Download microbiología industrial - Recursos Politecnico 2012

Universidad de los Lago
Departamento
Ciencias y Tecnología Alimentos
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
CAPITULO 3:
MICROORGANISMOS DE
INTERES INDUSTRIAL
Profesor:
Héctor Mancilla Chávez
Osorno- 2007
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
CAPITULO 3 MICROORGANISMOS DE INTERÉS
INDUSTRIAL
1.
2.
3.
4.
Microorganismos utilizados a nivel industrial.
Actividades y características de interés. Principales tipos.
Fisiología del crecimiento
Metabolismo microbiano.
___________________________________________________________________
1
Microorganismos utilizados a nivel industrial
No todos los microorganismos tienen un uso industrial. Mientras que
los microorganismos aislados de la naturaleza muestran el
crecimiento celular como su principal propiedad fisiológica, los
microorganismos industriales son organismos que se han
seleccionado cuidadosamente para que produzcan uno o más
productos específicos. Incluso cuando el microorganismo industrial es
uno que se ha aislado por las técnicas tradicionales, se convierte en
un organismo altamente "modificado" antes de entrar en las
industrias a gran escala. En gran parte, los microorganismos
industriales son especialistas metabólicos capaces de producir
específicamente determinados metabolitos y con gran rendimiento.
Con el fin de lograr esta elevada especialización, las cepas
industriales están alteradas genéticamente, por mutación o por
recombinación. Habitualmente se reprimen o se eliminan las vías
metabólicas menores y frecuentemente existe en ellas un
desequilibrio metabólico. Los microorganismos industriales pueden
presentar muchas propiedades celulares y bioquímicas alteradas.
Aunque las cepas industriales pueden crecer satisfactoriamente bajo
las condiciones altamente especializadas de un fermentador, pueden
mostrar un crecimiento pobre en ambientes naturales competitivos.
1.1
Origen de las cepas industriales
La fuente última de todas las cepas de microorganismos industriales
es el ambiente natural. Pero a través de los años, a medida que los
procesos microbianos a gran escala se han ido perfeccionando, un
cierto número de cepas industriales se han ido depositando en las
2
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
colecciones de cultivos. Cuando se patenta un nuevo proceso
industrial, al solicitante de la patente se le requiere para que
deposite una cepa capaz de llevar a cabo el proceso, en una colección
de cultivos reconocida. Hay varias colecciones de cultivos que actúan
de depositarias y suministradoras de cultivos microbianos. Aunque
estas colecciones pueden ser una fuente rápida y fácil de cultivos, es
comprensible que la mayoría de las compañías industriales se sientan
poco dispuestas a depositar sus mejores cultivos en las colecciones
de cultivos. Además de cultivos de microorganismos, muchas
colecciones de cultivos tienen también colecciones de varios
plásmidos, de genes clonados y de vectores para su uso en ingeniería
genética, de líneas celulares animales para el cultivo de virus
animales, y de hibridomas para producir anticuerpos monoclonales.
ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
1. Alimentos fermentados
a) Selección involuntaria según las características del
proceso
b) Selección in vitro de aquellas cepas que presentaran
unas características más interesantes
2. Producción de aditivos y enzimas de uso alimentario
a) Selección a partir de cualquier fuente natural
b) Colecciones de cultivo públicas y privadas
1.2
Mejora de cepas
Corno hemos indicado, la fuente inicial de un microorganismo
industrial es el ambiente natural, pero el aislamiento original se
modifica en gran medida en el laboratorio. Como resultado de esta
modificación, es posible anticipar una mejora progresiva en el
rendimiento de un producto. El ejemplo más espectacular de tal
mejora progresiva es el de la penicilina, el antibiótico producido por
el hongo Penicillium chrysogenum. Cuando se produjo por primera
vez la penicilina a gran escala, se obtuvieron rendimientos de 1- 10
µg/ml. A lo largo de los años, como resultado de la mejora de las
cepas acoplada a cambios en el medio y en las condiciones de
cultivo, el rendimiento de penicilina aumentó hasta 50.000 µg/ml. Es
interesante decir que todo este incremento de 50.000 veces el
rendimiento, se obtuvo por mutación y selección; no estuvo
implicada ninguna manipulación genética. La introducción de nuevas
3
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
técnicas genéticas ha conducido a posteriores, aunque mucho más
modestos, incrementos del rendimiento.
2
Actividades y características de interés. Principales tipos.
2.1
Propiedades de un microorganismo industrial
Un microorganismo adecuado para su utilización industrial debe
producir la sustancia de interés, pero hay muchos otros aspectos a
considerar. Es preciso disponer del organismo en cultivo axénico
(puro), debe ser genéticamente estable, y debe crecer en cultivo a
gran escala. Además, debe ser posible mantener cultivos del
organismo durante un período de tiempo largo en el laboratorio y en
la planta industrial. El cultivo debe producir preferentemente esporas
o alguna otra forma celular reproductora, para que los organismos se
puedan inocular fácilmente en los grandes fermentadores. Una
característica importante es que el organismo. industrial crezca
rápidamente y produzca el compuesto deseado en un período de
tiempo relativamente corto.
El organismo, además, debe ser capaz de crecer en un medio de
cultivo líquido y relativamente barato, que se pueda obtener en
grandes cantidades. Muchos procesos microbiológicos industriales
utilizan fuentes carbonadas de desecho de otras industrias, como
principal ingrediente o como suplemento para los medios de cultivo a
escala industrial. Algunas de estas fuentes son, por ejemplo, el licor
de maceración de maíz (un producto rico en nitrógeno y factores de
crecimiento), el suero (un producto líquido de desecho de la industria
lechera, que contiene lactosa y sales minerales) y otros materiales de
desecho industriales, que tienen elevado contenido de carbono
orgánico. (La utilización de estos materiales carbonados de desecho
ayuda también a resolver los problemas de eliminación de residuos,
creados por la elevada demanda biológica de oxígeno (BOD) de los
residuos orgánicos de desecho). Además, un microorganismo
industrial debería no ser dañino para las personas ni para los
animales y plantas económicamente importantes. Debido al gran
tamaño de la población dentro del fermentador y a la imposibilidad
práctica de evitar la contaminación del ambiente fuera del
fermentador, un patógeno podría plantear problemas potenciales
desastrosos.
Otro requisito importante de un microorganismo industrial es que
sea posible eliminar las células microbianas del medio de cultivo con
relativa facilidad. En el laboratorio, las células se retiran
principalmente por centrifugación, pero la centrifugación a gran
escala puede ser difícil o cara. Los organismos industriales más
favorables son aquellos que tienen un tamaño de célula grande,
4
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
porque las células más grandes se depositan rápidamente en un
cultivo o pueden filtrarse fácilmente con materiales de filtro
relativamente baratos. Los preferidos son los hongos, las levaduras y
las bacterias filamentosas. Las bacterias unicelulares, debido a su
pequeño tamaño, son difíciles de separar del fluido de cultivo.
Finalmente, un microorganismo industrial debería ser susceptible de
manipulación genética. En microbiología industrial, el incremento del
rendimiento se ha obtenido primordialmente por medio de la
mutación y selección. También es deseable que el organismo
industrial sea capaz de sufrir recombinación genética, bien por un
proceso sexual o por algún tipo de proceso parasexual1. La
recombinación genética permite incorporar en un solo genoma,
características genéticas de más de un organismo.
Sin embargo, muchas cepas industriales se han mejorado
enormemente por mutación y selección, sin el uso de la
recombinación genética.
REQUISITOS DE LAS CEPAS INDUSTRIALES
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
Posibilidad de obtener cultivos puros
Genéticamente estables
Fácil de mantener por largos períodos de tiempo
Tasa rápida de producción de formas de propagación
Tasa rápida de crecimiento en preinóculo y en fermentador
Ausencia de problemas tecnológicos durante el escalado
Nutricionalmente poco exigentes
Autoprotección (bajada de pH, temperatura óptima extrema,
producción de agentes antagonistas, etc).
Producción rápida de los metabolitos de interés
Fácil separación entre el producto y el microorganismo
Producción mayoritaria del metabolito de interés
Falta de producción de sustancias tóxicas
Susceptible de mejora genética
Existen una serie de características que comparten todos los
microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la
industria. la más fundamental, el pequeño tamaño de la célula
1
Ciclo que implica cambios en el número cromosómico, pero que difiere en lugar y tiempo del
ciclo sexual; tiene lugar en los hongos cuyo ciclo normal está suprimido o aparentemente
ausente. Cuando es Homocariótico los núcleos presentes en una hifa son del mismo tipo
genético. Para el caso Heterocariótico dos o más núcleos son genéticamente distintos. En la
Heterocariosis se produce la fusión de micelios genéticamente distintos, el par formado sufre
mitosis o, puede suceder en la mutación de un micelio Homocariótico.
La Parasexualidad consiste en los siguientes procesos: Heterocariosis, cariogamia,
recombinación, segregación mediante entrecruzamiento mitótico y haploidización. Los procesos
parasexuales se asemejan a la reproducción sexual, pero estos pueden tener lugar cuando el
micelio está en desarrollo, mientras que la fase sexual (sí la hay) depende de las condiciones
nutritivas y del hábitat
5
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a
volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de
la célula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metabólica.
Así, la tasa de producción de proteína en las levaduras es varios
órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su
vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de
biosíntesis microbiana extremadamente alta permite que algunos
microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos (Escherichia
coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy
variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas
comprendidas entre el punto de congelación del agua y el punto de
ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de
aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase
de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas
permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente,
más favorable, permita el desarrollo de las células. Los
microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa
gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de
nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones
industriales se basen en nutrientes baratos.
Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe
estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en
cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo
industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto
período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente
barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un
microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los
animales o plantas. Otro requisito importante es la facilidad de separar las
células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara
a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son
aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias
filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias
unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar.
2.2
Diferentes tipos de microorganismos industriales
Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre
representan, como máximo, unos pocos centenares de especies de
entre las más de 100000 descritas en la Naturaleza. Los pocos que se
han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar
alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata
por otros métodos.
6
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
2.2.1
Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la
fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda
fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el
hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean
diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y
alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie
fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la
producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia
lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum
cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de
digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad
de oxidación de compuestos orgánicos, incluídos algunos que son
tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos.
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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
2.2.2
Hongos filamentosos
Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por
su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Los hongos
son responsables de la degradación de gran parte de la materia
orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que
permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos
causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y
pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el
hombre.
Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su
utilización industrial. Los hongos son la base de muchas
fermentaciones como la combinación de soja, habichuelas, arroz y
cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y
tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas
comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos
(cítrico, láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales
(Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.
8
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
9
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
2.2.3
Bacterias
Entre las especies bacterianas de interés industrial están las
bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden
convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es productor
de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e
insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar Clostridium
acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona
y butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las
especies de los géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen
yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente
industrial de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a
compuestos volátiles (geosmina) producidos por Streptomyces
aunque su principal importancia radica en la producción de
antibióticos
como
anfotericina
B,
kanamicina,
neomicina,
estreptomicina, tetraciclina, etc
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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
3
Fisiología del crecimiento
Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el
incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese
sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que
eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos
pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del
tamaño del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es
un aumento de la población. El crecimiento bacteriano podemos
estudiarlo desde dos puntos de vista:
ƒ
ƒ
A escala individual
A escala poblacional
Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia
al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes
temas:
¾ inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de
plásmidos);
¾ segregación de cromosoma y plásmidos a las células
hijas;
¾ síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre
todo de pared celular
¾ señales que coordinan la replicación genómica con la
división celular.
El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los
siguientes tópicos:
¾ cinética del crecimiento;
¾ factores que afectan al tiempo de generación (g);
¾ factores ambientales que limitan el crecimiento.
3.1
Ciclo celular
Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una
serie de eventos identificables que se van produciendo en una
secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de
ellos hace falta que se complete el anterior.
11
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Ciclo eucariótico
Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M
(mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente
constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración
del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento),
lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida,
de la fase M.
Ciclo eucariótico
Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M
(mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente
constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del
ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que
cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M.
Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M
(mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente
constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del
ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que
cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M.
Ciclo procariótico
Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos
carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe
mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces
la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo.
Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden
poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en
medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Los
periodos del ciclo procariótico son:
Ciclo procariótico
Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos
carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe
mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces
la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo.
Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden
poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en
12
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Los
periodos del ciclo procariótico son:
¾ fase C (equivalente a la S eucariótica): replicación del
ADN cromosómico;
¾ fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su
terminación coincide con el final de división celular;
¾ fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su
terminación coincide con el final de división celular;
Lo característico del ciclo es que las fases C y D son relativamente
constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de
generación (g), lo hace a expensas de la fase "G1". Por ejemplo, en
Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min.
3.1.1
Ciclo celular en función del tiempo de generación
Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qué ocurre con el ciclo
celular a distintos tiempos de generación.
Cuando g>C+D
existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicación). En
estas condiciones podemos observar nítidamente periodos
diferenciados entre sí (de síntesis de ADN y de división
celular).
Cuando g=C+D
ya no existe G1, y cada ronda de replicación comienza
inmediatamente tras la precedente división celular (es decir,
cada célula hija recién nacida se embarca inmediatamente
en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de
replicarlo, la célula inicia la división celular).
Cuando g<C+D
las rondas de replicación de un ciclo se inician antes de que
haya terminado la división celular del anterior
(superposición parcial entre fases C y D).
Cuando g<C
ya no se puede detectar fase D como tal. La síntesis de ADN
es continua durante todo el ciclo. Se inician rondas de
replicación cromosómica antes de que haya terminado la
anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran
un típico patrón de replicación dicotómica y en que dichos
cromosomas pasan a cada célula hija ya embarcados en una
nueva ronda de replicación.
13
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Una característica del ciclo es que, cuanto más rico es un
medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación (g),
mayor es el tamaño medio de las células. Es decir, los
individuos de una cepa bacteriana que esté en un medio rico
son más grandes que los individuos de esa misma cepa
creciendo en un medio pobre.
3.1.2
Control de la replicación del ADN2 cromósomico
De lo anterior se deduce que debe de existir algún tipo de
acoplamiento entre las ondas de replicación y la división
celular.
Nosotros, sobre el esquema que hemos comentado, podemos
inferir cuándo se debe de iniciar una nueva ronda siempre que
sepamos los valores de g, C y D:
Contamos C+D minutos a partir de g, y entonces podemos
prever que la ronda de replicación tendrá lugar g--(C+D)
minutos antes de la próxima división celular (o bien, G1-g
minutos si existe periodo G1).
Pero, por supuesto, la célula no es tan "lista" (no sabe contar
hacia atrás en el tiempo) ni tiene el don de la predicción (los
humanos tampoco, para la mayor parte de las cosas
importantes). La bacteria tampoco sabe "contar hacia
adelante", ya que el tiempo de inicio de una ronda de
replicación no guarda una relación sencilla con la división
celular previa.
Entonces, ¿cómo se acoplan división celular y replicación
cromosómica? Una clave hacia la respuesta a esta pregunta es
que la razón (proporción) entre orígenes de replicación y masa
celular en el inicio (inmediatamente antes de la replicación) es
igual para todas las tasas de crecimiento. Hé aquí un modelo
hipotético sobre el mecanismo de coordinación entre ambos
eventos del ciclo celular:
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA: Deoxyribonucleic
Acid). Constituye el principal componente del material genético de la inmensa mayoría de los
organismos, junto con el ARN. Es el componente químico primario de los cromosomas y el
material en el que los genes están codificados. En las bacterias, el ADN se encuentra en el
citoplasma mientras que en organismos más complejos, tales como plantas, animales y otros
organismos multicelulares, la mayoría del ADN reside en el núcleo celular. Se conoce desde hace
más de cien años. El ADN fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, biólogo
suizo, en los núcleos de las células del pus obtenidas de los vendajes quirúrgicos desechados y
en el esperma del salmón. Él llamó a la sustancia nucleína, aunque no fue reconocida hasta
1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery.
2
14
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
El sistema de coordinación detecta la concentración de orígenes
de replicación; conforme la bacteria crece, esta concentración
va descendiendo, hasta que se alcanza un valor umbral crítico
que desencadena una nueva onda de replicación. Ello hace que
se doble el número de orígenes. Una ulterior ronda no se pone
en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo descender
la concentración de orígenes.
Se trataría, pues, de una especie de reloj biológico y
"oscilador" que usaría como medida del tiempo el
pararámetro de masa celular, volumen, u otro equivalente, de
tal modo que la concentración crítica de un factor
iniciador o la dilución de un represor servirían para
disparar la replicación a una concentración determinada.
3.1.3
Relaciones entre velocidad de crecimiento y tamaño celular
Es fácil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto más rico es
un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación (g),
mayor es el tamaño medio de las células.
1.
2.
a. bacterias
i
creciendo en un medio relativamente
o (supongamos que en este medio g=60 min,
pobre
.
C+D=g);
si transplantamos una célula recién
dividida procedente del cultivo anterior a un medio
más rico (por ejemplo, que permite un tiempo de
generación g=35 min) podemos observar que:
a. la primera división ocurre C+D (60 minutos)
después; es decir, con un tiempo idéntico al
que tenía en el medio anterior;
b. pero como en este medio g=35 min, la
iniciación de una nueva ronda de replicación
ocurre antes de dicha replicación celular (es
decir, C y D se superponen);
c.
se observa que se alcanza un nuevo equilibrio,
con un tamaño celular mayor que en el medio
pobre, y una masa de inicio (tras la división
celular) mayor, alterándose igualmente el
tiempo de inic
15
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
3.1.4
Segregación de cromosomas y plásmidos
Existe un mecanismo eficiente que asegura la segregación de los
cromosomas bacterianos a las células hijas. Como se recordará, el
cromosoma se encuentra unido a la membrana citoplásmica, al
parecer a través de un mesosoma. Existen indicios de que durante la
replicación, el vértice de la horquilla de replicación va pasando por
ese punto de anclaje.
La replicación cromosómica se inicia en una región especial
denominada oriC, a partir de la cual se efectúa una replicación
bidireccional, hasta que ambas horquillas se encuentran en un punto
situado a 180o respecto de oriC. Cuando el mesosoma llega a ese
término de replicación se escinde en dos mesosomas, cada uno de
los cuales constituye el punto de anclaje de cada copia del
cromosoma. Cuando se forme el septo transversal, cada mesosoma
va a parar a cada célula hija, de modo que las copias de los
cromosomas quedan segregadas. Parece ser que algunos plásmidos
se segregan por este mismo mecanismo.
Así pues, el mesosoma parece actuar como un análogo primitivo del
aparato mitótico.
3.1.5
Productos anómalos de la división celular
Existen diversos tipos de mutantes cuyos fenotipos implican serias
alteraciones del proceso de división celular y de replicación o
segregación del material genético a las células hijas. Algunos de
estos mutantes han encontrado útiles aplicaciones en estudios
genéticos y moleculares.
Células sin cuerpos nucleares (= maxicélulas)
Determinados mutantes termosensibles son incapaces de iniciar la
replicación a temperaturas elevadas, de modo que siguen creciendo
en tamaño y se dividen mucho después de que se haya completado
la última replicación cromosómica (iniciada a una temperatura más
baja, permisiva). El resultado de la división celular a la temperatura
no permisiva es que se producen células de tamaño normal, pero
sin cromosoma, aunque poseen los demás componentes celulares,
incluyendo copias de plásmidos.
Por estos mutantes se puede deducir que no existe una relación
directa entre la septación (o sea, la fase D de división celular) y la
replicación cromosómica anterior (fase C).
16
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Minicélulas
Se producen en ciertos mutantes que forman septos anómalos
acéntricos (asimétricos, cerca de un extremo y no en el centro). En
las minicélulas tampoco se segrega cromosoma, pero pueden
"heredar" copias de plásmidos.
De estos mutantes se deduce otro rasgo del ciclo celular: el lugar
habitual donde se produce la septación está programado
genéticamente, y esta programación se puede alterar por
mutaciones.
Uso de maxicélulas y minicélulas en estudios moleculares y
genéticos:
Un empleo habitual de estas "células" anómalas en el laboratorio se
deriva del hecho de que durante cierto tiempo pueden sintetizar
proteínas codificadas por los únicos genes que poseen: los del
plásmido o plásmidos que alberguen. Por marcaje radiactivo y
electroforesis en gel de proteínas, se detectan unas pocas bandas,
correspondientes sólo a las proteínas de los pocos genes existentes,
con la ventaja de que no hay interferencia de los cientos o miles de
proteínas de la célula normal.
3.2
Métodos para el estudio y medición del crecimiento a escala
individual
3.2.1
Por microscopía
Se basan en la observación microscópica de microcultivos a
temperatura constante.
¾ seguimiento
de
células
individuales
por
microfotografía secuencial
¾ por inmunofluorescencia: se observa en microscopio
de fluorescencia la incorporación de materiales de P.C. o
de
membrana
marcados
con
algún
colorante
fluorescente.
3.2.2 Por obtención de cultivos sincrónicos
Como veremos en el próximo capítulo, en un cultivo bacteriano
habitual, las distintas células se encuentran en fases distintas del
ciclo celular, es decir, no están sincronizadas. Por lo tanto, del
17
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
estudio de la población no es posible sacar conclusiones sobre
eventos del ciclo celular. Sin embargo, por una serie de
procedimientos, es factible producir cultivos sincrónicos, en los
que durante cierto tiempo (casi) todas las células están en la misma
fase, de modo que tienen la misma edad, el mismo tamaño, y se
dividen y replican el cromosoma al mismo tiempo. Entonces, el
comportamiento de la población (más fácil de estudiar que el de un
solo individuo) es una "imagen ampliada" del individual.
Los principales métodos de obtención de cultivos sincrónicos se
basan en seleccionar, a partir de un cultivo estándar no sincrónico,
aquellas células que o bien son del mismo tamaño, o bien son de la
misma edad. Las técnicas principales son:
¾ selección por tamaños: se suele recurrir a
gradientes de densidad, sobre todo los formados por
mezclas de agua normal y agua deuterada (H2O/D2O).
¾ selección por edades: el método más empleado es la
selección por filtración (técnica de HelmstetterCummings), aunque sólo se puede aplicar a ciertas
cepas (en E. coli funciona con la cepa B/r, pero no con la
K12).
Procedimiento
9
Se filtra un cultivo asincrónico que esté en fase exponencial
a través de una membrana de nitrocelulosa: las células se
adhieren al filtro.
9
Se invierte el filtro.
9
Se va pasando medio fresco (=nuevo) precalentado. Cada
célula unida al filtro se nutre y crece, y finalmente se divide:
una de las células hijas queda unida al filtro y la otra pasa al
eluato, que se recoge. En cada momento concreto de esta
operación, las células hijas eluidas y recogidas corresponden a
células "recién nacidas". Las células eluidas en cada momento
concreto (y por lo tanto, de la misma edad) sirven como
"fundadoras" de un cultivo sincrónico.
Obsérvese la cinética de un cultivo "sincrónico" expresada como
número de individuos en función del tiempo:
ƒ
ƒ
durante unas pocas generaciones el cultivo es más o menos
sincrónico;
las mesetas indican las fases en que el número de células
no varía, porque todas están creciendo en tamaño antes de
dividirse;
18
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
ƒ
las subidas bruscas (casi verticales) en el número de
individuos nos indican que todas las células del cultivo se
están dividiendo a (casi) el mismo tiempo.
Pero la sincronía se va perdiendo paulatinamente, de modo que al
cabo de unas generaciones la gráfica se convierte en una recta con
pendiente. La explicación estriba en que el tiempo exacto de división,
o más concretamente C y D no duran exactamente lo mismo en los
distintos individuos. Estas pequeñas variaciones estadísticas se van
acumulando, generando desfases cada vez mayores entre células,
hasta que la sincronía se pierde irreversiblemente.
3.3
Medida del crecimiento
El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido
desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a
determinar
la
medida
del
crecimiento
mediante
diversas
metodologías.
Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que
tienen las células individuales, ésto es iniciar y completar una división
celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como
partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento
en el número total de partículas bacterianas. Existen dos formas para
determinar el número total de microorganismos en una muestra:
•
•
Recuento microscópico de partículas
Recuento electrónico de partículas
Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos
capaces de formar colonias debido a que sólo se tiene en cuenta el
número de microorganismos viables, esto es capaces de crecer
indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:
•
•
Recuento de colonias
Método del número más probable
Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares
una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos,
la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la
síntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento.
Para este grupo la división celular es un proceso esencial pero menor
que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento
es la capacidad del sistema enzimático para utilizar los recursos del
medio y formar biomasa.
19
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
•
•
•
•
Determinación
Determinación
Determinación
Determinación
de peso húmedo
de peso seco
de nitrógeno total
química de un ácido nucleico
Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que
ejercen los microorganismos en los cambios químicos de su entorno como
consecuencia del incremento de la biomasa.
Recuentos Directos
Recuento microscopico: Es una técnica común, rápida y barata
que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio
de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente
cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de
muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con
colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener
reproductibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra
dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio,
incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución
de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de
alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de
carbono).
Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de PetroffHausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con
objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se
realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del
recuento microscópico es brindar información adicional sobre el
tamaño y la morfología de los objetos contados.
Camara de recuento de Petroff-Hausser
20
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Tipo de cuadro
Area
[cm2]
Volumen
[ml]
Factor
[1/Volumen]
Cuadrado total
1.00 x 10-2
2.00 x 10-5
5.00 x 104
Cuadrado grande
4.00 x 10-4
8.00 x 10-7
1.25 x 106
Cuadrado pequeño
2.50 x 10-5
5.00 x 10-8
2.00 x 107
•
•
•
1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la
cámara de recuento.
Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de
la cámara que se utilizaron para contar un el número de
bacterias.
Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la
cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el
recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un
volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104
µm3 = 5 x 10-8 ml).
Recuento electronico: Los contadores electrónicos permiten
realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y
protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o
miceliares.
Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos
comunicados a través de un pequeño conducto. En ambos
compartimientos hay electrodos que miden la resistencia eléctrica del
sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su
resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada
compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de
estos instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen
fijo de una suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un
compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy
breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo
compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la
conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios
en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados.
Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas
bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son
21
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla
al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse células que
formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de
microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un
breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más
grande. Es común la obstrucción del orificio por microorganismos
muy grandes.
Medida de la Biomasa
La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es
utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad
metabólica, o de un constituyente metabólico o químico.
Algunos de los métodos para cuantificar la biomasa son obvios y
confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la
exactitud.
Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión
que es pesada luego de la separación de las células por filtración o
centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de
muestra.
La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el
espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad
de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de
células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio
intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se
determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio
intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan
soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden
ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las
paredes bacterianas.
Peso seco: El peso seco (contenido de sólidos) de las células
bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el
secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante.
Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a
que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de
un gran número de bacterias.
La desventaja de este método es que componentes volátiles de la
célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna
degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad
durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad
relativa alta.
22
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Determinación de acidos nucleicos: Es una técnica que permite
determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se
determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico
(generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la
población.
Determinacion de nitrógeno: Es una técnica que permite
determinar indirectamente la masa de una población bacteriana.
Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno
que contiene una muestra en relación al compuesto que se quiera
determinar. Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el
NO2-, NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en UV,
Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante
la Digestión de Kjeldahl.
Incorporación de precursores radiactivos: Es una técnica que
permite determinar indirectamente la masa de una población
bacteriana. En esta técnica se adiciona al medio un compuesto
marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y
luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la
población.
Dispersión de la Luz
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en
suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte
es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz
dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la
luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través
de la solución. En relación a la longitud de onda y al tamaño de la
partícula pueden existir tres tipos de dispersión.
Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas
para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy
útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos.
Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido
macromolecular).
Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión
de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz
residual transmitida.
Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones
diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del
tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de
concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones
diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco,
independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin
embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o
23
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las
células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el
número de microorganismos totales o el número de microorganismos
viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de
calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es
posible relacionar Absorbancia (Densidad Optica) con el número de
microorganismos totales o con UFC.
Absorbancia en función del Peso Seco
Absorbancia = K x Peso Seco
K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa
la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento
de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).
Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades
de peso seco (µg/ml-mg/ml).
La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica
para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no
deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores
producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el
inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un
mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de
absorción.
24
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Absorbancia en función del Peso Seco
Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales
En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos
microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma
absorbancia,
mientras
que
para
el
mismo
número
de
microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es
distinta.
Lectura complementaria Anexo 1
25
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
4
Metabolismo microbiano.
4.1
Introducción al metabolismo.
El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que
permiten el crecimiento de un organismo (por lo tanto, en bacterias,
que conduce a la creación de nuevas células). El metabolismo de la
célula comprende dos grandes tipos de reacciones:
1)
reacciones de mantenimiento, que suministran
a)
energía
b)
poder reductor
c)
precursores metabólicos
2)
reacciones del anabolismo (biosíntesis), que usan energía y
poder reductor procedente de las reacciones de mantenimiento.
El término metabolismo se utiliza cuando nos referimos a todos los
procesos químicos que tienen lugar dentro de una célula. Los
elementos químicos básicos que utiliza una célula provienen del
medio ambiente y estos elementos químicos son transformados por
la célula en los constituyentes característicos que componen dicha
célula. Estos compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso
por el cual una célula transforma estos nutrientes en sus
componentes celulares se denomina anabolismo o biosíntesis. La
biosíntesis es un proceso que requiere energía. Esta energía se
obtiene del medio ambiente. Las células pueden utilizar 3 tipos
distintos de fuente de energía: luz, compuestos orgánicos y
compuestos inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su
energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de compuestos
químicos. Cuando estos compuestos químicos se rompen originando
compuestos más simples se libera energía. Este proceso se denomina
catabolismo. Las células también necesitan energía para otras
funciones celulares como es la motilidad (movimiento celular) y
transporte de nutrientes. Como hemos visto existen dos procesos
básicos de transformaciones químicas en las células: anabolismo y
catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anabólicas y
catabólicas es el metabolismo.
26
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
CLASIFICACION DE LOS ORGANISMOS SEGUN SU FUENTE DE CARBONO Y
ENERGIA
FUENTE DE ENERGIA
FOTOTROFOS
QUIMIOTROFOS
AUTOTROFOS
HETEROTROFOS
FUENTE DE CARBONO
LUZ
QUIMICA
CO2
COMPUESTOS ORGANICOS
FOTOAUTOTROFOS
FOTOHETEROTROFOS
QUIMIOAUTOTROFOS
QUIMIOHETEROTROFOS
FUENTE DE ENERGIA
FUENTE DE CARBONO
LUZ
LUZ
QUIMICA
QUIMICA
CO2
COMPUESTOS ORGANICOS
CO2
COMPUESTOS ORGANICOS
Fotoautotrofos:Vegetales, algas, bacterias fotosintéticas.
Fotoheterotrofos: Bacterias
Quimioautotrofos: Bacterias.
Quimioheterotrofos: Animales, Protozoos, bacterias. NUTRICION
MICROBIANA
Dr. Pedro F. Mateos
Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de
Salamanca
I.- NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS
II.- NUTRIENTES
1.- MACRONUTRIENTES
2.- MICRONUTRIENTES
3.- VITAMINAS Y HORMONAS
4.- ELEMENTOS TRAZA
III.- PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE
I.- NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS
La gran meta que tiene un microorganismo es crecer y dividirse; para ello necesita duplicar
el material que posee. Las células utilizan elementos químicos que provienen del medio
27
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
ambiente para transformarlos en los constituyentes característicos que componen dicha
célula. Estos compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una célula
transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o
biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía. Esta energía se obtiene del
medio ambiente. Las células pueden utilizar tres tipos distintos de fuentes de energía: luz,
compuestos orgánicos o compuestos inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su
energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de compuestos químicos. Cuando estos
compuestos químicos se rompen originando compuestos más simples se libera energía y a
este proceso se le denomina catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones
anabólicas y catabólicas es el metabolismo.
Cuando los microorganismos se separan de su hábitat (donde adquieren los nutrientes) y se
cultivan en laboratorios o industrias se deben usar medios de cultivo que contengan los
elementos químicos necesarios para su crecimiento.
II.- NUTRIENTES
Los nutrientes que requiere una célula para su crecimiento se pueden clasificar en los
siguientes grupos:
1.- Macronutrientes: carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno.
2.- Micronutrientes: fósforo, potasio, azufre, magnesio.
3.- Vitaminas y hormonas
4.- Elementos traza: zinc, cobre, manganeso, molibdeno, cobalto.
1.- MACRONUTRIENTES
Carbono. Todos los organismos necesitan carbono en alguna de sus formas. El carbono
forma el esqueleto de los tres más importantes nutrientes (carbohidratos, lípidos y
proteínas) que se utilizan para la obtención de energía así como material celular. Los
microorganismos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono se llaman
heterotrofos y aquellos que utilizan el CO2 como fuente de carbono se llaman autotrofos.
Hidrógeno y Oxígeno. El hidrógeno y oxígeno forman parte de muchos compuestos
orgánicos. Se encuentran en el H2O, como componentes de nutrientes y en la atmósfera.
Además el O2 se utiliza en la respiración aeróbica como aceptor terminal de electrones.
Nitrógeno. Todos los organismos requieren nitrógeno. El nitrógeno es metabolizado y
entra a formar parte de las proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Las
fuentes de nitrógeno que pueden ser utilizadas por diferentes organismos incluyen el N2
atmosférico en algunos procariotas, otros utilizan compuestos inorgánicos como nitratos,
nitritos o sales de amonio, mientras que otros requieren compuestos nitrogenados orgánicos
como son los aminoácidos o péptidos.
28
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
2.- MICRONUTRIENTES (c.a. 0,2 g / l)
Fósforo. El fósforo es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos y ATP; también forma
parte de los fosfolípidos y polímeros de la pared celular. El fósforo se suministra
normalmente como fosfato inorgánico; alternativamente se puede utilizar fosfato orgánico
como son los glicerofosfatos y fosfolípidos.
Potasio. El ión potasio actúa como coenzima y probablemente como catión en la estructura
de RNA y otras estructuras aniónicas celulares.
Azufre. El azufre es necesario para la biosíntesis de los aminoácidos cisteina, cistina y
metionina. También forma parte de coenzimas como biotina, coenzima A y ferredoxina. El
azufre se suministra en forma inorgánica como sulfato u orgánica como cistina, cisteina y
metionina.
Magnesio. Se utiliza como cofactor de reacciones enzimáticas donde actúa el ATP.
3.- VITAMINAS Y HORMONAS
Las vitaminas se clasifican en dos grupos, hidrosolubles y liposolubles. Dentro de éstas
últimas la vitamina A, D y E no son necesarias para el crecimiento de las bacterias. Todas
las vitaminas hidrosolubles, excepto el ácido ascórbico, son necesarias para el crecimiento
de bacterias. La mayor parte de las vitaminas hidrosolubles son componentes de coenzimas.
En los medios indefinidos se utiliza como fuente de vitaminas el extracto de levaduras.
4.- ELEMENTOS TRAZA (c.a. 25 mg / l)
En general los requerimientos de elementos traza se conocen sólo cualitativamente ya que
es difícil demostrar su requerimiento debido a que las cantidades necesarias se suelen
encontrar a menudo como contaminantes en otros constituyentes del medio. Son necesarios
para activar algunos enzimas; por ejemplo, el Mo6+ se necesita en la nitrogenasa que es el
enzima que cataliza la conversión del nitrógeno atmosférico en amoníaco en la fijación
biológica de nitrógeno.
III.- PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE
La membrana citoplásmica controla el paso de los nutrientes dentro de la célula, así como
hacia fuera de la célula. Existen 4 mecanismos que regulan el transporte de nutrientes:
1.- DIFUSION PASIVA
29
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Las moléculas de H2O y algunos nutrientes liposolubles pasan libremente a través de la
membrana hasta equilibrar concentraciones. No hay consumo de energía.
2.- DIFUSION FACILITADA
Los nutrientes se unen a una proteína transportadora para atravesar la membrana pasando
de mayor a menor concentración. No hay consumo de energía.
3.- TRANSPORTE ACTIVO
La mayor parte de los nutrientes son transportados mediante este mecanismo. Este proceso
permite concentrar altos niveles de nutrientes necesarios para las actividades metabólicas
dentro de la célula. Hay consumo de energía. El ATP distorsiona el sitio de unión de la
proteína transportadora dificultando a la molécula salir de la célula.
4.- TRANSPORTE POR TRANSLOCACION DE GRUPO
En este tipo la proteína transportadora es un enzima que añade un grupo fosfato del ácido
fosfoenolpirúvico al nutriente durante el transporte. Este nutriente alterado ya no es capaz
de unirse a la proteína transportadora por lo que se acumula dentro de la célula.
La energía y el poder reductor en el metabolismo microbiano:
papel del ATP y de los piridin nucleotidos
La energía química es la energía liberada cuando un compuesto
orgánico o inorgánico es oxidado. En biología las unidades de energía
más usadas son la kilocaloría (Kcal) y el kilojulio (KJ). 1 Kcal = 4.184
KJ. La utilización de energía química en los organismos vivos está
implicada con las reacciones de oxidación-reducción, llamadas
REDOX ya que por cada oxidación que ocurre tiene que haber una
reducción. Una oxidación se define como la eliminación de electrones
de una sustancia y una reducción se define como la adición de
electrones a una sustancia. En bioquímica, las oxidaciones y
reducciones frecuentemente conllevan no sólo la transferencia de
electrones, sino de átomos enteros de hidrógeno.
La energía liberada como resultado de las reacciones redox debe de
conservarse para ser utilizada por la célula. En los organismos vivos,
la energía química liberada en las reacciones redox se transfiere
normalmente a una variedad de compuestos fosfato en la forma de
enlaces fosfato de alta energía. El compuesto más importante en los
organismos vivos que contiene enlaces fosfato de alta energía es el
adenosín trifosfato (ATP). El ATP contiene 2 enlaces fosfato de alta
30
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
energía. Se puede considerar que el ATP tiene por objeto "atrapar"
una parte de la energía libre que queda disponible en las reacciones
catabólicas e impulsar reacciones biosintéticas al activar ciertos
metabolitos intermediarios de la biosíntesis.
Además del ATP, existen otros compuestos de alta energía que
activan intermediarios metabólicos y así impulsan ciertas reacciones
de biosíntesis:
Compuestos de alta energía
Guanina, Uridina
Citidina
Desoxitimidina
Acetil coenzima A
Causa activación en la biosíntesis de:
Proteínas, Peptidoglicano, Glucógeno
Fosfolípidos
Lipopolisacáridos
Acidos grasos
Ya hemos dicho que cuando ocurre una oxidación tiene que haber
una reducción, es decir una sustancia que acepte los electrones
eliminados. En la mayor parte de los casos, cada etapa de oxidación
de un metabolito implica la eliminación de dos electrones y, por ello,
la pérdida simultánea de dos protones; esto equivale a la eliminación
de dos átomos de hidrógeno y se denomina deshidrogenación.
Inversamente, la reducción de un metabolito implica la adicción de
dos electrones y de dos protones y se considera una hidrogenación.
Los compuestos que con más frecuencia llevan a cabo oxidaciones y
reducciones biológicas (es decir, que sirven como aceptores de
átomos de hidrógeno liberados en las reacciones de deshidrogenación
y como donadores de átomos de hidrógeno requeridos para las
reacciones de hidrogenación) son dos piridín nucleótidos:
nicotinamida adenín dinucleótido (NAD) y nicotinamida adenín
dinucleótido fosfato (NADP). Estos dos piridín nucleótidos pueden
fácilmente sufrir oxidaciones y reducciones reversibles en el grupo
nicotinamida. La oxidación-reducción reversible del NAD y del NADP
puede simbolizarse así:
NAD+ + 2H -----> NADH + H+
oxidado
reducido
NADP+ + 2H -----> NADPH + H+
Mecanismos de obtencion de ATP
31
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
En el metabolismo, el ATP se genera por dos mecanismos
bioquímicos fundamentalmente diferentes: Fosforilación a nivel de
sustrato y fosforilación oxidativa.
1.- Fosforilación a nivel de sustrato: Mediante la fosforilación a
nivel de sustrato, el ATP se forma a partir de ADP por transferencia
de un grupo fosfato de alta energía de un intermediario de una ruta
catabólica. La siguiente reacción sirve de ejemplo:
Acido 2 fosfoglicérico -----> Acido fosfoenolpirúvico + ADP -----> Acido
pirúvico
+
ATP
Como consecuencia de la pérdida de una molécula de H2O, el enlace
éster de baja energía del fosfato del ácido 2-fosfoglicérico se
convierte en un enlace enólico de alta energía en el ácido
fosfoenolpirúvico. Este fosfato de alta energía puede luego ser
transferido al ADP con lo que se produce una molécula de ATP.
2.- Fosforilación oxidativa (Transporte de electrones): En los
diferentes modos de metabolismo microbiano, incluyendo la
respiración y la fotosíntesis, el ATP se genera por transporte de
electrones a través de una cadena de moléculas transportadoras que
tienen una orientación fijada en la membrana celular. Los
componentes de la cadena son moléculas transportadoras capaces de
sufrir oxidaciones y reducciones de modo reversible de tal manera
que cada miembro de la cadena es capaz de ser reducido por la
molécula transportadora que le precede y oxidado por la que le
sigue.
En la cadena de transporte de electrones algunos miembros
transportan átomos de hidrógeno (un electrón más un protón),
mientras que otros transportan sólamente un electrón. La orientación
de los transportadores en la membrana celular es tal que los
transportadores de átomos de hidrógeno realizan el transporte hacia
fuera de la célula y los transportadores de electrones lo realizan
hacia el interior con lo que en cada confluencia se transporta fuera de
la célula un protón. La membrana celular es impermeable a los
protones; como resultado, el transporte de electrones retiene una
porción de energía química liberada por la reacción global de la
cadena (oxidación del donador primario de electrones por el aceptor
terminal de electrones). Esta energía se utiliza en los sistemas de
permeasas, movilidad celular por flagelos y en la síntesis de ATP a
partir de ADP y fosfato inorgánico. Esta síntesis de ATP está
catalizada por un enzima complejo unido a la membrana la ATP
fosfohidrolasa (ATPasa). La fosforilación oxidativa se puede explicar
32
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
aplicando el símil de la generación de energía eléctrica a través de
agua embalsada. La membrana actúa como una presa que retiene el
agua (en este caso los protones que se transportan fuera de la célula
a través de la cadena transportadora de electrones); en el momento
que se abren las compuertas (ATPasa) este agua liberada (protones)
mueve la turbina (ATPasa) que genera energía eléctrica (síntesis de
ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico).
4.2
Metabolismo primario
Suma de los procesos esenciales para las funciones básicas de
la célula, como la glucólisis.
Un proceso microbiano típico, en el que el producto se forma durante
la fase primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por
fermentación3. El etanol es un producto del metabolismo anóxico de
la levadura y de algunas bacterias y se forma como parte del
metabolismo de la energía. Debido a que el crecimiento sólo puede
tener lugar si puede producirse energía, la formación de etanol tiene
lugar en paralelo con el crecimiento. En la imagen inferior, se
muestra una típica fermentación alcohólica indicando la formación de
células, de etanol, y la utilización del azúcar.
Sustrato de crecimiento
Células
Metabolito
Primario
Las células y el metabolito se producen
más o menos simultáneamente
En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier proceso microbiano a
gran escala, sea o no sea bioquímicamente una fermentación. De hecho, la mayoría de las
fermentaciones industriales son aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación
industrial se denomina fermentador y el microorganismo implicado es el agente de la
fermentación
3
33
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
34
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
4.3
Metabolismo secundario
Suma de los procesos no esenciales para las funciones
metabólicas básicas de la célula. Estos procesos están
asociados a ciertas ventajas adaptativas, como los
mecanismos de defensa (antibióticos, toxinas, etc.).
Un tipo más complejo de productos industriales es aquel en el que el producto
deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la
fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se
denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más
comunes y más importantes de interés industrial. Los más conocidos y más
ampliamente estudiados son los antibióticos y en la imagen inferior puede
verse la cinética del proceso de obtención de la penicilina. Mientras que el
metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el
metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro.
Las características reconocidas del metabolismo secundario son:
1. Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos
organismos.
2. Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el
crecimiento y la reproducción.
3. La formación de metabolitos secundarios es extremadamente dependiente
de las condiciones de crecimiento, especialmente de la composición del medio.
Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito
secundario.
4. Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo
de estructuras estrechamente relacionadas. Por ejemplo, se ha visto que una
sola cepa de una especia del Streptomyces produce 32 antibióticos distintos
pero relacionados, del tipo antraciclina.
5. Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproducción de
metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como
están al metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una
manera tan espectacular.
Trofofase e idiofase. En el metabolismo secundario, las dos fases distintas
del metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la fase de
crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" ) mientras que la fase de
producción de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un
metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se
proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que
35
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
las condiciones se alteren adecuadamente y en el momento oportuno para que
la formación del producto sea excelente. En el metabolismo secundario, la
producción en cuestión puede no derivarse del sustrato primario del
crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó a partir del
sustrato primario del crecimiento. Por tanto, el metabolito secundario se
produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios que se
acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las células, durante el
metabolismo primario. Una característica de los metabolitos secundarios es
que las enzimas implicadas en la producción del metabolito secundario están
regulados separadamente de las enzimas del metabolismo primario. En
algunos casos se han identificado inductores específicos de la producción de
metabolitos secundarios. Por ejemplo, se ha identificado un inductor específico
de la producción de estreptomicina, un compuesto denominado Factor A.
Sustrato de crecimiento
Células
Metabolito
Primario
Metabolito
Secundario
Después de producidas las células y el
metabolito primario, las células
convierten el metabolito primario en uno
secundario
36
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Sustrato de crecimiento
Células
Metabolito
Primario
Metabolito
Secundario
Después de producidas las células el
sustrato se convierte en un metabolito
secundario durante un posterior
crecimiento
Características de los metabolitos secundarios
•
•
•
•
9
•
Específicos de un grupo de organismos
No esenciales para el crecimiento
Dependiente de las condiciones de crecimiento
Producidos como grupo de estructuras relacionadas:
Una cepa de Streptomyces produce 32 antibióticos
distintos del tipo antraciclina
Puede obtenerse una superproducción espectacular
Relación entre el metabolismo primario y el secundario. La
mayoría de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas
complejas que para su formación requieren un gran número de
reacciones enzimáticas específicas. Se sabe, por ejemplo, que en la
síntesis del antibiótico tetraciclina están implicados al menos 72
pasos enzimáticos separados y más de 25 en la síntesis de la
eritromicina, y que ninguna de estas reacciones tiene lugar durante
el metabolismo primario. Sin embargo, las vías metabólicas de estos
metabolitos secundarios arrancan del metabolismo primario porque
los materiales de partida para el metabolismo secundario vienen de
las vías biosintéticas principales.
Muchos metabolitos secundarios estructuralmente complejos, se
originan a partir de precursores estructuralmente muy similares.
37
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
4.4
Mecanismos de obtención de energía por microorganismos
quimioheterotrofos
Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterotrofos son
aquellos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono
y energía. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y
casi todas las bacterias. Las vías utilizadas por los quimioheterotrofos
para la oxidación de compuestos orgánicos y la conservación de la
energía en ATP se pueden dividir en dos grupos:
1.- Fermentación: cuando las reacciones redox ocurren en ausencia
de cualquier aceptor terminal de electrones.
2.- Respiración: cuando se utiliza el oxígeno molecular o algún otro
agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aeróbica:
oxígeno; Anaeróbica: Nitrato, Sulfato, Fumarato, Oxido de
Trimetilamina.
Fermentación
Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas sólo
ocurre una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto
orgánico y por lo tanto sólo se produce una pequeña parte de la
energía disponible.
La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción de un
compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato
inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de
electrones. El ATP en la fermentación se produce a partir de la
fosforilación a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no
participación de un aceptor externo de electrones, el sustrato
orgánico experimenta una serie de reacciones oxidativas y reductoras
equilibradas; los piridín nucleótidos reducidos en un paso del proceso
son oxidados en otro. Este principio general se ilustra en dos
fermentaciones: la fermentación alcohólica (típica del metabolismo
anaeróbico de la glucosa por levaduras) y la fermentación
homoláctica (típica del metabolismo de algunas bacterias lácticas).
Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embden-Meyerhof: las
dos moléculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en
reacciones que implican un ulterior metabolismo del piruvato. En el
caso de la fermentación homoláctica, esta oxidación ocurre como
consecuencia directa de la reducción del ácido pirúvico a ácido
38
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
láctico. En el caso de la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico se
descarboxila primero para formar acetaldehído y la reoxidación del
NADH ocurre en paralelo con la reducción del acetaldehído para
formar etanol.
Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales
distintos al ácido láctico y al etanol debido a las diferencias en el
metabolismo del ácido pirúvico. Estos productos finales pueden ser
ácido fórmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, ácido butírico, butanol. La
mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar
varios productos finales, pero ninguna fermentación da lugar a todos
los productos finales.
Resultados de la fermentación de la glucosa. El resultado final
de la glicolisis es el consumo de glucosa, la síntesis de 2 ATP y la
producción de productos de fermentación. Para el organismo el
producto más importante es el ATP y los productos de la
fermentación son productos de desecho. Sin embargo, estos
productos son muy importantes para el cervecero, panadero,
quesero. La fermentación anaeróbica de glucosa por levaduras
produce etanol que es el producto principal de las bebidas
alcohólicas, y la producción de ácido láctico es el paso inicial en la
producción de productos lácteos fermentados incluyendo el queso.
Para los panaderos, la producción de CO2 por la fermentación de
levaduras es el paso esencial en el esponjamiento del pan.
El efecto Pasteur se produce en microorganismos capaces de
realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia (anaerobios
facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiración aeróbica,
pero pueden emplear la fermentación si no hay O2 libre en su medio
ambiente. Pasteur fué el primero en observar que el azúcar es
convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que
en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el
CO2 el principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto
indica el mayor rendimiento energético de la respiración sobre la
fermentación.
Respiración aeróbica (Rutas de utilización del piruvato por
aerobios)
La glucosa, tanto en el metabolismo respiratorio como en el
fermentativo, se transforma en ácido pirúvico por una de las
siguientes rutas:
¾ Embden-Meyerhof (eucariotas y procariotas)
39
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
¾ Pentosa fosfato (eucariotas y procariotas)
¾ Entner Doudoroff (sólo en ciertos procariotas
como alternativa a la ruta Embden-Meyerhof)
Embden-Meyerhof
40
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Entner Doudoroff
41
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
En la mayor parte de los aerobios, el piruvato sufre una
descarboxilación oxidativa catalizada por un sistema enzimático
llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetilcoenzima A (acetil-CoA). El acetil-CoA es un metabolito precursor
que puede entrar en rutas biosintéticas; alternativamente, puede ser
oxidado completamente a CO2 a través de una ruta conocida como
ciclo de Krebs o ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Este ciclo es
la principal vía de generación de ATP en los heterotrofos aeróbicos
(por paso de electrones a través de una cadena transportadora de
electrones desde los piridín nucleótidos reducidos). El ciclo TCA
genera además tres metabolitos precursores, a-cetoglutarato,
succinil-CoA y oxalacetato. El ciclo TCA efectúa la oxidación completa
de una molécula de ácido acético a CO2, produce tres moléculas de
piridín nucleótidos reducidos, una molécula de ATP y una molécula de
FAD reducido (flavoproteína que cede electrones a una cadena de
transporte independiente de piridín nucleótidos).
Reacciones anapleróticas. El ciclo TCA, además de oxidar el acetil
CoA (dentro del ciclo) genera metabolitos precursores que son
utilizados en la biosíntesis (fuera del ciclo), por lo que requiere un
aporte de ácido oxalacético que reponga el utilizado en la síntesis de
los metabolitos precursores. Estas reacciones de síntesis de
oxalacético se denominan anapleróticas y fundamentalmente
consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el
fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el
carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: vía
acetil-CoA y vía piruvato o fosfoenolpiruvato.
Ciclo del glioxilato. Durante la oxidación de ácido acético o ácidos
grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia
de piruvato, ocurre una modificación especial del ciclo TCA conocida
como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede
generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato
(anapleróticas) ya que en los microorganismos aeróbicos no existe un
mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato
requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la
oxidación de succinato y malato, que se produce por una secuencia
de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un
intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y
glioxilato. En la segunda reacción el acetil-CoA se condensa con el
glioxilato para formar malato, el precursor inmediato del oxalacetato.
Así, el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que
permite el funcionamiento normal del ciclo TCA.
Balance energético de la respiración aeróbica. El TCA produce la
42
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
completa oxidación del ácido pirúvico en 3 moléculas de CO2 con la
producción de 4 moléculas de NADH y una molécula de FADH. El
NADH y FADH pueden ser reoxidados a través del sistema de
transporte de electrones originando 3 moléculas de ATP por NADH y
2 moléculas de ATP por FADH. También se produce una molécula de
ATP por fosforilación a nivel de sustrato en la oxidación de acetoglutarato a succinato. En total suman 15 moléculas de ATP por
ciclo. Como por cada molécula de glucosa se originan 2 moléculas de
ácido pirúvico, en total serían 30 moléculas de ATP. A estos hay que
añadir las 2 moléculas de ATP formadas en la glicolisis y los 2 NADH
que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de
electrones originando 6 moléculas de ATP. En total son 38 ATP por
cada molécula de glucosa que contrastan con los 2 ATP producidos en
la fermentación.
4.5
Mecanismos de obtención de energía por microorganismos
autótrofos
A diferencia de lo que ocurre en los heterotrofos las reacciones de
mantenimiento de los autotrofos, que obtienen su carbono celular del
CO2, tienen lugar en dos fases bioquímicas distintas:
1.- Síntesis de metabolitos precursores
2.- Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos
Síntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson
Este ciclo es compartido por la mayoría de los fotoautotrofos y los
quimioautotrofos. La mayor parte de los autotrofos (aunque hay
excepciones) fijan el CO2 mediante una reacción catalizada por el
enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa 1,5difosfato en ácido 3-fosfoglicérico, a partir del cual se sintetizan
todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijación de CO2
depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato. Por consiguiente,
parte del ácido fosfoglicérico debe de utilizarse para regenerar este
aceptor de CO2 (Ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin-Benson puede
dividirse en 3 fases:
1.- Fijación de CO2
2.- Reducción del CO2 fijado
3.- Regeneración del aceptor de CO2
El ciclo de Calvin-Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridín
43
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
nucleótidos, los consume. En los autotrofos tales compuestos se
sintetizan por otros mecanismos.
Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos
A.- Quimioautotrofos
Los quimioautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la
oxidación de compuestos inorgánicos. Los substratos que pueden
servir como fuente de energía son H2, CO, H3N, NO2-, Fe2+ y
compuestos reducidos de azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de
metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan
a través de una cadena de transporte de electrones que genera ATP
por el modo que opera en los heterotrofos (fosforilación oxidativa). El
aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautotrofos
es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgánicos (H2 y
CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para
reducir directamente a los piridín nucleótidos, pero otros no lo son.
Estos agentes reductores débiles (NO2- y Fe2+) reducen los piridín
nucleótidos por un proceso llamado transporte inverso de
electrones; en el cual parte de la fuerza motora de protones
generada en el funcionamiento de la cadena normal de transporte de
electrones se utiliza para impulsar electrones en una dirección
inversa, que de otro modo sería termodinámicamente desfavorable, a
través de otra cadena que une el sustrato inorgánico con los piridín
nucleótidos oxidados que resultan por ello reducidos.
B.- Fotoautotrofos
Los fotoautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la
fotofosforilación, proceso por el que los organismos fototrofos
convierten la energía radiante de la luz en energía metabólica y
poder reductor. Existen dos tipos de fotosíntesis, la oxigénica y la
anoxigénica.
Fotosíntesis oxigénica: La generación de ATP y poder reductor se
lleva a cabo en dos centros de reacción fotoquímica diferentes
llamados fotosistema I (PSI) y fotosistema II (PSII), los cuales
contienen clorofila y se localizan en las membranas de los tilacoides.
Estos dos fotosistemas actúan de una manera conjunta en
cianobacterias, algas y plantas. i) Cuando la luz es absorbida por las
moléculas de clorofila existentes en el PSI, éstas moléculas de
clorofila se fotoactivan lo que les permite oxidarse. Los electrones
eliminados de las moléculas de clorofila del PSI son aceptados por el
NADP reduciéndose a NADPH2. Todo esto deja a las moléculas de
clorofila del PSI temporalmente deficientes en electrones lo que les
confiere una carga positiva. ii) De la misma manera, la luz absorbida
44
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
por las moléculas de clorofila existentes en el PSII provoca que un
electrón sea eliminado de cada molécula. Estos electrones pasan a
través de un sistema transportador de electrones hasta que llegan al
PSI donde son aceptados por las moléculas de clorofila deficientes en
electrones que se reducen. Este sistema transportador de electrones
es parecido al descrito en la fosforilación oxidativa, utilizándose la
energía liberada para la síntesis de ATP. La diferencia radica en que
el donador primario de electrones es la clorofila del PSII y el aceptor
terminal de electrones es la clorofila del PSI (NADH2 y O2
respectivamente en la fosforilación oxidativa). iii) En este punto la
clorofila del PSII es deficiente en electrones. Sin embargo, esta
clorofila es un fuerte agente oxidante que obtiene los electrones
necesarios para reducirse de las moléculas de H2O. Esta oxidación
del H2O genera oxígeno gaseoso. Las cianobacterias, algas y plantas
son organismos que generan oxígeno mediante la fotosíntesis
oxigénica, siendo los responsables de la producción mayoritaria del
oxígeno que existe en la atmósfera terrestre. La atmósfera de la
primitiva Tierra no contenía oxígeno hasta que se desarrollaron las
cianobacterias hace entre 1000 y 3000 millones de años. El
desarrollo de los organismos aerobios sólo fué posible después de
que se acumularan en la atmósfera apreciables cantidades de O2
(generado mediante la fotosíntesis oxigénica de las cianobacterias).
Fotosíntesis anoxigénica: Los fototrofos anoxigénicos convierten la
energía de la luz en energía química necesaria para el crecimiento;
sin embargo, y al contrario que las plantas, algas y cianobacterias en
este proceso de transformación de la energía no se produce oxígeno
y por ello se le llama fotosíntesis anoxigénica. Otra diferencia es que
los fototrofos anoxigénicos contienen un tipo de clrofila,
bacterioclorofila, diferente a la clorofila de las plantas. Estas bacterias
contienen además carotenoides, pigmentos encargados de la
absorción de la energía de la luz y posterior transmisión a la
bacterioclorofila. El color de estos pigmentos son los que le dan el
nombre a estas bacterias: bacterias rojas y bacterias verdes. En las
cianobacterias estos pigmentos captadores de luz son las ficobilinas,
de ahí su nombre: bacterias azules (cianobacterias). En las bacterias
rojas y bacterias verdes sólo existe un fotosistema, de tal manera
que la energía absorbida de la luz se utiliza para transportar un
electrón desde la clorofila a la cadena de transporte de electrones
que finalmente cede el electrón a la misma clorofila. En esta cadena
de transporte de electrones se genera la energía necesaria para
sintetizar ATP. Sin embargo, el transporte de electrones es cíclico (el
donador primario de electrones y el aceptor terminal de electrones es
la misma clorofila) no existiendo por lo tanto reducción de NADP a
NADPH. Esta reducción se lleva a cabo mediante transporte inverso
de electrones gracias a los electrones donados por el hidrógeno
45
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
gaseoso (H2) o el sulfuro de hidrógeno (H2S). En cualquier caso
nunca se produce O2.
4.6
Biosíntesis
La célula es una excelente "industria química" encargada de
ensamblar las intrincadas moléculas de la vida. Muchas de estas
sustancias químicas "fabricadas" por las células son tan complejas
que todavía no han podido ser sintetizadas artificialmente por los
químicos en el laboratorio. Sin embargo, las bacterias pueden
sintetizarlas a partir de los nutrientes y a temperatura ambiente.
Estas sustancias son:
1.- Sustancias nitrogenadas, incluyendo proteínas (como son los
enzimas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA).
2.- Carbohidratos, donde se incluyen polisacáridos complejos como
es la parte correspondiente del peptidoglucano de la pared celular.
3.- Fosfolípidos, los cuales son componentes importantes de la
membrana citoplásmica.
4.6.1
Sustancias nitrogenadas
A.-
Proteínas
El ácido glutámico es el aminoácido más importante a partir del cual
las bacterias sintetizan otros aminoácidos. En Escherichia coli el ácido
glutámico se obtiene por reducción aminada del ácido acetoglutárico. Este ácido glutámico se puede transformar en otros
aminoácidos por dos mecanismos:
Transaminación: el grupo amino del ácido glutámico se intercambia
por un átomo de oxígeno de diversos ácidos orgánicos
convirtiéndolos en aminoácidos. Por ejemplo, la síntesis de alanina a
partir de la transaminación del ácido pirúvico:
Acido glutámico (-NH2) + Acido pirúvico (=O) --------> Acido a-cetoglutárico
46
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
(=O) + Alanina (-NH2)
Alteración de la estructura molecular: la otra vía por la cual el
ácido glutámico se utiliza para sintetizar otros aminoácidos es
alterando su estructura molecular. Estos cambios estructurales
requieren energía en forma de ATP. Un ejemplo es la síntesis de
prolina:
Acido glutámico + ATP + NADH2 --------> Semialdehido del ácido glutámico +
ADP + P + NAD --------> H2O + Pirrolina-5-ácido carboxílico + NADPH2 -------> Prolina + NAD
Una vez sintetizados, estos aminoácidos deben activarse para así
poder ser utilizados en la síntesis de proteínas. Las células activan los
aminoácidos usando la energía del ATP de la siguiente manera:
Aminoácido + ATP --------> Aminoácido-AMP + Pirofosfato
La
síntesis
de
proteínas
se
verá
en
capítulos
posteriores.
B.- Acidos nucleicos
Los aminoácidos son utilizados también por las células para sintetizar
nucleótidos (bloques constituyentes de los ácidos nucleicos). Existen
dos tipos de nucleótidos según el azúcar que contengan:
¾ Ribonucleótidos: ribosa; síntesis de RNA
¾ Deoxiribonucleótidos: deoxiribosa; síntesis de
DNA
Estos nucleótidos también se clasifican en dos grupos según la base
nitrogenada que contengan:
Purinas: adenina o guanina
Pirimidinas: citosina, timina o uracilo
En la biosíntesis de las purinas se requieren los aminoácidos glicina,
aspártico y glutamina además de energía en forma de ATP y GTP
(guanosina trifosfato). En la biosíntesis de las pirimidinas se
requieren los aminoácidos glutamina y ácido aspártico así como
47
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
energía en forma de ATP. En ambos casos la ribosa fosfato se obtiene
a partir de glucosa.
Una vez que se han sintetizado los nucleótidos, éstos se activan por
ATP. En este proceso el nucleótido, que ya contiene un grupo fosfato,
adquiere otros dos grupos fosfato. Por ejemplo, la guanosina
monofosfato se activa a guanosina trifosfato:
GMP + 2 ATP --------> GTP + 2 ADP
El ATP, además de ser una molécula que intercambia energía, es la
forma activa de un nucleótido, la adenosina monofosfato (AMP), que
se utiliza para sintetizar ácidos nucleicos.
La biosíntesis de DNA y RNA a partir de los nucleótidos activados la
veremos en capítulos posteriores
Carbohidratos
Los microorganismos sintetizan carbohidratos mediante diferentes
mecanismos según sean autotrofos (CO2) o heterotrofos
(compuestos orgánicos como la glucosa) a partir de los cuales
obtienen los diferentes monosacáridos. Estos monosacáridos deben
ser activados para poder ser ensamblados en los polisacáridos
correspondientes. Por ejemplo, la forma activada de la glucosa es
uridin difosfato glucosa (UDP-Glucosa) y la fuente de energía usada
es ATP y UTP:
Glucosa + ATP + UTP --------> UDP-Glucosa + ADP + Pirofosfato
Biosíntesis del peptidoglucano de la pared celular: La síntesis
de los polisacáridos bacterianos se puede ilustrar mediante la
biosíntesis del peptidoglucano. Si bien este peptidoglucano está
localizado en la pared celular, la mayoría de la energía utilizada en
este proceso biosintético se consume dentro de la célula. Los
distintos pasos involucrados en este proceso se sumarizan en:
(i)
A partir de glucosa y utilizando ATP y UTP se obtiene Nacetilglucosamina-UDP (NAG-UDP).
(ii)
Algunas de estas moléculas de NAG-UDP se utilizan para
obtener N-acetilmurámico-UDP (NAM-UDP). La energía
requerida en este paso se obtiene a partir del
fosfoenolpirúvico.
48
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
(iii)
A cada molécula de NAM-UDP se le unen 5 aminoácidos
para formar una cadena pentapeptídica. La adición de cada
aminoácido requiere energía en forma de ATP.
(iv)
El grupo UDP del NAM-pentapéptido-UDP se reemplaza por
un lípido llamado lípido transportador.
(v)
A este NAM-pentapéptido-lípido transportador se le une una
molécula de NAG-UDP para formar una unidad completa
activada que se insertará en la cadena de peptidoglucano.
(vi)
Esta unidad completa activada se transporta, con la ayuda
del lípido transportador, a través de la membrana hacia la
pared celular.
(vii)
Una vez en la pared celular, esta unidad completa activada
se une a una cadena de peptidoglucano alargándose esta
cadena en una unidad.
(viii)
El último paso es la unión de esta cadena a otras cadenas
para formar la malla del peptidoglucano que constituye la
estructura de la pared celular. Esta unión se inicia con la
eliminación del quinto aminoácido de la cadena
pentapeptídica, reacción catalizada por el enzima
transpeptidasa. La rotura de este enlace libera energía que
es utilizada por la transpeptidasa para unir los
tetrapéptidos de dos cadenas distintas (el tercer
aminoácido de una con el cuarto aminoácido de otra).
Lípidos
Los lípidos más importantes de las células bacterianas son los
fosfolípidos que, junto con las proteínas, forman la estructura de la
membrana citoplásmica. La vía general por la cual los
microorganismos sintetizan fosfolípidos comienza a partir de
glucosa (6C) que a través de la glucolisis se oxida originando dos
moléculas de ácido pirúvico (3C) que a su vez se descarboxila a
acetil-CoA (2C); este acetil-CoA puede carboxilarse para formar
malonil-CoA (3C). Esta última reacción consume energía en forma
de ATP:
Acetil-CoA + CO2 + ATP --------> Malonil-CoA + ADP + P
El acetil-CoA y malonil-CoA son las formas activas del ácido acético y
malónico respectivamente las cuales se utilizan para sintetizar ácidos
grasos de cadena larga:
49
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
(2C) Acetil-CoA + (3C) Malonil-CoA --------> Acetil-proteína + Malonilproteína --------> (4C) Butiril-proteína + CO2 --------> + Malonil-proteína -------> (6C)-proteína + CO2 --------> + Malonil-proteína --------> --------> --------> -------> --------> (16C ó 18C)-proteína + CO2
Una vez formados los ácidos grasos de cadena larga, éstos se utilizan
para sintetizar los fosfolípidos. Para ello se necesita además glicerol
fosfato, compuesto que se obtiene por reducción de la
dihidroxiacetona fosfato que es un intermediario en la glucolisis. A
cada molécula de glicerol fosfato se le unen dos moléculas de ácidos
grasos de cadena larga para formar una molécula de ácido fosfatídico
que es un fosfolípido sencillo a partir del cual se sintetizan otros
fosfolípidos mediante la unión de otros grupos químicos al grupo
fosfato. Por ejemplo, el aminoácido serina se puede adiccionar al
ácido fosfatídico para formar fosfatidilserina. La energía que se
requiere en esta reacción se obtiene a partir de la citidina trifosfato
(CTP):
Acido fosfatídico + CTP + Serina --------> Fosfatidilserina + CMP + Pirofosfato
4.7
Mecanismos de obtención de energía por microorganismos
quimioheterotrofos
Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterotrofos son
aquellos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono
y energía. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y
casi todas las bacterias. Las vías utilizadas por los quimioheterotrofos
para la oxidación de compuestos orgánicos y la conservación de la
energía en ATP se pueden dividir en dos grupos:
1.- Fermentación: cuando las reacciones redox ocurren en ausencia
de cualquier aceptor terminal de electrones.
2.- Respiración: cuando se utiliza el oxígeno molecular o algún otro
agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aeróbica:
50
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
oxígeno; Anaeróbica:
Trimetilamina.
Nitrato,
Sulfato,
Fumarato,
Oxido
de
Fermentación
Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas sólo
ocurre una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto
orgánico y por lo tanto sólo se produce una pequeña parte de la
energía
disponible.
La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción de un
compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato
inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de
electrones. El ATP en la fermentación se produce a partir de la
fosforilación a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no
participación de un aceptor externo de electrones, el sustrato
orgánico experimenta una serie de reacciones oxidativas y reductoras
equilibradas; los piridín nucleótidos reducidos en un paso del proceso
son oxidados en otro. Este principio general se ilustra en dos
fermentaciones: la fermentación alcohólica (típica del metabolismo
anaeróbico de la glucosa por levaduras) y la fermentación
homoláctica (típica del metabolismo de algunas bacterias lácticas).
Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embden-Meyerhof: las
dos moléculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en
reacciones que implican un ulterior metabolismo del piruvato. En el
caso de la fermentación homoláctica, esta oxidación ocurre como
consecuencia directa de la reducción del ácido pirúvico a ácido
láctico. En el caso de la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico se
descarboxila primero para formar acetaldehído y la reoxidación del
NADH ocurre en paralelo con la reducción del acetaldehído para
formar etanol.
Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales
distintos al ácido láctico y al etanol debido a las diferencias en el
metabolismo del ácido pirúvico. Estos productos finales pueden ser
ácido fórmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, ácido butírico, butanol. La
mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar
varios productos finales, pero ninguna fermentación da lugar a todos
los productos finales.
Resultados de la fermentación de la glucosa. El resultado final
de la glicolisis es el consumo de glucosa, la síntesis de 2 ATP y la
producción de productos de fermentación. Para el organismo el
producto más importante es el ATP y los productos de la
fermentación son productos de desecho. Sin embargo, estos
productos son muy importantes para el cervecero, panadero,
quesero. La fermentación anaeróbica de glucosa por levaduras
51
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
produce etanol que es el producto principal de las bebidas
alcohólicas, y la producción de ácido láctico es el paso inicial en la
producción de productos lácteos fermentados incluyendo el queso.
Para los panaderos, la producción de CO2 por la fermentación de
levaduras es el paso esencial en el esponjamiento del pan.
El efecto Pasteur se produce en microorganismos capaces de
realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia (anaerobios
facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiración aeróbica,
pero pueden emplear la fermentación si no hay O2 libre en su medio
ambiente. Pasteur fué el primero en observar que el azúcar es
convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que
en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el
CO2 el principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto
indica el mayor rendimiento energético de la respiración sobre la
fermentación.
Respiracion aerobica (Rutas de utilización del piruvato por
aerobios)
La glucosa, tanto en el metabolismo respiratorio como en el
fermentativo, se transforma en ácido pirúvico por una de las
siguientes rutas:
a) Embden-Meyerhof (eucariotas y procariotas)
b) Pentosa fosfato (eucariotas y procariotas)
c) Entner Doudoroff (sólo en ciertos procariotas como alternativa a la ruta
Embden-Meyerhof)
En la mayor parte de los aerobios, el piruvato sufre una
descarboxilación oxidativa catalizada por un sistema enzimático
llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetilcoenzima A (acetil-CoA). El acetil-CoA es un metabolito precursor
que puede entrar en rutas biosintéticas; alternativamente, puede ser
oxidado completamente a CO2 a través de una ruta conocida como
ciclo de Krebs o ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Este ciclo es
la principal vía de generación de ATP en los heterotrofos aeróbicos
(por paso de electrones a través de una cadena transportadora de
electrones desde los piridín nucleótidos reducidos). El ciclo TCA
genera además tres metabolitos precursores, a-cetoglutarato,
succinil-CoA y oxalacetato. El ciclo TCA efectúa la oxidación completa
de una molécula de ácido acético a CO2, produce tres moléculas de
piridín nucleótidos reducidos, una molécula de ATP y una molécula de
52
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
FAD reducido (flavoproteína que cede electrones a una cadena de
transporte independiente de piridín nucleótidos).
Reacciones anapleróticas. El ciclo TCA, además de oxidar el acetil
CoA (dentro del ciclo) genera metabolitos precursores que son
utilizados en la biosíntesis (fuera del ciclo), por lo que requiere un
aporte de ácido oxalacético que reponga el utilizado en la síntesis de
los metabolitos precursores. Estas reacciones de síntesis de
oxalacético se denominan anapleróticas y fundamentalmente
consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el
fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el
carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: vía
acetil-CoA y vía piruvato o fosfoenolpiruvato.
Ciclo del glioxilato. Durante la oxidación de ácido acético o ácidos
grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia
de piruvato, ocurre una modificación especial del ciclo TCA conocida
como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede
generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato
(anapleróticas) ya que en los microorganismos aeróbicos no existe un
mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato
requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la
oxidación de succinato y malato, que se produce por una secuencia
de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un
intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y
glioxilato. En la segunda reacción el acetil-CoA se condensa con el
glioxilato para formar malato, el precursor inmediato del oxalacetato.
Así, el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que
permite el funcionamiento normal del ciclo TCA.
Balance energético de la respiración aeróbica. El TCA produce la
completa oxidación del ácido pirúvico en 3 moléculas de CO2 con la
producción de 4 moléculas de NADH y una molécula de FADH. El
NADH y FADH pueden ser reoxidados a través del sistema de
transporte de electrones originando 3 moléculas de ATP por NADH y
2 moléculas de ATP por FADH. También se produce una molécula de
ATP por fosforilación a nivel de sustrato en la oxidación de acetoglutarato a succinato. En total suman 15 moléculas de ATP por
ciclo. Como por cada molécula de glucosa se originan 2 moléculas de
ácido pirúvico, en total serían 30 moléculas de ATP. A estos hay que
añadir las 2 moléculas de ATP formadas en la glicolisis y los 2 NADH
que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de
electrones originando 6 moléculas de ATP. En total son 38 ATP por
cada molécula de glucosa que contrastan con los 2 ATP producidos en
la fermentación
53
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
4.8
Mecanismos de obtencion de energia por microorganismos
autotrofos
A diferencia de lo que ocurre en los heterotrofos las reacciones de
mantenimiento de los autotrofos, que obtienen su carbono celular del
CO2, tienen lugar en dos fases bioquímicas distintas:
1.- Síntesis de metabolitos precursores
2.- Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos
Síntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson
Este ciclo es compartido por la mayoría de los fotoautotrofos y los
quimioautotrofos. La mayor parte de los autotrofos (aunque hay
excepciones) fijan el CO2 mediante una reacción catalizada por el
enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa 1,5difosfato en ácido 3-fosfoglicérico, a partir del cual se sintetizan
todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijación de CO2
depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato. Por consiguiente,
parte del ácido fosfoglicérico debe de utilizarse para regenerar este
aceptor de CO2 (Ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin-Benson puede
dividirse en 3 fases:
1.- Fijación de CO2
2.- Reducción del CO2 fijado
3.- Regeneración del aceptor de CO2
El ciclo de Calvin-Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridín
nucleótidos, los consume. En los autotrofos tales compuestos se
sintetizan por otros mecanismos.
Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos
Los quimioautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la
oxidación de compuestos inorgánicos. Los substratos que pueden
servir como fuente de energía son H2, CO, H3N, NO2-, Fe2+ y
compuestos reducidos de azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de
metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan
a través de una cadena de transporte de electrones que genera ATP
por el modo que opera en los heterotrofos (fosforilación oxidativa). El
54
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautotrofos
es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgánicos (H2 y
CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para
reducir directamente a los piridín nucleótidos, pero otros no lo son.
Estos agentes reductores débiles (NO2- y Fe2+) reducen los piridín
nucleótidos por un proceso llamado transporte inverso de electrones;
en el cual parte de la fuerza motora de protones generada en el
funcionamiento de la cadena normal de transporte de electrones se
utiliza para impulsar electrones en una dirección inversa, que de otro
modo sería termodinámicamente desfavorable, a través de otra
cadena que une el sustrato inorgánico con los piridín nucleótidos
oxidados que resultan por ello reducidos.
4.9
Relaciones de las bacterias con el oxígeno
Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas
eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar.
Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno:
Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al
menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para
la captación de energía química.
Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno
inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A
estas bacterias se las califica como microaerófilas.
¾ Algunas microaerófilas lo son permanentemente
(microaerófilas estrictas).
¾ Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando
crecen usando determinadas fuentes de energía química o
de nitrógeno (microaerófilas condicionales).
Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia
de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del
oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo.
Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen
de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los
productos nocivos resultantes del oxígeno.(Por ejemplo, las especies
de Clostridium, y las arqueobacterias metanogénicas).
Anaerobias aerotolerantes (= aerodúricas): Al igual que las
anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero
soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores.
Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como
55
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama
anaerobios indiferentes.
Lectura completaría
Anexo 1
CRECIMIENTO MICROBIANO
Dr. Pedro F. Mateos
Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de
Salamanca
I.- TIEMPO DE GENERACION
II.- CURVA DE CRECIMIENTO
III.- CRECIMIENTO SINCRONICO
IV.- CULTIVO CONTINUO
V.- DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
VI.- EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO
•
•
•
•
Temperatura
pH
Agua
Oxígeno
I.- TIEMPO DE GENERACION
Las principales reacciones de la síntesis celular son reacciones de polimerización, proceso
por el cual los polímeros (macromoléculas) se sintetizan a partir de monómeros: síntesis de
DNA, RNA y proteínas; que una vez sintetizadas se ensamblan formando las estructuras
celulares tales como la envuelta celular, flagelos, ribosomas, cuerpos de inclusión, etc. En
la mayor parte de los microorganismos este crecimiento continúa hasta que las células se
dividen en dos nuevas células. El tiempo que requiere una célula para completar su ciclo es
muy variable y depende de factores nutricionales y genéticos. El intervalo que transcurre en
la formación de dos células a partir de una célula se llama generación y el tiempo requerido
para esto es el tiempo de generación.
56
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Cálculo del tiempo de generación
Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida o una
población se duplique.
t
G = ----n
Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y así
sucesivamente en cada generación. Como se puede comprobar el crecimiento se produce en
progresión geométrica:
1 generación -------------> 2 células = 21
2 generaciones -------------> 4 células = 22
3 generaciones -------------> 8 células = 23
4 generaciones -------------> 16 células = 24
5 generaciones -------------> 32 células = 25
Si partimos de N células (en microbiología los estudios se realizan con poblaciones), a un
tiempo determinado (Ta) tenemos un número de células determinadas (Na). En la primera
generación se duplicará el número de células (2Na) y así sucesivamente de tal manera que
al cabo de un tiempo determinado Tb el número de células determinadas será Nb (Nb = 2n
Na) donde n es el número de generaciones transcurridas desde Ta hasta Tb. En esta fórmula
(Nb = 2n Na) conocemos todos los parámetros excepto el número n de generaciones
transcurridas por lo que aplicando logaritmos será posible calcularlo. Una vez obtenido el
número de generaciones n transcurridas en un tiempo t podremos calcular el tiempo de
generación G para ese microorganismo.
Ta -------------> Na
1 generación -------------> 2Na = 21 Na
2 generaciones -------------> 4Na = 22 Na
3 generaciones -------------> 8Na = 23 Na
4 generaciones -------------> 16Na = 24 Na
5 generaciones -------------> 32Na = 25 Na
n generaciones (Tb) -------------> Nb = 2n Na
Nb = 2n Na
lg Nb = n lg 2 + lg Na
lg Nb - lg Na
n = -----------------------lg 2
lg Nb / Na
n = ----------------
57
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
lg 2
Nb
n = 3,3 lg -------Na
t
G = -------------------3,3 lg Nb / Na
El tiempo de generación de la levadura Saccharomyces cerevisiae es de 90 minutos y el de
la bacteria Escherichia coli es 20 minutos. Esta bacteria tiene un crecimiento muy rápido de
tal manera que a partir de una sóla célula se obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 = 480
minutos; 480 : 20 = 24 generaciones; 224 = 2 x 106 células) 2 millones de células. Esta
misma bacteria al cabo de dos días se habría multiplicado hasta 2,2 x 1043 células. Una
bacteria pesa aproximadamente 10-15 - 10-11 gramos por lo que el peso de todas estas
células es de aproximadamente 2,2 x 1030 gramos que equivalen a 8 veces el peso de la
Tierra.
II.- CURVA DE CRECIMIENTO
Es la representación gráfica del logaritmo del número de células frente al tiempo. La curva
teórica sería una recta pues los microorganismos estarían creciendo constantemente pero en
la práctica la curva presenta distintas fases:
•
•
•
•
Fase de latencia: período de adaptación de un microorganismo a un nuevo medio
de cultivo.
Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la población que se duplica a
intervalos regulares de tiempo (G).
Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por
acumulación de productos tóxicos, etc.
Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es mayor que el
número de células que se dividen.
Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en que se
encuentren (la producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase estacionaria).
III.- CRECIMIENTO SINCRONICO
Hasta ahora se ha descrito el modelo de crecimiento de poblaciones bacterianas. Estos
estudios no permiten concluir nada sobre el tipo de crecimiento de las distintas células ya
que en la mayoría de los cultivos bacterianos el tamaño celular está distribuido al azar. Para
58
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
obtener información sobre el tipo de crecimiento de las distintas bacterias debe recurrirse a
los cultivos sincrónicos, es decir, cultivos en los que todos los individuos de una población
están en la misma etapa del ciclo celular. Esto se puede conseguir por diversas técnicas:
Inducción: cambios repetitivos de temperatura o suministrando nutrientes.
Selección: filtración o centrifugación diferencial.
Una curva de crecimiento sincrónico es del siguiente tipo: el número de células del cultivo
permanece aproximadamente constante durante el tiempo en el que las células recién
formadas aumentan de tamaño; luego, el número de células se duplica de manera brusca.
IV.- CULTIVO CONTINUO
Consiste en mantener la población microbiana en fase exponencial de crecimiento. Se
utiliza en fermentaciones industriales que requieren actividad metabólica máxima. Los
sistemas de cultivo contínuo pueden hacerse funcionar como quimiostatos o como
turbidostatos. En un quimiostato la velocidad de flujo de entrada y salida de nutrientes se
mantiene a un valor determinado de tal manera que la velocidad de crecimiento del cultivo
queda ajustada a esa velocidad de flujo. En un turbidostato el sistema incluye un dispositivo
óptico que regula la turbidez controlando la velocidad de flujo.
V.- DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo
mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco,
medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad
bioquímica en relación al tamaño de la población). Todos estos métodos se clasifican en
dos apartados: métodos directos y métodos indirectos.
•
Métodos directos:
o
o
o
o
•
Recuento del número de células en una cámara Thoma
Peso seco celular
Determinación de nitrógeno o de proteínas totales
Determinación de DNA
Métodos indirectos:
o
o
o
o
o
Recuento de colonias en placa
Recuento sobre filtro de membrana
Consumo de oxígeno
Liberación de dióxido de carbono
Concentración de un enzima constitutivo
59
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
o
o
o
Decoloración de un colorante
Incorporación de precursores radiactivos
Medida de la turbidez
VI.- EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO
No todos los microorganismos responden de la misma manera a los factores ambientales, lo
que para unos puede ser beneficioso para otros es perjudicial.
Temperatura
Es de los factores ambientales que más influye en el crecimiento de los microorganismos.
Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimáticas hasta una
cierta temperatura a la cual las proteínas, DNA y otras macromoléculas son sensibles y se
desnaturalizan. Cada microorganismo tiene una temperatura mínima, óptima y máxima de
crecimiento. La temperatura óptima siempre está más cerca de la temperatura máxima que
de la mínima.
Psicrófilos: temperatura óptima baja (Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes)
Mesófilos: temperatura óptima normal (la mayor parte de los organismos)
Termófilos: temperatura óptima alta (microorganismos aislados de áreas
volcánicas)
Termófilos extremos: temperatura óptima muy alta (Thermococcus celer 103° C)
pH
Debido a que los microorganismos cambian el pH del medio cuando crecen se debe añadir
un tampón en el medio para mantener el pH constante. Estos tampones funcionan en un
rango de pH por lo que se deben utilizar diferentes tampones dependiendo del pH que se
quiera en el medio. Para pH neutros se utiliza el tampón fosfato. Los ambientes naturales
tienen un rango de pH que oscila entre 5 y 9. Los microorganismos que crecen a pH
inferiores a 5 se denominan acidófilos (Thiobacillus pH: 0,5). Los microorganismos que
crecen a pH superiores a 9 se denominan alcalinófilos (Bacillus pH: 11).
Agua
Todos los organismos requieren H2O para vivir. Las sustancias absorben en mayor o menor
medida moléculas de H2O que no están disponibles para los organismos. Esta
disponibilidad del H2O es lo que se llama potencial de agua (aw) cuyos valores van de 0 a
1. El aw del H2O pura es 1; el aw de los frutos secos es 0,7; el aw de los campos de cultivo
se sitúa entre 0,9 y 1,0.
Halófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de sales.
Osmófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de azúcares.
60
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Xerófilos: microorganismos que viven en ambientes secos.
Oxígeno
•
Aerobios
o
o
Obligados Requieren O2 para crecer (21 %)
Facultativos No requieren pero crecen mejor en presencia de O2
•
Micraerófilos Requieren pero a niveles más bajos que los atmosféricos (1 - 15 %)
•
Anaerobios
o
o
Aerotolerantes No requieren y crecen peor cuando el O2 está presente
Obligados La presencia de O2 es letal
61
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
La importancia de ser pequeño
ƒ
ƒ
ƒ
Relación superficie/volumen favorece a células de menor radio
Permite a los procariotas alcanzar mayores tamaños poblacionales en la
mayoría de los habitats microbianos, debido a mayor tasa de
crecimiento
La mayor tasa de crecimiento y el mayor tamaño poblacional permites a
estos m.o. causar importantes cambios en los parámetros físicoquímicos de un ecosistema en un tiempo relativamente corto
62
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Anexo 1
Metabolismo microbiano
Llamamos metabolismo al conjunto de reacciones de un organismo.
Para los microorganismos con los que vamos a trabajar,
normalmente quimiohetero-(organo)-trofos, podemos hacer el
siguiente esquema general del metabolismo:
Los microorganismos son sistemas que necesitan una gran cantidad
de energía para mantenerse ordenados. Esta energía se obtiene de la
oxidación de compuestos orgánicos reducidos. Los nutrientes
proporcionan esos compuestos reducidos y, en el curso de la
oxidación, se libera energía (que se acumula en forma de moléculas
almacenadoras de energía, especialmente el ATP) y se producen
elementos estructurales que servirán para la construcción de nuevas
células (crecimiento y diferenciación).
Al proceso por el que se obtiene energía y elementos estructurales
básicos a partir de nutrientes se le denomina catabolismo y al que
utiliza la energía obtenida en el catabolismo para sintetizar nuevos
componentes celulares se le denomina anabolismo. Es importante
tener en cuenta que aunque se estudie de forma separada el
anabolismo y el catabolismo, ambos tipos de procesos ocurren
simultáneamente de forma que conforme se van produciendo
elementos estructurales y energía en el catabolismo, esos elementos
se usan para formar nuevos componentes celulares en procesos
anabólicos.
A los productos metabólicos generados durante el catabolismo y el
anabolismo que tiene lugar durante el crecimiento (trofofase) se les
63
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
denomina metabolitos primarios y su producción es paralela al
crecimiento celular. Por el contrario, los productos metabólicos que
se acumulan cuando no hay crecimiento sino diferenciación celular
(idiofase), se les denomina metabolitos secundarios. En general,
puede decirse que los metabolitos secundarios se producen después
de que se han producido los primarios; aunque en ciertas condiciones
(como en cultivo continuo) se pueden producir simultáneamente.
Es conveniente considerar el metabolismo como un flujo de materia
reducida que puede oxidarse para la producción de energía o
utilizarse para la biosíntesis de nuevos elementos estructurales. No
todo el carbono presente en los nutrientes va a oxidarse
completamente ya que parte se utilizará para sintetizar nueva
biomasa. Por otra parte, no todo el carbono de los nutrientes se
utiliza para la producción de biomasa y, por consiguiente, el
rendimiento (medido tal y como se describió en otro apartado de
estas notas >>>) es siempre inferior a la unidad (en torno al 50% en
muchos casos).
La oxidación de los nutrientes consiste en la capitación de electrones
de un compuesto reducido por parte de un agente oxidante que
llamaremos aceptor final de electrones. Este aceptor final puede ser
inorgánico: oxígeno (con DG0`= -237 kJ) o NO3- con DG0`= -163 kJ;
o compuestos orgánicos tales como el fumarato con DG0`= -86 kJ.
Cuanto más negativo sea el valor de DG0`, mayor cantidad de
energía se podrá obtener de la oxidación y más eficiente será el
proceso. Por esto, puede verse que la oxidación en la que el aceptor
final de electrones es el O2 es la que más rendimiento de producción
de energía permite.
En las páginas siguientes vamos a seguir el proceso de oxidación
biológica de una molécula reducida señalando los pasos en los que se
produce la liberación de energía. El esquema general del
metabolismo se construye en torno al proceso de oxidación de la
glucosa. La ecuación general de oxidación de la glucosa es la
siguiente:
C6H12O6 + 6 O2 ® 6 CO2 + 6 H2O
DG0`= -1330 kJ/mol
En el proceso de oxidación biológica de la glucosa, los productos
finales (CO2, H2O y la energía) se producen en sitios diferentes en la
célula: el CO2 se produce en reacciones de descarboxilación, mientras
que el H2O y la energía se producen principamente en la membrana
celualr como resultado de la cadena transportadora de electrones y
de la actividad de la ATPasa de membrana.
2.- Catabolismo de la glucosa (glucolisis)
64
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
El catabolismo de la glucosa (compuesto de seis carbonos al que nos
referiremos como C6) puede ocurrir por cuatro vías diferentes:
(1) Ruta de Embden-Meyerhof (EM). Es la más común en todo tipo de
organisos incluyendo hongos filamentosos, levaduras y muchos tipos de
bacterias. Esta ruta puede funcionar tanto en condiciones aerobias como en
anaerobias y se lleva a cabo por una serie de 10 enzimas citoplásmicas. La
mayoría de los pasos de la ruta son reversibles, aunque hay tres (los
catalizados por las enzimas hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato
quinasa) que son irreversibles. En los procesos anabólicos hay unos desvíos
metabólicos para evitar estos pasos irreversibles. El resultado de la ruta EM es
el siguiente:
Glucosa (C6) + 2ADP + 2NAD+ ® 2 piruvato (C3) + 2ATP + 2NADH + 2H+
Como resultado de esta ruta se obtiene una pequeña cantidad de energía (dos
moles de ATP por mol de glucosa) por procesos de fosforilación a nivel de
substrato, se obtienen dos moles de NAD reducido (NADH+ H+) y se ha
logrado una oxidación parcial del carbono de la glucosa para producir como
metabolito final dos moles de piruvato por mol de glucosa catabolizada.
(2) Ruta de las Pentosas Fosfato (PF). Esta ruta está presente en muchas
bacterias y en la mayoría de los eucariontes. En muchos casos se lleva a cabo
simultáneamente a la tura EM descrita antes. Por ejemplo: en levaduras, entre
el 10 y el 20% de la glucosa se metaboliza porla ruta PF (el porcentaje puede
ser aún mayor en condiciones de crecimiento rápido) y el resto por la EM. La
ruta PF funciona en condiciones aerobias y anaerobias y tiene importancia en
procesos catabólicos y en anabólicos tales como en la síntesis de nucleótidos y
de aminoácidos aromáticos. La ecuación general de la ruta PF es la siguiente:
3 Glucosa-6-fosfato (C6) + 6NADP+ + 3H2O ® 2 fructosa-6-fosfato (C6) +
gliceraldehido-3-fosfato (C3) + 3CO2 + 6NADPH + 6H+
Como resultado, no se produce energía, aunque sí ocurre una
descarboxilación.La fructosa-6-fosfato y el gliceraldehido-3-fosfato son
intermediarios comunes de las rutas EM y PF. Por último, los seis moles de
NADPH+ H+ producidos en la ecuación se usan como "poder reductor" en
procesos anabólicos.
(3) Ruta de Etner-Doudoroff (ED). Es una ruta usada por un número reducido
de microorganismos carentes de la ruta EM. La mayoría son bacterias Gramnegativas tales como Pseudomonas, Rhizobium, Xhantomonas, Azotobacter y
Zymomonas. La ruta ED es muy rara en hongos. El resultado general de la
ruta ED es el siguiente:
Glucosa (C6) + ADP + NAD+ + NADP+ ® 2 piruvato (C3) + ATP + NADH +
NADPH + 2H+
65
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
Como puede verse, el rendimiento energético es menor que en la ruta EM.
(4) Ruta de la Fosfocetolasa o de Warburg-Dickens (WD).Es la ruta que siguen
ciertas bacterias lácticas (especialmente Lactobacillus y Leuconostoc). Se
puede considerar una variante de la ruta de las PF puesto que se forma un
azucar C5 y, por consiguiente, tiene lugar una descarboxilación. sin emabrgo,
en la ruta WD, la enzima fosfocetolasa rompe el azucar C5 y da lugar a dos
ramas que condicen a la formación de lactato y etanol en un proceso de
feremntación heteroláctica.
El metabolito final más relevante de esta primera fase del catabolismo de la
glucosa es el ácido pirúvico (piruvato) que se forma en las rutas EM, ED y PF
(en esta ruta, tal y como se ha descrito, se forman intermediarios que pueden
conducir a la formación de piruvato). El metabolismo central continúa, pues,
con el catabolismo del piruvato
Procesos metabólicos fermentativos I
1.- Concepto de fermentación
La palabra «fermentación» es confusa en Microbiología porque con ella se hace
referencia a cuatro tipos de procesos diferentes: el metabolismo microbiano en
ausencia de oxígeno, la producción de metabolitos secundarios, la modificación
de compuestos químicos por microorganismos en crecimiento y el crecimiento
bacteriano en sí cuando el interés del cultivo es la producción de biomasa.
El sentido en que vamos a utilizarla en la clase de hoy es el primero:
fermentación es el proceso por el que las células pueden obtener energía sin
llevar a cabo un proceso de fosforilación oxidativa. Esto es: en la fermentación,
la energía se obtiene mediante un proceso químico de fosforilación a nivel de
substrato sin que se produzca una variación neta del poder reductor de la
célula.
Los primeros estudios científicos serios sobre procesos de fermentación se
llevaron a cabo por Pasteur en el análisis de los procesos de producción y
alteración del alcohol durante la fabricación del vino.
Los procesos de fermentación son universales; esto es: se encuentran en todo
tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las
formas más antiguas de conservación de la energía.
1.1.- Diferencias entre fermentación y respiración: en los procesos de
fermentación la energía química también deriva de la oxidación de compuestos
reducidos. En cualquier proceso de oxidación se produce una transferencia de
electrones desde el compuesto reducido que se oxida hasta el compuesto
oxidado que se reduce, y en esa transferencia de electrones se produce la
66
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
liberación de energía. En los procesos oxidativos el aceptor final de los
electrones de la oxidación es el oxígeno o, de una manera más general,
cualquier compuesto inorgánico oxidado. Sin embargo, en los procesos
fermentativos, la transferencia de electrones se produce hasta llegar a un
aceptor final que es un compuesto orgánico oxidado. Por consiguiente, en un
proceso de fermentación tanto el donador de electrones como el aceptor son
compuestos orgánicos, mientras que en un proceso de respiración el donador
de los electrones es orgánico y el aceptor inorgánico.
Otra manera de plantear el mismo proceso es considerar que en un proceso de
respiración el aceptor final de electrones es siempre externo mientras que en
un proceso de fermentación el aceptor final es interno.
La respiración es mucho más efectiva energéticamente que la fermentación
porque en aquélla la oxidación del compuesto orgánico es más completa que
en esta y, como resultado de ello, se liberan 688 kcal/mol (DGo) en la
respiración de glucosa y sólo 58 kcal/mol en la fermentación. (Estos valores
hay que considerarlos a la luz de la necesidad de 7.3 kcal/mol para la síntesis
de ATP).
Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxígeno como
aceptor final de los electrones. Esto no quiere decir que en ausencia de
oxígeno sólo se pueda producir fermentación: el aceptor final de los electrones
puede ser un compuesto inorgánico oxidado que los reciba al final de la cadena
respiratoria produciéndose un proceso de fosforilación oxidativa en ausencia de
oxígeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de
respirar otras moléculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO3--) los
sulfatos (SO4=).
2.- Rutas fermentativas para la utilización del piruvato
En la oxidación de un mol de glucosa a piruvato se producen en total 2 moles
de ATP como rendimiento neto (se producen 4 moles de ATP y se consumen
dos) y se genera también un mol de NADH+H+. Cuando se produce la entrada
en el ciclo de Krebs del piruvato se va a generar una gran cantidad de
NADH+H+ que se reoxida principalmente mediante la fosforilación oxidativa.
Cuando una célula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede
reoxidarse a NAD+ y, por consiguiente, no se puede regenerar el agente
aceptor de hidrógeno necesario para las primeras fases de la glicolisis. Los
procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el NAD+ necesario
para los procesos metabólicos iniciales del catabolismo de la glucosa.
Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando
lugar a distintos procesos de fermentación que se conocen por sus productos
finales.
67
Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
2.1.- Fermentación etanólica o alcohólica: el piruvato se reduce para
formar etanol y CO2:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ® 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP
este es el proceso de fermentación que lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae
y algunas (pocas) bacterias.
Su importancia industrial es evidente: la fermentación alcohólica produce el
alcohol presente en las bebidas fermentadas (vino cerveza, etc.) y el CO2 que
se libera en esta fermentación es el causante del esponjamiento de la masa de
pan durante su fermentación. En este último caso el proceso de cocción
posterior durante la fabricación permite eliminar todo el alcohol de manera que
no queda presente en el producto final.
2.2.- Fermentación homoláctica: se denomina así la fermentación cuyo
único producto final es el ácido láctico. Su ecuación global es:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ® 2 ácido láctico + 2 ATP
Estas bacterias producen el piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la
ruta de Embden-Meyerhof (vía glucolítica clásica).
Es un proceso de fermentación presente en muchas bacterias del grupo láctico:
Streptococcus (grupo de enterococos), Pediococcus y varios grupos de
Lactobacillus.
Su importancia industrial estriba en la bajada del pH de los productos donde se
encuentran estas bacterias: esta bajada del pH como consecuencia de la
liberación de ácido láctico es suficiente para producir unos cambios químicos
en el producto (precipitación de proteínas durante el cuajado de la leche),
cambios microbiológico (protección del deterioro microbiano de alimentos
como consecuencia de la eliminación de la flora competidora) y organolépticos
(los ácidos orgánicos de cadena corta, y entre ellos el ácido láctico tienen
características de producción de sabor) que hacen de esta fermentación un
proceso muy relevante en la producción de alimentos.
La fermentación homoláctica es la causante de las agujetas producidas en los
músculos después de un esfuerzo intenso en el que la cantidad de oxígeno
aportada a las fibras musculares no es suficiente para asegurar toda la
reoxidación del NADH+H+. Las agujetas se producen por los depósitos de ácido
láctico entre las fibras musculares. Asimismo, la fermentación homoláctica es
responsable de la alteración del esmalte dental en la boca causado por
bacterias láctica flora habitual.
2.3.- Fermentación heteroláctica: denominada así porque su producto final
no es exclusivamente ácido láctico. El proceso tiene un rendimiento menor al
de la fermentación homoláctica como se desprende de la producción de sólo un
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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
mol de ATP por mol de glucosa fermentada. La obtención del piruvato en estas
bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por la ruta de las
pentosas.
La reacción global es:
Glucosa + ADP + Pi ® Ac. láctico + etanol + CO2 + ATP
Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo láctico pertenecientes a los
géneros Leuconostoc y Lactobacillus.
Industrialmente el proceso es relevante en la producción de alimentos
fermentados (por ejemplo el sauerkraut). Otra bacteria productora de este tipo
de fermentación es Lactobacillus acidophilus que facilita el metabolismo de la
leche.
2.4.- Fermentación del ácido propiónico: las bacterias que presentan este
tipo de fermentación se pueden utilizar tanto azúcares como lactato como
puntos de partida para el proceso. La ruta es un proceso complejo en el que se
genera acetato, CO2 y ácido propiónico como productos finales.
Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias del tipo Propionibacterium y
otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbívoros donde llevan a
cabo una fermentación secundaria de los productos de las fermentaciones
lácticas primarias.
Industrialmente Propionibacterium es importante en la fermentación del queso
para producir el tipo suizo: la fermentación propiónica utiliza en este caso el
lactato producido en las fermentaciones lácticas primarias produciendo CO2
responsable de los «ojos» del queso suizo y acumulación de ácidos orgánicos
de cadena corta responsables de características organolépticas.
2.5.- Fermentación ácido-mixta: La fermentación ácido mixta produce ácido
acético, etanol, H2 ,CO2 y proporciones diferentes de ácido láctico o propiónico
(fórmico) según las especies. Es un tipo de fermentación que llevan a cabo las
enterobacterias. En esta ruta de fermentación se produce ATP además de la
reoxidación del NADH+H+.
La producción de formiato o CO2 + H2 depende de la presencia en la bacteria
de una enzima denominada formiato-liasa responsable del paso. No todas las
bacterias la tienen y su actividad es detectable por la producción de grandes
cantidades de gas (el H2 es insoluble) como consecuencia de la fermentación
del azúcar.
2.6.- Fermentación butanodiólica: es una variante de la anterior presente
en algunas enterobacterias como Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la
que se da una fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta ruta se
desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol. Como paso
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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
intermedio de la ruta se produce acetoína que puede servir para la
identificación de las bacterias que presentan esta ruta mediante la reacción de
Voges-Proskauer que permite distinguir bacterias muy semejantes como
Escherichia y Enterobacter.
2.7.- Fermentación del butanol: es un tipo de fermentación llevado a cabo
por bacterias anaerobias estrictas del género Clostridium. En el curso de esta
fermentación se producen compuestos orgánicos disolventes de gran
importancia industrial y que, históricamente, han sido los primeros productos
industriales bacterianos de importancia económica relevante durante la 1ª
Guerra Mundial (trabajo de Weizmann).
3.- Rutas fermentativas de utilización de aminoácidos
En algunas bacterias del género Clostridium se producen procesos acoplados
de oxidación de aminoácidos con el objeto de producción de energía. Como en
estos procesos no se utiliza ningún aceptor externo de los electrones de la
oxidación (el aceptor es el segundo aminoácido de la pareja) técnicamente
constituyen procesos de fermentación de aminoácidos en los que se llega a la
desaminación y descarboxilación de los aminoácidos que intervienen en la
pareja.
El ejemplo más representativo es la desaminación y descarboxilación oxidativa
de la alanina a acetato acoplada con la desaminación reductiva de la glicina en
el proceso conocido como reacción de Stickland.
4.- Conclusión
Los procesos de fermentación, en sentido metabólico, son aquellos en los que
se produce una oxidación de compuestos orgánicos reducidos siendo el aceptor
final de electrones un compuesto orgánico interno que se reduce. En estos
procesos puede producirse algún rendimiento energético; pero su principal
función es la reoxidación del NADH+H+ a NAD necesario para poder iniciar los
primeros pasos del catabolismo. Los diferentes procesos pueden identificarse
por sus productos finales.
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