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I Conferencia Nacional de Biotecnología Lima, 12 y 13 de Mayo 2009 Perspectivas de la Biotecnología Aplicada a los Recursos Hidrobiológicos del Perú APLICACIONES EN ACUICULTURA Susana Sirvas Cornejo, PhD Aspectos a saber para una acuicultura razonada: • Rasgos de vida, reproducción y crecimiento de la especie a cultivar. • Genética de la especie. • Nutrición en los diferentes estadíos de desarrollo (Requerimientos nutricionales). • Enfermedades potenciales de la especie. • Condiciones del medio de cultivo. Desconocimiento de cualquiera de estos aspectos podría conducir a un mal manejo de la especie. EFECTO DE DIETAS MICROENCAPSULADAS SUPLEMENTADAS CON UNA BACTERIA GENETICAMENTE MODIFICADA SOBRE EL DESARROLLO DE POSTALRVAS DE Fenneropenaeus indicus Sirvas S., Latchford J. W., y Jones D. A. Journal of Aquaculture Nutrition, 2007, 13, p. 10 -16 School of Ocean Sciences - SOS University of Wales, Bangor, Reino Unido de La Gran Bretaña Financiamiento: - Overseas Development Administration – ODA (British Council) - Recursos propios INTRODUCCION ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN DIFERENTES ESTADIOS DE DESARROLLO LARVAL Y POSTLARVAL EN ESPECIES DE PECES Y CRUSTACEOS. - Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990a) Ontogenetic change in digestive enzyme activity in larval and postlarval white shrimp Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda, Penaeidae). Biol. Bull., 178: 144-159. - Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990c) Ontogenetic changes in enzyme distribution and midgut function in developmental stages of Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda; Penaeidae). Biol. Bull. Woods Hole, 178: 160-174. - Jones D. A. et al. (1993) The Potential for Replacement of Live Feeds in Larval Culture. Journal of World Aquaculture Society, Nº 2, 24: 199 – 210. - Kolkovsky et al. (1990) The use of exogenous digestive enzymes to improve microdiets for gilthead seabream (Sparus aurata) larval rearing. International Symposium on Development and Aquaculture of Marine Larvae held in Bergen, Norway, 12 – 15 August 1990. - Munilla-Moran et al.(1990) The role of exogenous enzymes in digestion in culture turbot larvae (Scophthalmus maximus L.). Aquaculture,88:337-350 ANTECEDENTES PROBLEMAS - Mortalidad alta - Tasa de crecimiento baja CAUSAS - Indigestibilidad del alimento HIPOTESIS Un suplemento de enzimas digestivas microbianas en la dieta incrementaría la digestibilidad de la misma en postlarvas de camarón. Los camarones requieren enzimas digestivas en estadíos tempranos de desarrollo: principalmente Proteasas del tipo tripsina Propuesta: Uso de cepas bacterianas productoras de proteasas tipo tripsina. Aeromonas hydrophila (PERO…potencialmente patógena) La Mancha Negra Aislar sólo el gen de proteasa de A.h. Pm ¿Cuándo clonar? Cuando otros métodos no representan la mejor estrategia de solución. Objetivo General MEDIR EL EFECTO DE DIETAS SUPLEMENTADAS CON UNA CEPA BACTERIANA GM, EN EL DESARROLLO Y SUPERVIVENCIA DE POSTLARVAS DE CAMARON. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Identificación de la cepa donadora (API 20 NE) 2. Clonación y expresión del gen de proteasa de la cepa donadora en Escherichia coli XL1-Blue (Contiene parte del gen de la β-galactosidasa, Bullock,1977). 3. Perfil de proteínas y ensayos enzimáticos en cepa donadora y en la clona productora de proteasa. 4. Secuenciado del gen de proteasa. 5. Preparación de dietas microencapsuladas suplementadas con la cepa productora de proteasa, y bioensayos con postlarvas de Fenneropenaeus indicus. MATERIALES Y METODOS MATERIALES Materiales para Clonación Cepas bacterianas : Aeromonas hydrophila Pm (c. donadora) Escherichia coli XL1 Blue (c. receptora) Plasmidios : pUC19, pP635 Enzimas : Sau3AI, HindIII, PstI, BamHI proteinasa K, fosfatasa alcalina, ligasa T4 Medios de cultivo : Caldo y agar nutritivo, caldo LB, caldo y agar LB-TET-AMP, agar Leche, agar TET-AMP-X-GAL-IPTG MATERIALES Y METODOS MATERIALES …continuación Materiales para Secuenciado Clona E. coli XL1p635 (conteniendo gen proteasa) Plasmidio pP635 Primer M13 (forward) Primer M13 (reverse) Desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Didesoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Polimerasa T7 Celda de electroforesis GT Sequi-Gen (BIO RAD) Acrilamida / bisacrilamida Papel hiper fotográfico, soluciones de revelado MATERIALES Y METODOS MATERIALES …continuación Materiales para Bioensayos Dieta CD2 Dieta 2 Dieta XL1 Dieta 635 Dieta 7 : comercial Frippak CD2 (INVE) : CD2 reencapsulada : Dieta 2 + E. coli XL1Blue (no proteasa) : XL1 + E. coli XL1p635 (proteasa) : XL1 + E. coli XL1p7 (lipasa) Microscopio 300 postlarvas de F. indicus (PL1) 15 recipientes de 5 L c/u MATERIALES Y METODOS METODOS Para Clonación Extracción de ADN Cromosomal : Sambrook et al. (1989) Extracción de ADN Plasmídico : Birnboim y Doly (1979) Digestión de ADN Cromosomal : Sambrook et al. (1989) Unión ADN cromosomal y plasmidio (Ligation) : King (1986) Transformación : Sambrook et al. (1989) Prueba de Alfa complementación : Sambrook et al. (1989) Electroforesis : Sambrook et al. (1989) Para Secuenciado : Sanger et al. (1977) Análisis de la secuencia del gen : PC, Genetic Computing Group (GCG) paquete SEQNET, Daresbury, England 3. MATERIALES Y METODOS METODOS …continuación Para Bioensayos Se llevaron a cabo 5 tratamientos, cada uno por triplicado, colocando 20 PL1 en cada recipiente. Temperatura del agua : 28 °C pH : 8.0 – 8.3 Salinidad : 3.3 % Alimentación : 3 veces al día (15 % biomasa) Longitud total : cada 2 días Supervivencia : monitoreada cada 2 días El tamaño de microcápsulas se analizó con un ANVA y con la prueba de Tukey Kramer. El proceso de disolución de las mismas, con ANVA y con la prueba de Scheffe. El desarrollo y la supervivencia se analizaron con ANVA , y Tukey Kramer. RESULTADOS Vector Fragmentos de ADN del organismo donador Construcción de moléculas de ADN recombinante CONSTRUCCIÓN DE MOLÉCULAS Se introducen en una bacteria receptora Cada una contiene un fragmento diferente DE ADN RECOMBINANTE Se cultiva en placa Cada colonia contiene múltiples copias de sólo una molécula de ADN recombinante RESULTADOS MEDIO DE CULTIVO SELECTIVO PARA IDENTIFICACION DE CLONAS: LB-AMP-TET-XGAL-IPTG Expresión de β-galactosidasa RESULTADOS Las colonias blancas son clonas, las azules, no lo son. PRUEBA DE ALFA-COMPLEMENTACION RESULTADOS PRUEBA DE PROTEASA A.h.Pm 635 Halo de degradación de las proteínas de la leche. XL1-Blue AGAR LECHE RESULTADOS PERFILES DE PROTEINAS CELULARES Y EXTRACELULARES ACTIVIDAD ENZIMATICA La actividad de proteolítica (trypsina) fue mayor en las clonas que en la cepa donadora: A.hydrophila Pm: 1.7156 unid./mg E. coli XL1pP635: 2.4950 unid./mg. 60 RESULTADOS Secuencia de nucleótidos del inserto en el plasmidio pUC19 Marco de lectura abierto (ORF) desde posición 371 hasta posición 886. 961 RESULTADOS ANALISIS DE LA SECUENCIA DE ADN DEL GEN DE PROTEASA EN EL PLASMIDIO pP635 SEQNET - GRUPO DE COMPUTACION GENETICA - GCG DARESBURY – REINO UNIDO FRAMES.- Determinó marcos de lectura abiertos (ORF) TRANSLATE.- Determinó la secuencia de aminoácidos BESTFIT.- Comparó la secuencia con otras secuencias de las bases de datos DIAGRAMA DE ESTRUCTURA DE PEPTIDOS.Determinó la afinidad por el agua de la molécula. Identificó sitios de glicosilación MAP.- Determinó lugares de corte para enzimas de restricción RESULTADOS PLASMIDIO pP635 4. RESULTADOS DE LOS S O Y A S N E O BI Fenneropenaeus indicus Nombres FAO: Español: Langostino blanco de la India Francés: Crevette royale des Indes Inglés: Indian white shrimp Nombre local: Kiri issa Tamaño: Máximo 18 cm en machos y 23 cm en hembras. FORMULACIÓN DE LAS DIETAS CD2 D2 XL1 635 7 : Dieta ME comercial Frippak CD2 : 5 g CD2 + 5 g Hb + 50 mL H2O : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa XL1 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 635 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 7 Donde: Hb (hemoglobina), XL1 (cepa E. coli XL1Blue pUC19), 635 (cepa E. coli XL1pP635, productora de proteasa del tipo tripsina), y 7 (cepa E. coli XL1p7,productora de lipasa) RESULTADOS MICROCAPSULAS CONTENIENDO LA CEPA E. coli XL1pP635, PRODUCTORA DE TRIPSINA, ANTES DE SER DIGERIDAS POR LA CEPA. MICROCAPSULAS DESPUES DE SER DIGERIDAS POR LA CEPA E. coli XL1pP635. RESULTADOS MICROCAPSULAS DE HEMOGLOBINA EN PROCESO DE DIGESTION RESULTADOS DIETAS MICRO ENCAPSULADAS EN SOLUCION. POSTLARVA DE Fenneropenaeus indicus DESPUES DE INGERIR LA DIETA 635. RESULTADOS EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS EN EL DESARROLLO DE POSTLARVAS DE Fenneropenaeus indicus. CD2 : SIN ENZIMA 140 µm 635 CD2 7 XL1, D2 D2 : SIN CEPA NI ENZIMA 218 µm XL1 : CON CEPA SIN ENZIMA 218 µm 635 : PROTEASA (TRIPSINA) 218 µm 7 : LIPASA 218 µm RESULTADOS EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS EN LA SUPERVIVENCIA DE POSTLARVAS DE Fenneropenaeus indicus. DIETA % SUPERVIVENCIA CD2 (CONTROL) D2 (SIN CEPA) XL1 (CON CEPA SIN PROTEASA) 635 (CON CEPA Y CON PROTEASA) 7 (CON CEPA Y LIPASA) 83.33 76.67 55.00 83.33 71.67 CONSIDERACIONES DE BIOSEGURIDAD En caso de un posible escape de la cepa GM al medio: • Cuando la cepa ingresa al estómago del camarón, las condiciones para su supervivencia no so favorables, ya que el pH del estómago del camarón es ácido (5.0-7.0) (Dall et al., 1990), y esta cepa no puede desarrollar a un pH de 5 o menos (Sirvas, 1999). • La cepa receptora o huésped (E. coli XL1-Blue), había sido probada ser no patógena para seres humanos (Bullock et al. 1987). • Trabajos posteriores mostraron que la cepa GM no se hallaba presente en el medio de cultivo de los camarones, luego de ser alimentados con las dietas suplementadas. GRACIAS Malecón de La Marina, Miraflores, Lima