Download B bigemina

• “Desarrollo de Herramientas
Moleculares para el estudio de
enfermedades transmitidas por
garrapatas”
•
Marisa Farber, PhD
Inst. Biotecnologia
INTA (National Institute for Agricultural Technology)
Buenos Aires, Argentina
Tristeza bovina (Bovine Tick-Borne Diseases)
•Babesiosis: Babesia bovis, Babesia bigemina
•Anaplasmosis: Anaplasma marginale.
En Argentina:
30°S
33°S
 Boophilus microplus
Babesia enzootic area
 A. marginale enzootic area
65°W
 Ticks & TBD free area
Las pérdidas económicas directas por reducción de peso o mortalidad, y los
costos para el tratamiento y la prevención de estas enfermedades, mediante
vacunas vivas en la Argentina, se han estimado en US$ 38.9 millones al año.
• Babesiosis: Babesia bovis,
Babesia bigemina
• Anaplasmosis: Anaplasma marginale
Ciclo de vida
RELEVANCIA SOCIAL, ECONOMICA Y
PRODUCTIVA DEL PROBLEMA
•
•
Demanda de alimentos en el mundo
Devaluación del peso en el 2001, la suba del tipo de cambio real,
crecimiento de la economía
• Suba de precios internacionales
PRODUCCION DE CARNE VACUNA 2000-2006
Producción (*) Exportación (**) Expo/Prod. (%)
Año
2000
2.489
342
12,6%
2001
2.526
152
6,1%
2002
2.664
351
13,9%
2003
3.024
392
14,7%
2004
3.132
631
20,9%
2005
3.132
771
24,6%
2006
3.030
565
18,6%
(*) miles de toneladas res
Fuente: SAGyPA
(**) miles de toneladas res con hueso
Distribución de la producción ganadera en
Argentina
• Stock de 49.000.000 bovinos
• Pampa húmeda concentra el 60%
• NEA posee el 24% del stock
• NOA tiene el 8,4%
LABORATORIO DE HEMOPARASITOS
• Un poco de historia ……
• Comenzó por el Diagnóstico
• Continuó con Vacunas
• Se extendió a la Epidemiología
Aprovechamiento de la información
genómica para el desarrollo de
herramientas aplicadas al Estudio de la
Babesiosis y Anaplasmosis Bovinas
GENOMICA FUNCIONAL:
ANTIGENOS
VACUNAS
GENOMAS
EPIDEMIOLOGIA
DIAGNOSTICO
¿En qué trabajamos?
•
•
•
Producción de antígenos recombinantes para
determinaciones serológicas
Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiológicos
•
Estudios básicos
• Proteínas de exportación y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
•
•
Búsqueda de nuevos antígenos
Sistemas de expresión heteróloga
¿En qué trabajamos?
•
•
•
Producción de antígenos recombinantes para
determinaciones serológicas
Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiológicos
•
Estudios básicos
• Proteínas de exportación y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
•
•
Búsqueda de nuevos antígenos
Sistemas de expresión heteróloga
La técnica de Reverse Line Hybridization (RLB) puede ser
utilizada para la detección simultánea de diversas especies
ó cepas de parásitos en muestras de aislamientos.
La introducción de la sonda general (catch all) permite la
detección de parásitos aún no descriptos.
Se ha desarrollado este método para parásitos
transmitidos por garrapata tales como Theileria ssp.,
Babesia ssp., Ehrlichia ssp. y Anaplasma ssp.
Permite la caracterización de numerosas muestras en un
mismo ensayo partiendo de un producto de PCR.
RLB
Primers:
Anaplasma ssp.
HER-F: AGAGTTGGATCMTGGYTCAG
EHR-R: AGAAGAAGTCCCGGCAAACT
Babesia ssp.
RLB-F2: GACACAGGGAGGTAGTGACAA
RLB-R2: B-CTAAGAATTTCACCTGTGACAGT
Sondas:
A. centrale específica:
TCGAACGGACCATACGC
A. marginale especifica:
GACCGTATACGCAGCTTG
Anaplasma ssp. catch all:
GGGGGAAAGATTTATCGCTA
B. bovis específica:
CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG
B. bigemina específica:
CGTTTTTTCCCTTTTGTTGG
Babesia ssp. catch all.
CTGTCAGAGGTGAAATTCT
Reverse Line Blot Hybridization para la detección
e identificación de Babesia spp y Anaplasma spp.
Detección de polimorfismo en la sonda específica
para B. bigemina
Observations
Name
Currenly used probe
MEXICO
BgM2P
Pathogenic B. bigemina from Chavarria,
Corrientes, Argentina
BgS1A
BgS1A
BgS2P
BgS2P.clone1
Pathogenic B. bigemina
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
Sequence
C C C T
C C C T
C C C T
BgM2P
Possible options for BgM2P sequences
Attenuated B. Bigemina
C
C
C
BgS2P.clone2
BgS2P.clone3
BgS2P
Attenuated B. Bigemina from Alen-Cue,
Corrientes, Argentina
BgM1A
Pathogenic B. bigemina from Alen-Cue,
Corrientes, Argentina
BgM1P
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
C
G
T
T
T
T
T
T
C
C
C
T
C
G
T
T
T
T
T
T
C
C
C
T
C
G
T
T
T
T
T
T
C
C
C
T
B. bigemina from Brasil
Details
T
C
C
G
T
C
T
G
C
G
G
C
C
C
C
C
C
C
G
G
C
T
G
T
C
T
T
T
G
T
T
T
G
T
T
G
T
T
T
T
C
T
C
G
G
G
T
T
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
G
T
T
T
G
G
T
G
T
T
T
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
T
T
T
C
T
C
C
C
T
T
G
G
T
T
G
T
T
G
G
T
G
T
T
T
G
G
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
T
T
T
C
G
T
C
T
T
G
G
G
G
G
G
G
B. bigemina P
B. bigemina A
B. bigemina T
C
C
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
C
G
C
CLONED
Jul-04
PCR
Nov-04
PCR
Nov-04
CLONED
Jul-04
PCR
Sep-II-04
CLONED
Jul-04
CLONED
Sep-04
CLONED
Sep-04
CLONED
Sep-04
PCR
Sep-II-04
PCR
Nov-05
PCR
Nov-05
PCR
Nov-05
G
Secuencias para membrana
B. bigemina M
Reference sample
G
G
G
G
Reverse Line Blot Hybridization para la detección
e identificación de Babesia spp y Anaplasma spp.
Detección de B. bigemina por PCR:
Inmunosensor óptico basado en MSP5 para el
diagnóstico de A. marginale
Distribución de Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (F.A.U) de 12 sueros
negativos (barras negras) y 9 sueros de bovinos infectados con A. marginale.
7
Anaplasma spp uninfected cattle
Anaplasma spp infected cattle
Number of sera
6
5
4
Valor de corte: 40 F.A.U
Sensibilidad 95%
Especificidad 83%
3
2
1
>1
01
91
-1
00
81
-9
0
71
-8
0
61
-7
0
51
-6
0
41
-5
0
31
-4
0
21
-3
0
10
-2
0
0
F.A.U at 670 nm
Comportamiento del inmunosensor en muestras de campo: concordancia con el
ELISAc como gold standard
Negativos
Positivos
Positivos
25
6
Negativos
1
1
IS
Concordancia entre las dos
pruebas: 88%
¿En qué trabajamos?
•
•
•
Producción de antígenos recombinantes para
determinaciones serológicas
Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiológicos
•
Estudios básicos
• Proteínas de exportación y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
•
•
Búsqueda de nuevos antígenos
Sistemas de expresión heteróloga
Muestreo NEA y NOA
Diseño del muestreo: Establecer zonas de riesgo en función del número
de generaciones de garrapatas que nos permite definir 3 regiones de baja,
media y alta transmisibilidad respectivamente, las cuales se asocian
indirectamente las condiciones climáticas, uso de garrapaticida, etc.
Hipótesis de trabajo: Definir marcadores moleculares que permitan
asociar los indicadores de riesgo con la variabilidad genética de los
aislamientos.
Marcadores moleculares
Regiones repetidas en tandem en genes que codifican para
proteínas de superficie: A. marginale (MSP1a), B. bovis (Bv80, TRAP,
P200, Antigen 3, Desmoyokin), B bigemina (P200, PLP)
Primer For
MACF
Primer Rev
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PCR amplification of the repeat region from
different isolates of B. bigemina. 1:BgS2P,
2:BgS1A, 3:BgM1P, 4:BgM1A, 5 and 6:BgMx
(Jg29), 7:BgBr, 8:BgM2P, 9:negative control.
Marcadores moleculares
VNTR (Variable number of tandem repeats) : A. marginale (AMTR 15 y
AMTR11). En desarrollo para Babesia sp
MLST (Multilocus Sequence Typing): selección de los genes blanco
(housekeeping
genes),
determinación
de
la
especificidad,
secuenciación de los fragmentos amplificados, búsqueda de
polimorfismo de nucleótidos simples (SNPs), determinación de la tasa
de sustitución para verificar que los genes seleccionados respondan a
modelos de evolución neutra.
DataBase
• The ACCESS data base (DB) includes information about
4189 bovine samples from Northeast (1198) and
Northwest (2991) Argentina.
• DB fields correspond to information describing sampling
(date, responsible, place of work), the field (region,
province, locality, department, field coordinates), the
cattle (breed, age, tick control strategies), the sample
evaluation (ELISA, PCR, RLBH), molecular
characterization: Polymorphic genes, VNTR, MLST.
• Based on the information required, different queries were
designed. These queries enable the DB user to easily
extract information about the 4189 samples.
RLBH detection
NE A
NOA
100
T ota l
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Eo
m
bi
A
B
bo
B
%
%
B
bo
A
iA
m
Eo
Eo
m
bi
Eo
Bb
%
m
bo
B
B
B
%
%
bo
B
bi
A
Eo
o
iE
Am
%
m
Bb
%
bi
A
B
%
%
B
bo
A
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m
bi
bo
B
%
%
B
bo
N
B
eg
Eo
%
m
A
%
i%
Bb
bi
o-
B
Bb
%
%
C
A+
B
bo
to
t
%
Eo
to
t
%
A
m
bi
%
B
%
%
B
bo
to
t
to
t
0
La proporciòn de animales co-infectados con A. marginale y Babesia sp resultó
significativamente alta (P<0.001). Posteriormente se estudió la asociación entre el
status de co-infeccion y factores que pudieran influenciar el riesgo de co-infección
usando un modelo de regresion lineal multivariado. Los factores que se consideraron
fueron el lugar de origen y la edad de los bovinos.
¿En qué trabajamos?
•
•
•
Producción de antígenos recombinantes para
determinaciones serológicas
Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiológicos
•
Estudios básicos
• Proteínas de exportación y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
•
•
Búsqueda de nuevos antígenos
Sistemas de expresión heteróloga
Inmunogenicidad de proteínas de membrana o exportación
 PCR sustractiva
 Library phoA
Selección de antígenos candidatos
 Bibliografía
 Bioinformática
Caracterización bioinformática
Antigeno
Identificación
Características
TolC
Library PhoAC
OMP conservada.
Sistema secreción TipoI.
OMP85
Library PhoAC
OMP conservada.
Antígeno protectivo
OMP 4
Library PhoAC
Familia de antígenos superficie
PhoAc
Library PhoAC
L22
PCR sustractiva
OMP Cluster conservado
patógenos y simbiontes
intracelulares.
Adh
Dominios
transmembrana
Probable adhesina
AM 742
Dominios
transmembrana
Hypotetical proteína -
Verificar la transcripción
Expresión de proteínas recombinantes
Ensayos de linfoproliferación
Perfil de estimulación de citoquinas
Western blot
• Los genes que codifican proteínas
exportadas pueden identificarse mediante
fusiones traduccionales al gen de la fosfatasa
alcalina (phoA) de Escherichia coli.
• La actividad de fosfatasa alcalina se manifiesta
cuando la enzima se encuentra fuera del ámbito
citoplasmático.
• El gen reportero phoA utilizado no posee
su promotor ni la región que codifica
el péptido señal amino terminal.
• La actividad PhoA se detecta fácilmente
utilizando BCIP como sustrato.
Actividad de PhoA de acuerdo con la localización subcelular
NH2
MEDIO EXTERNO
NH2
Membrana externa
NH2
PERIPLASMA
NH2
NH2
Membrana interna
CITOPLASMA
NH2
NH2
PhoA enzimáticamente inactiva
PhoA enzimáticamente activa
Segmento hidrofóbico
de transmembrana
Búsqueda de proteínas exportables
Clonado y expresión de fusiones a
PhoA en Escherichia coli CC118
Inmunogenicidad de proteínas de membrana o exportación
Selección de antígenos candidatos
Caracterización bioinformática
Verificar la transcripción
Expresión de proteínas recombinantes
Ensayos de linfoproliferación
Perfil de estimulación de citoquinas
Western blot
Predicted
ORF
Signal
peptide
TM
Domains
TM Pred
ID
Name
Annotation
Nucleotide
Signal P
AM
1108
PhoAC
Hypothetical
protein
2076
+
AM
127
L22
Hypothetical
protein
3000
+
AM
216
Adh
Hypothetical
protein
PhoAC Orf
1
2
1
Ortologos
Conserved
domain
Pentapeptide
repeat
B-Lectin
Blast2GO
Uniprot
Pentapeptide
repeat
Pentapeptide
repeat domain
protein
Acetamidase
formamidase
family protein
-
2
Conserved
cluster within
Anaplasmas
and Ehrlichias
2529
+
1
L22
Conserved
cluster within
intracellular
pathogens and
endosymbionts
Adh
Inmunogenicidad de proteínas de membrana o exportación
Selección de antígenos candidatos
Caracterización bioinformática
Verificar la transcripción
Expresión de proteínas recombinantes
Ensayos de linfoproliferación
Perfil de estimulación de citoquinas
Western blot
Confirmó la expresión de los
genes candidatos
Inmunogenicidad de proteínas de membrana o exportación
Selección de antígenos candidatos
Caracterización bioinformática
Verificar la transcripción
Expresión de proteínas recombinantes
Ensayos de linfoproliferación
Perfil de estimulación de citoquinas
Western blot
Inmunogenicidad de proteínas de membrana o exportación
Selección de antígenos candidatos
Ensayos con animales naturalmente
infectados (Mercedes, Corrientes)
N º ID
Caracterización bioinformática
Verificar la transcripción
Infectados/ no
infectados
Msp5-PCR
Control
No
infectado
-
-
282
Infectado
Aguda
+
285
Infectado
Crónico
+
99
Infectado
Crónico
+
Expresión de proteínas recombinantes
Ensayos de linfoproliferación
Perfil de estimulación de citoquinas
Western blot
Confirmó la infección por pcr diagnostica del gen msp5
Respuesta positiva fuerte para PhoAC ORF y Adh Cterm y
mas débil para los antígenos L22 N term y Adh Nterm
Inmunogenicidad de proteínas de membrana o exportación
Selección de antígenos candidatos
Caracterización bioinformática
Verificar la transcripción
Expresión de proteínas recombinantes
msp5
PhoAC
Adh-
Adh+
Ensayos de linfoproliferación
Perfil de estimulación de citoquinas
L22 Cterm
Western blot
PhoAc 5’
PhoAC
RT qPCR Citokine expression profile
Factorof UP-regulatation
AM1108 PhoAC ORF
AM216 Adh-
5
5
4,5
4,5
4
4
3,5
3,5
3
3
2,5
2,5
2
2
1,5
1,5
1
1
0,5
0,5
0
IL2
IL10
IL12p35
TNF
INF
0
IL2
IL10
IL12p35
TNF
INF
Results were presented as ratios calculated with the Relative expression software tool (REST@)
application described by Plaffl et al. The value of PCR efficiency for all transcripts was 2, as
calculated following the formula: E = 10[-1/slope].
Regulation factor of cytokine profile
IL2
IL10
IL12p35
TNF
IFN
Enhanced expression
PhoAC
1,18
1,39
1,49
2,71
1,98
↑↑↑ TNFα, ↑IFNγ
Adh- (C-term)
1,41
2,27
1,46
1,63
2,52
↑ IL2, ↑↑IL10, ↑ IL12, ↑↑↑ TNFα,
↑↑IFNγ
Inmunogenicidad de proteínas de membrana o exportación
Selección de antígenos candidatos
Caracterización bioinformática
Verificar la transcripción
Expresión de proteínas recombinantes
Ensayos de linfoproliferación
Perfil de estimulación de citoquinas
Western blot
Identificación y caracterización de nuevos
antígenos candidatos capaces de estimular
una respuesta inmunológica específica
Blancos potenciales para ser
estudiados en nuevas
formulaciones vacunales.
Twin arginine translocation pathway: “TAT system”
Sistema de traslocación de proteínas “plegadas” a través de la
membrana interna de bacterias Gram-negativas.
Twin arginine translocation pathway: “TAT system”
•
Identificación de los componentes del sistema: tatA, B y C y su organización
en el genoma en las
•
alphaproteobacterias.
Estudio la transcripción de los genes y la regulación .
•
Funcionalidad de tatABC en sistema heterologo de mutantes de Escherichia
coli.
Identificación de los componentes del sistema: tatA, B y C y
su organización en el genoma
Anaplasma marginale
Brucella abortus
A
B
tatAB
Dispersa
Operon
tatBC
tatC-Ser
Funcionalidad de tatABC en sistema heterologo de Escherichia coli
Tat A,B y C
E coli TatA-
Promotor Tat Ecoli
AmaTatA,B,C
pUNIp
E coli TatB-
3404 bp
Anaplasma marginale
E coli TatC-
Brucella abortus
Escherichia coli (Controles)
Viabilidad en SDS 2%
A marginale
B abortus
Tat A
Funcional
?
TatB
No funcional
Funcional
TatC
No funcional
Funcional
¿En qué trabajamos?
•
•
•
Producción de antígenos recombinantes para
determinaciones serológicas
Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiológicos
•
Estudios básicos
• Proteínas de exportación y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
•
•
Búsqueda de nuevos antígenos
Sistemas de expresión heteróloga
Análisis de la región que contiene el dominio MACPF
•
Estudio in silico (colaboración Natalia Rego y Hugo Naya de la División de
Bioinformática del Instituto Pasteur de Montevideo)
Predicción de estructura de los genes con dos “gene finders” basados en HMM:
Fgenesh entrenado con P. falciparum y Glimmer HMM entrenado con el
cromosoma II y III de B. bovis.
La anotación pública de cromosomas de B. bovis y Theileria sp. permitió el estudio de la
ortología y sintenia entre estos cromosomas y los contigs de B. bigemina
Hasta el momento hemos identificado 6 genes con dominio MACPF y estamos
trabajando en la anotación y la verificación de los resultados con estudios in vitro
CDS de 1 Exón:
BbiPLP1 3721 pb; BbiPLP2 3240pb
BbiPLP1
Señal TATA
Péptido señal
BbiPLP2
Región polimórfica (PLR: perforin like
repeat)
Dominio MACPF (Smart)
BbiPLP1: 623pb y BbiPLP2: 655pb
Sitio Poly A
Verificación de la expresión de la BbiPLP1
A
RT + RT-
ADNg
B
ADNg RT+ RT-
C
RT+ RT-
ADNg
RT- PCR. A: cDNA Merozoítos BbiMx, B: cDNA Merozoítos BbiS3 y
C: cDNA Fases sexuales BbiMx
¿En qué trabajamos?
•
•
•
Producción de antígenos recombinantes para
determinaciones serológicas
Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiológicos
•
Estudios básicos
• Proteínas de exportación y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
•
•
Búsqueda de nuevos antígenos
Sistemas de expresión heteróloga
•
Identificación de potenciales nuevos antígenos de B.
bigemina a partir de un análisis proteómico
 Optimización de la purificación de proteínas totales de merozoítos del aislamiento argentino BbiS2P
-Infección experimental con BbiS2P de terneros esplenectomizados
- Purificación de merozoítos (estadío intraeritrocítico) con gradiente de Percoll
- Preparación del extracto de proteínas solubles totales
- Optimización del Isoelectroenfoque
- Optimización del SDS- PAGE
- Optimización del método de detección de las proteínas (Coomassie coloidal)
-Transferencia de los perfiles protéicos a membranas PVDF
- Inmunoscreening con sueros bovinos
A
+
B
-
+
Gel en 2D teñido. IEF: tiras de 7 cm, rango de pH 4-7 y SDSPAGE 10%. A: proteínas de merozoítos de BbiS2P. B: proteína de
eritrocitos no infectados
-
Descubrimiento de biomarcadores peptídicos para
diagnóstico: aplicación para el diagnostico de la
babesiosis bovina
-Se utillizó una pipeline bioinformatica (desarrollada por Santiago Carmona y Fernan
Agüero- IIB UNSAM) diseñada para identificar antigenos peptidicos a partir del genoma
anotado de parasitos patógenos.
-La pipeline define una función lineal que permite hacer un ranking de péptidos solapados
de 12 residuos aminoacidicos a partir de los fragmentos virtuales provenientes del
proteoma “in silico” del parasito (Babesia bovis)
-Se consideraron los siguientes atributos para obtener la puntuación de los peptidos:
Atributos Positivos
-regiones estructuradas vs. no estructuradas
-repeticiones
-sitios de glicosilación
-localización subcelular
-Medida del sesgo en el uso de codones (CAI)
Atributos Negativos
-Secuenciaas conservadas en el proteoma bovino
-Secuencias conservadas en el proteoma de
Theileria
Diseño del microarray de peptidos
•
•
•
Luego de inspeccionar manualmente los peptidos con mayor puntaje se seleccionaron 83
peptidos, entre lo que se incluyen peptidos de reactividad conocida y los nuevos candidatos.
Se imprimieron los vidrios con los 85 peptidos y otros peptidos utilizados como control (JPT
Peptide Technologies, Alemania)
Durante los proximos periodos se interrogará el array con grupos de sueros de bovinos
infectados y sueros control.
¿En qué trabajamos?
•
•
•
Producción de antígenos recombinantes para
determinaciones serológicas
Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiológicos
•
Estudios básicos
• Proteínas de exportación y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
•
•
Búsqueda de nuevos antígenos
Sistemas de expresión heteróloga
Vectores virales: Capaces de estimular las diferentes vías
del sistema inmune generando protección efectiva.


Genéticamente atenuados.
Llevar secuencias de interés en posiciones que no sean esenciales para la
replicación viral.

Fácil producción (bajo costo) y administración.

Estables, inocuos.
Poxvirus recombinantes: reúnen estas características.
“ En Poxvirus, el ADN foráneo se inserta por recombinación homóloga in vivo y
la expresión se consigue insertando el gen de interés bajo regulación de
secuencias promotoras tempranas de poxvirus.”
Vector de transferencia
pE- X - t
poxvirus
Sitio blanco de inserción
pE: promotor temprano de poxvirus
X: gen de interés.
t: terminador de transcripción y traducción
poxvirus recombinante
recombinación
homóloga in vivo
pE- X - t
Teniendo en cuenta que:
 La eficiencia de transfección es baja en cultivos primarios.
 La frecuencia de ocurrencia de doble recombinación (intercambio alélico) no se puede cuantificar.
 El virus salvaje replica normalmente.
Screening por actividad de una enzima marcadora
Actividad de la enzima B-glucuronidasa codificada por el
gen bacteriano uidA. Screening con X-Gluc (sustrato de la
enzima GUS)
Vector de transferencia
pH6- GUS- t
Poxvirus
pE/L-XX - t
Gen no esencial
recombinación homóloga in vivo
Poxvirus recombinante
pH6-GUS- t
pE/L -XX - t
1- Subclonar el gen de interés en el vector de transferencia.
2- Infección de un cultivo celular con el virus salvaje.
3- Transfección del VT con las células infectadas.
4- Selección de los poxvirus recombinantes.
5- Obtención de un stock
puro.
6- Caracterización molecular y biológica de los recombinantes
seleccionadas.
Objetivo
Diseñar, construir y caracterizar un MVA recombinante (MVAr) que exprese un
multiantígeno consistente en epitopes de tipo B y T de tres proteínas
inmunogénicas de B. bovis.
Epitopes T
Espitopes B
Producción INF - ɣ
Estadío donde esta presente
Rap-1
Sí
Sí
Sí
Merozoíto
Msa-2c
ND
Sí
ND
Esporozoíto
Hsp20
Sí
Sí
Sí
Espor/Mero
Conservación entre cepas
Sí
Sí
Sí
Localización subcelular
Roptrias
Mem. Plásm.
Citosol y MP
ND: No determinado
Construcción del
Multiantígeno
Extracción de ADNg o ARN de merozoítos y amplificación de los genes
en cuestión con primers específicos.
Clonado en vector de tipo T por separado e ingeniería genética para
subclonar y fusionar los genes.
Secuenciación para verificar correcta orientación.
1- Subclonar el gen de interés en el vector de transferencia.
2- Infección de un cultivo celular con el virus salvaje.
3- Transfección del VT con las células infectadas.
4- Selección de los poxvirus recombinantes.
5- Obtención de un stock puro.
6- Caracterización molecular y biológica de los recombinantes
seleccionados.
1) Análisis mediante PCR sobre ADN total purificado de FEP infectados o no para
determinar:
A) Presencia del gen de interés, pero stocks no
puros (no homogéneo)
M
WT
22
C
23
24
1.8
B) Pureza de stocks recombinantes
(homogéneos)
M
21 22 23
WT C
24
WT M 21
1.8
0.54
0.54
Pasaje 5°
Pasaje 9°
22
23 24