Download Paciente con hiperglucosuria y glicemia normal Mutacion SGLT2

Paciente con hiperglucosuria y glicemia normal presenta mutaciones en el transportador SGLT2. A.  Boltansky1, L Vasquez3, A. Vukusich1, C. Villafaena2, C. Suazo2, M. Lozano2 y CE. Irarrázabal2;. 1Departamento de Nefrología, Clínica Dávila, SanOago de Chile. 2Facultad de Medicina, Universidad de los Andes, SanOago de Chile. 3Departamento de Medicina y Nefrología, Hospital Juan Noe, Arica-­‐Chile. Anamnesis o  Paciente femenino, 29 años o  Presenta glucosuria de 2747,6 mg/dl o  Equivalente a 44,51 g/24 hrs. o 
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Glicemia basal de 83,6 mg/dl. Curva de tolerancia a la glucosa normal. Valores de insulina en ayuno (2 µU/ml) Post prandial normal (22,6 µU/ml). Hemoglobina glicosilada 5,3% (rango 4,2-­‐5,8 %). o  Presencia de un caso de Glucosuria. Glucosuria Renal Familiar (FGR) •  Alteración genéRca definida por excreción de glucosa en la orina en ausencia de hiperglucemia y cualquier signo de disfunción generalizada de túbulo proximal (Santer 2003). •  Es causada por mutaciones en SLC5A2 (gen posicionado en 16p11.2) que codifica el transportador SGLT2. •  La proteína SGLT2 es un cotransportador sodio-­‐glucosa (Kanai, 1994). •  Es esencial en la reabsorción de glucosa, siendo expresada en el segmento S1 del túbulo contorneado proximal ascendente (Wright, 2007) Glucosuria Renal Familiar (FGR) q  Se han descrito alrededor de 50 mutaciones en SLC5A2 (SGLT2) q u e c a u s a r í a n e l t r a s t o r n o d e h i p e r g l u c o s u r i a , correspondiendo estas a 22 mutaciones (puntuales mutaciones por deleción, inserción y alteración de splicing) (Santer 2003, Magen 2005, Calado 2006). q  Para SGLT1 se ha descrito una mutación asociada a glucosuria y cataratas juveniles (Kloeckener-­‐Gruissem , 2008) The Human Gene MutaOon Database hap://www.hgmd.cf.ac.uk Modelo de transporte de Na+ /glucosa en el riñón. SGLT2 es predominantemente expresada en el segmento S1 del túbulo proximal y es responsable de la mayoría de la reabsorción de glucosa desde la orina (Esquema obtenido desde Santer 2010)
Mutaciones Descritas SLC5A2 Análisis mutacional de SLC5A2. Dominios transmembrana son mostrados como cajas gris oscura (Esquema obtenido desde Calado 2001) Glucosuria Renal Familiar (FGR) Criterio definido •  Ante esta mulRtud de posibilidades para el desarrollo de la búsqueda, hubo que definir un criterio de análisis como punto de parRda para estudio genéRco paciente. •  Criterio de niveles de glucosuria . Excreción de glucosa urinaria de 44,51 g por cada 24 hrs. Relación entre mutaciones y glucosuria Exon Glucosuria T° Producto Mutación SusOtución Annealing (bp) Ensayo enzima 09 38,8 g/día 79 °C 214 R368W gCCG-­‐TGG (+) Fnv 4HI 11 43,3 g/día 79 °C 242 G449D GGC-­‐GAC mm (-­‐) Nae I 12 31,7 g/día 75° C 279 R499C GGC-­‐GAC (-­‐) Sph I 12 30,1-­‐92,4 279 T543P cACG-­‐CCG (-­‐) Msp I 75 °C Santer R, J Am Soc Nephrol 14: 2873–2882, 2003. ParRdores qRT-­‐PCR Relación entre mutaciones y glucosuria Exon Glucosuria T° Producto Mutación SusOtución Annealing (bp) Ensayo enzima 09 38,8 g/día 79 °C 214 R368W gCCG-­‐TGG (+) Fnv 4HI 11 43,3 g/día 79 °C 242 G449D GGC-­‐GAC mm (-­‐) Nae I 12 31,7 g/día 75° C 279 R499C GGC-­‐GAC (-­‐) Sph I 12 30,1-­‐92,4 279 T543P cACG-­‐CCG (-­‐) Msp I 75 °C Santer R, J Am Soc Nephrol 14: 2873–2882, 2003. Patrón electroforéOco de RFLP de SGLT2 Cromatograma producto amplificación SGLT2 Exon 9 Cromatograma producto amplificación SGLT2 Exon 11 Cromatograma producto amplificación SGLT2 Exon 12 Secuencia del gen SGLT2 E9 Secuencia del gen SGLT2 E11 Secuencia del gen SGLT2 E12 Secuencia aminoacídica SGLT2 E9 Secuencia BLAST: RRGGLSLADEVACVVPEVCRRVCGTEVGCSNIAYPRLVVKLMPNGKGSPGPQ AQAR Secuenciación SGLT2 E9: 5'3' Frame 3 R R G G P S A T E A A Stop C Stop V C R R V C G T E V G C S N I A Y P R L V V K L Met P N G K G S P G P Q A K L A Secuencia aminoacídica SGLT2 E11 Secuencia BLAST: GQLFDYIQAVSSYLAPPVSAVFVLALFVPRVNEQ Secuenciación SGLT2 E11 5'3' Frame 3 AQLFDTSKQSKTPDTAPVRRLRAGALRAAR Stop Stop A Secuencia aminoacídica SGLT2 E12 Exon 12 IGGLLMGLARLIPEFSFGSGSCVQPSACPAFLCGVHYLYFAIVLFFCS GLLTLTVSLCTAPIPRKH Secuencia BLAST: 5'3' Frame 1 ARLIPEFSFGSGSCVQPSACPAPFCGVHYLYFAIVLFFCSGLLTLTVSLCTAPIPRKH Conclusión §  El estudio de la secuenciación del exón 9, 11 y 12 de SGLT2 del paciente en estudio, reveló que posee mutaciones genéRcas en los tres exones 9 , 11 y 12 en el gen del cotransportador de sodio y glucosa. §  Estas mutaciones se traducen en una importante alteración de la secuencia aminoacídica normal, originado una proteína truncada. §  Estos datos permiten sugerir que la paciente posee una proteína SGLT2 alterada lo que podría afectar su función y por lo tanto explicar la hiperglucosuria en condiciones normales de manejo de la glicemia. §  FONDECYT 1100885 Referencias Santer R, Kinner M, Lassen C, Schneppenheim R, Eggert P, Bald M, Brodehl J, Daschner M, Kemper M, VolR S, Neuhaus T, Skovby F, Swir P, Schaub J, Klaerk D. Molecular Analysis of the SGLT2 Gene in PaRents with Renal Glucosuria. J Am Soc Nephrol 14: 2873 2882, 2003. The Human Gene MutaRon Database hap://www.hgmd.cf.ac.uk. Base de datos de mutaciones relacionada con enfermedades . Describe Rpo de mutación, patología asociada y descriptores. The NaRonal Center for Biotechnology InformaRon. hap://www.ncbi.nlm.nih.gov/ A través de las bases de datos de este siRo se obtuvieron las secuencias nucleóRdicas y aminoácidicas uRlizadas como referencia en este estudio. Expasy hap://web.expasy.org/cgi-­‐bin/traslate. Herramienta en línea para traducir secuencias nucleoRdicas a secuencias aminoácidicas. ÚRl para determinar efectos de susRtuciones puntuales o deleciones sobre secuencia de proteína. •  SGLT2 E11 ( nucleóRdos 1300-­‐1468 del mRNA) GCTCTGGGTGGTGTTCATCGTGGTAGTGTCGGTGGCCTGGCTTCCCGTGGTGCAGGCGGCACA
GGGCGGGCAGCTCTTCGATTACATCCAGGCAGTCTCTAGCTACCTGGCACCGCCCGTGTCCGCC
GTCTTCGTGCTGGCGCTCTTCGTGCCGCGCGTTAATGAGCAG •  Producto secuenciación SGLT2 E11 desde producto PCR V.E. CTAAATCAGCCATGAAATGAGAAAAAAAGAGAAGACAGGAGACTAAAGAAAGACTTCAGTAG
AGAAGCCCAAACGCGCGCAGCTCTTCGATACATCCAAGCAGTCTAAGACACCTGACACCGCCC
CTGTCCGCCGTCTTCGTGCTGGCGCTCTTCGTGCCGCGCGTTAATGAGCAGGTGAGCGGCACG
CGCGTGGTGACGGCGGGGCTGGGATCGCCCCCACCCCCGTGGCTGGCATCGACCCGGTCTGT
GGGTAAACACGCTTCTTTATTTTTGGCGACAACTAATTTACAATGAATAAAGATAAAGAAATGC
TGAGAACAACACAGGCTTAAAGCGCCCCACGCCCCCCGAATATATAGTGAAAAAAAAAAAAAA
AAGGGGGCGGGGGGGGAGTTTTTTTTTCTCCCCCCCCGTCCACTGATTTATGTGCCTGTGAAAA
CAGGGTAAAGAGACAAACACAAATCCGATCAAAGGGTGAAAAAACGGGTCTCTCAACCCACT
ACCACCAAAAAGTGGCATTATTCTTGTATTTCCTTGCGAATACTGTCGGGAATTACAGGTTCTTC
AACACCGGAGGAGCGAAATTCATTAGGATCACCACA •  Confirmar mediante nueva secuenciación que diferencias observadas para los exones 9, 11 y 12 de SGLT2 relación a secuencia descrita en GenBank corresponden a mutaciones reales y no errores en la lectura. Una vez realizada esta confirmación, proceder a estudio familiar mediante: a)  Ensayo enzima de restricción b)  Secuenciación de productos de PCR de exones 9, 11 y 12 de SGLT2 de otros miembros de la familia •  Conseguir nuevas muestras de sangre de pacientes N.D. y V.E. para repeRr secuenciaciones. •  Para estudios futuros, uRlizar técnica PCR HRM (High ResoluRon MelRng) como sistema de primera selección . Por esta vía se definirían que exones presentan anomalías en relación a DNA de referencia (en caso de mutaciones puntuales), antes de recurrir a ensayos de enzimas de restricción y secuenciación. 4)  Wilson FH, Disse-­‐Nicodème S, Choate KA, Ishikawa K, Nelson-­‐Williams C, Desiaer I, Gunel M, Milford DV, Lipkin GW, Achard JM, Feely MP, Dussol B,Berland Y, Unwin RJ, Mayan H, Simon DB, Farfel Z, Jeunemaitre X, Liron RP. Human hypertension caused by mutaOons in WNK kinases. Science. 2001 Aug 10;293(5532):1107-­‐12. 5) The Human Gene MutaOon Database hap://www.hgmd.cf.ac.uk Base de datos de mutaciones relacionada con enfermedades . Describe Rpo de mutación, patología asociada y descriptores. •  SGLT2 E9 ( nucleóRdos 1041-­‐1148 del mRNA) ACGAGGTGGC GTGCGTGGTG CCTGAGGTGT GCAGGCGCGT GTGCGGCACG GAGGTGGGCT GCTCCAACAT CGCCTACCCG CGGCTCGTCG TGAAGCTCAT GCCCAACG •  Producto secuenciación SGLT2 E9 desde producto PCR V.E. TACGCAGGAAGGCCTGCATAAGGCGCGGAGGCCCTTCGGCGACAGAGGCGGCGTGATG
CTGAGTGTGCAGGCGCGTGTGCGGCACGGAGGTGGGCTGCTCCAACATCGCCTACCCGC
GGCTCGTCGTGAAGCTCATGCCCAACGGTAAGGGCAGCCCCGGGCCACAGGCGAAGCTC
GCTGAATTAGTACGACCTTTGTGCAGACTGTCCCGGAAGAGGCCCTCCCCAAGTTGGAG
GGTGACTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCC •  SGLT2 E12 ( nucleóRdos 1469-­‐1648 del mRNA) GGCGCCTTCTGGGGACTCATCGGGGGCCTGCTGATGGGCCTGGCACGCCTGA TTCCCGAGTTCTCCTTCGGCTCGGGCAGCTGTGTGCAGCCCTCGGCGTGCCCAGCTTTCCT
CTGCGGCGTGCACTACCTCTACTTCGCCATTGTGCTGTTCTTCTGCTCTGGCCTCCTCACCC
TCACGGTCTCCCTGTGCACCGCGCCCATCCCCAGAAAGCAC •  Producto secuenciación SGLT2 E12 desde producto PCR V.E. TCGGGAAGAAGTGATAGATGGAATTAGTATACGGGGGTGAGGTGATGGGCTAAAGCAC
GCCTGATTCCCGAGTTCTCCTTCGGCTCGGGCAGCTGTGTGCAGCCCTCGGCGTGCCCAG
CTCCTTTCTGCGGCGTGCACTACCTCTACTTCGCCATTGTGCTGTTCTTCTGCTCTGGCCTC
CTCACCCTCACGGTCTCCCTGTGCACCGCGCCCATCCCCAGAAAGCACGTGAGTGGCCAG
GTGCCCCAGGCAGCACTGTGATGACGAGGCCGGAGCAGATTACAGCACATGGCAATTTA
AAGGTAAATGCACCTTTGTACAAATCCCCCCAAAAAAAAAAAATGCTGCCCCATAAGCCC
AAAACCTAAAGGCCCCGAAGAAAAAAAAGCCTTGGGGGGGGGTTTTGTTTTTTTTTTTCC
CCCCCCCAAAATTCTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAACTTTTTTACCCCCCCCCATCAAGGG
GGGGGCCCCCTTTTTATGGGGGTTTCCCCCCCCCCCCCCATCTTAATTTTT