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ARQUITECTURA CONFOCAL CON DETECCIÓN EN DOBLE BRAZO
M.T. Caballero 1, C. Ibáñez-López 2, A. Pons 2 y M. Martínez-Corral 2
1
Departamento de Óptica, Universidad de Alicante, 03080 Alicante
2
departamento de Óptica, Universidad de Valencia, 46100 Burjassot
1. Introducción.
La principal característica de los sistemas confocales de barrido es su capacidad de seccionado óptico. Sin embargo, la resolución axial de dichos dispositivos es, incluso en las condiciones más favorables, unas tres veces peor que la resolución transversal. En los últimos
años se han propuesto diferentes técnicas para disminuir esa anisotropía. En este contexto
destaca la técnica de microscopía confocal 4Pi [1], en la que se obtiene un importante estrechamiento de del lóbulo central de la respuesta unidad axial mediante la interferencia de dos
haces contrapropagantes fuertemente focalizados. Para este fin, también se ha propuesto el
uso filtros pupilares, bien puros de amplitud [2], o bien puros de fase [3,4].
Una técnica alternativa para mejorar la resolución axial de los sistemas confocales es la
técnica de imagen sustractiva. Esta técnica permite la obtención de una imagen sintética superresolvente mediante el uso de un sistema confocal de doble brazo. Hasta el momento, esta
técnica ha sido utilizada únicamente para mejorar la resolución transversal [5]. Nuestro propósito en esta contribución es extender el uso de las arquitecturas confocales de doble brazo a
la formación de imágenes 3D. El dispositivo que se propone consta de un brazo de iluminación que focaliza en un punto de la muestra la luz procedente de una fuente monocromática.
La emisión fluorescente se divide en dos haces, que se hacen focalizar en dos detectores puntuales diferentes. Una combinación lineal adecuada de las dos imágenes obtenidas permite
mejorar la capacidad de seccionado óptico del sistema en un 25%.
2. Dispositivo confocal de dos brazos.
Considérese el dispositivo confocal que
se muestra en la Fig. 1. En dicho sistema la
muestra fluorescente es iluminada por un haz
monocromático fuertemente focalizado. La
luz emitida, por fluorescencia, por la muestra
se divide en dos haces, que son focalizados
independientemente en dos detectores puntuales. Este sistema permite la adquisición en
paralelo de dos imágenes confocales del objeto. Una de las imágenes se obtiene con una
configuración confocal en la que tanto el camino de iluminación como el de colección
tiene diafragma de abertura circular (camino1). Para la segunda imagen, se inserta en el
camino de colección un filtro pupilar (camino-2). La distribución de intensidades correspondientes a las dos imágenes obtenidas vale:
Fig. 1. Esquema del dispositivo confocal con detección en doble brazo.
{
}
I i (r , z ) = hil (r , z ) hdet i (εr , εz ) ⊗ 3 O (r , z ) = PSFi (r , z ) ⊗ 3 O(r , z ) donde i = 1,2
2
2
(1)
En esta ecuación, hil (r , z ) representa la respuesta unidad en amplitud del sistema de
iluminación, mientras que hdet i (r , z ) representa la de colección. La función O(r , z ) describe la
distribución espacial de fluorosforos en la muestra. El parámetro ε = λil / λdet aparece debido
a la diferencia entre la longitud de onda de excitación y la de fluorescencia.
El sistema confocal de dos brazos permite la obtención en paralelo de dos imágenes
confocales de la misma muestra. Nuestro propósito es crear una imagen sintética combinando
adecuadamente las imágenes independientes. La distribución de intensidades de la imagen
sintética es
I syn (r , z ) = I1 (r , z ) − γ I 2 (r , z ) = PSFsyn (r , z ) ⊗3 O (r , z ) ,
(2)
siendo
PSFsyn (r , z ) = PSF1 (r , z ) − γ PSF2 (r , z ) = hil (r , z ) hdet1 (εr , εz ) − γ hill (r , z ) hdet 2 (εr , εz ) (3)
2
2
2
2
donde γ ∈ ℜ + .
Para crear una imagen sintética superresolvente
axialmente, proponemos insertar en el camino-2 un
filtro pupilar cuya respuesta unidad axial sea nula en
foco. Sustrayendo entonces la imagen obtenida a
través del camino-2 de la obtenida por el camino-1,
es posible obtener una respuesta unidad sintética en
la cual el lóbulo central axial se ha estrechado significativamente. Para esta tarea hemos seleccionado el
filtro que se muestra en la Fig. 2. Este filtro, obtenido
tras un proceso de optimización, proporciona una
pendiente máxima en la respuesta unidad axial en las
proximidades del foco.
Fig. 3 Respuesta unidad axial del sistema confocal de doble brazo.
Fig. 2 Transmitancia en amplitud del filtro pupilar seleccionado.
Fig. 4 Intensidad integrada para los sistema de
uno y de dos brazos.
Seguidamente, en la Fig. 3 se muestra el proceso de síntesis de respuesta unidad. Con
línea discontinua hemos representado la función PSF1 (0, z N ) , donde z N = n(1− cosα )z / λexc .
Nótese que esta curva representa simplemente la respuesta unidad axial de un sistema confocal. Con línea punteada hemos representado la función PSF2 (0, z N ) que, lógicamente, presenta un valor nulo en el origen. Finalmente con línea continua hemos representado respuesta
unidad sintética para el caso γ = 1.5 . En la Fig. 4 comparamos la intensidad integrada para las
arquitecturas de uno y de dos brazos. Las prestaciones del sistema de dos brazos, en comparación con las del de uno se resumen en la Tabla 1.
PSF AXIAL
Anchura en
Anchura en
PSF( z N ) = 0.01
PSF( z N ) = 0.5
INTENSIDAD INTEGRADA
Anchura en
Anchura en
I int ( z N ) = 0.01
I int ( z N ) = 0.5
Confocal
un brazo
1.54
(100%)
0.68
(100%)
1.78
(100%)
0.68
(100%)
Confocal
dos brazos
1.02
(66%)
0.54
(79%)
1.34
(75%)
0.58
(85%)
Tabla 1
Por último, en la Fig. 5 mostramos el resultado de un experimento numérico en el se
obtiene la imagen de un objeto test constituido por dos esferas fluorescentes concéntricas.
Nótese como en la dirección axial la definición de la imagen proporcionada por el sistema de
doble brazo es claramente superior.
Fig. 5 Experimento numérico de formación de imágenes. (a) Objeto test; (b) Imagen proporcionada
por un sistema confocal de un brazo; (c) Imagen proporcionada por el sistema de doble brazo.
Agradecimientos
Los autores agradecen la ayuda financiera proporcionada por el Plan Nacional I+D+I
del Ministerio de Ciencia y Tecnología (Proyecto DPI 2000-0774). C. Ibáñez-López disfruta
de una beca FPI financiada por la misma institución.
Referencias
[1] S. Hell y E. H. K. Stelzer, J. Opt. Soc. Am. A 9 (1992) 2159.
[2] M. Martínez-Corral, P. Andrés, C. J. Zapata-Rodríguez y M. Kowalczyk, Opt. Commun.
165 (1999) 267.
[3] M. A. Neil, R. Juskaitis, T. Wilson, Z. J. Laczik y V. Sarafis, Opt. Lett. 25 (2000) 245.
[4] C. J. R Sheppard, Opt. Lett. 24 (1999) 505.
[5] G. Boyer y V. Sarafis, Optik 112, (2001) 177.