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CAPÍTULO 2.1.17
ENFERMEDAD DEL HERPESVIRUS KOI
1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD
La enfermedad del herpesvirus koi (EHVK) consiste en la infección por un herpesvirus (17) capaz de
inducir una viremia grave y contagiosa en la carpa común (Cyprinus carpio) y en otras variedades como
la carpa koy y la carpa fantasma (15).
2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA
a)
Factores del agente
El agente etiológico es el herpesvirus koi (KHV) de la familia Herpesviridae (17, 40) que también
ha recibido las denominaciones de virus de la nefritis intersticial y virus de la necrosis de las
branquias (CNGV) (19, 28). Waltzek et al. (39) aportaron pruebas que sirven para clasificar el
virus como un herpesvirus, y lo denominaron herpesvirus ciprínido 3 (CyHV-3) en congruencia
con la nomenclatura de otros herpesvirus ciprínidos: CyHV-1 (virus de la viruela de la carpa,
papiloma de los peces) y CyHV-2 (virus de la necrosis hematopoyética del pez rojo). Las
estimaciones del tamaño del genoma KHV oscilan entre 150 kpb (11) y los 277 kpb (19) hasta los
295 kpb (39). Se han identificado cuatro genes que codifican la helicasa, una proteína tríplex
intercapsomérica, polimerasa ADN, y proteína principal de la cápsida, y el análisis de secuencias
de esos genes ha servido para demostrar que el KHV está estrechamente relacionado con el
CyHV-1 y el CyHV-2, y tiene una relación lejana con el virus del bagre de canal (Ictalurid herpesvirus
1: IcHV-1) (39). También existen diversas estimaciones del tamaño de los viriones. La medición
de las nucleocápsidas de virus con marcaje negativo dan 103–112 nm de diámetro rodeado por
una envoltura (17, 19, 37). Las nucleocápsidas de virus finamente seccionados tienen un diámetro
de 80–110 y 110–120 nm (4, 17, 26).
Se ha demostrado que el suero de carpa con anticuerpos contra el KHV produce reacción cruzada
con CyHV-1, lo que constituye un indicio adicional de la estrecha relación existente entre estos
virus. Se ha demostrado la reacción cruzada de anticuerpos mediante enzimoinmunoensayo y
pruebas de inmunoelectrotransferencia con sueros procedente de koi infectado con CyHV-1 o
KHV (1).
Las comparaciones de genomas de aislados de KHV procedentes de diversas zonas geográficas
mediante análisis de enzimas de restricción (9, 15) o mediante análisis de secuencias de
nucleótidos (13, 20, 29) han mostrado que aquellos son prácticamente idénticos. De igual forma,
los polipéptidos de aislados de KHV procedentes de diferentes zonas geográficas han resultado
ser similares, aunque un aislado de Israel contenía dos polipéptidos adicionales (7, 9).
El virus se inactiva por radiación UV y exposición a temperaturas superiores a los 50°C durante
1 minuto. También se inactivan con los siguientes desinfectantes: yodóforo a 200 mg/litro
durante 20 minutos, cloruro de benzalconio a 60 mg/litro durante 20 minutos, alcohol etílico al
30% durante 20 minutos e hipoclorito sódico a 200 mg/litro durante 30 segundos, todos ellos a
15°C (21).
b)
Factores relacionados con el hospedador
Se han registrado infecciones naturales por KHV sólo en la capa común (Cyprinus carpio carpio), la
carpa koy y la carpa fantasma (Cyprinus carpio goi) y en híbridos de esas variedades. Parece que los
peces son susceptibles al KHVD a cualquier edad (4, 29, 36), pero en condiciones experimentales,
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Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi
los peces de 2,5–6 g son más susceptibles que los de 230 g (26). Se ha demostrado una resistencia
variable al KHVD entre diversos tipos de carpa común (32) y otros estudios sugieren que la
resistencia depende de la edad (26). La morbilidad de las poblaciones afectadas puede ser del
100%, y la mortalidad, del 70–80% (4, 38), pero ésta puede llegar al 90 o 100% (4, 37).
Las carpas se cultivan a menudo en policultivos con otras especies de peces, pero no se han
observado signos de la enfermedad en esas especies durante los brotes de EHVK, en condiciones
normales de policultivo. Entre las especies reacias se encuentran el pez rojo (Carassius auratus), el
amur (Ctenopharyngodon idellus), la carpa plateada (Hypophthalmichthys molitrix), la tenca (Tinca
tinca), el esturión (Acipenser sp.) la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), la perca plateada (Bidyanus
bidyanus) y el bagre de canal (Ictalurus punctatus) (4, 17, 26, 35).
La enfermedad depende de la temperatura, y ocurre entre los 16–25°C (6, 17, 26, 29, 36, 37). En
condiciones experimentales, la enfermedad ha causado una gran mortalidad a 28°C (10) pero no a
29 o 30°C (19, 25), ni a 13°C (10). Sin embargo, se detectó AND vírico en los peces mediante
PCR a 13°C, y es posible que los peces infectados que sobreviven a bajas temperaturas
constituyan reservorios del virus (10). El desarrollo de la enfermedad puede ser rápido. La misma
se manifestará en 3 días si añadimos peces sanos a un estanque que contiene peces infectados
(38), pero lo normal es que transcurran 8–21 días hasta que la enfermedad pueda observarse en
los peces que estaban sanos (4, 17). No se sabe si en condiciones normales los supervivientes de la
EHVK son infectados de forma persistente por el virus, y, en caso afirmativo, durante cuánto
tiempo los peces retienen el virus. Se han investigado algunos de estos aspectos con peces
infectados de forma experimental, hallándose que el virus podía persistir en la carpa infectada a
una temperatura soportable y después podía mantenerse a temperaturas inferiores a la soportable
(33).
Las variedades de carpa común (Cyprinus carpio) constituyen en la actualidad el único hospedador
de la EHVK y, por tanto, se las considera como las más susceptibles a la infección por KHV. Se
ha publicado que los híbridos de pez rojo y carpa común, producidos por hibridación de pez rojo
macho y carpa hembra, muestran cierta susceptibilidad a la infección por KHV.
Aproximadamente el 50% de estos híbridos examinados a los 25 días de administrarles una
inyección intraperitoneal con una dosis alta de KHV poseían ADN genómico vírico, lo que se
detectó mediante PCR (18). En contraste con los descubrimientos realizados en otros lugares,
datos experimentales procedentes de Alemania sugieren que el pez rojo y el amur son susceptibles
al KHV, pero es precisa una confirmación adicional de estos hallazgos (14, 18). Al realizar
muestreos durante los programas de vigilancia del KHV, se debería seleccionar de forma
preferente la carpa común o variedades como la carpa koi o la carpa fantasma (koi × común) y a
continuación cualesquiera híbridos de carpa común presentes en el lugar, como el híbrido pez
rojo × carpa común. Por lo general, se mezclan especies de ciprínidos en sistemas de policultivo y
existe un gran riesgo de transmisión del virus entre las diferentes especies durante los brotes de la
enfermedad. Si se confirman los hallazgos de Alemania, a efectos de vigilancia, debería
considerarse a todas las especies de ciprínidos como portadoras encubiertas potenciales de KHV.
Los reservorios de la EHVK son los peces con infección clínica y los portadores encubiertos de
virus entre los peces cultivados, asilvestrados o silvestres. Los virus virulentos se diseminan por
las heces, la orina, las branquias y el moco de la piel. Sin embargo, la branquia, el riñón y el bazo
son los órganos con mayor cantidad de virus durante el curso de la infección patente. (10).
La forma de transmisión del KHV es horizontal pero no se puede descartar la transmisión
asociada a los huevos (normalmente llamada transmisión “vertical”). La transmisión horizontal
puede ser directa (de unos peces a otros) o vectorial, siendo el agua el mayor vector abiótico. Sin
embargo, los vectores animados (ej. los parásitos invertebrados y los pájaros y mamíferos
piscívoros) y los fomites también pueden estar implicados en la transmisión.
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c)
Patrón de la enfermedad
Los patrones de la enfermedad dependen de la temperatura del agua, la virulencia del virus, la
edad y estado del pez, la densidad de la población y los factores estresantes. También es un factor
importante el estado inmunológico del pez, y la inmunidad inespecífica (interferón) y específica
(los anticuerpos del suero, inmunidad celular) desempeñan un papel importante en las infecciones
por herpesvirus. La enfermedad clínica prevalece a temperaturas superiores a los 18°C cuando la
respuesta del hospedador inmune es la óptima. La carpa infectada produce anticuerpos contra el
virus que se han detectado mediante pruebas ELISA con dilución alta de suero. Se han detectado
anticuerpos en el suero 3 semanas después de la infección experimental y en supervivientes un
año después de la infección natural (1, 28, 33). En las carpas enfermas se observan con frecuencia
infecciones concurrentes secundarias por bacterias y/o parásitos que pueden incidir en la
mortalidad y el despliegue de signos de la enfermedad (15).
Tras las primeras descripciones de la EHVK en Israel y Alemania (4, 16, 26), se ha ampliado el
ámbito geográfico de la enfermedad. Ésta se ha extendido por países de todo el mundo, debido en
primer lugar a la comercialización de la carpa koy antes de que se tuviera un mayor conocimiento
de la enfermedad y de los medios para detectarla. Hoy día se sabe que ocurre o se ha descubierto
en peces importado por al menos 21 países. En esa cifra están incluidos los siguientes países
europeos: Austria, Bélgica, Dinamarca, Francia, Italia, Luxemburgo, Holanda, Polonia, Suiza y el
Reino Unido (3, 6, 15, 30). En Asia, China (Hong Kong) (15), Indonesia (34, 35), Japón (29),
Malasia (15, 22, 23), Singapur (en peces importados de Malasia), Taipei China (37) y Tailandia (en
peces importados a Alemania (15)). También en Sudáfrica (15) y los EE.UU. de América (11, 16,
36) se ha descrito la existencia de la EHVK. Es probable que el virus exista en muchos otros
países, pero aún no se ha identificado o descrito.
d)
Control y prevención
Los métodos de control de la EHVK consisten sobre todo en evitar la exposición al virus junto
con una buena higiene y prácticas de bioseguridad. Eso es factible en pequeños criaderos cuyas
aguas proceden de manantial o de pozos y que cuentan con un sistema de seguridad que impide la
entrada de peces al criadero por los desagües. Entre las medidas de bioseguridad está la de
asegurarse de que los peces introducidos proceden de sitios libres de la enfermedad y un sistema
de cuarentena por el que los peces nuevos se mantienen junto con peces testigo a temperaturas
adecuadas para la EHVK. A continuación se mantiene a los peces en cuarentena durante un
período mínimo de entre 4 semanas y 2 meses antes de transferirlos al sitio principal junto con los
peces no infectados. Las medidas de higiene a aplicar en el sitio son similares a las recomendadas
para la viremia primaveral de la carpa (VPC), e incluyen la desinfección de los huevos mediante
tratamiento con yodóforos (21), la desinfección regular de los estanques, la desinfección química
del equipamiento del criadero, la manipulación cuidadosa de los peces para evitarles estrés y la
eliminación de los peces enfermos en condiciones de seguridad.
En las instalaciones de crianza que cuentan con un entorno controlado, la subida de la
temperatura del agua por encima de los 26–28°C puede reducir la mortalidad durante los brotes
de EHVK (7, 28). La disminución de la densidad de existencias y el tratamiento de las infecciones
secundarias también contribuyen a atenuar la gravedad de la enfermedad (35) En la actualidad no
se dispone de una vacuna segura y efectiva de fácil acceso. Sin embargo, se ha usado virus
atenuado para vacunar carpas y proteger a los peces de la amenaza del virus (25, 28). La vacuna
utilizada provoca la aparición de anticuerpos contra el virus, pero se desconoce la duración de la
protección. Esa vacuna está autorizada en Israel y se ha utilizado de forma amplia en los criaderos
del país.
3.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Puede obtenerse el diagnóstico de EHVK para peces clínicamente infectados mediante aislamiento del
virus. Sin embargo, el virus se aísla en tan sólo un pequeño número de líneas celulares, pero el manejo
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Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi
de dichas líneas puede resultar difícil. Además, el aislamiento en cultivo celular no es tan sensible como
los métodos basados en la PCR, cuya utilización para detectar el ADN del KHV ha sido descrita (15).
Los métodos de inmunodiagnóstico, similares a los utilizados para el diagnóstico de la viremia
primaveral de la carpa (ej. las pruebas de inmunofluorescencia [IF] o las pruebas ELISA), pueden ser
adecuados para la identificación y el diagnóstico rápidos de la EHVK, pero no se han descrito,
comparado ni validado de forma exhaustiva. En tanto no se disponga de pruebas validadas, el
diagnóstico de la EHVK no debe basarse en una sola prueba sino en una combinación de dos o tres
(15).
La infección por KHV produce una respuesta de anticuerpos detectable en la carpa, y se ha publicado
sobre enzimoinmunoensayos que sirven para detectar de forma fiable esos anticuerpos (1, 28). Se
pueden utilizar tales métodos como pruebas rápidas presuntivas durante la fase aguda de la
enfermedad; sin embargo, varios parámetros, como la especificidad y sensibilidad de los anticuerpos y
la preparación de la muestra, pueden influir en los resultados y, como consecuencia, se debería
ponderar con cautela un resultado negativo.
La detección de anticuerpos puede ser un buen método para establecer la exposición previa al KHV en
peces de apariencia sana, y hasta que no se elaboren métodos basados en la PCR que sean capaces de
detectar de forma fiable el virus persistente en peces expuestos, las pruebas con anticuerpos pueden
constituir las únicas herramientas de vigilancia disponibles. No obstante, debido al insuficiente
conocimiento que se tiene de las respuestas serológicas de los peces a las infecciones víricas, la
detección de anticuerpos de los peces contra los virus no se ha aceptado hasta el momento como
método rutinario de análisis para determinar el estado vírico de las poblaciones de peces. En un
próximo futuro podría realizarse la validación de ciertas técnicas serológicas para algunas infecciones
víricas de los peces, propiciando que el uso de la serología con peces sea ampliamente aceptado para
análisis sanitarios.
El material de peces adecuado para el examen virológico es:
•
Peces asintomáticos (peces de apariencia sana): branquia, riñón, bazo, y encéfalo (peces de
cualquier tamaño).
•
Peces clínicamente infectados: branquia, riñón, bazo, intestino y encéfalo (peces de cualquier
tamaño).
a)
Métodos de diagnóstico de campo
Durante el brote de EHVK se producirá un notable incremento de la mortalidad en la población.
Todos los grupos de edad de los peces parecen ser susceptibles a la EHVK, aunque, por lo
general, los peces más jóvenes de hasta un año de edad son más susceptibles a la enfermedad
clínica. Los peces se tornan letárgicos, se separan del banco, se reúnen en la entrada de agua o en
las orillas del estanque y boquean en la superficie del agua. Algunos peces pueden sufrir pérdida
del equilibrio y desorientación, pero también pueden mostrar signos de hiperactividad. Al
examinar de cerca a los peces, los signos clínicos que se observan son decoloración, palidez o
enrojecimiento de la piel, que puede adquirir un aspecto rugoso, pérdida focal o total de la
epidermis, y sobre- o infraproducción de moco en la piel y las branquias. Otras lesiones
macroscópicas son enoftalmía (ojos hundidos), hemorragias en la piel y en la base de las aletas y
erosión de las aletas.
b)
Métodos clínicos
No existen lesiones macroscópicas patognomónicas. El diagnóstico final se producirá tras la
detección directa de ADN o antígeno vírico en tejidos o el aislamiento e identificación del virus.
Sin embargo, la patología general más consistente se observa en las branquias, y ésta puede variar
desde placas necróticas de color pálido hasta una decoloración amplia, necrosis grave e
inflamación. Un examen adicional puede revelar erosión de las laminillas primarias, fusión de las
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laminillas secundarias e hinchazón en los extremos de las laminillas primarias y secundarias. La
presencia de otras lesiones internas es variable y a menudo no se presentan en casos de mortalidad
repentina. Se han descrito otras lesiones macroscópicas, como adherencias en la cavidad
abdominal con o sin coloración anormal de órganos internos (más claros o más oscuros). El riñón
y el hígado pueden aumentar de tamaño e incluso pueden mostrar hemorragias focales o
petequiales.
La presencia de lesiones macroscópicas puede complicarse por el hecho de que los peces
enfermos, sobre todo la carpa común, estén infestados por ectoparásitos como Argulus sp.,
Chilodonella sp., Cryptobia sp., Dactylogyrus sp., Gyrodactylus sp., Ichthyobodo sp., Ichtyophthirius sp.,
Trichodina sp. y monogéneos de las branquias, así como numerosas especies de bacterias.
La histopatología de la enfermedad puede ser inespecífica y variable, pero la inflamación y
necrosis de los tejidos branquiales son una constante. Las branquias también exhiben hiperplasia e
hipertrofia del epitelio branquial y pueden observarse la fusión de las laminillas secundarias y la
adhesión de filamentos branquiales. Se observa una necrosis, que produce desde pequeñas zonas
de células epiteliales necróticas de las laminillas secundarias hasta la pérdida total de las laminillas.
Las células epiteliales y leucocitos de las branquias pueden presentar una hinchazón nuclear
destacada, marginación de la cromatina en forma de “anillo de sello”, y se han observado
inclusiones intranucleares eosinófilas y difusas de color pálido. Se han observado inflamación,
necrosis e inclusiones nucleares (separadas o juntas) en otros órganos, sobre todo en el riñón,
pero también en el bazo, páncreas, hígado, cerebro, intestinos y epitelio oral.
c)
Métodos de detección e identificación del agente
No presentaremos métodos en detalle porque no es abundante la comparación y validación de los
métodos de detección e identificación del KHV. No obstante, se ofrece una breve descripción de
los métodos sobre los que se ha publicado y están disponibles. La recomendación de los métodos
habrá de basarse en el ensayo y validación adicionales y en la obtención de más datos de los
laboratorios que han elaborado los métodos antes de decidir si son “aptos para el fin perseguido”.
•
Métodos de detección directa
i) Aislamiento de KHV en cultivo celular
Puede aislarse el virus en un pequeño número de cultivos celulares, pero el aislamiento en
cultivo celular no es tan sensible como la PCR y no se le considera fiable como método de
diagnóstico de la EHVK (15).
El virus se replica en células de aleta de koi (KF-1) (17), aleta de carpa (CaF-2) y células de
cerebro de carpa (CCB) (24), y células de aleta de carpa común o koy (19, 26, 28). Otras
líneas celulares utilizadas de forma rutinaria para el aislamiento de virus patógenos de los
peces como las células EPC, FHM, BF-2, CHSE-214 y RTG-2 son refractarias al virus (4,
19, 24, 37). El virus abunda sobre todo en los tejidos de branquia, riñón y bazo durante el
curso de la infección patente (10) y se recomienda tomar muestras de estos tejidos para el
aislamiento del virus. La temperatura óptima de incubación para el aislamiento del virus en
células KF-1 o CCB es 20°C pero puede necesitarse una incubación de 8–12 días antes de
que se observe el efecto citopático (ECP) (7).
ii) Identificación del virus aislado en cultivo celular
Deben identificarse de forma definitiva los virus aislados en cultivo celular, ya que se han
aislado diversos virus en carpas que mostraban signos clínicos semejantes a los de la
EHVK (5, 15).
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Métodos de identificación presuntiva rápida
Los métodos de inmunodiagnóstico, similares a los utilizados para la identificación
presuntiva del SVC (ej. pruebas IF o ELISA), pueden resultar adecuados para una
identificación y diagnóstico rápidos de la EHVK (27, 32).
Métodos de identificación confirmativa
El método más fiable para la identificación confirmativa es la PCR, o una de sus variantes,
que también se ha utilizado para identificar ADN de KHV en tejidos de peces (2, 8–11, 13,
19, 20, 27, 40).
Se ha informado de que una PCR basada en el gen timidina kinasa (TK) de KHV resultó
ser más sensible que los métodos PCR descritos por Gilad et al. (9) y Gray et al. (11), y
puede detectar 10 fg de ADN KHV (2); la PCR de Ishioka et al. (20), basada en el gen de
ADN polimerasa, detectó 100 fg de ADN de KHV. El método de la amplificación
isotérmica mediada por lazos (LAMP) (13) también se basó en el gen TK de KHV, y
resultó tan sensible como el método de la PCR elaborado por los mismos autores, pero fue
más rápido que la PCR. La PCR descrita por Gray et al. (11) fue perfeccionada por Yuasa et
al. (40), y ha sido incluida en las directrices oficiales japonesas para la detección del KHV.
Es de esperar que se sigan perfeccionando las pruebas PCR de diagnóstico y se sigan
validando según las recomendaciones del capítulo 1.1.3 de este Manual de animales acuáticos.
Los protocolos de extracción de ADN y de aplicación de la PCR que se detallan a
continuación para la detección directa del KHV en tejidos de peces También son
adecuados para la identificación confirmativa de sobrenadantes de cultivos celulares
infectados.
iii) Métodos de diagnóstico para peces con enfermedad clínica
Detección directa en tejidos de peces imprints
Se ha identificado el KHV en los frotis obtenidos por improntas del hígado, riñón y
cerebro de peces infectados mediante IF. Se observaron niveles muy altos de
inmunofluorescencia positiva en el riñón y se pudo detectar el virus en un frotis de riñón
1 día después de la infección (27, 32). También se ha detectado antígeno vírico en tejidos
infectados mediante un método de tinción con inmunoperoxidasa. El antígeno vírico se
detectó en el riñón antes de 2 días después de la infección, y también se observó en las
branquias y el hígado (27). No obstante la detección del KHV por inmunotinción debe
interpretarse con precaución, ya que la tinción positiva de las células podría ser debida a la
reacción cruzada con virus serológicamente relacionados (ej. CyHV-1) o una proteína novírica (27).
En varios laboratorios de todo el mundo se están elaborando métodos ELISA para la
detección directa del antígeno de KHV en tejidos infectados pero aún no se ha publicado
sobre ninguno.
Los métodos más comúnmente utilizados para la detección directa de KHV en tejidos de
peces son los ensayos PCR específicos para KHV (véase más arriba el apartado sobre
identificación confirmativa).
En estudios realizados en el laboratorio Cefas Weymouth, se compararon conjuntos de
cebadores publicados utilizando un protocolo de PCR estándar para la detección de ADN
de KHV en tejidos de carpa (K. Way, datos no publicados). El conjunto de cebadores
orientados al gen TK (2) fue el más sensible con un límite de detección tres log mayor que
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Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi
los cebadores de Gilad. Los cebadores CNGV (27) y los cebadores Gray SpH modificados
que se orientan a pequeñas regiones del genoma (109 pb y 151 pb, respectivamente)
también se desempeñaron bien, sobre todo en tejidos descompuestos. Más tarde, el
conjunto de cebadores TK se desempeñaron bien en la aplicación de un método de prueba
en anillo en 21 laboratorios de 19 países de todo el mundo (K. Way, datos no publicados).
En el mismo estudio realizado en Cefas y mediante el método de prueba en anillo también
se compararon kits comerciales de extracción de ADN según su capacidad de proporcionar
ADN de KHV con calidad suficiente para su uso en pruebas PCR. De entre los kits
comerciales evaluados en Cefas, el EasyDNA (Invitrogen), el DNeasy (Qiagen) y el
reactivo DNAzol (Invitrogen) sirvieron para extraer ADN de calidad adecuada. En la
prueba en anillo, dieron buenos resultados el High Pure PCR template preparation kit
(Roche), el QIAamp DNA blood minikit (Qiagen) y el Puregene DNA purification kit. Sin
embargo, en algunos laboratorios se halló que el reactivo DNAzol no era tan fiable.
En el protocolo de preparación de muestras que se detalla más adelante se utiliza el reactivo
DNAzol para la extracción de ADN de KHV. Se trata de un protocolo fácil, de corta
duración y relativamente barato en comparación con otros kits. A los laboratorios que no
están familiarizados con la extracción mediante DNAzol puede que este método les
parezca menos fiable. No obstante, existen kits de extracción de ADN en el mercado
(incluidos los mencionados anteriormente) que producen ADN de gran calidad adecuado
para su uso en el protocolo de la PCR detallado.
A continuación se ofrecen detalles sobre dos protocolos para PCR. En el primero se utiliza
el conjunto de cebadores TK elaborados por Bercovier y sus colegas en la Escuela de
Medicina de la Hebrew University-Hadassah de Israel (2). El segundo fue elaborado por
Yuasa y sus compañeros en el National Research Institute of Aquaculture (NRIA), Watarai,
Mie, Japón (40), y es una versión perfeccionada del protocolo elaborado por Gray et al.
(11).
De todos los métodos PCR de una sola reacción publicados, estos protocolos son
considerados actualmente como los más sensibles para la detección de ADN de KHV en
muestras de tejido fresco procedentes de carpas con la enfermedad clínica. Los mismos
protocolos pueden servir para la detección de niveles subclínicos del virus. Si el tejido
muestra signos de descomposición, puede ser preciso el uso de conjuntos de cebadores
(véase más arriba) orientados hacia las regiones cortas del genoma en vez del conjunto de
cebadores TK.
Notas de tipo general
La PCR suele producir resultados positivos falsos y negativos falsos. De ahí que cada
prueba y extracción de tejido debe incluir un control negativo para descartar la
contaminación. A fin de minimizar aún más el riesgo de contaminación, deben utilizarse los
extremos de la pipeta para prevenir la aparición de aerosoles en cada paso de la preparación
de la reacción PCR.
Preparación de muestras
290
i)
Para la extracción de tejidos de órganos, debe seguirse el procedimiento descrito en el
capítulo I.1 (sección B.3.2).
ii)
Se añaden 100 µl de homogenizado de tejidos (1/10 [p/v]) o de sobrenadante de
cultivo vírico a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1 ml de reactivo
DNAzol®.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi
iii) Se mezcla con suavidad invirtiendo el tubo cinco veces, se mantiene a temperatura
ambiente 5 minutos y luego se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 minutos utilizando
una microcentrífuga.
iv) Se separa 1 ml de sobrenadante y se añade a un nuevo tubo de microcentrífuga de
1,5 ml que contenga 0,5 ml de etanol.
v)
Se mezcla con suavidad invirtiendo el tubo cinco veces y manteniéndolo a
temperatura ambiente durante 5 minutos; a continuación se centrifuga a 13.000 rpm
durante 30 minutos utilizando un microcentrífuga.
vi) Se separa el sobrenadante y se lava el precipitado con 250 µl de etanol al 70% en agua
grado biología molecular.
vii) Se centrifugan las muestras durante 5 minutos a 13.000 rpm.
viii) Se separa el etanol con una pipeta y se seca al aire el precipitado dejando los tubos
abiertos en la mesa durante 5 minutos.
ix) Se resuspende el precipitado en 50 µl de agua grado biología molecular precalentada a
60°C, y se incuba a 60°C durante 5 minutes. Las muestras pueden guardarse a –20°C
hasta que se necesiten.
PCR
Todas las reacciones PCR deben prepararse en una zona limpia y separada de la zona en la
que se realizan las amplificaciones. Con ello se minimiza el riesgo de contaminación.
Protocolo 1 (con cebadores TK de Bercovier)
i)
Para cada muestra, se prepara una mezcla base que contenga:
Para Go-Taq Polimerasa:
10 µl
5 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
30,75 µl
Tampón de reacción (×10 conc.)
MgCl2 (25 mM stock)
dNTPs (25 mM de mezcla) [Promega Cat.no.U1240]
Cebador directo (100 pmoles/µl de stock)
Cebador inverso (100 pmoles/µl de stock)
Go Taq polimerasa 500 µ (5 µ/µl) [Promega Cat.no.M8305]
Agua grado biología molecular
Cebadores TK de Bercovier:
Directo = 5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’
Inverso = 5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’
Tamaño del producto = 409 pb
Para cada muestra, se colocan 47,5 µl en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y pared
delgada y se cubre con dos gotas de aceite mineral.
ii)
Se añaden 2,5 µl del DNAzol® extraído del ADN. Se guarda el resto de ADN a
–20ºC.
iii) Se colocan los tubos en un termociclador y se realiza el programa:
1 ciclo:
5 minutos a 94ºC
40 ciclos : 1 minuto a 95ºC
1 minuto a 55ºC
1 minuto a 72ºC
Un paso de extensión final de 10 minutes a 72ºC.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi
iv) Se aplica electroforesis a volúmenes del producto PCR de 20 µl en gel de agarosa al
2% teñido con bromuro de etidio (al 4% cuando se separen productos de
amplificación más pequeños de <300 pb) a 120 V durante 20 minutos y se observan
con luz UV. Se debe incluir en el gel una escala de peso molecular adecuada para
determinar el tamaño del producto.
v)
Mediante el análisis de secuencias, deben confirmarse productos de tamaño correcto
como KHV en origen.
Protocolo 2 (con cebadores Sph de Gray/modificados por Yuasa)
i)
Para cada muestra, se prepara una mezcla base que contenga:
Para la versión TaKaRa Ex Taq™ Hot Start:
2 µl
1,6 µl
0,2 µl
0,2 µl
0,1 µl
14,9 µl
Tampón Ex Taq (×10 conc.)
dNTPs (2,5 mM de mezcla)
Cebador directo (50 pmoles/µl de stock)
Cebador inverso (50 pmoles/µl de stock)
TaKaRa Ex Taq™ HS polymerasa [Takara Bio Inc. Cat.no.RR006A]
Agua grado biología molecular
(Nota: la concentración final de MgCl2 en la mezcla base es 2mM)
Cebadores Sph de Gray:
Directo = 5’-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3’
Inverso = 5’-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GGT-CGC-3’
Tamaño del producto = 292 pb
Para cada muestra, se colocan 19 µl en un tubo de microcentrífuga de 0,2 ml y de
pared delgada, y se cubre con dos gotas de aceite mineral.
ii)
Se añade 1µl del ADN extraído
iii) Se colocan los tubos en un termociclador y se lleva a cabo el programa:
1 ciclo de: 30 segundos a 94ºC
40 ciclos de: 30 segundos a 94ºC
30 segundos a 63ºC
30 segundos a 72ºC
Un paso de extensión final de 7 minutos a 72ºC.
iv) Se añaden 3 µl de ×6 tampón de carga a cada producto PCR y se aplica electroforesis
a 7 µl en del de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio a 100 V durante
20 minutos y se observa con luz UV. Se debe incluir en el gel una escala de peso
molecular adecuada para determinar el tamaño del producto.
v)
Mediante el análisis de secuencias, deben confirmarse productos de tamaño correcto
como KHV en origen.
4. CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN SU FINALIDAD
En el cuadro 1 aparece la lista de métodos disponibles en la actualidad para la vigilancia, detección y
diagnóstico de la EHVK. Los símbolos utilizados en el cuadro indican: A = se trata del método
recomendado por razones de disponibilidad y utilidad, así como por la especificidad y sensibilidad del
diagnóstico; B = se trata de un método estándar con buena especificidad y sensibilidad de diagnóstico;
C = el método es aplicable en algunas situaciones, pero su aplicación se ve seriamente limitada por
razones de coste, precisión y otros factores; y D = el método no se recomienda en la actualidad para
ese fin. Estas denominaciones (A, B, C y D) son un tanto subjetivas, puesto que están implicadas
cuestiones de fiabilidad, sensibilidad, especificidad y utilidad. Aunque no todas las pruebas de las
292
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi
categorías A y B se han sometido a estandarización y validación formales (al menos las fases 1 y 2 de la
figura 1 del capítulo 1.1.2), su naturaleza rutinaria y el hecho de haber sido ampliamente utilizadas sin
resultados dudosos las convierte en aceptables.
Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de la EHVK
Método
Vigilancia para declarar la
ausencia de infección
Diagnóstico presuntivo
de la infección o
enfermedad
Diagnóstico confirmativo
de la infección o
enfermedad
Síntomas generales
D
B
D
Histopatología de tejidos y
órganos
D
B
C
Aislamiento en cultivo
celular
D
C
D
Ensayos basados en
anticuerpos para detectar el
antígeno del KHV (IFAT,
ELISA)
D
B
C
MET
D
B
C
PCR con muestras de
tejidos*
C
A
A
PCR – análisis de
secuencias
NA
C
A
Detección de anticuerpos
de KHV en peces
expuestos (ELISA)**
C
C
D
IFAT = Prueba de inmunofluorescencia indirecta; ELISA = enzimoinmunoensayo;
MET = microscopía electrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa.
* Los virólogos especialistas en diagnóstico deben tener en cuenta que los peces recién vacunados contra el
KHV pueden dar positivo en pruebas de PCR. En la actualidad no se dispone de información que indique la
existencia de diferencia alguna de secuencias genómicas entre la cepa de vacuna atenuada y el KHV en estado
natural (de tipo silvestre). En tanto no se disponga de información sobre esas secuencias, los laboratorios de
diagnóstico no podrán distinguir entre el tipo silvestre de KHV y la cepa vacunal, lo que puede inducir a un
diagnóstico equivocado.
** Los virólogos especialistas en diagnóstico deben tener en cuenta que los peces recién vacunados contra KHV
pueden dar positivo mediante ELISA. También puede darse reacción cruzada de bajo nivel con anticuerpos
contra CyHV-1.
NOTA: Muchos laboratorios de diagnóstico pueden tener dificultades a la hora de conseguir anticuerpos contra
KHV que sean adecuados para su uso en pruebas de inmunodiagnóstico. No obstante, es posible que pronto se
disponga de un número limitado de anticuerpos monoclonales y policlonales de procedencia comercial. Es muy
posible que pronto se pueda contar con kits de diagnóstico de la misma procedencia.
5.
CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO
a)
Definición de caso sospechoso
Un caso sospechoso de KHVD se define como la presencia de signos clínicos típicos de la
enfermedad en la población de peces susceptibles, o la presencia de histopatología típica en cortes
de tejidos, o el típico efecto citopático (ECP) en cultivos celulares sin identificación del agente
causal o un solo resultado positivo de una de las pruebas de diagnóstico descritas con
anterioridad.
b)
Definición de caso confirmado
Un caso confirmado se define como caso sospechoso con identificación ulterior del agente causal
mediante uno de los métodos serológicos o moleculares anteriormente descritos, O un segundo
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
293
Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi
resultado positivo a partir de una prueba de diagnóstico distinta y aplicada por separado de entre
las descritas anteriormente.
6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/DETECCIÓN PARA ESTABLECER LA AUSENCIA DE INFECCIÓN
En la actualidad no existen métodos recomendados para la vigilancia de poblaciones de peces
susceptibles con el fin de establecer la ausencia de infección por KHV. No obstante, muchos
laboratorios están investigando el desarrollo de métodos moleculares para incrementar la sensibilidad
(ej. la PCR en tiempo real y la anidada) o para la detección fiable de niveles bajos de ADN de virus
persistente. Dichos métodos pueden resultar fiables para los programas de vigilancia.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE especializados en la enfermedad del herpesvirus koi
(véase el cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web
de la OIE : www.oie.int)
296
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006