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NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista
del capítulo 1.2.3 del Código de animales acuáticos.
Este capítulo no ha sido actualizado desde 2003.
CAPÍTULO 2.1.6.
VIROSIS DEL BAGRE DE CANAL
RESUMEN
La virosis del bagre de canal (VBC) es causada por un herpesvirus denominado Herpesvirus Ictalúrido 1
por la Comisión Internacional de Taxonomía de Virus, pero el nombre comúnmente utilizado es el de
virus del bagre de canal (CCV). El CCV afecta al bagre de canal (Ictalurus punctatus) de los Estados
Unidos de América. Para una visión más detallada de sus características, véase Wolf (22) o Plumb (15).
La VBC es importante debido a las consecuencias de tipo clínico y económico para la crianza del bagre de
canal. La VBC provoca una gran mortalidad en las poblaciones de alevines y formas juveniles del bagre de
canal. Los peces afectados muestran ascitis, exoftalmos y hemorragia en las aletas y los músculos. Por lo
que atañe a los tejidos, el daño más llamativo se produce en los riñones, donde se da una amplia necrosis de
los túbulos y el tejido intersticial.
Los peces sobrevivientes a la VBC adquieren una fuerte inmunidad protectora junto con la síntesis de
anticuerpos contra el virus y la condición de portadores asintomáticos. Durante la fase de portador latente
del hospedador, el virus no se puede detectar por procedimientos tradicionales de cultivo o detección del
antígeno, ni siquiera cuando los adultos tienen inmunodepresión durante el desove.
Según los estudios antigénicos realizados con anticuerpos policlonales de conejo, los aislamientos de CCV
forman un grupo homogéneo. No obstante, el uso de anticuerpos monoclonales permite observar ciertos
cambios en los determinantes antigénicos entre distintos aislamientos (1). Durante los brotes naturales de
la enfermedad, se ha registrado cierta variación en la virulencia de las cepas de CCV y se ha demostrado
de forma experimental. Además, los datos moleculares indican cambios genéticos dentro de esta especie (7,
18).
Los reservorios de CCV son los peces con infección clínica y los portadores asintomáticos. El CCV
infeccioso se puede detectar en el agua de los tanques de peces infectados de forma experimental, pero no se
ha establecido la ruta de diseminación del virus. Los tejidos con mayor abundancia del virus en el
transcurso de la infección manifiesta son, en orden decreciente, el riñón posterior, la piel, las branquias, el
bazo y el intestino, (12, 13). La transmisión del CCV es horizontal y vertical. La transmisión
horizontal puede ser directa o vectorial, siendo el agua el principal vector abiótico. Se ha observado que el
virus se adsorbe con facilidad en los sedimentos del estanque (6), y la interacción con partículas de arcilla
suspendidas en el agua del estanque puede incidir en la transmisión horizontal. La transmisión del CCV
también puede estar causada por vectores animados y por objetos inanimados. Se cree que la transmisión
vertical es común pero se desconoce su mecanismo, ya que no se ha detectado el virus infeccioso ni en la piel
ni en los productos sexuales de los reproductores adultos. Después de producirse la VBC en una población
de peces, los sobrevivientes se convierten en portadores asintomáticos.
Se ha hallado que el bagre de canal y su pariente cercano, el bagre azul (Ictalurus furcatus), han sido los
únicos peces infectados por CCV, y que hay diferencias en la susceptibilidad al CCV dependiendo de la
variedad de pez. La edad del pez es un factor de extrema importancia para la infección patente. Aunque
los datos experimentales apuntan a que los peces mayores son susceptibles a los brotes naturales de la
virosis del bagre de canal (11), la enfermedad ocurre de forma casi exclusiva en los peces menores de 1 año
y, por lo general, en los que son menores de 4 meses. El factor medioambiental más importante es la
temperatura del agua. Hay una elevada tasa de mortalidad por encima de los 27°C, que disminuye de
forma abrupta o desaparece a menos de 18°C.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.6. — Virosis del bagre de canal
El diagnóstico de la VBC se basa en el aislamiento del virus en cultivo celular. Las pruebas confirmativas
son la identificación inmunológica por neutralización, la inmunofluorescencia, el enzimoinmunoensayo
(ELISA) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las técnicas rápidas de las pruebas de
inmunofluorescencia o el ELISA son adecuadas, sobre todo, para el diagnóstico en peces con infección
patente. Los métodos de cultivo o las pruebas basadas en antígenos son de poca utilidad para el examen de
portadores, ya que no se producen proteínas ni virus infeccioso. En su lugar, resultan más útiles la
detección de anticuerpos neutralizantes en una población de peces y, más recientemente, la PCR para
detectar ADN genómico de CCV.
Los métodos de control utilizados actualmente se basan en el mantenimiento de existencias poco densas y en
evitar el manejo estresante de los peces jóvenes durante los meses de verano. También se siguen medidas
prácticas de control e higiene durante la crianza del bagre. La incubación de los huevos y la cría de alevines
y juveniles en instalaciones separadas de las poblaciones de portadores son de crucial importancia para
prevenir la aparición de la VBC en un sitio de producción que está libre de CCV. Dado que el virus sólo
se detecta durante los brotes activos, la definición de la ausencia de infección por CCV se lleva a cabo en
gran medida utilizando datos históricos o identificando las poblaciones que son seronegativas al virus.
Recientemente, la utilización de la PCR y de sondas de hibridación para detectar ADN genómico de
CCV latente indica que el CCV está presente en muchas poblaciones que previamente no han padecido la
enfermedad (2, 5, 9, 21). La vacunación, aunque prometedora desde el punto de vista experimental (19,
20, 23, 24), no se aplica en este momento.
PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de la virosis del bagre de canal (VBC) generalmente se basa en el aislamiento del virus del
bagre de canal (CCV) en cultivo celular, seguido de su identificación inmunológica o basada en el ácido
nucleico (el enfoque convencional). Como alternativa, puede utilizarse la demostración inmunológica del
antígeno de CCV en tejidos de peces infectados. El enfoque convencional es el de utilización más común
porque el virus produce un rápido efecto citopático (ECP) en el cultivo celular y no existen en el mercado
proveedores de antisuero específico para CCV, y los antisueros contra CCV producidos por encargo a
menudo tienen una titulación baja o tienen reacción cruzada en tejido de peces.
Debido al escaso conocimiento de la serología de las infecciones víricas de los peces, la detección de
anticuerpos de peces contra los virus aún no está reconocida como un método de diagnóstico válido para
la evaluación del estatus infectivo de las poblaciones de peces. Sin embargo, resulta poco útil el uso del
cultivo directo o la detección del antígeno vírico para detectar los peces portadores. Por tanto, la
identificación de anticuerpos contra CCV tiene más valor como medio de analizar las poblaciones
portadoras (8, 14). Los títulos de anticuerpos de poblaciones portadoras varían según las estaciones; los
títulos más bajos se dan al final de invierno y al comienzo de la primavera (3). En un futuro próximo
podría plantearse la validación de algunas técnicas serológicas para el diagnóstico de ciertas infecciones
víricas de los peces, con lo que podría producirse una aceptación más amplia del uso de la serología de
peces para fines de diagnóstico.
El material de pez infectado adecuado para el examen virológico es:
• Peces clínicamente afectados: alevines enteros o juveniles pequeños (longitud del cuerpo ≤3 cm),
vísceras, incluido el riñón (3 cm ≤longitud corporal ≤6 cm) o, con peces de mayor tamaño, el riñón y
el bazo.
•
No existe una prueba definitiva para los peces asintomáticos (peces de apariencia sana): no son
posibles ni el cultivo celular ni la detección de antígeno de virus latente. Se ha detectado un
recrudecimiento de la infección latente en bagres de canal adultos tras el desove, (16) o durante los
meses de invierno o tras el tratamiento con dexametazona (4), pero estos métodos carecen de fiabilidad
suficiente par fines de inspección. La detección de ADN de virus latente puede llevarse a cabo
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con tejido de riñón, aleta o branquia (2, 5, 10).
Sin embargo, estas pruebas se han aplicado en peces infectados de forma experimental y no se han
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
aplicado a los sistemas de producción. Por tanto, no se ha documentado su utilización o fiabilidad para
la detección de CCV en poblaciones o para predecir el potencial de transmisión vertical.
Procedimientos de muestreo: véase el capítulo I.1, sección B.
1. MÉTODO ESTÁNDAR DE ANÁLISIS DE LA VBC
1.1. Aislamiento del CCV en cultivo celular
Línea celular que se ha de utilizar: CCO
a) Inoculación de monocapas
i)
Se prepara una dilución decimal adicional de 1/10 de sobrenadantes de homogeneizado
de órganos y se transfiere un volumen apropiado de cada una de las dos diluciones a
monocapas de células de 24 horas. Se inocula al menos 2 cm2 de monocapa celular con
100 µl de cada dilución.
ii)
Se deja que el virus se adsorba durante 0,5–1 hora a 25–30°C. Luego (sin retirar el
inóculo), se añade medio de cultivo celular tamponado a pH 7,6 y suplementado con
suero fetal bovino (SFB) al 10% (1 ml/pocillo para placas de cultivo celular de 24 pocillos
y escurridas), y se incuba a 25–30°C.
b) Control de la incubación
i)
Se sigue el curso de la infección en controles positivos y otros cultivos celulares
inoculados mediante el examen microscópico a 40–100 aumentos durante 10 días. Se
recomienda la utilización del microscopio de contraste de fases. El ECP es extenso y
progresa rápidamente en los cultivos procedentes de individuos claramente enfermos. El
ECP consiste en la formación y contracción de células fusionadas (sincitio) dejando que
los ejes citoplasmáticos irradien desde el sincitio a puntos de la superficie del frasco a la
que previamente se habían adherido las células.
ii)
Se mantiene el pH del medio de cultivo celular entre 7,3 y 7,6 durante la incubación. Esto
se logra mediante la adición al medio de cultivo celular inoculado de tampón bicarbonato
(para frasco de cultivo celular herméticamente cerrados o en un incubador de CO2), 2 M
de solución tamponada con Tris o usando 25 mM de medio tamponado con HEPES
(HEPES = ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfónico).
iii) Si aparece ECP en los cultivos de células inoculados con las diluciones de los
sobrenadantes de homogeneizado ensayados, se deben aplicar de inmediato los
procedimientos de identificación (véase la sección 1.2 más adelante).
Si se está implementando un programa de vigilancia/control de la salud de los peces, puede que se
hayan de tomar medidas para retirar el estatus sanitario aprobado de la unidad o zona de
producción (en caso de que hubiera sido aprobado con anterioridad) de los que procede la muestra
positiva de virus. La suspensión del estatus sanitario se mantendrá hasta que se demuestre que el
virus en cuestión no es el CCV.
iv) Si no se produce ECP en los cultivos inoculados (a pesar de la progresión normal del
ECP en los controles de virus), se deberán subcultivar los cultivos inoculados durante
otros 7 días. Si la muestra inoculada con controles de virus no produce ECP, se debe
repetir el proceso con células susceptibles frescas y nuevos lotes de muestras.
c) Procedimientos de subcultivo
i)
Se toman alícuotas del medio de cultivo celular de todas las monocapas inoculadas con
diluciones de cada sobrenadante de los homogeneizados de órganos.
ii)
Se inoculan las monocapas de células como se describió en la sección 1.1.a.
iii) Se incuban y observan como se describió en la sección 1.1.b.
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Capítulo 2.1.6. — Virosis del bagre de canal
iv) Se realiza un segundo (y último) paso de subcultivo si el primero persiste como negativo
al virus.
1.2. Identificación del CCV
a) Prueba de neutralización (Nota: durante el desarrollo de antisueros para el CCV, la mayoría de los
investigadores han hallado una respuesta débil de los anticuerpos de neutralización en conejos; a menudo
también ocurre una reacción cruzada con componentes celulares)
i)
Se recoge el medio de cultivo de las monocapas de células que exhiben ECP y se
centrifugan a 2.000 g durante 15 minutos a 4°C para retirar los desechos celulares.
ii)
Se diluye el medio que contiene el virus de 10–2 a 10–4.
iii) Se mezclan alícuotas (por ejemplo 200 µl) de la dilución del virus con volúmenes iguales
de una solución de anticuerpos específica para CCV, y se tratan de forma similar alícuotas
de cada dilución de virus con medio de cultivo celular.
(La solución de anticuerpos neutralizantes [NAb] debe tener un título de reducción del
50% de placas de al menos 2.000).
iv) De forma paralela, se deben realizar otras pruebas de neutralización contra:
v)
•
un virus homólogo (prueba de neutralización positiva)
•
un virus heterólogo (prueba de neutralización negativa).
Se incuban todas las mezclas a 25°C durante 1 hora.
vi) Se transfieren alícuotas de cada una de las muestras referidas anteriormente a monocapas
celulares (se inoculan dos cultivos celulares por dilución) y se deja que se realice la
adsorción durante 0,5–1 hora a 25°C; para ese fin son adecuadas placas de cultivo de 24 o
12 pocillos, usando 50 µl de inóculo.
vii) Cuando se haya completado la adsorción, se añade a cada pocillo el medio de cultivo
celular, suplementado con 2% de suero fetal bovino y tamponado a pH 7,3–7,6, y se
incuba a 25–30°C.
viii) Se comprueba si comienza el ECP en los cultivos celulares y se leen los resultados tan
pronto como aquél se produzca en los controles no neutralizados (las monocapas
celulares están protegidas en los controles de neutralización positivos). Se registran los
resultados ya sea después de un simple examen microscópico (preferiblemente mediante
contraste de fases) ya sea después de descartar el medio de cultivo celular y teñir las
monocapas celulares con una solución de 1% de cristal violeta en etanol al 20%.
ix) El virus de la prueba se identifica como CCV cuando se rechaza o retrasa notablemente el
ECP en los cultivos celulares que habían recibido la suspensión vírica tratada con
anticuerpo específico para CCV, mientras que el ECP es evidente en todos los demás
cultivos celulares.
x)
Cuando no se da neutralización mediante NAb para CCV, se realiza una prueba de
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) con la muestra sospechosa, un
enzimoinmunoensayo (ELISA) o un ensayo basado en ácido nucleico específico para
CCV.
b) Prueba de inmunofluorescencia indirecta
i)
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Se preparan monocapas de células en pocillos de 2 cm2 en placas de plástico para cultivo
celular o sobre cubres para obtener una confluencia de aproximadamente 80%, que
normalmente se consigue antes de transcurridas 4 horas de incubación a 30°C (se
siembran seis monocapas celulares por cada aislamiento del virus que hay que identificar,
más dos para los controles positivos y otras dos para los negativos).
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Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
ii)
Cuando las monocapas celulares están listas para la infección, i.e., el mismo día o el día
después de la siembra, se inoculan las suspensiones víricas a identificar realizando pasos
de diluciones decimales directamente en los pocillos o en recipientes de cultivo celular.
iii) Se diluye de forma similar la suspensión de CCV con el virus control, a fin de obtener un
título vírico de en torno a 5.000–10.000 unidades formadoras de placas (UFP) /ml en el
medio de cultivo celular.
iv) Se incuba a 25°C durante 18 horas.
v)
Se elimina, se lava una vez con 0,01 M de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2,
luego se lava brevemente tres veces con acetona fría (almacenada a –20°C) para los
cubres o con una mezcla de acetona al 30%/etanol al 70%, también a –20°C, para los
pocillos.
vi) Se deja fijar durante 15 minutos. Un volumen de 0,5 ml es apropiado para 2 cm2 de
monocapas celulares.
vii) Se deja que las monocapas de células se sequen al aire durante al menos 30 minutos y se
procesan de forma inmediata o se congelan a –20°C.
viii) Se prepara una solución de anticuerpo purificado o suero contra CCV en 0,01 M de PBS,
pH 7,2, que contenga 0,05% de Tween 80 (PBST), a la dilución apropiada (que se ha
establecido previamente; no existen proveedores comerciales de antisuero específico
contra CCV).
ix) Se rehidratan las monocapas celulares secas en cuatro pasos de lavado con la solución
PBST, y se retira completamente el tampón después del último lavado.
x)
Se tratan las monocapas celulares con la solución de anticuerpos durante 1 hora a 37°C
en una cámara húmeda. El volumen de la solución a utilizar es 0,25 ml/pocillo de 2 cm2.
xi) Se lava cuatro veces con PBST como antes.
xii) Se tratan las monocapas celulares durante 1 hora a 37°C con anticuerpo conjugado con
una solución de isotiocianato de fluoresceína (FITC) contra la inmunoglobulina usada en
la primera monocapa y preparada de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Estos
anticuerpos FITC son casi siempre de conejo o cabra.
xiii) Se lava cuatro veces con PBST.
xiv) Se examinan de inmediato en placas de plástico las monocapas celulares tratadas, o se
montan los cubres usando solución salina con glicerol a pH 8,5 antes de la observación
microscópica.
xv) Se examinan con luz UV incidente utilizando un microscopio con lente ocular de ×10 y
lente objetivo de ×20–40 que tenga una apertura numérica alta. Debe conseguirse que los
controles positivo y negativo muestren los resultados esperados antes de ninguna otra
observación.
c) Enzimoinmunoensayo
i)
Se recubren los pocillos de las microplacas para pruebas ELISA con diluciones adecuadas
de inmunoglobulina (Ig) purificada o suero específico para CCV, en 0,01 M de PBS,
pH 7,2 (200 µl/pocillo). La Ig puede ser policlonal o monoclonal y procede casi siempre
de conejo o de ratón, respectivamente.
ii)
Se incuba toda la noche a 4°C.
iii) Se lava cuatro veces con 0,01 M de PBS que contenga 0,05% de Tween 20 (PBST).
iv) Se bloquea con leche desnatada (5% en PBST) u otra solución bloqueadora durante
1 hora a 37°C (200 µl/pocillo).
v)
Se lava cuatro veces con PBST.
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Capítulo 2.1.6. — Virosis del bagre de canal
vi) Se añade 2% de Tritón X-100 a la suspensión vírica a identificar.
vii) Se distribuyen 100 µl/pocillo de una dilución en dos o cuatro pasos del virus a identificar
y del virus control de CCV, y se deja que reaccione con el anticuerpo recubierto contra el
CCV durante 1 hora a 20°C.
viii) Se lava cuatro veces con PBST.
ix) Se añade a los pocillos el anticuerpo policlonal biotinado contra el CCV.
x)
Se incuba durante 1 hora a 37°C.
xi) Se lava 4 veces con PBST.
xii) Se añade peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina a los pocillos que han
recibido el anticuerpo conjugado con biotina, y se incuba 1 hora a 20°C.
xiii) Se lava cuatro veces con PBST.
xiv) Se añaden el sustrato y el cromógeno. Se suspende la prueba cuando reaccionan los
controles positivos, y se observan los resultados.
d) Reacción en cadena de la polimerasa
Se ha publicado sobre varios ensayos PCR para el CCV (2, 5, 10). Tal como se afirmó en el
capítulo I.1, sección C.3.5, la PCR es muy susceptible a los resultados positivos falsos y a los
negativos falsos. Por tanto, cada prueba y extracción de tejidos deberían incluir un control
negativo para descartar una posible contaminación. El establecimiento de la reacción de la
PCR debería llevarse a cabo en un lugar distinto del utilizado para la evaluación de los
productos de la PCR. La PCR es un método útil para la identificación del virus después de su
aislamiento en cultivo. El siguiente método es una modificación del de Boyle & Blackwell (5) y
en él se utiliza como control interno una diana modificada (12). La secuencia 5’–3’ del cebador
superior es TCA-TCC-GAA-TCC-GAC-AAC-TGA y la del cebador inferior es CCA-AGATCG-CGG-AGA-AAC. Para minimizar la posibilidad de contaminación, todas las
preparaciones de muestras y de la reacción se deben hacer con las puntas de las pipetas para
prevenir aerosoles.
• Preparación de la muestra
i)
Se recoge 1–0,5 ml del sobrenadante del cultivo celular de los pocillos afectados en un
tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
ii)
Se centrifuga a la máxima velocidad en una microfuga (18.000–20.000 g) durante
30 minutos.
iii) Se descarta el sobrenadante y se resuspende el precipitado en 10 µl de tampón de
proteinasa K (50 mM de KCl, 15 mM de Tris-HCl pH 8,3 y 0,5% de Nonidet P-40) que
contenga 0,5 mg/ml de proteinasa K y se incuba a 55°C durante 1 hora.
iv) Se inactiva la proteinasa K por calentamiento a 95°C durante 10 minutos. Se centrifuga a
velocidad máxima durante 10 segundos. Se usan 3 µl en la reacción por PCR.
Pueden usarse otros métodos para la extracción de ADN.
• Preparación de la PCR
La mezcla base debe hacerse en un lugar separado de las zonas en las que se preparan las
muestras de diagnóstico y se analiza el producto de la PCR.
i)
178
Se prepara la mezcla base. Se prepara al menos una alícuota extra para por cada
10 reacciones planificadas. Se incluirá un control positivo y otro negativo (agua) por cada
10 muestras.
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Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
Para cada muestra:
ii)
agua destilada
10× tampón
Cebador superior (50 pmoles/µl)
Cebador inferior (50 pmoles/µl)
dNTPs (2,5 mM cada uno)
25 mM de MgSO4
Control interno (0.025 pg/µl)
Polimerasa Taq (5 U/µl)
33,6 µl
5,0 µl
0,4 µl
0,4 µl
2,0 µl
5,0 µl
0,3 µl
0,3 µl
Se añaden 47 µl por cada tubo de reacción.
iii) Se añaden 3 µl de muestra o agua (control negativo).
iv) Si se utiliza un termociclador sin cubierta caliente, se añaden 50 µl de aceite mineral.
v)
Se pone en marcha la reacción. Se utilizan ciclos de 93°C durante 30 segundos, 60°C
durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos.
vi) Se someten a electroforesis 10 µl del producto en gel de poliacrilamida al 10% con una
escalera de 100 pb. Se tiñe el gel con bromuro de etidio. Se observa y fotografía con
transiluminación UV (17).
• Evaluación de los resultados
El control interno da por resultado un producto de 149 pb. El CCV produce un producto de
136 pb. Es de esperar una banda de 149 pb dentro del control negativo y en las muestras
negativas. Es de esperar un producto de 136 pb y un producto de 149 pb en las muestras
positivas a CCV. Si el CCV está presente en cantidad considerable, puede que no aparezca la
banda de 149 pb. Si no hay bandas, quiere decir que no se produjo la reacción de la PCR lo
que indica un fallo de uno de los componentes de la PCR o la presencia de un inhibidor en la
muestra. Si el segundo control muestra un producto de 136 pb, quiere decir que ha habido un
contaminante en la preparación de la PCR, y la prueba debe repetirse. Si se produce una banda
de tamaño aberrante o si se desea confirmar que el producto de la PCR procede del CCV, se
puede repetir la PCR sin utilizar un estándar interno y se puede secuenciar directamente el
producto. Luego se puede evaluar la secuenciación utilizando BLAST en la página Web del
Centro Nacional para la Información Biológica (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
para identificar las secuencias con una homología elevada. La PCR amplifica la región entre
107827 y 107962 del genoma del CCV (acceso M75136 a GenBank) que representa una
porción del marco de lectura abierto 73 dentro del ORF (9). Se debe esperar una identidad de
al menos el 95% para esta secuencia.
TCA-TCC-GAA-TCC-GAC-AAC-TGA-CGC-GTC-GGT-AGC-CCG-ACC-GAT-CCGTAT-GTT-ACG-GGT-GCG-GGG-GTC-GAC-ACC-GTG-CTC-GCC-GCG-ATG-AGG-CTGACC-GCG-GAC-ACG-GGG-GGT-CCC-CCT-CGT-TTC-TCC-GCG-ATC-TTG-G
Figura 1. Secuencia del producto de la PCR para CCV.
Los segmentos que aparecen en cursiva y subrayados indican secuencias de cebadores.
2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CCV
2.1. Aislamiento del virus e identificación subsiguiente
Como en la sección 1.1 y 1.2.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.6. — Virosis del bagre de canal
2.2. Prueba de inmunofluorescencia indirecta
• Procedimiento de la prueba
i)
Se sangra el pez completamente.
ii)
Se hacen impronta de riñón en portas de vidrio limpias o en el fondo de los pocillos de
una placa de cultivo celular
iii) Se almacenan los trozos de riñón (como se indicó en la sección B.3.1 del capítulo I.1)
junto con los órganos necesarios para el aislamiento del virus en caso de que el mismo se
requiera con posterioridad.
iv) Se deja secar el frotis al aire durante 20 minutos.
v)
Se fija con acetona o etanol/acetona y se seca como se indicó en la sección 1.2.b, pasos
(v–vii).
vi) Se rehidratan las preparaciones anteriores (véase la sección 1.2.b, paso [ix]) y se bloquea
con 5% de leche desnatada o 1% de albúmina de suero bovino, en PBST durante
30 minutos a 37°C.
vii) Se lava cuatro veces con PBST.
viii) Se tratan los frotis con la solución de anticuerpo contra CCV y se lava como se indicó en
la sección 1.2.b.
ix) Se bloquea y se lava como en los pasos (vi) y (vii).
x)
Se revela la reacción con anticuerpo específico conveniente conjugado con FITC, se lava
y se observa tal como se indicó en la sección 1.2.b, pasos (xii–xv).
Si la prueba resulta negativa, se procesan las muestras de órganos almacenadas a 4°C para el
aislamiento del virus en cultivo celular tal como se describió en la sección 1.1.
2.3. Enzimoinmunoensayo
a) Procesamiento de las microplacas
Como se describió en la sección 1.2.c de este capítulo hasta el paso (iv) (inclusive).
b) Procedimiento de muestreo
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1.:
B.1. para la selección de los ejemplares de peces
B.2. para la selección de los materiales de muestra.
c) Procesamiento de las muestras de órganos
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1:
B.3.1. para el transporte
B.3.2. para la extracción de virus y para la obtención de los homogeneizados de órganos.
d) Procedimiento de la prueba del enzimoinmunoensayo
i)
Se separa una alícuota de 1/4 de cada homogeneizado por si se precisa un aislamiento
adicional de virus en medio de cultivo.
ii)
Se trata el resto del homogeneizado con 2% de Tritón X-100 como se describió en la
sección 1.2.c, paso (v), y 2 mM de cloruro de fenil metil sulfónico; se mezcla suavemente.
Se completan los demás pasos del procedimiento descrito en la sección 1.2.c.
Si la prueba es negativa, se procesan las muestras de órganos guardadas a 4°C para el
aislamiento del virus en cultivo celular como se describió en la sección 1.1.
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Capítulo 2.1.7. — Encefalopatía y retinopatía víricas
2.4. Reacción en cadena de la polimerasa
Tal como se afirmó en el capítulo I.1. sección C.3.5, la PCR es muy susceptible a los resultados
positivos falsos y negativos falsos. Por lo tanto, cada prueba y extracción de tejido deben incluir
un control negativo para descartar cualquier contaminación. La preparación de la reacción de la
PCR debe llevarse a cabo en un lugar distinto al utilizado para la evaluación de los productos de la
PCR. De esta forma, no se recomienda la utilización de los protocolos de la PCR anidada para
fines de inspección. La prueba PCR aludida en la sección 1.2.d puede modificarse para la
detección directa de CCV en peces claramente infectados. Esto se lleva a cabo centrifugando
1,5 ml de una dilución 1/10 del homogeneizado a 8.000 g durante 5 minutos. A continuación se
usa el sobrenadante de la misma forma que se describe en la sección 1.2.d para el sobrenadante
del cultivo celular. Si se utiliza esta prueba para detectar peces portadores, el ADN se debe
purificar a partir del tejido (utilizando un kit disponible en el mercado, como, por ejemplo, el kit
de aislamiento de ADN “Puregene”, Gentra Systems, Minneapolis Minnesota, USA). Para
incrementar el límite hasta en la medida necesaria para detectar el estado de portador, se usa
0,5 µg de ADN, se prescinde del ADN de control interno, y se utilizan 35–40 ciclos. Para la
realización de la PCR con extractos de tejidos, se recomienda utilizar una muestra paralela que
haya sido ajustada (secuenciada) con ADN de CCV purificado y diluido o con un fragmento diana
clonado (como el estándar interno utilizado anteriormente) como control positivo para descartar
la presencia de inhibidores que produzcan resultados negativos falsos.
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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la virosis del bagre de canal (véase el cuadro al
final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE:
www.oie.int).
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006