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Métodos para el estudio de microorganismos Técnicas microscópicas •Campo claro •Campo obscuro •Contraste de fases •I.D. de Nomarski •Fluorescencia •Confocal •Electrónica de barrido •Estereoscópica (magnificación) Métodos para el cultivo bacteriano •Medios de cultivo •Técnicas de sembrado •Aislamiento de cepas Pruebas de susceptibilidad •Conc. mínimas inhibitorias (MIC) •Conc. mínimas bactericidas (MBC) •Antibiogramas (Kirby-Bauer) Técnicas microscópicas Campo claro •Bacterias fijadas y teñidas •Confirmación de la presencia de bacterias •Determinación del Gram •Definición de la morfología celular Trayectoria óptica Diafragma del condensador Diafragma de campo Alineación de diafragmas Fondo Secciones con I.D. y C.F. Contraste Comparación C.C./C.O. /I.D. Campo obscuro •Bacterias vivas •Confirmación de la presencia de bacterias •Observación de la motilidad •Definición de la morfología celular Contraste de fases •Bacterias vivas •Confirmación de la presencia de bacterias •Observación de la motilidad •Definición de la morfología celular I.D. de Nomarski •Bacterias vivas en 3D (aparente) •Visualización de estructuras internas •Observación de la motilidad •Definición de la morfología celular Técnicas microscópicas Fluorescencia •Bacterias vivas o fijadas •Utilización de tinciones fluorescentes (fluorochromos) •Observación de bacterias individuales en mezclas •Identificación de especies definidas Confocal •Bacterias vivas o fijadas •Utilización de tinciones fluorescentes (fluorochromos) •Definición de la organización e interacción entre células •Estudio de biopelículas en diferentes planos focales Electrónica de barrido •Bacterias fijadas en 3D (real) •Estudio de componentes superficiales finos •Observación de la organización entre células •Definición precisa de la morfología celular Estereoscópica (magnificación) •Bacterias en cultivo en 3D •Observación de organización macroscópica entre células •Determinación presuntiva de la pureza de los cultivos •Estudio de la morfología de colonia Multifotones Combinaciones fluorescencia Métodos para el cultivo bacteriano Curva de crecimiento bacteriano (in vitro) Fase de latencia Fase estacionaria Fase de declinación Periodo de retardo 9 Fase exponencial 8 7 6 Periodo de aceleración Cuentas viables/ml (10log) 10 5 4 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Tiempo (hrs) 30 33 36 39 42 45 48 Medios de cultivo Medios generales y enriquecidos •Nutricionalmente complejos favoreciendo el crecimiento de un gran número de especies •Pueden ser semi-selectivos variando su composición, pH y condiciones de cultivo (O2, C°, etc.) •USO: aislamiento primario para recuperación amplia de microorganismos y mantenimiento de cepas •EJEMPLOS: agar nutritivo, infusión cerebro-corazón, soya-tripticasa, agar sangre, agar chocolate, NHK, etc. Medios selectivo •Nutricionalmente pobres con componentes que estimulan e inhiben el crecimiento de cepas específicas •Inhiben el crecimiento de la mayoría de especies y favorecen el de un número reducido de microorganismos •USO: aislamiento primario de microorganismos específicos •EJEMPLOS: agar mitis-salivarius, agar Salmonella-Shigella, medio Thayer-Martin, etc. Medios diferenciales •Por definición son también selectivos •Permiten la identificación de actividades metabólicas específicas •USO: aislamiento primario de microorganismos específicos •EJEMPLOS: agar MacConkey, agar manitol salado, agar eosina-azul de metileno, etc. Técnicas de sembrado Estría simple Estría cuádruple Estría triple Aislamiento de cepas Dispersión y dilución Obtención de la muestra 10-1 500 µl 5 ml 500 µl 4.5 ml 100 µl 10-2 500 µl 4.5 ml 100 µl 10-3 500 µl 4.5 ml 100 µl 10-4 500 µl 4.5 ml 100 µl 10-5 4.5 ml 100 µl 100 µl Sembrado Cultivo Conteo X X X Confluyente Confluyente >300 UFCs ÷ 30-300 UFCs (≈150 UFCs) ÷ 30-300 UFCs (≈ 50 UFCs) X <30 UFCs Conteo de colonias � � 𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔×𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯 𝐝𝐝𝐝𝐝 𝐝𝐝𝐝𝐝𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬ó𝐧𝐧 (𝛍𝛍𝛍𝛍) �×𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟𝐟 𝐝𝐝𝐝𝐝 𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝ó𝐧𝐧 𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯 𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬 (𝛍𝛍𝛍𝛍) 𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯 𝐝𝐝𝐝𝐝 𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝𝐝ó𝐧𝐧 (𝐦𝐦𝐦𝐦) � = 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔/𝐦𝐦𝐦𝐦 𝟓𝟓𝟓𝟓 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔 × 𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝛍𝛍𝛍𝛍 � � × 𝟏𝟏𝟏𝟏, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 𝛍𝛍𝛍𝛍 � �= 𝟓𝟓 𝐦𝐦𝐦𝐦 � � 10-3 10-4 500 µl 4.5 ml 100 µl 𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔 � × 𝟏𝟏𝟏𝟏, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 𝛍𝛍𝛍𝛍 �= 𝟓𝟓 𝐦𝐦𝐦𝐦 𝟐𝟐, 𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔 × 𝟏𝟏𝟏𝟏, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 � �= 𝟓𝟓 𝐦𝐦𝐦𝐦 𝟐𝟐𝟐𝟐, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔 � � = 𝟓𝟓, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔/ml = 𝟓𝟓 × 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟔𝟔 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔𝐔/𝐦𝐦𝐦𝐦 𝟓𝟓 𝐦𝐦𝐦𝐦 ÷ 30-300 UFCs (≈ 50 UFCs) Propagación de cepas Propagación Aislamiento Medio Enriquecido Medio Selectivo
