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AGROBIOTECNOLOGÍA
Curso 2016
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Ruth Heinz
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
-
Sumario
Bacterias fitopatógenas
Interacciones planta-bacteria
Inmunidad Innata - Defensas inducibles en las
plantas
Estrategias para desarrollar resistencia a
bacterias mediante ingeniería genética
- Péptidos antimicrobianos
- Lisozimas
- Tioninas
- Genes de resistencia
- Receptores PAMPs
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Inhibición de la regulación de factores de
virulencia
Referencias
Bacterias fitopatógenas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Géneros
y especies
de bacterias
fitopatógenas
Géneros
Especies
División Firmicutes
(gram positivos)
Arthrobacter
Clavibacter
ilicis
iranicus, rathayi, tritici,
michiganensis (subsp.
michiganensis, insidiosus,
nebraskensis, sepedonicus,
tessellarius)
xyli (subsp. xyli, cynodontis)
Curtobacterium
flaccumfaciens
Rhodococcus
fascians
Agrobacterium
rhizogenes, rubi, tumefaciens,
vitis
Rhizomas
suberifaciens
Acidovorax
avenae (subsp. avenae,
citrulli)
Xylophilus
ampelinus
División Gracillicutes
(gram negativos)
Clase Proteobacteria
Subclase alfa
Familia Rhizobiaceae
Familia (sin nombre)
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Subclase beta
Familia Comamonadaceae
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Géneros
y especies
de bacterias
fitopatógenas
Géneros
Especies
Erwinia
amylovora, nigrifluens, quercina,
rubrifaciens, stewartii,
tracheiphila, herbicola, ananas,
carotovora ( subsp. carotovora,
atroseptica, betavasculorum),
chrysanthemi, rhapontici
Subclase
Subclase Gamma
gamma
Familia Enterobacteriaceae
Familia Pseudomonadaceae
Pseudomonas
1) fuscovaginae, marginalis,
tolaasii
2)
amygdali
amygdali
3) syringae, viridiflava
4) chicorii
5) corrugata
Familia (sin nombre)
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Xanthomonas
albilineans , campestris,
fragariae, graminis, oryzae,
populi
Xylella
fastidiosa
Streptomyces
Spp.
Familia (sin nombre)
Géneros de afiliaciónincierta
Tomado de Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Géneros
y especies
de bacterias
fitopatógenas
Las TOP 10 bacterias
Fitopatógenas segun MPPMPP
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Esquema de
una bacteria
fitopatógena
Principales componentes de la ultraestructura
de una bacteria fitopatógena típica

Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Microscopía electrónica de Erwinia
pyrifoliae, patógeno del peral. Pueden
observarse el glicocálix y varios pili.
La mayoría de las bacterias
fitopatógenas tienen forma de
bastones cortos de 0,6-3,5 µm
de longitud y 0,5-1 µm de diámetro
500 nm
Microscopía electrónica de barrido de células
de Pseudomas syringae.
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Bacterias fitopatógenas Gram negativas y Gram positivas
Microscopía electrónica de
células de Xhantomonas
con un flagelo polar (arriba)
y de Peudomonas con
flagelos lofotricos (abajo)
Filamentos ramificados,
micelios aereos y cadenas
de esporas características
de Streptomyces spp.
Ciclo biológico
de una bacteria
fitopatógena
con fase epifita
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Las bacterias fitopatógenas utilizan a los estomas
y lenticelas como vías naturales de ingreso a la planta
Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.
Microscopía de barrido de la superficie
del envés de una hoja de cítrico.
Se observan células de Xanthomonas citri
colonizando la cavidad subestomática
Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudando
de los estomatas de hojas de cerezo infectadas
Muchas bacterias fitopatógenas se localizan en el apoplasma
La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se acumula en el espacio
extracelular o en el tejido vascular y utiliza esta vía y los tejidos conductivo
para colonizar diferentes órganos de la planta
A
B
A
B
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.
Microscopía electrónica de Xanthomonas
campestris colonizando una hoja
de Brassica. Las bacterias están
generalmente rodeadas de un polisacárido
extracelular (EPS) y proliferan en estrecho
contacto con las paredes celulares (CW)
Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)
y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci
en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.
Principales tipos de enfermedades bacterianas
y síntomas que producen en el huésped
Tipo de
enfermedad
Síntomas
Tejidos afectados
Patógenos
Manchas foliares
y en frutos
Necrosis con hidroceles
Manchas angulares o alargadas
Manchas necróticas con halo
Perdigonado de hojas
Clorosis de hojas jóvenes
Desecamiento foliar
Manchas en frutos
Exudados
Espacios intercelulares
y necrosis del
parénquima
Principales especies
fitopatógenas de
Pseudomonas y
Xanthomonas
Chancros y
marchitamieto
en plantas
leñosas
Necrosis de la corteza
Marchitamientoo desecamiento de
brotes jóvenes y corimbos florales
Necrosis de yemas
Gomosis
Invasión del floema y
xilema a través de
heridas, yemas,
cicatrices foliares, hojas
jóvenes y flores
Pseudomonas
syringae pv. syringae
Erwinia amylovora
Xanthomonas axonopodis
Marchitamientos
en plantas
herbáceas
Marchitamiento
Enanismo
Podredumbre en anillo
Manchas en ojo de pájaro
Invasión del floema y
xilema
Clavibacter y
Curtobacterium
P. solanacearum
Algunas Erwinias y
Xanthomonas
Principales tipos de enfermedades bacterianas
y síntomas que producen en el huésped
Tipo de
enfermedad
Síntomas
Tejidos afectados
Patógenos
Podredumbres
blandas
Pudrición blanda de tubérculos,
bulbos o rizomas
Pie negro
Maceración de la lámina
media y pared primaria
celular
Erwinias pectinolíticas y
algunas Pseudomonas
Hiperplasia y
proliferación
Tumores en cuello y raíz
Tumores en ramas
Hiperproliferación radicular
Estimulación anormal de la
división celular y del
crecimiento de tejidos
meristemáticos
Agrobacterium
Rhodococcus fascians
P. syringae pv. savastanoi
Roñas o
costras
Necrosis eruptivas rugosas, con
costras o pústulas y
suberificadas
Tejidos más externos
epidérmicos,
subepidérmicos y
parenquimáticos
Streptomyces
Microscopía electrónica de
barrido de la
lesión del cancro
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Infección de geranio por
Xhantomonas hortorum pv pelargonii
(clorosis y necrosis foliar)
Infecciones de caña de azúcar por
Pseudomonas rubrilineas (bandas
necróticas; arriba derecha) y de
Platycerium bifurcatum por
Pseudomonas gladioli (lesiones
Infección por
Xanthomonas
axonopodis
(cancro de
los cítricos)
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
Síntomas de cancrosis en frutos,
hojas y ramas de Citrus.
Huanglongbing
(HLB) o
“greening” de lso
cítricos
“Candidatus
Liberibacter spp.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Síntomas del “greening” en frutos,
hojas y ramas de Citrus.
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Infección de peral (arriba)
y de manzano (derecha) por
Erwinia amylovora (tizones)
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Arriba izquierda:
Infección de
tubérculos de
papa
por Streptomyces
scabies (escaras)
Abajo izquierda:
Infección de fruto
de tomate por
Clavibacter
michiganensis
(cancros)
Derecha:
Infección de
tubérculos de
papa por Erwinia
carotovora subsp.
atroséptica
(podredumbre
blanda)
Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Infección de una cucurbitácea por Erwinia tracheiphila
(invasión del xilema con goma bacteriana)
Métodos de control de bacteriosis en cultivos
• No existe control químico eficiente
• Pulverizaciones a base de cobre
Pulverización
de citrus con
un preparado a
base de sulfato
de cobre para
el control de
cancrosis
Métodos de control de bacteriosis en cultivos
• Erradicación y quema de las plantas infectadas
Quema de citrus infectados con cancrosis
Interacciones planta-bacteria
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Interacciones
planta-bacteria
Eventos de señalización
que regulan la interacción planta-bacteria
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
La enfermedad
resulta de la
interacción entre
el hospedante,
el patógeno y el
medio ambiente
• No se produce enfermedad cuando:
- La planta posee defensas preformadas o su sistema
. defensivo reconoce moléculas presentes en la
. superficie del patógeno (PAMPs; patrones moleculares
. asociados al patógeno) desencadenando una respuesta
. de protección general (resistencia de no específica).
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la .
. planta (Respuesta Hipersensible, Resistencia Sistémica
. Adquirida) y el patógeno resulta restringido en la zona inicial
. de la infección. (resistencia específica).
- Las condiciones ambientales externas cambian y el
. patógeno muere antes de llegar a una etapa en que la
. infección es irreversible.
• Se produce enfermedad cuando:
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
- Las defensas preformadas son inadecuadas
- El patógeno es capaz de neutralizar las respuestas
. defensivas de la planta y/o de retardar el inicio de las mismas
- Las condiciones externas son favorables para la infección
La especificidad
del patógeno
bacteriano y de
los genes de
resistencia de
la planta
determinan
diferentes tipos
de interacción
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
(variedades)
(variedades)
Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.
Factores que intervienen en la interacción planta-patógeno
Factores de patogenicidad: imprescindibles
para general la enfermedad; no determinan
los síntomas en forma directa (ejemplo,
proteínas hrp; proteínas vir)
Factores de
virulencia:
Factores de virulencia: responsables de la
sintomatología; modulan la gravedad de la
enfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas
degradadoras, fitohormonas)
Factores de
avirulencia:
Requeridos para el reconocimiento del
patógeno por parte de la planta
Factores secretados por bacterias fitopatógenas
FITOTOXINAS
SIDEROFOROS
EXOPOLISACARIDOS
BACTERIA
EXOENZIMAS
PROTEINAS
NUCLEADORAS
FITOHORMONAS
BACTERIOCINAS
Algunos factores bioquímicos producidos por las bacterias fitopatógenas que
tienen una función en la virulencia y en la colonización de la planta huésped
El modelo gen
por gen explica
los casos de
compatibilidad de
incompatibilidad
planta-patógeno
El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 1940)
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.
Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr
del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
Localización
de proteínas
de resistencia
y esquema
de sus
dominios
funcionales
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
BS2: gen de resistencia de pimiento que confiere resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria; Cf-2,4,5 y 9: genes de
resistencia a las razas 2, 4, 5 y 9 de Cladosporium fulvum; FLS2: gen de resistencia a bacterias de Arabidopsis thaliana; L6: gen
de resistencia a la roya del lino 6; PBS1: gen de A. thaliana que confiere resistencia a Pseudomonas syringae; Pto: gen de
resistencia a P. syringae pv. tomato; RPG1: gen de resistancia a Puccinia graminis sp. tritici 1; RPM1: gen de resistencia a P.
syringae pv. maculicola; RPP5: gen de resistencia a Peronospora parasitica; RPW8: gen de resistencia de A. thaliana que
confiere resistencia a Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersici; RRS1: gen de resistencia a Ralstonia
solanacearum 1; Xa21: gen de resistencia a X. oryzae pv. Oryzae; Va1 y Va2: genes de resistencia de tomate que confieren
resistencia a Verticillium alboatrum. ECS: señal de endocitosis; NLS: secuencia de localización nuclear; PEST: secuencia ProGlu-Ser-Thr-like; CC: dominio coiled-coil; NB: dominio de unión a nucleótidos; TIR: domino similar a Toll/receptor de
interleuquina; LRR: leucine rich repeat; WRKY: dominio de “dedos de zinc” . Dominios 1-4: sin homología conocida.
Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia:
hipótesis de la “proteína guardiana”
Interacción
R2
proteína “guardiana”
Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.
El sistema de secreción de tipo III
Secresión de proteínas mediada por el
sistema Hrp
La región de patogenicidad Hrp contiene:
- El agrupamiento conservado de genes hrp
(subconjunto hrc en púrpura)
- El gen hrpZ que codifica a la harpina HrpZ (Z
amarilla)
- Multiples genes avr (cruzado) en regiones
flanquentes variables
Nutrientes
El sistema Hrp (tipo III) secreta:
Agua
-HrpZ al medio (parte del aparato de
secresión extracelular?)
Incremento
de pH
- Proteínas Avr directamente dentro de la
célula vegetal (transferencia gatillada por
contacto con el hospedante?)
Parasitismo
Pared
celular
Factores de compatibilidad (virulencia)
- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan
con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros)
- Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran)
- Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de
los símbolos rojos/verdes)
- Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía:
.
Supresión de las defensas?
.
Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes
HR y
defensa
Factores de incompatibilidad (avirulencia)
- Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R
(símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas
defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia
- Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran)
- La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier
par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos
rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran)
- Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones
virulentas (compatibles)
Modelo de patogenia bacteriana que involucra la liberación mediada por el sistema Hrp de
factores de patogenicidad y factores de avirulencia dentro de la célula vegetal
Inmunidad Innata y Defensas inducibles
en las plantas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
La planta y su sistema defensivo
Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)
en el sistema de genes RPS2-avrRPt2/RPM1-avrRPM1
.
A
RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere
resistencia a cepas que expresa el factor de
avirulencia avrRpt2. RPM1 de A. thaliana
(Resistance to P. syringae pv maculicola 1)
confiere resistencia a cepas que que expresan
el gen de avirulencia avrRPM1.
Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.
Las respuestas
defensivas
inducibles por
patógenos
comprenden
diversos
mecanismos
moleculares
Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémicos
comprendidos en una respuesta inducible
Cl BA
Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Respuesta
defensiva
- Engrosamiento de la pared celular
- Inducción de genes involucrados en la síntesis
de metabolitos secundarios. Síntesis de fitoalexinas
- Síntesis de tioninas
- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa (PRs)
a patógenos
- Síntesis de ácido salicílico
Inducción de Resistencia
Sistémica Adquirida (SAR)
Genes involucrados en resistencia local a patógenos
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
COL1
EIN2
CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine insensitive 1; EDR1: enhanced disease resistance 1; EN2: ethyleneinsensitive 2; NRD1: non-race specific disease resistance 1; PAD4: phytoalexin-deficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: factores de
transcripción Pto-interacting 4, 5 and 6; SID2: SA induction deficient 2; SS2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR1-5.
TGAs: factores de transcripción de unión a TGACG
Genes involucrados en resistencia Sistémica
SIR
SAR
ISR
Dth9: detachment 9;
ISR1: induced systemic
resistance 1;
JAR1: JA resistance 1;
NPR1-1 inducible;
SNI1: suppressor of SAR
SON1: suppressor of nim1-1;
SAG: salicylic acid glucoside.
Independiente de SAR
Dir1?
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Estrategias para desarrollar resistencia
a bacterias mediante ingeniería genética
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias
por medio de ingeniería genética
Proteína
Origen
Especie
transgénica
Resistencia a
Nivel de
resistencia
Producción de compuestos antibacterianos no vegetales
Shiva-1
Gusano de seda
Tabaco
Ralstonia solanacearum
Parcial
MB39
Gusano de seda
Tabaco
Pseudomonas syringae pv. tabaci
Parcial
Atacina E
Gusano de seda
Manzano
Erwinia amylovora
Parcial
Lisozima
Bacteriofago T4
Papa
Erwinia carotovora
Parcial
Lisozima
Humano
Tabaco
Pseudomonas syringae pv. tabaci
Parcial
Lactoferrina
Humano
Tabaco
Ralstonia solanacearum
Parcial
Taquiplesina
Cangrejo herradura
Erwinia carotovora
Parcial
Papa
Inhibición de la patogenicidad o de factores de virulencia bacterianos
Proteína de
resistencia a
tabtoxina
Pseudomonas
syringae pv. tabaci
OCTasa
insensible a
faseolotoxina
Pseudomonas
syringae pv.
phaseolicola
Tabaco
Haba
Pseudomonas syringae
Total
Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola
Total
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias
por medio de ingeniería genética
Proteína
Origen
Especie
transgénica
Resistencia a
Nivel de
resistencia
Incremento de los sistemas de defensa naturales
Pectato liasa
Erwinia carotovora
Papa
Erwinia carotovora
Proteína Xa21
Cultivares resistentes
Arroz
Xanthomonas oryzae
Glucosa oxidasa
Aspergillus niger
Papa
Erwinia carotovora
Parcial
Tionina
Cebada
Pseudomonas syringae pv.
tabaci
Parcial
Tabaco
Pseudomonas syringae pv.
tabaci
Total
Tabaco
Parcial
Total
Muerte celular inducida artificialmente en el sitio de infección
Bacterio-opsina
Halobacterium
halobium
Interferencia con el mecanismo de quorum sensing
aiiA
Bacillus spp.
Tabaco
Erwinia carotovora
Parcial
ExpR
Erwinia carotovora
Tabaco
Erwinia carotovora
Parcial
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.
Péptidos
antimicrobianos
Estructuras de algunos péptidos antimicrobianos
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
En rojo: aminoácidos básicos (cargados positivamente)
En verde: aminoácidos hidrofobitos
La estructura
anfipática
de los péptidos
antimicrobianos
determina
su especificidad
y mecanismo de
acción
Mecanismos de acción postulados
para péptidos antimicrobianos
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
Mecanismos de acción postulados para péptidos antimicrobianos
Modelo de Shai-Matzusaki-Huang para el mecanismo de acción de péptidos líticos
A: reconocimiento de la
membrana bacteriana.
B: inserción a la
membrana mediada por
la atracción
electrostática
C: formación de poros
en la membrana.
D: transporte de
péptidos y lípidos a la
capa interna de la
membrana.
E: acción de los
péptidos sobre
“blancos” intracelulares
F: colapso de la
membrana bacteriana y
ruptura de la célula.
Llípidos en amarillo:
carga negativa. Lípidos
en negro: sin carga neta
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
Expresión en
plantas de un
péptido lítico
antimicrobiano
análogo de
magainina
Transformación de cloroplastos de tabaco
con el gen del análogo de magainina MSI-99
8.105
8.105
8.104
8.102
8.103
8.102
8.103
Transgénica
8.105
Wild type
8.105
Agrobiotecnología
Transgénica
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Wild type
Tomado de: Chakrabarti, Planta, 2003.
Bioensayos en plantas de tabaco transformadas con el gen MSI-99. Se trataron
áreas de 5-7 mm de hojas de plantas transformadas R0 y de plantas control con
un papel de lija fino y se inocularon en las mismas 10 l de 8x105, 8x104, 8x103
y 8x102 células de Pseudomonas syringae pv tabaci.
Resistencia
a bacterias
mediada por
sarcotoxina,
un péptido
aislado de
Sarcophaga
peregrina
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Expresión de sarcotoxina en plantas
transgénicas de cítricos
Tomado de: Ohshima et al. J. Biochem., 1999.
Hojas de plantas de naranja inoculadas con Xanthomonas axonopodis
pv. Citri (104 ufc/mL), bacteria causante de la cancrosis en cítricos.
Izquierda: planta control no transgénica; derecha: planta transgénica que
expresa el gen de sarcotoxina. Fotos obtenidas a los 26 d post-infección.
La lisozima es
una enzima
de reconocida
acción
bacteriolítica
Resistencia antibacteriana en plantas de papa
transformadas con el gen de lisozima del fago T4
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de : Düring et al. The Plant Journal, 1993.
Estructura del vector pSR-2 conteniendo el gen quimérico de la lisozima
del fago T4 fusionado a la secuencia codificante del péptido señal de
-amilasa de cebada. El gen es dirigido por el promotor de 35S del CaMV
Ensayos de maceración con distintas densidades de inóculo
La resistencia
fue clasificada
determinando
la superficie
macerada
sobre el total
de la superficie
de cada disco.
En a) se
muestra el
promedio de 5
experimentos;
en b) se
muestra el
promedio de 4
experimentos.
La edad de los
tubérculos fue
de 2-3 meses
Evaluación de resistencia mediante ensayos de maceración
en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4
Ensayos de maceración con Erwinia carotevora pv atroséptica a lo largo de 1-12 días.
Se presentan los resultados correspondientes a los controles, el mejor transformante
y el valor promedio de todos los transformantes
Plantas
transgénicas
de papa que
expresan el
gen de la
lisozima
Ensayos de brotación de tubérculos en plantas
de papa transformadas con lisozima del fago T4
Comparación de la brotación en plantas de papa control y transformadas con la lisozima del fago
T4 en condiciones de invernadero. Se plantaron trozos de tubérculo infectados con Erwinia
carotovora pv atroséptica. Izquierda: plantas transgénicas T424; derecha: plantas control Z2
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Düring et al. The Plant Journal, 1993.
Cuantificación de los resultados de un bioensayo de brotacion de tuberculos en invernadero
luego de la infección con Erwinia carotovora pv. atroséptica
Plantas de Solanum tuberosum transformadas
con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina
Ensayos de
infección con
Erwinia
carotovora
de plantas
transgénicas
(derecha)
y
controles
(izquierda) de
Solanum
tuberosum
que expresan
combinaciones
de uno, dos y
tres genes
antimicrobianos
controles
transgénicas
controles
transgénicas
Ensayos de maceración en tubérculos de plantas transgénicas
Ensayos de
maceración
en
tubérculos
de Solanum
tuberosum
inoculados
con Erwinia
carotovora
Las tioninas
son proteínas
ricas en
cisteína
tóxicas para
las bacterias
Desarrollo de plantas de tabaco
que expresan tioninas de trigo y de cebada
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal, 1993.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci
UP1
WT
Lesiones causadas por las bacterias 6 días después
de la inoculación en plantas transformadas con la
tionina de cebada (UP1) y no transformadas (WT)
Datos de infección. El porcentaje de infección fue
medido 90 h después de la inoculación y representa
la proporción de puntos de inoculación que formaron
lesiones necróticos.
SNN: N. tabacum Sansum NN no
transformada
SNN+CS: plantas de N. tabacum Samsun NN
transformadas con un vector vacío
UP1 hz y UP2 hz: plantas homocigotas
transformadas con la tionina de cebada
UP6 pg y UP7 pg: progenies heterocigotas
de UP1 y UP2
UP3 hz y UP4 hz: plantas homocigotas
transformadas con la tionina de trigo.
Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal. 1993.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci
(trigo)
(cebada)
El desarrollo de la infección
se midió titulando el número
de bacterias. Los títulos en las
plantas UP1 a las 34 y 48 h
fueron significativamente
diferentes de los de las
plantas UP3 y controles. Los
títulos en UP3 no son
significativamente diferentes
de los de los controles
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci
A: lesiones causadas por el patógeno en
plantas transgénicas (UP1) y control (WT)
a los 4 días de la infección
B: Datos de infección. Se midió el área
necrótica a los 4 días de la infección en el
Experimento 1 y a los 3 días de la
infección en el Experimento 2.
Modo de acción de la faseolotoxina
La OCTasa de Pseudomonas
es insensible a su propia
toxina.
Se la expresó la secuencia de
la la OCTasa en plantas para
proteger de la acción de la
faseolotoxina.
faseolotoxina
A la secuencia de la OCTasa
se le agregó una señal de
transporte al cloroplasto (en
plantas, ruta de síntesis
cloroplastídica).
Ensayos con faseolotoxina
en plantas transgénicas SSU-OCTasa
Efecto de faseolotoxina en la actividad de ornitil carbamoil transferasa
(OCTasa) de plantas transgénicas SSU-OCTasa y plantas control.
Planta
Actividad OCTasa
Sin toxina
Toxina (37 ng/ml)
Toxina (375 ng/ml)
Control
2,50 ± 0,02
0,10 ± 0,02
N.D.
SSO-T1
5,50 ± 0,10
2,10 ± 0,15
2,10 ± 0,30
SSO-T13
14,20 ± 0,26
10,70 ± 0,14
10,30 ± 0,30
SSO-T16
22,90 ± 0,66
19,90 ± 0,15
19,80 ± 0,40
Control
(cloroplastos)
6,0 ± 0,05
0,90 ± 0,03
N.D.
SSO-T3
(cloroplastos)
68,00 ± 6,10
59,80 ± 2,40
N.D.
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
La actividad de OCTasa está expresada como mmoles de citrulina formados por
min/mg de proteína, con la excepción de extractos de cloroplastos, que fueron
reportados por mg de clorofila. Las actividades mostradas representan un
promedio de tres experimentos independientes. N.D. = no determinado.
Ensayos con
faseolotoxina
con plantas
transgénicas
SSU-OCTasa
Agrobiotecnología
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
A: Clorosis típica inducida en hojas de Phaseolus tratadas con faseolotoxina.
B y D: Plantas control independientes no transformadas tratadas con faseolotoxina.
C y E: Plantas transgénicas independientes tratadas con faseolotoxina. Todos los
tratamientos en las hojas fueron con 2 l de una solucion de 3 g/ml de toxina.
Las flechas señalan los sitios de inoculación de la toxina
Ensayos con
Pseudomonas
syringae en
plantas
transgénicas
SSU-OCTasa
Efecto de la inoculación con Pseudomonas syringae pv
phaseolitica sobre las plantas transgénicas OCTasa
A
C
B
D
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
A y C: Plantas control no transformadas a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas
B y D: Plantas transgénicas SSU-OCTasa a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas
Sobre
expresión de
pétido
antimicorbiano
Snakin1 en
papa
Efecto de la sobre expresion del gen Snakin 1 en papa
sobre el desarrollo y la resistencia a Erwinia caratovora
A
B
Transgénicas
No transgénica
Plantas de papa transgénicas para SN1
fueron desafiadas con Erwinia
carotovora.
C
D
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
PLANT PHYSIOLOGY, 2013, vol 158
Plant Signaling & Behavior, 2012 vol. 7 p.
MOLECULAR PLANT PATHOLOGY, 2008, 9: 29 - 3381
-5
Localización
SN1 de papa en
Membrana
plasmática
SN1 localization determined
by confocal microscopy analysis of
SN1-Egfp fusion protein in agroinfiltrated
N. benthamiana epidermal leaf
cells.
Expression of SN1SP-Egfp (B, F,
J, and N), plasma membrane (pm-rk; C,
G, and O), or endoplasmic reticulum
(ER-rk; K) markers is shown in crosssections
of cells without (A–D) or with
(M–P) plasmolysis. Cortical views of
the coagroinfiltrated cells are shown in
E to L). Bright-field (A, E, I, and M) and
merged images of GFP and red channels
(D, H, L, and P) are given. Bars =
10 mm.
SN1 was retained in the plasma membrane and was not localized to the cell wall or apoplast
Transformación
de arroz
con el gen
de resistencia
Xa21
Plantas control
Plantas transgénicas
Resistencia a la infección
con Xanthomonas oryzae
pv. oryzae en cultivares
susceptibles
transformados con
el gen Xa21
A: cultivar Minghui 63-12
B: cultivar IR7 2-82
C: Síntomas en plantas
transgénicas (izquierda) y
control (derecha) en
ensayos de campo.
Plantas control
Plantas transgénicas
C
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
Transformación de arroz con el gen de resistencia Xa21
Segregación de la expresión de Xa21 en la generación R1 de las líneas
transgénicas IR72-82, Minghui 63-12, Minghui 63-22 y BG90-2-27
Transformación
de arroz
con el gen
de resistencia
Xa26
Resistencia a la infección de
Xanthomonas oryzae pv. oryzae en
plantas transformadas con el gen
Xa26, aislado del cultivar MH63
MH63: Minghui 63 (con moderada
resistencia)
MDJ8: Mudanjiang 8 (susceptible)
RB22: MDJ8 transformado con
Xa26
Lesiones producidas por
Xanthomonas orizae pv. orizae
sobre hojas de plantas de arroz.
IR24: planta susceptibles
Rb17-18: Líneas transgenicas que
expresan el gen Xa26.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Controles de la PCR para Xa26:
Positivos: MH63 y IRBB3, líneas
moderadamente resistentes y
resistentes, respectivamente.
Negativo: MDJ8, línea susceptible.
Tomado de: Sun et al., Plant Journal, 2004.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Crecimiento bacteriano [log (cfu/cm2)]
Transformación
de tabaco con
el gen de
resistencia
Pto de tomate
Planta transgénica
Planta control
Tomado de: Thilmony et al. The Plant Cell. 1995.
Crecimiento de Pseudomonas syringae pv tabaci en plantas de tabaco transformadas
con el gen de resistencia Pto (líneas sólidas) y en plantas control no transformadas
(líneas discontínuas). Las plantas fueron inoculadas con bacterias que expresan el gen
avr/Pto (cuadrados) o que no poseen el gen (triángulos). Los tipos de interacciones que
se indican son: [1]: incompatibilidad (presencia de gen R y gen avr; [2]: compatibilidad
(ausencia del gen R y presencia del gen avr; [3]: compatibilidad (presencia del gen R
y ausencia del gen avr); [4]: compatibilidad (ausencia del gen R y del gen avr)
Expresión de
receptores de
PAMPs
Transferencia de receptores PRR (plant patternrecognition) de Arabidopsos a Tabaco y tomate
confiere resistencia a distintas especies de
bacterias.
La expresión del receptor EFR de Arabidopsis en
Tabaco y tomate confiere resistencia en estas
especies a distintas bacterias como
Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas and
Ralstonia.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
nature biotechnology VOLUME 28 NUMBER 4 APRIL 2010
Inhibición de la regulación
de factores de virulencia
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Un gran número
de bacterias
Gram – se
comunican
sintetizando,
secretando y
respondiendo a
compuestos
difusibles
Quorum sensing
• Mecanismo de comunicación comunitario presente en
. diversas especies de bacterias. Fue detectado por
. primera vez en Vibrio fischeri
• Capacidad de los microorganismos de percibir y
. responder a la densidad poblacional a través de la
. producción de moléculas difusibles de reducido peso
. molecular
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
El incremento de una población bacteriana determina una
elevada concentración de factores difusibles
Regulación génica dependiente de la densidad poblacional
Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.
El mecanismo
de quorum
sensing es
mediado por
moléculas
difusibles
como las acilhomoserin
lactonas
Modelo simplificado de la transducción
de señales en quorum sensing
Proteína R
activada
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales
difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R (rojo),
sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa entonces
como regulador transcripcional, aumentando su afinidad por secuencias
promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .
La interferencia
de la
comunicación
entre bacterias
es una posible
estrategia
de resistencia
antimicrobiana
Posibles blancos y estrategias para interferir en la
comunicación entre bacterias (quorum quenching)
HSL
sintetasa
R
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Mecanismos que afectan la regulación
mediada por homoserin lactonas
Enzimas degradadoras de A- HSLs
Organismo
Molécula
Función
Variovax paradoxus
Actividad aminoacilasa
Degrada A-HSLs
Bacillus sp. 240B1
A-HSLs lactonasa
Gen aiiA
Degrada A-HSLs
Moléculas imitadoras de las A- HSLs
Delisea pulchra
Furanonas halogenadas
Se unen a receptores de A-HSLs
Inhiben quorum sensing
Plantas superiores
(arroz, arveja, etc)
Diferentes compuestos
Afectan sistema de quorum
sensing
Organismos A- HSLs oportunistas
Salmonella enterica
( patógeno humano)
Homólogos de proteína Lux- R
No producen A- HSLs
Reconocen las A-HSLs
producidas por otros organismos
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol., 2002.
Transformación de plantas de papa con el gen
de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.
Cortes transversales de tubérculos de papa
inoculados con Erwinia carotovora.
A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.
A la derecha: tubérculo de planta transformada con el
gen aiiA.
Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1.
Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiA
Abajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas
Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.
Las plantas que
expresan
genes de
N-acil-homoserin
lactona sintasas
exhiben mayor
resistencia
a Erwinia
carotovora
A
transgénica
B
control
Transformación
de plantas de
tabaco con el
gen de la N-acilhomoserin
lactona sintasa
de E. carotovora
(gen expI)
A: detalle de una hoja
de una planta
transgénica infectada
con Erwinia carotovora
B: hoja de una planta
control luego de la
infección
Porcentajes de
infección observados
para dos líneas
transgénicas (barras
verde y anaranjada) y
de una planta control,
no transgénica (barra
violeta).
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.
El sistema de secreción de tipo III basado en efectores tipo TAL
Efectores tipo TAL en
Xanthomonas y
su potencialidad para
Aproximaciones por
“gene targeting”
El sistema de secreción de tipo III basado en efectores tipo TAL
Aplicaciones biotecnológicas
 Generar plantas transgénicas con genes de resistencia portadores rio arriba de
cajas blanco de distintos efectores TAL para conferir resistencia a diferentes
patógenos bacterianos
 Ensamblado de unidades repetitivas para dirigirrlas a secuencias blanco para
aplicaciones “gene targeting”.
Referencias
1.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Bosh, J., Bomas, U. Xanthomonas AvrBs3 Family-Type III Effectors:
Discovery and Function. Annu. Rev. Phytopathol. 2010. 48:419–36
2. Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and García Olmedo,
F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance
to bacterial pathogens. The Plant Journal, 3:457-462, 1993.
3. De Gray, G., Rajasekaran, K., Smith, F., Sanford, J. and Daniell, H. Expression of an
antimicrobial peptide via the chloroplast genome to control phytopathogenic bacteria
and fungi. Plant Physiology, 127:852-862, 2001.
4. Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B. and Zhang, L.H. Quenching quorumsensing-dependent bacterial Infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature,
411:813-817, 2001.
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Quorum-sensing. Annals of Botany, 89:245-248, 2002.
6. Jones & Dangl. Natur3 444: 323, 2006
7. Loh, J., Pierson, E.A., Pierson, L.S., Stacey, G. and Chatterjee, A. Quorum sensing
in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant Biology, 5:1369-1375, 2002.
8. Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012
9. Mae, A., Montesano, M., Koiv, M. and Palva, E.T. Transgenic Plants producing the
bacterial pheromone N-acyl-homoserine lactone exhibit enhanced resistance to the
bacterial phytopathogen Erwinia carotovora. Molecular Plant-Microbe Interactions,
14:1035-1042, 2001.
10. Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen, M.C., Stall, R.E.
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96:14153-14158, 1999.