posibilidad de que este se haya silenciado, además de realizar un
análisis de genotipificación mediante PCR de todas las plantas que presenten
fenotipo, estos experimento se harán en un futuro próximo.
5.3.2 Fenotipo del gen At4g00870 (bHLH14)
En el primer caso se trata de un factor de transcripción perteneciente a la
familia basic Helix-Loop-Helix designado con el número catorce (bHLH14) (ToledoOrtiz et al., 2003),
con el locus At4g00870; las plantas transformadas son
similares a las plantas WT en la fase vegetativa, las diferencias son visibles en la
fase reproductiva donde la silicua (el fruto de Arabidopsis) se desarrolla
aproximadamente un 50% en tamaño respecto a la WT (Figura 16).
Figura 16. Comparación de frutos de Arabidopsis WT vs antisentido At4g00870 (bHLH14). En el
panel A se muestran frutos de Arabidopsis del ecotipo Columbia WT (wild type), los frutos se encuentran
en el estado 17ª (Roeder y Yanofsky, 2006) donde ya han alcanzado su máximo tamaño, los frutos WT
se observan de forma normal. En el panel B se muestran frutos de las plantas transformadas con la
construcción antisentido del gen At4g00870, los frutos se desarrollan aproximadamente la mitad del
tamaño normal, además el cambio de color de las valvas de verde a amarillo se observa más temprano.
36
5.3.3 Fenotipo del gen At4g29080 (IAA27)
En el siguiente caso se trata del gen con el locus At4g29080, perteneciente
al grupo de proteínas inducidas por ácido indolacético (auxinas) designado con el
número veintisiete (IAA27) (Dreher et al., 2006), las plantas transformadas
presentaron diversos fenotipos; éstas tienen un tiempo de floración más corto
respecto a la plantas WT (Figura 17), las inflorescencias también se observaron
alteradas, los primeros capullos florales (botones) de cada inflorescencia no abren,
es decir, no muestran los pétalos ni los estambres sólo se aprecian los sépalos y
la parte superior del pistilo conformado por el estilo y el estigma (Figura 18),
después de aproximadamente los 10 primeros botones, las flores abren similar a
la WT con la diferencia de que la parte superior del pistilo sobresale del resto de
los órganos florales días antes de que la apertura suceda.
Figura 17. Comparación en tiempos de floración entre WT vs antisentido At4g29080 (IAA27). Del
lado izquierdo de la imagen se observa una planta ecotipo Columbia (WT), del lado derecho se muestra
una planta transformada con la construcción antisentido del gen At4g29080, ambas plantas fueron
sembradas al mismo tiempo, bajo las mismas condiciones de luz, en la misma maceta; al parecer la
planta transformada florece más temprano que la planta WT.
37
Figura 18. Comparación de inflorescencia WT vs antisentido At4g29080 (IAA27). En el panel
A se muestra una inflorescencia WT donde las flores y los frutos se desarrollan de forma normal,
en los paneles B y C se observan inflorescencias de plantas antisentido At4g29080, al comienzo
de las inflorescencias los primeros botones no abren, además la parte superior del pistilo sobresale
del resto de los órganos florales antes de que el botón abra, después de los primeros 10 botones
aproximadamente los botones abren de forma normal, pero el pistilo sigue sobresaliendo del botón
floral.
Por otro lado los frutos de las plantas transformadas presentaron
deficiencias en su desarrollo, los cuales tenían tamaños variados que van desde
pistilos que prácticamente no se desarrollaron, sólo se le cayeron los demás
órganos florales, hasta frutos que alcanzaron aproximadamente en 70% de su
tamaño normal (Figura 19).
38
Figura 19. Comparación de frutos WT vs antisentido At4g29080 (IAA27). En el panel A se
observan frutos de plantas ecotipo Columbia (WT), en B y C son frutos de plantas antisentido
At4g29080. Todos los frutos se encuentran en el estado de desarrollo 17ª (Roeder y Yanofsky,
2006) donde se han desarrollado totalmente, los frutos de las plantas antisentido varían mucho de
tamaño, estos van desde pistilos que prácticamente no se desarrollan (panel C) hasta frutos que
alcanzan un 70% aproximadamente de su tamaño normal.
5.3.4 Fenotipo del gen At4g17460 (HAT1)
El tercer y último fenotipo se refiere al gen con el locus At4g17460, que
codifica para un factor de transcripción perteneciente a la familia Homeobox
Leucine-Zipper, denominado HAT1 por Homeobox from Arabidopsis thaliana
(siglas en inglés) (Schena y Davis, 1992), en este caso las plantas transformadas
se desarrollaron de manera normal durante la fase vegetativa, pero al llegar a la
fase reproductiva se observaron deficiencias en el desarrollo del fruto, el cual
alcanzó aproximadamente tres cuartas partes del tamaño de una silicua WT
(Figura 20).
39
Figura 20. Comparación de frutos WT, construcción antisentido y línea insercional del gen
At4g17460 (HAT1). En el panel A se observan frutos de plantas ecotipo Columbia (WT). Tanto los
frutos de la construcción antisentido (panel B) como los frutos de la línea insercional (panel C),
presentan defectos en su desarrollo en diferente grado de severidad, los frutos de la construcción
antisentido alcanzan aproximadamente el 75% del tamaño normal (panel B), mientras que los
frutos de la línea insercional SALK_069162 solo se desarrollan un 20% respecto al WT (panel C).
De manera paralela a la búsqueda de los fenotipos de interés en las plantas
transformadas, se compraron las líneas insercionales obtenidas por el Salk
Institute Genomic Analysis Laboratory (SALK), mediante T-DNA, para cada uno de
los genes seleccionados, las semillas compradas se sembraron y genotipificaron
mediante PCR utilizando los oligonucleótidos adecuados para cada una de las
líneas, diseñados específicamente para el análisis. Durante el análisis genotípico
se lograron identificar plantas homocigotas para todas las líneas pedidas
(Apéndice I), algo importante de resaltar es el hecho de que la mayoría de estas
líneas insercionales, tienen el T-DNA en segmentos no codificantes de los genes,
como son: las regiones promotoras, 5’ y 3’ UTR e intrones, lo que disminuye la
probabilidad de encontrar algún fenotipo en las plantas transgénicas con T-DNA.
Pese a esto, en una línea se observó un fenotipo (SALK_069162), el cual presentó
deficiencias en el desarrollo del fruto (Figura 20).
40
La línea insercional SALK_069162 que presentó el fenotipo de interés
corresponde al factor de transcripción Homeobox Leu-Zip HAT1, del cual también
se observó fenotipo en las plantas transformadas. Los dos fenotipos obtenidos por
métodos diferentes afectan en diferente grado el desarrollo del fruto, en las plantas
homocigotas de la línea insercional las silicuas sólo alcanzan el 20% de su tamaño
normal (Figura 20), en las que se logran desarrollar de una a tres semillas viables.
5.4 Análisis molecular de las plantas transformadas.
De las plantas transformadas se tomaron muestras de inflorescencia, de las
cuales se extrajo RNA total para realizar un chequeo de nivel se expresión del gen
en cuestión mediante RT-PCR, primero se analizaron las muestras para los genes
At4g00870 (bHLH14) y At4g29080 (IAA27) las cuales muestran que en las plantas
transformadas existe disminución de expresión del gen afectado respecto a
plantas WT (Figura 21).
Para el gen HAT1 se encontró una versión de “splicing” alternativo predicha
en el sitio web de NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/, la cual
incluye la parte final del segundo exón, segundo y tercer intrón y tercer y cuarto
exón (Figura 22), para poder amplificar esta versión de manera específica se
diseñó un oligonucleótido a partir de una región que forma parte del primer exón
del “splicing” alternativo, pero en la versión “normal” (gen completo) el
oligonucleótido se alinea en el segundo intrón (Figura 22).
41
Figura 21. Análisis de expresión mediante RT-PCR de las plantas transformadas con las
construcciones antisentido. Las muestras fueron tomadas de 6 plantas diferentes para cada
construcción antisentido, en la imagen de los geles, los números, indican la planta de la cual
proviene la muestra tomada para el análisis, de las cuales se observa la severidad del fenotipo en
las imágenes superiores, el orden de las muestras en los geles es el mismo de las imágenes de los
frutos para las construcciones antisentido.
42
Figura 22. El gen HAT1 con sus diferentes versiones de “splicing”. Aquí se muestra en primer
plano el sitio donde se encuentra la inserción de T-DNA a 269 bases del codón de inicio (atg),
también se muestran
las tres diferentes versiones del gen, además de los oligonucleótidos
utilizados para amplificar éstas versiones, el número 3 es específico para amplificar las dos
versiones más pequeñas, los números indican la posición en nucleótidos, en las cuales inician o
terminan las regiones UTR (rojo), exones (azul) e intrones (verde) de las diferentes versiones.
Se probaron los oligonucleótidos necesarios para amplificar la versión de
“splicing” alternativo del gen HAT1. Al hacer el RT-PCR se esperaba amplificar
una banda de 397 pares de bases que incluye los dos exones del “splicing”
alternativo, sin embargo, al visualizar el producto del RT-PCR en un gen de
agarosa al 1.2% se observaron dos bandas, una correspondiente al peso
esperado de 397 pares de bases, y la otra banda correspondía a un fragmento de
498 pares de bases, la cual se podría obtener al amplificar el “splicing” alternativo,
incluyendo el intrón (Figura 23).
Con la finalidad de verificar si los fragmentos amplificados correspondían al
“splicing” alternativo con y sin el intrón, se llevó a cabo de nuevo un RT-PCR con
43
los oligonucleótidos adecuados, los fragmentos obtenidos se purificaron a partir de
un gel de agarosa al 1 % y se mandaron a secuenciar.
Figura 23. Amplificación de las versiones cortas de “splicing” alternativo del gen HAT1. Al
tratar de amplificar la versión pequeña previamente predicha del gen HAT1 de 397 pares de bases,
se logró amplificar una banda mayor extra que corresponde a la versión pequeña del gen con el
intrón de 498 pares de bases.
Los resultados arrojados de la secuenciación corroboraron la hipótesis
anterior, pues las secuencias de los fragmentos correspondieron al “splicing”
alternativo del gen HAT1 sin el intrón (397 pares de bases) y con el intrón (498
pares de bases) (Figura 23).
Una vez aclarada la situación, se realizó el análisis de expresión de las
plantas transformadas para el gen HAT1, en las cuales se logró verificar una
disminución de expresión de las diferentes versiones del gen (Figura 24B).
44
Figura 24. Análisis de expresión del gen At4g17460 (HAT1) mediante RT-PCR. En el panel A
se muestra el RT-PCR realizado en las plantas de la línea insercional, en el panel B el RT-PCR en
las plantas transformadas con la construcción antisentido. Las muestras fueron tomadas de 6
plantas diferentes para la construcción antisentido, y de las 3 plantas que resultaron homocigotas
en el caso de la línea insercional SALK_069162 (Materiales y Métodos). En la imagen superior se
muestra la severidad del fenotipo de las plantas de las cuales provienen las muestras tomadas
para el análisis de las plantas antisentido, para el caso de la línea insercional el fenotipo se
muestra en la figura 20C y es similar para las tres plantas homocigotas.
La línea insercional de gen HAT1 tiene una inserción de T-DNA localizada
al inicio del segundo exón (Figura 22), para dicha línea también se checó el nivel
de expresión del gen afectado, al hacer el análisis utilizando los oligonucleótidos
necesarios para amplificar las diferentes versiones del gen (Figura 24A), se
45
observó lo siguiente; para la versión del gen completo, no se logró visualizar
alguna banda, lo cual indicó que para la versión completa del gen HAT1, es una
línea de pérdida de función (knockout), en el caso de las otras dos versiones se
lograron observar débiles bandas lo cual indica que aunque la disminución de la
expresión de dichas versiones es considerable, todavía existe expresión de estas
versiones.
Se realizó una traducción de la secuencia de nucleótidos a aminoácidos de
las diferentes versiones de “splicing” del gen HAT1 con la ayuda del programa
BioEdit descargado del sitio web: www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html, con lo
cual se obtuvo para la versión completa, una proteína de 282 residuos de
aminoácidos, para la versión pequeña sin el intrón una proteína de 131 residuos y
para la versión pequeña con el intrón una proteína de 109 residuos de
aminoácidos (Figura 25).
Figura 25. Dominios conservados en las proteínas predichas de los diferentes “splicing”
alternativos del gen HAT1. Las tres proteínas predichas contienen al menos un dominio
conservado, en rosa se muestra el dominio N-terminal asociado al Homeodominio (HD-ZIP-N), en
verdel el Homeodominio (HD) y en azul se muestra el dominio Leucine-Zipper asociado al
Homeodominio (HALZ). Los números indican la posición en aminoácidos dentro de la proteína. En
la parte izquierda se muestran las diferentes versiones del gen HAT1 con UTR (rojo), exones (azul)
e intrones (verde).
46
Posteriormente
con
dichas
secuencias
proteicas
se
hizo
un
análisis en busca de dominios conservados en el sitio web de NCBI:
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi, lo que arrojó diferentes dominios,
la versión completa contiene tres dominios: un dominio N-terminal al cual no se le
ha asignado función alguna hasta el momento, un Homeodominio que es capaz
de interactuar con el DNA y un dominio de Leucine-Zipper que interviene en
interacciones proteína-proteína; la versión pequeña sin el intrón contiene dos
dominios: un Homeodominio y un dominio de Leucine-Zipper; finalmente la versión
pequeña con el intrón solo contiene el dominio de Leucine-Zipper (Figura 25).
Figura 26. Diferencias entre los frutos de la línea insercional y los frutos de la construcción
antisentido para el HAT1. En el panel A se muestra la vista frontal de uno de los carpelos, del
fruto WT, los frutos de la construcción antisentido (panel C) muestran una estructura adicional en la
parte central y a lo largo del carpelo algo que no ocurre en los frutos de la línea insercional (panel
B).
47
Figura 27. Inflorescencia terminal de las plantas transformadas con la construcción
antisentido y la línea insercional para el gen HAT1. El panel A muestra la inflorescencia de una
planta transformada con la construcción antisentido, las flechas indican los sépalos con estructuras
carpeloides y óvulos ectópicos; el panel B muestra la inflorescencia de una planta de la línea
insercional, la flecha indica una estructura carpeloide en lugar de un óvulo ectópico; el panel C
muestra un sépalo de la línea insercional, las flechas indican óvulos ectópicos y estructuras
carpeloides .
A pesar de que tanto las plantas transformadas con la construcción
antisentido, como la línea insercional presentan defectos en el desarrollo del fruto
en diferente grado, existe una característica observada en los frutos de las plantas
transformadas que no presentan los frutos de la línea insercional, la cual consiste
en una estructura adicional en la parte central y a lo largo de cada carpelo, dicha
estructura tampoco se observa en los frutos de plantas WT (Figura 26),
Por otro lado, en las plantas transformadas con la construcción antisentido y
en la línea insercional referente al gen HAT1 se observó un fenotipo en sus
inflorescencias terminales, en las cuales algunos órganos florales adquieren
identidades diferentes, los sépalos se transforman en estructuras carpeloides
(adquieren identidad de carpelo) teniendo tejido estigmático en la parte apical y
óvulos en sus dos bordes; además los estrambres prácticamente se pierden
(Figura 27).
48
Figura 28. Análisis de expresión de genes involucrados en el desarrollo de óvulos y pistilo,
en inflorescencias terminales de las plantas transformadas con la construcción antisentido
y la línea insercional para el gen HAT1 y en WT. El RT-PCR indica una disminución de
expresión de los genes SEEDSTICK (STK) SHATTERPROOF1 (SHP1), AGAMOUS (AG) y
SEPALLATA3 (SEP3), en cambio del gen SHATTERPROOF2 (SHP2) no muestra cambio de
expresión respecto al WT.
.
En este caso se realizó un análisis de expresión mediante RT-PCR de
genes clave en el desarrollo del pistilo y los óvulos, en las inflorescencias
terminales de dichas líneas, los genes analizados fueron: SEEDSTICK (STK),
SHATTERPROOF (SHP 1/2), AGAMOUS (AG) y SEPALLATA3 (SEP3). Los datos
iniciales indican que tanto en las plantas transformadas con la construcción
antisentido como en la línea insercional existe una disminución en la expresión
con respecto al WT de 4 de los 5 genes: STK, SHP1, AG y SEP, lo cual podría
estar relacionado con el fenotipo observado antes descrito; en cambio, para el gen
SHP2 el nivel de expresión es similar en los tres casos (Figura 28).
49
6.- DISCUSIÓN
La regulación de la expresión génica, se lleva a cabo a través de
mecanismos complejos, que involucran una gran diversidad y número de
proteínas, entre ellas podemos destacar los factores de transcripción.
Durante este trabajo se seleccionaron genes que posiblemente están
involucrados en el desarrollo del fruto de Arabidopsis, estos se seleccionaron a
partir de un estudio de perfil de expresión de 1304 genes la gran mayoría factores
de transcripción en las diferentes etapas del desarrollo del fruto, realizado en el
2004 por de Folter y colaboradores.
Después de varias depuraciones tomando en cuenta criterios antes
mencionados, se redujo el número de genes candidato a solo 23; de los cuales
fueron descartados aquellos previamente reportados lo que dio como resultado 15
genes. Dentro de estos genes descartados se encontraron: FUL, SHp1, YAB3 y
FIL, de los cuales se ha demostrado su participación en el desarrollo del fruto, esto
nos indicó que los criterios de selección llevados a cabo fueron adecuados.
De los genes seleccionados se amplificó un fragmento de 300 pares de
bases para las construcciones antisentido, utilizando el sistema GATEWAY™
(Invitrogen). Para dicho fin se utilizó el vector destino Hellsgate8 (Helliwell et al.,
2002), al hacer la reacción de recombinación, se presentó un rearreglo en el
vector, pues al final la construcción quedaba solo con la cadena antisentido y se
perdía la cadena sentido y el intrón que separa a las dos cadena sentido y
antisentido. La hipótesis se corroboró al secuenciar el vector con el fragmento de
interés. Una característica interesante en este rearreglo es que, fue el mismo en
las 15 construcciones realizadas, por lo que se nos hizo una buena oportunidad
para probar este vector como un vector para construcciones antisentido utilizando
el sistema Gateway, además de probar si estas construcciones funcionan para
factores de transcripción, ya que para otros tipos de genes se han reportado
silenciamientos que van desde un 10 hasta más del 90% (Tieman et al., 1992,
D’Aoust et al., 1999, Jorgensen et al., 2006, Fagoaga et al., 2007).
Después de transformar y seleccionar las plantas transformadas de las 15
construcciones antisentido para los genes seleccionados se observaron fenotipos
50
en los cuales se afectó el desarrollo del fruto, para tres de estos genes: At4g00870
el miembro número catorce de la familia Basic Heleix-Loop-Helix (bHLH14),
At4g29080 una proteína inducida por ácido indolacético la número vientisiete
(IAA27) y At4g17460 un miembro de la familia Homeobox Leucine-Zipper
denominado HAT1.
Para el gen At4g00870 las plantas transformadas presentan un fenotipo
donde el fruto alcanza aproximadamente el 50% del tamaño normal (Figura 16), se
ha reportado que miembros de esta familia se encuentran participando en un
amplio rango de procesos biológicos como: señalización por luz o por hormonas,
expresión de genes por hormonas, (Toledo-Ortiz et al.,
2003) diferenciación
celular e incluso genes como SPATULA (Heisler et al., 2001) y ALCATRAZ (Rajani
y Sundaresan, 2001) involucrados en el desarrollo del gineceo, por lo que este
gen posiblemente podría estar participando en algún proceso de expansión o
proliferación celular de acuerdo a la características del fenotipo observado, para
corroborar esta hipótesis es necesario verificar si los diferentes tejidos que
componen el fruto presentan alguna diferencia a nivel celular con respecto a la
WT.
En el caso del gen At4g29080 (IAA27) las plantas transformadas presentan
diversos fenotipos, primero se observó fenotipo en el tiempo de floración, donde
las plantas transformadas florecen más temprano respecto a las WT (Figura 17),
hasta el momento no existen reportes donde se involucre directamente a las
auxinas con el tiempo de floración; sin embargo, se ha demostrado que plantas
WT florecen más temprano cuando son asperjadas con giberelinas (Wilson et al.,
1992), además mutantes donde se afecta la biosíntesis de giberelinas como gal-3
(Wilson et al., 1992) presentan floración tardía. Recientemente se reportó que las
giberelinas pueden actuar a través de una señalización por auxinas (Dorcey et al.,
2009), por lo cual proponemos una hipótesis: La floración temprana de las plantas
transformadas se puede deber a una anomalía en la señalización por auxinas que
finalmente desencadena en una anormalidad en el equilibrio de giberelinas; para
corroborar dicha hipótesis es necesario realizar experimentos de floración.
Otro de los fenotipos observados en la plantas transformadas para este gen
51
es una desincronización en el desarrollo de los órganos florales (Figura 18), en los
capullos florales WT los órganos se desarrollan de forma paralela, de tal manera
que al momento en que éstos abren, las anteras se encuentran a la misma altura
que el estigma situado en la parte apical del pistilo, el cual está compuesto de
estructuras especializadas que cumplen la función de captar el polen momentos
antes de la fertilización, en cambio en las plantas transformadas la parte superior
del pistilo sobre sale del resto de los órganos florales cuando los capullos están
todavía cerrados, lo cual ocasiona que al momento de que los capullos abren, el
pistilo se encuentra más desarrollado que los demás órganos, provocado que las
anteras y el estigma no se encuentren en pleno contacto para llevar a cabo una
fertilización eficiente, lo que trae como consecuencia que el fruto no se desarrolle
completamente como en el WT.
En este caso, al afectar la correcta expresión de un gen de la familia de
proteínas de respuesta a auxinas como es el IAA27, la activación de uno o más
genes tipo ARF que en condiciones normales están siendo reprimidos por genes
de la familia AUX/IAA, se puede dar de forma más temprana en el inicio del
desarrollo del pistilo con respecto al WT lo que posiblemente ocasiona que el
pistilo se desarrolle un poco antes que el resto de los órganos florales, causando
así las características fenotípicas observadas en las plantas transformadas.
Respecto al gen At4g17460 denominado HAT1, observamos fenotipos que
presentan defectos en el desarrollo del fruto tanto en plantas transformadas con la
construcción antisentido, como en la línea insercional de T-DNA (Figura 20)
obtenida a través del Salk Institute Genomic Analysis Laboratory (SALK);
en
ambos casos el desarrollo del fruto se ve afectado, presentando una mayor
severidad de fenotipo en las plantas de la línea insercional.
Para el gen HAT1 se reporta una proteína de 282 residuos de aminoácidos,
la cual contiene tres dominios conservados, un dominio N-terminal con función
desconocida hasta el momento, un dominio de unión al DNA denominado
Homeodominio y un dominio Leucine-Zipper asociado al Homeodominio
involucrado en interacciones proteína-proteína (Figura 25). Además de esta
proteína se predice al menos una versión de “splicing” alternativo, la cual tiene un
52
codón de inicio diferente a la proteína anterior y diferente al canónico ATG, que es
AAG.
Debido a lo mencionado anteriormente para el gen HAT1, éste se
seleccionó para iniciar su análisis funcional. Con esto en cuenta se diseñaron
oligonucleótidos capaces de amplificar estas dos versiones por separado, al
realizar el RT-PCR se observó que para la versión pequeña se amplificó dos
bandas en lugar de una, las bandas se purificaron y secuenciaron, una secuencia
correspondía a la versión de “splicing” predicha, y la otra correspondía a la versión
corta con el intrón incluido, estas dos versiones codifican para proteínas truncadas
de la versión de 282 residuos. La versión corta sin el intrón codifica para una
proteína de 131 residuos con dos dominios conservados: el Homeodominio y al
dominio Leucine-Zipper asociado al Homeodominio, la versión corta con el intrón
codifica para una proteína de 109 residuos, la cual incluye sólo el dominio de
Leucine-Zipper (Figura 25), de esta manera a partir de un solo gen se pueden
obtener tres proteínas con la capacidad de interactuar entre ellas o con otras
proteínas creando una red regulatoria que resulta interesante para un estudio
posterior. En el 2008 Youn-Sung y colaboradores reportaron que proteínas
pequeñas de 60 a 100 residuos de aminoácidos aproximadamente, que contienen
sólo un dominio Leucine-Zipper denominados LITTLE ZIPPERS, son capaces de
actuar como inhibidores competitivos de genes de la familia Homeobox-LeucineZipper grupo III (HD-ZIP III), y además que actúan de forma selectiva, por lo que
convendría realizar estudios de interacción proteína-proteína mediante el sistema
de dos híbridos.
A pesar de que tanto las plantas transformadas con la construcción
antisentido, como la línea insercional presentan defectos en el desarrollo del fruto
en diferente grado, existe una característica observada en los frutos de las plantas
transformadas que no presentan los frutos de la línea insercional, la cual consiste
en una estructura adicional en la parte central y a lo largo de cada carpelo (Figura
26), esta singular diferencia puede ser consecuencia de una alteración en la red
regulatoria que existe entre estas tres proteínas del gen HAT1, ante una posible
interacción entre ellas, un cambio en las proporciones de cada una de estas
53
proteínas podría causar un efecto diferente dependiendo de la proteína que se vea
más afectada. De esta manera, el hecho de que en la línea insercional se vea más
afectada la versión larga ocasiona un mayor impacto en el desarrollo general del
fruto, en cambio, en las plantas antisentido, las versiones cortas están más
afectadas lo que causa un efecto de forma más específica obteniendo una
estructura extra en los carpelos. Aunque no se puede descartar la posibilidad de
que debido a que se trata de una construcción antisentido y pese a que se hicieron
los análisis necesarios para minimizar esta posibilidad, esta estructura extra sea el
resultado de la afectación de expresión de un gen muy cercano al gen HAT1.
Además del fenotipo en fruto, las plantas antisentido e insercionales del gen
HAT1 también presentaron fenotipo en las inflorescencias terminales, donde
ciertos órganos florales cambian de identidad y se observa la aparición de óvulos
ectópicos, esta conversión ectópica es más severa en las plantas de la línea
insercional respecto a las plantas de la construcción antisentido (Figura 27); al
checar la expresión de genes clave en el desarrollo del pistilo y los óvulos, se
observaron cambios de expresión de estos genes con respecto a las plantas WT,
esto nos indica que una cambio en la expresión del gen HAT1 puede ser capaz de
alterar la expresión de genes como: STK, SHP1, AG Y SEP3, pero no de SHP2
(Figura 28).
Se ha reportado que la expresión ectópica de SHP2 en un
fondo de
pérdida de función de AG, es capaz de restaurar el desarrollo del pistilo (Pinyopich
et al., 2003), también la expresión ectópica de STK causa óvulos ectópicos
(Favaro et al., 2003), con estos antecedentes y de acuerdo al fenotipo observado
de conversión de sépalos a estructuras carpeloides y óvulos ectópicos, se
esperaría un aumento en la expresión de los genes STK y SHP1/ 2, sin embargo,
se observó una disminución de expresión de STK , SHP1, así como de AG y SEP3
y no hay cambios aparentes en el gen SHP2, la disminución de expresión del gen
AG y la conservación de expresión del gen SHP2, es una analogía de la expresión
ectópica de SHP2 en un fondo de pérdida de función de AG, lo cual podría
explicar la transformación de sépalos a órganos carpeloides, sin embargo,
también existe la posibilidad de que los cambios de identidad de órganos se deba
54
a la alteración en el patrón de expresión de otros genes ya sean reportados o no,
que pudieran estar involucrados en el desarrollo de carpelos y óvulos.
55
7.- CONCLUSIONES
De los 15 genes seleccionados se obtuvieron fenotipos visibles para tres de ellos:
At4g17460 (HAT1), At4g29080 (IAA27), At4g00870 (bHLH14) en los cuales se
corroboró una disminución en la expresión del gen afectado.
Para el gen At4g17460 o HAT1 se obtuvo fenotipo con la construcción antisentido
y con la línea insercional SALK_069162.
Se logró identificar a nivel de expresión transcripcional, tres diferentes versiones
del gen HAT1, dos de ellas predichas.
Una disminución en la expresión del gen HAT1 es capaz de ocasionar alteraciones
en la identidad de los órganos florales.
56
8.- PERSPECTIVAS
Analizar las otras líneas insercionales para el gen HAT1.
Realizar el análisis de segregación de plantas heterocigotas para la línea
insercional SALK_069162 del gen HAT1.
Analizar las cruzas de líneas marcadoras y mutantes en fruto previamente
reportadas.
Realizar análisis de hibridación in situ para el gen At4g17460 (HAT1).
Analizar los frutos de las plantas antisentido y de la línea insercional del gen
At4g17460 (HAT1) realizando cortes y tinciones.
Realizar ensayos de interacciones proteína-proteína de las diferentes versiones
del gen At4g17460 mediante el sistema de dos híbridos.
Realizar fusiones transcripcionales y traduccionales de las diferentes versiones del
gen At4g17460 (HAT1), utilizando como genes reporteros GFP y GUS.
Realizar ensayos de tiempo de floración con las plantas transformadas con la
construcción antisentido para el gen At4g29080 (IAA27), para verificar si existe
alguna alteración en ese proceso biológico.
57
9.- REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
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62
10.- APENDICES
APENDICE I. Análisis de genotipificación de las líneas insercionales para los
genes seleccionados.
63
APENDICE
II.
Oligonucleótidos
para
amplificar
fragmentos
aproximadamente 300 pares de bases para cada gen seleccionado.
64
de
APENDICE III. Oligonucleótidos utilizados para la genotipificación de las
líneas insercionales. Cuando sólo se muestra uno o ningún oligo significa que se
utilizaron los oligos del APENDICE II.
SECUENCIA 5’
3’
GEN
At4g39330
LINEA INSERCIONAL
SALK_103565
CODIGO
SDF147
SDF148
TTTATCAACAACGTCCAACCAG
TGTTTCTGACTCTGTCTTAGTC
At2g32370
RP
LP
SALK_045543
RP
SDF149
AAAGGTACGACCTTAGCGCT
LP
CS859330
SDF150
GGTTTCCGACATTTCCCTTAG
At5g15310
SDF151
SDF152
TCTTAGTCACCGCCATTTCAC
GTTTTGAGAGCAAAGAAATAAGAACC
At3g04730
LP
RP
SALK_139276
RP
SDF153
AAACAATAATTGAGGCCAGGC
LP
SALK_114809
SDF154
TTTCAGGCAACTATGGACCAC
At3g04730
SDF155
SDF156
ATTTAGAGCCAAGACAAGGCC
ATTTCTCGATATAATGATTATCAACGAG
At1g68200
RP
LP
SALK_045897
RP
SDF157
ATTCCTCATAATTTCCCTCGC
LP
SDF158
ATGCATCACAGAGGAGGATTG
At1g68520
SALK_074343
SDF159
SDF160
CACGAATAATGCCAAGAGTGG
ATTGAACTTATCACCATCAACAAGAAG
At1g76890
RP
LP
SALK_014451
RP
SDF161
GATAAAATGGTCCATCCCACC
LP
SALK_024999
SDF162
CTTCTTCCTCGTCAGATGCAG
RP
LP
SALK_018229
SALK_069162
RP
SALK_080995
SDF163
SDF164
ACGTGTCAAGTTCACGTCTCC
TTCTTTCCAGTGATCCCGACC
OLIGOS DE APÉNDICE II
SDF165
ATGATGATGGGTAAAGAGGATTTG
LP
SDF166
TCTCCTTCTTTCCCCATTCAC
RP
CS125706
SDF167
GAGGGACGTACAGACGATAC
LP
SDF168
GATTCAGCCACATCCACAATC
RP
SALK_070738
SDF169
GAGACAACTCCTGCGATTGAG
At4g29080
SDF170
SDF171
CTCTTTTCATGCTTCTGGTGG
CAAATATAATTGTGGACAAACTTTTGAAG
At5g46830
LP
RP
SALK_054612
At4g00870
At4g34590
At4g17460
At2g44745
At1g75410
65
At1g75390
RP
SALK_084241
SDF172
TGGTTCTTCTTGGTTTCCATG
RP
SDF173
TCGAGTGACCCATGATAACAAC
SDF40
ATTTTGCCGATTTCGGAAC
T-DNA
APENDICE IV. Oligonucleótidos utilizados para los RT-PCR. Para los genes
previamente seleccionados que presentaron fenotipo de interés, el análisis se
realizó utilizando los oligos del APENDICE II.
CÓDIGO
SDF189
76
SECUENCIA 5’
3’
CAAGGGCTTTATTGTAAAACTACAG
AGACCTAGGAACGCATCACATC
REV
SDF217
SDF218
GCTAAGCTGAGACAACAGATC
TCCGAGATGAAGAATTTTCTTGTC
FOR
SDF219
GCTAATACTCAGTACTATCAGCAAG
REV
SDF220
GAGGGGAAGAAACAAGTTATCATG
FOR
SDF219
GCTAATACTCAGTACTATCAGCAAG
REV
SDF221
CTAGTGTCATACGAACCTCC
FOR
PDS1396
CCAAACCGCTCTCCAGTTAG
REV
PDS1397
CATCAACATAAGCATAAAATTCACTG
FOR
PRO672
ATGGGAAGAGGGAGAGTAG
REV
PDS286
TAGAGTTTTATTTGTCTCAGTC
GEN
DIRECCIÓN
HAT1 VERSIÓN CORTA
FOR
REV
SEEDSTICK
FOR
SHATTERPROOF1
SHATTERPROOF2
AGAMOUS
SEPALLATA3
APENDICE V. Oligonnucleótidos utilizados para secuenciar las clonas
antisentido en el vector Hellsgate8 rearreglado.
SECUENCIA 5’
3’
CÓDIGO
DIRECCIÓN
35S
FOR
CAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCC
P27-3
REV
GAGCTACACATGCTCAGG
66