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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE UNA FRACCIÓN DE
Caesalpinia spinosa EN UN MODELO DE CÁNCER MAMARIO MURINO
JUAN CARLOS MANCIPE VARGAS
Dra. SUSANA FIORENTINO. PhD.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLOGICAS
BOGOTA D. C.
2013
NOTA DE ADVERTENCIA
La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia.
Artículo 23 de la resolución Nº 13 de julio de 1946.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE UNA FRACCIÓN DE
Caesalpinia spinosa EN UN MODELO DE CÁNCER MAMARIO MURINO
Ingrid Schuler. PhD
Manuel Franco MD. PhD
Decana Académica
Facultad de Ciencias
Director de Posgrado
Facultad de Ciencias
TABLA DE CONTENIDO
Pág
1. INTRODUCCION
15
2. MARCO TEORICO
18
2.1. Generalidades del cáncer
2.2. Cáncer de seno
2.3. Clasificación del cáncer mamario
2.4. Modelos murinos del cáncer mamario
2.5. Modelo de cáncer mamario murino con células tumorales 4T1
2.5.1. Origen de la línea tumoral
2.5.2. Características generales del modelo
2.5.3. Tumor primario y microambiente tumoral
2.5.4. Metástasis a órganos distantes
2.5.5. Hallazgos histológicos
2.5.6. Alteraciones hematológicas: Reacción leucemoide y hematopoyesis
extramedular
2.6. Actividad antitumoral ejercida por productos naturales en el modelo 4T1
2.6.1. Caesalpinia spinosa: Descripción, composición y características de la
fracción P2Et
2.6.2. Actividades biológicas reportadas sobre Caesalpinia spinosa
2.6.3. La fracción P2Et obtenida de Caesalpinia spinosa y su relación con el
cáncer
2.7. Polifenoles con actividad antitumoral presentes en la fracción P2Et
2.7.1. Pentagaloilglucosa (PGG)
2.7.2. Metilgalato
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
3.2. Objetivos específicos
18
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31
4. MATERIALES Y MÉTODOS
32
4.1. Estandarización del modelo de cáncer mamario murino con células tumorales
4T1 en ratones BALB/c
32
4.1.1. Animales
32
4.1.2. Recepción, readaptación y distribución de grupos
32
4.1.3. Condiciones de mantenimiento de los ratones BALB/c
32
4.2. Mantenimiento de la línea tumoral 4T1 In vitro
32
4.3. Inoculación de las células tumorales en el ratón
33
4.4. Evaluación del crecimiento del tumor
33
4.5. Toma de muestras y hemogramas
33
4.6. Eutanasia
33
4.7. Remoción quirúrgica del tumor y toma de muestras para histopatología
33
4.8. Diagnóstico histopatológico y conteo de células tumorales
34
4.9. Determinación de la dosis letal 50 (DL50) de la fracción P2Et de Caesalpinia
spinosa en ratones BALB/c
34
4.10.
Evalyación de la actividad antitumoral de la fracción P2Et en hembras
BALB/c inoculadas con células tumorales 4T1
34
4.11.
Análisis estadístico
35
5. RESULTADOS
36
5.1. Estandarización del modelo de carcinoma mamario con células tumorales 4T1
en ratones BALB/c
36
5.2. Dosis Letal 50 (DL50)
39
5.3. Establecimiento del modelo de cáncer mamario murino en ratones BALB/c
hembras y tratamiento con la fracción P2Et
40
5.3.1. La fracción P2Et disminuye la evolución del tumor primario en los
grupos tratados en los dos ensayos
40
5.3.2. La fracción P2Et disminuye el peso del tumor primario
42
5.3.3. La fracción P2Et disminuye la reacción leucemoide en ratones BALB/c
con cáncer de seno mamario murino
44
5.3.4. La fracción P2Et disminuye el número de células tumorales en el tumor
primario
48
5.3.5. La fracción P2Et disminuye la metástasis a órganos parenquimatosos49
6. DISCUSIÓN
54
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
58
8. ANEXOS
8.1. Publicaciones
8.2. Menciones
63
63
63
INDICE DE TABLAS
Pág
Tabla 1. Componentes identificados en la fracción P2Et de Caesalpinia spinosa
28
INDICE DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Las células tumorales 4T1 hacen metástasis a órganos distantes desde los
días pos-inoculación
36
Figura 2. Las células tumorales 4T1 aumentan el número de megacariocitos en bazo
desde los 7 días post-inoculación
37
Figura 3. Se observa Leucocitosis superiores a 50.000 células/ul en sangre periférica,
entre el día 14 y 21 post-inoculación
38
Figura 4. El tumor primario comienza a ser palpable a partir del día 4 postinoculación y llega a los 15 mm de diámetro en el día 21 post-inoculación
38
Figura 5. 5.2. Dosis Letal 50 (DL50)
39
Figura 6. La fracción P2Et retrasa la evolución del tumor en ratones SPF
41
Figura 7. La fracción P2Et retrasa la evolución del tumor primario en ratones BALB/c
con condiciones sanitarias convencionales
42
Figura 8. La fracción P2Et disminuye el peso del tumor primario en ratones BALB/c
(SPF)
43
Figura 9. La fracción P2Et disminuye el peso del tumor primario en ratones BALB/c
(condiciones sanitarias convencionales)
44
Figura 10. La fracción P2Et disminuye la reacción leucemoide en ratones BALB/c
(SPF)
45
Figura 11. La fracción P2Et disminuye la reacción leucemoide en ratones BALB/c
(condiciones sanitarias convencionales).
46
Figura 12. La fracción P2Et disminuye el número de megacariocitos en bazo (SPF) 47
Figura 13. La fracción P2Et no afecta el número de megacariocitos en bazo
(condiciones convencionales)
47
Figura 14. La terapia con P2Et no afecta el número de células tumorales en el tumor
primario en ratones BALB/c (SPF)
48
Figura 15. La fracción P2Et disminuye el número de células tumorales en los ratones
BALB/c (condiciones sanitarias convencionales).
49
Figura 16. La fracción P2Et disminuye el número de células tumorales por órgano en
ratones BALB/c (SPF)
51
Figura 17 La fracción P2Et no disminuye el número de células tumorales por órgano
en ratones BALB/c (Condiciones sanitarias convencionales)
51
Figura 18. Diferencias histológicas entre los órganos sometidos al estudio
comparando individuo normal (sin tratamiento), control (tratado con el vehículo de la
fracción) y tratados con la fracción P2Et. Aumento 10X
52
Figura 19. Diferencias histológicas entre los órganos sometidos al estudio
comparando individuo normal(sin tratamiento), control(tratado con el vehículo de la
fracción) y tratados con la fracción P2Et. Aumento 100X
53
Lista de Símbolos
Kg
g
mg
µg
μL
ºC
%
msnm
Kilogramo
Gramos
Miligramos
Microgramos
Microlitro
Grados centígrados
Porcentaje
Metros sobre el nivel del mar
LISTA DE ABREVIATURAS
DAPI:
4-6-diamino-2-phenylindole
DL50:
Dosis letal 50
G-CSF:
Factor estimulador de colonias granulocíticas
GM-CSF:
Factor estimulador de colonias granulocíticas y monocíticas
HER-2:
Receptor 2 del factor del crecimiento epidermal
H&E:
Hematoxilina & Eosina
IC50:
Concentración Inhibitoria 50
IFN-γ:
Interferón gamma
I.P:
Intraperitoneal
LT:
Linfocito T
LTC:
Linfocito T citotóxico
MT:
Microambiente tumoral
MMP:
Metaloproteinasa de matriz
PN:
Productos naturales
PGG:
Pentagaloilglucosa
VEGF:
Factor de crecimiento endotelial vascular
4T1:
Línea celular de adenocarcinoma mamario murino
RESUMEN
El cáncer de seno representa una de las causas de mortalidad más altas en mujeres en
nuestro país, y dentro de estas muertes el cáncer metastásico (estadio IV) está
cobrando importancia. Utilizando un modelo singénico de cáncer mamario murino en
ratones BALB/c con la línea tumoral 4T1, en el presente trabajo evaluamos la
actividad antitumoral de una fracción de la planta Caesalpinia spinosa, llamada P2Et
previamente obtenida y evaluada in vitro por el grupo de Inmunología y Biología
Celular de la Pontificia Universidad Javeriana, la cual es rica en galotaninos, que en
estudios previos se ha demostrado su efecto antitumoral por diferentes vías, entre las
cuáles se encuentran detención del ciclo celular, despolarización de la membrana
mitocondrial y la activación de la apoptosis por la vía de las caspasas. En este trabajo
primero estandarizamos el modelo en las condiciones de nuestro laboratorio en
donde evaluamos, crecimiento y peso del tumor primario, presentación de reacción
leucemoide mediante hemogramas y cuantificación de metástasis a órganos distantes
mediante microscopia óptica en cortes histológicos; luego evaluamos la toxicidad
aguda y la actividad de la fracción P2Et en el modelo previamente estandarizado. El
experimento se realizó por duplicado con dos grupos de ratones de diferente
proveniencia, SPF (specific patogens free) y condiciones sanitarias convencionales. La
fracción disminuyó el crecimiento y el peso del tumor primario, así como también la
reacción leucemoide inducida por factores de crecimiento producidos de manera
constitutiva por el tumor, además disminuyo el número de células metastásicas a
órganos parenquimatosos como pulmón, hígado, bazo y en tumor primario.
Este trabajo nos ha permitido mostrar in vivo, que la fracción P2Et rica en galotaninos,
presenta actividad antitumoral y sienta bases para futuros estudios inmunológicos
sobre la metástasis tumoral y los efectos de la fracción como una futura terapia
alternativa para el tratamiento y control de la metástasis.
ABSTRACT
Breast cancer is one of the highest causes of death in women in our country, and
within these deaths metastatic (stage IV) is gaining importance. Using a syngeneic
murine mammary cancer model in BALB c mice with 4T1 tumor line , in this work we
evaluated the antitumor activity of a fraction of Caesalpinia spinosa plant, called P2Et
previously obtained and evaluated in vitro by the group of Immunology and cell
Biology, Pontificia Universidad Javeriana , which is rich in gallotannins , which in
previous studies have demonstrated its antitumor effect in different ways, among
which are cell cycle arrest , mitochondrial membrane depolarization and activation of
apoptosis by way of caspases . In this paper we first standardize the model under the
conditions of our laboratory where we test, growth and weight of the primary tumor,
presenting leukemoid reaction by blood counts and quantification of metastasis to
distant organs by light microscopy in histological sections, then evaluate the acute
toxicity and P2Et activity fraction of the model previously standardized. The
experiment was performed in duplicate with two groups of mice of different
provenance, SPF (specific patogens free) and conventional sanitation. The fraction
decreased growth and weight of the primary tumor as well as the reaction leukemoid
induced growth factors constitutively produced by the tumor also decreased the
number of metastatic cells of parenchymatous organs such as lung, liver, spleen and
tumor primary .
This work has allowed us to show in vivo, the fraction rich in gallotannins P2Et , has
antitumor activity and lays foundation for future immunological studies of tumor
metastasis and the effects of the fraction as a future alternative therapy for the
treatment and control of metastasis .
1.
INTRODUCCIÓN
El cáncer de seno es la primera causa de muerte en mujeres en el mundo y en Colombia
con 115 muertes en el 2010 (Instituto Nacional de Cancerología., 2012). Esta enfermedad
genera más de 22.000 casos de muerte en Latinoamérica al año y se diagnostican más de
69.000 nuevos casos en estadios avanzados; de ellos el 80% se presentan en mujeres
mayores de 50 años y el 75% de los casos se presenta en mujeres sin riesgo conocido. En
Colombia, según datos del INC (Instituto Nacional de Cancerología) la incidencia anual
para el año 2010 fue de 670 casos (120 más que el año anterior), representando el 10,6%
del total de casos nuevos de cáncer en el país, los casos se presentaron desde los 20 años y
la mayor incidencia fue a partir de los 35 años de edad. Del total de casos 8% estaban en
estadio IV (Instituto Nacional de Cancerología., 2012), el cual se caracteriza por
diseminarse más allá de la glándula mamaria, incluyendo nódulos linfáticos y órganos
como pulmón, hígado, bazo, hueso y/o cerebro (Hepner, Miller, & Shekhar, 2000; OstrandRosenberg & Pulaski, 2000; duPre' & Hunter Jr, 2007).
Existen múltiples opciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer de seno, entre las
que se encuentran: la extirpación quirúrgica radical, radioterapia, hormonoterapia y la
quimioterapia (Pulaski & Ostrand-Rosenberg, Reduction of Established Spontaneous
Mammary Carcinoma Metastases following Immunotherapy with Major Histocompatibility
Complex Class II and B7.1 Cell-based Tumor Vaccines, 1998) (Baliga, Meleth, & Katiyar,
2005). Generalmente, los efectos benéficos de estos tratamientos son opacados por los
efectos secundarios tales como: toxicidad hepática, toxicidad renal, inmunosupresión y
signos gastrointestinales entre otras. Es por esto que cada día resulta más importante la
búsqueda de nuevas terapias alternativas para esta enfermedad.
Por otro lado, la metástasis es la principal complicación de los tumores malignos y la
principal causa de la morbilidad y mortalidad en pacientes con cáncer (Fantozzi &
Christofori, 2006). Los órganos en donde se encuentran principalmente los focos
metastásicos en el estadio IV del cáncer mamario humano son pulmón, hígado, bazo y en
algunos casos hueso y cerebro (Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000).
Uno de los mayores impedimentos en el estudio de la enfermedad metastásica es la falta
de modelos que muestren y emulen las características de la enfermedad y se repliquen de
manera similar como en humanos. Las células tumorales humanas tienen una pobre
metástasis en modelos murinos, y cuando ocurre hay cambios inesperados en el proceso
15
metástasico. Por el contrario, en modelos con células tumorales murinas, las
características de replicación, distribución y patogenicidad, mimetizan la enfermedad
metastásica igual que en humanos (Fantozzi & Christofori, 2006; Gupta & Kuperwasser,
2004).
Los modelos in vivo utilizando el modelo murino como sujeto experimental en la
investigación del cáncer, han contribuido en el estudio de mecanismos de progresión
tumoral, control de la proliferación, diferenciación y migración de células tumorales
(metástasis). Las similitudes fisiológicas e inmunológicas entre el modelo humano y el
murino, han hecho que este último se utilice como herramienta para estudiar
enfermedades humanas contribuyendo al desarrollo y al avance en el campo de la
biomedicina. (Fantozzi & Christofori, 2006; Gupta & Kuperwasser, 2004; Fantozzi &
Christofori, 2006; Ottewell, Coleman, & Holen, 2006)
Uno de los modelos que ha sido ampliamente utilizado en el estudio del cáncer mamario,
es aquel que utiliza células tumorales 4T1 en ratones Balb/c, por medio del cual se puede
emular el estadio IV del cáncer de seno humano (Jiang, y otros, 2010; Baliga, Meleth, &
Katiyar, 2005; duPre' & Hunter Jr., 2008; Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000; Heppner,
Miller, & Shekhar, 2000).
Las células tumorales 4T1 empleadas en este modelo, han sido estudiadas in vitro e in vivo,
para el estudio de compuestos y extractos derivados de plantas como la uva, el té verde y
el té negro, demostrando acción proapoptótica mediante depolarización de la membrana
mitocondrial por diferentes vías (Baliga, Meleth, & Katiyar, 2005; Bove, Lincoln, & Tsan,
2002).
La Caesalpinia spinosa, conocida en nuestro país como Dividivi se le atribuye actividad
antibacteriana, antiinflamatoria y antitumoral por conocimiento tradicional (Pombo,
2008). Esta actividad se ha demostrado mediante ensayos que han utilizado fracciones o
extractos de la planta para probar por ejemplo, el efecto de inhibitorio ante bacterias gram
positivas como el Staphylococcus aureus y gram negativas como el Bacteroides fragilis
(Kloucek, 2005), el efecto antiinflamatorio en pacientes con gingivitis crónica (Cabello,
2009) y la capacidad antitumoral se ha evaluado a través de la acción de sus principales
compuestos como la acción de los taninos en células de piel de ratón inhibiendo la
actividad del peróxido de hidrógeno inducida por rayos ultravioleta así como la ornitina
carboxilasa y la síntesis de ADN, los cuales se utilizaron como marcadores tempranos de
16
cáncer de piel (Gali-Muhtasib et al, 1999). entre otros. Esta actividad se le atribuye a la alta
concentración de taninos los cuales son motivo de estudio en la lucha contra el cáncer
(Pombo, 2008).
Nuestro grupo ha estudiado la composición de una fracción derivada de los frutos de la C.
spinosa llamada P2Et, la cual presenta entre sus principales compuestos polifenoles como
el metildigalato, digalato y ácido 3,5-di-O-galloilquinico, a los cuales se les atribuyen entre
otras, actividades proapoptóticas y citotóxicas en células neoplásicas. En estudios in vitro
se ha estudiado el pontencial citotóxico y apoptótico de la fracción en líneas de células
tumorales de cáncer mamario murino (4T1), melanoma murino (Mel-Rel), eritroleucemia
humana (k562) y melanoma humano (A375) (Pombo, 2009). En la línea 4T1 la fracción
P2Et mostró alteración de la viabilidad celular mediante alteraciones morfológicas y
actividad citotóxica y apoptótica evaluada midiendo el potencial de depolarización de la
membrana mitocondrial y la actividad de la caspasa 3 (Pombo, 2009).
Por lo anterior, se ha propuesto evaluar la actividad antitumoral de la fracción P2Et,
obtenida a partir de Caesalpinia spinosa en ratones Balb/c, en un modelo de cáncer
mamario derivado de células tumorales 4T1, teniendo como parámetros la medición del
diámetro del tumor primario, conteo de leucocitos y análisis de órganos parenquimatosos
como hígado, bazo, pulmón y tumor primario en cuales se analizaran cambios compatibles
con metástasis y conteo de células tumorales si se llegan a presentar.
17
2. MARCO TEÓRICO
2.1.
Generalidades del cáncer
La transformación maligna de una célula tumoral, esta mediada por múltiples procesos
que llevan a la alteración de su crecimiento, proceso conocido como carcinogénesis (Mak
& Saunders, 2006).
Estos procesos se han clasificado en cuatro etapas: Iniciación, promoción, conversión y
transformación maligna. En la iniciación, se presenta daño en el ADN que puede darse por
rupturas en sus hebras o mutaciones que no son reparadas por los mecanismos de control,
y como resultado hay alteración en la codificación de proteínas relacionadas con la
regulación del metabolismo y crecimiento celular; la promoción, es la etapa en la que se
presenta exposición a estímulos que promueven la proliferación de la célula diana con las
alteraciones genéticas, dando lugar a un clon de células preneoplásicas. En la progresión,
se dan mutaciones adicionales debido a que hay una predisposición adquirida por los
cambios genéticos de las etapas anteriores, las células en este punto se denominan
neoplásicas. Factores externos como el microambiente tumoral influyen en la progresión
de esta etapa. Por último en la conversión maligna, las células neoplásicas continúan
adquiriendo cambios genéticos, estructurales, metabólicos que las hace diferentes de las
células de los tejidos adyacentes y algunas pueden llegar a tener la capacidad de dejar el
tumor primario y formar nuevos clones en tejidos distantes, lo que se conoce con el
nombre de metástasis (Hepner, Miller, & Shekhar, 2000; Mak & Saunders, 2006).
La metástasis es un proceso que también se da de manera secuencial y está dividido en
seis etapas: Invasión, intravasación, transporte, extravasación, arresto y crecimiento
(Hepner, Miller, & Shekhar, 2000; Fidler, Kim, & Langley, 2007; Magdalena A. Cichon,
2010). Las células carcinogénicas del tumor primario tienen la capacidad de alterar vías
de señalización, que promueven la secreción directa o indirecta de enzimas, citoquinas y
factores de crecimiento, que ayudaran a la alteración de células mioepiteliales y
endoteliales que permitirán la intravasación a la circulación sanguínea y posteriormente
su adhesión y extravasación en matrices de órganos distantes para dar lugar al
crecimiento de nuevos focos metastásicos en otros tejidos (Magdalena A. Cichon, 2010).
Las células que adquieren estas capacidades metastásicas (Invasión, intravasación,
transporte, extravasación, arresto y crecimiento) cumplen entre otras con las siguientes
características: Sostenimiento de las señales de proliferación, evasión de supresores de
crecimiento, resistencia a la apoptosis, alta capacidad de replicación e inmortalidad,
inducción de angiogénesis, invasión de tejidos y metástasis (Hanahan & Weinberg, 2011).
2.2.
Cáncer mamario
El cáncer de seno es el más frecuentemente diagnosticado en mujeres a nivel mundial con
un 23% del total de casos anuales y con 14% del total de muertes por cáncer (Jemal, Bray,
18
& Ferlay, 2011). En Colombia, la incidencia anual para el 2010 fue de 670 casos,
representando el 10,6% del total de casos nuevos de cáncer en el país. De estos nuevos
casos el 8 % (54 casos) estaban en estadio IV. La mortalidad por cáncer en mujeres fue de
612, de los cuales 115 fueron por cáncer de seno (Instituto Nacional de Cancerología.,
2012).
La muerte en estas mujeres se asocia a las complicaciones como el síndrome
paraneoplásico, derivado de la metástasis a nódulos linfáticos y órganos parenquimatosos
como hígado, pulmón, bazo, cerebro y también hueso. Los cambios moleculares en las
células tumorales e interacciones con el microambiente tumoral que incluye matriz
extracelular, estroma mamario compuesto por adipocitos, fibroblastos, células
endoteliales, células inflamatorias, factores de crecimiento, citoquinas y quemoquinas,
contribuyen a la remodelación de la matriz, el crecimiento tumoral y los pasos de la
carcinogénesis como son: proliferación, invasión, angiogénesis, resistencia a la apoptosis y
metástasis (Fantozzi & Christofori, 2006).
En el cáncer de seno, se encuentran marcadores moleculares utilizados para evaluar el
pronóstico y determinar el tratamiento entre los cuales se encuentran el receptor de
estrógenos (ER) y el receptor de progesterona (PR) y los receptores de factores de
crecimiento epidermales como: el receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR) y
el receptor de crrecimineto epidermal-2 (HER-2) principalmente. La sobreexpresión en
los genes que codifican estos receptores se asocia a procesos tumorales de malignidad.
Adicionalmente, las quemoquinas como la E-caderina y RANTES pueden estar implicadas
en procesos metastásicos, así como las mutaciones en genes oncosupresores como el
BRCA-1, BRCA-2 y p53 las cuales pueden activar la expresión de oncogenes relacionados
con el cáncer mamario (Giancotti, 2006).
2.3.
Clasificación del cáncer de seno
El sistema de estadificación del American Joint Committee on Cancer (JACC), ha clasificado
el cáncer de seno según el pronóstico basándose en el sistema TNM (Tamaño del tumor
primario, migración a nódulos linfáticos regionales y Metástasis a distancia) como: T (TX,
T0, Tis, T1, T2, T3, T4), N (NX, N0, N1, N2, N3), M (MX, M0, M1); Los estadíos se clasifican
en 0, IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC y estadío IV (cualquier T, cualquier N y M1) (Edge, Byrd,
Compton, & al, 2010) que se caracteriza por ser invasivo, metastásico a nódulos linfáticos
regionales y órganos distantes del tumor primario y además es de pobre pronóstico (Jiang,
y otros, 2010; Pockaj, y otros, 2010). Esta clasificación se utiliza para adoptar protocolos
de diagnóstico, seguimiento y tratamiento según el estadío; en el IV (Pockaj, y otros, 2010;
Álvarez, 2010).
Para entender la fisiología del desarrollo de la enfermedad tumoral y metastásica en el
cáncer de seno, es necesario el modelo in vivo, debido a que permite el estudio de las
diferentes interacciones entre el sistema inmune y el tumor, además de patrones de
distribución, angiogénesis y vías de señalización (Aslakson & Miller, 1992).
19
2.4.
Modelos murinos de cáncer mamario.
Debido a la complejidad de procesos anatomopatológicos que se presentan en el cáncer de
seno como la vigilancia inmune, alteración de vías de señalización, angiogénesis,
desarrollo del microambiente tumoral y las características carcinogénicas que tienen estas
células (Hanahan & Weinberg, 2011), los modelos in vivo son los más significativos (Gupta
& Kuperwasser, 2004), y aunque no hay un modelo que replique el cáncer mamario con
todas sus fases, los modelos que existen aportan información valiosa en la inducción,
progreso y estadio metastásico de la enfermedad, que no podrían realizarse en modelos in
vitro (Ottewell, Coleman, & Holen, 2006).
Los modelos murinos para cáncer de seno se pueden dividir en: modelos con carcinógenos
químicos o asociados a virus, trasgénicos, xenogénicos y singénicos (Gupta &
Kuperwasser, 2004; Hepner, Miller, & Shekhar, 2000); o también se pueden dividir en
modelos preneoplásicos que emulan estadios tempranos de la enfermedad y en modelos
metastásicos, que reproducen el estadio final de la enfermedad (estadio IV) (Hepner,
Miller, & Shekhar, 2000; Ottewell, Coleman, & Holen, 2006; Pulaski & Ostrand-Rosenberg,
2000).
2.5.
Modelo de cáncer mamario murino con células tumorales 4T1.
2.5.1. Origen de la línea tumoral.
La línea tumoral 4T1 es una subpoblación que fue obtenida a partir de un tumor que
creció espontáneamente en una hembra Balb/cfC3H portadora del MMTV (virus del tumor
mamario murino), que deriva de una línea obtenida en 1969 del Cancer Research
Laboratory en la Universidad de California. En el primer reporte describen cuatro líneas
tumorales denominadas 66, 67, 168 y 68-H (Dexter D. L., y otros, 1978). En un estudio
posterior, se aisló una línea denominada 410, a partir de un nódulo tumoral en pulmón
que creció en una hembra Balb/c luego de la inoculación vía subcutánea (s.c.) de un
décimo pasaje de la línea tumoral original, la cual no había sido separada en el estudio
anterior. Esta subpoblación se caracteriza por tener una alta incidencia de metástasis
espontánea a pulmón e hígado y presentar resistencia a quimioterapéuticos de la época
como la 6-tioguanina (Miller, Roi, Howard, & Miller, 1983; Miller, Miller, Wilburn, &
G.H.Heppner, 1987). La línea 4T1 es una variante de un cuarto pasaje de la sublínea 410
(410.4) (Aslakson & Miller, 1992).
20
2.5.2. Características generales del modelo.
El modelo 4T1, es un modelo singénico en ratones BALB/c hembras, nulíparas, maduras
(6–8 semanas de edad). Las células tumorales de la línea 4T1 se caracterizan por ser
transplantables, pueden ser inoculadas vía ectópica (subcutánea, debajo del cojinete
mamario) y la ortotópica (dentro del tejido mamario) creciendo anatómicamente en el
sitio correcto. Tras su inoculación, se desarrolla un tumor primario que puede ser
palpable a partir de la semana de inoculación dependiendo del número de células
inoculadas y hace metástasis espontánea agresiva vía hematógena (similar a la
presentación del estadío IV de cáncer de seno en humanos) a pulmón, hígado, bazo,
nódulos linfoides secundarios, y ocasionalmente hueso y cerebro, siendo una de las pocas
líneas que tienen esta característica (Heppner, Miller, & Shekhar, 2000; Fantozzi &
Christofori, 2006) (Pulaski & Ostrand-Rosenberg, 2000).
En la línea 4T1, se ha reportado la producción y secreción de enzimas y factores
involucrados en los procesos carcinogénicos que la hacen un excelente modelo del estadio
IV de cáncer de seno. Entre los principales se encuentran las metaloproteinasas (MMP)
responsables de la modificación de la matriz extracelular (ECM), como la MMP3, MMP9 y
la MMP13; dos moduladores del crecimiento del tejido endotelial-vascular, como el factor
de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C) y la angiopoyetina 2 (AGPT-2), los cuáles
interactúan con sus receptores en el endotelio vascular alterado, dando lugar a
vasculogénesis y linfangiogénesis que son importantes para la irrigación tumoral y a su
vez para el escape de células metastásicas vía hematógena y linfática. Adicionalmente
promueven el reclutamiento de monocitos y macrófagos en el sito de inflamación
(Aslakson & Miller, 1992; Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008). Esta línea tumoral también
produce factores involucrados en la producción de células inflamatorias como: factor
estimulante de colonias para monocitos (M-CSF) inducido por interferón-γ (INF-γ) y de
granulocitos- monocitos (MG-CSF) y granulocitos (G-CSF) producidos constitutivamente
por la línea 4T1. Estos factores de crecimiento se han caracterizado como los responsables
en la leucocitosis circulante y la hematopoyesis extramedular de este modelo. Así mismo,
la producción de quemoquinas como CXCL6 y CXCL1, también es crucial en el
reclutamiento de granulocitos en el microambiente tumoral, los cuáles contribuyen a la
remodelación de la ECM y favorecen la metástasis (duPre' & Hunter Jr., 2008; duPre' &
Hunter Jr, 2007; Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008).
2.5.3. Tumor primario y microambiente tumoral.
El tumor primario se clasifica como un tumor sólido, el cual está compuesto por una
capsula fibrosa y en su interior por diferentes tipos de células como: tumorales,
estromales, inflamatorias polimorfonucleares, fibroblastos y células endoteliales. (Liao,
Luo, Markowitz, Xiang, & Reisfeld, 2009; Roland, y otros, 2009). Este conjunto de células
junto con las citoquinas, hormonas y factores de crecimiento producidos en él, se conoce
como microambiente tumoral (MT) (duPre' & Hunter Jr, 2007). Luego de la inoculación de
21
las células tumorales 4T1 en el cojinete mamario, se desarrolla una inflamación local
originada por los factores producidos por estas células como VEGF, GM-CSF y la ECM,
induciendo la infiltración de células inflamatorias con perfil supresor (Gr1+CD11b+,
células supresoras derivadas mieloides, MDSC), las cuáles pueden llegar a representar el
25% del total de células en un tumor maduro (duPre' & Hunter Jr, 2007). Estas MDSC son
una población heterogénea de macrófagos, granulocitos y células dendríticas en un estado
temprano de maduración y con el mismo progenitor en la médula ósea; su función es
controlar la inflamación excesiva o prolongada en condiciones patológicas, pero cuando
esta población forma parte del microambiente tumoral, inhibe de manera significativa la
respuesta celular de linfocitos (LT) CD4+ y CD8+, a través de la producción de óxido
nítrico sintasa inducible (iNOS), el cual hace que los macrófagos activados (M1) se
polaricen a macrófagos activados alternativamente (M2) siendo estos los responsables de
la polarización de la respuesta celular tipo Th1 a tipo Th2 facilitando la progresión del
tumor, (Serafini, Borrello, & Bronte, 2006; Sinha, Clements, Bunt, & Ostrand-Rosenberg,
2007) e induciendo la acumulación de LT reguladores (LTr) (Sinha, Clements, Bunt, &
Ostrand-Rosenberg, 2007). Otro mediador de importancia en el microambiente es el INFγ, secretado en el microambiente por células inflamatorias como: macrófagos, células
dendríticas, natural killer (NK) y granulocitos (duPre' & Hunter Jr, 2007). Adicionalmente,
en el tumor primario las células 4T1, han identificado proteínas de superficie inducibles de
manera dosis dependiente por el INF-γ producido por células inflamatorias infiltrantes
que son: B7-H1 (relacionada con la supresión de la respuesta de LT CD8+), ICAM1(Relacionado con la migración transendotelial de la célula y metástasis) y el I-Ad
(haplotipo del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHCII)). Por otra parte en el
modelo 4T1 en ratones knockout para INF-γ (INF-γ-/-), se ha observado que desarrollan
metástasis más rápido y que el tiempo de sobrevida es menor comparado con el modelo
convencional, lo que sugiere el papel que juega el INF-γ en la respuesta inmune
antitumoral innata (duPre' & Hunter Jr., 2008; Pulaski, Smyth, & Ostrand-Rosenberg,
2002).
En cuanto al crecimiento del tumor primario, Liao y colaboradores reportaron un
crecimiento bifásico debido a la regresión en algunas masas primarias entre la segunda y
cuarta semana pos-inoculación, acompañada de necrosis e infiltración leucocitaria, la cual
la atribuyeron a la respuesta inmune. En ratones atímicos no se observa esta característica
y no se encontraron anticuerpos en suero dirigidos contra múltiples antígenos tumorales
(Liao, Luo, Markowitz, Xiang, & Reisfeld, 2009). Por otra parte, cuando se hace la disección,
se han observado vasos sanguíneos mostrando la vasculogénesis que se relaciona con la
producción de factores como VEGF y la arginasa (ARG) la cual es producida por los
macrófagos asociados al tumor. También se ha reportado necrosis en el centro de algunas
masas primarias y se le puede atribuir a la hipoxia en estos tumores sólidos, debido a que
el crecimiento del tumor supera la irrigación que lo nutre (Cronin, Wang, & Redmond,
2010; duPré, 2005). De igual forma, la cantidad de vasos linfáticos es insuficiente, lo que
conlleva a que la presión intersticial sea mayor que la presión sanguínea, haciendo más
difícil el transporte de nutrientes, células inflamatorias y factores de crecimiento al tumor
primario (duPre' & Hunter Jr., 2008). El tumor es medible aproximadamente entre la
segunda y la tercera semana pos-inoculación (Pulaski & Ostrand-Rosenberg, 2000).
22
2.5.4. Metástasis a órganos distantes
Como se mencionó anteriormente, en el modelo 4T1, cuando la inoculación se hace por vía
ortotópica la metástasis a pulmón se observa, desde el día 5 y en hígado a los 20 días posinoculación (Aslakson & Miller, 1992). También se ha utilizado la inoculación vía
hematógena por inyección de las células tumorales en la vena de la cola, dando como
resultado focos metastásicos en pulmón, en la vena porta, en hígado, y por infusión
cardiaca a muchos órganos blanco incluyendo hueso (Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000;
Lelekakis, y otros, 1999).
Ensayos de clonogenicidad han mostrado una mayor cantidad de células tumorales en
sangre comparado con los nódulos linfáticos regionales del tumor primario, justificando la
ruta hematógena como principal ruta de metástasis (Aslakson & Miller, 1992).
Estudios realizados por Ostrand-Rosenberg y colaboradores han demostrado que el
número de células tumorales a inocular es importante para el desarrollo del tumor
primario y la metástasis. Cuando se han inoculado 7x103 células/μl se han observado
pobres signos de metástasis y un desarrollo lento del tumor primario; por otra parte,
cuando se han inoculado 1x104 a 1x107 células/µl, se ha observado metástasis desde el día
15 con esplenomegalia y signos de granulocitosis en sangre periférica (Ostrand-Rosenberg
& Pulaski, 2000).
La metástasis en este modelo ha mostrado una secuencia en cuanto a su distribución.
Primero se observa en pulmones (alrededor de las primeras 3 semanas), luego a hígado,
bazo y hueso (5-6 semanas post-inoculación). Ocasionalmente se ha observado metástasis
a cerebro, corazón e intestino (Aslakson & Miller, 1992; duPre' & Hunter Jr, 2007). La
realización de imagenología in vivo ha permitido demostrar que de hecho estas células
hacen metástasis a partir del día 8 y que además pueden invadir el hueso (Tao, Fang,
Alroy, & Sahagian, 2008). El microambiente tumoral (MT) es el responsable del escape de
las células metastásicas y su infiltración a órganos distantes, en parte favorecido por el
VEGF y las MDSC que contribuyen al proceso de vasculogénesis, y a la expresión
constitutiva de quemoquinas como CXCR4 (Cronin, Wang, & Redmond, 2010). Esta
citoquina, participa en el proceso de vascularización tumoral, al estar presente en células
madre de tejido endotelial, células hematopoyéticas maduras y ser inducido por el VEGF.
(Cronin, Wang, & Redmond, 2010; Williams, y otros, 2010; Sun, y otros, 2010; Fricker &
Teicher, 2010). Por otra parte, su ligando (SDF-1a o CXCL12) evita la capacidad de
producir INF-γ por parte de los LT, la migración desde el nódulo linfático hacia el tumor, y
su inhibición ha potencializado la respuesta de LT específicos de tumor en los nódulos
linfáticos que drenan el tumor (Adler, Lemken, Katchen, & Kurt, 2003; Tao, Fang, Alroy, &
Sahagian, 2008). Adicionalmente, también se asocia a la migración de células tumorales
metastásicas, debido a su producción en tejidos de órganos como pulmón, hígado, riñón,
cerebro, corazón, glándulas adrenales y hueso, en los cuales es frecuente la metástasis
para este tipo de cáncer. CCL5 por su parte, favorece el reclutamiento de neutrófilos y
metástasis, debido a que las células tumorales pueden migrar del tumor primario unidas a
ellos (Wu, Wang, Condron, Bouchier-Hayes, & Redmond, 2001; Tao, Fang, Alroy, &
23
Sahagian, 2008), lo que explicaría otro mecanismo de migración por parte de la célula
tumoral.
2.5.5. Hallazgos histológicos.
En el modelo 4T1, histológicamente la distribución de la metástasis en las primeras
semanas es cerca a los vasos sanguíneos aferentes de los órganos involucrados y con
algunos focos infiltrantes los cuales son esféricos.
Los cortes de los tumores primarios muestran una arquitectura desorganizada y puede
haber áreas de necrosis, infiltradas por leucocitos y células tumorales en la periferia. Las
células necróticas son pobremente diferenciadas y se caracterizan por la presencia de
núcleos hipercromáticos, y poca cantidad de citoplasma (Tao, Fang, Alroy, & Sahagian,
2008). En médula ósea se observan hallazgos que muestran hiperplasia de la médula ósea
con pérdida de células grasas (duPre' & Hunter Jr, 2007).
En los nódulos linfáticos 3 semanas después de la inyección de las células tumorales, se
han reportado áreas necróticas con infiltración de neutrófilos y otras células inflamatorias.
En la mayoría de casos, los nódulos linfáticos regionales carecen de células tumorales
después de que ya se ha comprobado la metástasis en otros órganos distantes,
corroborando que la ruta de metástasis es por vía hematógena (Aslakson & Miller, 1992).
En pulmones se ha observado la infiltración de células metastásicas después de 3 semanas
post-inoculación de las células tumorales, alrededor de los vasos sanguíneos (Tao, Fang,
Alroy, & Sahagian, 2008).
En hueso, la metástasis es evidente entre la cuarta y sexta semana post-inoculación. En
aproximadamente el 50% de los animales se han reportado focos mestastásicos en la
diáfisis distal de fémur y proximal de la tibia. Se observan áreas osteolíticas con presencia
de osteoclastos alrededor de las células tumorales. Ocasionalmente se han observado
focos metastásicos en espina dorsal, costillas y cráneo. En la semana 6 la metástasis se
encuentra en la articulación femuro-tibial con extensa osteolisis del hueso (Lelekakis, y
otros, 1999; Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008).
En hígado y bazo la metástasis ha sido evidente entre las semanas 4 y 6 pos-inoculación de
las células tumorales; las células se encuentran en grupos infiltrando los sinusoides o
alrededor de las células endoteliales. Los dos órganos con metástasis muestran extensa
hematopoyesis extramedular, por presencia de megacariocitos y megacarioblastos en la
pulpa roja. También reportan reducción en la proporción de la pulpa blanca. En cuanto al
tamaño del bazo muestra un incremento de dos veces el tamaño normal en el día 15 y un
aumento de 6 veces el tamaño de los controles al día 29 post-inoculación (duPre' & Hunter
Jr, 2007; Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008).
En riñón y glándulas adrenales en la semana 6 post-inoculación del tumor se observan
células tumorales en vasos de gran calibre y en parénquima renal, al igual que en el
adrenal (Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008).
24
2.5.6. Alteraciones hematológicas:
extramedular.
Reacción
leucemoide
y
hematopoyésis
La reacción leucemoide es una leucocitosis con conteos superiores a 50.000 células/μl, la
cual se origina fuera de la médula ósea y viene acompañada de hiperplasia de la pulpa roja
en el bazo y en consecuencia esplenomegalia. Esta es una de las alteraciones que
acompañan el síndrome paraneoplásico y se ha descrito en canceres humanos y animales
(duPre' & Hunter Jr, 2007). Tao y colaboradores, en este modelo de cáncer mamario con
células 4T1, reportan valores de leucocitos de 56.000 hasta 80.000 células/μl en la 4
semana luego de iniciado el experimento (Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008).
En el ratón la producción de glóbulos rojos en condiciones normales se da en la médula
ósea de los huesos largos, aunque en condiciones de enfermedad se puede dar en hígado y
bazo lo que se denomina hematopoyesis extramedular. Este fenómeno ocurre solamente
en el ratón y no se observa cuando los animales están sanos (Percy & Barthold, 2007).La
hematopoyesis extramedular en el modelo de 4T1, se ha observado durante la semana 6
post-inoculación ortotópica de las células tumorales, a la vez que progresa el crecimiento
del tumor y el desarrollo de la metástasis. Este fenómeno ocurre en forma concomitante al
incremento en la circulación periférica de neutrófilos y otros leucocitos asociado también
a un aumento en peso y tamaño de hígado (hepatomegalia) y bazo (esplenomegalia) por
infiltración en estos órganos y a la descrita hematopoyesis extramedular que es
concomitante con la presencia de megacariocitos en la pulpa roja del parénquima
esplénico (duPre' & Hunter Jr, 2007; Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008). Así mismo, la
granulocitosis ocurre sin cambios significativos en el número de LB o LT en sangre
periférica determinado por citometría de flujo analizando los marcadores GR1+ y CD45
(duPre' & Hunter Jr, 2007).
Estas alteraciones hematológicas se le atribuyen a la producción constitutiva en las células
4T1 de factores estimulantes de colonia mieloide como MG-CSF, G-CSF y el M-CSF
(inducible por presencia de INF-γ), pero principalmente al G-CSF, debido a que es el único
de estos factores que se ha encontrado en sangre periférica. Algunos estudios han
demostrado que el G-CSF actúa en sinergia con los otros dos, potencializando esta
reacción, la cual estimula la hematopoyesis y liberación de células con el fenotipo GR1+ y
Gr1+CD11b+ a la circulación. Estas células se han caracterizado como células MSDC,
capaces de inhibir la inmunidad tumoral mediada por LT, facilitando la patogénesis
tumoral. Adicionalmente, esta leucocitosis se ha atribuido al efecto antiapoptótico sobre
los granulocitos inducido por el MG-CSF prolongando su sobrevida y permanencia en los
tejidos que infiltra y en el torrente sanguíneo (duPre' & Hunter Jr, 2007).
2.6.
Actividad antitumoral ejercida por productos naturales en el modelo 4T1.
La actividad citotóxica y antitumoral de los extractos de plantas como los derivados del té
verde, específicamente la epigalocatequina-3-galato (EGG), ha sido evaluada en el modelo
murino con células tumorales 4T1. El tratamiento in vitro ha demostrado que la células
4T1 mueren por apoptosis con disminución de la expresión de oncoproteínas supresoras
25
de apoptosis como Bcl-2 e incremento en la expresión de proteínas proapoptóticas como
Bax. Adicionalmente, se observó la consecuente liberación de citocromo c y la formación
del complejo apoptosoma con el consecuente clivaje de la caspasa 3, y las proteínas PARP.
Los estudios in vivo, demostraron que el tratamiento disminuyo los focos metastásicos a
órganos distantes y aumento el porcentaje de sobrevida en comparación con los grupos no
tratados (Baliga, Meleth, & Katiyar, 2005).
2.6.1. Caesalpinia spinosa: Descripción, composición y características de la fracción
P2Et
La Caesalpinia spinosa Molina Kuntze es un árbol de hasta 10 metros (m) o arbolito de 3 a
5 m perteneciente a la familia Caesalpiniaceae (Leguminosae: Caisalpinoideae). El fruto
tiene forma de vainas encorvadas que miden aproximadamente 10 centímetros (cm) de
largo por 3 cm de ancho, y poseen un color naranja rojizo cuando están maduros.
Contienen de 4 a 7 semillas ovoides, ligeramente aplanadas, membranosas, de color pardo
oscuro o negruzco cuando están maduras. Es originaria de la región andina distribuida
entre los 800 y 3000 msn, en países como Venezuela, Colombia, Chile y Perú en donde es
conocida comúnmente como tara, dividivi, quebrancho, huarango, guasango y guaranga.
En Colombia está presente en climas fríos (18-24°C) y bosque seco pre montañoso, con un
promedio anual de lluvias de 500 a 1.000 mm, y pertenece a la subregión o provincia
subhúmeda. Sus principales usos comerciales son aprovechados en Perú, país que es el
primer productor mundial de esta planta; a nivel industrial las vainas de sus frutos son
utilizados por su alto contenido en taninos utilizado en la industria de curtido de pieles
animales, así como su contenido de ácido gálico, utilizado como materia prima en la
industria alimentaria y farmacéutica, al igual que la goma de las semillas de esta plante,
rica en polisacáridos como el galactomanano. (Barriga, 1974; Cabello, 2009)
Existe un gran número de plantas conocidas en la actualidad por su actividad antitumoral,
conocimiento derivado del uso tradicional. Entre ellas, la Caesalpinia spinosa, presenta un
interés particular en nuestra comunidad (Barriga, 1974).
Esta planta ha sido utilizada desde la época prehispánica en la medicina folclórica y en
años recientes como materia prima en el mercado mundial de hidrocoloides alimenticios.
De acuerdo con García Barriga la bebida del cocimiento de los frutos sirve en gargarismos,
para aliviar la amigdalitis, es desinfectante y reduce las glándulas. También ésta cocción en
sorbetorios por la nariz es útil en el tratamiento de la sinusitis. De los frutos se extraen
taninos, por lo que se utiliza en la industria curtiembre. En Perú, Caesalpinia spinosa es
utilizada como antiinflamatorio en forma de gárgaras para infecciones bronquiales,
sinusitis; como agua de lavado para los ojos inflamados, infecciones vaginales y micóticas
(Liu, 2009).
26
2.6.2. Actividades biológicas reportadas sobre Caesalpinia spinosa
Diferentes actividades han sido reportadas para los extractos obtenidos de Caesalpinia
spinosa. Un extracto etanólico de los frutos de C. spinosa presentó actividad antimicrobiana
tanto en bacterias Gram positivas como Gram negativas (Kloucek, Polesny, Svobodova,
Vlkova, & Kokoska, 2005). El ácido gálico es uno de los compuestos reportados en el
Dividivi al cual se le han atribuido un gran número de propiedades, entre las que se
incluyen: antioxidante, antialérgico, antimutagénico, anticarcinogénico y antiinflamatorio
(Gandhi & Nair, 2005). Adicionalmente, se ha reportado actividad citotóxica importante
para los metil, propil y octil esteres del ácido gálico, sobre la línea celular tumoral HeLa
(Adenocarcinoma de cérvix humano) y su relación estructura-actividad (Fiuza, y otros,
2004). Nosotros reportamos previamente que una fracción obtenida de Caesalpinia
spinosa (P2Et) tiene efecto citotóxico sobre células leucémicas (K562), induciendo
apoptosis (Castañeda, Pombo, Hernandez, Urueña, & Fiorentino, 2012).
Otro de los compuestos que han sido identificados en esta planta es la pentagaloilglucosa
(PGG), que además identificamos en la fracción P2Et. Esta molécula, actúa sobre células
MCF-7 deteniendo el ciclo celular en la fase G1 (Chen, Chang, & Lin, 2003). Nosotros
también observamos previamente que la fracción P2Et induce arresto en fase G1 del ciclo
celular en células MCF-7 (Castañeda, Pombo, Hernandez, Urueña, & Fiorentino, 2012),
posiblemente por la presencia de la PGG.
Por otra parte, el grupo de Gali-Muhtasib demostró que los taninos hidrolizables (ácido
tánico) obtenidos de los frutos de Caesalpinia spinosa disminuyen los niveles de algunos
marcadores bioquímicos asociados con cáncer de piel y retrasan el desarrollo de tumores
en la piel de ratones (Gali-Muhtasib, Yamout, & Sidani, 2000). La actividad de los taninos
sobre células de cáncer de seno murino, ha sido evaluada principalmente para el EGG
(tanino de tipo condensado con presencia de ácido gálico), presente en el té verde,
utilizando células 4T1. El EGG mostró que era capaz de inducir apoptosis por la vía
mitocondrial en estas células (Baliga, Meleth, & Katiyar, 2005).
2.6.3. La fracción P2Et obtenida de Caesalpinia spinosa y su relación con el cáncer.
La fracción P2Et se derivó de un extracto etanólico de la planta Caesalpinia spinosa,
caracterizada fitoquímicamente por el Grupo de Inmunobiología y Biología celular de la
Pontificia Universidad Javeriana.
A esta fracción, se le realizó una caracterización química, donde se encontró un alto
contenido de taninos hidrolizables derivados del ácido gálico (Pombo, 2008), al cual se le
han atribuido acciones antiinflamatorias, antibacterianas y antitumorales induciendo
muerte celular en carcinomas escamosos, células leucemicas y células de mieloma (Gandhi
& Nair, 2005; Gali-Muhtasib, Yamout, & Sidani, 2000). La caracterización se hizo por HPLCPDA y espectofotomeria de masas, hallando principalmente derivados del ácido
galloilquinico y en menor proporción (PGG) y otros derivados del ácido gálico como el
metilgalato y el digalato (Tabla 1). (Castañeda, Pombo, Hernandez, Urueña, & Fiorentino,
2012; Pombo, 2008).
27
Estudios in vitro realizados con la fracción P2Et, sobre células tumorales K562
(eritroleucemia humana), demostraron una disminución de la viabilidad celular con
diferentes cambios morfológicos como la aparición de vesículas intracitoplasmáticas.
Adicionalmente mediante ensayos de citotoxicidad con Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), se observó que esta fracción es citotóxica dosis
dependiente. Al evaluar la inducción de apoptosis sobre esta línea celular, se observó una
pérdida del potencial de la membrana mitocondrial (MMP), con inducción de caspasa 3 y
fragmentación de DNA. Adicionalmente, al evaluar la capacidad proliferativa de las células
in vitro por ensayos de clonogenicidad se observó una disminución significativa en
comparación con el control negativo (Castañeda, Pombo, Hernandez, Urueña, & Fiorentino,
2012; Pombo, 2008).
POSIBLES COMPUESTOS
Ácido 1-O-galoilquinico
ABUNDANCIA RELATIVA
%
162,76
Ácido 3-O-galoilquinico
Ácido 4-O-galoilquinico
Ácido 5-O-galoilquinico
Ácido 3,4-di-O-galoilquinico
38,13
Ácido 3,5-di-O-galoilquinico
Ácido 4,5-di-O-galoilquinico
Ácido 1,3,4-tri-O-galoilquinico
Ácido 1,3,5-tri-O-galoilquinico
15,73
Ácido 1,4,5-tri-O-galoilquinico
Ácido 3,4,5-tri-O-galoilquinico
Pentagaloilglucosa
7,43
Digalato
15,82
Metilgalato
15,98
Metildigalato
3,14
Tabla 1. Compuestos identificados en la fracción P2Et de Caesalpinia spinosa.
Tomado de: (Pombo, 2008)
28
2.7.
Polifenoles con actividad antitumoral presentes en la fracción P2Et.
2.7.1. Pentagaloilglucosa (PGG).
La pentagaloilglucosa (PGG), es un compuesto polifenólico presente en más de setenta
especies de plantas entre ellas la C. spinosa, y se ha reportado actividad biológica en cáncer
de seno, próstata, pulmón, leucemia y melanoma. Los efectos reportados incluyen
actividades proapoptóticas, antiproliferativas, antiangiogénicas y antimetastásicas las
cuáles se deben a múltiples efectos en las células tumorales como arresto en la fase G1 del
ciclo celular, disminución de producción y actividad de MMP, inhibición de receptores de
andrógenos y estrógenos, inhibición del VEGF en las células endoteliales, pérdida del PMM
y activación de la caspasa 3 (Zhang, Li, Kim, Hagerman, & Lu, 2009). En modelos in vivo de
cáncer de próstata con la línea humana PC-3, la PGG inhibió el crecimiento y la invasión de
la línea que fue inoculada vía intra-tibial. En este modelo, el tratamiento fue por vía
intraperitoneal (i.p.), durante 28 días, suprimiendo el peso del tumor de 4,2 gramo (gr) a 1
gr. El mecanismo de acción que se le atribuye es la inhibición del EGFR, reduciendo la
producción MMP-9 que se relaciona directamente con este factor, disminuyendo la
invasividad. Adicionalmente, se ha observado el PGG puede bloquear el receptor de
andrógenos que es un regulador del crecimiento de las células que poseen este receptor,
en cáncer de próstata, y también se ha planteado que la PGG interfiere con las DNA
polimerasas, al inducir arresto en la fase S del ciclo celular. En modelos de cáncer de seno
con la línea MCF-7 in vitro, inhibiendo el EGF-2 y el ER, los dos involucrados en la
angiogénesis y como factor regulador del crecimiento (Zhang, Li, Kim, Hagerman, & Lu,
2009).
La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es una enzima precursora de mediadores de la inflamación y
mediadores pro-angiogenicos como VEGF y PGE2. Recientemente, esta enzima ha sido
involucrada en el crecimiento, metástasis y angiogénesis durante el proceso carcinogénico.
Algunos medicamentos comerciales que inhiben esta enzima tienen efectos colaterales;
por esta razón la búsqueda de compuestos que tengan como blanco terapéutico esta
enzima es de gran importancia. Entre las plantas medicinales, se ha identificado la PGG,
como un compuesto con actividad in vitro en estudios con cultivos celulares utilizando
células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), donde se observó una
inhibición del VEGF. Estudios in vivo utilizando un modelo de cáncer de seno de pulmón
Lewis en ratones C57BL/6, demostraron una supresión del crecimiento del tumor y una
disminución en la proliferación de las células tumorales con inducción de apoptosis, al
inhibirse el VEFG y COX-2. (Huh, y otros, 2005).
2.7.2. Metilgalato.
Los LTr pueden modular la respuesta antitumoral innata y adquirida, fomentando el
crecimiento del tumor primario y facilitando la metástasis. En cáncer, la presencia de LTr
se ha asociado con mal pronóstico. En un modelo murino de linfoma en ratones C57BL/6
con células EL-4 cuyo tumor primario es sólido, el metilgalato redujo la capacidad
funcional de LTr CD4+CD25+ y LTr FOXP3, al disminuir la expresión de CTLA-4, CCR4,
CXCR4, afectando su capacidad supresora y la propiedad de invadir el tumor primario y el
29
parénquima esplénico. Esto, favoreció el tiempo de sobrevida de los murinos que paso de
un lapso entre 38 y 70 días a 90 días con el tratamiento (Lee, y otros, 2010).
30
3. OBJETIVOS
3.1.
OBJETIVO GENERAL:
Evaluar la actividad antitumoral de la fracción P2Et de Caesalpinia spinosa en ratones
BALB/c en un modelo de cáncer mamario murino
3.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.2.1. Estandarizar el modelo de cáncer mamario murino en ratones BALB/c con células
tumorales 4T1.
3.2.2. Determinar la dosis letal (DL 50) de la fracción P2Et de Caesalpinia spinosa en
ratones BALB/c.
3.2.3. Evaluar la actividad antitumoral de la fracción P2Et de Caesalpinia spinosa en la
evolución del cáncer mamario con células 4T1
31
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.
Estandarización del modelo de cáncer mamario murino con células
tumorales 4T1 en ratones BALB/c
4.1.1. Animales
Se emplearon ratones hembras BALB/c, nulíparas e inmunológicamente maduras (6 a 8
semanas de edad) con un peso de 20 a 25 gr. Los ensayos se realizaron según la
legislación nacional e internacional para el uso de animales vivos como sujetos de
experimentación (República de Colombia. Congreso Nacional., Ley 84 de 1987; Republica
de Colombia, Ministerio de Protección Social, Resolución 08430 de 1993). Se emplearon
grupos de 8 ratones para que el estudio sea estadísticamente significativo. Los ratones
fueron identificados con marcas en la cola con tinta indeleble.
4.1.2. Recepción, readaptación y distribución de grupos
Los grupos de ratones luego de la recepción fueron examinados clínicamente y luego se
distribuyeron en grupos al azar y se sometieron a un periodo de adaptación a las
condiciones del bioterio durante un periodo de 7 días.
4.1.3. Condiciones de mantenimiento de los ratones BALB/c
Los animales se mantuvieron en el bioterio de la Universidad Juan N. Corpas en una cabina
aisladora en policarbonato y rejillas metálicas en acero inoxidable. El alimento fue
autoclavado y peletizado a una ración semanal de 35 gr. El agua y el alimento fueron ad
libitum. Los animales estuvieron en condiciones contraladas de temperatura (18 oC),
cambio de cama cada dos días y humedad (70%), con fotoperiodo de 12 horas.
4.2.
Mantenimiento de la línea tumoral 4T1 in vitro
La línea celular 4T1 fue donada por el Dr. Alexander Asea de la Universidad de Texas. La
línea celular fue cultivada en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino
(SFB) al 10%, 2mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina,
0.01M de Hepes, 1 mM de piruvato de sodio en frascos de cultivo tipo roux; se incubaron y
mantuvieron en atmósfera húmeda a 37°C y 5% de CO2. Una vez las células alcanzaron un
80% de confluencia, estas fueron tratadas con tripsina/EDTA y lavadas con buffer fosfato
salino (PBS) a pH 7.2 y resuspendidas en medio suplementado. Para los experimentos en
los ratones se utilizaron células tumorales entre pase 8-11.
32
4.3.
Inoculación de células tumorales en el ratón
Para inocular las células tumorales en los ratones, se utilizó la concentración de 1x105
celulas/µl (Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000), en un volumen de 0.2 mL en el vehículo
de la fracción (Etanol-Agua). Para esto se utilizó un grupos de 8 ratones (con las células
4T1) y un ratón control (sin células tumorales). Para la inoculación, se utilizaron jeringas
de tuberculina con aguja 27G con el bisel hacia arriba de manera que se pudiera ver la
escala y así el volumen a inyectar. Los ratones fueron inmovilizados y se inocularon las
células vía subcutánea (ectópica) debajo del cojinete mamario abdominal izquierdo.
4.4.
Evaluación del crecimiento del tumor
Mediante palpación digital se identificó el inicio del crecimiento del tumor y luego cada
tercer día se midió el diámetro del tumor con un calibrador de vernier y se aplicó la
fórmula: Diámetro= √(eje mayor) (eje menor) (Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000).
4.5.
Toma de muestras y hemogramas
Para realizar los hemogramas, se tomaron muestras de sangre periférica con
anticoagulante de la vena lateral de la cola y se obtuvieron 20 µl de muestra el día de la
inoculación y a los días 8, 15, 22 y 29 post-inoculación. El anticoagulante a usar para los
hemogramas fue EDTA al 0.1%. Las muestras se procesaron utilizando el hemocitometro
ABX MICROS 60®.
4.6.
Eutanasia
Los ratones se eutanasiaron con CO2 y confirmación con el método físico de dislocación
cervical (Republica de Colombia, Ministerio de Protección Social, Resolución 08430 de
1993; American Veterinary Medical Asociation (AVMA), 2007; República de Colombia.
Congreso Nacional., Ley 84 de 1987), cuando el diámetro del tumor alcanzó 16 a 18 mm al
día 30 post-inoculación de las células tumorales (Canadian Council on Animal Care (CCAC),
2010) .
4.7.
Remoción quirúrgica del tumor y toma de muestras para histología
Al final del experimento, a los ratones sacrificados se les realizó necropsia. Se empleó
instrumental de disección y guantes estériles en condiciones de asepsia y antisepsia. Se
procedió a realizar un examen anatomopatológico de los ratones evaluando la condición
de órganos y cavidades en busca de posibles masas compatibles con focos metastásicos;
luego se realizó la extirpación del tumor primario (masa tumoral en glándula mamaria) y
de los siguientes órganos con o sin masas visibles: pulmón, hígado, bazo, cerebro y hueso.
33
4.8.
Diagnóstico histopatológico y conteo de células tumorales
Los diferentes órganos (Pulmón, bazo, hígado y tumor primario) fueron enviados en
envases plásticos de boca ancha, marcados y fijados con formaldehido al 10%. Para las
muestras de hueso se hizo una decalcificación previa sumergiendo los especimenes
(fémur) en una solución de HCl al 5% durante 24 horas. Luego se realizaron técnicas de
deshidratación, aclaració, inclusión en parafina, cortes del tejido mediante microtomo y
finalmente se tiñeron con los colorantes hematoxilina y eosina (H&E). Las muestras fueron
analizadas por un patólogo veterinario, empleando un microscopio de luz en busca de
focos de micrometástasis y otros cambios en los diferentes órganos del estudio. El conteo
de células tumorales se realizo en los cortes histológicos mediante un microscopio de luz
empleando una rejilla micrométrica en el objetivo 40X, la calibración de la rejilla para este
objetivo nos permite obtener el número de células por 1.032 um2.
4.9.
Determinación de la dosis letal (DL 50) de la fracción P2Et de Caesalpinia
spinosa en ratones BALB/c
Ratones BALB/c hembras de 10 semanas de edad, fueron agrupados aleatoreamente en
unidades experimentales de 8 individuos en las condiciones descritas anteriormente.
Posteriormente, los ratones fueron tratados con diferentes dosis de la fracción P2Et, por
vía intraperitoneal (i.p). Se realizó el conteo de animales muertos por dosis cada 24 horas
hasta las 72 horas post-tratamiento. El cálculo de la DL50 se obtuvo utilizando la función
Probit del Minitab (version 14).
4.10. Evaluación de la actividad antitumoral de la fracción P2Et en hembras
BALB/c inoculadas con células tumorales 4T1.
Fundamentado en los resultados de los estudios de toxicidad se obtuvieron 2 dosis las
cuales se emplearon en el actual estudio utilizando 2 diferentes grupos previa adaptación
de los ratones a las condiciones del bioterio e inoculación de las células tumorales (1x104).
Este ensayo se realizó 2 veces en las mismas condiciones, exceptuando el origen de los
ratones. En el primer ensayo se utilizaron ratones de la Universidad de Antioquia en
condiciones libres de patógenos (SPF, Specific Patogens Free) y en el segundo, se
emplearon ratones obtenidos del bioterio del Instituto Nacional de Salud (INS) en
condiciones convencionales de salubridad.
Los grupos y tratamiento se distribuyeron de la siguiente forma:
Grupo A: 8 murinos tratados vía i.p. con 18.7mg/kg de la fracción.
Grupo B: 8 murinos tratados vía i.p. con 9.3 mg/kg de la fracción.
Control C: 8 murinos tratados vía i.p. con el vehículo de la fracción.
Los tratamientos se iniciaron cuando fue perceptible el crecimiento del tumor mediante la
palpación de una masa nodular en el sitio de la inoculación de las células 4T1. Se inició al
día 4 y se continuó cada tercer día durante los 29 días del ensayo, para un total de 8
34
tratamientos. Los tumores se midieron 2 veces por semana hasta el final del tratamiento.
El día 29 se realizo la necropsia y toma de muestras para histopatología como se describió
anteriormente.
4.11. Análisis estadístico
Los datos fueron analizados con un análisis de varianza (ANOVA) a dos vías para los datos
del conteo de leucocitos y diámetro tumoral y para el conteo de células tumorales se
utilizó un ANOVA a una vía. Las diferencias entre los tratamientos y el grupo control se
determinaron mediante las pruebas de Tukey y Bonferroni para las ANOVA a una y dos
vías respectivamente. Se consideraron diferencias significativas entre P<0.05 y P<0.001.
Se empleó el programa GraphPad Prism4®.
35
5.
RESULTADOS
5.1.
Estandarización del modelo de cáncer mamario con células tumorales 4T1 en
ratones hembras BALB/c.
600
Ratón 1 Día 4
Ratón 2 Día 7
Ratón 3 Día 14
Ratón 4 Día 21
Ratón 5 Fallece Día 13
Ratón 6 Día 21
Ratón 8 Día 21
400
200
o
ue
s
H
er
eb
ro
C
íg
ad
o
H
Pu
lm
B
ón
0
az
o
Células tumorales/1024 um2
Se utilizaron 8 ratones BALB/c hembras de 8 semanas de edad previamente adaptadas a
las condiciones del bioterio. En base a los antecedentes del modelo publicado por OstrandRosenberg, la dosis a inocular que se escogió fue de 1x105 células/μl en el cojinete
mamario izquierdo (Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000). Después de la inoculación los
ratones se sacrificaron, y se les realizó la necropsia. Las muestras se enviaron para estudio
histológico con el siguiente protocolo: los días 4, 7 y 14 (un ratón por día) y el día 21 (3
ratones). Al día 7 post-inoculación, se observó en los cortes histológicos, metástasis de las
células tumorales al bazo, De igual forma, a los días 14 y 21, se observaron células
tumorales en el parénquima pulmonar, hepático y esplénico, en mayor número al día 21.
(Figura 1).
Figura 1. Las células tumorales 4T1 hacen metástasis a órganos distantes desde los
7 días pos-inoculación. Ratones BALB/c fueron inoculados con 1X105 células/ µl. Los
ratones fueron numerados aleatoriamente y se realizó la necropsia de manera secuencial
para identificar el momento en que se iniciaba la metástasis a partir de la inoculación de
las células 4T1. Se realizaron cortes histológicos de bazo, pulmón, hígado y hueso, se
observaron alteraciones histológicas y las células tumorales infiltrantes se identificaron y
contaron utilizando una rejilla micrométrica en microscopio de luz con un aumento de
40X.
Adicionalmente, se realizó el conteo de megacariocitos (como se describe en la
metodología) en el parénquima esplénico, donde se evidenció su presencia desde los 7
36
Megacariocitos/1024 um2
días post-inoculación y se observó un aumento hasta el final del experimento (día 21 postinoculación). Este aumento podría deberse a un fenómeno de hematopoyesis
extramedular que se ha relacionado con la reacción leucemoide inducida en este modelo
(duPré et al, 2007) (Figura 2). No se observó evidencia de metástasis a hueso ni cerebro
en ningún individuo.
20
15
Ratón 1
Ratón 2
Ratón 3
Ratón 5
Ratón 6
Ratón 8
10
5
0
4
7
14
13
21
21
(Día)
Fallecido
Días pos-inoculación
Figura 2. Las células tumorales 4T1 aumentan el número de megacariocitos en bazo
desde los 7 días post-inoculación. Ratones BALB/c fueron inoculados con 1X105
células/ µl. Luego de la inoculación de las células tumorales en el cojinete mamario, se
evaluó mediante la observación microscópica a partir de cortes histológicos esplénicos, la
presencia de megacariocitos por área.
Para saber si las células tumorales inducían leucocitosis con conteos superiores a 50.000
células/ul, se realizaron hemogramas a partir de sangre periférica tomada en la vena
caudal de la cola, encontrando leucocitosis superiores a este número en la segunda y
tercera semana pos-tratamiento, en el cual uno de los sujetos se acercó a los 150.000
células/ul (figura 3).
Finalmente, se midió en diámetro del tumor primario como se describió en la metodología
(Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000), y encontramos que el tumor fue palpable y medible
desde el día 4 pos-inoculación, hubo una disminución de tamaño hacia la segunda semana,
siendo concordante en otra estandarización de este mismo modelo (Tao, Fang, Alroy, &
Sahagian, 2008), y continuo su crecimiento hasta llegar a los 15mm de diámetro en el día
21.
37
Leucocitos/ul
150
Ratón 2
Ratón 3
Ratón 4
Ratón 6
Ratón 8
100
50
0
7
14
(Día)
21
Post-inoculación
Figura 3. Se observa Leucocitosis superiores a 50.000 células/ul en sangre
periferica, entre el día 14 y 21 post-inoculación. Ratones BALB/c fueron inoculados
con 1X105 células/ µl, luego se tomaron muestras de sangre periférica en la vena lateral de
la cola y se analizaron en hemocitometro. Las muestras se tomaron los días 7, 14 y 21
post-inoculción de las células tumorales 4T1.
Diametro (mm)
15
Ratón 4
Ratón 6
Ratón 8
10
5
0
0
4
7
10
12
14
17
19
21
Días Post-inoculación
Figura 4. El tumor primario comienza a ser palpable a partir del día 4 post-inoculación y
llega a los 15 mm de diámetro en el día 21 post-inoculación. Ratones BALB/c fueron
inoculados con 1X105 células/ µl. Luego se midieron los ejes del tumor mediante un calibrador
de vernier y se calculó el diámetro con la formula reportada por Ostrand-Rosenberg y
colaboradores en el 2000; los diámetro se midieron cada dos días, finalizando al día 21 donde
llegaron a los 15 mm de diámetro.
38
5.2.
Dosis Letal 50 (DL50).
La DL50 se calculó utilizando 0 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml y 8 mg/ml de la
fracción P2Et por vía intraperitoneal (i.p) en 0.1 ml de PBS. Teniendo en cuenta el conteo
de animales muertos por dosis a las 72 horas post-tratamiento y después de realizar los
análisis con la función probit (versión 14) del software MINITAB. Se obtuvo una
concentración letal de 1,74 mg/ml. Esto expresado en función del peso promedio de los
ratones BALB/c (25 gr), nos da un valor DL 50 de 69.4 mg/kg. (Figura 5)
P2Et
0 mg/ml
1 mg/ml
(40mg/kg)
5
2mg/ml
(80mg/kg)
5
4 mg/ml
(160mg/kg)
8 mg/ml
(320mg/kg)
5
5
5
Muertos 72 Horas Pos-tratamiento
0
1
3
5
5
Figura 5. Esquema del ensayo de toxicidad aguda con la fracción P2Et en ratones
BALB/c. Ratones BALB/c fueron tratados con diferentes dosis de la fracción P2Et (0, 1, 2,
4 y 8 mg/ml) por 72 horas. El conteo de animales muertos fue realizado al final del
tratamiento en cada grupo.
39
5.3.
Establecimiento del modelo de cáncer mamario murino en ratones BALB/c
hembras y tratamiento con la fracción P2Et.
5.3.1. La fracción P2Et disminuye la evolución del tumor primario en los grupos
tratados en los dos ensayos.
Previamente, nuestro grupo reportó que la fracción P2Et está compuesta por diferentes
compuestos polifenólicos, y presenta actividad in vitro sobre células K562 y 4T1, con
despolarización de la membrana mitocondrial, activación de caspasa 3 y disminución en la
capacidad clonogénica de las células tumorales (Castañeda, Pombo, Hernandez, Urueña, &
Fiorentino, 2012; Urueña, y otros, 2013; Pombo, 2008). Esta actividad in vitro, nos llevó a
pensar en un posible efecto in vivo utilizando el modelo de cáncer de seno murino en
ratones BALB/c.
Una vez determinada la DL50 (69,4 mg/kg), según las recomendaciones de la guía de la
OECD para ensayos de toxicidad, la dosis terapéutica óptima para realizar los ensayos in
vivo debe estar entre 2 y 4 dosis por debajo de la DL50 ((OECD), Draft Updated Test
Guideline 407, 2007). Teniendo en cuenta lo anterior las dosis empleadas fueron de 18,7
mg/kg y 9,3 mg/kg. Para los tratamientos, se crearon 3 grupos (A, B y C), como se indicó
en la metodología. Para estos ensayos se utilizaron 1x104 células tumorales, se evaluó el
diámetro del tumor primario como parámetro de evolución, y se realizaron los
tratamientos cada tercer día.
Como se observa en la figura 6 , los tumores de los 2 grupos de ratones tratados con P2Et
evolucionaron más lentamente en comparación con el grupo control, a partir del día 14,
siendo estas diferencias estadísticamente significativas a los días 24 y 28 (p<0.001). Estos
experimentos fueron realizados 2 veces, como se describió en la metodología con ratones
provenientes de condiciones SPF y el otro con ratones provenientes de condiciones
convencionales de salubridad. Al final del tratamiento (día 29), la diferencia en el diámetro
tumoral fue significativa solo entre el grupo control y el grupo a dosis de 18,7 mg/kg con
ratones en condiciones libres de patógenos.
En el experimento con ratones en condiciones sanitarias convencionales (Figura 7)
realizado con los ratones provenientes del INS, se observan diferencias significativas a
partir del 17 día post-inoculación entre el grupo control y el grupo tratado con la menor
dosis de P2Et, (grupo B) (p<0.01). Al día 21y 24 post-inoculación las diferencias en la
evolución del tumor fueron significativas para las dos dosis utilizadas y se mantuvieron
hasta el final del experimento (p<0.001). Las dos dosis de P2Et presentaron la misma
actividad sin diferencias significativas entre ellas.
40
***
p>0.001
***
p<0.001
***
p<0.001
p<0.001
20
Diámetro (mm)
***
C. Control
A.18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
15
***
p<0.001
10
5
0
0
3
7
10
14
17
21
24
28
30
Días Post-inoculación
Figura 6. La fracción P2Et retrasa la evolución del tumor en ratones SPF. Células
tumorales 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo en
ratones hembra BALB/c, y se evaluó la evolución del diámetro tumoral desde el momento
de la inoculación hasta terminar el experimento. Los grupos se trataron con 2 dosis de
P2Et (Grupo A: 18.7 mg/kg y Grupo B: 9.3 mg/kg) o sin tratamiento (Grupo C: Vehículo).
La significancia estadística se evaluó por medio de un ANOVA a dos vías con una
significancia de ***p<0.001.
41
***
***
p<0.001
p<0.001
***
20
p<0.001
***
18
C. Control
16
Diámetro (mm)
***
***
p<0.001
A.18.7 mg/kg
**
p<0.01
**
14
B. 9.3 mg/kg
**
12
p<0.01
p<0.01
10
8
6
4
2
0
0
3
7
10
14
17
21
24
28
32
Días Post-inoculación
Figura 7. La fracción P2Et retrasa la evolución del tumor primario en ratones
BALB/c con condiciones sanitarias convencionales. Células tumorales 4T1 (1x104)
fueron inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo de ratones BALB/c
hembras. Se evaluó la evolución del tumor primario a través del tiempo. Se crearon 3
grupos, Grupo A: 18.7mg/kg, Grupo B: 9.3mg/kg, Grupo C: Vehículo. La significancia
estadística se evaluó por medio de un ANOVA a dos vías con una significancia de
***p<0.001 y **p<0.01. Este experimento se realizó en las mismas condiciones utilizadas
en los ratones SPF.
5.3.2. La fracción P2Et disminuye el peso del tumor primario.
El tumor primario de este modelo se clasifica histológicamente como un tumor sólido, es
decir, que está compuesto por células tumorales, estromales e inflamatorias y densas
capas de tejido conectivo, además de áreas necróticas (Liao D, 2009). Esto en conjunto
puede afectar la masa del tumor. Por esta razón, para evaluar el efecto de la fracción P2Et
sobre el peso del tumor primario, se realizó una escisión radical del tumor al final del
experimento durante la necropsia de los animales y se pesó en balanza analítica tomando
valores con cuatro cifras significativas. En el experimento con ratones SPF, como se
muestra en la figura 8, se ve una diferencia estadísticamente significativa (p<0.0001) entre
el peso de los tumores primarios del grupo A vs el control. Aunque la diferencia entre el
grupo B vs el control fue menor, esta diferencia es estadísticamente significativa
(p<0.001). Adicionalmente, no hubo diferencias estadísticas al comparar las dos dosis de
tratamiento.
42
En el experimento con ratones convencionales, se presentó diferencia estadísticamente
significativa entre el grupo B y el control (*p<0.05). Para el grupo A se observó una
tendencia que sugiere diferencias entre este y el grupo control aunque no es
estadísticamente significativa. (Figura 8). Estos resultados demuestran que la fracción
estudiada tiene un efecto sobre el peso del tumor primario, que podría deberse a una
menor proliferación de células tumorales o incluso a una respuesta inflamatoria
disminuida, con menor migración de células o disminución del tejido conectivo.
Si tenemos en cuenta las diferencias entre los 2 experimentos realizados, podríamos
suponer que en el primer grupo (SPF), la respuesta inmune cruzada o la activación previa
del sistema inmune no debería estar jugando un papel importante. En este experimento, se
observan diferencias mayores entre el peso del tumor luego del tratamiento, debido
posiblemente al efecto del P2Et, ya sea sobre el microambiente tumoral, sobre el tumor
primario o sobre los dos. En contraste, en el realizado con ratones convencionales (Figura
9), en los cuales no hay evaluación del estatus sanitario y son animales mantenidos en
condiciones completamente convencionales, expuestos a aire no filtrado, no se observan
diferencias significativas en el peso del tumor, lo que podría sugerir una mayor infiltración
de células del sistema inmune, o incluso un sistema inmune pre-activado. Sería
conveniente evaluar el tipo de infiltrado en cada tumor para determinar si el peso del
tumor es debido a un mayor crecimiento de las células tumorales, a la presencia de un
mayor infiltrado inflamatorio o a la modificación de la red de colágeno y por ende del
microambiente tumoral.
**
***
Gramos
3
p<0.001
p<0.0001
2
1
0
Control
18.7 m g/kg
9.3 m g/kg
Figura 8. La fracción P2Et disminuye el peso del tumor primario en ratones BALB/c
(SPF). Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el cojinete mamario izquierdo de ratones
hembras Balb/c. Los ratones fueron tratados con diferentes dosis de la fracción P2Et
(grupo A y grupo B) o con el control negativo (grupo C). Una vez finalizado el tratamiento,
43
se extirpo el tumor y se peso en balanza analítica. Se realizó un ANOVA a una vía y la
prueba de Tukey (***, ** P<0.0001) para observar diferencias respecto al control.
*
Gramos
3
p<0.05
2
1
0
Control
18.7 mg/kg
9.3 mg/kg
Figura 9. La fracción P2Et disminuye el peso del tumor primario en ratones BALB/c
(condiciones sanitarias convencionales). Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el
cojinete mamario abdominal izquierdo de ratonas BALB/c. Los ratones fueron divididos
en 3 grupos y tratados con diferentes dosis de la fracción p2Et (Grupo A: 18.7 y Grupo B:
9.3 mg/kg) o Grupo C: Vehículo. Al final del experimento (día 30), los animales fueron
sacrificados y el peso del tumor primario fue calculado. Las diferencias significativas entre
los diferentes grupos se calcularon realizando un ANOVA a una vía utilizando como posttest la prueba de Tukey (* P<0.05).
5.3.3. La fracción P2Et disminuye la reacción leucemoide en ratones BALB/c con
cáncer de seno mamario murino.
La reacción leucemoide, característica de este modelo, se ha definido como una
leucocitosis superior a 50.000 células/μl con origen extramedular y se relaciona con la
presencia de megacariocitos en el parénquima esplénico (du Pre et al, 2006; Kai Tao et al,
2008). Para evaluar si la fracción P2Et afectaba el recuento de leucocitos en sangre
periférica en los ratones BALB/c con cáncer de seno murino, después de los diferentes
tratamientos, se realizaron conteos semanales en los 3 grupos, y las diferencias se
analizaron utilizando un ANOVA a dos vías utilizando como post-test la prueba de
Bonferroni. En los dos experimentos se observó leucocitosis superior a 50.000 células/μl
en los animales control al día 30. Después del tratamiento con la fracción P2Et, se observó
una disminución estadísticamente significativa, con las 2 dosis empleadas (grupo A
(p<0,001) y grupo B (p<0,01)) (Figura 10). En el experimento donde se emplearon ratones
con estatus sanitario convención, se observó también una disminución de la leucocitosis al
día 28, en respuesta al tratamiento con P2Et, aunque esta fue significativa solo para el
grupo B (p<0,001) (Figura 11).
44
103 Leucocitos/ul
**
140
C. Control
120
A.18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
100
P<0.01
***
P<0.001
80
60
40
20
0
0
8
16
22
30
Días Post-inoculación
Figura 10. La fracción P2Et disminuye la reacción leucemoide en ratones BALB/c
(SPF). Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo
de ratonas BALB/c. A los días indicados, se realizó conteo de leucocitos en sangre
periférica, a partir de sangrías en la venal lateral de la cola. Se realizaron comparaciones
entre los grupos tratados (Grupo A: 18.7 mg/kg y Grupo B: 9.3 mg/kg) y el control (Grupo
C: Vehículo). Se utilizó un ANOVA a dos vías y prueba de Bonferroni para la significancia
estadística. ***p<0.001 - **p<0.01.
45
***
p<0.001
140
103 Leucocitos/ul
120
100
C. Control
A.18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
80
60
40
20
0
0
7
14
21
28
Días Post-inoculación
Figura 11. La fracción P2Et disminuye la reacción leucemoide en ratones BALB/c
(condiciones sanitarias convencionales). Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el
cojinete mamario abdominal izquierdo de ratonas BALB/c. A los días indicados, se realizó
conteo de leucocitos en sangre periférica semanal a partir de cortes en la vena lateral de la
cola. Se realizaron comparaciones entre los grupos tratados y el control. Se utilizó un
ANOVA a dos vías y prueba de Bonferroni para la significancia estadística. ***p<0.001.
Para evaluar la presencia de hematopoyesis extramedular inducida por la presencia del
tumor, así como el efecto de la terapia con la fracción P2Et sobre este fenómeno; se
determinó la presencia y el número de megacariocitos en cortes histológicos esplénicos en
los grupos tratados y en el grupo control. En el experimento realizado con ratones SPF
(figura 12), se observó una diferencia estadísticamente significativa en el número de
megacariocitos/μm2 presentes entre el grupo A y el control (p<0.05). Con respecto al
grupo B, se observaron diferencias, pero los datos no fueron significativos. En el
experimento con ratones en condiciones convencionales (figura 13), no se observaron
diferencias estadísticamente significativas, aunque se observan diferencias entre las
medias de los grupos tratados respecto a la del control, demostrando que la fracción P2Et,
influye en la hematopoyesis inducida por la línea 4T1 disminuyendo la producción de
estas células en el parénquima esplénico. En los dos experimentos las diferencias se
analizaron con un ANOVA a una vía y prueba de Tukey para comparar los grupos.
46
*
Megacariocitos/1024 um2
15
C. Control
A. 18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
p<0.05
10
5
0
C
A
B
Megacariocitos/1024 um
2
Figura 12. La fracción P2Et disminuye el número de megacariocitos en bazo (SPF).
Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo de
ratonas BALB/c. Al final del experimento (día 30) se contaron los megacariocitos en cada
uno los grupos a partir de cortes histológicos de bazo obtenidos al momento de la
necropsia. El conteo se realizó mediante microscopía utilizando una rejilla micrométrica.
Se analizaron los resultados mediante un ANOVA a una vía y se compararon mediante la
prueba de Tukey. *p<0.05.
4
C. Control
A. 18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
3
2
1
0
C.
A.
B.
Figura 13. La fracción P2Et no afecta el número de megacariocitos en bazo
(condiciones convencionales). Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el cojinete
mamario abdominal izquierdo de ratonas BALB/c. Al final del experimento se contaron los
47
megacariocitos en cada uno los grupos a partir de cortes histológicos de bazo obtenidos al
momento de la necropsia. Se analizaron los resultados mediante un ANOVA a una vía y se
compararon mediante la prueba de Tukey. No se encontraron diferencias estadísticas
significativas.
5.3.4. La fracción P2Et disminuye el número de células tumorales en el tumor
primario.
Para evaluar si la fracción tiene algún efecto directo sobre el tumor primario además del
diámetro tumoral, evaluamos el número de células tumorales presentes en el. Se realizó el
conteo de células tumorales en los cortes histológicos del tumor obtenido durante la
necropsia, como se describió en la metodología. En el experimento con ratones SPF
(Figura 14) se observaron diferencias entre las medias de los grupos tratados respecto al
grupo control pero no son estadísticamente significativas. En el experimento con ratones
convencionales (Figura 15) se presentó una diferencia significativa entre los grupos
tratados y el control (p<0.05), analizada por un ANOVA a una vía y prueba de Bonferroni.
La disminución en el número de células tumorales en el segundo experimento, y no en el
primero, debe ser evaluada teniendo en cuenta, nuevamente la proveniencia de los
animales como se mencionó anteriormente. Esta disminución teniendo en cuenta los
componentes de la fracción y las actividades reportadas en modelos tumorales, podría
deberse a apoptosis intratumoral inducida por la fracción o citotoxicidad por células
inmunológicas infiltrantes activadas.
Células/1024 um2
2000
C. Control
A. 18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
1500
1000
500
0
Tumor Primario
Figura 14. La terapia con P2Et no afecta el número de células tumorales en el tumor
primario en ratones BALB/c (SPF). Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el cojinete
mamario abdominal izquierdo de ratonas BALB/c. Las células tumorales se contaron en
48
los cortes histológicos coloreados con H&E. Las diferencias entre los grupos se analizaron
utilizando un ANOVA a una vía y prueba de Bunferroni. No se observaron diferencias
significativas.
Células/1024 um2
1000
**
***
800
C. Control
A. 18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
600
400
200
0
Tumor Primario
Figura 15. La fracción P2Et disminuye el número de células tumorales en los
ratones BALB/c (condiciones sanitarias convencionales). Células 4T1 (1x104) fueron
inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo de ratonas BALB/c. Al día 30 del
experimento luego de la eutanasia, a los animales se les realizó escisión de los tumores
primarios y se les realizaron cortes histológicos coloreados con H&E, mediante
microscopia utilizando una rejilla micrométrica se contaron las células tumorales a un
aumento de 40X. Las diferencias entre los grupos se analizaron utilizando un ANOVA a
una vía y prueba de Bunferroni. Se observaron diferencias significativas entre el grupo a
dosis de 18.7mg/kg (***p<0.05), 9.3mg/kg (**p<0.05) y el grupo control.
5.3.5. La fracción P2Et disminuye la metástasis a órganos parenquimatosos.
La metástasis a órganos distantes parenquimatosos es una característica de este modelo
simulando lo que se observa en el cáncer mamario humano en estadio IV. Esta
característica, nos permitió evaluar el efecto de la fracción sobre las metástasis en órganos
como pulmón, hígado y bazo, según se describió en la metodología. En la figura 16 se
muestra el experimento con ratones SPF, en cual se aprecia la reducción en el número de
células metastásicas en los tres órganos evaluados con diferencias significativas (p<0.05).
Siendo más acentuada en el bazo entre el grupo tratado a la dosis alta y el control. En la
Figura 17 se muestra el experimento en animales SPF en el que a pesar de no haber
diferencias estadísticas se ven tendencias que muestran una reducción en el número de
células metastásicas en los órganos de los animales tratados con respecto al control.
El análisis detallado de los cortes histológicos de los diferentes órganos de los ratones
BALB/c SPF, nos permitió observar como se aprecia en la Figura 18, infiltración por
49
células metastásicas (flechas blancas), en el corte de pulmón normal se observan los
septos alveolares delgados y con mínima infiltración celular, el control muestra un foco
compuesto por células tumorales y aunque en los cortes de los tratados con la fracción hay
presencia de células tumorales en los septos, el grosor y la infiltración de células
polimorfonucleares y tumorales es mayor en los tratados a dosis de 9.3 mg/kg. En hígado,
se observan pequeños focos de células tumorales, presentes en mayor número en los
tratados a dosis de 9.3 mg/kg y más numerosos en el control. En bazo, se observa
infiltración de células tumorales en la pulpa roja y aumento en su tamaño comparado con
el tejido normal, la infiltración es menor en los tratados a dosis de 18.7mg/kg. En glándula
mamaria, se observan diferencias estructurales marcadas como, perdida de la arquitectura
normal en todos los tratados y el control, el tejido glandular y graso en reemplazado por
un estroma fibroso y un elevado número de células tumorales, en los tratados a dosis de
18.7mg/kg, se observan más áreas necróticas y piocitos (flechas negras punteadas) que en
los otros grupos, además los tratados presentan más áreas libres de células tumorales,
compuestas por adipocitos que el control (flechas negras).
En el grupo de ratones BALB/c provenientes de condiciones convencionales (figura 19) ,en
pulmón se aprecia mejor la estructura de los septos alveolares (flechas blancas
punteadas), de menor tamaño en los tratados a dosis de 18.7mg/kg, debido a menor
cantidad de células tumorales y polimorfonucleares infiltrantes, además las figuras
mitóticas signo de malignidad también son menos frecuentes (círculos blancos). En hígado
y bazo, las células tumorales infiltrantes están en menor número y las figuras mitóticas
también son menos frecuentes en los tratados a dosis de 18.7mg/kg. En glándula mamaria,
aparte de la pérdida de la arquitectura normal del tejido, la infiltración por células
tumorales en los tratados y el control es alta, aunque son frecuentes las figuras mitóticas
en el control a diferencia de los tratados, y en estos últimos podemos encontrar adipocitos
y mayor cantidad de tejido fibroso entre las células tumorales.
Células tumorales/1024 um2
**
1400
1200
1000
800
p<0.05
*
*
C. Control
A. 18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
p<0.05
*
600
*
p<0.05
*
400
200
0
Bazo
Pulmón
Hígado
50
Células tumorales/1024 um2
Figura 16. La fracción P2Et disminuye el número de células tumorales por órgano
en ratones BALB/c (SPF). Células 4T1 (1x104) fueron inoculadas en el cojinete mamario
abdominal izquierdo de ratonas BALB/c. Al finalizar el experimento (Día 30), los ratones
fueron eutanasiados, se realizó necropsia y se tomaron muestras de tumor primario, bazo,
pulmón e hígado. A partir de cortes histológicos de dichos órganos se contaron las células
tumorales en los grupos tratados y el control, se realizó un ANOVA a una vía y prueba de
Bunferroni. Hubo diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos y el grupo
control en los tres órganos evaluados. *p<0.05, **p<0.05.
150
C. Control
A. 18.7 mg/kg
B. 9.3 mg/kg
100
50
0
Bazo
Pulmón
Hígado
Figura 17. La fracción P2Et no disminuye el número de células tumorales por
órgano en ratones BALB/c (Condiciones sanitarias convencionales). Células 4T1
(1x104) fueron inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo de ratonas
BALB/c. Al finalizar el experimento (Día 30), los ratones fueron eutanasiados, se realizó
necropsia y se tomaron muestras de tumor primario, bazo, pulmón e hígado. A partir de
cortes histológicos se contaron las células tumorales en los grupos tratados y el control, se
realizó un ANOVA a una vía y prueba de Bonferroni. No hubo diferencias estadísticas
significativas entre los tratamientos y el grupo control, aunque se observan tendencias que
muestran que los tratados a dosis de 18.7 mg/kg, tuvieron menos células metastásicas que
el grupo control.
51
Normal
Control
P2Et
18.7 mg/Kg
P2Et
9.3 mg/Kg
Pulmón
Hígado
Bazo
Glándula
Mamaria
Figura 18. Diferencias histológicas entre los órganos sometidos al estudio
comparando individuo normal (sin tratamiento), control (tratado con el vehículo de
la fracción) y tratados con la fracción P2Et. Aumento 10X. Células 4T1 (1x104) fueron
inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo de ratonas BALB/c, al finalizar el
experimento (Día 30), los ratones fueron eutanasiados, al momento de la necropsia se
tomaron muestras de tumor primario, pulmón, hígado y bazo, para luego ser fijadas,
cortadas y teñidas con H&E. Se observaron en microscopio de luz. Las flechas blancas
muestran infiltración por células metastásicas, las flechas negras muestran adipocitos y las
flechas negras punteadas muestran áreas necróticas y piocitos.
52
Normal
Control
P2Et
18.7 mg/Kg
P2Et
9.3 mg/Kg
Pulmón
Hígado
Bazo
Glándula
mamaria
Figura 19. Diferencias histológicas entre los órganos sometidos al estudio
comparando individuo normal(sin tratamiento), control(tratado con el vehículo de
la fracción) y tratados con la fracción P2Et. Aumento 100X. Células 4T1 (1x104)
fueron inoculadas en el cojinete mamario abdominal izquierdo de ratonas BALB/c, al
finalizar el experimento (Día 30), los ratones fueron eutanasiados, al momento de la
necropsia se tomaron muestras de tumor primario, pulmón, hígado y bazo, para luego ser
fijadas, cortadas y teñidas con H&E. Las flechas blancas muestran células tumorales
infiltrantes, las flechas blancas punteadas muestran los septos y los círculos blancos
figuras mitóticas. Se observaron en microscopio de luz.
53
6.
Discusión
En este trabajo estandarizamos el modelo de cáncer de seno murino metastásico
utilizando la línea tumoral 4T1 en ratones BALB/c. De igual forma evaluamos la actividad
antitumoral de una fracción obtenida de Caesalpinia spinosa (P2Et) en este modelo, la cual
ha sido utilizada tradicionalmente para el tratamiento del cáncer por los Wayu en el norte
de país.
Muchos de los descubrimientos de medicamentos derivados de plantas se han basado en
el conocimiento tradicional, permitiendo la selección dirigida de plantas que han sido
benéficas para la humanidad a través del tiempo. En el campo de la investigación contra el
cáncer, se han concentrado grandes esfuerzos en proyectos de identificación y aislamiento
de moléculas activas a partir de productos naturales (PN), al punto de que más del 60% de
los medicamentos aprobados contra el cáncer por la FDA entre 1983 y 1994 provienen de
PN (Cragg & Newman, 2005). La utilidad de los PN como fuente de nuevas estructuras,
pero no necesariamente como el producto final, sigue siendo activamente utilizada. Desde
1940 y hasta la fecha, de 175 pequeñas moléculas, 85 o lo que corresponde al 48.6% son
de origen natural o derivados de ellos (Newman & Cragg, 2012). Entre los metabolitos
obtenidos a partir de plantas con actividad antitumoral más conocidos están los alcaloides
vinblastina y vincristina aislados del arbusto Catharantus roseus, el paclitaxel obtenido a
partir de la corteza del árbol Taxus brevifolia L., la podofilina aislada de varias especies del
género Podophyllum y la camptotecina aislada del árbol Campthotheca accuminata
(Hsiang et al., 1985; Jordan, Thrower, and Wilson, 1991; Mukherjee et al., 2001). Si bien es
cierto que los medicamentos antitumorales obtenidos de plantas se han desarrollado
principalmente luego de separar los componentes que presentan actividad antitumoral,
para utilizarlos en forma independiente, esta actividad se mantiene principalmente
cuando estos componentes actúan en sinergia, lo que ha motivado al uso de fracciones
complejas en estas terapias.
La validación biológica de esta actividad, debe ser llevada a cabo utilizando la misma
rigurosidad que para los medicamentos alopáticos. Particularmente en nuestro medio era
una necesidad contar con modelos animales que permitieran evaluar la eficiencia de estas
preparaciones herbales y estudiar más a fondo los mecanísmos que participan en el
control del tumor en caso que se presente. En el grupo de Inmunobiología, donde se
desarrolló el presente trabajo, escogimos estandarizar el modelo de cáncer de seno
murino dado que la incidencia y prevalencia de esta enfermedad es alta en nuestro país y
adicionalmente, porque el modelo escogido con ratones BALB/c inoculados
ortotópicamente con células 4T1 semeja la patología en humanos (Ostrand-Rosenberg &
Pulaski, 2000; Baliga, Meleth, & Katiyar, 2005; duPre' & Hunter Jr, 2007; Tao, Fang, Alroy,
& Sahagian, 2008)
Las células tumorales 4T1 cuando son inoculadas por vía ortotópica o subcutánea en el
cojinete mamario desarrollan metástasis espontánea desde la segunda semana postinoculación, a órganos parenquimatosos como pulmón, hígado y bazo, aseverando que es
un tumor altamente metastásico como lo reportó duPré S y col en el 2008. Estas
54
características metastásicas hacen que este modelo murino se asemeje al cáncer mamario
humano en estadio IV (Aslakson & Miller, 1992; duPre' & Hunter Jr., 2008; Tao, Fang,
Alroy, & Sahagian, 2008).
En este trabajo se realizó inicialmente un experimento donde utilizamos 1X105 células
tumorales, basados en los reportes de estandarización del modelo que van desde 1x103
hasta 1x107 células 4T1 (Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000; duPre' & Hunter Jr, 2007;
Danna, y otros, 2004; Aslakson & Miller, 1992; Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008), en
donde observamos metástasis a partir del día 7 a bazo y en el día 14 y 21 a hígado y
pulmón. Encontramos además leucocitosis superior a 50.000 células/μl a partir del día 14
y en una de las ratonas se acercó a las 150.000 células/μl. En cuanto al tumor primario, fue
medible desde el día 4 pos-inoculación y alcanzó los 15 mm de diámetro a los 21 días, con
lo cual nuestro modelo a la dosis que elegimos mostro el crecimiento del tumor primario
ortotópico, con metástasis secuencial a órganos parenquimatosos (no se observó en hueso
ni cerebro), y se observó una reacción leucemoide con conteos de leucocitos superiores a
50.000 células/μl, con presencia de megacariocitos en la pulpa roja esplénica, todo
concordante con otros reportes de este modelo (Ostrand-Rosenberg & Pulaski, 2000;
Aslakson & Miller, 1992; Lelekakis, y otros, 1999; duPre' & Hunter Jr, 2007; Tao, Fang,
Alroy, & Sahagian, 2008). A diferencia de otros estudios encontramos que el tiempo en que
se desarrolló la metástasis fue muy rápido (Pulaski & Ostrand-Rosenberg, 1998; duPre' &
Hunter Jr, 2007; Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008; Baliga, Meleth, & Katiyar, 2005), Y no
nos permitiría observar adecuadamente la evolución del tratamiento con P2Et, a través del
tiempo; por ello para los experimentos en los cuales tratamos con la fracción P2Et,
disminuimos la dosis de células tumorales a 1x104.
En este modelo ha sido descrito que las células tumorales del tumor primario se
encuentran distribuidas uniformemente y con escasa matriz extracelular; las mismas
características histológicas reportadas para un tumor sólido humano con alta celularidad,
uniforme, escasa matriz extracelular y algunos con áreas necróticas (Oelze, O’Brien Jr,
Blue, & Zachary, 2004; Liao, Luo, Markowitz, Xiang, & Reisfeld, 2009). Algunos estudios
han descrito que las células tumorales 4T1 evaden la respuesta inmune antitumoral
porque secretan factores de crecimiento que producen de manera constitutiva y
adicionalmente por el microambiente que desarrollan en conjunto con las células
inflamatorias infiltrantes. De hecho, la producción de algunos factores de crecimiento
como GM-CSF y G-CSF por las células tumorales promueve la infiltración de células
supresoras mieloides Gr+CD11b+ (CSM) y linfocitos T reguladores (LTr) que finalmente
favorecen la progresión tumoral al inhibir directamente los LT CD4+ y CD8+ (Bunt, Sinha,
Clements, Leips, & Ostrand-Rosenberg, 2006; Ko, y otros, 2010; Ko, y otros, 2010; duPre' &
Hunter Jr, 2007; Magdalena A. Cichon, 2010; Olkhanud, y otros, 2009). Los LTr en modelos
de cáncer murino incluyendo el 4T1, así como en canceres humanos, se han encontrado
infiltrando nódulos linfático regionales y también masas tumorales primarias y
metastásicas (Chaput, y otros, 2007). La inducción de tolerancia por los LTr en el modelo
4T1 en la progresión tumoral, se atribuye a la coexpresión de moléculas GITR, CTLA-4 y
secreción de IL-10 (Chaput, y otros, 2007), inhibiendo directa e indirectamente los LT
CD4+ y CD8+ (Olkhanud, y otros, 2009).
55
Por otra parte, se ha encontrado que los LTr CCR4+ infiltran y favorecen la metástasis a
parénquima pulmonar a diferencia de las CSM las cuales son importantes en el desarrollo
del microambiente tumoral, aunque también participan en la metástasis (Olkhanud, y
otros, 2009). En la inmunidad innata, los LTr CCR4+ en el modelo 4T1, pueden interferir
en la inmunidad antitumoral mediada por células natural killer (NK), debido a la alta
producción de la citoquina (β-galactoside binding protein) βGBP, la cual es un factor de
crecimiento celular negativo que induce arresto del ciclo celular y apoptosis. Lo anterior
muestra la importancia de este modelo, debido a que en cáncer mamario humano estadio
IV, se han encontrado reducidos niveles de células NK y CD8+ (Olkhanud, y otros, 2009).
Aunque en este trabajo no evaluamos estos parámetros inmunológicos, el conocimiento de
los mismos nos permitirá a futuro evaluar los cambios en la respuesta inmune inducidos
por diferentes tipos de terapias.
Al evaluar el efecto de la terapia en el modelo de 4T1 observamos disminución en el
tamaño y peso del tumor primario en los grupos tratados con la fracción P2Et, lo cual se
puede atribuir a la presencia de algunos compuestos en la fracción P2Et como los
polifenoles. Diferentes compuestos de este grupo han sido aislados a partir de otras
plantas como por ejemplo el té negro, el té verde y la cáscara de uva entre otros, y su
actividad antitumoral ha sido previamente demostrada (Baliga, Meleth, & Katiyar, 2005;
Sun, Chen, Wu, Yao, & Sun, 2012; Bove, Lincoln, & Tsan, 2002). La fracción P2Et, está
constituida por algunos polifenoles como la PGG, el metilgalato, digalato y la 3,5
epigalocatequina. El grupo de Lu y col en el 2009, demostraron que la PGG induce
apoptosis de las células tumorales induciendo detención del ciclo celular en la fase G1/S y
activación de caspasas efectoras. De igual forma, los autores observaron pérdida del
potencial de membrana mitocondrial (MMP) por liberación de citocromo C al citosol y
activación de la pro-caspasa 9 y caspasa 3, así como inhibición del factor de crecimiento
endotelial vascular (VEFG) a partir de cortes de focos tumorales mediante
inmunohistoquímica y estudios in vitro en cultivos celulares HMEC-1, la cual es una línea
celular endotelial microvascular inmortalizada, donde se observó inhibición de su
proliferación y crecimiento (Zhang, Li, Kim, Hagerman, & Lu, 2009). Esta actividad
previamente demostrada para uno de los compuestos presentes en la fracción P2Et,
podría ayudar a explicar el menor tamaño del tumor primario en los grupos de ratones
tratados con la fracción P2Et y el menor número de células tumorales en el tumor
primario.
Adicionalmente, nosotros observamos una disminución de las metástasis a órganos
parenquimatosos después del tratamiento con la fracción P2Et, lo cual puede deberse a
una disminución de diferentes factores dentro del microambiente tumoral como GM-CSF,
G-CSF y VEFG, dada su relevancia en la metástasis en este modelo. Pero esto debe ser
evaluado. En relación con esta observación, vale la pena tener en cuenta el trabajo del
grupo de Baliga y col, quienes en el 2005, demostraron que la 3,5 epigalocatequina uno de
los principales compuestos polifenólicos del té verde, en el modelo 4T1 induce apoptosis
de las células tumorales y disminución de las metástasis. Esta última actividad se atribuye
a un aumento en moléculas pro-apoptóticas como la proteína Bax y disminución de
proteínas oncogénicas como la Bcl-2 (Baliga, Meleth, & Katiyar, 2005), efecto que también
podría alterar la proliferación y la migración del tumor en nuestro modelo.
56
Por otra parte, el grupo de Lee y col en el 2010, demostraron que el metilgalato, otro
compuesto presente en la fracción P2Et, reduce la migración de LTr CD4+CD25+ y
Foxp3+CD4+CD25+ (Lee, y otros, 2010) al tumor primario, así como también disminuye su
capacidad supresora mediante la proliferación de LT CD4+CD25-, potencializando así la
diferenciación de LT CD8+. Posiblemente la fracción P2Et pueda estar favoreciendo la
disminución de estas poblaciones celulares.
Las células 4T1 cuando son inoculadas in vivo inducen una hematopoyesis extramedular
que genera la llamada reacción leucemoide. Esta leucocitosis superior a 50.000 células/µl
en humanos, ha sido asociada con diferentes neoplasias en modelos animales, y en
canceres humanos sólidos con mal pronóstico (Schniewind et al.,2005). En nuestros
experimentos los animales desarrollaron reacción leucemoide con conteos superiores a
50.000 leucocitos/μl tal como ha sido previamente demostrado (duPre' & Hunter Jr, 2007;
Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008). En nuestro modelo, es posible que estas células
tengan un origen extramedular debido a que no se presentaron cambios medulares en los
cortes histológicos de hueso (resultados no mostrados), pero si se evidencio en el
parénquima esplénico un aumento en el número de megacariocitos e infiltración de
células polimorfonucleares en la pulpa roja (Tao, Fang, Alroy, & Sahagian, 2008).
Adicionalmente, en este modelo ha sido descrito que esta reacción leucemoide se puede
originar por factores de crecimiento producidos de manera constitutiva por la línea 4T1,
como los son el GM-CSF, G-CSF, IL6, VEGF y TGFβ (Ko, y otros, 2010). Es posible que los
polifenoles de la fracción puedan entonces favorecer una menor producción de estos
factores de crecimiento y en consecuencia una menor infiltración de CSM, LTr,
modificación del microambiente tumoral y así una mejor respuesta antitumoral que pueda
ser mediada por LT CD8+ y NK. Sin embargo, es necesario evaluar esto en este modelo.
Nosotros creemos que la disminución de esta reacción puede estar asociada con un menor
número de células tumorales infiltrantes en la pulpa roja, tal como se aprecia en el conteo
de células 4T1 en el parénquima esplénico y en el tumor primario, debido posiblemente a
la apoptosis inducida en las células tumorales. Esta inducción de apoptosis ha sido
previamente demostrada en diferentes líneas celulares tumorales, incluyendo las células
4T1 (Castañeda, Pombo, Hernandez, Urueña, & Fiorentino, 2012; Urueña, y otros, 2013).
Otro mecanismo que podría estar participando en la disminución de las células tumorales
puede ser la pérdida del MMP seguida de la liberación de citocromo c y posterior
activación de caspasas efectoras. Este efecto sobre la inducción de apoptosis ha sido
previamente demostrado en otras líneas celulares con la fracción P2Et (Castañeda, Pombo,
Hernandez, Urueña, & Fiorentino, 2012).
Este trabajo sento las bases de la utilización de un modelo murino de cancer de seno,
utilizado convencionalmente en la literatura, en la evaluación de la actividad antitumoral
de productos naturales, y permitirá a futuro el estudio de los mecanísmos implicados en la
metástasis tumoral y en el desarrollo de terápias que peritan el control de estas
metástasis.
57
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS
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8. ANEXOS
8.1.
Artículos publicados
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8.2.
Menciones
Mención Honorífica. Mención de la Academia Nacional de Medicina, noviembre de
2010. Bogotá, Colombia.
63