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XVIII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
X Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular
MUTACIÓN DE LOS GENES QUE REGULAN LA EXPRESIÓN DE hrpA EN Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 AUTORES Mildred Leticia, Gorgonio González; Rodolfo, Marsch Moreno.
DIRECCIÓN: Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados del IPN
Email: [email protected]
INTRODUCCIÓN
El sistema de secreción tipo III es una
maquinaria especializada que utilizan las bacterias
patógenas Gram-negativas para trasladar proteínas
efectoras dentro de su célula blanco y al ambiente
extracitoplásmico durante dicha interacción (Alfano;
Collmer, 1997). En P. s. maculicola los genes del
grupo hrp son requeridos para la expresión del
sistema de secreción Tipo III, así como para
provocar los síntomas de enfermedad en plantas
hospedadoras y la respuesta de hipersensibilidad
(HR) en plantas resistentes o no hospedadoras
(Guttman et al, 2002). Debido a que la red de
regulación transcripcional que concluye en la
expresión del sistema se secreción Tipo III y de los
otros factores de patogenicidad de P. syringae es
incompleto, es necesario el estudio del proceso de
infección para una mejor comprensión y
aprovechamiento en el desarrollo de nuevas
estrategias en el control de las enfermedades
causadas por bacterias fitopatógenas y como
herramienta biológica de secreción intracelular de
proteínas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron las cepas: Pseudomonas syringae pv.
maculicola M2, Pseudomonas syringae MUT8
(mutada en el gen hrpZ, por transposiciòn del
tranposón pTn5cat1).
Las mutantes se generaron mediante la inserción
del transposón desarmado pTn5SpGm1 conjugado
in vitro con la transposasa e introducido a MUT8
por electroporación con un aparato de Gene
PulserR II system (Bio-Rad).
La selección de mutantes se realizó sembrando en
placas de KB Sp15 y posteriormente en KB Cm50 y
KB Gm50.
DESARROLLO
El plásmido pMMIL3 se linearizó con PvuII para
liberar al pTn5SpGm1 que se conjugó con la
transposasa (Epicentre Technologies) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Con los 'transposomas'
obtenidos
se
transformaron
células
electrocompetentes de P. s. pv. maculicola MUT8.
Se seleccionaron las colonias con mayor
crecimiento en placas con medio minimo con hojas
de Arabiposis con cloranfenicol o gentamicina que
en medio rico KB con cloranfenicol o gentamicina.
Se determinaron los niveles de expresión de los
genes mutados midiendo la D.O. a 620 nm de cada
mutante en los dos medios.
Posteriormente se clonarán los genes mutados
para su secuenciación e identificación.
RESULTADOS
Se
obtuvieron
colonias
resistentes
a
espectinomicina y con cambios en la regulación de
la exresión de cat.
CONCLUSIONES
Se obtuvieron mutantes en genes que afectan la
expresión del operón hrpAZBCDE determinada
como mayor crecimiento en presencia de
cloranfenicol en medio rico que en medio mínimo
con jugo de hojas de Arabidopsis thaliana.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Alfano, James; Collmer, Alan; 1997, The type III
(Hrp) Secretion Pathway of Plant Pathogenic
Bacteria: Trafficking Harpins, Avr Proteins, and
Death. Journal of Bacteriology, No.18, Vol.179,
pag. 5655-5662.
2. Guttman, Davis S.; Vinatzer, Boris A.; 2002, A
Functional Screen for the Type III (Hrp)
Secretome
of
the
Plant
Pathogen
Pseudomonas syringae. Science, Vol. 296, pag.
1722.
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