Download Desarrollo y Utilizaci6n de Papas Transgenicas Resistentes a

Desarrollo y Utilizaci6n de Papas
Transgenicas Resistentes
a Enfermedades Bacterianas
Taller 24 al 26 de Noviembre, 1998
Lima y San Ramon - Peru
Centro Internacional de la Papa
Illli•llIl lll6l lil/0
1 111111111111111111111 111111111111
029CJ,
CIP G4 C45.1
Deutsche Gesellschaft fur
Technische Zusammenarbeit (GTZ)
Centro Internacional de la Papa
Citacion correcta de las Memorias :
Centro Internacional de la Papa (CIP). 2000 . Desarrollo y
Utilizacion de Papas Transgenicas Resistentes a Enfermedades
Bacterianas. 24 al 26 de noviembre, 1998. Memorias del Taller.
Lima y San Ramon, Peru .
Desarrollo y Utilizaci6n de Papas Transgenicas
Resistentes a Enfermedades Bacterianas
Memorias del Taller
Lima y San Ramon, Peru . 1998
Coordinacion tecnica :
Dr. Marc Ghislain
Big. Luis Nopo
Procesado por
Departamento de Capacitacion y
Comunicaciones, CIP
Coordinacion
Dr. Patricio Malagamba
Big. Margarita Lopez
Edicion
Big . Edda Echeandfa
Estas Memorias han sido financiadas con los recurses de
Deutsche Gesellschaft fUr Technische Zusammenarbeit
(GTZ)
CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA {CIP)
Apartado 1558 - Lima, Peru
Tel.: (51-1) 349-5783; 349-6017. Fax: (51-1) 349-5638.
Correo-E : [email protected]
Participl
l . Lorentz Bulow
2 . Fausto Buitron
3 . Jorge Benavides
4. Daniel Chirito
5 . Cesar Giron
6. Ricardo Gutierrez
7. Patricio Arce-Johnson
8 . Eduardo Perez
9. Jorge Tenorio
l 0. Marc Ghislain
l l . Cesar Aguilar
CtP
~'t
C45.A
TABLA DE CONTENIDO
Centro lnt~rMr.ional de la Papa
NOTA DEL EDITOR ••.•....• ··········I:a··MO"~mei··lima··········
OBJETIVOS ••••••••••••••••••••
............ 3
·········1··5··'!1f.AY1.l""?UOO""""""""" ..•.••••.••• 5
PROGRAMA ••••••••..••.•••••••••••••••.•••.•..••••••••••••••.•.••••••••••••••••.•••• 7
BIBLIOTECA
PREAMBULO
/\4ericleth Bonierhale •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9
RESISTENCIA A ENFERMEDADES DE PAPA MEDIADA
POR PROTEiNAS ANTIMICROBIANAS
Marc Ghislain •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 /,
EVALUACION DE TUBERCULOS DE PAPA TRANSGENICA
A LA PUDRICION CAUSADA POR Erwinia carotovora
SUBSP. carotovora
,~vlvie Priou ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
I
MEJORAMIENTO PARA OBTENER RESISTENCIA A
MARCHITEZ BACTERIANA
,~1·/vie Priou ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25
/
DESARROLLO DE ESTRATEGIAS DE INGENIERIA GENETICA
PARA LA RESISTENCIA A BACTERIAS FITOPATOGENICAS
/
Petra Porsch •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39
EXPERIMENTOS CON PAPAS TRANSGENICAS EN
INVERNADERO Y CAMPO EN EL PERU
Ali Gohnirzaie ••••••••..••..•••.•••••••••••••••••••••••••••••.•.•.••.•••.•.••••..••••••• 45 /
TRANSFORMACION DE PLANTAS DE PAPA CON GENES DE
LISOZIMA, A'fACI~ ~fCECROPINA PARA CONFERIR
RESISTENCIA. A:SAc:;T-=~IA;S·
Patricio Arce-Johnson ................................................................ 53 /
HIBRIDIZACION ENTRE Y DENTRO DE VARIEDADES
CULTIVADAS Y SILVESTRES DE PAPA
Bodo Trognitz ............................................................................ 57
INVESTIGACION EN BIOSEGURIDAD EN ALEMANIA: PAPAS
CON LISOZIMA T 4 Y SUS IMPLICACIONES EN LA
COMUNIDAD MICROBIANA COMO UN CASO DE ESTUDIO
Andreas Mahn .......................................................................... 63 I
._
•1
ROL DEL SENASA EN LA SANIDAD VEGETAL DEL PERU
Enrique Carranza ...................................................................... 69
' t · -·
'c6t.1o LIBERAR PLANTAS TRANSGENICAS RESISTENTES A
PLAGAS EN CAMPO
Jorge Benavides •••.•••••••••••••.••••.•.•.•••.•••.••...•••••••••••••.••••.••••..•.••.•. 73
EXPERIMENTO EN CAMPO: PAPAS RESISTENTES AL
ATAQUE DE BACTERIAS
Luis Nopo ................................................................................ 77
EXPERIMENTO DE CAMPO: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
EN EL CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA
Jorge Tenorio ..•.•.••.•.•..•••.•.•..•••.•.•••...•..••.•••.••..•••.••...•.•.•..••....••.. 83
RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES .............................. 89
LISTA DE PARTICIPANTES ............................................... 91
NOTA DEL EDITOR ,·\i·;•.:" ·
A note 10 lhe fe'?ider ~· ·
Desde el inicio de la agricultura, el hombre ha estado
preocupado por mejorar las cultivos con la finalidad de obtener
variedades mas productivas y resistentes a las enfermedades que las
atacan. Con el desarrollo de las tecnicas de transformacion de plantas
en el afio 1983, el mejoramiento de las cultivos de importancia
agrfcola se via impulsado. Se ofreda una alternativa rapida para
introducir genes foraneos en plantas, versus la metodologfa clasica.
Actualmente, el mejoramiento genetico de plantas se hace
utilizando la biotecnologfa no solo con fines agrfcolas y nutricionales,
sino tambien para obtener plantas de mejores caracterfsticas
morfol6gicas (ornamentales) y/o coma fabrica de productos de inte.res
industrial, farmaceutico, qufmico, agro-alimenticio, entre otros.
Durante mas de 28 anos, desde su fundaci6n, el Centro
Internacional de la Papa (CIP) ha realizado avances importantes en el
mejoramiento genetico, no solo de la planta de papa, sino tambien de
otros cultivos andinos coma el camote y recientemente en las cultivos
Con este fin,
denominados "rafces y tuberosas andinas".
constantemente se incorporan a la metodologfa empleada las tecnicas
que han ido apareciendo dentro de esta actividad cientffica.
En 1989 el CIP empezo a elaborar las primeros lineamientos
para el desarrollo de la introduccion de genes foraneos en el genoma
de la papa, con la finalidad de conferir resistencia a pat6genos coma
Erwinia sp. y Ralstonia sp., bacterias que causan enfermedades en
este cultivo y que incluso lo eliminan. Asf, el CIP se convirtio en el
pionero para la aplicacion de esta tecnica en el Peru.
El uso de Agrobacterium tumefaciens coma mediador de la
transferencia de genes permitio a las cientfficos realizar estudios en
3
los ambientes de laboratorio, bajo condiciones controladas, para
comprobar al utilicjad ~de este sistema ante las distintas variaciones
climaticas y de suelo~· .. :~.
Agrobacterium tumefaciens result6 ser una herramienta tan util,
que pronto empezaron los trabajos de mejoramiento con el fin de
disminuir la incidencia de enfermedades de gran importancia a nivel
mundial como por ejemplo la "podredumbre blanda" y la "pierna
negra".
En la actualidad estos trabajos se siguen realizando a traves de
programas especiales respaldados por una experiencia cientffica de
cooperaci6n internacional. En estos programas se vigila el
cumplimiento de las normas de bioseguridad aprobadas en el ano
1994 por el gobierno peruano para llevar a cabo estudios de esta
naturaleza sin causar cambios en el lugar en el que se realicen
(campos de cultivo rurales, ambiente de los diferentes nichos
ecol6gicos ).
Gracias al apoyo del Centro Federal para la Investigaci6n del
Mejoramiento
en
Plantas
Cultivadas
(Bundesanstalt
fi.ir
ZOchtungsforschung an Kulturpflanzen, BMZ, Alemania), el CIP ha
crefdo conveniente la organizaci6n del taller "Desarrollo y utilizaci6n
de papas transgenicas: Resistencia a enfermedades bacterianas", con
la finalidad de exponer las bases del mejoramiento biotecnol6gico a
las instituciones educativas y gubernamentales locales, para lo cual se
ha irivitado a investigadores entendidos en el area, tanto del CIP como
de institutes colaboradores en el extranjero.
Edda M. Echeandfa Chiappe
Editora
4
•
f
' •
~
OBJETIVOS:
Objectives
Objetivos Generales
Revision de temas estrategicos relacionados al desarrollo y uso
de papas transgenicas en el control de enfermedades.
Establecer recomendaciones para el empleo apropiado de las
variedades transgenicas de papa.
Objetivos Especificos
Revision de experiencias relacionadas con la introduccion de
papas transgenicas tolerantes a enfermedades bacterianas y proponer
estrategias de manejo para maximizar las beneficios y minimizar las
riesgos.
Preguntas espedficas a responder:
•!•
lCuales son las beneficios de la papas mejoradas par ingenJerfa
genetica con tolerancia a enfermedades bacterianas?
•!•
lCual es la probabilidad de una transferencia horizontal de genes
desde las papas transgenicas hacia las microorganismos en el
suelo?
•!•
lCuales son las riesgos de la hibridizacion entre las papas
transgenicas con tolerancia a enfermedades bacterianas y papas
no transformadas con especies silvestres?
•!• lEs importante realmente el origen? lSon acaso los genes de
defensa y resistencia "natural" mejores que los genes quimericos
o sinteticos?
5
•!•
lCuales son las medidas de seguridad
apropiadamente
plantas
transgenicas
con
enfermedades bacterianas en el Peru?
•!• lQue
otros experimentos
desarrollarse?
y
nuevas
para manejar
tolerancia
a
informaciones
deben
PROGRAMA
Program
Martes 24 de noviembre
Lima
08:00
08:30
09:00
09:30
09:45
10:30
11:15
12:00
13:30
14:00
14:45
15:00
15:45
16:15
Asuntos administrativos
Inauguracion del taller
Resistencia a enfermedades de la papa mediante
protefnas antimicrobianas
Cafe
Marchitez bacteriana y su control
Mejoramiento para resistencia a enfermedades
Desarrollo de estrategias de ingenierfa genetica
para la resistencia a bacterias fitopatogenicas
Almuerzo
Procedimientos de bioseguridad en el CIP
Experimentos con papas transgenicas en
invernaderos y campo en Peru
Cafe
Hibridizacion entre y dentro de papas cultivadas
y especies silvestres
Transformacion de plantas de papa con genes de
lisozima, atacina y cecropina
Discusion general
N. Espinoza
M. Bonierbale
M. Ghislain
S.
S.
P.
L.
Priou
Priou
Persch
Bulow
M. Ghislain
A. Golmirzaie
B. Trognitz
P. Arce
M. Ghislain
Miercoles 25 de noviembre
San Ramon
07:00
12:00
13:00
Viaje a San Ramon
Visita al campo seguida por una discusion sabre
la adecuacion de los procedimientos de
bioseguridad
Almuerzo
P. Aley
14:00
15:00
15:45
16:00
16:30
17:00
Investigaci6n sabre bioseguridad en Alemania:
Papas con el gen T 4 de la lisozima y su
implicancia en la comunidad microbiana coma un
caso de estudio
Protocolos de bioseguridad en el Peru SENASA
Cafe
Experimento de campo: Papas resistentes a
insectos
Experimento de campo: Papas resistentes a
bacterias
Experimento de campo: Medidas de bioseguridad
A. Mahn
E. Carranza
J. Benavides
L. Nopo
J. Tenorio
Jueves 26 de noviembre
Lima
08:00
11:00
12:00
12:30
Regreso a Lima
Desarrollo de recomendaciones sabre
bioseg u rid ad
Clausura del taller
Almuerzo
,":.
' : ; .·.
M. Ghislain
PREAMBULO
Foreword
Merideth Bonierbale *
La Biotecnologfa y la Bioseguridad nos ofrecen una serie de
avances que nos ayudan en la actualidad a extender las fronteras del
mejoramiento genetico y de la Biologfa en general.
Par un lado, utilizando las herramientas de la Biotecnologfa,
ahora es posible enriquecer las acervos geneticos de nuestros cultivos
con informaci6n de variedades nativas y para fines espedficos, coma
par ejem plo:
•!•
•!•
•!•
La defensa y/o resistencia de plantas ante estreses abi6ticos y
bi6ticos
Aumentar la nutrici6n y/o calidad de los alimentos
Mejorar la productividad
Y por otro lado, el concepto de Bioseguridad en el manejo de
las plantas transgenicas ha sido siempre una preocupaci6n de los
biotecn61ogos conscientes del equilibria ecol6gico de nuestro media.
Casi en forma simultanea, muchas autoridades a nivel mundial han
tornado interes en estas actividades cientfficas. Ahora el Peru empieza
a formar parte del grupo de pafses que desarrollan nuevas tecnologfas
en una manera responsable.
En la practica, la Bioseguridad aplicada a los transgenes
comprende la evaluaci6n de los posibles riesgos inherentes a la
experimentaci6n en laboratorio, invernadero o campo, utilizando un
conjunto de medidas o procedimientos especfficos para cada caso.
Actualmente, existe literatura abundante que trata sabre las
aspectos concernientes a la experimentaci6n con plantas transgenicas
en el ambiente. Varios talleres han sido llevados a cabo a nivel
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
9
mundial, inclusive en America del Sur (Iguazu, Argentina), donde se
analizaron los posibles riesgos de la liberacion de papas transgenicas
en la zona andina (Riesgos ambientales de las plantas transgenicas en
centros de diversidad: la papa como modelo, Parque Nacional Iguazu,
Argentina, junio de 1995). En el caso espedfico de Peru dependiendo
del tipo de mejora que se realiza, por ejemplo, la introduccion de una
planta transgenica de papa con un gen de resistencia a bacterias
implica distintos riesgos y por ende distintas medidas de seguridad
que la introduccion de una planta transgenica de soya con un gen de
resistencia a herbicidas, puesto que dicho cultivo es originario de esta
region andina.
Otro concepto que ha evolucionado paralelamente con el de
Bioseguridad es la Bioetica. Varios pafses de la Union Europea ya han
desarrollado comites consultivos sobre Bioetica, lo que refleja una
madurez en la opinion publica de la biotecnologfa, asf como en las
clases polfticas encargadas de la regulacion de los avances cientfficos.
La Bioseguridad, tal como se discutira en el presente taller, esta
relacionada con los riesgos y precauciones que deberan considerarse
para el manejo responsable de plantas transgenicas de papa con
genes de resistencia a enfermedades bacterianas en el Peru. Como un
ejemplo de un caso espedfico.
•!• lQue clases de riesgos existen?
•!• lCual es la probabilidad que dichos riesgos se lleven a cabo?
•!• lCuales de estos riesgos son economicamente y/o ecologicamente
inaceptables?
•!• LQue medidas deberan tomarse en cuenta?
•!• El SENASA y el CIP han elaborado reglamentos. lSon adecuados?
•!• lQue fallas podrfan detectarse en nuestros procedimientos
actuales?
Estos aspectos seran revisados durante este taUer, y esperamos
llegar al final a recomendaciones y conclusiones que puedan ser utiles
para el desarrollo y establecimiento de procedimientos ajustados a
nuestra realidad, estructurados con una solida base cientffica. De esta
manera, esperamos contribuir con las autoridades gubernamentales
encargadas de la regulacion de la investigacion con plantas
tra nsgen icas.
10
RESISTENCIA A ENFERMEDADES DE
PAPA MEDIADA POR PROTEiNAS
ANTIMICROBIANAS
Potato Disease Resistance Mediated by
Anti-microbial proteins
Marc Ghislain *
INTRODUCCION
El presente taller forma parte del programa de un proyecto
realizado en colaboracion con el "Federal Center for Breeding
Research on Cultivated Plants" en Quedlinburg, Alemania.
Muches son los factores que afectan la produccion de papa,
entre estos se encuentran las ~ y_ enfermedades.
Se estima que hay una perdida de 21 % de la produccion total
de papa que esta relacionada a enfermedades propias del cultivo. Para
disminuir esta perdida, es necesario desarrollar resistencia a plagas y
enfermedades en papa para garantizar la seguridad alimentaria de la
poblacion, disminuir los costos de produccion, mejorar la seguridad y
salud de los productores y su familia, disminuir la contaminacion
ambiental y bajar la concentracion de residues qufmicos en la
alimentacion, para beneficio del consumidor.
A continuacion presentamos un resumen de las actividades de
este proyecto relacionadas al taller y que se estan llevando a cabo con
el fin de contribuir en la obtencion de mejores variedades de cultivos
de importancia.
Comencemos mencionando los objetivos del proyecto:
EL OBJETIVO PRINCIPAL es la manipulacion de la expresion
de genes que codifican para protefnas de accion antimicrobiana con la
finalidad de aumentar la resistencia a la marchitez bacteriana y al
tizon tardfo en papa.
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
11
Para cumplir con este objetivo, se estan considerando estas dos
enfermedades dentro del proyecto: Ambas son las enfermedades de
mayor importancia en el cultivo de la papa en los pafses en vfas de
desarrollo. Por esta raz6n, el CIP, esta dedicando sus mayores
esfuerzos a la investigaci6n en este campo, a pesar de las dificultades
para mejorar los niveles de resistencia a estas enfermedades.
Varios fueron /os OBJETIVOS ESPECIFICOS definidos para este
proyecto:
•!•
Estrategias utilizadas para combatir al Tizon Tardio
Aislamiento del gen codificante, en variedades de papas nativas,
de la protefna osmotina, conocida como factor inhibidor de
crecimiento del hongo responsable del Tizon Tardio. Una vez obtenido
el gen, se desarrolla una construccion genica que codifique para la
expresi6n constitutiva, inducida y con secreci6n a nivel vacuolar de la
protefna osmotina. Ademas, come una alternativa, se esta trabajando
en el desarrollo de construcciones di- y tri- genicas ( que incluirfan
osmotina y/o lisozima y/o glucanasa) para obtener un efecto sinergico
durante el proceso de defensa al Tizon Tardio. Estes genes quimericos
pueden ser transferidos a variedades de papa susceptibles coma:
Achirana INTA, Amarilis y Tomasa Condemayta.
Finalmente, se
realizan ensayos de campo para determinar el nivel de resistencia
alcanzado.
•!•
Estrategias
Bacteriana
utilizadas
para
combatir
la
Marchitez
En el caso de la Marchitez Bacteriana, se busca la transferencia
del gen que codifica para la lisozima del bacteriofago T4 a variedades
susceptibles de papa como: Achirana INTA, Amarilis y Tomasa
Condemayta. Primera, se desarrollan construcciones genicas con
expresi6n dirigida al espacio intercelular de tejidos espedficos ( como
los haces vasculares) e inducida por estres abiotico (presencia de
heridas) o condiciones anaer6bicas. Estas construcciones incluiran el
gen de interes del bacteriofago T4. Posteriormente se realizara la
transferencia de estas construcciones a variedades de papa
susceptibles coma: Achirana INTA, Amarilis y Tomasa Condemayta. En
este case, tambien se realizan ensayos de campo para determinar el
nivel de resistencia alcanzado.
12
•!•
Organizaci6n de talleres sobre
transgenicas en el medio ambiente
manejo
de
papas
Se realizaran dos talleres especializados en el manejo de papas
transgenicas con resistencia a enfermedades bacterianas y al Tizon
Tardio en las cuales se trataran las siguientes temas :
1.
Identificaci6n de las riesgos ( Lconsecuencias?)
2.
Evaluaci6n de estos riesgos (Lconsecuencias?)
3.
Experimentos que deben realizarse antes de liberar papas
transgenicas
4.
Medidas a seguir para el manejo eficiente de papas transgenicas
5.
Revision de la situaci6n actual de las reglas y normas en el Peru
para el manejo de papas transgenicas.
•!•
Uso de la ingenieria genetica para la resistencia a
enfermedades bacterianas en papa
El mejoramiento convencional para aumentar la resistencia a la
Marchitez Bacteriana no logr6 hasta ahora altos niveles de resistencia.
Generalmente se cree que hay poca resistencia par lo menos dentro
del germoplasma cultivado. Es par eso que el mejoramiento mediante
el uso de la ingenierfa genetica, tambien llamado mejoramiento
molecular, se ha convertido en un nuevo campo de investigaci6n con
promisorios resultados. Antes de definir cuales son las estrategias
para el mejoramiento molecular de la resistencia a enfermedades
bacterianas en papa, es importante resaltar varios aspectos del cultivo
de la papa:
(a) La papa es el cuarto cultivo en importancia en el mundo despues
del trigo, arroz y mafz.
(b) Tiene un alto valor nutritivo y gran potencial en rendimiento.
(c) Constituye aproximadamente la mitad
producci6n mundial de rafces y tuberculos.
del
volumen
de
la
(d) Forma parte de la dieta de media bi116n de consumidores en
pafses en vfas de desarrollo.
( e) La producci6n global para la decada de los 60 era de 29 millones
de toneladas, se preve que llegara a superar las 100 millones de
toneladas para fines de milenio.
13
(f) El rendimiento par pafs fluctua entre las 7 t/ha, en pafses de la
region del sub-Sahara, y las 27 t/ha caracterfsticos de la provincia
de Shandong en la China. El rendimiento promedio mundial esta
en 13 t/ha en pafses en vfas de desarrollo.
(g) En pafses desarrollados, la mayor produccion se presenta en
Holanda, llegando hasta 42 t/ha.
(h) En condiciones 6ptimas de crecimiento, se estima que la
producci6n podrfa sobrepasar las 100 t/ha.
4!Que ventajas tiene la papa en la Transformacion Genetica?
Se ha realizado porque:
1. Fue el primer cultivo alimenticio en ser transformado a principios
de la decada de las 80, la tecnolog fa en pa pa ya esta bien
establecida y durante su desarrollo no se report6 ningun efecto
indeseable.
2.
La transferencia de genes es muy eficiente y esta mediada par el
sistema natural caracterfstico de Agrobacterium tumefaciens
llamado "agroinfeccion".
3.
Existe la posibilidad de aplicar el sistema a larga escala en pafses
en vfa de desarrollo sin mayor costo.
4.
La agroinfeccion favorece la insercion de algunas copias del
transgen en la planta.
5.
La multiplicaci6n clonal caracterfstica de esta planta permite
mantener el caracter agregado en forma estable.
4!Cuales son las estrategias antimicrobianas en la papa
transgenica?
(a) Los genes codificantes para cecropina B (y sus analogos
artificiales coma Shiva y 58-37) y atacina E, aislados de celulas
del insecto Hya/ophora cecropia fueron introducidos en plantas de
tabaco, papa y manzana. Se han presentado reportes con
resultados contradictorios en trabajos realizados con cecropina
para determinar la expresi6n de este gen foraneo y el nivel de
resistencia adquirido.
14
(b) El gen que codifica para la sarcotoxina ( del mismo ti po que la
cecropina), aislado del insecto Sarcophaga peregrina e introducido
en papa. Este material esta actualmente en proceso de evaluacion
en el campo en San Ramon (proyecto de colaboracion entre el
Weizmann Institute of Science, Israel y el CIP).
( c) Uso de genes codificantes de tioninas (peso de 5000 da, ricas en
cistefnas) presentes en trigo y cebada. Fueron transferidos a
plantas de tabaco (de expresi6n intracelular). Se observe un
aumento en la resistencia a P. syringae en tamizados de hojas
infiltradas, pero no en condiciones de campo. Otras pruebas con
tioninas se hicieron en tomate y papas sin mayor exito.
( d) El gen de un peptido antimicrobiano, tachyplesin, aislado de un
cangrejo asiatico, fue expresado en papas con secrecion dirigida
hacia el espacio intercelular. Una ligera disminucion del grade de
pudricion fue observada luego de la inoculacion con Erwinia spp.
(e) Protefnas de transferencia no espedfica de lfpidos, nsLTP,
(aisladas de plantas de cebolla) fueron introducidas en tabaco
para conferir resistencia a la presencia de Pseudomonas syringae,
resistencia que se manifesto en la forma de una menor presencia
de sfntomas en las hojas infectadas.
(f) El gen que codifica para la enzima glucosa oxidasa del hongo
Aspergillus niger fue introducido en papas. Esta enzima promueve
la produccion de peroxide de hidrogeno (H 20 2), molecula
altamente toxica para las microbios, pero tambien involucrada en
la reaccion local de hipersensibilidad y coma sefial de defensa
celular. Se observaron altos niveles de resistencia a Erwinia
carotovora. Sin embargo, debe evaluarse el efecto de la expresion
de este gen sabre la salud humana por la toxicidad del H20 2 en
eucariotes.
(g) Genes de lisozima fueron tambien introducidos exitosamente en
papas para aumentar la resistencia a enfermedades bacterianas.
Se trata de las genes que codifican la lisozima del bacteri6fago T4,
de la clara de huevo de gallina, y de bovino.
15
Posibles mejoras
antimicrobianos.
en
la
expresion
de
los
genes
Expresi6n controlada de la lisozima L en !2BJ29.
•
La expresi6n constitutiva del gen de lisozima T4 y su posterior
secreci6n hacia el espacio intercelular permiti6 la reducci6n del
grado de pudrici6n observado ante la presencia de Erwinia
carotovora en el cultivo.
•
Par la naturaleza del proceso de infecci6n se ha centrado el
estudio en la construcci6n de genes quimericos. Asf, se busca que
la lisozima se acumule en el momenta yen el tejido oportuno.
Expresi6n diriqida en teiidos
•
El uso del promotor pat del gen de patatina que se expresa en
tuberculos, podrfa ser muy util para aumentar la resistencia a
enfermedades bacterianas causadas par Erwinia spp.
•
El uso del promotor grpl.8 que se expresa en los haces vasculares
durante el proceso de diferenciaci6n, podrfa ser especialmente util
para R. solanacearum.
Expresi6n controlada QQ[ factores abi6ticos
•
Uso de genes promotores coma el mas y el wunl que son
activados por heridas en el tejido vegetal. Estas heridas
constituyen una de las vfas de ingreso mas utilizadas par las
bacterias durante el proceso de infecci6n. Con este gen quimerico
se busca la resistencia a R. so/anacearum.
•
Uso del gen promoter GapC4, inducido bajo condiciones
anaer6bicas, condiciones que prevalecen durante el proceso de
pudrici6n del tuberculo. Este gen podrfa ser util para incrementar
la resistencia a Erwinia spp.
(h) Protefnas tipo hevein (aisladas de amaranto) que se caracterizan
par su afinidad a la quitina, compuesto que forma parte de la
membrana celular de varios pat6genos.
(i) Protefnas del ti po knottin (aisladas de Mirabilis jalapa) que tienen
las mismos ranges de actividad antimicrobiana. Estas protefnas se
transfirieron a tabaco pero nose observ6 ningun efecto in vivo de
actividad antimicrobiana.
16
(j) Defensinas, protelnas aisladas en semillas de rabanito. Fueron
utilizadas exitosamente en tabaco para incrementar su defensa
ante la presencia de hongos.
c!Otras estrategias en camino para el futuro?
•
La identificacion de nuevas protefnas de accion antimicrobiana
en rafces y tuberculos.
•
Expresion en plantas del gen de origen bacteriano que codifica
la oligo-galacturonido liasa, enzima que convierte los
compuestos resultantes de la degradacion de la membrana
vegetal por las enzimas de la bacteria patogenica y que
actuan como inductores de patogenicidad, en compuestos
inactivos.
•
Expresion en plantas de anticuerpos especfficos que bloqueen
los factores de patogenicidad.
•
Determinar un mecanismo de muerte celular inducida por un
gen suicida activado por el pat6geno.
PERSPECTIVAS
Las construcciones gerncas que se utilizaron podrfan conferir
resistencia a variedades susceptibles a marchitez bacteriana.
Se probaran los genes en cultivares como Achirana INTA,
Amarilis, Tomasa Condemayta y Desiree.
La o las construcciones que demuestren conferir cierto grado de
resistencia a marchitez bacteriana seran utilizadas conjuntamente para
buscar un efecto sinergico de los genes quimericos sobre la resistencia
bacteriana.
POSIBLES LIMITACIONES
•
La opinion publica esta todavfa poco preparada a aceptar los
alimentos obtenidos mediante el uso de la biotecnologfa. Se
trata, en mi opinion mayormente de una falta de informacion
sobre la naturaleza de los cambios geneticos producidos por
este metodo en comparaci6n con los metodos convencionales
que tambien generan modificaciones geneticas. En realidad,
el
termino
genenco
de
Organismos
Modificados
Geneticamente, ya revela la mala informacion del publico,
17
porque cualquier producto del mejoramiento es una modificacion
genetica que nose encuentra en la naturaleza. Tambien existe en
la opinion publica la creencia de que no existe ningun tipo de
regulacion de los cultivos transgenicos. Esto tampoco es verdad, al
igual que las otros productos obtenidos par mejoramiento, estos
se analizan con respecto a varios caracteres conocidos coma
dafiinos para la salud humana. Sin embargo, algunos riesgos
ambientales necesitan una regulaci6n espedfica que en muchos
casos todavia no existe en los paises en desarrollo.
La desconfianza del consumidor hacia los cultivos
geneticamente modificados podrfa interferir con la inversion que se
realiza en este tipo de investigaci6n, atrasando el desarrollo de esta
tecnologfa en los pafses donde se venden estos productos y afectando
a los productores envueltos en esta actividad.
Tambien, un efecto perverse de esta actitud podrfa ser que se
promuevan los productos que no hayan sido modificados
geneticamente y mantener el sistema actual de producci6n asistido por
numerosos aportes en productos fitosanitarios. Todos sabemos que
estos contaminan el media ambiente, son peligrosos para la salud
humana, tanto para el agricultor coma para el consumidor, y
mantienen una dependencia del agricultor hacia las empresas de
agroqufmicos.
•
La regulacion de la bioseguridad referente a los cultivos
transgenicos es tambien un factor limitante para el desarrollo
de esta tecnologia. En general, la obligaci6n de establecer
normas nacionales de bioseguridad conduce a una demora
para el desarrollo de este tipo de productos en los pafses en
desarrollo. Par esta razon, es muy importante que en pafses
coma el Peru se establezca a la brevedad posible normas y
regulaciones, que permitan el desarrollo de esta tecnologfa
bajo la supervision de instancias nacionales donde las sectores
industriales, de proteccion del media ambiente y de la
investigacion agrfcola esten representados.
Los derechos de propiedad intelectual constituyen un tercer tipo de
posibles limitaciones para el desarrollo de esta tecnologfa. Existe un
peligro real que concentra la tecnologfa en unos pocos "duefios".
Compafifas transnacionales, que pueden comprar patentes de otros y
defender sus patentes por la gran capacidad financiera que tienen.
Las pequenas empresas o el sector publico generalmente no tienen el
18
respaldo financiero suficiente como para entablar acci6n judicial en
contra de estas companfas. Entonces, los derechos de propiedad
intelectuales podrfan limitar esta tecnologfa fuera de pafses en vfa de
desarrollo por carecer estos de legislaciones adecuadas para
protegerlos.
Tabla 1.
Costas adicionales en el cultivo de papa ocasionados par la presencia de
las 'plagas mayores'.
Plagas y
Enfermedades
Area
afectada
{ha) 1
{x10
3
)
Perdidas
enla
produccion
{$US)1
Proteccion
del cultivo
{$US) 1
{x10
{x10 6 )
1
2
Tizon Tardfo
1,960
2,430
Marchitez
Bacteriana
1,150
720
Virus
1,405
705
Insectos
746
6
)
Valor de
perdida
del cultivo
{$US) 2
Total
{$US)
{x10 6 )
{x10 6 )
742
3,172
720
705
655
655
Estimado a partir de Walker y Collion, 1997
Estimado en base a la depreciacion y las costos par insecticidas para gorgojo de las
Andes de la papa, mosca minadora y polilla de papa. Tornado de Walker y Collion,
1997
19
"
,I
EVALUACION DE TUBERCULOS DE PAPA
TRANSGENICA A LA PUDRICION
CAUSADA POR Erwinia carotovora
subsp. carotovora
Evaluation of transgenic tubers against
bacterial wilt due to Erwinia carotovora
subsp. carotovora
Sylvie Priou *
MATERIALES Y METODOS
Se evaluaron 16 clones transformados con el gen de lisozima
C2, 9 con el gen de lisozima T4 y 32 con el gen Sarcotoxina IA para
resistencia a la pudrici6n blanda causada por Erwinia carotovora
subsp. carotovora bajo condiciones de laboratorio y empleando de 5 a
10 tuberculos por don. Los tuberculos fueron cortados por la mitad e
inoculados con la cepa CIP-400. Se usaron dos concentraciones
diferentes de ineculo (5x10 8 y 2.Sx 109 ufc/ml) para cada mitad. La
inoculacien se realize por el metodo del sacabocado. Se utilize 20 ~d
de la suspension bacteriana que fue depositada en el hoyo de 2 mm
de profundidad por 3 mm de diametro hecha en la parte central de la
mitad del tuberculo con un sacabocados N°3. Los tuberculos fueron
incubados en una camara humeda a 25°C durante dos dfas, al cabo de
los cuales se evalu6 el peso (g) de tejido podrido. Luego se calcul6 el
porcentaje relative de pudrici6n blanda (PRPB):
Peso tota I - Peso sa no
PRPB
=
x 100
Peso total
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
21
Los datos fueron transformados a:
Arc Sena --J PRPB
para ser analizados por SAS (programa de computacion utilizado para
el analisis estadfstico).
RESULTADOS
Todos los clones evaluados desarrollaron pudricion, sin
embargo, en los clones Desiree con el gen lisozima C2 se encontr6
que los clones Desiree/Lys-C2/ AA-09 y Desiree/Lys-C2/ AA-15 son
significativamente menos susceptibles que el testigo Desiree (sin el
gen lisozima C2). En clones con el gen de lisozima T4 se encontr6
que los clones Desiree/Lys-T4/DL-10 y Desiree/Lys-T4/DL-12 tambien
son significativamente menos susceptibles que el testigo Desiree
(Tabla 1).
En el case de los clones con el gen Sarcotoxina IA se encontr6
que los clones Achirana - INTA / Saree - IA/PS - 12, TS-10 / Sarco IA/ PS - 8, Achirana - INTA/Sarco-IA/PS - 1, Desiree/Saree - IA/TS 14, TS-10 /Saree - IA/ PS - 9 y TS - 10/Sarco - IA/PS - 6 son
significativamente mejores con respecto a los testigos Desiree y TS 10 sin transformar pero mas susceptibles que el cultivar Yana Puna
(testigo moderadamente resistente; Tabla 2).
Tabla 1.
Porcentaje relativo de pudrici6n blanda (PRPB) en clones de papa
transgenicas (genes C2 y T4 Lisozima) inoculadas mediante sacabocado
con dos concentraciones de Erwinia carotovora subsp. carotovora.
DL12 (T4)
WIKAA15 (C2)
WIKAA09 (C2)
DLlO (T4)
Desiree
cs, NT)
Dunnett, P = 0.05
S = Susceptible; NT = Clan no transgenico.
22
Concentraci6n de inoculo
2.5 x 109 ufc/ml
5 x 108 ufc/ml
2.5 a
3.7 a
3.2 b
3.9 b
5.2 c
3.9 a
4.1 a
10.8 d
12.8 c
4.8
b
Tabla 2.
Porcentaje relativo de pudricion blanda (PRPB) en clones de papa
transgenicas (Sarcotoxina IA) inoculadas por el metodo del sacabocado
con dos concentraciones de Etwinia carotovora subsp. carotovora.
Concentracion de inoculo
Clon
5 x 10 ufc/ml
2.5 x 109 ufc/ml
PS-12 (Achirana INTA)
PS-8 (TS-10)
2.6* b
2.9 b
3.6 c
4.0 c
4.1 c
4.2 c
9.7 d
0.12 a
10.8 e
6.7 e
3.8 b
PS-1 (Achirana INTA)
TS-14 (Desiree)
PS-9 (TS-10)
PS-6 (TS-10)
Desiree (S, NT)
Yana Puna (MR, NT)
TS-10 (S, NT)
8
4.8 c
3.9 b
5.6 d
4.7 c
10.5 f
0.49 a
14.2 g
Dunnett, P = 0.05
MR = Moderadamente resistente; S = Susceptible;
NT= Clon no transgenico.
23
'7
6oos~~~~~~~~~~~-----,
MEJORAMIENTO PARA OBTENER
RESISTENCIA A MARCHITEZ
BACTERIA NA
Breeding for Resistance to Bacterial Wilt
Sylvie Priou *
HISTORIA DEL MEJORAMIENTO GENETICO DE LA PAPA EN EL
CIP
En la decada de los 50 las doctores F. Haynes y L. Nielsen de la
Universidad de Carolina del Norte evaluaron mas de 9000 cultivares de
papa para la resistencia a marchitez bacteriana.
Muy pocos cultivares demostraron ser resistentes, el mejor de
estos fue Prisca. Posteriormente se hallaron otros tres cultivares
resistentes: Achat, Ontario y Cruza 148. Prisca es un cultivar aleman
que ya no es cultivado en Europa. Este cultivar fue hallado en
Madagascar por personal del CIP y anadido al PTL (Pathogen TestedList Collection, un grupo de cultivares libres de pat6genos que se
conserva en el CIP, bajo condiciones in vitro) coma el numero 800966.
Achat es una variedad que se cultiva en gran cantidad en Brasil debido
al hecho de que es tolerante a la marchitez bacteriana, pero el poseer
caracterfsticas culinarias pobres y carecer de periodo de floraci6n,
llev6 a EMBRAPA - CNHP a iniciar en 1987, un programa de
mejoramiento en resistencia a marchitez bacteriana en colaboraci6n
con el CIP.
Desde 1987 hasta 1995 se recibieron progenies TPS de los
ultimas cruces realizados en CIP de los que se habfan seleccionado
contra la raza 130 clones cuyo desempeno era igual o mejor que
Achat (Lopes et al., 1998).
Cruza 148 es un cv. de Costa Rica de pedigrf desconocido que ha sido
utilizado ampliamente en programas de mejoramiento en el CIP,
CNPH-Brasil y CAAS-China y cultivado en muchos pafses por su
resistencia a la marchitez bacteriana (Tabla 1). Sin embargo, sus
tuberculos poseen caracterfsticas de plantas silvestres (anillo morado,
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
25
alto contenido de alcaloides), valor de comercializacion pobre y sus
tuberculos son infectados en estadfo de latencia por Ralstonia
so/anacearum (Rs).
El programa de mejoramiento para la resistencia a marchitez
bacteriana fue iniciado en 1972 en la Universidad de Wisconsin por
Rowe y Sequeira despues de la identificaci6n de la resistencia en los
clones colombianos de So/anum phureja (Sequeira y Rowe, 1969).
Toda el material evaluado en el Peru durante los primeros ocho
anos del CIP vino del programa de mejoramiento de Wisconsin.
De 1972 a 1976 (French y Sequeira)
Poblaciones basadas en los clones colombianos resistentes de S.
phureja (CCC) fueron cruzadas con 5. tuberosum subsp. tuberosum
(provistas por el programa de mejoramiento de Wisconsin). Los
hfbridos resultantes fueron luego cruzados con clones mejicanos
resistentes al tiz6n tardfo (LB) ( derivados de la variedad silvestre
hexaploide de S. demissum): los c6digos utilizados fueron BR, MS, PSP
y PSW (Figura 1). A partir de este material, muchas variedades se han
convertido en nuevas variedades (coma Cajamarca y Molinera) o han
sido cultivadas en grandes cantidades durante los ultimas anos de la
decada de los 70 (Tabla 1). Se han incorporado nuevas fuentes de
resistencia a la primera poblacion derivada de las especies silvestres 5.
chacoense y S. raphanifolium.
La mayorfa de estas eran de maduracion tardfa. Mas aun,
existfa una interaccion altamente especifica hospedero - lfnea - media
ambiente y la resistencia se expresaba solamente bajo condiciones de
temperatura frfas. Ademas, la base genetica para la poblaci6n que
llevaba la resistencia tuvo que ser ampliada y adaptada a condiciones
de temperatura calidas junta con la adici6n de la caracterfstica de
maduracion temprana.
De 1977 a 1979 (Mendoza)
En 1977 los clones BR fueron cruzados con
maduraci6n temprana (series 3778 del CIP, Grupo I).
clones de
Los clones del Grupo I fueron cruzados en 1979 con genotipos
adaptados a condiciones tropicales para obtener los clones que
constituyen el Grupo II (series 3796 del CIP).
26
El Grupo III (serie 3805 del CIP) fue producida entre 1979 y
1980 para restaurar la resistencia a marchitez bacteriana y tiz6n tardfo
que se perdieron cuando las Grupos I y II fueron creados. La
autopolinizaci6n se convirti6 en un procedimiento imprescindible
debido a las restricciones de material que surge de la necesidad de
prevenir el uso de plantas infectadas con PS1V.
De 1980 a 1985 (Schmiediche)
Los resultados obtenidos en Sri Lanka confirmaron que la
expresi6n de la resistencia a marchitez bacteriana esta en funci6n a la
adaptabilidad al calor. Con el fin de aumentar la base genetica para la
resistencia, se genera el Grupo IV (series 3810 CIP) a partir del clan
AVRDC-1287.19 proveniente de Taiwan (resistente a marchitez
bacteriana y tolerante al calor) cuya fuentes de resistencia a marchitez
bacteriana son S. chacoense y S. raphanifolium y Serrana INTA ( cv. de
Argentina, resistente a PLRV y PVY e inmune a PVX). Los niveles de
resistencia eran superiores a las del cv. variedad Phureja en las
Filipinas.
El Grupo V fue generado en 1982 cruzando las clones con mejor
resistencia a marchitez bacteriana con Cruza 148 (resistente a
marchitez bacteriana y tiz6n tardfo) e India 853 ( resistente a tiz6n
tardfo) para introducir nuevas fuentes de resistencia a marchitez
bacteriana, tiz6n tardfo y maduraci6n temprana (y para superar la
tendencia a la autofecundaci6n).
De 1986 a 1995 (Anguiz, Mendoza y Chujoy)
Una poblaci6n diploide llamada MBN fue producida, derivada de
una poblaci6n de S. sparsipilum ( combinando resistencia al nude de la
rafz causada par nematodos), chacoense, microdontum y phureja.
Esta poblaci6n fue cruzada con una poblaci6n diploide cultivada que
fue derivada de S. stenotomum, phureja y gonioca/yx (del Dr. Haynes
en la Universidad de Carolina del Norte). La poblaci6n diploide final
fue cruzada con el germoplasma tetraploide mas avanzado resistente
a marchitez bacteriana (TD). Los genotipos TD fueron finalmente
cruzados con las mejores genotipos de las Grupos VI y V obteniendose
una poblaci6n con un alto grado de heterocigocidad y te6ricamente
con un amplio espectro de resistencia a marchitez bacteriana
( combinando, par lo menos, cuatro fuentes especfficas de resistencia;
Figura 2). Fueron clones de alta productividad cuya forma de
tuberculo es similar a S. tuberosum, sin embargo, tenfan alga de
27
maduracion tardfa. Esos clones fueron enviados a las Filipinas de los
cuales se seleccionaron 27 (series BP) como resistentes a la marchitez
bacteriana con un nivel mas alto de resistencia que los clones Phureja
(entraron en el PTL del CIP). Sin embargo, estos clones eran
susceptibles al tiz6n tardfo.
Cruces realizados luego con los materiales que mejor se
adaptaban a las altas temperaturas (materiales de tropicos de tierras
bajas [LT]) y de maduracion temprana y tambien con material
resistente al tizon tardfo, y/o Hneas resistentes a RKN y/o clones
inmunes a PVX y PVY llevaron a obtener tres poblaciones que aun se
encuentran en evaluaci6n en la ciudad de Carhuaz, Peru (contra raza
3):
•!•
•!•
•!•
MB raza 3, PVX, PVY, LB;
MB raza 1, PVX, PVY, LT, maduraci6n temprana media y buena
prod uctividad;
MB raza 1, LT, RKN y maduraci6n temprana.
CARACTERISTICAS DE LA RESISTENCIA DE PAPA A LA
MARCHITEZ BACTERIANA
1. Tipo poligenico y cuantitativo (con genes aditivos y no aditivos);
2.
!nestable debido a una fuerte interacci6n genotipo - patogeno,
genotipo - medio ambiente;
3.
Bajo nivel de resistencia en los clones mas resistentes y si no
todas son potencialmente susceptibles a la infecci6n latente;
4.
Se requiere una amplia adaptacion del genotipo hospedero para
que haya una expresion estable de resistencia;
5.
No se ha evidenciado una relacion gen por gen entre Rs y papa,
pero la resistencia es especffica del linaje (no es especffica de la
raza o cu ltiva r);
6.
La alta variabilidad genetica en (Rs) requiere de un ti po de
resistencia de amplia base para que pueda manejarse;
7.
la base genetica es diferente para cada especie silvestre de
Solanum (algunas de ellas de tipo poligenico, genes mayores y
menores) ademas el concepto de resistencia de amplio espectro
es realfstico.
28
CONSECUENCIAS DE LAS ESTRATEGIAS DE MEJORAMIENTO
La magnitud relativa de los componentes y rangos de
heredabilidad de las varianzas geneticas sugieren que la seleccion
clonal serfa exitosa (pero con un progreso lento en la poblacion). La
resistencia a la marchitez bacteriana es mas estable cuando se le
relaciona con la tolerancia al calor o con alguna adaptacion
relativamente amplia dentro de genotipo. La selecci6n clonal puede
ser exitosa para condiciones de crecimiento especffico con prevalencia
de lfneas especificas de Rs (la limpieza y elecci6n de los cultivares
debe realizarse en el lugar donde se utilizara el cv.). Por ejemplo: en
las Filipinas, los clones BP que combinan maduraci6n temprana,
adaptaci6n al calor y alguna resistencia a marchitez bacteriana de
especies silvestres, presentaron resistencia exitosa (R) a la marchitez
bacteriana (razas 1 y 3). Las lfneas altamente virulentas de Rs que
mantienen patogenicidad por encima de un amplio rango de
condiciones ambientales serfan las mas apropiadas para ser elegidas
coma portadoras de una resistencia estable.
RESISTENCIA A LA MARCHITEZ BACTERIANA EN OTROS
HOSPEDEROS
Materiales resistentes han sido encontrados en tomate,
pimientos, berenjena, tabaco y manf. No se ha evidenciado inmunidad
alguna y en ninguno de los casos, las plantas resistentes estan
infectadas de manera latente con Rs. La resistencia no es estable de
una localidad y/o lfnea a otra, y se quiebra ante la presencia de altas
poblaciones de Me/oidogyne sp. en el suelo.
Se han encontrado dos tipos de tomate resistentes (Prior et al.,
1994):
(a) tipo poligenico (CRA66);
(b) tipo de herencia simple monogenica y dominante (coma Hawai
7996) que sigue las leyes de la segregacion Mendeliana (en
Guadeloupe, Francia), pero recientemente caracterizada por el
mapeo genetico a partir del cual se hallo que es controlado por un
loci resistente cuantitativo ubicado en el cromosoma 6. En este
cromosoma tambien se encuentra el gen Mi que lleva la
resistencia a Meloidogyne sp. (Deberdt y Prior, 1998). Estudios de
mapeo posteriores demostraron que pueden existir dos QTLs, uno
controlando la resistencia adaptativa y el otro controlando la
29
resistencia constitutiva (e.g., no dependiente del media ambiente;
Wang et al., 1998).
Sin embargo, todos las materiales resistentes de tomate tienen
frutos pequenos (gen localizado en cromosoma 2). En un experimento
reciente, coordinado por AVRDC para comparar el comportamiento de
35 llneas de tomate resistentes (variedades comerciales, llneas para
mejoramiento y especies silvestres) mas de 11 palses confirmaron que
hay no inmunidad. Pero las resultados mostraron que hay 7 entradas
que mostraron mas de 90% de supervivencia en las diferentes
localidades. Ademas, parece que la estabilidad de la resistencia en
tomate esta disponible y que el desarrollo de variedades para una
distribuci6n mas amplia es posible (Wang et al., 1998).
VARIABILIDAD GENETICA DE Ralstonia solanacearum
Se utilizan- dos sistemas de clasificaci6n para Rs. las sistemas
de raza y de biovar.
El sistema de razas esta basado en el rango de hospederos
bajo condiciones de campo. A partir de esto, se pueden distinguir
cuatro razas (Hayward, 1991):
1.
Raza 1: afecta un amplio rango de cultivos solanaceos, incluyendo
la papa, varias malas hierbas y bananas diploides. Algunas llneas
pueden afectar al manly al jengibre. La mayorla de las veces se le
halla en lugares de poca elevaci6n, en las tr6picos y subtr6picos.
2.
Raza 2: afecta plantas de la familia de las musaceae, coma la
banana triploide, el platano y la He/iconia spp. en las tr6picos.
3.
Raza 3: afecta principalmente papa y ocasionalmente tomate
junta con otros cultivos solanaceos y malas hierbas. Se la haya
comunmente en lugares de mayor elevaci6n o latitudes ( climas
frfos).
4.
Raza 4: afecta a la mora y se halla solamente en China.
El sistema biovar consiste en pruebas bioqulmicas basadas en la
habilidad de la bacteria para utilizar tres disacaridos y/u oxidar tres
alcoholes de hexosa.
30
La clasificacion de las biovares se basa en lo siguiente (Hayward,
1991):
1. Bv 1 = utilizacion de disacaridos negativa, oxidacion de alcoholes
negativa;
2. Bv 2 = utilizacion de disacaridos positiva, oxidacion de alcoholes
negativa;
3. Bv 3 = utilizacion de disacaridos positiva, oxidacion de alcoholes
positiva;
4. Bv 4 = utilizacion de disacaridos negativa, oxidacion de alcoholes
positiva;
5. Bv 5 = utilizacion de disacaridos positiva, oxidacion solo de
manitol.
Hay alguna equivalencia entre la raza y el biovar: la raza 3
coincide con el biovar 2A; las lfneas de raza 1 son del biovar 1, 3 o 4,
el biovar 1 es el mas comun en papa. No se ha establecido una raza
para el biovar 2T, se le haya principalmente en las tierras bajas de la
cuenca del Amazonas. Tiene muchas lfneas y un rango amplio de
hospederos coma en el caso de la raza 1; sin embargo, el biovar 2T
son menos agresivas. Las lfneas de la raza 2 son las biovares 1 y 3, y
toda la raza 4 son el biovar 5 (Hayward, 1991).
De hecho, el sistema de biovares es el mas utilizado en la
actualidad debido a la poca importancia que tiene la raza: no hay
especificidad del hospedero que haya sido evidenciada y ademas se ha
presentado superposicion entre las razas. Rs es extremadamente
adaptable desde el momenta en el que puede afectar 200 especies de
plantas diferentes.
Muchos estudios realizados con el fin de acceder a la diversidad
genetica de Rs han llevado a tener una imagen mas clara de SU
distribucion y evolucion geografica. Rs es una especie muy
heterogenea. Estudios en RFLP utilizando sondas de 8 ADNs dividieron
las lfneas de Rs en 38 genotipos multilocus agrupados en dos
divisiones mayores (Cook y Sequeira, 1994):
(a) Division 1: contiene las biovares 3, 4 y 5 (razas 1 y 4);
(b) Division 2: reagrupa las biovares 1, 2A y 2T (razas 1, 2 y 3).
La caracterfstica que ha sido correlacionada de manera mas estrecha
con las datos obtenidos del RFLP fue el origen geografico de las
lfneas. Los dos grupos mayores que se han podido distinguir
provienen o del Viejo Mundo o del Nuevo Mundo. Cerca del 92% de
las lfneas de la Division I provienen de Australia y Asia, y el 97% de
31
las lfneas de la Division II son de las Americas. Al final, la lfneas de los
biovar 1 y 2 fueron separadas en dos grupos. Dentro del grupo del
biovar 2 se separaron aquellas lfneas que proceden del biovar 2A de
las tierras altas de los Andes de aquellas que proceden del biovar 2T
indfgenas de los valles de la tierras bajas en Peru y Brasil lo que es
consistente con la especializacion de la papa dentro del biovar 2A.
Al secuenciar el ADNr 165, la division 1 fue dividida en dos
subdivisiones (Fegan et al., 1998):
i.
ii.
Division 2a: lfneas de los biovares 1, 2A y 2T provenientes de
Indonesia; y Ralstonia syzygii (agente de la enfermedad del
clavo de Sumatra) y Pseudomonas ce/ebensis ( agente la
enfermedad bacteriana de la sangre del banana presente en
Asia), dos patogeno muy estrechamente relacionados a Rs,
Division 2b: todas las otras lfneas de los biovares 1, 2A y 2T.
Estas tecnicas moleculares han confirmado las conclusiones a
las que han llegado patologos luego de estudiar los fenotipos y la
patogenicidad. Los subgrupos mas homogeneos fenotfpica y
genotfpicamente de Rs son:
iii. Uneas de la Raza 3 / biovar 2A (grupos RFLP 26, 27, 34) que
causan marchitez bacteriana / pudricion marron de papa;
iv. Uneas de la Raza 2 I biovar 1 (grupos RFLP 24, 25 y 28) que
causan la enfermedad de Bugtok del platano y la enfermedad
Moko de la banana.
Todas la lfneas Europeas pertenecen al grupo 26 de RFLP, pero
al aplicarse la tecnicas de AFLP y RC-PFGE se encontro cierto
polimorfismo: tres grupos mostraron evidencias de tener varias lfneas
clonales presentes en Europa. No habfa correlacion entre la
distribucion geografica o la adaptaci6n ecol6gica y los perfiles que
podrfan obtenerse (Van der Wolf et al., 1998).
PROSPECTOS: MAYORES EVALUACIONES DE PAPA Y Solanum
spp. SILVESTRE EN EL CIP
La infeccion latente no esta relacionada con los sfntomas fuera del
suelo. Casi nada se conoce acerca de la genetica de la resistencia a la
infecci6n latente, este aspecto fue descartado como objetivo en la
investigacion realizada en favor del mejoramiento. En un esfuerzo
mayor por el mejoramiento en el CIP, se pondra enfasis tanto en la
expresion de la enfermedad como en la infeccion latente en tuberculos
(utilizando el kit post-enrichment NCM-ELISA del CIP).
32
Actualmente se realizan las siguientes actividades en el CIP
relacionadas con la investigacion en resistencia a Marchitez
Bacteriana:
1.
Evaluacion de campo (campo de raza 3 infectada) de la ultima
poblacion que tiene al menos cuatro fuentes de resistencia a
Marchitez Bacteriana combinada con la inmunidad a PVY y PVX
y/o resistencia a RKN, madurez prematura y tolerancia al calor
(Figura 2).
2.
Pruebas en el invernadero con las accesiones mas resistentes de
las especies silvestres evaluadas por Sequeira en 1986. A partir de
1573 accesiones de la coleccion Internacional probadas en
Sturgeon Bay, Wisconsin, 25 accesiones mostraron menos de 10%
plantas marchitas despues de la inoculacion con Rs. La progenies
resistentes fueron de las siguientes especies: 5. demissum, S.
acaule, S. po!ytrichon, S. raphanifolium, S. commersonii y S.
boliviense. Estas accesiones seran evaluadas nuevamente en los
invernaderos del CIP. Se ran inoculadas con varias lfneas de Rs de
la razas 1 y 3, y las progenies mas resistentes seran clonadas y
evaluadas para infeccion latente en tuberculos despues de la
inoculacion del suelo.
3.
Pruebas en el invernadero (siguiendo la misma estrategia descrita
anteriormente) del germoplasma silvestre que aun no haya sido
probado, algunos de ellos colectados en la areas endemicas de
Marchitez Bacteriana de Latinoamerica: 5. a!bicans, S. bukasovii,
S. multiinterruptum, S. wittmackii.
4.
Pruebas en el invernadero de especies cultivadas de Solanum
incluyendo 5. tuberosum ssp. andigena.
5.
Evaluacion en el campo de plantas transgenicas (genes de
sarcotoxina y lisozima) en San Ramon (cam po infectado con la
raza 1).
6.
Caracterizacion de la resistencia a Marchitez Bacteriana (mas
lfneas, infeccion latente ... ) de los hfbridos somaticos de haploides
de S. tuberosum ssp. tuberosum y las especies diploides silvestres
de S. commersonii recientemente obtenidas en Wisconsin
(Laferriere et al., 1998).
33
REFERENCIAS
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36
Figura 1.
Pedigrfs de varios clones BR derivados de S. phureja con resistencia
a marchitez bacteriana (Schmiediche, 1985).
S. demissum retrocruzada con
S. tuberosum ssp. tuberosum
Atzilmba
So/anum phureja (2x)
CCC 1386 x CCC 1339
i
(1968)
1 . n - i t a- - - - - - .
Kathadin(4x) x 316.3
~ (1969)
I
r
BR 63.74
Caxamarca
(1976) Peru
Figura 2.
S. phureja
BR63.65
Molinera
(1977) Peru
I
~
A -1 (4X)
(1970)
't
BR69.84
Molinerall (1978) Peru
Domoni (1983) Fiji
BR 63.15
Br 63.76
BR 63.S
Huanuquefia
(1985) Peru
Kenya
Tanzania
Mauritius
Zaire
Nigeria
Fuentes de resistencia a la marchitez bacteriana y su utilizacion en el
programa de mejoramiento del CIP (Schmiediche, 1988).
S. chacoense
S. raphamfolium
Fuente
desconocida
AVRDC-1287.19
CRUZA 148
S. sparsipilum;
S.chacoense
Poblaci6n 2x NCSU
x
Poblaci6n MBN
Poblacion 4x con resistencia a BW & RKN
Combinacion de resistencias de al menos cuatro fuentes especificas
37
DESARROLLO DE ESTRATEGIAS DE
INGENIERIA GENETICA PARA LA
RESISTENCIA A BACTERIAS
FITOPATOGENICAS
Development of genetic engineering strategies
for resistance to phytopathogenic bacteria
Petra Porsch *
INTRODUCCION
La podredumbre blanda causada por Erwinia chrysantemi y
Erwinia carotovora es una de las enfermedades bacterianas de papa
de mayor importancia. Ya que el control qufmico no es posible, es
preferible mejorar geneticamente la resistencia de la planta. La mejora
genetica mediante el metodo clasico es diffcil de lograr ya que hay
escasez de variedades resistentes. Es por eso que la ingenierfa
genetica se ha convertido en la alternativa mas prometedora.
Nuestra investigaci6n se basa en dos ideas:
1. Transformaci6n de papa con el gen para lisozima de bacteri6fago
T4
2.
Producci6n de anticuerpos contra diferentes enzimas peptolfticas
de Erwinia - transformaci6n de papa con las construcciones de
anticuerpos mas exitosas.
* Federal Center for Breeding Research on Cultivated Plants (BAZ), Quedlinburg,
Germany
39
LISOZIMAS
Las lisozimas hidrolizan espedficamente el peptidoglicano
componente de la pared celular de las bacterias llamado murelna.
En la mayorla de las plantas, la actividad de la lisozima es
relativamente baja y esta localizada en la vacuola. Nuestro fin fue
integrar una lisozima foranea a los genes de papa donde deba ser
secretada a los espacios intercelulares, en el lugar de la infecci6n y
multiplicaci6n.
Nuestro grupo eligi6 la lisozima de bacteri6fago T4 para la
transformaci6n de papa porque ha sido reportada como la mas activa
contra bacterias gram (-) y gram ( + ).
En lugar de utilizar la lisozima natural, utilizamos el mutante
M6K que tiene un aminoacido cambiado en la posici6n 6 de metionina
a lisina. Mientras la actividad muramidasa de este mutante es la
misma que la de la enzima natural, la actividad bactericida ( que sera
explicada mas adelante) es cuatro veces la actividad normal.
En todas las construcciones, el gen para lisozima T4 esta
enlazado con un secuencia para un peptide senal (de cebada, oc amilasa) de localizaci6n extracelular. En dos de las construcciones
(pSR 8-36 y pSR 8-40) el gen de lisozima esta dirigido por el promoter
35s del CaMV para lograr su expresi6n constitutiva. En pSR 8-40 la
unidad de lisozima esta flanqueada por regiones asociadas a la matriz
que han sido reportadas como regiones que aumentan la expresi6n
del transgen y reducen la variaci6n.
Mediante la evaluaci6n densitometrica de los Western blots el
nivel de expresi6n de lisozima en plantas in vitro fue calculada entre
0.0002 y 0.0006% del total de protelna soluble.
Se prob6 la susceptibilidad ante Erwinia en ensayos con discos
de tuberculos. Algunas llneas transgenicas especialmente DL 11 y DL
13 presentaron menor laceraci6n.
40
Dos lfneas (DL 4 y DL 5) fueron finalmente cultivadas en campo
en dos localidades: en Quedlinburg en Alemania Central y en GroB
Lusewitz al norte de Alemania en los afios 1997 y 1998.
Para poder probar los 'tuberculos-semillas' ante pierna negra y
podredumbre blanda, tuvimos que infectarlos con Eca. Dos metodos
fueron utilizados: infiltraci6n al vado e infecci6n por sacabocados.
Para el ultimo metodo se hizo un agujero profundo en el tuberculo con
un sacabocado y se llen6 el agujero con una suspension de Erwinia.
Mientras que la mayorfa de los tuberculos brotaron despues de
la infiltraci6n al vado, varios tuberculos no lo hicieron despues de la
infeccion con sacabocado y se pudrieron en el suelo.
El porcentaje de tuberculos infectados con Erwinia que no
brotaron fue de 70% de la lfnea DL 4, 40-60% del Desiree no
transformado y 25-40% de la lfnea DL 5. Se supone que el pesimo
resultado con DL 4 es una consecuencia de su desarrollo tardfo,
probablemente causado por una variaci6n somaclonal en la etapa de
cultivo de tejidos.
Las plantas fueron evaluadas para sfntomas de pierna negra
una vez al mes. No se pudo encontrar diferencias entre las lfneas en
Quedinburg, pero si se detectaron marcadas diferencias en GroBLusewitz. DL 4 present6 mayor cantidad de sfntomas mientras que y
DL 5 fue se mostro coma la mejor planta.
Despues de la cosecha se evalu6 la susceptibilidad de las
tuberculos ante podredumbre blanda. Para esto se utilizaron
diferentes metodos: 1) Infecci6n de mitades de tuberculos con
suspension de Erwinia y 2) Una prueba de almacenamiento en balsas
plasticas selladas par varios meses a temperatura ambiente. En el
ensayo de las tuberculos en mitades, DL 4 y DL 5 mostraron una
maceraci6n significativamente menor que las Ifneas control
(transformadas y no transformadas ). La pudrici6n en los tuberculos
dentro de las balsas selladas no mostraron diferencias entre las lfneas.
41
En una segunda fase nuestro proyecto, el promotor constitutivo
Ubi3 fue utilizado junta con otros promotores para obtener la
expresi6n temporal o localizada de lisozima: el promotor Mas de
Agrobacterium (inducido par heridas), y el promotor Wun de papa; el
promotor GapC4 de mafz (inducido par anaerobi6sis) y el promotor
Pat de papa especffico de tuberculos.
El promotor Ubi presenta un nivel de expresion comparable al
del promotor 35s. Los ensayos de Western Blot confirmaron una
inducci6n de la lisozima luego de hacer heridas en hojas de papa que
llevaban el promotor Mas, mientras que no se pudo evidenciar
ninguna expresi6n en plantas con el promotor Wun. En un primer
intento, los Western blots de plantas transformadas con la
construccion Pat-lisozima dieron resultados negativos. Ya que la
expresi6n de estas construcciones esta prevista a suceder en las capas
mas externas del tuberculo, se debio repetir el experimento solo con
este tejido. El promotor GapC4 sera discutido par separado.
Al realizar las analisis de las plantas con expresion de la lisozima
T4 , se detect6 que estas plantas no solo presentaban resistencia ante
bacterias fitopat6genas, sino tambien ante hongos fitopat6genos. Esto
no se puede explicar ni la actividad muramidasa, ni con la actividad
quitinasa, ya que el hongo Phytophthora infestans implicado en el
proceso no contiene quitina en su estructura. Esto nos llev6 a
investigar los posibles mecanismos de accion de la lisozima. Un
analisis de computadora revel6 varias regiones amfipaticas en la parte
terminal C de la lisozima T4 en donde las aminoacidos basicos se
encuentran agrupados a un lado de la molecula y los aminoacidos
hidrof6bicos se hallan en el otro. De acuerdo con la secuencia en esta
region, se han sintetizado dos peptidos que posteriormente fueron
evaluados en sus acciones bactericida y fungicida.
Para cumplir con este objetivo, se introdujeron dos sistemas de
evaluacion. La acci6n bactericida fue medida par media de un
ensayo de conteo en placa (count plating assay). Celulas de E coli
fueron incubadas con lisozima T4 par una hara a 37°C. Las soluciones
fueron luego sembradas en placas y se contaron las colonias crecidas
para el dfa siguiente. La supervivencia de celulas se redujo en una
proporci6n muy grande luego de la incubaci6n con lisozima natural,
lisozima desnaturalizada par temperatura, lisozima mutante M6K y un
peptido (A4). El segundo peptido (A23) no tuvo efecto en la
supervivencia de las bacterias. Las medidas de la acci6n fungicida
42
fueron realizadas en el MPI en Cologne en el grupo de Werner
Gieffers. Se midi6 el largo de las tubas germinativos de las hongos
luego de un periodo de incubacion de varias horas de conidias con
lisozima T4 • En el caso de Phytophthora nicotianae/ Fusarium
oxysporum y Botiytis cinerea las tubas germinativos fueron mas
cortos.
En un ensayo de discos de hoja con Phytophthora infestans
razas 1 - 11, algunas llneas transgenicas portando lisozima T4 fueron
mas resistentes que las plantas control.
Los resultados con las peptides muestran que la actividad
antimicrobiana de T4 reside en la region amfipatica. Se supone que
helice cargada positivamente interactua con las componentes de
membrana (de carga negativa) de las bacterias u hongos y
posiblemente se inserta en la membrana llevando a la muerte celular.
Se conoce un caso similar con HEWL.
Estos resultados son la base para la construccion de nuevas
protefnas o peptides para aumentar la accion antibacteriana y la
estabilidad estructural.
ANTICUERPOS
Se hicieron anticuerpos por media de la tecnica tradicional de
hibridomas; los anticuerpos de cadena simple fueron hechos por el
metodo de muestreo de fagos (phage display). Las cadenas simples
estan constituidas par las regiones variables de las cadenas livianas y
pesadas combinadas con un peptido de union. Los anticuerpos fueron
probados contra 5 enzimas de pared celular de Erwinia: liasas pecticas
C y D, poligalacturonasa y celulasa de Ecc, y contra PME de Ech. En
los ensayos de disco de tuberculos, las celulas de Erwinia fueron
mezcladas con una cierta cantidad de anticuerpo y se determine el
grado de maceraci6n. Hemos encontrado anticuerpos contra la
poligalacturonasa y anticuerpos de cadena simple contra las Hasas
pecticas Cy D logrando asf inhibir la maceracion.
43
.
~
I
'\ 0
EXPERIMENTOS CON PAPAS
TRANSGENICAS EN INVERNADERO Y
CAMPO EN EL PERU
Experiments with transgenic potato plants at
field and greenhouses in Peru
Ali Golmirzaie *
INTRODUCCION
El CIP cuenta con tres estaciones experimentales donde
mantiene colecciones de germoplasma de papa, camote y, rafces y
tuberosas andinas (RTAs). En estas estaciones tambien se realizan
pruebas con las materiales mejorados obtenidos par metodos
convencionales y/o par biotecnologfa. Las estaciones estan ubicadas
en cada una de las regiones agroecologicas mas importantes del Peru.
La estaci6n principal esta en la costa, Lima (La Molina); la segunda
estaci6n esta en la sierra, en Huancayo, a 3,200 msnm, y la tercera en
la ceja de selva, en San Ramon, a 800 msnm.
La investigacion en el CIP esta dirigida hacia la producci6n de
papas mejoradas que contribuyan en la soluci6n de las problemas de
hambre en el mundo. Para lograr este objetivo, desde 1986, CIP esta
aplicando tecnicas de cultivo in vitro que junta con la transformacion
genetica se han convertido en herramientas primordiales en el fin de
incorparar y/o aumentar la resistencia natural a enfermedades y
plagas en las cultivas de papa y camate.
Durante el periodo 1986-1997, se han realizado cerca de 25,000
ensayos con plantas cultivadas in vitro y plantas transgenicas en
campas de cultivo a nivel mundial. El numero de cultivas probados en
cerca 45 pafses diferentes es aproximadamente 60. Del total de las
25,000 ensayos, aproximadamente el 60% (15,000) se han realizado
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
45
entre los anos 1986 y 1995, y el 40% en los dos ultimas anos. La
mayorfa de los ensayos se han llevado a cabo en los EEUU y Canada
(72%). Otros lugares en los que se han realizado ensayos son:
Europa, America Latina, Asia y Sudafrica.
Tabla 1.
Cultivos transgenicos evaluados en pruebas de campo (1986-1995).
Pais
Exp.
Pais
Exp.
Pais
Exp.
Argentina
78
Dinamarca
16
Rusi a
11
Australia
46
Francia
253
Sud Africa
22
Belgica
97
Alemania
49
Espana
30
Be lice
5
Guatemala
3
Suecia
18
Bolivia
6
Hungrfa
22
Suiza
2
Bulgaria
3
Italia
69
Tailandia
2
Canada
486
Japan
25
Pafses Bajos
113
Chile
39
Mejico
38
Reino Unido
133
China
60
Nueva Zelandia
15
Estados Unidos
1952
Costa Rica
17
Noruega
1
ZimbagOe
1
Cuba
18
Portugal
5
Total (mundial) = 3,647
Total Sudamerica 199
Fuente: James, C. & A. F. Kratigger. 1996. Global Review of the Field Testing and commercialization of Transgenic
Plants. (1986 to 1995: The First Decade of Crop Biotechnology). !SAA Briefs No. 1. NY, p. 31.
=
Los cultivos mas utilizados para llevar a cabo con plantas
transgenicas son: mafz, tomate, soya, canola, papa y algod6n. Y entre
las caracterfsticas que se desean mejorar generalmente se encuentran
la tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, calidad del producto y
resistencia a virus. En America Latina se han realizado ensayos con
plantas de papa, mafz y frijol.
46
REQUISITOS PARA El MANEJO DE PLANTAS TRANSGENICAS
EN PERU
1.
Establecimiento de las reg/as de bioseguridad: Antes de iniciar
trabajos con plantas transgenicas a nivel de invernadero y campo,
el CIP desarroll6 un Reglamento de Bioseguridad para el
manejo de material transgenico que, luego de ser revisado por el
Ministerio de Agricultura, fue aprobado por el Gobierno Peruano.
2.
Acuerdo sabre derechos de propiedad inte!ectual con los donantes
de genes.· Para poder empezar con los trabajos de transformaci6n
genetica, el CIP estableci6 acuerdos con las instituciones donantes
de genes en los que se delineaban las reglas del uso de los genes
donados y de las derechos de uso de las plantas posiblemente
mejoradas resultantes del proceso.
3.
Autorizaci6n def Ministerio de Agricu/tura de/ Gobierno Peruano:
NingCm experimento de campo puede realizarse sin la previa
autorizacic:Sn del Gobierno Peruano, otorgada a traves de su oficina ,
competente, SENASA.
Sin embargo, existen · algunas restricciones
experimentos con plantas transgenicas:
para
conducir
No debe realizarse experimentos de campo que signifiquen un riesgo
de contaminacicSn de media ambiente del lugar donde se desea
montar un estudio. En caso de que las pruebas en el invernadero
demuestren que dicho riesgo no existe, el experimento puede llevarse
a cabo bajo medidas estrictas de bioseguridad.
Por ejemplo: Plantas transformadas con protefnas de cubierta de
virus, en el CIP los experimentos con plantas transgenicas para
evaluar la resistencia al viroide PSTV, el patcSgeno que causa las
mayores perdidas en los cultivos de papa, solo se realizan a nivel de
invernadero.
47
Tabla 2.
Plantas transgenicas producidas/evaluadas en el CIP entre 1994 y 1998.
Caracteristica
Genes
Pa ea
G
Gen marcador
Resist. a insectos
x
Intr6n GUS
x
x
CryA(Ib)
Lectina de Galanthus nivalis
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Inhibidor de tripsina tipo Kunitz
de soya
x
x
x
x
x
x
Inhibidor de
trigo
alfa-amilasa
Protefna de cubierta PLRV
de
x
Protefna de cubierta PVX
x
Protefna de cubierto PVY
x
Resistencia a
viroides
PSTVd antisense
x
Resistencia a
bacterias
Atacina E
x
x
Cecropina B
x
x
Lisozima de pollo
x
Lisozima C2
x
x
Sarcotoxina IA
x
x
x
Lisozima
x
x
48
F
x
Inhibidor de tripsina de! caupf
G: Invernadero
F: Campo
G
GUS
Quitinasa de frejol
Resistencia a virus
F
Cultivo
Ca mote
T4
Para poder llevar a cabo experimentos en campo y/o invernadero se
deben tener en cuenta algunas reglas de seguridad basicas:
1. Aislamiento de las plantas con las que se realizara el trabajo.
2.
3.
4.
Realizar un manejo cuidadoso del material en evaluacion.
Remocion de yemas florales del material transformado.
Incineracion de las plantas despues de su evaluaci6n.
En el caso en que se realicen pruebas en el campo, se deben tener en
cuenta las siguientes cuidados adicionales:
1. Utilizar barreras o cercos en las bordes del campo, par ejemplo,
2.
3.
mafz.
Realizar la irrigacion par goteo.
Rotacion de cultivo.
TRABAJOS
VIRUS
REALIZADOS PARA OBTENER RESISTENCIA A
Se han realizado diferentes ensayos para evaluar la resistencia a
enfermedades causadas por virus. Todos estos ensayos se han
realizado solo en invernadero "Proyectos de Colaboracion" con
diferentes instituciones de pafses desarrollados:
(a) Virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV): Resistencia a
PLRV con el gen de la protefna de cubierta de PLRV (CP-PLRV)
proporcionado por CSIRO (Australia). Resultado: dos lfneas
transgenicas resistentes.
(b) Virus Y de papa (PVY), Virus X de papa (PVX) : Resistencia a PVY
y PVX con genes proporcionados por MONSANTO (USA). Para el
ensayo de resistencia a PVY en invernadero se utilizaron plantas
de 8 cultivares diploides y 1 tetraploide que fueron inoculados por
injerto con plantas infectadas (Solanum tuberosum vr. Rosita)
con PVY. Resultado: 5 lfneas diploides resistentes y 4 lfneas
tetraploides resistentes. Para el ensayo de resistencia a PVX en
invernadero, se utilizaron plantas de 8 cultivares diploides y 1
tetraploide que fueron inoculados mecanicamente con PVX.
Resultado: 6 lfneas diploides resistentes y 2 lfneas tetraploides
·
resistentes.
(c) Resistencia a PSTVd: Este trabajo fue realizado bajo un proyecto
en colaboraci6n con la Universidad de Lousiana (EEUU). Las
49
I
construcciones geneticas fueron preparadas por LSU y el CIP
realiz6 la transformaci6n genetica y las pruebas de resistencia a
nivel de invernadero. Durante las pruebas de resistencia a PSTV
se guardan todos los cuidados necesarios para evitar
contaminaci6n con este viroide. Resultado: 2 Ifneas tolerantes a
PSTV. Estas lfneas no pueden ser utilizadas porque se pueden
comportar como portadores sanos de este pat6geno.
TRABAJOS REALIZADOS PARA OBTENER RESISTENCIA A
BACTERIAS
Se estan realizando diferentes proyectos con el objetivo de obtener
resistencia a Pseudomonas so/anacearum y Erwinia carotovora. Se
estan utilizando genes de peptidos lfticos:
(a) Gen Lisozima T4 (origen: fago T4 ) provisto por el Inst. For
.Breeding Methods in Vegetables (BAZ-Alemania).
(b) Gen de Lisozima C2 (origen bovine) provisto por Smart Plant
Institute (USA).
( c) Gen Sarcotoxina ( origen: mosca de la came - insecto) provisto
par Weizmann Institute of Science. En los resultados del ensayo
en invernadero de pruebas de resistencia a Erwinia carotovora con
el Gen de Sarcotoxina (gen de la mosca de la came) se encontr6
que las plantas transgenicas muestran cierto nivel de resistencia a
Erwinia, aun asf se requieren mas ensayos para confirmar los
resultados mencionados.
TRABAJOS REALIZADOS PARA OBTENER RESISTENCIA A
GORGOJO DE LOS ANDES (APW)
Proyecto realizado en colaboracion con AXIS Genetics (compafifa
inglesa privada). Se realize un experimento en invernadero con la
lfnea PWG-70 conteniendo el gen inhibidor de Alpha-amilasa de trigo y
una lectina de Galanthus niva/is (gorgojo de los andes). Esta lfnea
result6 resistente al ataque del gorgojo, despues de dos meses de
inoculaci6n.
Otro experimento fue realizado en campo con plantas transgenicas de
papa, transformadas con genes inhibidores de proteasas. Esta prueba
fue en San Ramon en 1995.
50
TRABAJOS REALIZADOS PARA OBTENER RESISTENCIA A PTM
Proyecto realizado en colaboraci6n Plant Genetic System entre 1993 y
1997. Se realiz6 la evaluaci6n de este material en su nivel de
resistencia a la polilla del tuberculo de papa (Potato Tuber Moth,
PTM).
La lfnea transgenica LT-8 (Costanera) mostr6 resistencia a PTM en
una prueba de laboratorio (Bioensayo ).
En 1996, en lea, la cosecha de la lfnea transgenica resistente a PTM
comparada con cosecha de material control no diferla en sus
caracterfsticas agron6micas. Para liberar esta Ifnea transgenica co mo
variedad se estan realizando otros ensayos de campo en Tacna.
51
TRANSFORMACION DE PLANTAS DE PAPA
CON GENES DE LISOZIMA, ATACINA Y
CECROPINA PARA CONFERIR RESISTENCIA
A BACTERIAS
Potato Plants Transformation for Anti-Bacterial
Resistance with Lysozyme/ Attacin and Cecropine
Genes
Dr. Patricio Arce-Johnson*
RESUMEN
La pudrici6n blanda y el pie negro son dos importantes
enfermedades que afectan al tuberculo en almacen y a la planta de
papa cultivada en el campo respectivamente en Chile. Estas
enfermedades son producidas por bacterias del genera Erwinia spp.
siendo principalmente Erwinia carotovora subsp. atroseptica la
responsable de los mayores danos en nuestro pals. Con el objeto de
conferir resistencia a bacterias en este cultivo, transformamos plantas
transgenicas de papa de la variedad Desiree para que porten de
manera independiente los genes de lisozima de pollo ( chly), atacina
acida de Hyalophora cecropia (att), o un peptide analogo a cecropina
(sb-37). Mas de 200 lfneas transgenicas de papa resultaron del
proceso de transformaci6n vfa Agrobacterium tumefaciens.
Aquellas plantas que manifestaron variaci6n somaclonal (30%
aproximadamente, que se reflej6 en cambios en la coloraci6n o la
forma de los tuberculos o tambien en la forma de crecimiento de la
plantas), fueron descartadas. Aquellas lfneas que mantuvieron las
caracterfsticas fenotfpicas de la variedad Desiree, fueron analizadas
para verificar la presencia y expresi6n del gen de interes mediante la
evaluaci6n de su resistencia a Erwinia spp.
Aproximadamente, el 5% de las Ifneas analizadas de lisozima, el 7%
de las lfneas de atacina, y el 13% de las lfneas de cecropina mostraron
* Departamento de Genetica Molecular y Microbiologla, Fae. de Ciencias Biol6gicas,
Pontificia Universidad Cat61ica de Chile. Apartado 114-D, Santiago, Chile
53
alta resistencia al pie negro o a la pudrici6n blanda en ensayos de
invernadero y laboratorio.
PRESENTACION
En Chile se producen anualmente importantes perdidas
econ6micas en los cultivos de papa a consecuencia de las
enfermedades bacterianas causadas par Erwinia spp. Estas bacterias
infectan el tuberculo en almacen pudriendolo completa o parcialmente
causando lo que se llama "pudrici6n blanda". En el campo, las plantas
afectadas desarrollan el "pie negro", que se caracteriza par un
empardecimiento y posterior necrosis en la base del tallo. Ambas
afecciones se presentan principalmente en el sur de nuestro pals en
zonas caracterizadas por alta humedad y bajas temperaturas, siendo
Erwinia carotovora subsp. atroseptica/ la principal bacteria responsable
de dichas enfermedades.
Con el prop6sito de obtener resistencia a Erwinia spp. en papas,
aplicamos tecnicas de ingenierfa genetica a este cultivo. Mediante
transformaci6n binaria via Agrobacterium tumefaciens, produjimos
214 llneas transgenicas de papa que portan uno de los siguientes
genes: lisozima de polio ( chly) con su correspondiente peptide senal o
atacina acida de Hya/ophora cecropia (att) o un peptide analogo a
cecropina (sb-37). Todas las construcciones estan bajo el control
transcripcional del promotor 355 del virus mosaico de la coliflor, y la
secuencia terminadora del gen de la nopalina sintetasa de
Agrobacterium spp. (nosT). Ademas, portan el gen de neomicina
fosfotransferasa II (nptll) bajo el mismo promoter, que confiere a la
planta resistencia al antibi6tico kanamicina. Todas las plantas que
presentaron variaci6n somaclonal (63 llneas, equivalentes al 30% ),
que se reflej6 principalmente en deformaci6n y cambios en la
coloraci6n de los tuberculos o cambios en la apariencia de la planta o
de su habito de crecimiento, fueron descartadas. El resto de las llneas
fueron analizadas mediante las tecnicas de Southern-blot para verificar
la presencia y numero de copias del transgen, y de Northern-blot
para evaluar el nivel de expresi6n de los ARN mensajeros de las genes
bactericidas, ademas se les hizo un analisis de resistencia a bacterias
en tuberculos y plantas.
Para evaluar la resistencia a Erwinia spp. en papa se montaron dos
tipos de ensayo. El primero consisti6 en evaluar susceptibilidad a
54
desarrollar pie negro en esquejes de plantas transgenicas de papas
tratadas con Erwinia spp. en concentraciones de 5.8xl04 y 5.8x10 6
unidades formadoras de colonias par mililitro de cultivo (ufc/ml).
Con este fin, se depositaron los esquejes en vasos que
contenfan una mezcla de perlita/tierra y posteriormente se les reg6
una vez con la solucion de bacterias. Se evaluo a los 4 y 6 dfas
despues de la infeccion para determinar si hubo desarrollo de
sfntomas, de acuerdo a un fndice de dano entre 1 y 5. En este fndice,
el valor 1 correspondfa a esquejes que no presentaron sfntomas de la
enfermedad, y el valor 5 correspondla a esquejes completamente
necrosados. Valores intermedios correspondlan a daifos porcentuales
en las esquejes.
Para comparar el grado de resistencia entre las lfneas
transgenicas con el control, regado con agua, se determino un
coeficiente de resistencia. El coeficiente de resistencia resulta de la
division del lndice de resistencia promedio de las plantas controles,
entre el lndice de resistencia promedio de las plantas transgenicas.
Con este tipo de analisis en invernadero, el 16% de las plantas que
portaban el gen de la lisozima, el 35% que portaba el gen de la
atacina, y el 45% que portaba el gen de la cecropina, presentaron
algCm grado de resistencia a Erwinia spp. Sin embargo, solo unas
pocas lfneas presentaron alto nivel de resistencia a Erwinia carotovora
subsp. atroseptica.
El segundo ensayo se realiz6 para evaluar la resistencia en
tuberculos a la pudricion blanda. Para ello, utilizamos mitades de
tuberculos que fueron tratadas con una solucion de 106 ufc/ml de
Erwinia carotovora subsp. atroseptica.
Cada mitad de tuberculo fue depositada en el fondo de un vaso
plastico transparente y cubierta con tierra esteril. Con este
procedimiento fue posible ir examinado la evolucion de las sfntomas
en las tuberculos en el tiempo, sin destruir o remover el ensayo. Se
evaluo la capacidad de brote de las tuberculos tratados con bacterias
o con agua (en el caso del control) a lo largo del tiempo. De acuerdo a
este ensayo, se obtuvo un nivel de resistencia media o alto en 12 de
69 llneas transformadas analizados de lisozima. De la misma manera,
se obtuvo un grado de resistencia a la pudrici6n blanda superior al
control en 11 de 35 lfneas transformadas analizados de atacina, y en
14 de 31 lfneas transformadas analizados de cecropina.
55
En el caso de las llneas transgenicas de lisozima, cecropina y
atacina que presentaron alto nivel de resistencia a Erwinia,
encontramos generalmente una alta correlaci6n con el nivel de
expresi6n del transgen. En aquellos cases en los que esto no ocurri6,
el nivel de resistencia fue atribuido a las diferencias fisiol6gicas
propias de las plantas y tuberculos, que son dificiles de controlar
cuando se realiza el ensayo de resistencia.
A modo de resumen general, actualmente contamos con
aproximadamente 6 diferentes clones transgenicos que portan alguno
de los genes bactericidas descritos y que en ensayos de laboratorio e
invernadero presentan alta resistencia a Erwinia spp.
Recientemente, hemos producido plantas transgenicas de
papa que portan conjuntamente el gen de la lisozima de pollo y el gen
ap-24 que corresponde a una protelna relacionada con patogenesis
(PRS), del grupo de la osmotina tipo taumatina. Este gen afecta la
membrana plasmatica de la celula, par lo que esperamos un efecto
sinergico al de la lisozima en la actividad bactericida. Las Hneas
transgenicas producidas con estas construcciones dobles las
evaluaremos en laboratorio y terreno durante el ano 1999.
56
HIBRIDIZACION ENTRE Y DENTRO DE
VARIEDADES CULTIVADAS Y
SILVESTRES DE PAPA
Hibridization within and between cultivated
and wild species
Bodo Trognitz *
Las plantas transgenicas se han hecho cada vez mas disponibles
para la experimentaci6n y uso en la agricultura. Este desarrollo ha
aumentado la preocupaci6n por la protecci6n de la biodiversidad
frente a la posible infiltraci6n de genes foraneos (extranos a la papa).
Un investigador cuidadoso debe probar la hip6tesis de que un
transgen puede ser transmitido en forma creciente desde el material
modificado geneticamente hacia sus parientes silvestres y cultivados.
El mecanismo mas importante que puede llevar a este tipo de
transferencia es la recombinacion meiotica luego de una polinizacion
cruzada accidental y una fertilizaci6n exitosa subsecuente en los
parientes silvestres o cultivados que puedan hallarse creciendo al lado
del campo transgenico. Este escenario podrfa llevar a la suposicion de
que cualquier hfbrido potencialmente resultante podrfa transmitir el
transgen a poblaciones de especies relacionadas.
El objetivo del presente estudio de factibilidad de cruce entre la
papa cultivada y salvaje es resaltar los procesos que influyen en el
"outcrossing" y la formacion de organismos hfbridos, evaluar las
oportunidades que un transgen podrfa incorporarse accidentalmente
en el contenido genetico de una especie relacionada.
Las condiciones necesarias para que se lleve a cabo una
fertilizaci6n cruzada exitosa implica la ruptura de ambas barreras,
espacial y biol6gica, que normalmente previenen que este evento
suceda (Tabla 1).
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
57
Tabla 1.
Complejidad
Espacial
Barreras de la polinizaci6n cruzada, entre especies de papa
relacionadas. Las barreras estan enumeradas en orden jerarquico de
arriba a abajo. Basta que una de las cuatro barreras permanezca
intacta para prevenir la hibridaci6n.
Barreras
Distancia
Tiempo de floraci6n
Biol6gica
Componentes
Insectos polinizadores
Baja propensi6n del polen de papa a ser
transportado por el aire
Tiempo de vida largo del polen
Pre cig6tica
Fertilidad (pol en, 6vulo)
Incompatibilidad estilar
Post cig6tica
Incompatibilidad gen6mica
Incompatibilidad citoplasmatica
Ploidfa
Se ve claramente que el aislamiento espacial de las plantas
transgenicas puede ser llevado a cabo en su totalidad bajo
condiciones experimentales. Sin embargo, el aislamiento de un cultivo
transgenico en condiciones agrfcolas regulares no puede ser
garantizado bajo todas las circunstancias, ya que el aislamiento
espacial del cultivo no puede alcanzarse completamente.
Consecuentemente, el potencial de las barreras biol6gicas para
prevenir un flujo genetico accidental, debe ser discutido.
Se les llama barreras pre cig6ticas a las procesos que evitan
la fertilizaci6n. La fertilidad es un requerimiento basico para la
hibridizaci6n. Los sistemas de esterilidad citoplasmatica masculina
(Grun, 1979) pueden ser utilizados eficientemente para reducir la
fertilidad del polen de un genotipo utilizado para transformaci6n
genetica. Estos sistemas pueden causar tambien la esterilidad de una
progenie putativa en caso de que ocurra una hibridizaci6n con un
ancestro silvestre, ademas reduce la posibilidad de multiplicaci6n de
un transgen.
La incompatibilidad de estilos es un mecanismo importante que
dirige o previene la hibridizaci6n entre dos plantas fertiles de papa.
Las dos formas, la autocompatibilidad y la incongruencia unilateral ( o
incompatibilidad interespedfica), estan condicionadas en parte par el
58
mismo loci genetico (Bernacchi y Tanksley, 1997). El polen de
genotipos diploides autoincompatibles frecuentemente puede crecer
con exito dentro de los estilos de una planta autocompatible, mientras
que el cruce redproco usualmente no llega a su fin (Trognitz y
Schmiediche, 1993). Los estilos de papas tetraploides (5. tuberosum
ssp. tuberosum y ssp. andigena) frecuentemente no apoyan el
desarrollo de los tubes de polinizaci6n de sus parientes silvestres
(Tabla 2). Sin embargo, los experimentos en polinizaci6n han
demostrado que el polen de papa comun puede crecer hacia el ovario
a lo largo de los estilos de varies parientes tetraploides (Figura 1).
Para saber los grades de crecimiento de los tubes pollnicos, ver
Tabla 2. B: formaci6n de la baya; no P, no hay polen remanente en
el estigma despues de la polinizaci6n.
Las barreras postcig6ticas actuan durante y despues de la
fertilizaci6n, llevan a aberraciones del embri6n y del desarrollo de la
semilla y previenen de esta manera la formaci6n de hfbridos. Los
factores gen6micos hipoteticos que evitan el desarrollo del embri6n
debido a la malformaci6n del endospermo se conocen como los
factores del numero de balance endospermico, EBN (Johnston y
Hanneman, 1980). Los valores de EBN entre 1 y 4 han sido asignados
a varias especies de so/anum que forman tuberculos (Johnston et al.,
1980) y la hibridaci6n solo puede ser exitosa entre parejas con
numero EBN identico. En este caso, el entrecruzamiento de la papa
comun con un valor EBN de 4 se vera reducido a especies
relacionadas con el mismo valor, los que representa menos del 20%
de todas las especies conocidas.
La habilidad de apareamiento, mei6tico y mit6tico, de los
cromosomas hom61ogos tambien contribuye a la reducci6n de la
hibridaci6n exitosa. Varias combinaciones de los cinco genomas de
papa y sus parientes: A, B, C, D y E (Matsubayashi, 1991) llevaron a
distorsiones en el emparejamiento y recombinaci6n. Sin embargo,
estos problemas puede ser sobrepasados per algunas plantas con la
union de gametes no reducidos, que llevan en sf un genoma diploide
en lugar de un equivalente al genoma haploide y resultan en
embriones alopoliploides con emparejamiento normal de los
cromosomas hom61ogos.
59
Tabla 2.
Grado de crecimiento del tuba polfnico de un diploide silvestre y
polinizadores tetraploides de papa dentro de los estilos de cultivares de
papa.
Fem.
Cruz a
148
Molinera
Perricholi
Acg
abz
amb
bue
ber
7*
12
3
9
2
3
3
1
9
1
2
1
Fem.
Cruza
148
Molinera
Perricholi
oxc
10
Phu
10
pcs
10
16
2
16
3
9
3
Masculino
Chq
chm
15
cmm
3
Cnd
10
lxs
2
mcc
15
2
10
1
1
3
12
3
10
5
Masculino
uru
San
10
10
mol
6
lpt
brd
etb
3
12
13
2
2
13
13
11
9
15
pur
18
sol
16
9
9
10
9
3
12
2
9
3
Grados de crecimiento del tubo polfnico entre 1-3 son suficientes para la fertilizacion y el desarrollo de la
semilla, los valores entre 4-9 raramente resultan en fertilizacion y valore entre 9-18 previenen eficazmente el
contacto de los tubos polfnicos con el ovario, y asf excluyendo la posibilidad de polinizacion.
Para las abreviaciones de los nombres de la especies, ver Huaman y Ross (1985).
Este mismo mecanismo puede tambien llevar a la formaci6n de
embriones fertiles (euploides) en un cruce entre especies de diferente
nivel de ploidla. Por ejemplo, el cruce de una planta de papa
tetraploide con un pariente diploide resulta normalmente en hfbridos
triploides esteriles, que se hallan sexualmente aislados de sus
progenitores y de cualquiera de los parientes euploides. Sin embargo,
cuando el progenitor diploide de tal cruce forma gametes no
reducidos, diploides, un cruce de estos con una papa tetraploide, con
gametes diploides regulares, resultarfa en una progenie tetraploide
fertil.
Finalmente, las combinaciones de tipos espedficos de
citoplasma con tipos particulares de genoma, pueden resultar en una
progenie esteril o no viable (Lossl, 1996).
Los cruces interespedficos que ocurren dependen de un sistema de
circunstancias, como la presencia de genotipos y condiciones que
lleven a la hibridaci6n. Varias barreras para la hibridizaci6n se hayan
virtualmente en cualquier situaci6n y la presencia de solo una o
algunas de ellas es suficiente para hacer la hibridaci6n imposible.
Sin embargo, pueden existir situaciones aisladas en las que
te6ricamente ocurra la hibridaci6n. Asf, el riesgo de un escape
accidental de un transgen debe estar completamente eliminado bajo
condiciones de experimentaci6n apropiadas y la liberaci6n de
cultivos de papa alterados geneticamente, especialmente para la
60
producci6n, en el area de distribuci6n de parientes del cultivo debe
ser considerada cuidadosamente bajo un sistema de estudio de las
riesgos caso a caso.
REFERENCIAS
Bernacchi D, SD Tanksley 1997.
An interspecific backcross of
Lycopersicon esculentum x L. hirsutum: linkage analysis and QTL
study of sexual compatibility factors and floral traits. Genetics 147:
861-877.
Grun P 1979. Evolution of the cultivated potato: a cytoplasmic
analysis. In: The Biology and Taxonomy of the Solanaceae. Linnean
Society Symposium Series, No.7. Eds. Hawkes JG; RN Lester AE
Skelding, London, Academic Press Inc. :655-665.
Huaman Z, H Ross, 1985. Updated listing of potato species names,
abbreviations and taxonomic status. Amer Potato J 62: 629-641.
Johnston SA, RE Hanneman Jr. 1980. Support of the endosperm
balance number hypothesis utilizing some tuber-bearing Solanum
species. Amer Potato J 57(1):7-14.
Johnston SA, TPM den Nijs, SJ Peloquin, RE Hanneman Jr. 1980. The
significance of genie balance to endosperm development in
interspecific crosses. Theor Appl Gen 57: 5-9.
Lossl A 1996.
Analyse der DNA variabilitat in Zellorganellen
somatischer Fusionshybriden der Kartoffel und deren phanotypische
Auswirkungen. Ph. D. thesis, Dissertations Druck Darmstadt GmbH,
Darmstadt, Germany: 111 p.
Matsubayashi M, 1991. Phylogenetic relationships in the potato and
its related species. In: Tsuchiya T, PK Gupta (eds.), p. 93-118.
Chromosome engineering in plants: genetics, breeding, evolution.
Part B. Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam.
Trognitz BR, PE Schmiediche 1993. A new look at incompatibility
relationships in higher plants. Sex Plant Reprod 6: 183-190.
61
Figura 1.
Incompatibilidad unilateral entre especies solanaceas tetraploides,
expresada por el grado de crecimiento del tubo polfnico dentro de un
estilo.
Yalaes:
rrtrn 10-13
1-3 irtibid6n &bil o ma, r:ffibilic:Ecl c:E fertilizadOn.
a::i
10-13
9-18 irtiad6n fu:rte en la p:irte SLµrior cl2I estigra,
sin r:ffialic:Ecl c:E fertilizad6n.
tt.qO 13
Especiesde .2>'.nmErtreouzaclas:
Jxt
13
:d
h.q2 11
i:x:;i
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62
13
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cd
craie
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Jxt
jB:uia (a 4x hbicb)
JXj
{J3Uiju;µn
a1J
arrig:na
trr
lliErrELm
INVESTIGACION EN BIOSEGURIDAD EN
ALEMAN IA: PAPAS CON LISOZIMA T4 Y SUS
IMPLICACIONES EN LA COMUNIDAD
MICROBIANA COMO UN CASO DE ESTUDIO
Biosafety Researh in Germany: T,, Lysozyme Potatoes
and Their Implications on the Microbial Community
as a Case Study.
Andreas Mahn
*
INTRODUCCION
En 1990, el Ministerio Aleman para la Educacion y la
investigacion estableci6 el programa llamado "Biotecnologfa 2000",
con los siguientes objetivos:
•!• Fortalecer la investigaci6n como base para las provisiones de
•!•
salud, ambiente y energfa.
Desarrollar el potencial de la biotecnologfa para su aplicacion en la
economfa.
En las anos 1995 y 1996 se destino un fondo promedio de 150
millones de marcos alemanes anuales para la promocion de proyectos
de investigacion. Las siguientes areas de investigacion recibieron
mayor importancia:
•!•
•!•
Desarrollo de metodos para la biotecnologfa (DM 4 millones)
Metodos alternativos para experimentos con animales
(DM 7.5 millones)
•!• Bioseguridad y evaluaci6n de riesgos (DM 7.5 millones)
•!• Investigacion en biologfa celular y protefnas (DM 10 millones)
•!• Investigacion neurobiologica (DM 4 millones)
•!• Investigacion genomica (OM 35 millones)
* Federal Center for Breeding Research on Cultivated Plants (BAZ), Quedlinburg,
Germany
63
•!•
Mejoramiento de plantas y desarrollo de pesticidas biol6gicos (DM
9.5 millones)
•!• Investigaci6n molecular en sustancias naturales (DM 20 millones)
•!• Bases biol6gicas de las tecnologfas destinadas a la reducci6n de la
poluci6n ambiental (DM 5 millones)
En 1997, el programa "Biotecnologla 2000", y especialmente el
campo de la bioseguridad y la evaluaci6n del riesgo, se complement6
con el programa "BioMonitor", promocionando las siguientes aspectos
de investigaci6n:
Ecologfa y monitorizaci6n de plantas transgenicas en campo.
Entrecruzamiento de transgenes durante el cultivo de plantas
tolerantes a herbicidas
Y Influencia de las plantas resistentes a virus en la emergencia
de poblaciones de pat6genos alteradas
";;- Efectos de la expresi6n de la toxina Bt en plantas transgenicas
sabre la poblaci6n de insectos
'r Efectos de la resistencia a pat6genos geneticamente
aumentada en plantas asociadas a bacterias y hongos
>-- Efectos de las alteraciones metab61icas en las caracterfsticas
fitopatol6gicas de las plantas transgenicas
•!• Ecologfa molecular de los microbios
•!• Ingenierfa genetica y alimentos
•!• Vectores para la terapia genetica somatica
•!•
'r
PROYECTO:
"Efecto del cultivo de papas transgenicas (con lisozima T4 )
sobre Los microorganismos en el campo"
Este proyecto de investigaci6n es resultante de la colaboraci6n
entre las siguientes instituciones:
a) Federal Centre for Breeding Research on Cultivated Plants,
Quedlinberg. Colaboradores: Klaus DUring, Andreas Mahn, Ina
Hempbel.
•!• Producci6n de material vegetal y organizaci6n de ensayos de
cam po
•!• Producci6n de lisozima T4
•!• Efecto de la lisozima T4 en celulas eucari6ticas
•!• Efecto de la micorrizaci6n en rafces de papa
64
b) Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry,
Braunschweig. Colaboradores: Cornelia Samalla, Holger Heuer.
•!• Efectos en las comunidades bacterianas de la riz6sfera
(incluyendo bacterias no cultivables)
c) Universidad de Oldenburg. Colaboradores: Wilfried Wackernagel,
Johann de Vries, Klaus Harms.
•!• Liberacion de la lisozima T4 y su actividad en el suelo
•!• Liberacion del AON vegetal y su persistencia en el suelo
•!• Transferencia genetica horizontal
d) University of Restock. Colaborador: Inge Broer
•!• Efectos en Rhizobia. Nodulaci6n y fijaci6n de nitr6geno en
leguminosas
e) University of Restock. Colaboradores: Gabriele Berg, Jana
Lottmann.
•!• Efectos de las bacterias beneficiosas y sus antagonistas.
Las investigaciones de estos grupos han permitido obtener
importantes hallazgos respecto al uso potencial de la lisozima T4 coma
agente bactericida. A continuacion se resumen algunos aspectos:
•!•
Se produjeron varias lfneas transgenicas de papa del cultivar
Desiree, conteniendo tanto el gen de la lisozima T4 coma el
gen marcador NPTII de resistencia al antibi6tico kanamicina.
De la misma manera, se obtuvo plantas transgenicas del
mismo cultivar, pero conteniendo solamente el gen NPTII.
•!•
La accion bactericida de la lisozima T4 no solo es debida a la
actividad enzimatica sino tambien a la actividad sabre la
membrana celular. Para demostrarlo, se realiz6 una prueba
con protoplastos de papa utilizando SYTOX, un sistema de
tincion verde-fluorescente de acido nucleico; este colorante es
impermeable a la membrana y tine solo a las protoplastos con
la membrana danada. Despues de aplicar lisozima de huevo
de gallina y T4 , a un grupo de protoplastos, pudo apreciarse
que muchos protoplastos tuvieron la membrana danada, en
comparacion a las controles con PBS ("Phosphate Buffered
Saline") o BSA ("Bovine Serum Albumin").
•!•
En un ensayo de hemolisis, la lisozima T4 no mostr6 reacci6n.
•!•
Se redujo la micorrizacion de las rafces de las lfneas
transgenicas que expresaron lisozima T4 •
65
•!• Se tomaron muestras bacterianas de la riz6sfera de plantas
transgenicas y controles sembrados en campo. Se aisl6 una
fracci6n bacteriana y se establecieron cultivos axenicos. Para
investigar aquellas bacterias que pudieron cultivarse, se aisl6
la fracci6n total del ADN bacteriano y los fragmentos 16S del
rADN fueron amplificados por PCR. El uso de DGGE
(Denaturating Gradient Gel Electrophoresis) evidenci6 un
"fingerprint" caracterfstico; el secuenciamiento posterior de las
bandas halladas no mostr6 diferencias entre las plantas
transgenicas y los controles, pero sf una disminuci6n de los
acti nom icetos.
66
•!•
Utilizando placas con medias de cultivo, se estudi6 el efecto
de la lisozima T4 sobre diferentes bacterias pat6genas de
plantas asf como del suelo. Esto permiti6 apreciar que la
lisozima T4 tuvo mayor efecto sobre las bacterias grampositivas Bacillus subtilis y Clavibacter michiganense, y sabre
la bacteria gram-negativa Xanthomonas campestris. Ademas,
una prueba espectrofotometrica empleando B. subti!is en 0.3X
PBS y extractos de tuberculos de papa, mostr6 que dicho
extracto proveniente de papas transgenicas expresando
lisozima T 4 causaron una disminuci6n significativa de la
densidad 6ptica por minuto, respecto a los controles. Sin
embargo, la actividad de esta enzima estuvo disminuida
drasticamente en el entorno qufmico del suelo (tierra, arena,
podzol, loamy soil), permitiendo un mayor crecimiento de las
poblaciones de B. subti!is. Par otro lado, ha sido posible la
detecci6n de la lisozima T4 a traves de un Western blot
realizado con una soluci6n de crecimiento de plantas
transgenicas, demostrando que la lisozima T4 es excretada de
la planta transformada.
•!•
La expresi6n de lisozima T4 en rafces transgenicas de Vicia
hirsuta, una planta hospedera de Rhizobia, redujo el numero
de n6dulos inducidos por esta bacteria. Sin embargo, el
experimento de campo mostr6 un efecto distinto. Se
sembraron plantas de Vicia hirsuta en los alrededores de
plantas transgenicas de papa y luego fueron cosechadas las
primeras, contandose el numero de n6dulos formados asf
como la tasa de fijaci6n de nitr6geno mediante cromatograffa
de gas, no encontrandose diferencias respecto a los
experimentos con papas control.
En resumen, los datos obtenidos de los experimentos de campo
han permitido demostrar que no siempre estos resultados coinciden
con aquellos obtenidos bajo condiciones controladas de laboratorio.
67
ROL DEL SENASA EN LA SANIDAD
VEGETAL DEL PERU
SENASA: It's role on Peruvian
agriculture health
Enrique Carranza Hernandez
*
lQUE ES EL SENASA?
El Servicio Nacional de Sanidad Agraria, SENASA, es el organismo
responsable de desarrollar y promover la participacicSn de la
actividad privada y de las instituciones publicas, para la ejecucicSn de
los Planes y Programas de PrevencicSn, Control y Erradicacion de
Plagas y Enfermedades que inciden con mayor significacion
socioeconomica en la actividad agraria. A su vez es la institucion
responsable de cautelar la seguridad sanitaria del Agro Nacional.
El SENASA ha sido creado por Decreto Ley N° 25902 el 27 de
noviembre de 1992, es un organismo publico descentralizado del
Ministerio de Agricultura, con personerfa jurfdica de Derecho Publico
Interno, autonomfa tecnica, administrativa, economica y financiera; y
se rige por su Reglamento de OrganizacicSn y Funciones, aprobado por
Decreto Supremo N° 24-95-AG.
lCUAL ES LA FUNCION DEL SENASA?
La principal funcion del SENASA, es la de preservar la sanidad
en el campo agrfcola, a traves de la ejecuci6n de planes y programas
de prevenci6n, control y erradicaci6n de plagas y enfermedades que
afecten o puedan afectar el normal desarrollo de la actividad
agropecuaria en el pafs.
El SENASA promueve y desarrolla la participacion de la actividad
publica y privada en la busqueda y consolidacion de un marco de
seguridad sanitaria, que garantice, ayude al mantenimiento y logro de
ventajas competitivas del sector agrfcola y pecuario en los mercados
internaciona les.
* Programa de Marchitez Bacteriana. Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA)
Ministerio de Agricultura. Lima, Peru
69
PRINCIPALES FUNCIONES
•!• Controlar y supervisar el estado sanitario de animales, vegetales y
de productos e insumos agrarios, en el comercio nacional y en el
de importaci6n o exportaci6n que realice nuestro pafs.
•!•
Normar las aspectos sanitarios dentro de las actividades de
importaci6n, exportaci6n, comercializaci6n, transito interno de
animales y vegetales; asl coma productos e insumos agrarios.
•!•
Proponer al Ministerio de Agricultura las normas de alcance
nacional y regional en relaci6n a las actividades de vigilancia,
inspecci6n, registro, control, supervision y evaluaciones sanitarias
del agro.
•!•
Planear y organizar programas y proyectos de sanidad agraria a
desarrollarse en el pals, a traves de entes estatales o privados,
con recursos nacionales y apoyo de la Cooperaci6n Tecnica
Internacional.
•!•
Realizar analisis de riesgo e impacto sanitaries, a fin de generar la
informaci6n tecnico econ6mica necesaria para predecir la
magnitud de las efectos potenciales o reales; coma consecuencia
de la comercializaci6n de determinadas plantas, animales e
insumos agrarios.
•!• Organizar y conducir el sistema de cuarentena nacional, evitando
la introducci6n de nuevos problemas sanitarios y la dispersion de
las existentes hacia otras regiones o pafses libres de ellos.
Debido a las adelantos tecnol6gicos en el campo cientffico para
lograr desarrollar resistencia en las cultivos a plagas y enfermedades
mediante la utilizaci6n de productos transgenicos, con la intenci6n de
elevar el nivel socioecon6mico de las agricultores al obtener mejores
rendimientos en sus cosechas; y debido a las polfticas existentes de
libre comercio, el Servicio Nacional de Sanidad Agraria - SENASA,
responsable de velar par las importaciones de origen vegetal que
ingresen al palsy sabre todo de aquellas que puedan poner en riesgo
la conservaci6n y explotaci6n sostenible de la diversidad biol6gica y la
salud humana, actua en forma responsable al ser integrante del Grupo
Nacional de Trabajo en Bioseguridad, en donde actualmente se
70
elaboro un Proyecto de Ley de Seguridad de la Biotecnologfa que ya
ha sido elevado al Congreso de la Republica para su revision.
Actualmente solo se esta permitiendo la importaci6n de material
transgenico al Centro Internacional de la Papa, par ser una instituci6n
de investigaci6n seria y de prestigio internacional que acata las
disposiciones reglamentarias del pafs. Se cuenta con la RESOLUCION
MINISTERIAL N° 0682-94-AG; en esta se resuelve:
Artfculo 1°. Aprobar las Normas Internas de Biotecnologfa y
Bioseguridad del Centro Internacional de la Papa (CIP) para la
experimentacion
y
utilizacion
de
Organismos
Modificados
Geneticamente (GMO) que contiene 16 paginas y 4 formularios de
procedimientos, las mismas que coma anexo forman parte integrante
de la presente Resoluci6n.
Artfculo 2°. El Servicio Nacional de Sanidad Agraria - SENASA,
mediante la Direcci6n General de Sanidad Vegetal, sera la entidad
oficial encargada de supervisar, normar y evaluar la movilizaci6n de
material biologico nacional resultante de la experimentacion de GMO
de importaci6n, cuarentena post - entrada y autorizaciones para
estudios de campo y distribuci6n par la Red Internacional del Centro
Internacional de la Papa - CIP para las cultivos de papa, camote y,
tuberculos y rafces andinas.
Artfculo 3°. El Servicio Nacional de Sanidad Agraria, designara a
un representante especializado para integrar el Comite de
Bioseguridad, quien informara permanentemente de las avances y
alternativas alcanzados, para su utilizacion en la agricultura nacional,
asf coma recomendara las medidas requeridas para la mutua
colaboraci6n institucional.
El procedimiento para la importaci6n de este tipo de material, es el
siguiente:
1. Solicitud de los requisitos fitosanitarios para la importacion.
2. Solicitud del Formato "O", en el cual se alcanza al SENASA las datos
acerca de la ubicacion del predio de post - entrada.
3. Comunicacion a la Coordinacion a cargo del lugar especificado en el
Formato "O", para la verificacion del predio en donde se llevara a
cabo la cuarentena post - entrada.
71
4. Determinaci6n del Predio (Aprobaci6n o no aprobaci6n).
5. Emisi6n de los requisites fitosanitarios para la importaci6n.
6. Autarizaci6n par parte de SENASA de las estudias de campa y
distribuci6n de las cultivas.
7. El Camite de Biaseguridad informara peri6dicamente al SENASA
acerca de las avances y alternativas alcanzadas en la siembra de
estas cultivas.
72
COMO LIBERAR PLANTAS
TRANSGENICAS RESISTENTES A
PLAGAS EN CAMPO
How to Set Free in Held Transgenic Plants
Resistant to Pests
Jorge Benavides *
INTRODUCCION
La polilla de la papa, Phthorimaea operculella, es la plaga mas
importante de papa en zonas tropicales y subtropicales a nivel
mundial. Los intentos de control biologico clasico han tenido exitos
solo en limitadas producciones, y la resistencia genetica serfa el
principal componente en un manejo integrado de plagas. La
resistencia genetica obtenida hasta ahora par mejoramiento clasico
no ha podido proveer suficiente resistencia contra la plaga.
La produccion de lfneas transgenicas de importantes
variedades de papa con resistencia a la polilla ha sido alcanzadas
exitosamente en el laboratorio y en ensayos de invernadero, las
cuales han sido introducidas en pruebas de campo bajo condiciones
naturales.
PROYECTO COLABORATIVO
En 1992, el Centro Internacional de la Papa (CIP), y la empresa
privada belga llamada "Plant Genetic Systems" (PGS), iniciaron un
proyecto en colaboracion para desarrollar variedades transgenicas de
papa con resistencia a la polilla en el campo y en almacen. Esta
estrategia consiste en introducir el gen de Bacillus thuringiensis (Bt)
que codifica una protefna insecticida, en el genoma de la papa.
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
73
RESULTADOS
Diez importantes variedades de papa, (Tabla 1) han sido
transformadas utilizando el sistema de transformaci6n vfa
Agrobacterium tumefaciens llevando el gen Bt. Las lfneas
transgenicas han mostrado alta resistencia contra el ataque de la
larva de la polilla en hojas y tuberculos, en comparaci6n con
plantas de la misma variedad no transformadas. Mediante pruebas
moleculares y bioquimicas hemos comprobado la inserci6n y la
expresi6n del gen Bt en estas plantas transgenicas.
Un total de 81 lfneas transgenicas de las variedades
Costanera, Sangema y Cruza-148 han sido evaluadas en campo
(Tabla 2), siguiendo las medidas de bioseguridad establecidas en la
Gu fa de Bioseguridad del CIP.
De 48 lfneas transgenicas evaluadas en campo de la
variedad Costanera, 9 han sido seleccionadas par sus
caracterfsticas agron6micas y de resistencia a la plaga, las cuales
han sido evaluadas nuevamente en Tacna. Actualmente, se estan
evaluando en campo, el restante de lfneas transgenicas de las
variedades Sangema y Cruza-148.
El manejo de resistencia de la polilla a plantas transgenicas
resistentes en campo, se ha analizado en el Taller con el ejemplo
reportado para la principal plaga del algod6n en las Estados Unidos
que es la He/iotis virences. El manejo propuesto para evitar el
aumento de poblaci6n resistente en la plaga serfa de colocar un
refugio de plantas no transformadas para mantener la poblaci6n
susceptible, con la que puedan cruzarse con la poblaci6n resistente
sobreviviente en las plantas transgenicas y producir una poblacion
heterocigotico susceptible. Se ha propuesto que sembrando
plantas no transformadas (refugio) hasta 4% del total de area
sembradas con plantas transgenicas retardarfa la resistencia en par
lo menos 10 afios.
74
Tabla 1.
Relacion de plantas transgenicas de papa par variedad.
Pais
Variedad
Origen
Revoluci6n
Perricholi
Peru
CIP
Cruza-148
Mexico
Achirana lnta
Argentina
Sangema
Rwanda
Parda
Pastuza
Costanera
Marfa
Tambena
Atzimba
Peru, Bolivia
Peru, Bolivia, Guatemala,
Burundi, Etiopfa, Uganda
Burundi, Ruanda,
Uganda, Zaire
China, Nepal, Kenia,
Madagascar
Burundi, Ruanda, Zaire
LB, FT
#
Lineas
transg.
27
2
LB, BW
115
PLRV, LB, H
83
LB
46
Colombia
125
CIP
Peru
PVX, PVY,
TPS
80
CIP
Peru
LMF
90
Mexico
Desiree
Tabla 2.
Atributos
Costa Rica, Zaire
43
Egipto, Tunez,
Marruecos, Chile
60
Uneas transgenicas de papa evaluadas en campo, 1994-1998.
Variedad
Lineas
Selecci6n
Luga res
Costanera
48 (3X)
9 (3X)
Sangema
4 (3X)
10 (lX)
19 (2X)
ND
lea
Ta en a
lea
ND
Arequipa
Cruza-148
75
, C\
EXPERIMENTO EN CAMPO:
PAPAS RESISTENTES AL ATAQUE
DE BACTERIAS
Field Trial:
Potato plants resistant to bacterial attack
Luis Nopo *
OBJETIVO
Evaluar plantas transgenicas de papa bajo condiciones de campo.
EXPERIMENTOS EN LABORATORIO E INVERNADERO
En el laboratorio se realiza el proceso de transformaci6n
genetica de papa. Para llevarlo a cabo, se toman segmentos de hojas
o entrenudos de plantulas cultivadas in vitro. Estos segmentos de
tejido (llamados explantes), son puestos en contacto con una
suspension de Agrobacterium tumefaciens conteniendo un gen
foraneo y un gen marcador que seran introducidos en la planta. La
bacteria A. tumefaciens transfiere dicho gen foraneo al genoma de la
planta. Los explantes son trasladados a un media de cultivo semisolido
conteniendo la sustancia selectora (la mas empleada hasta la fecha es
el antibi6tico kanamicina), lo cual permite la regeneraci6n exclusiva de
plantas que han asimilado el gen deseado. Este proceso se puede
realizar tambien con trozos de microtuberculos.
Las plantas asf obtenidas (llneas transgenicas) son rotuladas en
laboratorio y propagadas in vitro. Un grupo de plantas de cada llnea
es sometida a la extracci6n de ADN para determinar en laboratorio si
se realize la inserci6n del gen en el genoma vegetal mediante la
realizaci6n de la prueba Southern Blot con una sonda espedfica para
el gen de importancia.
77
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
Por otro lado, en invernadero se producen tuberculos de cada
una de las lfneas transgenicas y de los respectivos controles (plantas
no transformadas). Todos estos tuberculos son infectados
experimentalmente con cepas bacterianas aisladas en laboratorio,
para evaluar el nivel de resistencia al pat6geno, Erwinia carotovora o
Ralstonia solanacearum segun se evalue el dafio.
EXPERIMENTO EN CAMPO
Aquellas Hneas que resultaron transgenicas en las pruebas
moleculares y que mostraron diferencias significativas en la infecci6n
bacteriana en laboratorio e invernadero con respecto a los controles,
son evaluadas en campo.
El experimento en campo se inicia con un diseno experimental
con base estadlstica que incluye una apropiada distribuci6n de las
plantas en el area donde se realizara la prueba (latices o bloques
completes al azar). Ademas, es necesario realizar pruebas previas al
suelo del campo con la finalidad de estimar la poblaci6n bacteriana
infectante, asl coma durante y/o despues de la cosecha para conocer
la presi6n patogenica a la que se ha expuesto el cultivo. Asl, el
material transgenico y el control suele distribuirse aleatoriamente en el
campo, empleandose par lo general tres repeticiones de siembra, lo
cual minimiza las errores en caso de tenerse una distribuci6n
heterogenea de la poblaci6n bacteriana en el suelo, o de estar
presentes otros factores que pudieran influir en el experimento. Dos
semanas antes de la siembra de papa, el campo a utilizarse es aislado
del resto mediante la siembra perimetrica de cinco filas de un cultivo
apropiado segun la region agroecol6gica de experimentaci6n: malz
(Zea mays) en zonas de clima de selva o tarwi en zona andina.
Es preferible la siembra de plantas brotadas a partir de
tuberculos de papa; se garantiza que se realice el experimento con
plantas mas vigorosas.
Luego de dos semanas de haber sido sembrado el campo, se
realiza el aporque, y de allf en adelante, se realiza la evaluaci6n
quincenal de los danos en las plantas. Como es evidente, aquellas
llneas transgenicas o controles susceptibles a la marchitez bacteriana,
78
no sobreviviran al ataque de Pseudomonas, Ralstonia o Erwinia. Como
norma de bioseguridad, cada dos dfas se realiza la eliminaci6n manual
y posterior autoclavado de todos las botones florales que pudieran
desarrollarse coma medida de protecci6n al germoplasma natural y
compatible que pudiera encontrarse cerca al area experimental, y
coma prevenci6n de bioseguridad hasta que se demuestre la ausencia
de riesgo al ecosistema.
Llegado el momenta de la cosecha, se realiza la evaluaci6n final
de la performance en campo, la cual incluye no solo al follaje sino
tambien al desarrollo y apariencia de las tuberculos. Los tuberculos
que representan el menor o ningun dano (idealmente), son separados
para estudiar su infecci6n latente en invernadero. Es decir, son
conservados en contenedores plasticos y en suelo durante 3 meses,
para determinar si las bacterias presentes en la cascara de las
tuberculos llegan a causarles dano.
Toda el material excedente de la cosecha, es autoclavado o
incinerado, dependiendo del volumen. Ademas, el campo no es
utilizado para la siembra de papa en la siguiente campafia agrfcola, o
se siembra otro cultivo. Si hubieran brotes posteriores de papa, seran
inmediatamente eliminados. Toda esto se realiza con la finalidad de
impedir el escape del material transgenico en experimentaci6n.
79
Figura 1.
Tuberculos de papa del genotipo Desiree, transformados con el gen
de lisozima c2. El control no transformado es Desiree CIP.
(Fuente: trabajo de tesis Big. Edda Echeandfa, UNALM)
Figura 2.
Cereo perimetrico de mafz identificando un experimento transgenico
con papas modificadas geneticamente. San Ramon, Enero 1998.
80
Figura 3.
Extracci6n de botones florales de las plantas transgenicas.
(Fuente: trabajo de tesis Big. Edda Echeandfa, UNALM)
Figura 4.
Papas transgenicas (WIK-AB-17 y WIK-AB-25) vs. papas control
(Desiree). San Ramon, Febrero 1998.
(Fuente: trabajo de tesis
Big. Edda Echeandfa, UNALM)
81
Figura 5.
82
Quema post-cosecha de desechos transgenicos en un campo
sembrado con papa en el anexo de La Libertad, Huancayo, a 3,800
msnm. Marzo 1998.
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EXPERIMENTO DE CAMPO:
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL
CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA
Field Experiment.·
Biosafety at the International Potato Center
Jorge Tenorio
*
Experimentaci6n en el campo
La experimentaci6n en el campo de las plantas transgenicas
tiene coma fin evaluar el comportamiento agron6mico, recuperar la
variedad original y analizar las caracterfsticas incorporadas.
Un
requisite previo para la realizacion en forma segura de estos
experimentos consiste en reunir la informacion apropiada sabre el
ambiente donde se van a realizar los experimentos de campo. Esta
selecci6n es particularmente importante cuando se requiere de
Puede incluir experimentos preliminares a pequefia
aislamiento.
escala con plantas no transformadas para verificar que el lugar reline
las condiciones necesarias para el estudio del genotipo transformado.
1. Aorobaci6n del ensayo de campo
•!•
Antes de iniciar un experimento en campo con plantas modificadas
geneticamente, debera someterse el formulario de Bioseguridad
BSC-2 (formulario para experimentos en cam po) para su
aprobacion por el Presidente del Comite de Seguridad.
•!•
La solicitud para realizar el ensayo en el campo debera enviarse a
las autoridades locales pertinentes (SENASA en el Peru). Los
ensayos con plantas transgenicas solo se iniciaran una vez que se
haya recibido la autorizaci6n escrita por parte de las autoridades.
* Centro Internacional de la Papa (CIP). Estacion Central, La Molina. Lima - Peru
83
2. Autorizacion especial para realizar experimentos fuera del
CIP
Cuando los experimentos con plantas transgenicas desarrolladas
en el CIP no se van a realizar en nuestras estaciones experimentales,
aquella instituci6n que va a llevar a cabo el experimento (una
instituci6n nacional, una extension del Ministerio de Agricultura o una
universidad) debera firmar un acuerdo con el Comite de Bioseguridad
del CIP para realizar el experimento y hacerle un seguimiento. Se
utilizara material transgenico proveniente del CIP, seg(m las normas
de Bioseguridad Nacional.
3. Documentacion en el campo
Cada clon debe se identificado con letreros especiales que indiquen
variedad/ transgen/ N° de clon y en caso de existir una nomenclatura
espedfica, tambien debe utilizarse .
Ejemplos:
Desiree/Lys/DL13
La variedad de papa (Desiree) ha sido
transformada con un gen Lisozima
(Lys) dando como resultado el clon
(DL 1 3)
Achirana INTA/Bt2/1-19
La variedad de papa (Achirana INTA)
ha sido transformada con un gen de
Bacillus thuringiensis (Bt2) dando
coma resultado el clon (1-19)
Jewel/CTI/13
La variedad de camote (Jewel) ha
sido transformada con el gen
inhibidor de tripsina del caupf (CTI)
dando como resultado el clon (13)
•!•
84
El formulario de Bioseguridad BSC-2 debe acompanar al libro del
campo y guardarse en el archive bajo la responsabilidad del
encargado de la estaci6n respectiva.
•!• Todos los campos deben identificarse con un panel pequefio que
indique el material de la planta y el nombre del investigador
principal.
4. Diseiio del campo
•!•
El investigador principal esta a cargo del disefio del campo. No
existe ningun disefio especifico del campo para las plantas
transgenicas; sin embargo, se deben tomar precauciones
espedficas durante su manipulacion.
•!•
Los ensayos de campo transgenicos y no transgenicos para el
mismo cultivo deben estar separados por una distancia minima de
20 m en todas las direcciones.
•!•
Los campos transgenicos pueden separarse con barreras ( cercos,
filas de malz, etc.) en el caso que se justifique el aislamiento
fisico. La justificacion de estas barreras debera notificarse en el
formularlo BSC-2.
5. Dispersion del polen
•!•
Las flares deben retirarse para evitar la polinizacion entre plantas
del mismo cultivo o de la parcela aledafia. Se debe impedir que el
polen llegue a las especies afines que se sepa esten presentes en
el ambiente, o a otros clones del mismo cultivo.
•!•
Si las flares son necesarias para una futura experimentacion, se
debe cubrir la inflorescencia antes de la maduracion. En estos
casos, se debe aislar la parcela para evitar las transmision de
polen hacia otras parcelas que tengan clones compatibles o
especies afines.
6. Manipulaci6n de los materiales transgenicos cosechados
•:•
Para transportar el material cosechado, debe ser empacado en
balsas de malla para prevenir perdidas accidentales en el camino
entre el campo y los de almacenamiento.
85
•!•
El almacenamiento del material transgenico cosechado no
requiere de condiciones especificas; sin embargo, debe rotularse
segun el protocolo del CIP: variedad/ transgen/ N° de don.
•!•
La evaluaci6n del material cosechado proveniente de la
experimentaci6n en el campo se debe realizar bajo un examen
selectivo y cuidadoso para detectar las fenotipos anormales,
basado en las descriptores para el cultivo respective y el analisis
de las caracterlsticas incorporadas.
7. Eliminaci6n de los restos transgenicos
•!•
Durante la cosecha, todos las restos de la planta, incluyendo el
material que podrla haber sido fertilizado accidentalmente (es
decir controles no transgenicos), deben incinerarse en las areas
designadas.
8. Monitoreo despues de la cosecha
•!•
Se debe monitorear el campo despues de la cosecha. Todas las
plantas "voluntarias" que aparezcan despues de la cosecha en las
parcelas expuestas tambien deberan esterilizarse en autoclave o
incinerarse.
•!•
Esto debe incluir una rotaci6n de cultivos sistematica en todos las
lugares donde se haya sembrado material transgenico (es decir: la
papa transgenica, el perlodo de descanso, el camote transgenico ).
9. Informe del ensayo de campo
•!•
Se debe enviar un "Informe del Ensayo" al Comite de Bioseguridad
dentro de los 30 dlas siguientes a las ensayos de campo.
Posteriormente, el Comite de Bioseguridad lo enviara a las
autoridades locales pertinentes.
•!•
El investigador principal, o en todo caso, el funcionario de
Bioseguridad asignado, debera tomar parte en cualquier pregunta
o decision relacionada al material transgenico.
86
Referencias:
1. "Biotecnologla y Bioseguridad en el CIP". Reglamento Interno.
Centro Internacional de la Papa, junio de 1993.
2.
Reglamento para la "Manipulacion de Plantas Modificadas
Geneticamente en el Centro internacional de la Papa".
Reglamento interno, 1998.
87
RECOMENDACIONES Y
CONCLUSION ES
Los participantes al taller hicieron especial enfasis en los siguientes
puntos:
•!•
Las papas transgenicas con genes de resistencia a enfermedades
bacterianas, lisozima, atacina, cecropina, sarcotoxina, no
presentan riesgos conocidos para el media ambiente donde ocurre
esta enfermedad.
•!•
Las medidas de bioseguridad establecidas antes de la realizaci6n
de este taller y discutidas en el transcurso del evento son
adecuadas para el manejo de este material en zonas agro
ecol6gicas del tipo de San Ramon (ceja de selva = "lowland
tropics") donde se presentan las enfermedades bacterianas.
•!•
La autoridad competente en la materia en el Peru es el SENASA.
Se deben fortalecer y desarrollar las herramientas internas con
apoyo cientffico y capacitacion por parte de instituciones expertas
coma el CIP.
•!•
El personal involucrado directamente con el manejo y/o monitoreo
de experimentos en campo debe tener el conocimiento suficiente
de los riesgos potenciales de los cultivos transgenicos para el
media ambiente y la salud humana.
•!•
Las medidas de bioseguridad, el equitaje, el cerco de malz, el
panel, y las permisos de ensayos en campo, son disenados para
ayuda r en la tom a de conciencia de las ca racterfsticas de este
nuevo material, por lo tanto, es importante que este disponible la
informaci6n en los lugares donde se desarrollan los ensayos de
cam po.
•!•
La dispersion del polen y por ende, del transgen no fue
considerada un riesgo dado que no ocurre en las especies
silvestres de las zonas agroecol6gicas donde existen estas
89
enfermedades bacterianas. Aun asf, serfa deseable que se llevara
a cabo un experimento de flujo de polen hacia especies silvestres
en los lugares donde las hibridizaciones interespecfficas podrfan
ocurrir con el fin de establecer las normas de bioseguridad para
estas areas.
90
LISTA DE PARTICIPANTES
Participants
Big. Jorge Alcantara
Programa Nacional de Investigacion en Recursos Geneticos y
Biotecnologfa (PRONARGEB)
Av. La Universidad s/n, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-5646
Correo electronico: [email protected]
Ing. Agr. Pedro Aley
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 2052
Correo electr6nico: [email protected]
Dr. Patricio Arce Johnson
Pontificia Universidad Catolica de Chile
Departamento de Genetica Molecular y Microbiologfa
Chile
Tel. +(56-2) 686 2897
Correo electronico: [email protected]
Big. Jorge Benavides
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 2113
Correo electronico: [email protected]
Ora. Merideth Bonierbale
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 3051
Correo electr6nico: [email protected]
91
Ing. Agr. Fausto Buitron
Agrotec
Jose Marfa Eguren 156, Magdalena, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 4616871
Sr. Lorentz Buelow
Bundesanstalt fi.ir ZOchtungsforschung an Kulturpflanzen,
BMZ (Centro Federal para la Investigaci6n del Mejoramiento
en Plantas Cultivadas)
Nuer Weg 22/23
D-06484, Quedlinburg, Alemania
Tel. +(03946) 47201
Correo electr6nico: [email protected]
Bach. Ing. Agr. Vilma Gutarra
Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA)
Av. La Universidad s/n, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 433-2851
Correo electr6nico: [email protected]
Lie. Big. Enrique Carranza
Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA)
Pasaje Francisco de Zela s/n, Jesus Marfa
Edif. Min. Agricultura, piso 10 SENASA
Tel. +(51-1) 423-4682
Correo electr6nico: [email protected]
Sr. Daniel Chirito
Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM)
Av. La Universidad s/n, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-5647
Ing. Agr. Noemi Flores
Institute Nacional de Investigaci6n Agraria (INIA)
Av. La Universidad s/n, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-5626
Correo electr6nico: [email protected]
92
Dr. Marc Ghislain
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017
Correo electronico: [email protected]
Big. Cesar Giron
Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA)
Programa Mosca de la Fruta
Av. La Universidad s/n, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-5756
Email: [email protected]
Dr. Ali Golmirzaie
Direcci6n actual:
College of Agriculture
Department of Horticulture
University of Arkansas
316 Plant Sciences Building
Fayetteville Arkansas 72701, U. S. A.
Phone: +(501) 575-8780
Email: [email protected]
Big. Ricardo Gutierrez
Instituto Nacional de Recursos Naturales (INRENA)
Calle 17 # 355, Urb. El Palomar, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 225-1112
Correo electronico: [email protected]
Big. Carmen Herrera
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017 Anexo 2124
Correo electronico: [email protected]
Sr. Andreas Mahn
Bundesanstalt fi.ir ZUchtungsforschung an Kulturpflanzen,
BMZ (Centro Federal para la Investigaci6n del Mejoramiento
en Plantas Cultivadas)
Nuer Weg 22/23,
D-06484, Quedlinburg, Alemania
Tel. +(03946) 47201
93
Big. Luis Nopo
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 2124
Correo electr6nico: [email protected]
Ing. Eduardo Perez Sandoval
Director de Investigaci6n en Recurses Naturales
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologla (CONCYTEC)
Calle del Comercio 197, San Borja , Lima, Peru
Tel. +(51-1) 225-1150
Correo electr6nico: [email protected]
Srta. Petra Porsch
Bundesanstalt fOr ZOchtungsforschung an Kulturpflanzen, BMZ
(Centro Federal para la Investigaci6n del Mejoramiento
en Plantas Cultivadas)
Nuer Weg 22/23,
D-06484, Quedlinburg, Alemania
Tel. +(03946) 47201
Correo electr6nico: [email protected]
Ora. Sylvie Priou
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017 Anexo 3049
Correo electr6nico: [email protected]
M. Sc. Big. Jorge Tenorio
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 2024
Correo electronico: [email protected]
Dr. Bodo Trognitz
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 3055
Correo electronico: [email protected]
Correo electr6nico: [email protected]
94
Unidad de Capacitaci6n, Centro Internacional de la Papa
Dr. Patricio Malagamba
Centro Internacional de la Papa (CIP)
..
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima,· P~~ru
Tel. +(51-1) ~49-6017, anexo 3099 ':'",'C:•fH·<'~
Correo electronico: p.malagamba@~gia~.org
Big. Nelson Espinoza
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 3102
Correo electr6nico: [email protected]
95
Unidad de Capacitaci6n, Centro Internacional de la Papa
Dr. Patricio Malagamba
Centro Internacional de la Papa (CIP) , .... ,,
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Pefru
Tel. +(51-1) ~49-6017, anexo 3099 ':··,,,.. ,~k''~
Correo electronico: p.malagamba@~9ia~.org
Big. Nelson Espinoza
Centro Internacional de la Papa (CIP)
Av. La Universidad 795, La Molina, Lima, Peru
Tel. +(51-1) 349-6017, anexo 3102
Correo electr6nico: [email protected]
/ }"?
95
-: las Memorias :
1al de la Papa (CIP). 2000 . Desarrollo y
.. s Transgenicas Resistentes a Enfermedades
26 de noviembre, 1998. Memorias del Taller.
. Peru .
l
Utilizaci6n de Papas Transgenicas
ermedades Bacterianas
r
. Peru .1998
ca :
Dr. Marc Ghislain
Big. Luis Nopo
Departamento de Capacitaci6n y
Comunicaciones, CIP
Dr. Patricio Malagamba
Big . Margarita Lopez
Participantes
Big . Edda Echeandfa
1an sido financiadas con las recurses de
chaft fi.ir Technische Zusammenarbeit
ERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)
Apartado 1558 - Lima, Peru
349-5783; 349-6017. Fax: (51-1) 349-5638 .
Correo-E : [email protected]
l . Lorentz Bulow
2. Fausto Buitron
3. Jorge Benavides
4. Daniel Chirito
5. Cesar Giron
6 . Ricardo Gutierrez
7. Patricio Arce-Johnson
8. Eduardo Perez
9. Jorge Tenorio
l 0. Marc Ghislain
l l . Cesar Aguilar
12. Petra Porsch
13. Nelson Espinoza
l 4. Pedro Aley
15. Jorge Alcantara
l 6. Enrique Carranza
l 7. Ali Golmirzaie
18. Sylvie Priou
19. Luis Nopo
20 . Carmen Herrera
21 . Vilma Gutarra
22. Noemi Flores
Desarrollo y Utilizaci
Transgenicas R1
a Enfermedades
Taller 24 al 26 de tt
Lima y
Centro Internacional de la Papa
Illlil
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Deutsche Gesellschaft fUr
Technische Zusammenarbeit (GTZ)