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CAPÍTULO 2.1.3.
LENGUA AZUL
RESUMEN
La infección por el virus de la lengua azul (BTV) afecta a hospedadores vertebrados, tanto a los
rumiantes domésticos y salvajes, como a las ovejas, las cabras, el ganado vacuno, los búfalos, los
ciervos, la mayor parte de los antílopes africanos y muchos otros miembros de los artiodáctilos.
Esta infección vírica no contagiosa transmitida por los insectos es latente en la gran mayoría de los
animales infectados, pero resulta mortal en algunas ovejas, ciervos y rumiantes salvajes
infectados. Aunque el ganado vacuno no suele mostrar síntomas clínicos, estos son importantes
en la epidemiología de la enfermedad, debido a la viremia prolongada en ausencia de la
enfermedad clínica. Los síntomas clínicos varían de leves a graves no solamente entre las
especies, sino también entre las distintas razas y dentro de un mismo rebaño. La enfermedad de la
lengua azul (LA) cursa con fiebre y permeabilidad vascular e incluye la inflamación y congestión, el
edema facial con hemorragias, y la ulceración de las membranas mucosas. Sin embargo, en los
casos leves, se puede observar una hiperemia transitoria y rinorrea y lagrimeo leves. En los casos
muy graves, la lengua puede mostrar una hiperiemia intensa y llegar a estar edematosa y
sobresalir de la boca o volverse cianótica. La hiperiemia se puede extender a otras partes del
cuerpo, en particular a la banda coronaria de la pezuña, las ingles, las axilas y el periné. A menudo
se produce una grave degeneración muscular. La dermatitis puede ocasionar la rotura de la lana.
Las ovejas pueden presentar cojera como consecuencia de una coronitis, es decir, la inflamación
de la banda coronaria de las pezuñas, o de una miopatía esquelética. Una enfermedad grave
similar de los rumiantes salvajes es la causada por el virus de la enfermedad hemorrágica
epizoótica (EHDV) que, como el virus de la LA (BTV), es un miembro del género Orbivirus, pero
que está clasificado en una especie diferente.
Identificación del agente: El BTV es un miembro del género Orbivirus, de la familia Reoviridae, y
una de las 20 especies reconocidas dentro del género. La especie o serogrupo BTV contiene 24
serotipos reconocidos. Las especies de orbivirus se diferencian mediante pruebas inmunológicas
que detectan las proteínas víricas que están integradas dentro de cada serogrupo y, por tanto, son
diferenciables mediante pruebas serológicas. Sin embargo, existe una reacción cruzada
considerable entre especies relacionadas, y ese es el caso de los serogrupos LA y EHE. El
serotipo de los virus individuales dentro de cada serogrupo se identifica mediante pruebas de
neutralización. Las partículas completas del BTV tienen una cápsida icosaédrica doble y un ARN
de cadena doble. La cápsida externa contiene dos proteínas, una de las cuales, la VP2, es el
determinante principal de la especificidad serotípica. La cápsida interna contiene dos proteínas
principales y tres minoritarias, y 10 módulos genéticos de ARN bicatenario. La proteína VP7 de la
cápsida interna es la que posee los antígenos de especie o de serogrupo. La identificación
tradicional del virus implica su aislamiento y replicación en huevos embrionados de pollo, cultivos
de tejido o inoculación en rumiantes susceptibles y la posterior aplicación de pruebas específicas
para establecer el serogrupo y el serotipo.
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) ha permitido la replicación rápida
del ARN del BTV en muestras clínicas, y existen procedimientos disponibles, basados en la RTPCR, que pueden suplementar a las técnicas virológicas clásicas y permiten obtener información
sobre el serogrupo, el serotipo y el topotipo del virus.
Pruebas serológicas: En los rumiantes, las respuestas serológicas aparecen a los 7–14 días
después de la infección por BTV y, por lo general, son duraderas. Históricamente, para detectar los
anticuerpos específicos contra BTV se usaban pruebas como la inmunodifusión en medio sólido o
el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA), aunque estas pruebas tenían el inconveniente
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Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
importante de ser incapaces de distinguir de forma fiable entre anticuerpos contra los virus de las
especies BTV y EDHV. Un método ELISA de competición basado en anticuerpos monoclonales ha
resuelto este problema y, para detectar específicamente los anticuerpos anti-BTV, se recomiendan
ensayos de tipo ELISA de competición. Los procedimientos actuales para determinar la
especificidad de serotipo de los anticuerpos son tediosos porque requieren determinar la
capacidad de los sueros de ensayo para inhibir la infectividad de una serie de virus de serotipo
conocido mediante pruebas de neutralización de larga duración.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: En varios países se utiliza la
vacunación para limitar las pérdidas directas, evitar la circulación de la lengua azul y permitir el
comercio seguro de los animales. Durante muchos años se han utilizado en Sudáfrica vacunas
vivas atenuadas que son específicas en cuanto a serotipo. Los virus atenuados se preparan por
adaptación del virus BTV mediante crecimiento in vitro por pases seriados del virus natural en
huevos embrionados de pollo o en células cultivadas. La estimulación de una respuesta
inmunológica humoral intensa por estas vacunas se correlaciona directamente con su capacidad
para multiplicarse en el hospedador vacunado. La producción de vacunas vivas atenuadas en
grandes cantidades resulta barata, son capaces de generar una inmunidad adecuada tras una
única inyección y tienen una eficacia demostrada para la prevención de la enfermedad clínica. Las
consecuencias adversas son un descenso en la producción de leche en las ovejas lactantes y el
aborto o la muerte embrionaria y teratogénesis en la descendencia de las hembras grávidas
vacunadas durante el primer tercio de la gestación. Otro riesgo asociado al uso de las vacunas
vivas atenuadas es su potencial de diseminación por vectores, con la eventual reversión a la forma
virulenta y la recombinación de los genes del virus de la vacuna con los de las cepas del virus
normal. No está clara la relevancia y frecuencia de estos hechos, pero en Europa ya se ha
documentado la diseminación natural y local del virus de la vacuna. El hecho de que los virus
atenuados sean teratogénicos hace que la determinación de su transmisión sea un tema muy
importante. Se debería probar la eficacia de la vacuna, su potencial teratogénico y su transmisión.
En consecuencia, resultan preferibles las vacunas inactivadas o recombinantes, si son efectivas.
Las vacunas inactivadas no causan malformaciones y se han utilizado bajo la supervisión de los
servicios veterinarios oficiales desde 2004 en el tratamiento de brotes recientes en Europa.
A. INTRODUCCIÓN
Los mosquitos de algunas especies del género Culicoides (el insecto hospedador) (39) transmiten el virus de la
lengua azul (BTV) entre los rumiantes susceptibles, habiéndose infectado durante su alimentación a partir de
animales con viremia (el hospedador vertebrado). Después de un período de replicación de 6-8 días en la
glándula salivar del insecto, el virus se puede transmitir a un nuevo hospedador vertebrado durante la ingestión
de sangre. Los mosquitos infectados permanecen en ese estado toda la vida. El papel central del insecto en la
epidemiología de la LA implica que la distribución y la prevalencia de la infección está condicionada por factores
ecológicos, como la pluviosidad elevada, la temperatura, la humedad y las características edáficas que
favorezcan la supervivencia del insecto (6). En muchas partes del mundo la infección tiene, por tanto, una
frecuencia estacional (43). Se acepta que el BTV no provoca infecciones persistentes en los rumiantes y que su
supervivencia en el medio está asociada con factores del insecto (20, 23). Desde un punto de vista general, la
distribución del BTV puede considerarse como dependiente de los sistemas epidemiológicos (episistemas)
basados en las especies presentes del vector y en su historia natural (40).
Entre los hospedadores vertebrados del BTV se incluyen tanto los rumiantes domésticos como los salvajes,
como las ovejas, las cabras, el ganado bovino, los búfalos, los ciervos, la mayor parte de los antílopes africanos
y otros artiodáctilos como los camellos. Aunque se han demostrado anticuerpos contra el BTV, y, en algunos
casos, antígenos del virus en algunos carnívoros, felinos, rinocerontes negros y blancos, y elefantes, se
desconoce el papel que desempeñan en la enfermedad las especies de los no rumiantes en el medio natural. El
efecto de la infección varía desde una manifestación que pasa desapercibida en la gran mayoría de los animales
infectados, especialmente entre el ganado vacuno, hasta un resultado mortal en algunas ovejas, cabras, ciervos
y rumiantes salvajes infectados (43). Sin embargo, en Europa se ha observado la enfermedad clínica en ganado
bovino infectado con BTV8. Algunas razas de ovejas son más susceptibles a la enfermedad que otras, lo que
origina que en algunos países las infecciones del ganado por BTV puedan pasar desapercibidas o se detecten
solamente con una vigilancia activa (9). El virus de la enfermedad hemorrágica epizootica (EHDV) puede
producir una enfermedad en los rumiantes salvajes con manifestaciones clínicas idénticas a las observadas
después de la infección por BTV.
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Los síntomas clínicos de la enfermedad en las ovejas son de diversa gravedad y están determinados por factores
relacionados con la cría y con las razas (43). En los casos graves, hay una respuesta febril aguda caracterizada
por la inflamación y congestión, que conduce a un edema en la cara, párpados y orejas, y a la aparición de
hemorragias y ulceración de las membranas mucosas. La lengua puede tener una hiperemia intensa y un
aspecto edematoso, sobresalir de la boca y, en los casos graves, volverse cianótica. La hiperemia se puede
extender a otras partes del cuerpo, en particular a la banda coronaria de las pezuñas, las ingles, las axilas y el
periné. A menudo se produce una degeneración muscular grave. La dermatitis puede originar roturas de la lana
asociadas con una patología de los folículos. Es frecuente la resistencia a moverse o incluso la aparición de
tortícolis en los casos graves. En los casos fatales, los pulmones pueden mostrar hiperemia interalveolar con un
edema alveolar grave y el árbol bronquial puede contener espuma. La cavidad torácica y el saco pericárdico
pueden contener varios litros de un líquido parecido al plasma. En la mayor parte de los casos se presenta una
hemorragia característica cerca de la base de la arteria pulmonar (43).
Desde el punto de vista taxonómico, el BTV se clasifica como una especie o serogrupo del género Orbivirus,
dentro de la familia Reoviridae, y es una de las 20 especies reconocidas en ese género, que también incluye a
los agentes de la enfermedad hemorrágica epizoótica (EHE) y de la peste equina africana (PEA) (31). Dentro de
las especies, los miembros individuales se diferencian mediante pruebas de neutralización y, hasta la fecha, se
han descrito 24 serotipos del BTV. Existe una notable reacción inmunológica cruzada entre los miembros de los
virus de la LA y la EHE (31).
Las partículas del BTV se componen de tres capas proteicas. La cápsida externa contiene dos proteínas, la VP2
y la VP5. La VP2 es el antígeno de neutralización más importante y el que determina la especificidad de serotipo.
La eliminación de la cápsida externa de la VP2/VP5 deja una partícula con una cápsida icosaédrica interna
formada por dos capas compuestas de dos proteínas mayoritarias, la VP7 y la VP3, tres proteínas minoritarias y
diez módulos de ARN de cadena doble. La VP7 es un determinante importante de la especificidad del serogrupo
y el componente que contiene los epítopos que se utilizan en los enzimoinmunoensayos competitivos (C-ELISA)
para detectar los anticuerpos contra BTV (30). La VP7 también puede ser la responsable de la unión del BTV a
las células de los insectos (46).
La secuenciación de los genomas del BTV permite la diferenciación y el análisis de las cepas
independientemente del serotipo (16, 27, 36, 45). Incluso en el caso de las cepas pertenecientes a un mismo
serotipo, es posible identificar su probable origen geográfico (16, 35). Tales estudios han permitido detectar los
movimientos internacionales de las cepas de BTV. El movimiento natural de los vectores provocado por las
condiciones climáticas ocasiona un desplazamiento intercontinental del BTV. La identificación de las relaciones
existentes entre algunos genotipos del virus y algunas especies del vector sugiere la existencia de ecosistemas
virus-vector (9, 23, 40). Una mejor comprensión de estos aspectos epidemiológicos puede facilitar el comercio
internacional de los rumiantes en el futuro.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente (una prueba prescrita para el comercio internacional)
a)
Aislamiento del virus
Se utilizan los mismos procedimientos para los rumiantes domésticos y los salvajes. Hay varios sistemas en
uso para el aislamiento del virus, pero, generalmente, el más eficaz es la inoculación en huevos
embrionados de pollo (ECE). La inoculación en oveja también puede ser una estrategia útil si el título de
virus en la muestra de sangre es muy bajo, como suele ser el caso después de varias semanas de la
infección vírica. Los intentos de aislar el virus en cultivos celulares in vitro pueden ser más adecuados, pero,
con frecuencia, la probabilidad de éxito es mucho menor que la lograda mediante los sistemas in vivo (15).
Parece que el cultivo celular es una técnica más sensible para el aislamiento del EHDV.

Aislamiento en huevos embrionados de pollo
i)
Se recoge sangre de animales febriles con un anticoagulante como la heparina, el EDTA (ácido
etilamina diamina tetra-acético), o el citrato sódico, y las células sanguíneas se lavan tres veces con
solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Las células lavadas se resuspenden en PBS o en
cloruro sódico isotónico y se guardan a 4°C o se usan inmediatamente para intentar el aislamiento del
virus.
ii)
Para guardar a largo plazo cuando no es posible la refrigeración, las muestras de sangre se recogen
en oxalato-fenol-glicerina. Si las muestras se pueden congelar, entonces se recogen en solución
tamponada de peptona con lactosa o dimetil sulfóxido al 10% (41) y se mantienen a –70°C o a
temperatura inferior. El virus no es estable a –20°C durante períodos largos.
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iii)
El bazo y los nódulos linfáticos son los órganos preferidos para los intentos de aislamiento del virus en
los casos mortales. Los órganos y tejidos deben mantenerse a 4°C y transportarse a un laboratorio
donde se homogeneizan en PBS o en solución salina isotónica, y se utilizan como se describe más
adelante para las células de la sangre.
iv)
Se resuspenden en agua destilada células de la sangre lavadas o se sonican en PBS y se inoculan
0,1 ml intravascularmente en 5–12 ECE de 9–12 días de edad. Este proceso requiere práctica. El
trabajo de Clavijo et al. contiene los detalles (8).
v)
Los huevos se incuban en una cámara húmeda a 32–33°C y se observan diariamente al trasluz.
Cualquier muerte embrionaria ocurrida en las primeras 24 horas post-inoculación se considera
inespecífica.
vi)
Los embriones que mueren entre los días 2 y 7 se mantienen a 4°C y los que permanecen vivos el día
7 se sacrifican. Con frecuencia, los embriones infectados pueden presentar un aspecto hemorrágico.
Los embriones muertos y los que vivían el día 7 se homogeneizan por separado. Se homogenizan los
embriones completos, después de eliminar sus cabezas, u órganos concretos, como el hígado, el
corazón, el bazo, los pulmones y los riñones, y los restos se eliminan por centrifugación.
vii)
El virus se puede identificar directamente en el sobrenadante mediante un ELISA de captura de
antígeno (17) o una RT-PCR, o indirectamente por métodos de detección de antígenos, como la
inmunofluorescencia o la inmunoperoxidasa, después de su amplificación en cultivo celular, como se
describe en la sección siguiente.
viii) Si, después de la inoculación con el material de la muestra, los embriones no mueren, se hace un
inóculo con el material del primer pase por huevo y se vuelve a pasar por ECE o por cultivo celular.

Aislamiento en cultivo celular
El aislamiento de los virus se puede intentar en cultivos celulares susceptibles al virus de la lengua azul,
como las células L de ratón, las de riñón de hámster neonato (BHK-21), las de riñón de mono verde africano
(Vero) o el clon C6/36 de Aedes albopictus (AA). Mediante la inoculación de células en cultivo con muestras
de diagnóstico, la eficacia del aislamiento suele ser inferior a la que se obtiene con ECE. La mejor eficacia
de aislamiento en cultivo celular se logra mediante el aislamiento primario del virus en ECE y por pases
posteriores por células AA para una mayor replicación del virus. Normalmente se realizan pases adicionales
por líneas celulares de mamíferos, como células BHK-21 o Vero. En las células AA no se observa
necesariamente un efecto citopático (ECP), pero este es visible en células de mamíferos. Se analizan las
monocapas celulares para observar la presencia de un ECP durante 5 días a 37°C con 5% de CO2 y
humedad. Si no aparece el ECP, se realiza un segundo pase en cultivo celular.
La identidad del BTV en el medio de cultivo de células que manifiestan un ECP se puede confirmar
mediante varios métodos que se describen más adelante, incluyendo la prueba ELISA de captura de
antígeno, la inmunofluorescencia, la inmunoperoxidasa, la neutralización del virus (NV) o mediante la RTPCR.
b)

Aislamiento en ovejas
i)
Las ovejas se inoculan con células lavadas procedentes de 10 ml a 500 ml de sangre, o con 10–50 ml
de suspensión de tejido. Los inóculos se administran subcutáneamente en alícuotas de 10–20 ml.
Volúmenes superiores pueden facilitar el aislamiento del virus y deben administrarse por vía
intravenosa.
ii)
Las ovejas se mantienen 28 días para la comprobación diaria de la fiebre y la comprobación semanal
de la respuesta de anticuerpos utilizando pruebas serológicas como la prueba C-ELISA, que se
describe más adelante. Normalmente, la sangre de oveja recogida a los 7 y 14 días de la inoculación
contiene el virus, que puede mantenerse en estado viable a 4°C o a –70°C.
Métodos inmunológicos

Serogrupo de los virus
Los aislamientos de Orbivirus se suelen seroagrupar según su reacción con antisueros estándar específicos
que detectan proteínas, como la VP7, que se conservan dentro de cada serogrupo. La reacción cruzada
entre los miembros de los serogrupos BT y EHD plantea la posibilidad de que un aislamiento del EHDV
pueda confundirse con BTV debido a una reacción de inmunofluorescencia débil con un antisuero policlonal
anti-BTV. Por esta razón, se puede usar un MAb específico del serogrupo LA. Varios laboratorios han
generado tales reactivos específicos de grupo (2, 21). En contraste con el seroagrupamiento, el método
corriente de serotipificación es la prueba de NV utilizando métodos que se describen más adelante. Los
métodos más utilizados para la identificación de los virus a nivel de serogrupo son los siguientes.
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i)
Inmunofluorescencia
Se infectan monocapas de células BHK o Vero en cultivos laminares (portas de vidrio) con virus
adaptado al cultivo de tejido o con virus de lisados de ECE. Después de 24–48 horas, o después de la
aparición de un ECP incipiente, las células infectadas se fijan con agentes como el paraformaldehído,
la acetona o el metanol, se deja secar y el antígeno vírico se detecta utilizando un antisuero anti-BTV
o anticuerpos monoclonales específicos contra el BTV y los procedimientos estándar para la
inmunofluorescencia.
ii)
Enzimoinmunoensayo de captura de antígeno
Se puede detectar directamente el antígeno vírico en lisados de ECE, en los medios de cultivo (17), en
los insectos infectados (28) y en la sangre de oveja. En esta técnica, las proteínas derivadas del virus
se capturan por el anticuerpo adsorbido a una placa ELISA y los materiales unidos se detectan usando
un segundo anticuerpo. El anticuerpo de captura puede ser policlonal o un MAb específico de
serogrupo. Para detectar los virus capturados, se han usado con éxito MAb específicos de serogrupo y
anticuerpos policlonales contra las partículas de la cápsida expresadas en baculovirus (17).
iii)
Prueba inmune puntual
Se adsorben sobre nitrocelulosa pequeños volúmenes (2 µl) del sobrenadante de cultivo de células
infectadas o de células infectadas que han sido lisadas o sonicadas, y se deja secar. Los sitios de
unión inespecífica se bloquean incubando con una solución que contenga proteína de leche
desnatada. Después de incubar con un MAb reactivo para el serogrupo BTV, el anticuerpo se detecta
utilizando IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (14).

Serotipificación por neutralización del virus
Las pruebas de neutralización son específicas de tipo para los 24 serotipos de BTV actualmente
reconocidos y pueden utilizarse para serotipificar un virus aislado o modificarse para determinar la
especificidad de los anticuerpos en los sueros. En el caso de un aislamiento no tipificado, la localización
regional característica de los serotipos de BTV puede eliminar, por lo general, la necesidad de realizar la
neutralización con todos los 24 antisueros, en particular cuando se han identificado los serotipos
endémicos.
Existe una serie de métodos disponibles, que se basan en el cultivo celular, para detectar la presencia de
anticuerpos neutralizantes anti-BTV. Las líneas celulares más utilizadas son BHK, Vero y L929. Más
adelante se resumen cuatro métodos para serotipificar el BTV. Se ha descrito que los antisueros
específicos de serotipo generados por cobayas y conejos presentan menos reacción cruzada que los
obtenidos de ganado vacuno u ovino. Es importante incluir controles del antisuero.
i)
Reducción de placas (o calvas)
El virus que se va a serotipificar se diluye hasta que contenga aproximadamente 100 unidades
formadoras de placas (PFU) y se incuba sin suero o con diluciones de antisueros individuales estándar
de una serie de serotipos de BTV. Se añaden las mezclas de virus/antisuero a las monocapas. Tras la
adsorción y eliminación del inóculo, se cubren las placas con agarosa. Los títulos de anticuerpos
neutralizantes se expresan como el inverso de la dilución de suero que ocasiona una reducción
determinada (por ejemplo, 90%) en el número de PFU. Se considera que el virus no identificado es
serológicamente idéntico a un serotipo estándar cuando este último resulta neutralizado de forma
similar si se realiza la prueba en paralelo con el virus problema.
ii)
Inhibición de placas (o calvas)
Las pruebas se realizan en placas Petri de 90 mm de diámetro que contienen monocapas celulares
confluentes que se infectan con aproximadamente 5 × 104 PFU de virus estándar y de virus no
tipificado. Después de la adsorción y la eliminación del inóculo, la monocapa se cubre con agarosa. En
discos individuales de papel de filtro se añaden antisueros estándar anti-BTV, que se colocan sobre la
superficie de agarosa. Las placas se incuban por lo menos 4 días. Alrededor del disco que contenga el
antisuero homólogo aparecerá una zona de neutralización del virus con la consiguiente supervivencia
de la monocapa celular.
iii)
Neutralización en microtitulación
En una placa de microtitulación con pocillos de fondo plano se añaden aproximadamente 100 DICT50
(dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) del virus estándar y del virus no tipificado en un volumen
de 50 µl por pocillo, y se mezcla con el mismo volumen de antisuero estándar diluido con medio de
cultivo de tejidos. En un volumen de 100 µl se añaden aproximadamente 104 células por pocillo y,
después de incubar durante 4–6 días, se leen los resultados de la prueba utilizando un microscopio
invertido. Los pocillos se analizan respecto al grado de ECP observado. Los pocillos que contengan
solo células o células y antisuero no deberían mostrar ECP. Por el contrario, los pocillos con células y
virus deberían mostrar un ECP claro. Se considera que el virus no identificado es serológicamente
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idéntico al serotipo estándar de BTV si ambos resultan neutralizados en la prueba con un grado
similar.
iv)
Prueba de inhibición de la fluorescencia
Este método de neutralización, rápido y sencillo, requiere varias concentraciones de un virus
desconocido y concentraciones estándar de antisueros de referencia (5). Los virus aislados que han
crecido en cultivo celular se diluyen en serie y se mezclan con los antisueros individuales de referencia
en los pocillos de una placa Lab-Tek durante 1 hora antes de añadir las células. Después de incubar
16 horas, las células se fijan y se tratan con un procedimiento inmunofluorescente que utiliza un MAb
específico del serogrupo LA. El serotipo del virus se indica por la especificidad del antisuero que causa
una reducción mayor en el número de células fluorescentes.
c)
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (prueba prescrita para el mercado
internacional)
La amplificación del ácido nucleico vírico dirigida por cebadores ha revolucionado el diagnóstico de la LA (8,
27, 44). Las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) han
permitido la identificación rápida del ácido nucleico vírico del BTV en la sangre y otros tejidos de los
animales infectados. El diagnóstico basado en la RT-PCR debe interpretarse con cuidado. El procedimiento
RT-PCR detecta el ácido nucleico específico del virus, pero esto no indica necesariamente la presencia del
virus infeccioso (24). La PCR también se puede utilizar para establecer el serogrupo de los Orbivirus y, en
último término, puede hacer posible la serotipificación del BTV a los pocos días de recibir una muestra
clínica, como sangre de una oveja infectada (29). Los enfoques clásicos, que dependen del aislamiento del
virus y de su identificación serológica, pueden tardar hasta 3–4 semanas en suministrar información sobre
serogrupos y serotipos.
Los cebadores oligonucleotídicos utilizados hasta ahora derivan del ARN 7 (gen VP7) (44), del ARN 6 (gen
NS1) (8), del ARN 3 (gen VP3) (36), del ARN 10 (gen NS3) y del ARN 2 (VP2) (27). En general, el tamaño
de los productos amplificados de la transcripción es pequeño – del orden de varios centenares de
nucleótidos – pero también puede ser un gen completo. En el procedimiento que se describe más adelante
en detalle, se amplifica un fragmento del ARN 6 con 101 nucleótidos. Los cebadores que derivan de los
genes más conservados, como el VP3, VP7 y NS1, se pueden utilizar para los serogrupos (es decir,
reaccionarán con todos los miembros del serogrupo LA), mientras que aquellos cuya secuencia deriva de
las secuencias de genes VP2 permiten obtener información sobre el serotipo vírico. Se ha utilizado un
ensayo de RT-PCR múltiple, que depende del tamaño de los productos amplificados, para identificar en una
sola reacción los cinco serotipos norteamericanos del BTV, tanto aislados como en mezclas (18).
En el BTV, la secuencia nucleotídica de genes homólogos puede variar en función del área geográfica del
aislamiento del virus (16). Esto supone una oportunidad única para complementar estudios epidemiológicos
sobre el BTV, al suministrar información sobre el origen geográfico potencial de los virus aislados, un
proceso que se denomina genotipificación. Por tanto, la determinación de la secuencia de las porciones del
ARN puede indicar la procedencia del virus. Parece probable que la secuenciación de BTV aislados de
otras partes del mundo permita una discriminación más fina del origen geográfico. No obstante, la relación
entre la secuencia y el origen geográfico puede no ser directa. Esta información es importante y todos los
datos relativos a las secuencias de segmentos del BTV se deberían hacer accesibles enviando los datos a
las webs oficialmente reconocidas como:
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/ and
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/btv_sequences.htm
http://eubtnet.izs.it/btnet/index.htm
En las páginas web se presentan los análisis de los árboles filogenéticos de los aislamientos de BTV
basados en la secuencia de segmentos del ARN. Estos datos representarán un recurso para los estudios
epidemiológicos, la identificación de nuevos aislamientos y el diseño de nuevos cebadores para una PCR
posterior por trascripción inversa (RT) y, posiblemente, para las pruebas específicas de serotipo de BTV.
Se ha observado que, en la sangre de los terneros y las ovejas infectadas, se puede detectar el ácido
nucleico del BTV mediante la RT-PCR durante al menos 30 días, y a veces hasta 90 días, después de que
el virus pueda aislarse, pero este hecho no indica necesariamente la presencia del virus infeccioso.
La capacidad de las pruebas RT-PCR para detectar un pequeño número de moléculas de ácido nucleico
significa que tales pruebas son muy sensibles a la contaminación por ácidos nucleicos extraños, incluyendo
cualquier cebador utilizado en el laboratorio o los polinucleótidos amplificados previamente. Por tanto es
importante disponer de un área "limpia" que contenga todo el equipo necesario para la preparación de los
reactivos y de las pruebas y un área separada para el propio equipo de amplificación. Se deben utilizar
guantes de látex y cambiarlos con frecuencia en todas las fases del procedimiento, en particular después
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Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
de trabajar con muestras de ARN o de ADN amplificado. Esto ayuda a proteger a los reactivos y a las
muestras de la contaminación por ARNasas ubicuas y por otros agentes y de la contaminación cruzada con
ADN. La posibilidad de positivos falsos por contaminación de la muestra realza la importancia de la
secuenciación de los productos de la RT-PCR para determinar, por ejemplo, si la secuencia amplificada es
idéntica o diferente de la de un control positivo. Los resultados negativos falsos, debidos, por ejemplo, a las
muestras de baja calidad o a los cebadores inadecuados, se pueden identificar determinando la
imposibilidad de amplificar algún gen del BTV o del hospedador, como el de la globina, en extractos de
células infectadas Esto se explica con más detalle en el capítulo 1.1.5 Validación y control de calidad de las
reacciones en cadena de la polimerasa utilizadas para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas.
En la actualidad se usan muchas pruebas RT-PCR en las que se utilizan diferentes métodos de extracción,
transcriptasas inversas, enzimas de amplificación, cebadores y condiciones de ensayo. La tecnología está
en continuo cambio. Además, la diversidad de los genes del BTV determina que la elección y la validación
de las pruebas de RT-PCR estén condicionadas por su aplicación a un escenario regional determinado. Lo
mismo ocurre en el caso de la PCR en tiempo real, que en el futuro se desarrollará para el diagnóstico
molecular rutinario del BTV. Por tanto, los procedimientos indicados a continuación son tan solo ejemplos.
Cada vez resulta más importante mantener las pruebas de diagnóstico acreditadas con arreglo a una norma
internacional como la ISO/ISEC 17025 y colaborar en la mejora de las pruebas. En varios países se han
desarrollado sistemas para la mejora de las pruebas basadas en la RT-PCR.
La prueba de la RT-PCR que se describe comprende tres procedimientos separados. En el primero se
extrae el ARN del BTV a partir de sangre mediante un agente caotrópico como tiocianato de guanidina
(GuSCN) para desnaturalizar las proteínas y liberar el ARN vírico. Para esto existen varias preparaciones
comerciales en el mercado y el protocolo indicado describe la utilización de uno de esos preparados, el
IsoQuick (Orca Research, Bothell, Washington, EE.UU.). Los reactivos suministrados con la preparación
vienen numerados y su uso se indica en el protocolo descrito más adelante. Existen otras preparaciones
disponibles, y una de ellas, la TRIZOL (Life Technologies, Grand Island, New York, EE.UU.), es
particularmente útil para la extracción del ácido nucleico del virus a partir del bazo o de coágulos de sangre.
Los operadores deben seguir las indicaciones señaladas en cada caso y utilizar las soluciones de los
reactivos suministradas o recomendadas. El segundo procedimiento es la desnaturalización del ARN vírico
de cadena doble y la transcripción inversa para generar ADNc, que se amplifica mediante la RT-PCR. En el
procedimiento descrito a continuación se utiliza el Superscript Amplification System (Life Tecnologies)
para transcribir el ARN vírico y reactivos de Perkin-Elmer para la RT-PCR. Existen preparaciones y
reactivos equivalentes en otras fuentes comerciales. El paso final del proceso es el análisis del producto de
la RT-PCR por electroforesis. Los procedimientos para determinar la secuencia del producto amplificado no
se describen aquí.

Extracción del ARN vírico
i)
Se recoge sangre entera de los animales a ensayar y de controles no infectados en tubos con EDTA y
se centrifuga a 800–1.000 g durante 10 minutos. Se aspira el plasma y los eritrocitos (RBC) se
resuspenden suavemente en PBS estéril. Los RBC se sedimentan por centrifugación a 1.000 g
durante 10 minutos y se elimina el sobrenadante.
ii)
A continuación se añaden 400 µl de los RBC de ensayo a cada uno de cuatro tubos de
microcentrífuga de 1,7 ml y otros 400 µl de RBCs control a cada uno de dos tubos de microcentrífuga.
A cada tubo se añade el mismo volumen de agua libre de ARNasa y se agitan brevemente en un
vórtex para mezclar y lisar las células. Se congelan dos tubos que contengan los RBC de ensayo a
–70°C con fines de reposición y se continúa la extracción por duplicado.
iii)
Se centrifugan los RBC lisados del ensayo y del control a 12.000–16.000 g durante 10 minutos y se
elimina el sobrenadante. Luego se añaden 800 µl de agua libre de ARNasa y los tubos se agitan en un
vórtex y se centrifugan de nuevo a la misma velocidad durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante
y el precipitado con los RBC se deja escurrir.
iv)
Se añade un pequeño volumen de BTV (por ejemplo, 5 µl que contengan de 103 a 107 PFU) a uno de
los dos tubos con el precipitado de los RCB control. Este es el control positivo. El otro tubo que
contiene el precipitado de los RCB control se convierte en el control negativo.
v)
A continuación se añade a cada precipitado 75 µl de tampón de muestra (reactivo A de IsoQuick), y se
agitan vigorosamente en un vórtex, añadiendo después 125 µl de la solución de lisis que contiene
GuSCN (reactivo 1 de IsoQuick). La mezcla se agita vigorosamente en un vórtex durante
30 segundos.
vi)
Antes de utilizar la matriz de extracción que acompaña a la preparación comercial (reactivo 2 de
IsoQuick más el colorante 2A), se agita vigorosamente y se añaden 500 µl a los lisados. Después se
añaden 400 µl de tampón de extracción (reactivo 3 de IsoQuick) y los tubos se agitan en un vórtex
durante 10 segundos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
vii)
Se incuban los tubos a 65°C durante 10 minutos, se agitan brevemente después de 5 minutos y se
centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos.
viii) La fase acuosa (500 µl) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrífuga y se añade el mismo
volumen de matriz de extracción (reactivo 2 de IsoQuick). Los tubos se agitan en vórtex durante
10 segundos y se centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos.
ix)
La fase acuosa (330 µl) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrífuga y se añaden 33 µl acetato
sódico al 10% (reactivo 4 de IsoQuick) y 365 µl de isopropanol. Después de mezclar suavemente, se
colocan los tubos de 20 minutos a 1 hora a –20°C.
x)
El ARN se precipita mediante centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos. Se decanta el
sobrenadante y se añade 1,0 ml de etanol al 70% mezclando suavemente. Después de centrifugar a
5.000 g durante 5 minutos, se decanta el sobrenadante y se añade 1,0 ml de etanol al 100%. Se
guardan los tubos a –70°C hasta que se usen en la RT-PCR.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
i)
Se centrifuga el ARN en etanol a 12.000 g durante 5 minutos. Se decanta el etanol y se invierten los
tubos dejando que escurran. El precipitado, que puede pasar desapercibido, no debe secarse porque
esto haría difícil su resuspensión. También es posible que un precipitado seco se desprenda del tubo
invertido.
ii)
Se añaden a cada tubo 12 µl de agua libre de ARNasa, se mezcla y se calienta a 65°C durante 5–
10 minutos. Se colocan las muestras en hielo.
iii)
En una campana de bioseguridad "limpia", se preparan en agua libre de ARNasa las soluciones stock
que contienen 200 pmoles/µl de los cebadores A, B, C y D y se guardan a –70°C.
Cebadores de la primera fase de la RT-PCR (para amplificar el ARN 6 desde el nucleótido 11 al 284)
Cebador A: 5’-GTT-CTC-TAG-TTG-GCA-ACC-ACC-3’
Cebador B: 5’-AAG-CCA-GAC-TGT-TTC-CCG-AT-3’
Cebadores de la RT-PCR (para amplificar el ARN 6 del nucleótido 170 al 270)
Cebador C: 5’-GCA-GCA-TTT-TGA-GAG-AGC-GA-3’
Cebador D: 5’-CCC-GAT-CAT-ACA-TTG-CTT-CCT-3’
iv)
Las soluciones stock de los cebadores se diluyen a una concentración de 15–20 pmoles/µl. Se
preparan los cebadores para la primera fase de la reacción de PCR mezclando volúmenes iguales de
A y B. Se preparan los cebadores para la otra fase de la reacción de PCR mezclando volúmenes
iguales de C y D. Las mezclas de cebadores se congelan a –20°C en pequeñas alícuotas.
v)
Se rotulan los tubos de reacción y se añade a cada tubo 4 µl de mezcla de los cebadores (A+B) para
la primera fase de síntesis. Los tubos se dejan en hielo.
vi)
En una campana extractora de humos ‘limpia’ se diluyen por separado, en agua libre de ARNasa,
hidróxido metilmercúrico a 50 mM (dilución 1/20) y 2-mercaptoetanol a 350 mM (dilución 1/40). Estos
compuestos están catalogados respectivamente como extremadamente tóxico y muy tóxico. Hay que
utilizar ambos con mucho cuidado y eliminarlos, así como las puntas de pipeta utilizadas con ellos,
según las normas de seguridad. Se han descrito métodos alternativos en los que se utiliza la
desnaturalización por calor (22, 29)
vii)
Después se añaden 4 µl de las muestras de ARN de ensayo y de control positivo y negativo (paso ii)
sobre los 4 µl de mezcla de cebadores de RT-PCR (45).
viii) A cada tubo de RT-PCR se añaden 2,0 µl de la dilución 1/20 de hidróxido metilmercúrico con agitación
suave y se deja estar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de añadir 2,0 µl de la dilución
1/40 de 2-mercaptoetanol. Por razones de seguridad, algunos laboratorios utilizan formamida en vez
de hidróxido metilmercúrico para desnaturalizar el ARN de dos cadenas. Sin embargo, es preferible el
hidróxido metilmercúrico para una sensibilidad óptima.
ix)
En una campana ‘limpia’ se prepara una mezcla para ADNc que contenga los siguientes reactivos en
volumen suficiente para el número de muestras que se van a ensayar. La cantidad indicada es por
muestra y los reactivos son los contenidos en la preparación Superscript Preamplification System
(Life Technologies).
10 × tampón SuperscriptTM (200 mM Tris/HCl, pH 8,4, y 500 mM KCl)
MgCl2 (25 mM)
Mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Dithiothreitol (DTT) (0,1 M)
Transcriptasa inversa (200 unidades/µl)
x)
8
2,0 µl
2,0 µl
1,25 µl
2,0 µl
0,75 µl
Después se añaden 8 µl de la mezcla a cada tubo de RT-PCR hasta un volumen final de 20,0 µl.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
xi)
Se colocan los tubos de PCR en un termociclador, como el GeneAmp RT-PCR System 9600, que se
programa para transcripción inversa del siguiente modo:
Mantener 44°C
Mantener 4°C
xii)
50 minutos
Constante
Se sacan los tubos del termociclador y se añade a cada tubo 1,0 µl de ARNasa H y una bola de cera.
El ciclador se programa del siguiente modo:
Mantener 37°C
Mantener 98°C
Mantener 4°C
20 minutos
4 minutos
Constante
xiii) En una campana "limpia" se prepara una mezcla de primera amplificación que contenga los siguientes
reactivos en volumen suficiente para el número de muestras de ensayo. Todos los reactivos, excepto
el agua, son comercializados por Perkin-Elmer. La cantidad que se indica es por muestra.
ARNasa sin agua
10 × tampón PCR Perkin-Elmer (100 mM Tris/HCl, pH 8,3, y 500 mM KCl)
MgCl2 (25 mM)
Mezcla de dNTP (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Taq ADN polimerasa (5 unidades/µl)
62,0 µl
7,0 µl
7,0 µl
4,0 µl
0,85 µl
xiv) La mezcla de la primera fase se saca del área ‘limpia’ y se lleva al área del termociclador y se
depositan 80 µl en cada tubo con muestra. La capa de cera no debe romperse. Entonces cada tubo
debe contener 101 µl.
xv)
Se colocan los tubos en el termociclador, que se programa tal como se indica para la primera fase de
amplificación (correcto para el GeneAmp PCR System 9600 -la programación en otros termocicladores
debe determinarse):
Un ciclo:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
3 minutos
20 segundos
30 segundos
40 ciclos:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
20 segundos
20 segundos
20 segundos
Un ciclo:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
Mantener 4°C
20 segundos
20 segundos
5 minutos
Constante
xvi) 15 minutos antes de que se complete la programación, se preparan tubos de RT-PCR para la
siguiente reacción en una campana ‘limpia’, y se mantienen en hielo:
ARNasa sin agua
Mezcla de cebadores (C+D)
Bola de cera
17 µl por tubo
4,0 µl por tubo
xvii) Cuando se completa la primera fase de la amplificación, se sacan los tubos del termociclador y se
colocan en una cabina de seguridad biológica (no la campana "limpia). Después, se transfiere 1,5 µl
del producto de la primera fase al tubo correspondiente de RT-PCR de la segunda fase que contiene
cebador, agua y una bola de cera.
xviii) Se colocan los tubos en el termociclador que se programa tal como se indica para la formación de una
capa de cera:
Mantener 98°C
Mantener 4°C
4 minutos
Constante
xix) En una campana ‘limpia’ se prepara la mezcla de los siguientes reactivos en volumen suficiente para
el número de muestras a ensayar. Los reactivos son los mismos que en la primera fase (paso xii). Las
cantidades que se indican son por muestra:
ARNasa sin agua
10 × tampón PCR
MgCl2
Mezcla de dNTP
Taq ADN polimerasa
xx)
17,0 µl
5,0 µl
3,5 µl
4,5 µl
0,5 µl
La mezcla se pasa de la campana ‘limpia’ al termociclador y se depositan 30 µl en cada tubo. Cada
tubo debe contener entonces 52 µl.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
9
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
xxi) Se colocan los tubos en el termociclador, que se programa tal como se indica para la segunda
amplificación. Después de completar el proceso, los tubos se mantienen a 4°C o a –20°C hasta la
electroforesis:
Un ciclo:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
3 minutos
20 segundos
30 segundos
40 ciclos:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
20 segundos
20 segundos
20 segundos
Un ciclo:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
Mantener 4°C
20 segundos
20 segundos
5 minutos
Constante

Análisis electroforético del producto de la RT-PCR
i)
Al principio se prepara el tampón 1 × TBE (Tris/borato, pH 8,6, y EDTA 1,5 mM) a partir de una
solución stock × 10. Para el sistema de Bio-Rad Wide Mini-Sub cell, se preparan 700 ml (100 ml para
el gel y 600 ml para el depósito de tampón).
ii)
Se prepara en tampón TBE una solución al 3% de agarosa NuSieve 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland,
Maine, EE.UU.) o una agarosa equivalente. La solución se hierve hasta que la agarosa se disuelva por
completo y luego se deja enfriar hasta los 40°C. Se añade bromuro de etidio a una concentración de
0,5 µg/ml tanto al tampón de la agarosa como al del depósito. El bromuro de etidio es mutagénico y
tóxico. Siempre se deben utilizar guantes, ropa protectora y protección ocular.
iii)
Se cierran los extremos de la bandeja de electroforesis y se vierte la solución de agarosa. El peine se
inserta en la agarosa hasta que se solidifica en una superficie nivelada a los 30–60 minutos. El peine y
el cierre se eliminan con cuidado de la bandeja de electroforesis.
iv)
Se vierte el tampón en el depósito del aparato de electroforesis y se inserta la bandeja con la agarosa
de modo que el tampón cubra la agarosa.
v)
Las muestras de ensayo y los controles positivos y negativos se preparan para la electroforesis en
tubos de microcentrífuga del modo siguiente:
Solución de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 µl
ADN amplificado de cada tubo de RT-PCR y un tubo extra para
un ADN marcador
15,0 µl
Solución de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 µl
Marcador de 100 pares de bases (Cat. 15268-019, Life Technologies,
Grand Island, New York, EE.UU.)
1,0 µl
vi)
Se cargan las muestras en los pocillos adecuados del gel y se corren a 65–75 voltios durante 1–
1,5 horas o hasta que el colorante alcance la mitad de la longitud del gel. El gel se lleva a un
transiluminador y se fotografía para documentación permanente. Usar protección ocular para
visualizar las bandas en el gel.
vii)
Las muestras positivas para LA tendrán una banda de 101 pares de bases. Para que la prueba sea
válida, el control positivo debe mostrar una banda del tamaño correcto, y el negativo y los controles sin
ARN no deben mostrar ninguna banda. Las muestras se consideran positivas si hay una banda del
mismo tamaño que la del control positivo. Las muestras duplicadas deberían mostrar la misma
reacción. Si existe disparidad, debe repetirse la prueba.
viii) Durante una noche se coloca en el tampón del depósito un envase (Ameresco, Solon, Ohio, EE.UU.)
al objeto de eliminar el bromuro de etidio. Después se puede verter el tampón al alcantarillado y debe
colocarse el envase, después de reutilizarlo 10–15 veces, en un recipiente identificado
adecuadamente como bromuro de etidio y, finalmente, incinerarlo.
2.
Pruebas serológicas
Los anticuerpos contra BTV generados en animales infectados pueden detectarse mediante varios
procedimientos cuya sensibilidad y especificidad varían. Se inducen anticuerpos específicos tanto de serogrupo
como de serotipo y, si el animal no ha estado previamente expuesto al BTV, los anticuerpos neutralizantes que
se generan son específicos para el serotipo del virus infectante. Las infecciones múltiples con diferentes
serotipos de BTV dan lugar a la producción de anticuerpos capaces de neutralizar los serotipos a los que el
animal no ha estado expuesto.
10
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
a)
Fijación del complemento
Hasta 1982 se utilizó ampliamente una prueba de fijación del complemento para detectar anticuerpos contra
el BTV, que fue en gran medida reemplazada por la prueba de IGDA aunque la prueba de FC todavía se
utiliza en algunos países.
b)
Inmunodifusión en gel de agar (una prueba prescrita para el mercado internacional)
La prueba IGDA para detectar los anticuerpos anti-BTV es de un desarrollo simple y el antígeno utilizado en
la prueba es relativamente fácil de generar. Desde 1982, la prueba ha sido el procedimiento estándar de
ensayo para controlar el movimiento internacional de los rumiantes. Sin embargo, una de las desventajas
de la IGDA utilizada para la LA es su falta de especificidad, por la que puede detectar anticuerpos contra
otros Orbivirus, en particular los del serogrupo EHE. Por tanto, los sueros positivos por IGDA deben ser
probados de nuevo utilizando una prueba específica para el serogrupo LA. La falta de especificidad y la
subjetividad que se ejerce durante la lectura de los resultados ha promovido el desarrollo de procedimientos
basados en el ELISA para la detección específica de los anticuerpos anti-BTV. La versión preferida, una
técnica C-ELISA, se describe en la sección B.2.c.

c)
Procedimiento de la prueba
i)
Se prepara una capa de 2,8 mm de grosor de agarosa al 0,9% en NaCl al 0,85% y se excavan pocillos
circulares de 4,0 mm de diámetro separados entre sí 2,4 mm, con un pocillo central y seis pocillos
periféricos.
ii)
Se prepara antígeno vírico generando una preparación soluble de células BHK o Vero infectadas 24–
48 horas antes con un serotipo individual de BTV. El antígeno se puede concentrar por precipitación o
ultrafiltración.
iii)
Se colocan un suero positivo de referencia y tres sueros de ensayo de forma alterna en los seis
pocillos que rodean el pocillo central que contiene el antígeno y se incuban las placas 24 horas en un
ambiente húmedo a 20–25°C.
iv)
Se forman una serie de líneas de precipitina entre el antígeno y los sueros positivos, y las líneas
generadas por los sueros de ensayo positivos se juntarán con las de los controles positivos. Con las
muestras débilmente positivas las líneas control se curvan hacia el antígeno y se separan del pocillo
de la muestra de ensayo, pero no forman una línea continua con los pocillos de control de la prueba.
Con las muestras negativas, las líneas de precipitina continúan en los pocillos de la muestra sin
curvarse hacia el antígeno.
v)
Todas las muestras débilmente positivas y otras muestras que produzcan resultados dudosos deben
repetirse utilizando pocillos de 5,3 mm de diámetro separados entre sí 2,4 mm o probarse de nuevo
utilizando un C-ELISA como se describe a continuación.
Enzimoinmunoensayo competitivo (una prueba prescrita para el mercado internacional)
La prueba competitiva ELISA, o prueba de ELISA bloqueante para la LA, se desarrolló para medir los
anticuerpos específicos contra BTV sin detectar anticuerpos de reacción cruzada con otros Orbivirus (1, 4,
21, 32, 37). La especificidad es el resultado de utilizar uno de varios MAb con reactividad de serogrupo para
la LA, como el MAb-3-17-A3 (2) o el MAb 20E9 (21) o el Mab 6C5F4D7 (26). Los anticuerpos proceden de
varios laboratorios y, aunque son diferentes, todos parecen unirse a la región amino-terminal de la principal
proteína de la cápsida, VP7. En la prueba C-ELISA, los anticuerpos de los sueros de ensayo compiten con
los MAb para unirse al antígeno. El siguiente procedimiento de C-ELISA se ha estandarizado después de
los estudios comparativos en varios laboratorios internacionales.

Procedimiento de la prueba
Hay descritos varios procedimientos; este es un ejemplo de un procedimiento ELISA.
i)
Durante una noche a 4°C o durante 1 hora a 37°C, se recubren los 96 pocillos de las placas de
microtitulación con 50-100 µl de antígeno derivado de cultivos celulares obtenido por sonicación (2) o
del antígeno principal de la cápsida VP7 expresado en baculovirus (33) o levaduras (26), y diluidos en
0,05 M de tampón carbonato, pH 9,6.
ii)
Las placas se lavan cinco veces con PBST (0,01 M de PBS con 0,05% o 0,1% de Tween 20, pH 7,2).
iii)
A continuación se añaden por duplicado 50 µl de sueros de ensayo a una única dilución, 1/5 (1) o 1/10
(21), en PBST que contenga 3% de seroalbúmina bovina (BSA).
iv)
Inmediatamente, se añaden a cada pocillo 50 µl de una dilución predeterminada de MAb diluido en
PBST que contenga 3% de BSA. Los pocillos de control de MAb contienen tampón de dilución en vez
de suero de ensayo.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
11
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
v)
Las placas se incuban 1 hora a 37°C o 3 horas a 25°C, con agitación continua.
vi)
Después de lavar como se indicó anteriormente, los pocillos se llenan con 100 µl de una dilución
apropiada de IgG (H+L) anti-ratón obtenida en conejo y marcada con peroxidasa de rábano, realizada
en PBST con 2% de suero normal bovino.
vii)
Después de incubar 1 hora a 37°C, se elimina la solución del conjugado y las placas se lavan cinco
veces con PBS o PBST. Los pocillos se llenan con 100 µl de solución de substrato que contiene 1,0 M
de ABTS (2,2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6 ácido sulfónico]), y 4 mM de H2O2 en 50 mM de citrato
sódico, pH 4,0, y las placas se agitan a 25°C durante 30 minutos. (Se pueden utilizar otros substratos
y dejar que la reacción continúe agitándose durante un tiempo adecuado para permitir el desarrollo del
color).
viii) La reacción se detiene añadiendo un agente bloqueante, como azida sódica.
ix)
Después de poner a cero el lector de ELISA con los pocillos que solo contienen substrato y agente
bloqueante, se miden los valores de absorbancia a 414 nm. Los resultados se expresan como
porcentajes de inhibición y derivan de los valores medios de absorbancia de cada muestra por la
fórmula siguiente:
% inhibición = 100 – [(Media de la absorbancia de la muestra de ensayo) / (Media de la absorbancia
del control de MAb)] × 100.
NB: Algunos laboratorios prefieren usar un control de suero negativo que previamente se ha visto que
tiene un porcentaje de inhibición igual a cero como alternativa al control de MAb.
x)
Los porcentajes de inhibición >50% se consideran positivos. Una inhibición entre el 40% y el 50% se
considera sospechosa. Los resultados de los duplicados de los sueros de ensayo pueden variar con
tal de que los valores caigan dentro del valor de inhibición escogido.
xii)
En cada placa se deben incluir sueros positivos fuertes y débiles y un control de suero negativo. Un
positivo débil debe dar un 60-80% de inhibición y un negativo menos del 40% de inhibición.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
En varios países se utilizan tanto las vacunas con el BTV atenuado como las que contienen virus inactivados.
Hay vacunas recombinantes en proceso de desarrollo basadas en distintas estrategias pero ninguna ha sido
autorizada y tales vacunas no se consideran aquí. En Sudáfrica, se han usado durante más de 40 años las
vacunas vivas atenuadas y se saben que inducen una inmunidad eficaz y duradera (11). Las vacunas vivas
atenuadas se producen adaptando el BTV original a crecer in vitro en cultivo de tejidos o en huevos embrionados
de pollo mediante pases seriados. La estimulación de una fuerte respuesta de los anticuerpos mediante estas
vacunas se correlaciona directamente con su capacidad para crecer en el hospedador vacunado. La obtención
de vacunas vivas atenuadas en grandes cantidades es un proceso barato; producen una inmunidad protectora
tras una única inoculación y son eficaces para evitar la enfermedad clínica de la LA en las áreas donde se usan
(10). Sin embargo, las vacunas con el BTV vivo atenuado presentan algunos inconvenientes documentados o
potenciales, como la sub-atenuación, cuyo impacto puede variar en diferentes razas de ovejas. Las posibles
consecuencias adversas son un descenso de la producción de leche en las ovejas en periodo de lactación, el
aborto o la muerte embriónica y la teratogénesis en la descendencia cuando se utilizan en el primer período de la
gestación. Otro riesgo relacionado con el uso de las vacunas vivas atenuadas es su posible diseminación por
vectores, con reversión eventual a la virulencia y/o recombinación de los genes del virus vivo modificado (MLV)
con los de las cepas del virus original. La frecuencia y la relevancia de estos sucesos no están bien definidas,
pero en EE.UU. y en Europa, se ha puesto de manifiesto la diseminación natural y local de las cepas de las
vacunas (25, 42). Por tanto, son preferibles las vacunas inactivadas, si resultan eficaces. La inactivación de los
virus elimina los riesgos de la transmisión por vectores, la reversión de la virulencia, las anormalidades fetales y
la posibilidad de la recombinación vírica.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para las vacunas vivas atenuadas, el inóculo base o primario se prepara a partir de una placa o calva única
de BTV atenuado que se ha cultivado por pases seriados. Los virus se atenúan por pases en ECE, cultivo
celular de tejidos, o una combinación de ambos. Cada lote de inóculo primario debería probarse también
para la transmisión y la reversión de la virulencia. Se deben probar en las ovejas la avirulencia, la seguridad
y la inmunogenicidad de muestras de la vacuna preparada de inóculos víricos secundarios del máximo nivel
de pases permitidos.
12
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
Para las vacunas muertas, no se aplica atenuación alguna, y la estrategia utilizada suele ser la de utilizar
cepas de campo con pocos pases de cultivo para intentar lograr una elevada antigenicidad.
Los virus del inóculo primario deben estar libres de bacterias, virus, priones, hongos y micoplasmas
contaminantes, evitando en particular la contaminación por pestivirus. A este respecto, se debe prestar
atención al suero fetal bovino utilizado en los cultivos celulares, ya que puede estar contaminado. Los virus
de siembra deben tener la especificidad serotípica deseada.
El BTV que se utiliza en el lote de siembra primaria debería secuenciarse y los datos deberían depositarse
en las bases de datos reconocidas (34).
Los lotes de siembra secundaria que se usan como inóculo en la producción de vacunas, no suelen
presentar más de tres pases de cultivo que el lote de siembra primaria.
b)
Método de cultivo
Aunque las primeras vacunas de la LA se propagaron en ECE, recientemente se ha utilizado el cultivo
celular para la adaptación y los pases seriados. Entre estos cultivos están los de células primarias de
embrión bovino, células de riñón de cordero y de cordero fetal, y la línea celular continua de células BHK.
Los cultivos celulares deben comprobarse cuidadosamente para detectar la presencia de virus
contaminantes.
El BTV para vacunas inactivadas se produce a gran escala en los sistemas de células en suspensión que
son susceptibles al virus de la lengua azul.
c)
Validación como vacuna
Las vacunas atenuadas contra la LA deben ser seguras y eficaces; a continuación, se presenta una
descripción breve de las pruebas relacionadas con estos parámetros. Además, los virus atenuados no
deben revertir a la condición de virulentos durante su replicación en animales vacunados ni transmitirse
desde tales animales por insectos vectores. Este último criterio es muy importante, porque la transmisión de
los virus atenuados mediada por los insectos desde los animales vacunados a los no vacunados, con los
subsiguientes pasos replicativos en cada especie hospedadora, aumenta la probabilidad de reversión a la
virulencia. Aunque las pruebas de reversión a la virulencia y de transmisión se realizan raramente, se
resumen los requisitos en una breve descripción.
Existe variabilidad en la susceptibilidad a la lengua azul entre las distintas razas de ovejas; es importante, a
efectos de la validación de la vacuna, que se utilicen ovejas susceptibles a la infección por el BTV.
i)
Inocuidad
Debe ensayarse la seguridad de todas las vacunas. Las pruebas de inocuidad de las vacunas
atenuadas no contemplan la cuestión de la teratogenicidad. Las vacunas con virus atenuados son
teratogénicas y no deben administrarse a las ovejas gestantes durante la primera mitad de la
gestación debido a que pueden causar anormalidades fetales y la muerte embrionaria (12, 20).
Es necesario demostrar la avirulencia de las vacunas vivas atenuadas. Se inocula con un lote de
siembra primaria un grupo de ovejas que sean seronegativas a una prueba serológica con sensibilidad
apropiada (que detecte anticuerpos de forma fiable incluso en los animales vacunados). Para asegurar
la avirulencia y la inocuidad, se toma la temperatura dos veces diariamente y se observan los
animales a intervalos regulares durante un período de 28 días para detectar los síntomas clínicos y la
aparición de cualquier reacción local o sistémica. Se pueden tomar con regularidad muestras de
sangre para medir el nivel de viremia y la respuesta serológica. La prueba será válida si todas las
ovejas vacunadas muestran la multiplicación del virus y no muestran más síntomas de la enfermedad
que una indisposición leve y transitoria. En Sudáfrica se calcula un índice de reacción clínica para
cada animal entre los días 4 y 14 que debe estar por debajo de un valor estándar específico.
ii)
Eficacia
Las ovejas vacunadas y no vacunadas deben recibir un inóculo de desafío con un virus virulento de
serotipo homólogo. Se recomienda utilizar preferentemente el virus original cultivado solo en animales
rumiantes y sin pases por ECC o cultivo celular. El pase por tales sistemas de aislamiento origina unos
cultivos de virus que podrían inducir una enfermedad clínica de la lengua azul más leve que la
enfermedad natural (12). Los animales se examinan teniendo en cuenta los síntomas clínicos de LA.
Se toman diariamente las temperaturas rectales dos veces, se extraen a intervalos regulares muestras
de sangre para medir la viremia y la respuesta serológica. Sin embargo, es difícil asegurar la aparición
de la enfermedad clínica en las ovejas por la inoculación de algunos serotipos y aislamientos de BTV
y, por tanto, la evidencia de infección en las ovejas control no vacunadas puede reducirse a la
aparición de un aumento de la temperatura de por lo menos 1,7°C sobre la media anterior al inóculo
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
13
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
de desafío y a la viremia. Como prueba adicional de la infección, se analizan los sueros, pre- y postvacunación, para la presencia de anticuerpos neutralizantes.
iii)
Transmisión
La transmisión se produce con vacunas vivas atenuadas pero no con vacunas muertas. Los
procedimientos para determinar si un virus atenuado se puede transmitir por los insectos que se
alimentan con sangre de ovejas virémicas vacunadas son difíciles de realizar y de analizar
estadísticamente. Por ello, es raro que se investigue este criterio de validación de la vacuna. Hay
datos que indican que los virus adaptados a las condiciones del laboratorio se pueden transmitir a
través de insectos vectores (13, 31, 39). Un procedimiento adecuado para determinar la transmisión
de un virus atenuado requiere que las ovejas estén vacunadas y que, durante la viremia, estén
expuestas a los Culicoides no infectados a los que se deja alimentar con sangre de animales no
infectados controlados en relación con la presencia del BTV y anticuerpos anti-BTV. Como el título de
virus atenuados en la sangre de las ovejas vacunadas es muy bajo, se necesitaría una gran cantidad
de Culicoides, y solo una pequeña proporción de estos llegarían a infectarse y a vivir lo suficiente para
alimentarse de otra oveja no infectada y transmitirle potencialmente el virus. Es difícil diseñar un
experimento de laboratorio que tenga en cuenta el número de variables presentes en las situaciones
de campo. Los datos actuales indican que, durante la viremia, y a diferencia de los virus de tipo
salvaje, las cepas del BTV adaptadas a las condiciones de laboratorio pueden aparecer en el semen
de los toros y los carneros (19, 38). Un reciente estudio llevado a cabo en el semen de carneros
vacunados con la vacuna viva atenuada BTV2 indica que incluso cuando el BTV no se detecta en el
semen, la vacuna causa una disminución de su calidad (3).
Un procedimiento adecuado para determinar la transmisión de un virus atenuado requiere que las
ovejas estén vacunadas y que, durante la viremia, estén expuestas a Culicoides no infectados a los
que se les deja alimentar de animales no infectados controlados para detectar la presencia del BTV y
de los anticuerpos anti-BTV. Como el título de virus atenuados en la sangre de las ovejas vacunadas
es muy bajo, se necesitarían muchos Culicoides, y sólo una pequeña proporción de estos llegarían a
infectarse y vivir lo suficiente para alimentarse sobre otra oveja no infectada y transmitirle
posiblemente el virus. Es difícil diseñar un experimento de laboratorio que tenga en cuenta el número
de variables presentes en situaciones de campo. Aunque los títulos de virus en sangre inferiores a
103TCID50/ml se han considerado tradicionalmente como un umbral “seguro”, se han descrito
situaciones reales de insectos que adquieren el BTV a partir de animales con títulos víricos por debajo
de 103TCID50/ml. Debido a la compleja interacción que existe entre el BTV, los vectores Culicoides y
los animales hospedadores en el ciclo natural de la infección, los títulos de virus inducidos por la
vacuna viva atenuada deben mantenerse al mínimo, especialmente si la transmisión de las cepas de
la vacuna en condiciones de campo supone una preocupación.
iv)
Reversión a la virulencia
Los estudios de validación confirman que, en las ovejas vacunadas, los virus atenuados no revierten a
virulentos. Sin embargo, si los insectos no transmiten los virus atenuados desde los animales
vacunados a los no vacunados, la reversión a la virulencia resulta ser solo una posibilidad teórica. Sin
embargo, si los virus atenuados pudieran transmitirse desde los animales vacunados, la reversión a la
virulencia durante varios ciclos de replicación en oveja-insecto sería una posibilidad bien distinta. El
único modo apropiado de comprobar la reversión a la virulencia bajo estas circunstancias es comparar
la virulencia del virus vacunal con la del virus sujeto a varios ciclos de replicación oveja-insecto, como
se comentó anteriormente. Esto es difícil de realizar. Por consiguiente, no se ha determinado el efecto
de varios pases en insecto y en oveja sobre la virulencia de los virus atenuados. En Sudáfrica se
considera que si, durante la fase virémica, la sangre de los animales vacunados se pasa en serie tres
veces por oveja sin reversión a la virulencia, las posibilidades de reversión en el campo serán muy
pequeñas.
2.
Método de producción
La atenuación de aislamientos naturales de BTV se realizó primero mediante pases seriados en ECE. Debido a
la posibilidad de transmisión de los virus propagados en huevos, se ha recomendado que los animales
inoculados con vacunas producidas en ECE no realicen desplazamientos internacionales (34). Más
recientemente, parece claro que el pase por células en cultivo también induce a la atenuación de la virulencia. No
se han hecho estudios para relacionar con precisión el número de pases y el grado de atenuación de virus o
serotipos individuales. Para preparar virus atenuados, los aislamientos de campo se adaptan a cultivo celular y
se pasan in vitro hasta 40 veces o más. En teoría, en esta etapa se seleccionan varios virus purificados de
placas o calvas y cada uno se examina para el nivel de viremia que generan y su capacidad para inducir una
respuesta inmune de protección en las ovejas vacunadas. El virus ideal es el que se replica a bajo un título pero
que induce una respuesta inmune protectora y este puede representar la fuente del stock de virus para el inóculo
primario de la vacuna.
Para las vacunas muertas, el BTV se produce a gran escala en cultivos célulares en suspensión bajo condiciones
asépticas controladas. Se utilizan líneas celulares adaptadas para su cultivo industrial y que están libres de
14
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
microorganismos contaminantes. Cuando la suspensión alcanza su título vírico máximo, se realiza la
homogeneización celular y se clarifica y se filtra el cultivo. Después se lleva a cabo la inactivación según los
procesos adoptados por el fabricante, como la adición de etilenimina binaria (BEI) u otros agentes inactivantes.
El proceso debe cumplir con la legislación pertinente respecto al comercio, debe superar la validación que
asegure una inactivación completa y disponer de la documentación apropiada. El proceso de inactivación no
debe alterar de modo significativo las propiedades inmunogénicas de los antígenos víricos. La purificación se
realiza por cromatografía. El virus inactivado se concentra luego mediante ultrafiltración y se almacena. Los
antígenos inactivados del BTV, purificados por cromatografía y concentrados se convierten en vacuna mediante
la dilución en una solución tampón y la adición de adyuvantes.
3.
Control interno
Todos los componentes de origen animal, como el suero y las células, deben probarse para la presencia de
bacterias, virus, hongos o micoplasmas viables.
La concentración de virus en las vacunas atenuadas se determina a través de la infectividad y por pruebas
ELISA.
En cuanto a las vacunas inactivadas, durante la inactivación del virus se toman muestras a intervalos con el fin
de comprobar la velocidad y linealidad del proceso de inactivación. Los títulos víricos de las muestras se
determinan mediante inoculación de células BHK-21 u otros cultivos celulares adecuados. Al final del proceso de
inactivación, la vacuna se controla para asegurar que no contiene ningún virus vivo.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Cada lote de vacuna tiene que ser probado para detectar la presencia de bacterias, virus contaminantes,
hongos y micoplasmas. Por ejemplo, en Sudáfrica, se inocula un conjunto de diez ampollas seleccionadas
al azar en caldo de soja y caldo de tioglicolato y se incuba a temperatura ambiente y a 37°C,
respectivamente, durante 14 días. Si el cultivo aparece contaminado se desecha el lote.
b)
Inocuidad
Cada lote de vacuna atenuada se prueba para la inocuidad en ratón adulto y en neonato, en cobayas y en
ovejas. Si se advierten reacciones adversas o síntomas notables, se repite la prueba. Cualquier incremento
en la temperatura corporal del animal por encima de la esperada para esa cepa particular de virus atenuado
que se está ensayando debe considerarse como sintomático. Si los resultados no son satisfactorios tras un
segundo intento, el lote se desecha.
Las pruebas de inocuidad de las vacunas inactivadas se realizan en ovejas para asegurar la ausencia de
efectos secundarios.
c)
Potencia
Cada lote se prueba inoculando ovejas susceptibles. Los sueros de pre-vacunación y los de 21 y 28 días de
post-vacunación se prueban mediante ensayos de NV para determinar los niveles de anticuerpos
neutralizantes. Para superar este aspecto, el título de anticuerpos debe ser igual o superior a unos valores
establecidos por los estándares internacionales de vacunas.
d)
Duración de la inmunidad
Los estudios sobre vacunas con el BTV vivo atenuado han mostrado que, en las ovejas, los anticuerpos
aparecen antes del día 10 post-vacunación, alcanzan un máximo aproximadamente 4 semanas después y
persisten durante más de un año. Existe una relación temporal entre el aumento en el título de anticuerpos
neutralizantes y la desaparición del virus de la circulación periférica. Las vacunas con BTV vivo atenuado se
han usado durante más de 40 años y se sabe que inducen una inmunidad eficaz y duradera (43). En las
áreas endémicas de Sudáfrica pueden presentarse muchos serotipos del BTV, y se usan vacunas
polivalentes. La inclusión de 15 serotipos en la vacuna de implica que no se genera una respuesta inmune
eficaz frente a todos los serotipos, probablemente porque la masa antigénica de algunos antígenos
individuales específicos de serotipo es pequeña. Para intentar ampliar la respuesta, se repite anualmente la
vacunación (11).
Los estudios iniciales llevados a cabo con vacunas inactivadas indican que se pueden detectar anticuerpos
contra el BTV a los 7 días de la vacunación y el título aumenta a los 14–21 días. Una segunda dosis de la
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
15
Capítulo 2.1.3. - Lengua azul
vacuna aumenta el título. Se siguen analizando datos para demostrar la duración de la inmunidad
esperada.
e)
Estabilidad
Se han elaborado procedimientos para las vacunas atenuadas. La estabilidad debe comprobarse a lo largo
de un período de 2 años. Se considera que las vacunas en forma líquida o liofilizada tienen una caducidad
de 1 y 2 años, respectivamente. Cada lote de vacuna se somete a una prueba acelerada de caducidad,
guardándolos a 37°C durante 7 días. Luego se titulan y evalúan con arreglo a un procedimiento estándar,
como se determina en las pruebas iniciales de la vacuna.
Hasta el momento, las vacunas inactivadas se han utilizado en situaciones de emergencia en las que no
era importante el tema de la caducidad. No se han desarrollado los requisitos y los procedimientos para el
uso comercial rutinario.
f)
Precauciones (riesgos)
Las vacunas atenuadas deben usarse en los meses más fríos, cuando la población de Culicoides y su
actividad típica alcanzan su nivel más bajo. No deben usarse en las ovejas durante la primera mitad del
embarazo ni en los carneros 2 meses antes de la época reproductiva.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Véase la sección C.4.b.
b)
Potencia
Véase la sección C.4.c.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la lengua azul (véase el cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008