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I Conferencia Nacional de Biotecnología
Lima, 12 y 13 de Mayo 2009
Perspectivas de la Biotecnología Aplicada
a los Recursos Hidrobiológicos del Perú
APLICACIONES EN ACUICULTURA
Susana Sirvas Cornejo, PhD
Aspectos a saber para una acuicultura razonada:
• Rasgos de vida, reproducción y crecimiento de la especie a
cultivar.
• Genética de la especie.
• Nutrición en los diferentes estadíos de desarrollo
(Requerimientos nutricionales).
• Enfermedades potenciales de la especie.
• Condiciones del medio de cultivo.
Desconocimiento de cualquiera de estos aspectos podría
conducir a un mal manejo de la especie.
EFECTO DE DIETAS MICROENCAPSULADAS
SUPLEMENTADAS CON UNA BACTERIA
GENETICAMENTE MODIFICADA SOBRE EL
DESARROLLO DE POSTALRVAS DE
Fenneropenaeus indicus
Sirvas S., Latchford J. W., y Jones D. A.
Journal of Aquaculture Nutrition, 2007, 13, p. 10 -16
School of Ocean Sciences - SOS
University of Wales, Bangor, Reino Unido de La Gran Bretaña
Financiamiento:
- Overseas Development Administration – ODA (British Council)
- Recursos propios
INTRODUCCION
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN DIFERENTES ESTADIOS DE
DESARROLLO LARVAL Y POSTLARVAL EN ESPECIES DE PECES Y
CRUSTACEOS.
- Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990a) Ontogenetic change in
digestive enzyme activity in larval and postlarval white shrimp Penaeus
setiferus (Crustacea, Decapoda, Penaeidae). Biol. Bull., 178: 144-159.
- Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990c) Ontogenetic changes in
enzyme distribution and midgut function in developmental stages of
Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda; Penaeidae). Biol. Bull. Woods
Hole, 178: 160-174.
- Jones D. A. et al. (1993) The Potential for Replacement of Live
Feeds in Larval Culture. Journal of World Aquaculture Society, Nº 2, 24:
199 – 210.
- Kolkovsky et al. (1990) The use of exogenous digestive enzymes to
improve microdiets for gilthead seabream (Sparus aurata) larval rearing.
International Symposium on Development and Aquaculture of Marine
Larvae held in Bergen, Norway, 12 – 15 August 1990.
- Munilla-Moran et al.(1990) The role of exogenous enzymes in
digestion in culture turbot larvae (Scophthalmus maximus L.).
Aquaculture,88:337-350
ANTECEDENTES
PROBLEMAS
- Mortalidad alta
- Tasa de crecimiento baja
CAUSAS
- Indigestibilidad
del alimento
HIPOTESIS
Un suplemento de enzimas digestivas
microbianas en la dieta incrementaría
la digestibilidad de la misma en
postlarvas de camarón.
Los camarones requieren
enzimas digestivas en
estadíos tempranos
de desarrollo:
principalmente
Proteasas del tipo
tripsina
Propuesta: Uso de cepas bacterianas productoras de proteasas
tipo tripsina.
Aeromonas hydrophila (PERO…potencialmente patógena)
La Mancha
Negra
Aislar sólo el gen de proteasa de A.h. Pm
¿Cuándo clonar?
Cuando otros métodos no representan
la mejor estrategia de solución.
Objetivo General
MEDIR EL EFECTO DE DIETAS
SUPLEMENTADAS CON UNA CEPA
BACTERIANA GM, EN EL
DESARROLLO Y SUPERVIVENCIA DE
POSTLARVAS DE CAMARON.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Identificación de la cepa donadora (API 20 NE)
2. Clonación y expresión del gen de proteasa de la cepa
donadora en Escherichia coli XL1-Blue (Contiene parte
del gen de la β-galactosidasa, Bullock,1977).
3. Perfil de proteínas y ensayos enzimáticos en cepa
donadora y en la clona productora de proteasa.
4. Secuenciado del gen de proteasa.
5. Preparación de dietas microencapsuladas suplementadas
con la cepa productora de proteasa, y bioensayos con
postlarvas de Fenneropenaeus indicus.
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES
Materiales para Clonación
Cepas
bacterianas
: Aeromonas hydrophila Pm (c. donadora)
Escherichia coli XL1 Blue (c. receptora)
Plasmidios
: pUC19, pP635
Enzimas
: Sau3AI, HindIII, PstI, BamHI
proteinasa K, fosfatasa alcalina, ligasa T4
Medios
de cultivo
: Caldo y agar nutritivo, caldo LB, caldo y
agar LB-TET-AMP, agar Leche,
agar TET-AMP-X-GAL-IPTG
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES …continuación
Materiales para Secuenciado
Clona E. coli XL1p635 (conteniendo gen proteasa)
Plasmidio pP635
Primer M13 (forward)
Primer M13 (reverse)
Desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Didesoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
Polimerasa T7
Celda de electroforesis GT Sequi-Gen (BIO RAD)
Acrilamida / bisacrilamida
Papel hiper fotográfico, soluciones de revelado
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES …continuación
Materiales para Bioensayos
Dieta CD2
Dieta 2
Dieta XL1
Dieta 635
Dieta 7
: comercial Frippak CD2 (INVE)
: CD2 reencapsulada
: Dieta 2 + E. coli XL1Blue (no proteasa)
: XL1 + E. coli XL1p635 (proteasa)
: XL1 + E. coli XL1p7 (lipasa)
Microscopio
300 postlarvas de F. indicus (PL1)
15 recipientes de 5 L c/u
MATERIALES Y METODOS
METODOS
Para Clonación
Extracción de ADN Cromosomal
: Sambrook et al. (1989)
Extracción de ADN Plasmídico
: Birnboim y Doly (1979)
Digestión de ADN Cromosomal
: Sambrook et al. (1989)
Unión ADN cromosomal y plasmidio
(Ligation)
: King (1986)
Transformación
: Sambrook et al. (1989)
Prueba de Alfa complementación
: Sambrook et al. (1989)
Electroforesis
: Sambrook et al. (1989)
Para Secuenciado
: Sanger et al. (1977)
Análisis de la secuencia del gen
: PC, Genetic Computing
Group (GCG) paquete
SEQNET, Daresbury,
England
3. MATERIALES Y METODOS
METODOS …continuación
Para Bioensayos
Se llevaron a cabo 5 tratamientos, cada uno por triplicado,
colocando 20 PL1 en cada recipiente.
Temperatura del agua : 28 °C
pH
: 8.0 – 8.3
Salinidad
: 3.3 %
Alimentación
: 3 veces al día (15 % biomasa)
Longitud total
: cada 2 días
Supervivencia
: monitoreada cada 2 días
El tamaño de microcápsulas se analizó con un ANVA y con la
prueba de Tukey Kramer. El proceso de disolución de las
mismas, con ANVA y con la prueba de Scheffe.
El desarrollo y la supervivencia se analizaron con ANVA , y
Tukey Kramer.
RESULTADOS
Vector
Fragmentos de ADN del
organismo donador
Construcción de moléculas de ADN recombinante
CONSTRUCCIÓN
DE MOLÉCULAS
Se introducen
en una bacteria
receptora
Cada una contiene
un fragmento
diferente
DE ADN
RECOMBINANTE
Se
cultiva
en
placa
Cada colonia contiene múltiples copias
de sólo una molécula de ADN recombinante
RESULTADOS
MEDIO DE CULTIVO SELECTIVO PARA
IDENTIFICACION DE CLONAS:
LB-AMP-TET-XGAL-IPTG
Expresión de
β-galactosidasa
RESULTADOS
Las
colonias
blancas
son
clonas,
las
azules,
no lo son.
PRUEBA DE ALFA-COMPLEMENTACION
RESULTADOS
PRUEBA DE PROTEASA
A.h.Pm
635
Halo de
degradación
de las
proteínas
de la leche.
XL1-Blue
AGAR LECHE
RESULTADOS
PERFILES DE
PROTEINAS
CELULARES Y
EXTRACELULARES
ACTIVIDAD ENZIMATICA
La actividad de proteolítica
(trypsina) fue mayor en las clonas
que en la cepa donadora:
A.hydrophila Pm: 1.7156 unid./mg
E. coli XL1pP635: 2.4950 unid./mg.
60
RESULTADOS
Secuencia de
nucleótidos del
inserto en el
plasmidio
pUC19
Marco de
lectura
abierto (ORF)
desde posición
371 hasta
posición 886.
961
RESULTADOS
ANALISIS DE LA SECUENCIA DE ADN DEL GEN DE
PROTEASA EN EL PLASMIDIO pP635
SEQNET - GRUPO DE COMPUTACION GENETICA - GCG
DARESBURY – REINO UNIDO
FRAMES.- Determinó marcos de lectura abiertos (ORF)
TRANSLATE.- Determinó la secuencia de aminoácidos
BESTFIT.- Comparó la secuencia con otras secuencias de
las bases de datos
DIAGRAMA DE ESTRUCTURA DE PEPTIDOS.Determinó la afinidad por el agua de la molécula. Identificó
sitios de glicosilación
MAP.- Determinó lugares de corte para enzimas de restricción
RESULTADOS
PLASMIDIO pP635
4. RESULTADOS DE LOS
S
O
Y
A
S
N
E
O
BI
Fenneropenaeus indicus
Nombres FAO:
Español: Langostino blanco de la India
Francés: Crevette royale des Indes
Inglés: Indian white shrimp
Nombre local: Kiri issa
Tamaño: Máximo 18 cm en machos y 23 cm en hembras.
FORMULACIÓN DE LAS DIETAS
CD2
D2
XL1
635
7
: Dieta ME comercial Frippak CD2
: 5 g CD2 + 5 g Hb + 50 mL H2O
: 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa XL1
: 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 635
: 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 7
Donde: Hb (hemoglobina), XL1 (cepa E. coli XL1Blue
pUC19), 635 (cepa E. coli XL1pP635, productora de
proteasa del tipo tripsina), y 7 (cepa E. coli
XL1p7,productora de lipasa)
RESULTADOS
MICROCAPSULAS
CONTENIENDO LA
CEPA E. coli XL1pP635,
PRODUCTORA DE
TRIPSINA, ANTES DE SER
DIGERIDAS POR
LA CEPA.
MICROCAPSULAS
DESPUES DE SER
DIGERIDAS POR
LA CEPA E. coli XL1pP635.
RESULTADOS
MICROCAPSULAS
DE HEMOGLOBINA
EN PROCESO DE
DIGESTION
RESULTADOS
DIETAS
MICRO ENCAPSULADAS
EN SOLUCION.
POSTLARVA DE
Fenneropenaeus
indicus
DESPUES DE
INGERIR LA
DIETA 635.
RESULTADOS
EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS EN EL
DESARROLLO DE POSTLARVAS DE Fenneropenaeus indicus.
CD2 : SIN ENZIMA
140 µm
635
CD2
7
XL1, D2
D2 : SIN CEPA NI
ENZIMA
218 µm
XL1 : CON CEPA SIN
ENZIMA
218 µm
635 : PROTEASA
(TRIPSINA)
218 µm
7
: LIPASA
218 µm
RESULTADOS
EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS
EN LA SUPERVIVENCIA DE POSTLARVAS DE
Fenneropenaeus indicus.
DIETA
% SUPERVIVENCIA
CD2 (CONTROL)
D2 (SIN CEPA)
XL1 (CON CEPA SIN PROTEASA)
635 (CON CEPA Y CON PROTEASA)
7 (CON CEPA Y LIPASA)
83.33
76.67
55.00
83.33
71.67
CONSIDERACIONES DE BIOSEGURIDAD
En caso de un posible escape de la cepa GM al medio:
• Cuando la cepa ingresa al estómago del camarón, las
condiciones para su supervivencia no so favorables, ya
que el pH del estómago del camarón es ácido (5.0-7.0)
(Dall et al., 1990), y esta cepa no puede desarrollar a un
pH de 5 o menos (Sirvas, 1999).
• La cepa receptora o huésped (E. coli XL1-Blue), había
sido probada ser no patógena para seres humanos
(Bullock et al. 1987).
• Trabajos posteriores mostraron que la cepa GM no se
hallaba presente en el medio de cultivo de los
camarones, luego de ser alimentados con las dietas
suplementadas.
GRACIAS
Malecón de La Marina,
Miraflores, Lima