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PID 6082
Microscopia de Desconvolución Digital: Desarrollo, Evaluación y Utilización en
estudios cuantitativos tridimensionales
J. F. Adur, J. E. Diaz-Zamboni, N. B. Vicente, M. F. Izaguirre, V. H. Casco*
Autores: *Laboratorio de Microscopia, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Entre Ríos (UNER). Ruta 11
km 10, Oro Verde, Entre Ríos, Argentina.
Contacto: [email protected]
Resumen
La utilización de algoritmos de desconvolución aplicados a imágenes de microscopia de
fluorescencia tridimensional (3D) puede considerarse una alternativa económica si se
compara con las modernas técnicas de microscopia 3D. Recientemente, nuestro grupo
ha desarrollado un microscopio de desconvolución digital (MDD) sobre la base de un
microscopio derecho de epifluorescencia. El sistema permite realizar un
seccionamiento óptico preciso (captura de imágenes a diferentes planos focales) de la
muestra. Las imágenes registradas son tratadas utilizando métodos computacionales,
los que trabajan utilizando la información del proceso de formación de la imagen
(desconvolución usando la función de esparcimiento puntual (PSF)). Las imágenes
procesadas son luego utilizadas para realizar estudios de cuantificación y análisis 3D
más precisos. El objetivo principal de este trabajo es evaluar los pasos de esta técnica
haciendo hincapié en la metodología para obtener resultados útiles que puedan
aplicarse a modelos biológicos. Se consideran los principales aspectos para realizar
una adecuada y precisa cuantificación.
Palabras clave: Desconvolución, PSF, cuantificación 3D, análisis de imágenes 3D
Digital Deconvolution Microscopy: Development, Evaluation and Utilization in 3D
quantitative studies
Abstract
Deconvolution of three-dimensional (3-D) fluorescence microscopy images using
computational restoration algorithms may be seen as a cheaper alternative to modern
3-D microscopy techniques. We have recently developed a digital deconvolution
microscope based upon a standard upright fluorescence microscopy setup, which
allows us to perform precise optical-sectioning procedures by positioning the sample at
different focal depths. The acquired images are then treated using computational
methods which make use of the information regarding the image-formation process
(deconvolution using the Point Spread Function, PSF). The processed images are used
to perform a more accurate 3-D quantification and analyses. The main goal of this work
is to evaluate the technical steps, highlighting the methodology to analyze the
usefulness of this approach with the aid of a biological model. In the present work we
show the main aspects to be considered in order to obtain an adequate and precise
quantification.
Keywords: Deconvolution, PSF, 3-D quantification, 3-D image analyses
Universidad Nacional de Entre Ríos. ISSN 2250-4559. Eva Perón 24; 3260 FIB Concepción del Uruguay, Entre Ríos, Argentina.
Tel: 54-03442-421558/421530, http://www.revistacdyt.uner.edu.ar/suplemento/
Introducción
En biología celular y molecular se intenta comprender las complejas funciones
celulares y las interacciones de las células con su entorno. Para poder realizar esto,
pocas evidencias son tan contundentes al investigador como los que pueden aportar
las imágenes tridimensionales. Entre los métodos actuales que permiten obtener este
tipo de imágenes podemos mencionar varios tipos de microscopía de fluorescencia 3-D
(1, 31). Estas microscopias pueden ser consideradas únicas, por su capacidad de
examinar bioestructuras y estados fisiológicos en células vivas, permitiendo el análisis
de relaciones complejas entre funcionamiento y estructura de sistemas biológicos.
Adicionalmente, la fluorescencia permite examinar funcionalmente la distribución
espacial y temporal de componentes celulares específicos, integrando de esta manera
todas las propiedades de la microscopía óptica.
Entre las técnicas de fluorescencia más utilizadas para obtener imágenes 3-D
podemos citar la Microscopía Láser Confocal (15, 29) y la Microscopía de
Desconvolución Digital (6, 10). Ambas permiten realizar, aunque de maneras diferentes,
un seccionamiento óptico de la muestra. Existen también diferencias en el modo en que
cada una de ellas minimiza la contaminación que sufre la señal en foco (imagen del
plano focal) debido a la señales fuera de foco (imágenes de planos vecinos no focales).
La Microscopía Láser Confocal utiliza un filtro físico denominado pinhole, ubicado
delante del detector, que rechaza la fluorescencia proveniente de los planos no focales.
Por su parte, la Microscopía de Desconvolución Digital, registra tanto la fluorescencia
en foco como la que esta fuera de foco. Esto resulta, en una imagen que esta formada
por información proveniente del plano focal más la contaminación de la información
fuera de foco proveniente de los restantes planos. Esta información fuera de foco es
eliminada o restaurada por medios matemáticos, utilizando las técnicas de
desconvolución, para lo cual se requiere conocer la función de transferencia del
sistema óptico utilizado. Hay ventajas y desventajas en ambas metodologías, y la
elección de cual utilizar depende de la naturaleza de la muestra, del tipo de dato
requerido y de las aplicaciones. No obstante, los dos tipos de microscopía pueden
brindar excelentes y similares resultados en cuanto a resolución (5, 16, 24).
Estas tecnologías requieren de personal especializado y equipamiento muy
costoso. Con el objetivo de contar con este tipo de tecnologías, nuestro grupo ha
trabajado sobre la actualización de los equipos de microscopía de fluorescencia
existentes en nuestro laboratorio, habiendo completado la implementación de la técnica
de Microscopia de Desconvolución Digital. En el presente trabajo se describe paso a
paso la técnica mencionada, las estrategias de implementación llevadas a cabo en
cada paso y la evaluación de las mismas. Finalmente se describen los resultados
obtenidos al aplicar la técnica a diferentes modelos biológicos reales. Datos cualitativos
y cuantitativos en tres dimensiones son analizados.
Pasos de la técnica e implementación
La Figura 1 presenta un diagrama con los diferentes niveles implicados en las
aplicaciones de la Microscopia de Desconvolución Digital (MDD) relacionadas con la
cuantificación de la expresión diferentes moléculas. Resumiendo, aplicar la técnica
conlleva a ejecutar los siguientes pasos: seccionamiento óptico del espécimen,
determinación de la función de esparcimiento puntual (PSF), desconvolución de las
imágenes, visualización 3-D y cuantificación 3-D.
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento, Vol. 1 | Nº 1 (2011) ISSN 2250-4559
Fig. 1 Diagrama donde se observan los diferentes niveles que son necesarios realizar en la Microscopia
de Desconvolución Digital
Sistema de Microscopia
El sistema desarrollado, utilizado para adquirir imágenes tridimensionales, fue
implementado sobre un microscopio directo de epifluorescencia Olympus BX50,
equipado con una lámpara de mercurio que brinda picos de luminancia en las
siguientes longitudes de onda 365/366; 404,7; 435; 546,1 y 577/579,1 nm y una torreta
que permite colocar diferentes configuraciones de cubos con filtros. Las lentes objetivas
son del tipo plano-apocromáticas con corrección al infinito, logrando una imagen
intermedia libre de aberraciones. El sistema de registro consta de una cámara
monocromática digital CCD refrigerada de 14 bits de resolución (Apogee Co.). El
sensor posee una superficie de 512x768 píxeles con un tamaño de píxel de 9 µm.
Estos dispositivos poseen alta resolución, alta sensibilidad, amplio rango dinámico,
seguridad fotométrica y estabilidad geométrica, especialmente apropiados para el
análisis cuantitativo de alta calidad en estudios bi- y tridimensionales (17).
Seccionamiento Óptico
3
ADUR, J. F. y otros | Microscopía de Desconvulsión Digital…
Acoplado al microscopio BX50, se dispuso un sistema electromecánico (motor paso a
paso y caja de reducción) que permite desplazar la platina en incrementos discretos a
lo largo del eje focal del sistema de lentes. Esto permite realizar el seccionamiento
óptico, es decir, capturar imágenes bidimensionales en cada posición focal que registra
la lente al desplazarse por el espesor completo del espécimen. El motor paso a paso se
seleccionó por permitir un control digital, que no requiere realimentación, posee fácil
control de velocidad, larga vida útil, bajo costo, interfase sencilla y mantenimiento
mínimo. La elección del mismo se definió teniendo en cuenta la resolución del sistema
BX50. Se seleccionó el motor híbrido RS 440-436 de 1,8º por paso, lo que permite con
dos pasos realizar el movimiento mínimo del equipo (3,6º), obteniéndose una
resolución de 500 nm. Al motor, se acopló una caja reductora que permitió mejorar la
resolución. Se selecciono la caja RS 718-896, que posee una relación 100 a 1, lo que
permite obtener una resolución de 5 nm, suficiente para los estudios de seccionamiento.
El acople entre el motor y la caja reductora se realizó con un kit de adaptación que es
suministrado de fabrica. Por su parte, para realizar el acople de todo el conjunto (motor
y caja reductora) al BX50, se extrajo la perilla del tornillo micrométrico y se construyó
una pieza adaptadora, que la reemplaza y permite el acople con el eje de la caja
reductora por su cara externa. El control, por simplicidad y versatilidad, se realiza
desde el puerto paralelo de la PC. Esto ofrece la ventaja de poder conectar el sistema a
cualquier PC; además de la posibilidad de escribir y leer datos en una forma sencilla.
Se utilizaron cuatro líneas de salida del puerto (una por cada bobina del motor) para
excitar las bobinas del motor paso a paso, los pulsos de excitación son generados por
programa desde la PC. Para garantizar el total aislamiento del puerto (y de la PC) con
respecto a los circuitos de potencia, se utilizaron optoacopladores entre las líneas del
puerto y el resto de la electrónica. Para más detalle del diseño ver (2). El sistema está
controlado en forma automática por un software especialmente diseñado por el grupo:
SUMDD (Software para Usuarios de Microscopia de Desconvolución Digital), el cual,
además de realizar las operaciones de seccionamiento, permite seleccionar los
parámetros de adquisición, de almacenamiento y procesamiento (desconvolución y
reconstrucción tridimensional) de las imágenes (14).
En la Figura 2, se presenta el microscopio con los sistemas descriptos
anteriormente.
Determinación de la Función de Esparcimiento Puntual (PSF)
Con el seccionamiento óptico, se obtienen imágenes que contienen información en foco
e información fuera de foco. A los efectos de obtener solo la información de interés, se
debe eliminar la fluorescencia fuera de foco. Para ello, se debe conocer la función de
esparcimiento puntual o función transferencia del sistema (PSF). La función nos
describe exactamente como se distorsiona una fuente puntual de luz al pasar a través
de las ópticas del microscopio. La determinación, se puede realizar por medio de la
utilización de las leyes de la óptica geométrica o bien por un método empírico como el
que se detalla en este trabajo. Para realizar el cálculo empírico, se necesita simular una
fuente de luz puntual. Se debe tener en cuenta que la fuente no debe ser muy pequeña
ya que no podría ser resuelta por el microscopio ni ser muy grande porque dejaría de
representar a un punto. Como se trabaja en el modo fluorescencia, se decidió utilizar
como fuente puntual a las microesferas fluorescentes del equipo F-8888 (Molecular
Probes, Eugene, OR, USA). Estas han sido diseñadas especialmente para alineación y
calibración y son muy resistentes al fotodecaimiento (34). Están marcadas con
fluoróforos excitables a la misma longitud que el fluoróforo amarillo/verde (505/515 nm)
(FITC) utilizado en los experimentos. La solución madre fue diluida (1:100) de manera
de obtener una solución con microesferas que no estén tan próximas (permitiendo
aislar para el proceso microesferas individuales), ni tan separadas (pues la escases de
éstas en el campo de visión, dificulta la intensidad de señal). Obtenida la dilución ideal,
las muestras fueron colocadas sobre el portaobjetos hasta desecación y cubiertas con
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento, Vol. 1 | Nº 1 (2011) ISSN 2250-4559
cubreobjetos. Para facilitar la estabilidad del preparado, el mismo es sellado por los
bordes con un esmalte acrílico.
2
6
5
1
3
4
Fig. 2: Sistema MDD diseñado en el Laboratorio de Microscopia de la FI-UNER para realizar estudios de
microscopia en tres dimensiones. 1 - Microscopio de epifluorescencia Olympus BX-50. 2 - Cámara CDD.
3 - Control electromecánico. 4 - Modulo electrónico. 5 - PC de control. 6 - PC de procesamiento y análisis
de imágenes.
Para que trabaje como fuente puntual (delta de Dirac), el tamaño de la
microesfera se seleccionó considerando que el diámetro de la misma sea
aproximadamente la mitad del tamaño del anillo del patrón de difracción de cada lente
(resolución de la lente). Para ello se utilizó la fórmula que se presenta en la Eq. (1)
Diámetro de la microesfera ≤ 0,61 (λ/NA)
(1)
donde: NA es la apertura numérica de la lente y λ la longitud de onda de la lámpara de
fluorescencia. Seleccionado el diámetro, la PSF se obtuvo seccionando ópticamente la
microesfera. Para ello, los desplazamientos en Z (eje del microscopio) se realizaron
respetando la simetría y se repitieron barriendo la mayor cantidad de planos por encima
y por debajo del plano focal. De esta manera, se puede capturar la distorsión
introducida por el sistema y cuantificar plano a plano el patrón de Airy. Para obtener
una buena relación señal/ruido, el seccionamiento se realiza de 3 a 5 veces en cada
posición focal y la imagen final utilizada se promedia y normaliza. En la figura 3 se
ejemplifica una galería de imágenes de una microesfera de la PSF determinada para el
microscopio BX50. Es muy importante que se conserven las condiciones de captura de
la PSF en la captura del espécimen a estudiar.
Fig. 3: Forma y geometría de la PSF determinada experimentalmente en el microscopio Olympus BX50.
A) Secciones bidimensionales de 32x32 píxeles de una microesfera fluorescente de 0,46 µm de diámetro
capturada con la lente de 40X/AN 0,85. Las secciones se hallan separadas entre sí por un ∆Z = 0,5 µm.
5
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El recuadro en rojo representa la sección en foco. Al alejarse de esta posición (hacia derecha o izquierda)
los anillos concéntricos (patrón de Airy) se hacen más notables. Para mejor visualización, las imágenes
fueron aumentadas en tres veces. B) Proyección XZ, utilizando el método de máxima proyección de
intensidades, donde la forma de reloj de arena se visualiza claramente
Desconvolución
Todos los sistemas de imágenes causan un borroneo independientemente de las otras
formas de degradación (ruido, dispersión y brillo). Éstas pueden deberse tanto al
espécimen como a la electrónica del sistema. Es precisamente esta independencia del
borroneo con respecto a los otros problemas la que hace posible su remoción por
medio de la desconvolución. Dado que el borroneo es una función del microscopio y
principalmente de la lente objetiva, éste puede ser modelado con relativa simplicidad.
Los algoritmos utilizados derivan del análisis matemático que describe el proceso de
formación de la imagen en un microscopio. Este proceso se conoce como la
convolución de dos cantidades conocidas, la PSF tridimensional, PSF (x, y, z), y una
cantidad desconocida que es la distribución tridimensional original de luz del espécimen
o (x, y, z) (7, 20, 25). Este fenómeno óptico, en su forma más simple, se describe
matemáticamente por la Eq. (2):
i (x, y, z) = PSF (x, y, z) ⊗ o (x, y, z)
(2)
donde: i (x, y, z) es la imagen tridimensional capturada por seccionamiento óptico y ⊗
es el operador convolución tridimensional. Existen diferentes algoritmos de
desconvolución (Tabla 1), diferenciándose por la forma en que trabajan con la
fluorescencia fuera de foco que distorsiona las imágenes. Los algoritmos de eliminación
(substraen la fluorescencia fuera de foco) y los de restauración (reasignan la
fluorescencia a su posición original) (26, 32, 33). El software SUMDD (14) posee
implementado entre sus opciones los siguientes métodos de desconvolución: Nearest
Neighbor, Regularized Linear Least Square, Inverse Wiener Filter y Constraines
Iterative Deconvolution.
Tabla 1. Métodos de Desconvolución. 2D: bidimensionales; 3D: tridimensionales
Nombre
- Nearest Neighbor
- Multiples Neighbors
- Wiener Filter
- Regularized Linear Least Square
- No-Linear Least Square
- Constrained Iterative Deconvolution
- Maximum Likelihood
- Constrained Maximum Likelihood
- Blind Deconvolution
Tipo
2D/Lineal
2D/Lineal
2D/Lineal
3D/Lineal
3D/No Lineal
3D/Iterativo
3D/Iterativo / estadístico
3D/Iterativo / estadístico
3D/Iterativo
Categoría
Eliminación
Eliminación
Restauración
Restauración
Restauración
Restauración
Restauración
Restauración
Restauración
El algoritmo Nearest Neighbor es fundamentalmente bidimensional y elimina
información. Realiza una operación plano por plano para cada plano 2D de una pila 3D.
Brevemente, opera tomando una sección “o” a la que se le sustrae la información fuera
de foco de sus vecinos “o±1”. El volumen es procesado aplicando el algoritmo a cada
plano de la pila. De esta forma, una estimación de la información fuera de foco es
eliminada de cada plano. Son simples computacionalmente y rápidos, pero como
desventaja aumentan el ruido y reducen el nivel de la señal fluorescente. Los
algoritmos Regularized Linear Least Square e Inverse Wiener Filter son algoritmos de
restauración y trabajan con toda la pila de secciones. Son algoritmos inversos que
trabajan con la transformada de Fourier de una imagen y la dividen por la transformada
de Fourier de la PSF. Dado que la división en el espacio de Fourier es equivalente a la
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desconvolución en el espacio real, una simple división resuelve el problema del
borroneo que es introducido por la convolución del objeto con la PSF (ver eq. 2). La
utilidad de estos métodos está limitada por la amplificación del ruido. Durante la división
en el espacio de Fourier, pequeñas variaciones del ruido en la transformada de Fourier
son amplificados en el proceso de división. Para mejorar los métodos inversos, se
utilizan los métodos iterativos con restricciones. Estos trabajan en ciclos sucesivos e
incluyen restricciones a las posibles soluciones.
Los resultados de los rendimientos y eficiencias de los algoritmos
implementados en nuestro grupo han sido presentados en diferentes estudios (8, 12,
13). Estos son coincidentes con los reportados en la literatura (4, 9, 28); se ha
demostrado que los métodos de substracción eliminan información, y dada la
característica aleatoria de la imagen del espécimen, es difícil conocer en qué
proporción se eliminan las intensidades, lo que los convierte en inadecuados para
utilizarlos en
los procesos de cuantificación. Por tal motivo, en los estudios
presentados en adelante se utiliza el algoritmo de restauración denominado Método
Iterativo con Restricción de Positividad.
Representación Tridimensional y Cuantificación
Una vez que las imágenes son desconvolucionadas y su fluorescencia restaurada, las
mismas son apiladas para representar una vista 3D. Con el software SUMDD, la
representación tridimensional se realiza a través del método de proyección de
máximas intensidades (PMI), que se halla entre las opciones de graficación. El
siguiente paso es realizar la cuantificación en el volumen completo. La cuantificación
puede realizarse sobre pilas de n secciones de 256x256 o de 512x512 píxeles. Para
identificar los objetos estudiados se trabajó con un algoritmo que utiliza un método
basado en modelos (11). El algoritmo implementa un modelo geométrico del proceso a
estudiar, estableciendo parámetros de acuerdo a las características de la señal
fluorescente y la geometría del objeto. Estos son: radio mínimo y máximo; valores de
intensidad mínima y máxima integrada en todo el volumen seleccionado y rango
dinámico de la señal. El umbral inferior de este rango se considera de forma tal que el
background de fondo (conocido por inspección de todos los planos) no sea cuantificado
como señal y el umbral superior es el valor máximo que puede capturar la cámara CCD
sin llegar a saturación. El algoritmo fue implementado en Matlab 6.5 (MathWorks, Inc.),
que permite cargar las secciones completas de todo el volumen a estudiar. En forma
resumida, en el volumen se analiza la existencia de un punto (voxel) dentro del rango
de umbrales definidos como señal. Si dicho elemento existe, el algoritmo analiza la
intensidad integrada en una esfera considerada según los radios mínimo y máximo. Si
se cumple, dicho elemento es reconocido como tal, contabilizado y almacenado con
sus tres coordenadas (x,y,z).
Evaluación
Desarrollado el control electro-mecánico (responsable de la realización del
seccionamiento óptico), el software SUMDD (controla todo el sistema) y puesta a punto
la determinación empírica de la PSF; el siguiente paso fue evaluar el funcionamiento de
la técnica.
Registro y geometría de la PSF
Para obtener una buena imagen 3D con estos sistemas convencionales, a priori no
diseñados para esta finalidad, se debe lograr un arreglo en el que el camino óptico no
sea alterado significativamente. Para ello es necesario que los especímenes sean
observados en sistemas donde el índice de refracción del medio de montaje, del
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cubreobjetos y del medio de inmersión sea idéntico para todas las longitudes de ondas
de interés. En la práctica, durante la observación de un espécimen biológico no
siempre es posible lograr las condiciones antes mencionadas. El análisis tridimensional
de especímenes gruesos, desafortunadamente, dificulta aún más el problema. Por lo
tanto, las condiciones óptimas deberán ser determinadas para cada tipo de espécimen.
Recientemente, hemos demostrado (3) que una forma práctica y sencilla de obtener
dichas condiciones consiste en variar los parámetros hasta obtener la PSF con mayor
nivel de simetría en los tres ejes.
En este trabajo, se corroboró que la PSF se comporta como un conjunto de
anillos concéntricos en el plano XY (Fig. 3A) y en los planos XZ o YZ exhibe un perfil de
“reloj de arena” (Fig. 3B). Estos resultados concuerdan con los hallados en otros tipos
de sistemas ópticos (27). Dicha determinación fue realizada, respetando las
características ideales para las que fueron diseñadas las lentes objetivas. Se utilizó un
cubreobjetos de vidrio (índice de refracción 1,51 y espesor 170 µm), así como un medio
de montaje específicamente desarrollado para tal fin (Vectashield). En el caso de la
lente de inmersión (100X), para la determinación de la PSF se utilizó el aceite de
inmersión provisto por la empresa fabricante de las lentes, cuyo índice de refracción es
de 1,518. Los resultados obtenidos para esta lente (no mostrados aquí), fueron
similares a los representados en la figura 3.
Podemos concluir que las PSFs empíricas del sistema BX50 (lente de 40X y
lente de 100X) no presentan simetría perfecta (Fig. 3). Como regla general, cuanto
mejor es la calidad de la lente y la alineación, la PSF empírica tiende a acercarse a su
forma simétrica ideal. Puesto que el microscopio usado posee lentes planoapocromáticas que están corregidas para aberraciones cromáticas, esféricas y de
curvatura; y sumado al hecho de que la alineación es una práctica rutinaria que no
produce mayores problemas; se deduce que el problema de la asimetría debe
atribuirse a los problemas introducidos por el arreglo óptico que se forma al considerar
un espécimen de gran espesor (arreglo tridimensional). Esto se verificó evaluando la
PSF cambiando diferentes parámetros del arreglo óptico tridimensional. En la Figura
4A se presenta la PSF determinada variando los espesores de los cubreobjetos, en
tanto que la Figura 4B representa las mismas imágenes de la 4A pero con el valor de
la resolución para cada condición y en la Figura 4C la PSF determinada variando el
collar de corrección de la lente de 40X. Los resultados obtenidos al variar otros
parámetros se pueden analizar en (3).
Cubreobjetos N° 0
Cubreobjetos N° 1
Cubreobjetos N° 1.5
Cubreobjetos N° 2
Fig. 4A: Vista XZ de la proyección 3D de las PSF calculadas con la lente de 40X/AN 0,85 utilizando
diferentes espesores en los cubreobjetos. En cada caso se pueden observar las distintas figuras bicónicas con sus respectivas asimetrías respecto al plano focal.
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LENTE 40X: AN0.85
Res. XY
Res. XZ
8
Resolucion (µm)
6
4
2
0
-2
50
100
150
200
250
300
350
Espesor de Cubre Objetos (µm)
Fig. 4B: Variación de la resolución lateral (negro) y axial (rojo) en función del espesor del cubreobjeto
para la lente objetiva de 40X/0,85. La resolución fue computada midiendo el FWHM para los siguientes
cubreobjetos: N°0: ≈ 100 µm, N°1: ≈ 145 µm, N°1.5: ≈ 175 µm, N° 2: ≈ 220 µm y N°3: ≈ 300 µm. Los
valores son representados como su valor medio ± el desvío estándar (M ± DE), n=10.
Collar en 0,11
Collar en 0,14
Collar en 0,17
Collar en 0,20
Collar en 0,23
Fig. 4C: Vista XZ de la proyección 3D de las PSF calculadas con la lente de 40X/AN 0,85, colocando el
collar de corrección en los diferentes valores admitidos. En cada caso se pueden observar las distintas
figuras cónicas con sus respectivas asimetrías respecto al plano focal.
En todos los casos evaluados, se verificó que la geometría más simétrica de las
PSF se obtiene cuando las lentes se utilizan según los parámetros para los cuales han
sido diseñadas.
Restauración utilizando Desconvolución
En el proceso de seccionamiento, y debido a los problemas de difracción, la pila de
imágenes de las secciones registradas de una esfera luego de pasar por un sistema de
lentes se visualizará con una cierta elongación a lo largo del eje Z. Con el proceso de
desconvolución, se procura reducir esta elongación y restaurar las dimensiones y forma
de las esferas a sus valores originales. Para cuantificar la elongación en el eje Z (eje
óptico del microscopio) cuando se realiza la reconstrucción 3D y la reducción de la
misma luego del proceso de desconvolución; se trabajó con un espécimen patrón de
forma y tamaño conocidos (Figura 5). Se eligió una esfera fluorescente como las
mencionadas anteriormente, pero de 4µm de diámetro. Esta ya no es una fuente
puntual sino nuestro espécimen control. La elongación fue cuantificada utilizando el
9
ADUR, J. F. y otros | Microscopía de Desconvulsión Digital…
FWHM (23). En todos los casos se aplicó el mismo algoritmo de desconvolución. Se
presentan dos gráficos por cada experiencia. En el primero se mide la elongación a lo
largo del eje Z; la primera columna presenta el valor de la elongación que experimenta
la esfera cuando es observada en el modo convencional (sin desconvolucionar). Este
valor fue utilizado para las comparaciones estadísticas. En el segundo grafico se
presenta el porcentaje de reducción de la elongación para cada arreglo óptico. Es decir
se cuantifica el grado de restauración logrado.
En las Figuras 6 y 7 se observa la cuantificación obtenida para la lente de 100X,
trabajando con PSF determinadas para diferentes espesores de cubre objetos (Fig. 6) y
trabajando con PSF determinadas utilizando diferentes medios de inmersión (Fig. 7).
Se observó una reducción de la elongación extremadamente significativa para todos los
cubreobjetos. Si bien entre ellos no hay diferencias significativas en la reducción que
producen, las mayores reducciones (30% y 32%) se produjeron usando los
cubreobjetos N°1.5 y N°2 (Fig. 6). La disminución de la elongación luego del proceso
de desconvolución fue extremadamente significativa para los diferentes medios de
inmersión. Si bien entre los diferentes medios no se registraron diferencias
significativas, la mejor reducción (32%) se logró utilizando aceite de inmersión, con
índice de refracción 1,51 (Fig. 7).
De los resultados, se desprende que el algoritmo iterativo esta trabajando
correctamente. La fluorescencia fuera de foco que alargaba la imagen (mas de 3 µm
respecto al tamaño original), fue reestablecida a sus posiciones originales logrando una
mejora en el diámetro de la esfera (inferior a 1µm respecto al tamaño original).
Fig. 5: Máxima proyección de intensidades de 20 secciones ópticas de 64 x 64, separadas 0,5 µm entre
sí. A) Reconstrucción 3D de una esfera de 4 µm capturada en modo convencional por un microscopio de
epifluorescencia. B) Reconstrucción 3D de la misma esfera que en A, pero luego de aplicada la
desconvolución. Las flechas amarillas marcan la elongación en el eje Z. En B se puede observar
visualmente una reducción de la elongación luego del proceso de restauración.
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8.0
7.5
Elongación en Z (mm)
7.0
6.5
MDD
6.0
∗∗∗
∗∗∗
5.5
∗∗∗
∗∗∗
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
0
1
2
3
4
5
6
7
Cubreobjetos / Diferentes espesores
Fig. 6: Cuantificación 3D de la elongación en Z. Barra 3: PSF calculada con el cubreobjetos N°0: (80 –
120 µm de espesor). Barra 4: PSF calculada con el cubreobjetos N°1: (130 – 160 µm de espesor). Barra
5: PSF calculada con el cubreobjetos N°1.5: (160 – 190 µm de espesor). Barra 6: PSF calculada con el
cubreobjetos N°2: (190 – 220 µm de espesor). La línea azul indica el diámetro real de la esfera
visualizada. Los valores son representados como su valor medio ± el desvío estándar (M ± DE), n = 4.
Los datos fueron evaluados con un análisis ANOVA utilizando el test a posteriori de Tukey-Kramer: ∗
p<0,05; ∗∗ p<0,01; ∗∗∗ p<0,001.
8.0
Elongacion en Z (mm)
7.5
7.0
6.5
MDD
6.0
∗∗∗
∗∗∗
5.5
∗∗∗
∗∗∗
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
0
1
2
3
4
5
6
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Indice de Refraccion
Fig. 7: Cuantificación 3D de la elongación en Z. Barra 3: PSF calculada utilizando como medio de
inmersión aire η=1. Barra 4: PSF calculada utilizando como medio de inmersión agua η=1,33. Barra 5:
PSF calculada utilizando como medio de inmersión glicerina η=1,47. Barra 6: PSF calculada utilizando
como medio de inmersión aceite η=1,51. La línea azul indica el diámetro real de la esfera visualizada.
Los valores son representados como su valor medio ± el desvío estándar (M ± DE), n=4. Los datos
fueron evaluados con un análisis ANOVA utilizando el test a posteriori de Tukey-Kramer: ∗ p<0,05; ∗∗
p<0,01; ∗∗∗ p<0,001.
Aplicación sobre un modelo biológico
Como ejemplo de validación experimental del sistema se trabajó, entre otros modelos,
con la piel de embriones de Rhinella (=Bufo) arenarum de diferentes estadios para
analizar el patrón de expresión de las moléculas de adhesión celular sobre la
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membrana plasmática de las células. Particularmente se analizó la proteína
Cadherina-E, la que permite identificar las uniones célula-célula en el epitelio.
Expresión 3D de Cadherina-E
En relación a este estudio, análisis previos realizados por nuestro grupo (30), han
permitido identificar un patrón de distribución lineal y uniforme de dichas moléculas
sobre el perímetro de las células. El interés e importancia de estos estudios, es que
muchas funciones de las células dependen de la regulación espacial y temporal de las
moléculas de adhesión celular (18, 21, 22, 30). Al presente, todos los estudios han sido
realizados sobre imágenes bidimensionales y dado que para dilucidar su rol en este
sistema particular es necesario conocer la regulación de su localización espacial, la
aplicación de la técnica aquí presentada nos permitió realizar por primera vez un
abordaje tridimensional al problema. Se presentan a continuación (Figuras 8, 9, 10 y
11) algunas representaciones 3D de diversos estadios analizados y dos diferentes
estudios cuantitativos en 3D (Figura 12 y 13).
Fig. 8: Máxima proyección de intensidades de secciones ópticas reconstruidas en 3D de la piel de Bufo
Arenarum, embrión de estadio 19. Volumen crudo y volumen luego del proceso de desconvolución.
Fig. 9: Máxima proyección de intensidades de secciones ópticas reconstruidas en 3D de la piel de Bufo
Arenarum, embrión de estadio 25. Volumen crudo y volumen luego del proceso de desconvolución.
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Fig. 10: Máxima proyección de intensidades de secciones ópticas reconstruidas en 3D de la piel de Bufo
Arenarum, embrión de estadio 35. Volumen crudo y volumen luego del proceso de desconvolución.
Fig. 11: Máxima proyección de intensidades de secciones ópticas reconstruidas en 3D de la piel de Bufo
Arenarum, embrión de estadio 40. Volumen crudo y volumen luego del proceso de desconvolución.
Fig. 12: Histograma de la intensidad media de fluorescencia que compara la expresión tridimensional de
cadherina E en la piel dorsal de las regiones cefálica y troncal, a lo largo del desarrollo de Bufo arenarum.
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Fig. 13: Histogramas que representan la forma de las células epidérmicas apicales a lo largo del
desarrollo de Bufo arenarum. ANOVA con test de Dunn de comparación múltiple a posteriori.
Conclusiones
La MDD permitió cuantificar tridimensionalmente cadherina E a partir del St. 17 y hasta
el St. 40, aportando valiosa información sobre los cambios en el patrón de expresión en
las uniones intercelulares, a lo largo del desarrollo. Se verificó la transición desde un
patrón “discontinuo o segmentado” a uno “continuo”, incremento en el espesor de la
banda adhesiva, del tamaño de las puncta y de la densidad molecular. Estudios
morfométricos futuros, aplicando MDD, permitirán obtener mayor información en
relación a la densidad molecular en los puntos de contactos entre dos o más células.
El contar con las representaciones 3-D y 4-D de la molécula bajo estudio, así
como con la posibilidad de rotar las imágenes, puso claramente en evidencia la
desorganización de los complejos adhesivos cuando se utilizó un inhibidor de
fosfatasas de tirosina (ortovanadato sódico). Los estudios morfométricos preliminares
aquí presentados intentan dar cuenta de la relación existente entre la forma y la
estabilización mecánica de las células. Hasta el momento, nuestro modelo de
alteración de la expresión de cadherina E no parece aportar evidencias directas entre el
nivel de expresión de cadherina E y el fenotipo epitelial epidérmico.
La técnica aquí descripta e implementada por nuestro grupo sobre un
microscopio de epifluorescencia demuestra ser una alternativa excelente y económica
para realizar estudios tridimensionales. Las adaptaciones mecánicas propuestas (con
menores modificaciones) podrían ser implementadas en cualquier otro tipo de
microscopio; lo que justifica el desarrollo presentado.
Comparada con la microscopia confocal, podemos mencionar como ventaja que
la herramienta aquí implementada tiene una mejor eficiencia en la detección dado que
utiliza una cámara CCD como sensor en lugar de un tubo fotomultiplicador como
poseen la mayoría de los microscopios confocales. Por otro lado, si bien la atenuación
de las altas frecuencias es similar en las imágenes capturadas utilizando ambas
técnicas, con el proceso de desconvolución la atenuación puede ser corregida y por lo
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tanto puede lograrse una resolución efectiva mayor, comparada con las imágenes
confocales sin procesar. Como desventaja, podemos mencionar que los resultados
obtenidos con la Microscopia de Desconvolución Digital son fuertemente dependientes
de la correcta determinación de la función PSF y de los algoritmos de desconvolución
utilizados, por lo que se requiere una inversión de tiempo y personal entrenado
específicamente en estas áreas.
La implementación de esta tecnología nos ha permitido abordar estudios
tridimensionales antes impensados, lo que ha llevado a que nuestro equipo revea y
discuta nuevas metodologías de representación y cuantificación. Las modalidades de
representación 3D utilizando rendering de superficies, animaciones y máximas
proyecciones permiten obtener visiones de estructuras en referencia a su posición
espacial. El proceso de cuantificación presenta nuevos desafíos, por lo que
actualmente se están realizando diferentes modelizaciones que representen mejor la
distribución de las moléculas de adhesión celular en la piel y sean congruentes con su
función biológica.
Referencias bibliográficas
(1) Adur J, Balducci F, García J, Vila J, Izaguirre MF, Casco V. Observación
Tridimensional. La nueva era en la microscopía de fluorescencia. En: Ciencia
Hoy 2001 (11): 22-31.
(2) Adur J, Schlegel O. Diseño, desarrollo y construcción de un sistema de avance
micrométrico para microscopios fotónicos. Tesis de Graduación inédita. 1997
(3) Adur J. Determinación de las Propiedades Ópticas de un Sistema de
Epifluorescencia y su Utilización en Estudios de Microscopía Cuantitativa 3D.
Tesis para obtener el título de Maestría, inédita. UNER. 2006
(4) Agard A. Optical sectioning microscopy: Cellular architecture in three dimensions.
En: Annual Revision of Biophysical Bioengineering. 1984 (13): 191-219.
(5) Andrews P, Harper I, Swedlow J. To 5D and beyond: quantitative fluorescence
microscopy in the postgenomic era. En: Traffic 2002; (1): 29-36.
(6) Biggs D. Clearing Up Deconvolution. En: Biophotonics International 2004 (2):
32-37.
(7) Castleman K. Digital Image Processing. Prentice-Hall, Inc. Eds. 1996
(8) Cherniz A, Adur J, Deluca G, Casco V. Informática Aplicada al Desarrollo de un
Microscopio de Seccionamiento óptico. En: Proceedings of SADIO 2002.
(9) Conchello J. An overview of three-dimensional and four-dimensional microscopy
by computational desconvolution. En: Cell Image Methods Express. Stevens Ed,
2005: 181-204.
(10) Conchello JA, Lichtman JW. Optical sectioning microscopy. En:
2005 (12): 920-931.
Nat Methods
(11) Cootes T. Model-based method in análisis of biomedical images. En: Baldock R
and Graham J Eds. Image Processing and Análisis. Oxford University Press.
2000: 223-247.
(12) Díaz-Zamboni J, Adur J, Balducci F, Cherniz A, Izaguirre MF, Casco V. En:
Proceedings of XIV Congreso Argentino de Bioingeniería. SABI 2003.
(13) Díaz-Zamboni J, Adur J, Casco V. H. Sociedad Venezolana de Métodos
Numéricos en Ingeniería. Simulación Numérica y Modelado Computacional.
Capítulo Bioingeniería. 2004: 17-24.
15
ADUR, J. F. y otros | Microscopía de Desconvulsión Digital…
(14) Diaz-Zamboni J. Software para usuarios de Microscopia de Desconvolución
Digital (S.U.M.D.D.). Tesis de Graduación. Facultad de Ingeniería-Bioingeniería
2004.
(15) Difato F, Mazzone F, Scaglione S, Fato M, Beltrame F, Kubínová L, Janácek J,
Ramoino P, Vicidomini G, Diaspro A. Improvement in volume estimation from
confocal sections after image deconvolution. En: Microsc Res Tech 2004 (2):
151-155.
(16) Fung D, Theriot J. Imaging techniques in microbiology. En: Curr Opin Microbiol
1998 (3): 346-351.
(17) Hiraoka Y, Sedat JW, Agard DA. The use of a charge-coupled device for
quantitative optical microscopy of biological structures. En: Science 1987(238):
36-41.
(18) Hortsch M, Goodman CS. Cell and substrate adhesion molecules in Drosophila.
En: Annual review of cell biology 1991 (7): 505-557.
(19) Izaguirre MF. Influencia de la Expresión de las Moléculas de Adhesión Celular
en el Desarrollo Embrionario, Larval y Metamórfico de Bufo arenarum. Tesis
Doctoral. Doctorado en Ciencias Biológicas. 2003.
(20) Jansson P. Deconvolution of Images and Spectra. 2ª Ed., Academic Press
1997.
(21) Jessell TM. Adhesion molecules and the hierarchy of neural development. En:
Neuron 1988 (1): 3-13.
(22) Kosco MH, Gray D. Signals involved in germinal center reactions. En:
Immunological reviews 1992. (126): 63-76.
(23) Kozubek M. Theoretical versus experimental resolution in optical microscopy.
En: Microscopy Research and Technique 2001. (53): 157-166.
(24) Laurent M, Johannin G, Gilbert N, Lucas L, Cassio D, Petit P, Fleury A. Power
and limits of laser scanning confocal microscopy.En: Biol Cell 1994 (80): 229240.
(25) McNally JG, Karpova T, Cooper J, Conchello JA. Three-dimensional imaging by
deconvolution microscopy. Methods. 1999 (19): 373-385.
(26) Preza C, Miller MI, Thomas LJ Jr., McNally JG. Regularized linear method for
reconstruction of three-dimensional microscopic objects from optical sections.
En: Journal of the Optical Society of America. A. 1992 (9): 219-228.
(27) Scalettar BA, Swedlow JR, Sedat JW, Agard DA. Dispersion, aberration and
deconvolution in multi-wavelength fluorescence images. En:
Journal of
Microscopy 1996. (182): 50-60.
(28) Sibarita, J. Deconvolution Microscopy. En: Advanced Biochemistry Engineering
and Biotechnology 2005. (95): 201-243.
(29) Sprague BL, Müller F, Pego RL, Bungay PM, Stavreva DA, McNally JG.
Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by
fluorescence recovery after photobleaching. En: Biophys. J. 2006 (4): 11691191.
(30) Vitetta ES, Berton MT, Burger C, Kepron M, Lee WT, Yin XM. Memory B and T
cells. En: Annu Rev Immunol 1991 (9): 193-217.
(31) Vonesch C, Aguet F, Vonesch J, Unser M. Molecular and cellular bioimaging.
The colour revolution in bioimaging. En: IEEE Signal Processing Magazine
2006; 23 (3): 20-31.
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento, Vol. 1 | Nº 1 (2011) ISSN 2250-4559
(32) Wallace W, Schaefer LH, Swedlow JR. A workingperson's guide to
deconvolution in light microscopy. En: Biotechniques 2001 (31): 1076-1078.
(33) Wang YL. Digital deconvolution of fluorescence images for biologists. En:
Methods in Cell Biology 1998 (56): 305-315.
(34) Zhang YZ, Carter D. Multicolor fluorescent microspheres as calibration
standards for confocal laser scanning microscopy. En: Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 1999 (7): 156-163.
17
ADUR, J. F. y otros | Microscopía de Desconvulsión Digital…