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Materia Biotecnología Vegetal Responsable M.C. Rocío Calderón Pascacio Grado y grupo / Carrera 2º A, B, C, D, E / TSU Agrobiotecnología Unidad temática I. Importancia de la biotecnología y requerimientos para el cultivo in vitro Fecha y horario Semana 4, Lunes 28 Enero Laboratorio Biotecnología Vegetal, ed. B Práctica 3. Establecimiento del cultivo aséptico in vitro. Introducción La fase de establecimiento del cultivo aséptico es de vital trascendencia en el cultivo de células, tejidos y órganos, ya que se requiere para poder establecer el cultivo en condiciones adecuadas y poder lograr el desarrollo o regeneración de plántulas. Existen cuatro fuentes de infección: la planta (su exterior o su interior), el medio nutritivo (mala esterilización), el aire y el operador (trabajo poco preciso). La más importante de estas condiciones es la planta misma, el material vegetal debería ser bien esterilizado antes de su aislamiento in vitro. Existen diversas formas de esterilización de los tejidos o explantes vegetales en el cual se pueden utilizar diferentes agentes desinfectantes; estos pueden ser NaClO (hipoclorito de sodio), CaClO (hipoclorito de calcio) entre otros, los cuales se pueden utilizar a concentraciones bajas y resultan muy eficientes para el control de agentes contaminantes externos. Por otra parte en algunas ocasiones es necesario controlar infecciones sistémicas o internas para ello, pueden usarse previo diagnóstico y un manejo adecuado, antibióticos o antimicóticos en los medios de cultivos. En la presente práctica se pretende que el alumno experimente, el efecto de los diferentes agentes y dosis en el control de agentes infecciosos, así como lograr establecer cultivos viables necesarios para la demás fases. Objetivo • Conocer la técnica para la desinfestación de los tejidos vegetales • Evaluar el efecto de hipoclorito de calcio y de sodio a diferentes dosis en el control de agentes infecciosos para el establecimiento del cultivo aséptico Materiales, reactivos y equipos de laboratorio 2 vasos de precipitado de 500 mL (estéril) 2 vasos de precipitado de 250 mL (estéril) 2 cajas Petri de 90mm (estéril) 1 pipeta de 10mL (estéril) 2 probetas de 500 mL (estéril) 1 pinza de disección (estéril) 1 mango para bisturí núm. 4 (estéril) 1 bisturí núm. 22 (estéril) 1 Mechero de alcohol Frascos con medio de cultivo (estéril) Alcohol etílico al 96%. Tween-20. Agua destilada (estéril) 1 agitador magnético 1 parrilla eléctrica Cámara de flujo de aire laminar (cámara de cultivo). Material que el alumno deberá traer Hojas, ápices, yemas, embriones, tallos, etc. Alcohol etílico al 70% (farmacia) Hipoclorito de sodio (cloro comercial) diluido al 10 ó 20%. Hipoclorito de calcio (4%) Encendedor o cerillos Franela Detergente Marcador indeleble Plástico adherente (para sellar los frascos) Metodología 1.- Lavar el material vegetativo a utilizar con agua corriente y detergente para eliminar residuos de polvo. 2.- Sumergir el material vegetativo en una solución de fungicida y/o bactericida (captan o agrimicin) por un periodo de 10-15 min en agitación constante utilizando un agitador de matraces en agua destilada. 3.- En condiciones de asepsia bajo una campana de flujo laminar, enjugar los tejidos con agua estéril y transferirlos a una solución de alcohol al 70% por 1 o 2 min. 4.- Transferir los tejidos a una solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 10% v/v o hipoclorito de calcio al 10% p/v) conteniendo unas gotas de tween 20 u 80 por 10 min. 5.- Enjuagar con agua estéril los tejidos, previa eliminación de solución desinfectante durante 3 veces. 6.- Realizar los cortes de tejidos utilizando pinzas y bisturí estériles; para ello se flamean con alcohol al 96%. 7.- Realizar la siembra al medio de cultivo. 8.- Sellar los frascos o tubos y etiquetarlos debidamente (Nombre del cultivo, tratamiento, fecha, grado y grupo) 9.- Posteriormente colocarlos en la cámara de incubación. 10.- Revisar a las 24 o 48h y una semana después de realizada la siembra. 11.- Calcular el porcentaje de contaminación, identificar el tipo de microorganismo (bacterias u hongos). 12.- Discutir acerca de las probables causas de contaminación, proponer medidas para evitar de nuevo la contaminación. 13.- Elaborar el reporte de práctica Bibliografía Margara, J. 1988. Multiplicación vegetativa y cultivo in vitro (los meristemos y la organogénesis). Editorial Mundi - Prensa. España (Madrid).0237 pp. Merino, M. M. E. 1987. Medio de cultivo, En: Hurtado, M. D. V. y Merino M. M. E. (Eds.), Cultivo de tejidos vegetales. Trillas. México, D. F. Pp. 67-85. Pierik, R. L. M. 1988. Preparación y composición de los medios de cultivo, En: Cultivo in vitro de las plantas superiores. Mundi - Prensa. Madrid. Pp. 49-84.