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Tecnología de ADN recombinante
Técnicas fundamentales:
- Restricción
- Clonado
- Hibridización
- PCR
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Bibliotecas de ADN = Genotecas = bancos de secuencias = libraries
“colección de clones celulares (bacterias, levaduras, etc) en las que
cada célula contiene un fragmento de ADN recombinando en un
vector”
• Genotecas de ADN genómico: contiene al menos una copia de las
secuencias contenidas en el genoma, en forma estable y en un número
manejable de clones.
• Genotecas de ADN copia (o ADN complementario): contiene todos
los ARNm bajo la forma de ADNc en un tipo celular dado y en un
momento determinado de la vida celular, en forma estable y en un
número manejable de clones.
Estrategia a seguir:
• Se aíslan todas las secuencias
en sistemas independientes
• Se amplifican
• Se seleccionan e identifican
Requerimientos generales:
• Eficiencia
• Estabilidad
• Cobertura
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Objetivos de estudio con cada tipo de biblioteca:
- Genotecas de ADNc:
- Análisis de estructura y función de secuencias exónicas, deducción de
secuencias proteicas.
- Obtención de sondas de ADNc
- Identificación de genes que se expresan en un determinado tipo o estadío
celular.
- Producción de proteínas eucariotas en bacterias
- Genotecas de ADNg:
- Análisis de estructura y función de genes (intrones, exones, secuencias
regulatorias), regiones intergénicas, etc.
- Obtención de sondas de ADNg
- Organización del genoma
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Ventajas y desventajas de la construcción de cada tipo de
genoteca:
Genotecas de ADNc
ventajas
- tamaño pequeño
- enriquecidas en secuencias según la
expresión
desventajas
-fácil degradación del ARNm
- sólo se pueden analizar secuencias
codificantes
- es difícil identificar secuencias de muy
bajo nivel de expresión
Genotecas de ADNg
ventajas
- están representadas todas las secuencias
del genoma
desventajas
- construcción laboriosa
- no todos los clones pueden expresarse en
procariotas
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Tamaño de la genoteca
“Número mínimo de clones requeridos para representar todo el
genoma de un organismo al menos una vez”
Depende de: - tamaño de los fragmentos clonados
- tamaño del genoma a clonar
Organismo Tamaño genoma Nº insertos
haploide
de 15 Kb
Nº insertos
de 35 Kb
E. coli
4,2x106
1,3x103
5,5x102
S. cerevisiae
1,4x107
2,9x103
1,1x103
D. melanogaster 1,4x108
4,3x104
1,8x104
H. sapiens
1,0x106
4,3x105
3,3x109
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N = ln (1-p)
ln(1-x/y)
N: número de clones a analizar (tamaño de la genoteca)
p: probabilidad de encontrar un una secuencia determinada
x: tamaño del inserto
y: tamaño del genoma
Consideraciones prácticas:
- No todos los clones están igualmente representados
- Pérdida de clones durante el almacenamiento y/o amplificación
- Pérdida de clones por competencia en medio líquido o sólido
- Dado que los fragmentos en una población son clonados al azar, hay un
50% de probabilidad de encontrar un gen de copia única.
El tamaño de la biblioteca debe ser entre 3 y 10 veces el tamaño
del genoma a secuenciar.
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Elección del vector de clonado
- Depende del objetivo,del tipo de genoteca y del tamaño del inserto
Plásmidos
Fagos λ
Cósmidos
Fagos P1
BAC
YAC
hasta 10 Kpb
20-40 Kpb
30-50 Kpb
70-100 Kpb
300-500 Kpb
hasta 106
- Con insertos chicos:
- Fácil manejo
- Transformación de bacterias
- Número alto de clones
- Con insertos grandes:
- Menor número de clones a manipular
- Transformación difícil
- Menor número de copias
- Crecimiento lento
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Preparación del inserto
• ADN genómico: - Fragmentación mecánica
- Restricción parcial
- Separación por tamaño
• ADN copia: - Purificación de ARNm por unión a poliT
- Síntesis de ADNc (primers oligo dT o al azar)
- Separación por tamaño
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Selección de clones
“Identificación de aquellos clones que han incorporado el vector,
contengan o no el inserto que se quería clonar”.
Plásmidos
resistencia a antibióticos
Rastreo de clones recombinantes
“Identificación entre los clones seleccionados, de aquellos que contienen
el inserto de interés”
• Hibridización
• Expresión
• Actividad
• PCR
• Restricción
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Esquema general de rastreo de colonias por hibridización
Réplica en un
disco de nitrocelulosa
Colonias sobrevivientes
de la selección
- Lisis de células
- Desnaturalización del ADN
- Fijación del ADN
Hibridización con sonda
32P-ADN o 32P-ARN
Exposición sobre una
Película de rayos X
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