Download encefalopatía y retinopatía víricas

NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista
del capítulo 1.2.3 del Código de animales acuáticos.
Este capítulo no ha sido actualizado desde 2003.
CAPÍTULO 2.1.7.
ENCEFALOPATÍA Y RETINOPATÍA VÍRICAS
RESUMEN
La encefalopatía y retinopatía víricas (ERV), o necrosis nerviosa vírica ( NNV) se ha descrito como una
enfermedad grave de peces marinos jóvenes o en estado larvario y, con menor frecuencia, en adultos, excepto
en África (23). Hasta el momento se sabe que la enfermedad ha afectado al menos a 30 especies de peces,
siendo las más afectadas perca gigante (Lates calcarifer [10] y Dicentrarchus labrax [2]), el mero de
pintas rojas (Epinephelus akaara [22], E. fuscogutatus [3], E. malabaricus [6], E. moara [25],
E. septemfasciatus [9], E. tauvina [4], E. coioides [19] y Cromileptes altivelis [34]), el jurel limón
(Pseudocaranx dentex [21]), perca loro japonesa (Oplegnathus fasciatus [33]), el pez globo tigre
(Takifugu rubripes [25]), y peces planos (Verasper moseri [32], Hippoglossus hippoglossus [11],
Paralichthys olivaceus [26], Scophthalmus maximus [1]).
Se han visualizado partículas víricas de unos 25-30 nm de diámetro en los peces afectados y se han
caracterizado los agentes presentes en el jurel limón la perca gigante y la lubina, asignándolos al género
Betanodavirus, de la familia de los Nodaviridae (5, 21). En varios estudios inmunológicos se ha descrito
la relación existente entre el virus de la necrosis nerviosa del jurel limón (SJNNV, la especie prototípica
del género Betanodavirus) y otros betanodavirus. La clasificación genómica del betadonavirus ha puesto de
manifiesto esa estrecha relación, siendo los principales grupos el tipo SJNNV, el virus de la necrosis
nerviosa del pez globo tigre (TPNNV), el virus de la necrosis nerviosa de la platija de cola rayada
(BFNNV), y el virus de la necrosis nerviosa del mero de manchas rojas (RGNNV) (27). Se han
descrito secuencias completas de nucleótidos de ARN1 y ARN2 de SJNNV y de GGNNV (un
betanodavirus del mero) (15, 29).
Todas las enfermedades se caracterizan por anormalidades neurológicas, tales como la natación errática (en
espiral, en remolino o con el vientre hacia arriba en posición de descanso) y la vacuolización de los tejidos
nerviosos centrales. Normalmente, también se da vacuolización de las capas nucleares de la retina. En
general, los peces más jóvenes sufren lesiones más graves; los peces adultos padecen lesiones menos extensas,
que parecen afectar sobre todo a la retina. (23). Se han descrito inclusiones intracitoplásmáticas en células
cerebrales de la lubina europea, la perca gigante, el pez loro japonés y el mero de manchas marrones. Se ha
descrito la presencia de necrosis neuronal en casi todas las especies.
En el cuadro 1 se muestran diferencias importantes relativas a la aparición y gravedad de las
enfermedades. Difieren unas de otras con respecto a la edad en que pueden detectarse por primera vez y
respecto al periodo durante el cual se produce la mortalidad. En general, cuanto menor es la edad a la que
se detectan los síntomas de la enfermedad, mayor es la ratio de mortalidad. Aunque en algunas especies
rara vez aparece la enfermedad a edad temprana, para otras es frecuente que la mortalidad se dé a esa
edad, si bien no en el 100% de los casos, lo que indica que la susceptibilidad depende de la edad (23). Se
han descrito índices de mortalidad para la lubina europea (18) y el mero (9) adultos, pero incluso en esos
casos la mortalidad era mayor entre los peces más jóvenes.
Se ha demostrado que la transmisión vertical del agente causal de la enfermedad ocurre con Pseudocaranx
dentex, lo que se refleja en la aparición temprana de la enfermedad. Este hallazgo propició el control efectivo de
la NNV en larvas del jurel limón por el procedimiento de eliminar el reproductor portador del virus mediante la
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa y la desinfección con ozono de los fecundados (20,
40). Paradójicamente, también se ha descrito la infección ovárica en Dicentrarchus labrax; lo normal es que
en este caso no se detecte la enfermedad hasta los 30 días después de la incubación. Se ha demostrado la
transmisión/introducción del virus por los gametos y por cohabitación, pero están por demostrarse otras formas de
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Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
transmisión, que posiblemente incluirían el agua entrante, permanencia de los peces jóvenes en un mismo lugar, el
transporte en utensilios, vehículos, etc. Es probable que estos pequeños virus sean resistentes a las condiciones
ambientales (8) y, por tanto, fáciles de reubicar mediante las actividades comerciales. Se halla en fase de
experimentación una vacuna a base de proteína recombinante de la cápsida (13, 40).
Cuadro 1. Principales rasgos de la ERV/NNV en peces larvarios y en peces jóvenes
Aparición más Aparición más
temprana de la frecuente de la
enfermedad
enfermedad
Aparición más
tardía de nuevos
brotes
Tasa normal
de mortalidad
Tasa más alta
de mortalidad
Lates calcarifer
9 días
15−18 días
post-incubación post-incubación
≥24 días postincubación
50−100%/
mes
100% en
<1 mes
Dicentrarchus
labrax
10 días
25−40 días
post-incubación post-incubación
Peso corporal
400−580 g
10%/mes
–
Oplegnathus
fasciatus
6−25 mm
longitud total
–
<40 mm longitud
total
–
Hasta el 100%
Epinephelus
akaara
14 días postincubación
(7−8 mm
longitud total)
9−10 mm
longitud total
<40 mm longitud
total
80%
Hasta el 100%
Epinephelus
malabaricus
–
20−50 mm
longitud total
–
50−80%
–
<20 días postincubación (8 mm
longitud total)
100%
–
Peso corporal
50−100 mg
–
Hasta el 100%
Pseudocaranx
dentex
1 día
1−4 días
post-incubación post-incubación
Scophthalmus
maximus
<21 días
post-incubación
–
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Puede hacerse un diagnóstico presuntivo de la encefalopatía y la retinopatía víricas (ERV) o de la necrosis
nerviosa vírica (NNV) basado en la visualización, mediante microscopía de campo claro, de vacuolas en el
cerebro, la espina dorsal y/o la retina. Sin embargo, el diagnóstico es difícil cuando algunos peces tienen
tan solo unas pocas vacuolas en los tejidos nerviosos.
Las partículas víricas se pueden visualizar en el cerebro y la retina afectados mediante tinción positiva y
negativa. En el material con tinción positiva, el virus se asocia principalmente con células vacuolizadas y,
sobre todo con inclusiones. El tamaño de las partículas reconocidas oscila entre 22 y 34 nm, estando
dispuestas intracitoplasmáticamente en formaciones cristalinas, o como viriones individuales o agregados
dentro o fuera de las células. El virus es y de forma icosaédrica.
Todos lo betanodavirus se pueden detectar mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) o por
inmunohistoquímica con suero de conejo anti-SJNNV (12, 16). La mayor parte se pueden detectar
mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) con un conjunto de
cebadores diseñados para amplificar la región T4 (425 bases) del gen de la proteína de la cápsida del
SJNNV (27, 28) (este conjunto de cebadores es suficiente para la detección de todas las variantes
genotípicas de los betanodavirus, con una única excepción) (31). Aunque hay otros métodos
inmunológicos disponibles para la identificación del virus, como el enzimoinmunoensayo (ELISA) o la
prueba de neutralización, sólo se pueden utilizar con algunos betanodavirus debido a la poca información
serológica disponible en la actualidad.
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Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
El betadonavirus se puede cultivar en una línea celular de peces, la SSN-1, derivada del cabeza de serpiente
cabrío (7, 16). Para el análisis cuantitativo y cualitativo de todos los betanodavirus, resulta útil la línea
celular clónica E-11, derivada de la SSN-1 (17). Cabe resaltar que tanto la línea SSN-1 como la E-11 están
infectadas por un retrovirus de tipo C que actúa espontáneamente y se denomina SnRV (13, 17).
La detección de anticuerpos de peces contra los virus no se ha aceptado hasta el momento como método
rutinario de análisis para la evaluación del estatus vírico de las poblaciones de peces, debido al escaso
conocimiento que se tiene de las respuestas serológicas de los peces a las infecciones víricas.
Material de peces adecuado para el examen virológico:
• Peces asintomáticos (aparentemente sanos): larvas enteras o pececillos; cerebro, médula espinal, así
como los ojos en el caso de peces de mayor tamaño y/o fluido de los huevos procedente de los
reproductores en época de desove.
• Peces clínicamente afectados: larvas enteras, pececillos; cerebro, médula espinal, así como los ojos
para el caso de peces de mayor tamaño.
Procedimientos de muestreo: véase el capítulo I.1, sección B.
1. MÉTODO DE REFERENCIA PARA EL ANÁLISIS DE ERV/NNV
1.1. Aislamiento de los betanodavirus en cultivo celular
Línea celular a utilizar: SSN-1 o E-11 (un clon celular de SSN-1)
a) Inoculación de monocapas celulares
i)
Se homogeneizan muestras de peces con nueve volúmenes de solución salina equilibrada
de Hanks (HBSS), centrifugada y filtrada (con un filtro de membrana de 0.2 µm).
ii)
Se inoculan diluciones decimales de un filtrado vírico en monocapas celulares cultivadas
en medio L-15 de Leibovitz u otro medio suplementado con suero bovino al 5% (FBS).
Se inoculan al menos 2 cm2 de monocapa celular escurrida con 100 µl de cada dilución.
iii) Se deja que se adsorba durante 1 hora a temperatura ambiente y se añade el medio
suplementado con FBS al 5% e incubado a 20–25°C.
NOTA: Las temperaturas óptimas para el crecimiento son diferentes para las cuatro variantes
genotípicas: 25–30°C para el tipo RGNNV, 20–25°C para el tipo SJNNV, 20°C para el tipo
TPNNV, y 15–20°C para el tipo BFNNV (16, 17).
b) Control de la incubación
i)
Se sigue el curso de la infección en controles positivos y en otros cultivos celulares
inoculados mediante el examen microscópico diario durante 10 días.
ii)
En caso de que aparezca efecto citopático (ECP) en los mencionados cultivos celulares
inoculados con las diluciones de los sobrenadantes de homogeneizados ensayados, se
deben aplicar los procedimientos de identificación del betanodavirus (véase la sección 1.2
más adelante).
NOTA: El EPE en las células SSN-1 o E-11 se caracteriza por células finas o redondas,
refráctiles, granulares y con vacuolas, en cuyo caso las monocapas se desintegran parcial o
totalmente (7,16).
iii) Si no se produce ECP después de los 10 días de incubación se debe llevar a cabo el
subcultivo de los cultivos celulares inoculados.
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Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
c) Procedimientos de subcultivo
i)
Se recogen alícuotas de medio de cultivo celular a partir de todas las monocapas
inoculadas con homogeneizados de órganos.
ii)
Se inoculan las monocapas celulares tal como se describió en la sección 1.1.a.
iii) Se incuban y controlan tal como se describió en la sección 1.1.b.
1.2. Identificación del betanodavirus aislado en cultivo celular
a) Prueba de inmunofluorescencia indirecta
I
Se preparan monocapas celulares en dos pocillos de 2 cm2 en placas de microtitulación de
plástico o en cubres (o en portas con cámaras) a fin de lograr una confluencia en torno al
70%, lo que se consigue antes de 24 horas de incubación a 25ºC.
ii)
Se inocula la suspensión del virus que hay que identificar directamente en los pocillos o
frascos de cultivo celular.
iii) Se incuba a 20°C o 25°C durante 48–72 horas (véase la sección 1.1.a, Nota).
iv) Se retira el medio de cultivo, se aclara una vez con PBS y, a continuación, se fija con
metanol durante 10 minutos
v)
Se deja que las monocapas celulares se sequen al aire.
vi)
Se tratan las monocapas celulares con suero de conejo anti-betanodavirus durante
30 minutos a 37ºC en una cámara húmeda, y se aclara cuatro veces con PBS + Tween 80
(PBST).
vii) Se tratan las monocapas celulares durante 30 minutos a 37ºC con anticuerpo Ig anticonejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína que está disponible en el mercado, y
se aclara con PBST.
viii) Se examinan de inmediato en placas las monocapas celulares tratadas o se montan con
cubreobjetos utilizando solución salina con glicerol, pH 8.5, antes de su examen
microscópico.
b) Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
i)
Se extrae el ARN total de las células inyectadas con el virus utilizando un kit de extracción
de ARN disponible en el mercado y siguiendo las instrucciones del fabricante
Se ha publicado la existencia de varios cebadores para la amplificación de los
betadonavirus mediante RT-PCR. Están disponibles para todas las variantes genotípicas
los cebadores R3 (5’-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3’) y F2 (5’-CGT-GTCAGT-CAT-GTG-TCG-CT-3’), diseñados para amplificar la región T4 (427 bases) del gen
de la proteína de la cápsida de SJNNV (27).
2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PARA PECES CLÍNICAMENTE ENFERMOS
2.1. Detección directa en los tejidos celulares
a) Prueba de inmunofluorescencia indirecta
i)
Se deshidratan e incluyen en cera de parafina las muestras de peces previamente fijadas en
formalina tamponada al 10%. Se elimina la parafina de los cortes y se rehidratan con PBS.
ii)
Se tratan los cortes con tripsina al 0.1% en PBS a 37°C durante 30 minutos.
iii) Tras lavar con PBS fría, se procede del modo descrito en la sección 1.2.a, siguiendo los
pasos (vi–viii).
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Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
iv) Se observa la fluorescencia específica en el citoplasma de las células afectadas del cerebro,
la médula espinal o la retina.
b) Inmunohistoquímica (técnica de la avidina-biotina-fosfatasa alcalina) (12)
i)
Se preparan los cortes de parafina tal como se describió en la sección 2.1.a.
ii)
Se añade una solución de bloqueo, por ejemplo, 5% de seroalbúmina bovina (BSA) en
solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 20 minutos.
iii) Se incuba con suero de conejo anti-betanodavirus durante 30 minutes, y se lava con TBS.
iv) Se añade Ig biotinado anti-conejo de cabra durante 30 minutos y se lava con TBS.
v)
Se añade un complejo de fosfatasa alcalina y estreptavidina, se incuba durante 30 minutos
y se lava con TBS.
vi) Se añade un reactivo de cromógeno de fucsina, se deja 5 minutos y se aclara con agua
corriente.
vii) Se tiñe con hematoxilina para contraste.
viii) El resultado positivo aparece indicado por el color rojo.
c) Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
i)
Se homogeneiza la muestra de peces con agua destilada tratada con dietil pirocarbonato al
0,1 %.
ii)
Se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos.
iii) Se utilizará el sobrenadante según se describe en la sección 1.2.b.
2.2. Aislamiento del virus en cultivo celular
Véase la sección 1.1.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la encefalopatía y la retinopatía víricas (véase el
cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la
OIE: www.oie.int).
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