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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN BIOLOGÍA - MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA
RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES
ASMÁTICOS INFECTADOS POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO
Trabajo de grado para optar al Título de Magíster Scientarum en Biología
Mención - Inmunología Básica.
Autora: Lcda. Jennifer Gotera.
C.I.- 14.523.512
Tutora: Dra. Nereida Valero.
C.I.- 8.491.958
Maracaibo, 19 de Septiembre de 2008.
II
RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES
ASMÁTICOS INFECTADOS POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO
Lcda. Jennifer L. Gotera Z.
C.I: 14.523.512
Urbanización Urdaneta Vereda 45 casa 8. Sabaneta
Telf: (0261)7293698 Cel: (0414)6362696
Correo Electrónico: [email protected]
Tutora: MgSc. Nereida Valero.
C.I: 8.491.958
III
REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN BIOLOGÍA - MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA
ACTA VEREDICTO
En el día de hoy, 19 de Septiembre de 2008, se constituyeron los siguientes profesores: Dr.
Héctor Pons C.I:4.521.139 (Coordinador), Dr. Heberto Suárez C.I: 4.533.204 (Jurado
Principal), Dra. Francisca Monsalve C.I: 13.624.773 (Jurado Principal), Dra. Nereida Valero
C.I: 8.491.958 (Jurado Suplente), nombrados como jurado por el Consejo Técnico de la
División de Estudios para Graduados de esta Facultad en sesión Nº 014-2008 de fecha 10 de
Septiembre de 2008, para conocer y evaluar el Trabajo de Grado titulado: “RANTES, MCP-1,
SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES ASMÁTICOS INFECTADOS
POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO”, presentado por la maestrante: Lcda. Jennifer
Lucila Gotera Zambrano C.I: 14.523.512, para optar al grado de MAGISTER SCIENTARUM
EN BIOLOGÍA – MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA, siendo las 4:00 de la tarde en el Salón
Nº 01, situado en el Edificio Grano de Oro. El acto se inició con la exposición de la
maestrante: Lcda. Jennifer Lucila Gotera Zambrano. A continuación los miembros del jurado
intervinieron, hicieron y solicitaron aclaratorias. Concluida esta sesión, el jurado se reunió a
puerta cerrada para discutir sobre dicha evaluación.
Acto seguido procedió a emitir el siguiente veredicto:
APROBADO
Luego se procedió a declarar públicamente el juicio emitido y a suscribir la presente acta
EL JURADO
Dr. Héctor Pons
(Coordinador)
C.I:4.521.139
Dra. Francisca Monsalve
(Jurado Principal)
C.I: 13.624.773
Dr. Herberto Suárez
(Jurado Principal)
C.I: 4.533.204
Dra. Nereida Valero
(Jurado Suplente)
C.I: 8.491.958
Ave. Universidad Edif. Grano de Oro. Aptdo. 526 Maracaibo-Venezuela Telf. (0261) 7598078 Fax: 7515390
IV
DEDICATORIA
A mi Dios por darme esa guía y luz permanente
para alcanzar esta meta tan deseada.
A mi padre, se que estas conmigo y eso completa
mi felicidad a pesar de tu ausencia física.
Te amo Papi, me haces mucha falta!!!!!!
V
AGRADECIMIENTO
- A la Dra. Nereida Valero por darme la oportunidad de trabajar en su proyecto, por ser
una excelente docente, digno ejemplo de lucha y conocimiento.
- A la Dra. Yraima Larreal, por su asesoría constante, y por creer siempre mí.
- A mi amiga y compañera la Lcda. Alibeth Mavárez por su ayuda ilimitada durante todo
este tiempo y amistad invalorable.
- A la MgSc. MeryBell Maldonado por haber sido un pilar fundamental en para lograr
este trabajo, por su amistad y su orientación académica.
- A la MgSc. Luz Marina Espina por su colaboración y preocupación en el
mantenimiento de las líneas celulares, las cuales fueron importantes para este trabajo.
- Al Profesor Hector Pons, por haberme brindado su amistad, guía y sus consejos desde
el comienzo de esta maestría.
- Al Dr. Jesús Mosquera, por ser un docente por excelencia, digno de ejemplo y guía en
todo momento.
- Al Lcdo. Jhon Bermúdez por su apoyo y colaboración en la parte experimental.
- Al MgSc. Ricardo Atencio, por su amistad incondicional y ayuda constante durante
todo este camino.
- Al MgSc. Atilio Ferrebuz, a la Dra. Yasmir Quiroz por su ayuda y siempre hacerme el
camino más fácil.
- A la MgSc. Alegría Levy por sus palabras de apoyo y animarme en los momentos
difíciles.
VI
- Al personal de la Sección de Virología del Instituto de Investigaciones Clínicas Dr.
Américo Negrette por su colaboración.
- Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia
(CONDES) por el financiamiento del presente trabajo de investigación.
- A la máxima casa de estudios, La Universidad del Zulia especialmente a la División de
Postgrado de la Facultad Experimental de Ciencias por darme la oportunidad de seguir
adquiriendo mas conocimientos.
- Al los diferentes centros de salud por su cooperación en la adquisición de la mayoría
de las muestras que formaron parte de este trabajo.
- A mi mamá Lucila, el máximo apoyo en mi vida, por ser mi todo, mi mayor guía, amiga
y por ser la mejor madre del mundo. También te dedico este éxito a ti. Te Amo….
- A mis hermanos José Joaquín y Johana, por estar orgullosos siempre de mi y por su
apoyo incondicional.
- A ni nana, por estar siempre conmigo y por darme esas ganas de seguir adelante ante
cualquier dificultad.
- A mi sobrina bella y preciosa Alehanna, por regalarme siempre su sonrisa e inocencia,
sin saber lo importante que es para mí.
- Y finalmente a mi novio Carlos Eduardo, aunque estas de último en la lista, eres muy
importante para mi, gracias por darme siempre una palabra de apoyo en los momentos
difíciles, comprensión, y por sentirte orgulloso de tu osita preciosa.
VII
INDICE DE CONTENIDO
pág.
PORTADA……………………………………………………………………………
I
FRONTISPICIO………………………………………………………………………
II
VEREDICTO…………….……………………………………………………………
III
DEDICATORIA………….…………………………………………………………..
IV
AGRADECIMIENTOS………………….……………………………………………
V
ÍNDICE DE CONTENIDO………………………….……………………………….
VII
ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………….
VIII
INDICE DE TABLAS…………………………………………………………………
X
RESUMEN….………………………………………………………………………
XI
ABSTRACT….…………………………………….…………………………………
XII
ABREVIATURAS………….…………………………………………………………
XIII
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………
1
II. OBJETIVOS…………………………………………………………………
9
III. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………
10
Población Estudiada………………………………………………………………..
10
Toma de Muestra…………………………………………………………………….
11
Aislamiento e Identificación Viral por Inmunofluorescencia……………………
11
Cultivo e Infección de Monocitos…………………………………………………..
13
Ensayo de Proteínas por el Método de Bradford………………………………..
14
Cuantificación de RANTES…………………………………………………………
15
Cuantificación de MCP-1……………………………………………………………
15
Cuantificación de Sustancia P……………………………………………………..
15
Cuantificación de la Proteína C Reactiva…………………………………………
16
Análisis Estadístico………………………………………………………………….
17
IV. RESULTADOS…………………………………………………………….
18
V. DISCUSIÓN………………………………………………………………..
31
VI. CONCLUSIONES…………………………………………………………
36
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………………………………………………
37
ANEXOS……………………………………………………………………………
45
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Distribución de la población estudiada de pacientes asmáticos y no asmáticos
infectados por el virus sincicial respiratorio (VSR)………………………………………….18
Fig. 2. Concentraciones séricas de RANTES en pacientes asmáticos y no
asmáticos……………………………………………………………………………………… 19
Fig. 3. Concentraciones séricas de RANTES en pacientes asmáticos infectados o no
por el virus sincicial respiratorio (VSR) y en no asmáticos con o sin infección por
VSR………………………………………………………………………………………………20
Fig. 4. Concentraciones séricas de RANTES según el tipo de infección: viral y mixta y
según el agente causal: VSR y otros virus respiratorios………………………………… 21
.
Fig. 5. Concentraciones séricas de MCP-1 en pacientes asmáticos y no
asmáticos........................................................................................................................22
Fig. 6. Concentraciones séricas de MCP-1 en pacientes asmáticos infectados o no por
el virus sincicial respiratorio (VSR) y en no asmáticos con o sin infección por
VSR…………………………………………………………………………………………….. 23
Fig. 7. Concentraciones de RANTES en sobrenadante de cultivo de monocitos humanos
infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR)……………………………………25
Fig. 8. Concentraciones de MCP-1 en sobrenadante de cultivo de monocitos humanos
infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR)………………………………….. 26
Fig. 9. Concentraciones de MCP-1 en sobrenadantes de cultivo de monocitos de
individuos asmáticos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR)…………..27
Fig. 10. Concentraciones de Sustancia P en sobrenadantes de monocitos humanos
infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR)……………………………………28
Fig. 11. Concentraciones de Sustancia P en sobrenadantes de monocitos de individuos
asmáticos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR)……………………….29
Fig. 12. Concentraciones de Sustancia P en sobrenadante de células de HEp-2
infectadas o no por el virus sincicial respiratorio (VSR)……………………………………30
IX
Gotera Z. Jennifer G. “RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA
EN
PACIENTES
ASMATICOS
INFECTADOS
CON
VIRUS
SINCICIAL
RESPIRATORIO”. Trabajo presentado para optar el Grado de Magíster Scientarum en
Biología, Mención Inmunología Básica. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de
Ciencias. División de Estudios para Graduados. Maestría en Biología Mención
Inmunología Básica. Maracaibo, Venezuela. 2008. págs (46).
RESUMEN
En actualidad, numerosos estudios clínico-epidemiológicos a nivel mundial, han
identificado al Virus Sincicial Respiratorio (VSR) como uno de los principales patógenos
en infantes y niños como primera causa de bronquiolitis severa y neumonía,
predisponiéndolos a un subsiguiente desarrollo de asma. Aunque se ha descrito una
fuerte asociación entre la infección por VSR y el desarrollo de sibilancias e
hiperreactividad bronquial, aun se desconoce el papel de este virus en la patogénesis
del asma. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar las concentraciones de
RANTES, MCP-1, SP y PCR en pacientes asmáticos infectados por VSR. Se
seleccionaron 31 pacientes con infección respiratoria aguda (15 asmáticos y 16 no
asmáticos) sin distingo de edad y sexo y 10 individuos controles. Se tomaron muestras
de tracto respiratorio y sangre sin anticoagulante. Se utilizó cultivo de células HEp-2
para el aislamiento e identificación del VSR por la técnica de Inmunofluorescencia
Directa. La determinación de RANTES, MCP-1, SP y PCR se realizó a través de la
técnica de ELISA. RANTES, MCP-1 y SP se cuantificaron en sobrenadantes de cultivo
de células HEp-2 y de monocitos humanos (provenientes de individuos normales y con
antecedente de asma) a las 24 horas post infección. Se observaron concentraciones
aumentadas (p<0,01) de RANTES y MCP-1 en pacientes asmáticos viralmente
infectados. Las concentraciones séricas de PCR y SP permanecieron inalteradas. En
los cultivos se obtuvieron concentraciones elevadas (p<0,01) de RANTES, MCP-1 y SP
en monocitos infectados por el virus, mientras que en HEp-2 solo se observaron
cambios importantes en las concentraciones de SP. Estos datos sugieren la posibilidad
de la contribución de estas quimiocinas y de la SP en la patogénesis del asma ante la
presencia del VSR, no así de la PCR la cual no evidencio relación a la presencia de
infección por VSR, ni de asma.
Palabras Claves: VSR, Asma, Sustancia P, MCP-1, RANTES, PCR
Correo Electrónico: [email protected]
X
Gotera Z. Jennifer G. “RANTES, MCP-1, SUBSTANCE P AND REACTIVE PROTEIN C
IN ASTHMATIC PATIENTS INFECTED WITH THE RESPIRATORY SYNCYTIAL
VIRUS”. Trabajo presentado para optar el Grado de Magíster Scientarum en Biología,
Mención Inmunología Básica. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias.
División de Estudios para Graduados. Maestría en Biología Mención Inmunología
Básica. Maracaibo, Venezuela. 2008. págs (46).
ABSTRACT
At the present time numerous clinical and epidemiological studies in the world, have
identified the Respiratory Syncytial Virus as a the main pathogen in infants and children
as the first cause of severe bronchiolitis and pneumonia and it is able to predispose
children to a subsequent development of asthma. Although a strong association
between the infection by VSR and the development of sibilances and bronchial
hyperreactivity has been found there is not a clear information regarding the role of this
virus in the pathogenesis of asthma. Therefore, the objective of this work was to
determine the concentrations of RANTES, MCP-1, Substance P (SP) and Reactive
Protein C (RPC) in asthmatic patients infected by RSV. Thrirty one patients with acute
respiratory infection (15 asthmatic and 16 nonasthmatic), without distintion of age and
sex, and 10 individual controls were selected. Samples from the respiratory tract and
blood, without anticoagulant, were taken. Culture of HEp-2 cells was used for the viral
isolation and the identification of the VSR by the technique of Direct
Immunofluorescence. The determination of RANTES, MCP-1, SP and RPC was done
through the ELISA technique. RANTES, MCP-1 and SP were determination the
supernatant of cultures of HEp-2 cells and of monocytes (originating from normal
individuals and those with a history of asthma) 24 hours after the infection. Increased
concentrations (p<0.01) of RANTES, MCP-1 y SP in asthmatic patients virally infected
were detected. The seric concentrations of PCR and SP remained inaltered. In cultures
eleveted levels of RANTES, MCP-1 and SP were found in monocytes infected with the
virus. However in HEp-2 only significant changes were detected in the SP
concentrations. These data suggest the possibility of the contribution of these
chimiokines and SP in the pathogenesis of asthma in the presence of RSV, but not in
the presence of RPC which was not related both to the presence of the infection witch
RVS and asthma.
Key Words: RSV, Asthma, Substance P, MCP-1, RANTES, CRP
e-mail: [email protected]
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
VSR:
Virus Sincicial Respiratorio.
IRA:
Infección Respiratoria Aguda.
PCR:
Proteína C Reactiva.
RANTES: Regulated on activaction, normal T cell - expressed and secreted protein.
MCP-1:
Monocyte chemotactic protein-1.
SP:
Sustancia P.
HRB:
Hiperreactividad Bronquial.
IFD:
Inmunofluorescencia directa.
Hep-2:
Línea celular de carcinoma laríngeo.
CMN:
Células Mononucleares.
UFP:
Unidades Formadoras de Placas
PI:
Post-infección
SFB:
Suero Fetal Bovino