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OLI-75
DEGRADACIÓN DE SIMAZINA POR UN GRUPO DE BACTERIAS
AISLADAS DEL OLIVAR CORDOBÉS
RAQUEL SANTIAGO1, RAFAEL DE PRADO2 Y ANTONIO R. FRANCO1
(1) Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular
(2) Dpto. de Química Agrícola y Edafología. Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales.14071
Córdoba. España
Telf.- +34 957 211085. [email protected] , [email protected]
Proyecto CAO01-027 de la Junta de Andalucía
FORO DEL OLIVAR Y MEDIO AMBIENTE
RESUMEN
La biodegradación de herbicidas, el conocimiento de las rutas de detoxificación de estos productos,
así como la identificación de los microorganismos que llevan estos procesos a cabo son
indispensables para poder plantear las estrategias necesarias para mantener un equilibrio entre la
agricultura actual y mantenimiento del medio ambiente. Nosotros hemos analizado la capacidad de
dos suelos de olivar de la provincia de Córdoba para mineralizar simazina, herbicida de preemergencia que fue de aplicación generalizada en el olivar andaluz durante años. Los dos
presentaron una cinética de mineralización típica de suelos adaptados al herbicida. Aunque, el suelo
tomado de la comarca de Cabra presentó una capacidad de degradación superior, llegando a
mineralizar entorno al 70% del herbicida aplicado en 80 días, mientras que el otro suelo, comarca de
Baena, fue capaz de degradar hasta CO2 alrededor del 46% en el mismo periodo de tiempo. De
estos suelos hemos aislados microorganismos capaces de crecer con simazina como única fuente de
carbono y/o nitrógeno. La tasa de degradación de simazina en medio líquido de un grupo de estos
microorganismos fue muy elevada ( 60 mg.L-1 en una semana). Hemos detectado genes implicados
(atzC y trzN) en la degradación de simazina en este grupo y se han identificado a estos
microorganismos como Variovorax sp, Pseusothantomonas mexicana Acidovorax sp y Methylopila
capsulata, mediante secuenciación de fragmentos específicos del ADN que codifica para el 16S del
ARN ribosómico.
--oOo-El uso de agroquímicos en la agricultura actual, es una práctica generalizada. Entre todos los
productos utilizados tienen gran importancia aquellos que controlan el crecimiento de las malas
hierbas, en Europa el 46% de los agroquímicos que se aplican en campo son herbicidas. El olivar
andaluz, también sigue la tendencia de generalización y aumento de aplicación de estos productos.
Este uso generalizado nos lleva directamente a plantearnos el efecto que tienen los herbicidas sobre
los ecosistemas donde se aplican y sobretodo hace necesario poner a punto una serie de
herramientas de biorremediación para poder eliminar los herbicidas residuales que se pueden
acumular en el suelo y agua. 1,2 Nosotros trabajamos con simazina, herbicida sistémico de preemergencia, que fue muy utilizado en el olivar andaluz hasta principios de 2003. La biodegradación
es la ruta más importante para la detoxificación de suelo. Hay descritas diferentes bacterias gram
positiva y negativas y algún hongo que son capaces de degradar simazina.3-6 Nosotros trabajamos
para obtener microoganismos del suelo del olivar cordobés capaces de degradar simazina para que
puedan ser utilizados en la regeneración de suelos contaminados.
OBJETIVOS
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Analizar la capacidad de biodegradación de simazina de dos suelos de olivar andaluz.
Aislar del suelo los microorganismos responsables de la degradación de simazina.
Identificar los microorganismos aislados.
Caracterizar la ruta de degradación.
1
METODOLOGÍA
Capacidad de biodegradación del suelo.
Las muestras de suelo fueron recogidas de dos olivares de la provincia de Córdoba (comarcas de
Cabra y Baena), los puntos de muestreo fueron registrados por GPS. En ambos casos se conocía
que durante años se había aplicado simazina. Las dos muestras fueron parcialmente secadas y
tamizadas (5 mm). Para analizar la capacidad de biodegradación de estos suelos se realizaron
ensayos de mineralización. Una mezcla de 14C-simazina (14C se encuentra en el anillo triazínico del
herbicida) y simazina sin marcar (1.5 mg Kg-1). Estos suelos fueron incubados en recipientes
herméticos. El 14CO2 producido por la biodegradación del herbicida fue atrapado por 5 ml de NaOH
0.2 M. Este ensayo se realizó por triplicado para cada suelo. Los recipientes con NAOH fueron
reemplazados periódicamente y el 14CO2 fue determinado en un contador de centelleo (Beckman)
Aislamiento de microorganismos capaces de degradar simazina.
Se diluye el suelo en un mínimo medio salino con simazina (60 mg L-1), se incuba a 25 ºC, oscuridad
con fuerte agitación. 7 Cada 15 días se realizaba una nueva dilución hasta obtener una dilución 10-5
del suelo. Alícuotas de estas diluciones fueron sembrados en placas de medio mínimo salino
suplementado con simazina (2 g.L-1), citrato (1 g.L-1), vitaminas y cicloheximida . Los microorganismos
capaces de crecer en este medio fueron seleccionados y se inocularon en medio mínimo salino con
simazina (60 mg.L-1). La tasa de degradación de simazina de cada microorganismo se obtuvo
cuantificando alícuotas de cada medio periódicamente por análisis en HPLC.
Detección de genes implicados en degradación de simazina.
Se obtuvo el ADN de las bacterias aisladas. La células fueron digeridas con proteinasa K (1 mg. L-1 ,
Tris- Cl 0.5 M pH8), lisozyma ( 1 mg.L-1) y RNasa (0.005 mg.L-1). Posteriormente el ADN fue extraído
con fenol:cloroformo:isopronol (25:24:1) y precipitado con etanol. El ADN fue guardo a -20ºC hasta su
utilización.
Para detectar los genes implicados en la degradación de simazina se realizó PCR utilizando
cebadores específicos para genes que codifican a proteínas que forman parte de la ruta de
degradación de otros herbicidas de la misma familia. Los cebadores y condiciones habían sido
previamente descritos.8Para identificar a las bacterias se amplificó una región especifica que codifica
el fragmento 16S de los ribosomas. El producto de PCR del 16S fue utilizado una parte para llevar a
cabo la metodología de ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Análisis) y la otra fue
secuenciado. Con ambos resultados fueron analizados mediante herramientas de bioinformática.
Tabla 1 Parámetros de mineralización. P es el máximo porcentaje de
-1
mineralización del suelo, K es la constante de mineralización (días ),
Ti inicio de la fase lag (días).
Cabra
Baena
R2
0.99
0.98
P
71.81 +- 1.08
46.00 +- 2.31
K
16.90
18.80
2
+
+
-
Ti
0.78 18.66
2.5 22.66
+
+
-
0.54
1.45
RESULTADOS
Figura 1. Mineralización de simazina. La gráfica de la derecha recoge los datos
obtenidos del suelo de Cabra y los de Baena se reflejan en la gráfica de la izquierda.
En ambos casos los datos se ajustan a una curva sigmoidal, tipo Gompezt.
En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos en los ensayos de mineralización. Ambos
presentan una cinética de mineralización típica de suelos adaptados al herbicida . Los parámetros
cinéticos de los dos suelos se recogen en la tabla 1. El suelo del olivar de la comarca de Cabra,
presenta una mayor capacidad para degradar la simazina hasta dióxido de carbono y amoniaco que
el suelo de la comarca de Baena. El primero es capaz de mineralizar en torno al 70 % de la simazina
que se aplicó. Mientras que el suelo de Baena puede de degradar completamente el 46%. Pero en
ambos suelos se constata que existen microorganismo capaces de metabolizar simazina.
De las diferentes placas donde se habían sembrado
alicuotas de las serie de diluciones de ambos suelos, se
seleccionaron alrededor de 300 microorganismos que eran
capaces de crecer con simazina como única fuente de
carbono. Estos microorganismos se inocularon en medio
mínimo líquido donde el herbicida era la única fuente de
carbono y de nitrógeno. Estudiamos la tasa de degradación
de los microorganismos seleccionados, figura 2. De estos
microorganismos se volvieron a seleccionar a aquellos que
eran capaces de crecer en este medio y presentaban una
mayor tasa de degradación. Se seleccionó, un aislado del
olivar de Baena que presentaba una constante de
degradación bastante superior (tasa n en la figura 2), para
Figura 2. Constantes de degradación
hacer el estudio de la ruta de degradación e identificación
de
simazina
de
algunos
de los microorganismo. Cuando se realizó PCR con los
microorganismos aislados de los dos
cebadores específicos para diferentes genes que codifican
suelos (olivares de Cabra y Baena).
proteínas implicadas en la degradación de herbicidas de la
familia s-triazínicos, se obtuvo el producto específico esperado para los genes atzC y trzN. Pero no se
obtuvo ningún producto cuando se utilizaron los cebadores correspondientes a los genes, atzA, atzB,
atzD, atzE, y atzF.
El gen trzN, codifica a una clorohidrolasa implicada en la degradación de herbicidas triazínicos
descrita en Nocardiodes SP C190. 9 Este gen codifica una proteína de 40 KDa con dos actividades
clorohidrolasa y desaminasa, y cataliza la reacción de hidroxiatrazina a N-isopropimelida10.El otro gen
detectado, el gen atzC, codifica una proteína implicada en la reacción que transforma
isopropilamelida isopropilamino a ácido cianúrico. Cuando se caracterizó esta enzima se vio que era
capaz de de hidrolizar el grupo N-etilamina de la simazina.11 En base a estos datos sobre las enzimas
cabe esperar que la degradación de simazina por este aislado conlleve la acumulación de un
derivado metabólico, ácido cianúrico, ya que no hemos detectado los genes que codifican las
proteínas capaces de degradar a este ácido hasta dióxido de carbono (genes atz E, atz D y atz F).
Una vez analizados los resultados de los ensayos realizados para identificar este aislado, ARDRA y
secuenciación de fragmento específico del 16S DNAr, nos dimos cuenta de que no era una sola
especie de bacteria sino que al menos había 4 especies diferentes. Las especies identificadas fueron
3
Variovorax sp, Pseusothantomonas mexicana Acidovorax sp y Methylopila capsulata. Hemos llevado
a cabo un análisis filogenético, con estas bacterias y otras bacterias que se conoce su capacidad
para degradar simazina u otro herbicida de esta misma familia (figura 3).
Figura 3. Análisis filogenético de secuencias del 16S DNAr de las secuencias que nosotros
obtuvimos del aislado (especies subrayadas) y las secuencias del 16SDNAr de bacterias capaces
de degradar herbicidas de la familia de los s-triazínicas encontradas en el GenBank. Estas
especies son Pseudomonas sp ADP (AF326383); Agrobacterium sp (AY196141); Rhizobium sp
(AF514801); Rhodococcus sp (AY336559); Nocardioides sp C190 (AF253510); Nocardioides sp
SP12 (AF537327)
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