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La importancia del virus PRRS “Es la enfermedad más costosa de la porcicultura mundial de todos los 8empos por encima de enfermedades como: Aujeszky, Fiebre porcina clásica y PED”. Impacto de PRRS en la producción •  Incremento en la mortalidad todas las etapas. •  Aumento en el número de cerdos de desecho. •  Disminución de la ganancia diaria. •  Aumento en la conversión. •  Problemas reproduc8vos. Costos de la enfermedad Aprox 15 MIL MILLONES de pesos mexicanos . 1Holtkamp DJ, Kliebenstein JB, Neumann EJ, et al. Assessment of the economic impact of porcine reproduc8ve and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J Swine Health Prod 2013;21(2):72-­‐84
Aprox 15 MIL MILLONES de pesos mexicanos “Desarrollo de nuevas líneas celulares permisivas a PRRSV” y sus implicaciones. Por PhD MVZ Paloma Suárez Modificada por: MVZ, MC Raúl González M Gerente Técnico Unidad de Negocios Porcinos Virus PRRS •  Virus ARN, Arterivirus, envuelto de cadena sencilla. •  Agente causal del Sindrome Respiratorio y Reproduc8vo del cerdo (PRRS). •  7 ORF´s aunque hay reportes de nuevos ORF´s 5’ UTR 1a 1b 2a 3 4 5 6 7 sGP3 3’ UTR 2b(E) GP2a/GP3/
GP4 GP5/
M Meulenberg, J.J.M. 2000. PRRSV, the virus. Vet Res 31: 2b(E) N RNA PRRS Clasificación del virus PRRS* Tipo 1 (Europeo) Tipo 2 (Americano) Serologicamente y an8genicamente dis8ntos * Hay reportes de nuevos 8pos Meulenberg, J.J.M. 2000. PRRSV, the virus. Vet Res 31: Mul8plicación del virus PRRS Virus por primera vez aislado en 1991 (Europa – Lelystad Virus) y 1992 (USA – VR-­‐2332). El aislamiento se realizó, inicialmente, en Macrófagos Alveolares Porcinos (MAPs), ya que no era posible crecerlo en líneas celulares establecidas porque: •  Necesidad de sacrificar lechones (los macrófagos no se mul8plican) •  Animales libres de la enfermedad. •  No uniformidad en el número de células obtenidas; diferencias en ktulos víricos •  Contaminaciones frecuentes (flora del cerdo) •  Uso en la producción comercial de vacunas limitado (caro y díficill). Sólo vacunas muertas. Macrófagos Alveolares Porcinos Fuente; Cinta Prieto, Universidad de Madrid En 1992, aparece la primera línea celular que permika crecer el virus Línea Celular conUnua (CL 2621) Caracterís8cas de la CL 2621 •  Obtenida a par8r de un clon suscep8ble de la línea MA-­‐104, una línea celular de riñón de mono verde africano. Posteriormente se produjeron nuevos clones a par8r de misma línea celular dando origen a la línea MARC-­‐145 •  En la actualidad, el crecimiento del virus PRRS en células de simio, está protegido por patente en algunos países. –  Permi8do para uso en inves8gación –  Uso restringido para la producción de vacunas MARC-­‐145 Fuente; Cinta Prieto, Universidad de Madrid Desaoos presentes en PRRSV Alta tasa de mutación y variación gené8ca •  La inmunidad natural es limitada frente a cepas heterólogas. Mecanismos de evasion del sistema inmune • 
El virus induce la producción de Interleukina 10 – una citoquina an8inflamatoria muy potente. • 
La producción de Interferon-­‐α está suprimida en algunas cepas del virus. • 
Producción tardía de interferon-­‐γ • 
Producción tardía de an8cuerpos neutralizantes ¿Por qué Pfizer inves8go en PRRS? Pfizer era una compañía líder en CRP. (Ahora es lider). PRRS es una enfermedad de mucho interes: •  Distribución mundial de la enfermedad (aunque dos 8pos muy diferenciados). •  Múl8ples retos; enorme variabilidad gené8ca y an8génica. •  Con incremento en virulencia en varias regiones. •  Elevado impacto económico. ¿Por qué Pfizer/Zoe8s inves8go en PRRS? Grupo de inves8gación en PRRS con más de 20 años de experiencia propia y/o con colaboraciones. Avances generados en el conocimiento gené8co del virus y de sus proteínas estructurales: •  Primer clon infeccioso de ADN complementario de un virus PRRS 8po 2. •  Primer uso del virus PRRS como vector. •  Descubrimiento del receptor CD163 de PRRS. PRRSV y Pfizer ¿Qué es el receptor CD163? •  Se realizaron librerías de cADN a par8r de MAP que se seleccionaron por su habilidad de hacer que células no de simio fueran suscep8bles al PRRSV. •  Se iden8ficó el CD163 como el receptor primario frente al virus. La transfección transitoria del cDNA fue necesaria y suficiente para hacer que diferentes líneas celulares fueran permisivas a PRRSV. •  Posteriormente se crearon líneas celulares que de modo con8nuo expresaran el receptor CD163 en su superficie, permi8endo la replicación del virus. •  Dichas líneas proceden de diferentes especies, BHK21 (riñón de hamster), PK0809 (riñón porcino), y NLFK (riñón felino). Implicaciones Futuras Evidentemente, la más cercana es la generación de nuevas vacunas Diferente línea celular: diferentes propiedades La atenuación es un proceso evolu8vo •  El virus acumula mutaciones que le permiten crecer de forma eficiente en la línea celular •  Al mismo 8empo pierde propiedades que son ú8les para su mul8plicación en el cerdo •  Las presiones selec8vas son diferentes dependiendo de la línea celular u8lizada y por ello, los virus vivos atenuados en diferentes líneas celulares 8enen propiedades diferentes. Desarrollo actual: Generación de nuevas vacunas a PRRS. •  Estas líneas celulares permi8rán el desarrollo de nuevas vacunas, tanto muertas como vivas modificadas frente a PRRS y potencialmente con nuevas propiedades. •  De hecho, ya hemos obtenido el virus 8po 2 Master para el desarrollo de una vacuna (ya disponible en US-­‐Mex ) mediante el pase en células no de simio como de riñón porcino, CD163+ PK y células de riñón de hamster, CD163+ BHK que expresan el receptor CD163. Clonaje molecular (clon de ADN complementario infecUvo) MAPs Células PK-­‐CD163 Células PK-­‐
CD163 Células BHK-­‐CD163 Virus Master Desarrollo actual A pesar de su paso en células BHK el virus de la vacuna de Zoe8s replica bien en MAPs y sus predecesores perdieron genes que inhiben la liberación de ciertos interferones por las células del hospedador. Por lo tanto, hoy tenemos…….. Una vacuna vs virus PRRS, creada a parUr de un culUvo celular innovador que le confiere propiedades únicas como: “El virus vacunal crecido en este cul9vo celular (BHK CD163 +) NO interfiere con la producción de interferon por lo tanto mejor respuesta vacunal”. Nuevas oportunidades en el futuro v El tener un clon infec8vo de ADN complementario y una línea suscep8ble permi8rá en un futuro el alterar el genoma del PRRSV y por lo tanto: •  El desarrollo de Vacunas DIVA. •  Iden8ficar factores de virulencia y construir virus gené8camente atenuados. •  U8lizar el virus del PRRS como vector adicionando genes que confieran protección frente a otras enfermedades del cerdo. Muchas gracias