Download enfermedades de los lagomorfos en la lista b mixomatosis

SECCIÓN 2.8.
ENFERMEDADES DE LOS LAGOMORFOS EN LA
LISTA B
CAPÍTULO 2.8.1.
MIXOMATOSIS
RESUMEN
La mixomatosis es una enfermedad del conejo europeo causada por el virus del mixoma, un
miembro de los Poxviridae. El diagnóstico de la mixomatosis, independientemente de su forma
clínica, depende del aislamiento e identificación del virus o de la demostración de sus antígenos.
La presencia de una respuesta inmune humoral facilita el diagnóstico retrospectivo de una forma
suave de la enfermedad, y puede constituir una indicación de la prevalencia de la infección en una
población de conejos. La enfermedad se caracteriza por lesiones cutáneas globales de tipo
mixomatoso.
Identificación del agente: Cuando se presentan lesiones de piel en un conejo muerto, se puede
demostrar el antígeno vírico por pruebas de inmunodifusión con fragmentos de las lesiones. Los
cultivos celulares de riñón de conejo en monocapa muestran el efecto citopático carácterístico de
los poxvirus. La presencia de virus se puede confirmar por inmunofluorescencia y por tinción
negativa en microscopía electrónica.
La inoculación de conejos con material sospechoso tarda más en identificar la infección, pero sirve
para confirmar la presencia del virus infeccioso e indicar su patogenicidad.
Pruebas serológicas: La identificación y titulación de anticuerpos específicos que se originan por
inmunización natural o por vacunación se hace por la fijación de complemento tradicional o por un
enzimoinmunoensayo (ELISA) desarrollado recientemente y más sensible, que no es afectado por
factores pro– o anti–complemento. La dificultad de obtener muestras de sangre de miembros
representativos de una población se puede eliminar tomando sangre seca en papel de filtro; ésta
se puede luego extraer y examinar por la prueba de inmunofluorescencia indirecta o mediante
ELISA. También se puede utilizar en ensayos ELISA el muestreo de sangre por microcapilaridad.
Las pruebas cualitativas de inmunodifusión en medio sólido tienen la ventaja de detectar tanto el
antígeno como los anticuerpos humorales.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Para la inmunización de conejos
se dispone de vacunas con virus vivos modificados preparados del virus del fibroma o de cepas
modificadas del virus del mixoma.
A. INTRODUCCIÓN
La mixomatosis es una enfermedad vírica del conejo europeo (Oryctolagus cuniculus) causada por el virus del
mixoma, un miembro de los Poxviridae. El virus tiene un tropismo característico para la piel, causando una
manifestación dérmica nodular, o un tropismo para el tracto óculo–respiratorio, causando la forma no
mixomatosa. Afecta a los conejos de todas las edades y razas, con virulencia variable, originando lesiones
dérmicas inflamatorias, generalización y posiblemente la muerte eventual del animal por infecciones bacterianas
secundarias o por inanición. El virus se transmite a conejos susceptibles por insectos picadores, como pulgas o
mosquitos. Si están muy juntos, es posible una transmisión limitada de conejo a conejo.
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En el sitio de infección aparece a los 2–5 días una lesión primaria de mixoma, seguida de conjuntivitis (que es un
síntoma de infección sistémica), inflamación de la región anogenital, y formación de lesiones dérmicas
secundarias en otros sitios diferentes. En la forma óculo-respiratoria, la lesión primaria es normalmente
una mácula inflamatoria rosada seguida de catarro óculo-nasal. Las cepas virulentas pueden matar un conejo en
10–15 días. No hay riesgos sanitarios para los humanos que trabajan con el virus del mixoma.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
El envío de muestras para el diagnóstico en el laboratorio es muy importante, porque los síntomas de la
enfermedad se hacen menos singulares a medida que se atenúan las cepas de virus. Las diferentes técnicas
disponibles varían en su capacidad para distinguir el virus del mixoma en lesiones mixomatosas típicas, en
edema de los párpados o en el edema genital. En las lesiones atípicas, estas técnicas distinguen entre la
infección por el virus del mixoma y la debida al virus del fibroma de Shope.
1.
Identificación del agente
Se corta con tijeras una porción de la lesión y se la separa de la epidermis y de la dermis superficial. Se lava con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) con antibióticos, como se indica más adelante, y se homogeniza en
mortero de vidrio a una dilución en proporción de 1 g de tejido/4.5–9 ml de PBS. Las células se lisan con dos
ciclos de congelación y descongelación, o por ultrasonicación para liberar los virus y los antígenos víricos. Esta
suspensión se centrifuga a 1.500 g durante 5–10 minutos. El sobrenadante líquido es el material utilizado en las
pruebas.
a)
Cultivo
El aislamiento del virus en cultivo celular se realiza utilizando cultivos primarios de células de riñón de
conejo (RK), o líneas celulares establecidas, como la RK–13, que se crecen en medio mínimo esencial
(MEM) que contiene 5% de suero de ternero, 100 unidades internacionales (UI)/ ml de penicilina; 100 µg/ml
de estreptomicina; 100 µg/ml de gentamicina; 50 UI/ml de nistatina (micostatín); y 5 µg/ml de anfotericina
(fungizona). El inóculo es el sobrenadante de una lesión homogeneizada o una descarga óculo–respiratoria
en medio Opti–MEM con 2% se suero de ternero y antibióticos. El medio se elimina de la capa celular
después de 2 horas. La capa celular se lava con un pequeño volumen de medio y luego se rellena con
medio de mantenimiento (Opti–MEM).
El efecto citopático (ECP) típico de los poxvirus (10) se desarrolla por lo general en 24–48 horas (37°C y
5% de CO2), pero con algunas cepas se tarda hasta 7 días en observar el ECP. Los grupos de células con
un citoplasma confluente forman sincitios cuyo tamaño varía de 2 a 50, o incluso a 100, núcleos juntos,
dependiendo de la cepa del virus. Los núcleos de algunas células cambian, y la cromatina forma
agrupaciones basófilas que varían en número y tamaño y dan al cultivo una apariencia de piel de leopardo.
Si se presentan inclusiones intracitoplásmicas eosinófilas, éstas son escasas. Las células afectadas se
redondean, se contraen y aparecen con picnosis. Se lisan y llegan a despegarse del soporte de vidrio o de
plástico. Más tarde, todas las células se presentan afectadas y la monocapa celular se despega por
completo.
El virus del fibroma de Shope produce al principio masas voluminosas y bien definidas de células
redondeadas, que se multiplican y amontonan (10). Por el borde, las células recién infectadas muestran
cambios nucleares suaves e inclusiones citoplásmicas eosinófilas que son muy numerosas en los primeros
estadios. La capa celular resulta destruida al cabo de varios días.
b)
Métodos inmunológicos
Las pruebas de inmunodifusión en medio sólido (IGDA) son simples y rápidas de realizar con resultados
que pueden obtenerse en 24 horas. Las placas de agar se preparan con agar Noble (0.6 g), ácido etilén
diamino tetra–acético (EDTA) (2,5 g), cloruro sódico (4,5 g), y agua destilada (500 ml) que contiene
tiomerosal (mertiolato) a una dilución 1/100.000. El antisuero estándar (ver más abajo), y la muestra a
ensayar se colocan en pocillos opuestos de 6 mm de diámetro y separados 5 mm. Otra técnica consiste en
depositar directamente un pequeño trozo de la lesión en el agar, separado 5 mm de un disco de papel de
filtro impregnado con el antisuero. En 48 horas aparece un número de líneas de precipitación, normalmente
hasta tres, que indican la presencia de antígenos del virus del mixoma. En presencia de reacciones
heterólogas con el virus del fibroma de Shope, sólo se forma una línea.
Las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se pueden aplicar a los cultivos a partir de las 24 horas.
Las pruebas IFI revelan la multiplicación intracitoplásmica del virus, pero no son capaces de distinguir entre
el virus del mixoma y el del fibroma. La inoculación de células de embrión de pollo (tripsinizadas a los
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11 días de incubación del huevo) no origina ECP, pero resulta útil para detectar los antígenos víricos por
pruebas IFI.
c)
Microscopía electrónica
Se puede aplicar a una porción de la lesión una tinción negativa para microscopía electrónica (EM). La
técnica es simple y rápida, dando resultados en 1 hora. Se coloca alrededor de 1 mm3 de tejido en una
lente de vidrio y se añaden tres gotas de agua destilada. Después de 1–2 minutos a temperatura ambiente,
se coloca sobre el líquido una rejilla para EM recubierta de formvar y carbón. Después de 1 minuto se
elimina con papel de filtro el exceso de líquido y se añade inmediatamente sobre la rejilla una solución
acuosa de molibdato amónico al 2%. Después de 10 segundos se elimina el exceso de líquido con papel de
filtro y se prepara la rejilla para el microscopio electrónico. En un caso positivo, se pueden ver las típicas
partículas de poxvirus. Por este método, no se puede distinguir el virus del mixoma del virus del fibroma.
d)
Pruebas de inoculación
La inoculación intradérmica en conejos también supone un modo de identificar el virus por sus
características y patogenicidad especial, principalmente por el tropismo cutáneo (forma nodular) y el
tropismo óculo–respiratorio (forma no mixomatosa). Si es posible, esta prueba debe evitarse, pero tiene la
ventaja de ser un indicador de la virulencia, dependiendo del tipo de inflamación en las lesiones (infección
local o sistemática), la extensión de las lesiones y el tiempo de supervivencia, y permite distinguir entre el
virus del fibroma (con su lesión local fibromatosa) y el virus del mixoma (capaz de ocasionar infección
generalizada en adultos). Los conejos deben ser de raza doméstica, de 2 Kg. de peso aproximadamente,
no vacunados, y ensayados previamente respecto a la ausencia de anticuerpos (10).
El inóculo puede ser el sobrenadante líquido de una lesión homogeneizada (con antibióticos) o el producto
de un cultivo celular. Se administran intradérmicamente entre 0.1 y 0.2 ml detrás de la oreja o en la región
dorso–lumbar, previamente depilada. El inóculo se puede ensayar inyectando diluciones seriadas en
solución salina tamponada, cada dilución en un sitio. En 2–5 días aparecerá una lesión primaria en los sitios
de inóculo, seguida de conjuntivitis. Se puede obtener una dosis infecciosa media (ID50) utilizando cinco
sitios para cada dilución. Si el animal sobrevive, se puede confirmar la enfermedad serológicamente 15 días
más tarde.
2.
Pruebas serológicas
Los anticuerpos aparecen en 8–13 días. En las formas no letales y en conejos vacunados, el título es mayor
después de 20–60 días; desciende después, y desaparece a los 6–8 meses en ausencia de reinfección
(respuesta serológica evaluada por la prueba de fijación de complemento [FC]) (12).
Se pueden utilizar varias pruebas serológicas pero las más apropiadas para el comercio internacional y para
otras aplicaciones son (en orden de sensibilidad creciente) las de FC, IFI e inmunoensayo (ELISA). Estas
pruebas requieren antígenos y antisueros estandarizados. El antígeno se puede preparar de la cepa Lausanne, o
alguna cepa antigénicamente relacionada, propagada en conejos o en cultivos celulares.
•
Preparación de reactivos estándar
Las lesiones mixomatosas se obtienen de conejos a los 6–7 días de la inoculación y se homogenizan
tampón veronal a una dilución 1/5. El antígeno es el sobrenadante que se obtiene después de
centrifugación. Cualquier actividad anticomplementaria se elimina añadiendo cloroformo al 0,6%.
antígeno se puede congelar a –30°C o –70°C para almacenamiento o se puede utilizar directamente
pruebas FC después de la titulación con un antisuero estándar.
en
la
El
en
Para el antígeno hecho de cultivos celulares se utilizan las líneas RK–13. El virus se recoge como
suspensión celular 48 horas después de la infección, y se centrifuga. Se mantiene el sobrenadante. El
sedimento celular se homogeniza (suavemente) o se somete a ultrasonicación (continua durante 3 minutos
o con pulsos discontinuos durante 5 minutos, a 100 vatios), se resuspende y se recentrifuga, y el
sobrenadante que resulta se añade al anterior. El sobrenadante final es el antígeno y se guarda a –20°C o
–70°C (para conservación más duradera). Se titula en cultivos celulares antes de su utilización en pruebas
de neutralización del virus (NV).
Respecto al antisuero estándar, se vacuna un conejo adulto seronegativo con una cepa atenuada del virus
del mixoma, o con el virus del fibroma de Shope. Después de 3–4 semanas, el conejo se inocula con
material de lesión mixomatosa derivada de la cepa Lausanne del virus. El suero se obtiene 3 semanas
después y se titula por la prueba de FC. Si el título es 1/640 o más, el animal se sangra y el suero se
congela a –20°C.
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•
Titulación de reactivos estándar
i)
Inactivar el suero estándar durante 30 minutos en un baño con agua a 56°C. No existe un suero
internacional estándar para la mixomatosis, pero se deben preparar estándares internos positivos y
titularlos en el intervalo adecuado utilizando la prueba FC. Después de esto, se usa el siguiente
procedimiento con lotes estandarizados de antígeno.
ii)
Utilizando una placa de microtitulación de 96 pocillos con fondo redondeado, hacer diluciones
seriadas dobles del suero estándar en un tampón calcio/magnesio/veronal (CMV), pH 7,2, desde 1/2 a
1/4096, utilizando en cada línea un pocillo por cada dilución y 25 µl de volumen.
iii)
Utilizando tubos, hacer diluciones dobles del antígeno en CMV, de 1/10 a 1/1.280.
iv)
Añadir 25 µl por pocillo de la misma dilución de antígeno, (transferido de los tubos) a cada dilución en
una línea de la placa, de 1/10 a 1/1280, verticalmente.
v)
Añadir 25 µl de complemento por pocillo (6 unidades H50 [50% de hemolisis]).
vi)
Incubar las placas cubiertas con un film de plástico, durante 1 hora a 37°C o 14 horas a 4°C.
vii)
Añadir 50 µl por pocillo del sistema hemolítico (eritrocitos de oveja al 2,5% [RBCs] y un volumen igual
de suero anti–RBC de oveja a 1/200, ambos en CMV).
viii) Cubrir de nuevo la placa e incubar 30 minutos a 37°C.
ix)
Determinar la dilución más alta de antígeno que da hemolisis completa (H100) con la dilución más alta
de suero estándar. En 25 µl de esta dilución de antígeno hay 1 unidad antigénica (AgU).
Las pruebas NV (12) se pueden llevar a cabo en placas de microtitulación con grado para cultivo celular y
de fondo redondeado, utilizando el método virus constante/suero variable con 100 DICT50 de virus (dosis
infectiva media en cultivo de tejidos).
Las pruebas FC (12) se hacen en tubos o en placas de microtitulación (4) por métodos convencionales,
registrando el 100% o el 50% de hemolisis. En la actualidad, éste es el método estándar.
a)
Prueba de fijación de complemento
i)
Titular el complemento en tubos de hemolisis, en presencia de 1 AgU, para determinar la unidad H50.
ii)
Inactivar los sueros control positivos y negativos en un baño de agua a 56°C durante 30 minutos.
iii)
Hacer diluciones dobles seriadas de los sueros de ensayo y los sueros control en CMV, de 1/4 a
1/1.024, utilizando una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondeado y 25 µl por pocillo.
Utilizar el primer pocillo para la dilución inicial 1/4 y el segundo como un control de suero (control
anticomplementario a dilución 1/4). Preparar los pocillos de control para antígeno, complemento y
RBC (dos pocillos en cada caso).
iv)
Añadir 1 AgU en 25 µl por pocillo (excepto en los pocillos de control de suero, complemento y RBC),
luego añadir 6 H50 de complemento por pocillo (excepto en el pocillo para control de RBC).
v)
Incubar las placas cubiertas con un film de plástico, durante 14 horas (toda la noche) a 4°C.
vi)
Añadir 50 µl por pocillo de suero hemolítico.
vii)
Cubrir de nuevo las placas e incubar 30 minutos a 37°C.
viii) Preparar controles de hemolisis H100, H75, H50, H25 utilizando controles de complemento (H100) y
CMV.
b)
ix)
Después de la centrifugación o sedimentación pasiva a 4°C, proceder a las lecturas. Los resultados
del suero de ensayo se determinan como la dilución más alta de suero que da al menos una inhibición
de la hemolisis del 50%.
x)
Un suero negativo debería dar una inhibición de la hemolisis <50% a dilución 1/4.
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
La prueba IFI (7) se realiza utilizando cultivos celulares de embrión de pollo en pocillos de
fondo redondeado de placas de microtitulación: se distribuyen en todos los pocillos 200 µl de una
suspensión celular, diluida al 1/1.000 en medio, y en 24 horas se forma una monocapa celular confluente.
El medio se elimina y se añade a cada pocillo 100 µl de suspensión de virus que contenga 104 DICT50.
Después de 2 horas, se añaden 100 µl de MEM que contenga 2% de suero de ternero. Después de
incubar 48 horas, las placas se lavan con PBS y se fijan con acetona que contenga 15% de agua durante
30 minutos a –20°C. Luego se secan las placas a 37°C durante 15 minutos. Las placas se pueden guardar
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a –30°C o –70°C durante 3 meses. Los sueros se prueban por IFI utilizando IgG anti–conejo conjugada a
isotiocianato de fluoresceína. Los resultados de la prueba pueden ser cualitativos con sueros diluidos 1/10 o
1/20, o cuantitativos con diluciones seriadas de suero.
c)
Enzimoinmunoensayo
Un método ELISA desarrollado recientemente (6) usa un virus de la mixomatosis purificado parcialmente
(cepa hipervirulenta francesa T1, relacionada antigénicamente con la cepa Lausanne) producido en RK–13.
El virus se recoge a las 48 horas de la infección como una suspensión de células, y se centrifuga. El
precipitado celular se homogeniza en TL20 (20 mM de Tris, pH 8.6, 150 mM de NaCl y 1mM de EDTA) con
un mortero de vidrio y se centrifuga a 1.200 g durante 10 minutos.
El sobrenadante se deposita sobre el mismo volumen de una solución de sacarosa al 36% en TL20 y se
centrifuga a 200.000 g durante 2 horas en un rotor SW 41 a 4°C. El precipitado se homogeniza en 4–12 ml
de TL20 y se deposita de nuevo sobre una solución de sacarosa al 36%.
El nuevo precipitado se homogeniza en 1 ml de TL20 y se somete a un gradiente linear de sacarosa desde
30 a 65%, por centrifugación a 200.000 g durante 3 horas. La banda de virus se recoge y se diluye en 10 ml
de TL20 y luego se centrifuga a 130.00 g durante 1 hora para concentrar el virus.
El precipitado se homogeniza en 0,2 ml de TL20 y se cuantifica por el método de Bradford (reacción
colorimétrica con azul brillante de Coomassie) (3) o por espectrofotometría (las proteínas víricas suponen
cerca de tres quintos de la proteína total). Antes de su utilización, se puede guardar a –30°C.
i)
Durante 16 horas (toda la noche a 37°C) recubrir las placas de ensayo para unión con 1µg de
proteínas víricas por pocillo en 100 µl de PBS, pH 7,6, dejando una columna en blanco (es decir,
recubiertas solo con PBS). Adviértase que los diferentes lotes de antígeno pueden variar en actividad,
y deberían titularse frente a estándares conocidos para seleccionar antígenos con altas densidades
ópticas (OD).
ii)
Después de lavar tres veces con PBS, bloquear los sitios de unión libres incubando con 25 mg/ml de
gelatina en PBS durante 1 hora a 37°C.
iii)
Lavar la placa tres veces con PBS–Tween 20, y añadir 100 µl de diluciones seriadas dobles de suero
en PBS–Tween. Incluir en cada placa estándares de suero positivo y negativo.
iv)
Después de 60 minutos de incubación a 37°C y tres lavados con PBS–Tween, añadir 100 µl de una
dilución de suero de cabra con IgG anti–conejo (típicamente 1/3.000) conjugada con fosfatasa alkalina
y dejar 1 hora a 37°C.
v)
Después de cuatro lavados en PBS–Tween, añadir como substrato 100 µl de p–nitrofenil fosfato
disódico a una concentración de 1mg/ml en 10% de dietanolamina.
vi)
Después de 12 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, la reacción enzimática se detiene
añadiendo 50 µl de NaOH 2N.
vii)
Leer la OD en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm.
viii) Expresar el título de la muestra de suero como el inverso de la dilución más alta a la que la OD es
superior a tres veces la OD del suero estándar negativo.
La detección de anticuerpos específicos contra el virus del mixoma mediante ELISA ha resultado ser un
método sensible y específico para estudios cinéticos en infección experimental (2). La evaluación de la
prueba ha mostrado su gran valor como aplicación diagnóstica en poblaciones naturales de conejos (6).
Para análisis epidemiológicos, la prueba IFI y el método indirecto ELISA también se pueden realizar
utilizando sangre seca en papel de transferencia o de filtro: se cortan discos (de tamaño del papel
agujereado) y se colocan dos en cada pocillo, al que se añaden 100 µl de PBS para extraer el suero. La
dilución es cercana a 1/30 y puede ser usada en otro pocillo para ensayo (7). En el método ELISA se
pueden utilizar las muestras recogidas en tubos capilares con anticoagulante. La muestra se lava con la
solución de dilución para obtener la dilución requerida (11).
d)
Prueba de inmunodifusión en medio sólido
La inmunodifusión en gel de agar (IGDA) (15) es cualitativa y puede detectar antígeno y anticuerpo. El agar
se prepara como se ha descrito previamente (Sección B.1.) utilizando 6 ml por cada placa Petri de 10 cm.
Sobre la superficie del agar se colocan tiras de papel de filtro que contienen el antígeno estándar y el
antisuero, y discos que contienen el suero de ensayo (los discos entre las tiras). Las placas se incuban con
atmósfera húmeda a 37°C y se leen a las 24–48 horas. Deberían aparecer tres líneas de precipitación. Si el
suero de ensayo contiene anticuerpo, por lo menos una de las tres líneas se curva hacia la banda de
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antígeno; en caso contrario, permanece lineal. Si el suero contiene antígeno, al menos una de las líneas se
curva hacia la tira del suero estándar. También se puede hacer la prueba de una manera más convencional
utilizando reactivos líquidos en pocillos cortados en el agar.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Para vacunar contra la mixomatosis se utilizan dos tipos de vacunas vivas: una vacuna heteróloga preparada del
virus del fibroma de Shope (5, 9, 14), y una vacuna homóloga preparada de una cepa atenuada del virus del
mixoma (1, 8, 13, 16–18). Se administran subcutánea o intradérmicamente.
Se ha desarrollado recientemente un nuevo virus recombinante del mixoma que expresa la proteína de la
cápside del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) y que confiere protección doble contra la
mixomatosis y la RHDV (2), pero aún no está disponible en el mercado.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se indican en el capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias, Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 son de carácter general y
pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
Se debe establecer un inóculo primario de virus (MSV) y utilizarlo de acuerdo con el sistema de lotes de inóculo.
Se debe mantener un registro de su origen, historia de los pases y características.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Los virus empleados son los del fibroma o del mixoma. Las cepas del virus del fibroma son, en general, la
cepa OA original de Shope (1932), la cepa Boerlage u otras cepas estrechamente relacionadas. Las cepas
del virus del mixoma están modificadas por pases en huevos de pollo embrionados, células de riñón de
conejo a temperaturas descendentes, o células de embrión de pollo. Normalmente, las cepas son el
resultado de varias clonaciones.
b)
Método de cultivo
Las cepas de fibroma se mantienen por pases en conejos libres de patógenos específicos (SPF) o en
conejos no vacunados de poblaciones que se sabe que están libres de mixomatosis. Se afeita la piel de la
espalda de conejos adultos sanos y se inocula en varios sitios con una suspensión de material virulento al
1%. Los fibromas se desarrollan por completo a los 8–10 días, los conejos se sacrifican y los tumores se
extraen asépticamente y se homogenizan con agua destilada. La suspensión se guarda a –30°C o –70°C
en 50% de glicerol tamponado, o como una dilución proteica al 5%. También es posible la producción del
virus del fibroma en líneas celulares dérmicas de conejo.
El virus del mixoma se crece en cultivos de células de embrión de pollo obtenidas de poblaciones libres de
patógenos especificados o de líneas celulares adecuadas (línea celular dérmica de conejo).
c)
Validación como vacuna
i)
Identidad
Los antígenos específicos característicos de las cepas del virus del fibroma se comprueban por IGDA
utilizando sueros contra el fibroma y la mixomatosis.
La identidad del virus del mixoma se confirma por pruebas de neutralización en células RK–13 o en
una línea celular adecuada utilizando un antisuero monoespecífico.
ii)
Pureza
El inóculo primario debe estar libre de contaminación por bacterias, hongos, micoplasmas y virus.
iii)
Inocuidad
Las muestras para ensayos de inocuidad se toman de un lote producido según el proceso de
producción. La dosis utilizada debe contener el máximo título o potencia establecido por el fabricante
(título de liberación).
A nivel del inóculo primario se realizan varias pruebas para demostrar diferentes aspectos de la
inocuidad. Se debe demostrar la inocuidad de diez veces la dosis normal. Además es necesario
examinar la diseminación del virus vacunal en el animal vacunado, la capacidad del virus vacunal para
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Capítulo 2.8.1. — Mixomatosis
pasar del animal vacunado a otros en contacto con éste y probar si existe reversión a la forma
virulenta después de pases seriados en conejos.
La patogenicidad de las cepas del virus del fibroma se prueban inoculando conejos con diluciones
seriadas de los sobrenadantes obtenidos al centrifugar preparaciones de tumores. Las características
macroscópicas e histopatológicas y el desarrollo de los fibromas se prueba periódicamente en
conejos SPF. (Numerosos pases seriados en conejos pueden inducir una mutación a la cepa IA
inflamatoria, que produce lesiones graves que son más inflamatorias que neoplásicas).
La patogenicidad residual de las cepas del virus del mixoma se prueba por inyección
intradérmica en conejos SPF o en conejos sin vacunar libres de mixomatosis. Estos conejos no
deberían presentar más que una reacción local, posiblemente con pequeñas lesiones secundarias en
la cabeza, que desaparecen a los pocos días.
En ambos casos, se debe registrar la temperatura rectal y el peso corporal como parámetros
adicionales.
iv)
Eficacia
Se deben realizar diferentes ensayos con lotes representativos del producto final que contengan el
mínimo título o potencia. El efecto protector se determina como sigue:
Se inoculan como mínimo diez conejos adultos con una dosis de la vacuna del fibroma, y tres conejos
no vacunados sirven de control. Después de 14 días todos los conejos se inoculan intradérmicamente
en los párpados con una cepa patogénica del virus del mixoma (ejemplo: 0,1 ml de inóculo que
contenga 103 ID50 [dosis infectiva media]). Los controles morirán de mixomatosis en los siguientes
21 días y al menos siete de los diez conejos vacunados no deben presentar signos de infección
generalizada.
De modo similar, la vacuna del mixoma se prueba en diez conejos con tres de control. Después de
14 días, todos los conejos se inoculan como desafío con una cantidad suficiente de cepa virulenta
(ejemplo: 0,1 ml de la cepa vírica Lausanne que contenga 103 ID50). Después de 21 días, siete de los
diez conejos vacunados deben sobrevivir, mientras que los controles deben haber muerto de
mixomatosis.
El fabricante debe establecer un título o potencia mínima teniendo en cuanta la pérdida de potencia
durante la caducidad.
2.
Método de producción
El virus del fibroma se produce por inoculaciones intradérmicas múltiples del virus de inóculo en la piel del dorso
de conejos. También es posible la producción en líneas celulares dérmicas de conejo. Si se pretende evitar la
modificación del virus, sólo se puede utilizar el segundo pase (y quizás el tercero). El producto homogenado de
fibroma se puede guardar por congelación o utilizarse de inmediato. Después de una clarificación por
centrifugación, el sobrenadante se mezcla con un estabilizador que contenga antibióticos y se distribuye en
ampollas o botellas para liofilización. Se puede añadir como estabilizador caolín (40 mg/ml), en cuyo caso la
vacuna se administra subcutáneamente.
El virus del mixoma se produce en células de embrión de pollo (derivadas de huevos SPF) o una línea celular
apropiada, limitando el número de pases a un máximo de cinco. El virus se recoge después de 2–6 días. La
suspensión vírica se puede mantener a –70°C. La vacuna se prepara diluyendo la preparación vírica en
proporciones especificadas con un estabilizador para la liofilización. Después de la homogenización, el producto
se distribuye en botellas para la liofilización, y las botellas se cierran al vacío o en nitrógeno estéril.
También se puede producir cada virus en células RK–13.
3.
Control interno
El título del virus del fibroma se determina calculando la ID50 después de inoculación intradérmica de diluciones
seriadas del sobrenadante clarificado en varios sitios (hasta cinco, por ejemplo) de unos seis conejos. Se inocula
también cada conejo con una dilución de la preparación estándar del virus del fibroma para confirmar la
respuesta correcta de los animales a la inoculación. También puede realizarse la titulación en una línea celular
de conejo. En cada caso, el título se debería correlacionar con la potencia requerida según se definió por la
prueba de eficacia (ver Sección C.1.c.).
La identidad del virus del mixoma se comprueba en células RK. También se puede hacer la titulación de cada
virus en células RK–13 (como DICT50).
Los ensayos para virus contaminantes se hacen inoculando una capa celular de células Vero en confluencia. La
vacuna se ajusta al equivalente de 20 dosis/ml y se neutraliza con un volumen igual de suero hiperinmune
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Capítulo 2.8.1. — Mixomatosis
monoespecífico durante 30 minutos a 37°C. La mezcla se filtra por un filtro de membrana de 0,22 µm, y se
inoculan volúmenes de 1 ml en cinco botellas de cultivos celulares de 25 ml, que se mantienen bajo observación
durante 7 días. En la recogida, las células se suspenden en medio y se someten a varios ciclos de congelación y
descongelación, seguidos de centrifugación y filtración, y el material se inocula en cultivos frescos, que se
observan durante 7 días. No debería observarse ECP ni hemoadsorción con RBCs de pollo.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de materiales biológicos se encuentran en el
Capítulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Después de la rehidratación, se inyectan subcutáneamente diez dosis de la vacuna de fibroma a cada uno
de tres conejos susceptibles, que se observan durante 21 días. Las reacciones locales deben ser ligeras,
sin generalización ni efectos sobre la salud general.
La vacuna de mixoma se prueba utilizando diez dosis inyectadas intradérmicamente en las orejas de tres
conejos susceptibles, que se observan durante 21 días. La lesión primaria del mixoma debe permanecer
leve.
c)
Potencia
La potencia del lote se determina midiendo el contenido en virus. Se inoculan diluciones seriadas de la
vacuna en cultivos celulares apropiados. Una dosis de vacuna debe contener al menos el título mínimo que
se establece en la Sección C.1.c.
Si la cepa vacunal no está adaptada al cultivo, se tiene que realizar una prueba de eficacia en conejos (ver
Sección C.1.c).
d)
Duración de la inmunidad
Se vacunan varios grupos de diez conejos susceptibles. Un grupo se prueba con una infección de desafío
(como en la prueba de potencia de lotes) a los meses 1, 2, 3, etc., después de la vacunación con el virus
del fibroma, y a los meses 1, 3, 6 y 9 después de la vacunación con el virus del mixoma. La duración de la
inmunidad se deduce del tiempo durante el cual al menos siete de los diez conejos resultan resistentes a la
infección.
e)
Estabilidad
En al menos tres lotes de vacuna, se realizan titulaciones del virus vacunal a intervalos hasta 3 meses más
allá de la caducidad manifestada.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Ver sección C.4.b.
b)
Potencia
Ver sección C.4.c.
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