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Estudio de la diversidad del
Parvovirus canino tipo 2 (CPV-2)
mediante el análisis de repetidos en
el genoma viral.
Katia Alejandra Sosa da Silva
Licenciatura en Ciencias Biológicas
Plan 1992
Pasantía de investigación en Biología Molecular
Orientador: Dr. Ruben Pérez
Sección Genética Evolutiva
Facultad de Ciencias
Universidad de la República
Montevideo, mayo de 2009.
-1-
Índice
0B
4
1. RESUMEN
2B
1B
6
2. INTRODUCCIÓN
4B
3B
6
2.1. Familia Parvoviridae
6B
5B
7
2.2. La enfermedad: Parvovirosis canina
8B
7B
8
2.3. Diagnóstico
10B
9B
10
2.4. Genoma viral
12B
1B
11
2.5. Proteínas virales
14B
13B
13
2.6. Estructura de la cápside parvoviral
16B
15B
14
2.7. Ciclo replicativo
18B
17B
17
2.8. Origen y evolución
20B
19B
21
3. OBJETIVOS
2B
21B
21
3.1. Objetivo general
24B
23B
21
3.2. Objetivos puntuales
26B
25B
22
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Detección y caracterización de las cepas de parvovirus canino presentes en
Uruguay
4.1.1. Obtención de las muestras
28B
27B
22
29B
30B
22
32B
31B
23
4.1.2. Extracción de DNA
34B
3B
23
4.1.3. PCR
36B
35B
24
4.1.4. RFLP
38B
37B
25
4.2. Análisis de la región del segundo grupo de repetidos
40B
39B
25
4.2.1. Diseño de cebadores
42B
41B
26
4.2.2. Cepas de campo
4B
43B
26
4.2.3. Cepas vacunales
46B
45B
26
4.2.4. Extracción de DNA vacunal
48B
47B
27
4.2.5. PCR
50B
49B
27
4.2.6. Clonación
52B
51B
28
4.2.7. Extracción de DNA plasmídico
54B
53B
29
4.2.8. Secuenciación
56B
5B
29
4.2.9. Análisis comparativo de los repetidos
58B
57B
30
5. RESULTADOS
60B
59B
30
5.1. Detección y caracterización del virus en las muestras
62B
61B
30
5.1.1. Detección del virus
64B
63B
30
5.1.2. RFLP
6B
65B
30
5.2. Análisis de la región del segundo grupo de repetidos
68B
67B
30
5.2.1. PCR
70B
69B
5.2.2. Clonación
71B
31
72B
-2-
32
5.2.3. Secuenciación
74B
73B
32
5.2.4. Análisis comparativo de los repetidos
76B
75B
36
6. DISCUSIÓN
78B
7B
42
7. CONCLUSIONES
79B
43
8. PERSPECTIVAS FUTURAS
80B
44
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
81B
49
10. ANEXO I: PROTOCOLOS
82B
49
10.1. Clonación con el kit “GeneJet PCR Product Cloning kit” de Fermentas
83B
49
10.2. “Minipreps”, técnica fenol-cloroformo modificada de Sambrook
11. AGRADECIMIENTOS
84B
51
85B
-3-
1. RESUMEN
86B
El parvovirus canino de tipo 2 (CPV-2) es responsable de la parvovirosis, una de las
principales enfermedades infecciosas que afecta a perros de corta edad. El CPV-2 es un
Parvovirus autónomo, no posee envoltura lipídica y está compuesto de una cápside
icosaédrica de 26 nm de diámetro. Su genoma es una monohebra negativa de DNA (5.2 kb)
que codifica las proteínas no estructurales NS1 y NS2, involucradas en la replicación viral, y
las proteínas estructurales VP1 y VP2 que conforman la cápside.
El CPV-2 emergió y se expandió rápidamente a fines de la década del 70;
presuntamente se originó a partir de un parvovirus similar al de la Panleucopenia felina
(FPLV) que evolucionó y se adaptó al nuevo hospedero canino. En la década del 80 surgieron
consecutivamente dos variantes antigénicas, denominadas CPV-2a y CPV-2b, que
reemplazaron al CPV-2 original. En el año 2000 se detectó una nueva variante antigénica
llamada CPV-2c, que ha ido aumentando su frecuencia en poblaciones caninas de varias
partes del mundo. En el presente trabajo, por medio de la técnica de PCR-RFLP se analizaron
47 fecas de canes uruguayos con síntomas presuntivos de parvovirosis, de las cuales 34
resultaron positivas para CPV-2. Todas las muestras positivas fueron genotipadas como CPV2c, lo que sugiere que dicha variante es la única circulante actualmente en nuestro territorio.
Este hecho no había sido descrito en ningún país del mundo e indica que la variante 2c tiene
la potencialidad de reemplazar completamente a otras variantes en un corto tiempo.
Los estudios evolutivos demuestran que CPV-2 ha evolucionado por medio de
sustituciones nucleotídicas puntuales, especialmente en los genes de las proteínas de cápside.
No obstante, analizando secuencias de cepas de CPV-2, hemos detectado también variaciones
en secuencias repetidas no codificantes del genoma viral. En la cepa de referencia de CPV-2
(número de acceso M19296 en la base de datos GenBank) se hallan dos grupos de repetidos
hacia el extremo 5’ del genoma del virus, el primero compuesto por dos monómeros y el
segundo por tres. Los monómeros abarcan aproximadamente 60 nucleótidos cada uno pero
difieren marcadamente entre el primer y segundo grupo de repetidos. Aunque estas secuencias
han sido descritas por varios autores, no se conoce su funcionalidad ni nivel de variación.
Nuestro grupo de investigación detectó la existencia de variación en el número de monómeros
en el primer grupo de repetidos en las cepas que circulan actualmente por el mundo. Para
analizar si una variación similar existe en el segundo grupo de repetidos, en esta pasantía
hemos clonado y secuenciado la región correspondiente en cinco muestras uruguayas del
parvovirus canino. Se constató que las muestras uruguayas presentan un solo monómero en el
segundo grupo de repetidos. Asimismo, mediante estudios comparativos con secuencias
-4-
depositadas en las bases de datos genómicas, se determinó que la mayoría de los CPV-2 y
otros parvovirus relacionados también presentaban un único monómero con un alto nivel de
conservación nucleotídica. En este trabajo sugerimos que la ganancia o pérdida de
monómeros en el segundo grupo de repetidos no sigue una tendencia evolutiva (i.e. de cepas
antiguas a modernas) sino que constituye un mecanismo extra de variabilidad viral
relativamente poco común. Aunque han surgido reordenamientos en el segundo grupo de
repetidos parece poco probable la pérdida completa del mismo, ya que la presencia de un
monómero en todos los virus analizados y su alta conservación nucleotídica sugieren alguna
funcionalidad.
-5-
2. INTRODUCCIÓN
87B
2.1. Familia Parvoviridae
U
U
El Parvovirus canino tipo 2 (CPV-2), agente etiológico de la parvovirosis canina, es un
virus perteneciente a la familia Parvoviridae. Los integrantes de la misma se encuentran entre
los virus DNA animales más pequeños conocidos (“parvo”, de latín pequeño). Las partículas
parvovirales tienen un peso molecular de 5,5-6,2 X 106 daltons y un diámetro de 18-26 nm.
Su genoma es una molécula de DNA monohebra de aproximadamente 5 Kb, en su mayoría de
polaridad negativa. La familia Parvoviridae está formada por dos subfamilias: Parvovirinae,
la cual infecta vertebrados e incluye tres géneros, Parvovirus (comprende el CPV-2, el Virus
de la Panleucopenia felina (FPLV), el Virus de la enteritis del visón (MEV), el Parvovirus de
mapache (RPV), y el Virus diminuto de ratón (MVM)), Erythrovirus (incluye al virus
humano B19) y Dependovirus (engloba los Virus asociados a adenovirus (AAV)); y la
subfamilia Densovirinae, que infecta insectos y incluye tres géneros, Densovirus, Iteravirus y
Contravirus (Fields, 2006).
Los Dependovirus son los únicos entre los virus animales que, excepto bajo
condiciones especiales, requieren co-infección con un virus colaborador no relacionado, sea
un adenovirus o un herpesvirus, para generar una infección productiva (Fields, 2006). Aunque
estos virus pueden infectar las células hospederas, su genoma sufre una replicación
incompleta. Este genoma defectivo puede integrarse dentro del DNA hospedero en un estado
de latencia, pudiendo luego ser activado en una infección posterior con un virus colaborador
que inducirá la fase S del ciclo celular y la expresión de los elementos necesarios para la
replicación del dependovirus (Chiorini et al., 1996).
Por el contrario, los géneros Parvovirus y Erythrovirus, clasificados como parvovirus
autónomos, no necesitan un virus colaborador para la replicación de su genoma ya que son
capaces de replicarse por sí mismos. Sin embargo, al igual que los dependovirus requieren
que las células hospederas se encuentren en la fase S del ciclo celular para que se expresen los
componentes celulares necesarios para su replicación (Fields, 2006). El hecho de que los
parvovirus autónomos solamente repliquen en células en división hace que posean
predilección por animales jóvenes, en proceso de gestación, o por tejidos de animales adultos
con altos índices de proliferación.
-6-
2.2. La enfermedad: Parvovirosis canina
U
La Parvovirosis canina emergió en 1978, y en pocos meses se propagó por todo el
mundo generando una pandemia que provocó la muerte de decenas de miles de perros (Appel
et al., 1979b). Esta patología es una de las enfermedades infecciosas más prevalentes en canes
entre 6 y 12 semanas de vida (Desario et al., 2005), pero también puede afectar perros de
mayor edad.
La transmisión de la Parvovirosis generalmente ocurre de 8 a 12 días postinfección y
se realiza vía fecal-oral/nasal (Pollock, 1982). Una vez que el virus entra al organismo, la
replicación primaria se produce en las células de la nasofaringe y de la orofaringe, así como
en las amígdalas y otros tejidos linfoides. Posteriormente, una fase de viremia disemina el
virus sistémicamente, y luego de uno a tres días el mismo puede ser encontrado en las
amígdalas, los nódulos linfáticos retrofaríngeos, el timo y en los nódulos linfáticos
mesentéricos. A los tres días post-infección el virus comienza a replicarse en las Placas de
Peyer y se disemina a las células epiteliales intestinales destruyendo las mismas (Truyen,
2000). El virus es excretado en las heces de los canes infectados, las cuales actúan como
reservorio de la infección. La alta resistencia del virus a condiciones ambientales extremas, y
su resistencia a los desinfectantes más comunes permiten que pueda mantenerse viable en el
ambiente por largos períodos de tiempo (Truyen, 2000).
La parvovirosis canina presenta dos sintomatologías típicas: en los cachorros
neonatales generalmente provoca miocarditis aguda con alta mortalidad (Robinson et al.,
1979), y en los mayores a dos meses de edad provoca gastroenteritis hemorrágica (Appel et
al., 1979a; Robinson et al., 1980). Los síntomas más comunes de la gastroenteritis son
anorexia, depresión, fiebre, vómito y diarrea sanguinolenta y maloliente, los cuales producen
a su vez una marcada pérdida de peso y deshidratación. La recuperación del estado normal del
intestino delgado puede requerir un período de dos o tres semanas después de la infección,
momento en el cual el animal comienza a recuperar su peso normal. La enfermedad puede ser
incluso hiperaguda y conducir muchas veces a la muerte del animal en un plazo de 48 a 72
horas después de la manifestación de los primeros síntomas. Los cuadros de parvovirosis
pueden verse también exacerbados por infecciones concurrentes con Giardias, Ancilostomas,
y Coronavirus canino entre otros (Truyen, 2000).
Por otro lado, la enfermedad puede presentarse de forma asintomática en los canes de
edad avanzada, en cachorros correctamente inmunizados o en aquellos expuestos a una baja
concentración viral ya que la severidad de la infección está relacionada a la cantidad de virus
a la que el animal se expone. En estos casos el perro esparce el virus sin ser percibido, lo que
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evita que se pueda tomar las precauciones adecuadas. Del mismo modo, los individuos
infectados pueden excretar el virus antes de manifestar los signos clínicos de la enfermedad,
así como hasta tres semanas después de haber adquirido la infección y estar en fase de
recuperación.
2.3. Diagnóstico
U
El diagnóstico clínico primario de la enfermedad lo realiza el médico veterinario
mediante la observación de los signos clínicos que el animal presenta. Debido a que los
síntomas típicos de la parvovirosis también pueden ser producidos por otros patógenos, se
requiere de exámenes de laboratorio para su diagnóstico específico.
Dentro de los exámenes de laboratorio utilizados para el diagnóstico de Parvovirus
canino se encuentra la microscopía electrónica (ME) directa a partir de muestras fecales (Fig.
1). En general, para realizar un diagnóstico con esta técnica se requiere alrededor de 103
partículas virales por gramo de heces (Roseto et al., 1980). Asimismo, se trata de una técnica
costosa y que requiere equipamientos y manejo especiales.
Figura 1. Partículas de parvovirus en
las heces de un perro infectado. Se
indica con una flecha la partícula viral.
Micrografía Electrónica. Tomado de
www.b19virus.com
HU
U
La inmunocromatografía (IC) es otro método de diagnóstico utilizado por su simple y
rápido procedimiento. Esta técnica puede ser realizada tanto por veterinarios como por
propietarios de animales. Sin embargo, se requiere grandes cantidades de antígeno viral para
que se produzca una señal claramente visible por lo que los resultados pueden ser afectados
por la subjetividad del operador (Desario et al., 2005).
La prueba de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) también es un método
rápido y eficaz de diagnóstico, y puede realizarse de manera ágil y relativamente económica
por personal veterinario. Al igual que la ME, requiere una cantidad de partículas virales del
orden de 103 por gramo de heces. Esta metodología permite además detectar anticuerpos IgM
-8-
específicos para CPV-2, los cuales aparecen en las etapas tempranas de la infección y
desaparecen entre las dos y tres semanas después de la misma (Truyen, 2000).
Debido a que los parvovirus presentan la propiedad de unión a ácido siálico (SA), la
prueba de hemoaglutinación e inhibición de la hemoaglutinación (HA-HI) se puede utilizar
como método de diagnóstico. Éste es un método simple y rápido para detectar el virus en
materia fecal y en muestras de tejidos. Sin embargo, su utilización se ve obstaculizada por el
hecho de que existen cepas carentes de actividad de hemoaglutinación (Cavalli et al., 2001).
Además, esta técnica suele ser menos sensible que la ME o el ELISA (Truyen, 2000).
Por otro lado, también puede realizarse aislamiento viral (VI) para el diagnóstico de
CPV-2 utilizando varias líneas celulares de origen felino y canino. Esta metodología es más
sensible que las técnicas de ELISA, IC o HA-HI, aunque es poco utilizada como técnica de
diagnóstico ya que se requiere como mínimo una semana para obtenerse el resultado y sólo
puede realizarse en laboratorios especializados (Desario et al., 2005). Además, se requiere
que las partículas virales se encuentren intactas para que puedan ingresar a las células y
realizar su ciclo replicativo.
En la actualidad, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las
metodologías más ampliamente utilizadas como diagnóstico molecular, permitiendo la rápida
generación in vitro de millones de copias idénticas de la secuencia de DNA blanco. Se trata
de una técnica altamente sensible ya que requiere unas pocas moléculas del DNA de interés
para comenzar con la amplificación. Asimismo, presenta una gran especificidad dada por la
utilización de cebadores específicos que se hibridan con la secuencia complementaria en el
DNA molde. Utilizando procedimientos sencillos de extracción de DNA a partir de materia
fecal, esta técnica comenzó a ser empleada como método de diagnóstico de CPV-2 en 1995
(Schunck et al., 1995). Recientemente se ha desarrollado para la detección y cuantificación de
Parvovirus canino, una técnica de PCR en tiempo real (rt-PCR) basada en la tecnología
Taqman de sondas específicas de hibridación, la cual mostró ser altamente específica, sensible
y reproducible, así como más rápida que el método convencional basado en la PCR a tiempo
final (Decaro et al., 2005). Además de detectar y cuantificar el virus, la tecnología TaqMan
permite simultáneamente caracterizar la variante de CPV-2 presente en la muestra,
prescindiendo de técnicas adicionales (análisis de patrones de restricción y secuenciación)
requeridas con la PCR convencional. No obstante, el alto costo de los equipamientos y
reactivos necesarios para llevar a cabo el diagnóstico por rt-PCR impide que muchos
laboratorios dispongan de dicha técnica. Además, para la caracterización de nuevas cepas es
conveniente obtener la secuencia de los amplicones por métodos convencionales de PCR y
-9-
secuenciación, ya que esto nos brinda mayor información sobre la variabilidad del genoma
viral.
2.4. Genoma viral
U
El genoma de CPV-2 está constituido por una monohebra de DNA de
aproximadamente 5,2 Kb y de polaridad negativa que, por convención se representa en
dirección 3’-5’ (Berns, 1990).
El DNA viral posee dos unidades transcripcionales (Reed et al., 1988) (Fig. 2). El
transcripto de la primer unidad transcripcional produce los RNA mensajeros de las proteínas
no estructurales (NS1 y NS2) por un mecanismo que implica un corte y empalme alternativo
en el mensajero de la NS2 (Hoelzer et al., 2008). Este mecanismo genera un cambio en el
marco de lectura a partir del sitio de remoción del intrón, por lo que las proteínas NS1 y NS2
son idénticas en su extremo N-terminal pero difieren en el extremo C-terminal (Fig. 2).
El transcripto generado por la segunda unidad transcripcional produce los RNA
mensajeros de las proteínas estructurales (VP1 y VP2), también por procesamiento diferencial
(Reed et al., 1988). La secuencia completa de VP2 está presente en VP1, que contiene un
dominio N-terminal adicional de 143 aminoácidos (Hoelzer et al., 2008) (Fig. 2).
Gen NS
3’
Gen VP
5’
NS1
NS2
VP1
VP2
Figura 2. Esquema del corte y empalme alternativo que ocurre en ambas unidades transcripcionales del genoma
de CPV-2. Se producen cuatro RNA mensajeros a partir de dos unidades transcripcionales. Las proteínas NS1 y
NS2 presentan igual extremo N-terminal, sin embargo, el corte y empalme alternativo cambia el marco de
lectura en la segunda mitad de la proteína NS2 generando un extremo C-terminal distinto al de la proteína NS1.
Las proteínas VP1 y VP2 presentan el extremo C-terminal idéntico, pero VP1 presenta un dominio N-terminal
adicional.
Al igual que todos los parvovirus autónomos, CPV-2 posee secuencias palindrómicas
en ambos extremos de su genoma. Estos palíndromos son diferentes en cada extremo y se
pliegan sobre sí mismos para actuar como cebadores durante la replicación (Berns, 1990).
- 10 -
Un hecho notable en la estructura del genoma del parvovirus canino es la presencia de
unidades de repetidos directos ubicados hacia el extremo 5’ del genoma viral (extremo
derecho). Según la cepa de referencia de CPV-2 (número de acceso M19296 en la base de
datos GenBank) existen dos grupos de repetidos en dicha región viral (Reed et al., 1988) (Fig.
3). El primer grupo de repetidos está compuesto por dos monómeros: uno que flanquea el
codón stop del gen VP1/VP2 y tiene 61 nucleótidos, y otro posterior que posee 62 nucleótidos
y presenta una inserción de una A entre la posición 15 y 19, y una transición C→T en la
posición 29. El segundo grupo de repetidos está compuesto por tres monómeros de 62
nucleótidos cada uno. Los dos primeros presentan secuencias idénticas (representadas en
dirección 5’-3’), mientras que el tercer monómero presenta una transversión G→T en la
novena base del repetido (Reed et al., 1988) (Fig. 3). Estos repetidos también están presentes
en otros virus de la subfamilia Parvovirinae como el FPLV, MEV y RPV.
Proteínas no
estructurales
Proteínas de
la cápside
Extremo
palindróm ico 3’
Extremo
palindróm ico 5’
NS
VP
4514
4574
CAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAACATACTTACTATGGTTTTTATGTTTATTACATAT
CAACTAGCACCTAGAAAAATTATATTAATATACTTACTATGGTTTTTATGTTTATTACATAT
4575
4636
4701
4762
GTTTGTTAGATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
4824
GTTTGTTAGATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
4763
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
4825
4886
Figura 3. Esquema del genoma de una cepa de referencia de CPV-2 (número de acceso M19296 en la base de
datos GenBank). Se indica los dos grupos de repetidos localizados en el extremo 5’ del genoma. Se numera la
posición que abarcan cada uno de los monómeros de repetición y se muestra la secuencia en sentido 5’-3’ de la
hebra complementaria. Las variaciones en las bases se muestran en rojo subrayado.
2.5. Proteínas virales
U
A pesar de su pequeño tamaño, el genoma de los parvovirus puede generar varias
proteínas con múltiples funciones que garantizan un ciclo viral altamente efectivo.
- 11 -
VP2 es la proteína mayoritaria de la cápside por lo que se requiere para ensamblar la
misma y empaquetar el genoma viral en su interior. Esta proteína también le permite al virus
ingresar a la célula a través de su interacción con el receptor celular de la transferrina (TfR).
Por esta razón, unos pocos cambios en la secuencia de aminoácidos de la VP2 pueden variar
el grado de afinidad con su receptor celular, lo que podría alterar la capacidad infectiva y el
rango de hospedero del virus. Esta proteína, también ha sido implicada en la interacción con
ácido siálico (SA), asimismo, juega un rol importante en el proceso de infección celular ya
que posee actividad fosfolipasa A2. Sus sitios antigénicos son el principal blanco de los
anticuerpos del hospedero, los cuales protegen contra la infección (Parrish & Kawaoka,
2005).
La proteína VP1 forma también parte de la cápside viral. Además, presenta secuencias
básicas que podrían estar controlando los procesos de transporte nuclear (Parrish & Kawaoka,
2005). Adicionalmente, la observación de que se requiere VP1 para la infectividad sugiere
que el dominio N-terminal adicional de la misma posee una función esencial (Spitzer et al.,
1997). Por otro lado, existe evidencia de que dicho extremo se localiza internamente y que
ayudaría a neutralizar el DNA viral (Tsao et al., 1991).
La proteína VP3 es el componente minoritario de la cápside y resulta de una escisión
proteólitica post-traduccional de 15 a 20 aminoácidos del extremo N-terminal de VP2,
expuesto hacia el exterior de la cápside. Dicha escisión se realiza posteriormente al
ensamblaje de las partículas virales que contienen el genoma viral (partículas completas)
(Tsao et al., 1991). En las partículas virales carentes de genoma no se ha constatado la
presencia de la proteína VP3 (Agbandje et al., 1995).
La proteína NS1 posee una localización nuclear y está involucrada en el control de la
replicación del DNA ya que reconoce, une y corta el DNA viral durante la replicación
(Cotmore & Tattersall, 2003). A su vez, posee actividad helicasa y ATPasa, regula la
expresión génica, y también controla el empaquetamiento del DNA dentro de la cápside
(Daeffler et al., 2003). Además, interviene en el control de la apoptosis celular después de la
infección viral, y es la responsable del reconocimiento y unión a varias proteínas celulares
(Nuesch et al., 1998; Fields, 2006).
Por último, la proteína NS2 se encuentra en el núcleo y en el citoplasma, y a pesar de
ser aún poco conocida, se cree posee un rol, de una manera dependiente del tipo celular y del
hospedero, en el ensamblaje correcto (eficiente) de la cápside y en el tráfico de los
componentes de la misma (Cater & Pintel, 1992; Miller & Pintel, 2002). Además, se presume
que interviene en el proceso de regulación de la expresión génica, pero no parece tener un rol
mayor en el ciclo viral (Wang et al., 1998; Fields, 2006).
- 12 -
2.6. Estructura de la cápside parvoviral
U
El CPV-2 carece de envoltura lipídica y posee una cápside de 26 nm de diámetro
formada por 60 subunidades compuestas por VP1, VP2 y VP3, las cuales se ensamblan en un
icosaedro con un número de triangulación T=1 (Fields, 2006). La proteína VP2 posee una
estructura común en forma de barril β, compuesto por ocho láminas β antiparalelas,
conectadas a través de α hélices que forman lazos o “loops” (Tsao et al., 1991; Agbandje et
al., 1995) (Fig. 4). La superficie de la cápside viral está formada principalmente por dichos
“loops”, dentro de los cuales se han mapeado estructural y genéticamente varias propiedades
biológicas tales como el rango de hospedero, el tropismo celular, la unión al receptor celular,
y propiedades antigénicas. Las inserciones entre las cadenas βD y βE del barril β forman una
cinta β (β-ribbon) antiparalela, la cual junto a inserciones similares en otros cuatro
polipéptidos cercanos forman un cilindro en el eje de simetría 5 de la cápside viral, allí se
encuentra una abertura a la superficie viral por donde se cree que VP2 es externalizada para
su escisión en VP3 en las partículas maduras.
Figura 4. Diagrama en cinta de la topología de la proteína VP2. La distancia radial en ángstroms aproximada
desde el centro viral se muestra a lo largo del eje de simetría 5. En rojo se muestra la estructura en forma de
barril β constituida por 8 láminas β, y en azul las inserciones entre las mismas incluidos los loops que conforman
la superficie de la cápside. Tomado de Tsao et al., 1991.
Otros rasgos de la cápside parvoviral incluyen protusiones en forma de espina en el eje
de simetría 3, una depresión en forma de cañón en el eje 5, y una en forma de hoyuelo en el
- 13 -
eje 2 (Fig. 5). En las protusiones del eje 3 se han mapeado regiones antigénicas, y dentro de la
depresión del eje 2 sitios relacionados con la unión al receptor celular (Fields, 2006).
Figura 5. Estructura del Parvovirus.
Micrografía crioelectrónica del CPV-2
mostrando algunos rasgos de la superficie
viral. Se muestra los ejes de simetría 2, 3, y
5. Tomado de Fields (2006).
2.7. Ciclo replicativo
U
El virus ingresa a la célula blanco a través de su interacción con el receptor celular de
la transferrina (TfR). El TfR es una proteína transmembrana presente en todas las células del
organismo, a excepción de los eritrocitos maduros, y es responsable de la unión y transporte
del hierro circulante hacia el interior de las células (Skikne, 1998). Aunque el virus también
posee la capacidad de unirse a ácido siálico en la superficie de algunas células, esta propiedad
no parece ser importante para la infección viral ya que viriones mutantes para dicha capacidad
retienen la infectividad (Barbis et al., 1992). La internalización del virus en la célula se
produce mediante un proceso que implica vesículas de endocitosis recubiertas de clatrina. En
una etapa posterior del proceso, el virus puede ser encontrado en lisosomas, donde se cree que
el bajo pH es requerido para la infección o para el tráfico posterior del virión (Vihinen-Ranta
et al., 2004). A continuación, ocurre la penetración del virus al citosol, este es un proceso
lento y aún desconocido, no obstante, se piensa que estaría implicada la lisis de las vesículas
endosomales. El virión sería liberado en una localización perinuclear, donde posiblemente
ocurra la exposición sobre la superficie de la cápside, de los extremos N-terminales de las
proteínas VP1 y VP2, así como el extremo 3’ del genoma viral. Asimismo, existe evidencia
de que la cápside es alterada en el citosol por la actividad del proteosoma celular,
posiblemente generando la formación intracelular de la proteína VP3 (Vihinen-Ranta et al.,
2004). A posteriori, el virión es transportado desde el citosol hacia el núcleo mediante la
utilización de microtúbulos. La modificación de las proteínas de la cápside por el proteosoma
celular expone secuencias de localización nuclear (NLSs). Estas secuencias son necesarias
para el ingreso del virión al núcleo, por lo cual este último proceso es un fenómeno
específico, y activo ya que implica la utilización de ATP y factores citósolicos solubles
(Vihinen-Ranta et al., 2004).
- 14 -
El modelo consenso ilustrado en la figura 6 para la replicación del DNA de los
parvovirus se propuso a partir de los trabajos en MVM (Virus diminuto de ratón), un miembro
prototipo de los parvovirus autónomos. Sin embargo, aún existen pasos significantes que no
están claramente sustentados con evidencia experimental, por lo tanto, el modelo debe ser
considerado como un ejemplo de cómo los parvovirus autónomos pueden duplicar su genoma
generando intermediarios replicativos (Fields, 2006). Debido a que todas las DNA
polimerasas conocidas requieren un cebador con un 3’OH libre para comenzar con la síntesis,
y ésta ocurre en sentido 5’-3’, los genomas DNA han tenido que desarrollar distintas
estrategias para mantener su extremo 5’ intacto. Como se ha descrito, los genomas de los
parvovirus han desarrollado secuencias palindrómicas terminales que resultan indispensables
para una replicación exitosa (Fig. 6). Se asume que el extremo 3’ (izquierdo) se pliega sobre
sí mismo para servir como cebador en la iniciación de la síntesis de la hebra complementaria
(Berns, 1990). La síntesis del DNA complementario genera un intermediario replicativo doble
hebra (dsRF). Cuando la síntesis alcanza el extremo 5’ (derecho), que también se ha plegado
sobre sí mismo, se cree que ocurre una ligación entre la hebra complementaria recientemente
sintetizada y la hebra parental, resultando en una molécula doble hebra covalentemente
cerrada en ambos extremos (cRF). Subsecuentemente, la proteína viral NS1 corta la hebra
complementaria a unos 18-26 nts del extremo 5’ parental plegado, y se produce una unión
covalente entre dicha proteína y el extremo 5’ libre generado (Fields, 2006). Este hecho
origina un extremo 3’OH que es usado para reparar el extremo derecho generando una forma
dúplex extendida del mismo. Luego, el extremo derecho extendido forma un intermediario
doblemente plegado (configuración denominada orejas de conejo) que provee un nuevo 3’OH
libre para la reiniciación de la síntesis por desplazamiento de la hebra genómica. Esto
conduce a la formación de concatémeros (dímeros de dsRF), los cuales posteriormente son
resueltos en un dsRF con el extremo izquierdo covalentemente cerrado, y otro con ambos
extremos abiertos (Fig. 6). A continuación, este último provee la hebra negativa del virus a ser
encapsidada, mientras que la hebra positiva vuelve a sufrir replicación. A su vez, el dsRF con
el extremo izquierdo covalentemente cerrado vuelve a entrar en el proceso de replicación.
Cuando el genoma viral es encapsidado, las 18-26 bases 5’ terminales adicionales observadas
en los intermediarios replicativos se extienden hacia el exterior de la cápside para ser
subsecuentemente removidas (Berns, 1990).
- 15 -
Hairpin 3’
La DNA pol celular inicia la replicación utilizando el hairpin 3’ como cebador
A
f
3’
5’
Hairpin 5’
G
B
Vpar
a
A
F
E
Formación de la molécula doble hebra covalentemente
cerrada en ambos extremos (cRF)
NS1
e
C
f
E
F
Corte y unión de
NS1 a una
secuencia
específica
G
B
a
Vpar
Reiniciación de la síntesis de DNA
A
NS1
C
e
f
3’
B
G
Vpar
a
E
F
Reparación del extremo derecho
C
A
e
f
g
F
E
F
G
f
E
B
Vpar
a
f
Reiniciación de la síntesis de DNA
A
e NS1
g
e
F
C
B
NS1
Vpar
a
e
Formación de concatémeros y subsecuente resolución por corte y
unión de NS1
E
e
f
G F E
Vpar
a
f
F
NS1
NS1
Configuración
orejas de
conejo
G
NS1
B A
e
C
f
g
E
G
F g
F
C
A b
f
a
E F
Vprog
Resultado de la resolución
Vpar
aBA
C
Aba
E
e
g
e
Cadena que se
E encapsidará
f
NS1 e
F
f
Cadena que volverá a
sufrir el proceso de
replicación
Intermediario replicativo
que volverá a sufrir
proceso de replicación f
NS1
e
A
C
a
Vprog
G
F
E
e NS1
B
E
f
F
g
Figura 6. Modelo de replicación del genoma de MVM. Abreviaciones: ABa, palíndromo 3’ terminal de la hebra
parental del virión: FGf, palíndromo 5’ terminal de la hebra parental del virión; e, secuencia de 18-26 bases
presente en los intermediarios replicativos pero no en el DNA de viriones maduros; Vpar, hebra del virión
parental; Vprog, hebra del virión progenie; C, hebra complementaria.
- 16 -
Debido a que una o ambas proteínas NS son proteínas regulatorias, su síntesis parece
ocurrir primero que la de las proteínas estructurales. Una vez sintetizadas, estas proteínas
migran al núcleo para actuar en la regulación de la expresión génica viral, en la replicación
del genoma vírico y el empaquetamiento de los nuevos viriones. Al igual que éstas, las
proteínas estructurales, una vez traducidas en el citoplasma, deben migrar al núcleo para
participar en el ensamblaje de las nuevas partículas virales (Berns, 1990). Los viriones
emergen de la célula lisándola, lo que conduce al efecto citopático observado para las células
infectadas por este virus.
Además del requerimiento de la proteína viral NS1, se requieren otras proteínas
celulares auxiliares y la(s) DNA polimerasa(s) celular(es) para el ciclo replicativo de MVM.
Ensayos de inhibición indican que la DNA polimerasa α así como la DNA polimerasa γ
estarían involucradas en la replicación del genoma parvoviral, pero aún no se ha podido
determinar si la DNA polimerasa δ también estaría implicada (Berns, 1990).
2.8. Origen y evolución
U
El CPV-2 fue detectado por primera vez en 1978 en Estados Unidos, y casi
simultáneamente en Australia y Europa (Appel et al., 1978). Fue nombrado de esta forma
para diferenciarlo del CPV-1 (Parvovirus canino tipo 1) previamente descrito con el cual, a
pesar de compartir un cuadro clínico similar, no se encuentra evolutivamente relacionado
(Truyen, 2000). Pese a su primer reporte a fines de la década del 70, estudios serológicos
posteriores indicaron que el CPV-2 estaba presente en Europa en 1976 (Schwers et al., 1979).
Adicionalmente, Koptopoulos et al. (1986) reportó anticuerpos neutralizantes de CPV-2 en
sueros de canes de Grecia de 1974. Sin embargo, los autores remarcan que sus estudios
podrían haber detectado otros parvovirus relacionados, o quizá el ancestro de CPV-2. Por otro
lado, Shackelton et al. (2004) estimaron la tasa de evolución molecular del parvovirus canino
y sugirieron que el CPV-2 ancestral emergió en la población canina en 1968.
La hipótesis del origen de CPV-2 más aceptada propone la emergencia de éste a partir
de una variante del Virus de la panleucopenia felina (FPLV) o de un virus estrechamente
relacionado, como el Parvovirus del mapache (RPV) o Virus de la enteritis del visón (MEV).
Es probable que este virus haya infectado algún miembro de la familia Canidae, como lobos y
zorros, que actuaron como reservorio del ancestro de CPV-2 (Truyen et al., 1998).
La variante original denominada CPV-2 fue inicialmente caracterizada por
inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos contra FPLV (Appel et al., 1978), por lo cual
se presumió que correspondía a una variante de FPLV con la capacidad de infectar canes. El
- 17 -
análisis de la secuencia aminoacídica de la VP2 de este nuevo virus reveló que existían cinco
diferencias aminoacídicas (Lys-80-Arg, Lys-93-Asn, Asp-323-Asn, Asn-564-Ser, Ala-568Gly) con respecto a FPLV (Hueffer et al., 2003) (Tabla I). Los cambios en los residuos 93 y
323 serían los responsables del cambio en el rango de hospedero que permitió a CPV-2
infectar canes, por lo contrario, los cambios en los residuos 80, 564, y 568 habrían provocado
la incapacidad de infectar gatos (Hueffer et al., 2003).
En 1979 y 1980, se detectó la presencia de una nueva variante antigénica de CPV-2 en
varios países mediante ensayos con anticuerpos monoclonales, análisis con enzimas de
restricción, y secuenciación. Dicha variante fue denominada CPV-2a, y se diferencia de la
variante original (CPV-2) por seis cambios aminoacídicos (Met-87-Leu, Ile-101-Thr, Val103-Ala, Ala-300-Gly, Asp-305-Tyr, Val-555-Ile) en la secuencia proteica de VP2 (Martella
et al., 2006) (Tabla I).
En 1984 una segunda variante antigénica llamada CPV-2b, fue caracterizada por la
pérdida de un epítope neutralizante reconocido por anticuerpos monoclonales (MAbs)
utilizados en las tipificaciones. Dicha variante difiere de CPV-2a en dos aminoácidos (Asn426-Asp y Ile-555-Val) de la cadena proteica de VP2 (Parrish et al., 1991) (Tabla I). El
cambio en la posición 426 es el responsable de la pérdida del epítope neutralizante ya que
dicho aminoácido se encuentra expuesto en el sitio antigénico mayor (epítope A), localizado
en el eje de simetría 3 de la cápside icosaédrica viral (Nakamura et al., 2004). Por el
contrario, el cambio en la posición 555 representa una reversión o retención de la secuencia
de la variante original CPV-2.
En poco tiempo, CPV-2a y CPV-2b fueron reemplazando por completo al CPV-2
original a nivel mundial (Parrish et al., 1991). Además, las variantes antigénicas extendieron
su rango de hospedero ya que al contrario de la variante original, eran capaces de infectar
canes y gatos domésticos (Truyen et al., 1996), así como carnívoros salvajes, tales como el
tigre siberiano, el zorro orejas de murciélago, y el guepardo (Steinel et al., 2000). El rango de
hospedero felino de las nuevas variantes antigénicas CPV-2a y CPV-2b está probablemente
determinado por los cambios aminoacídicos en las posiciones 87, 300 y 305 (Steinel et al.,
2000).
Estudios recientes permitieron demostrar que el virus se encuentra en un activo
proceso de evolución. En los últimos años, la mayoría de las cepas de CPV-2a y CPV-2b que
se han aislado presentan la sustitución Ser-297-Ala en la proteína VP2, por lo cual han sido
clasificadas como CPV-2a y CPV-2b nuevas (Truyen, 1999; Ikeda et al., 2000; Buonavoglia
et al., 2001; Battilani et al., 2001; Battilani et al., 2002; Chinchkar et al., 2006). Asimismo,
- 18 -
estas nuevas variantes presentan Val en la posición 555 al igual que el FPLV y el CPV-2
original (Tabla I).
En el año 2000, se detectó en Italia una nueva variante antigénica, denominada CPV2c, la cual presenta Ala y Val en la posiciones 297 y 555 respectivamente, pero difiere de las
anteriores en el sitio antigénico mayor ya que presenta Glu en la posición 426 de la proteína
VP2 (Buonavoglia et al., 2001) (Tabla I). Dicha variante circula actualmente con CPV-2a y
CPV-2b en distintas partes del mundo ya que también ha sido detectada en Vietnam
(Nakamura et al., 2004), España (Decaro et al., 2006), Alemania (Decaro et al., 2007), Reino
Unido (Decaro et al., 2007), Estados Unidos (Hong et al., 2007), Portugal (Vieira et al.,
2008), Tunisia (Touihri et al., 2008) y Uruguay (Pérez et al., 2007). A pesar de haber sido
detectada en varios países del mundo, poco se sabe respecto a las propiedades biológicas de la
variante CPV-2c ya que ha sido escasamente estudiada en profundidad.
Posiciones aminoacídicas de VP2
VIRUS
80
87
93
101
103
297
300
305
323
426
555
564
568
FPLV
Lys
Met
Lys
Ile
Val
Ser
Ala
Asp
Asp
Asn
Val
Asn
Ala
CPV-2
Arg
Met
Asn
Ile
Val
Ser
Ala
Asp
Asn
Asn
Val
Ser
Gly
CPV-2a
Arg
Leu
Asn
Thr
Ala
Ser
Gly
Tyr
Asn
Asn
Ile
Ser
Gly
CPV-2b
Arg
Leu
Asn
Thr
Ala
Ser
Gly
Tyr
Asn
Asp
Val
Ser
Gly
Arg
Leu
Asn
Thr
Ala
Ala
Gly
Tyr
Asn
Asn
Val
Ser
Gly
Arg
Leu
Asn
Thr
Ala
Ala
Gly
Tyr
Asn
Asp
Val
Ser
Gly
Arg
Leu
Asn
Thr
Ala
Ala
Gly
Tyr
Asn
Glu
Val
Ser
Gly
CPV-2a
nueva
CPV-2b
nueva
CPV-2c
Tabla I. Posiciones aminoacídicas variables entre FPLV, CPV-2, y sus variantes (CPV-2a, CPV-2b, CPV-2a
nueva, CPV-2b nueva y CPV-2c).
La caracterización de las cepas circulantes en una determinada región es de gran
importancia para entender su epidemiología y virulencia, así como el impacto de la
vacunación y las estrategias de contención de la enfermedad. Asimismo, la tipificación de las
variantes presentes, así como el análisis de los cambios existentes entre ellas es
imprescindible para el estudio de la evolución del virus. Los virus DNA usualmente poseen
una tasa de evolución relativamente baja, sin embargo el CPV-2 presenta una tasa de cambio
muy elevada, más parecida a la de los virus RNA (Shackelton et al., 2005). Esto puede
explicar la rápida y constante evolución de CPV-2 observada durante su corta historia desde
su primera descripción en 1978.
- 19 -
Los estudios evolutivos indican claramente que el CPV-2 cambia por la adquisición de
mutaciones puntuales, particularmente en los genes de las proteínas de cápside. Éste
constituye el mecanismo típico de variación del CPV-2 hasta ahora estudiado. No obstante,
nosotros proponemos que también existen cambios en el número de secuencias repetidas
dentro del genoma parvoviral. Analizando secuencias repetidas del extremo 5’ de cepas de
parvovirus de los últimos años, hemos observado que existe variación en el número de
monómeros en el primer grupo de repetidos mencionado anteriormente (Fig. 3). Presumimos
que una variación similar podría estar ocurriendo en el segundo grupo de repetidos por lo que
proponemos analizarlos en el presente estudio.
- 20 -
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general:
U
•
U
Analizar la variabilidad del parvovirus canino en Uruguay.
3.2. Objetivos puntuales:
U
•
U
Detectar y caracterizar muestras de parvovirus canino colectadas durante el año 2007
en el Uruguay.
•
Analizar la región del genoma que incluye el segundo grupo de repetidos
anteriormente mencionado en muestras de campo y vacunales.
•
El aprendizaje de técnicas moleculares básicas como:
ƒ
La PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).
ƒ
La técnica de RFLP (Análisis del Polimorfismo en el Largo del
Fragmento de Restricción)
ƒ
•
La clonación de fragmentos de DNA.
El aprendizaje del manejo de programas bioinformáticos que permiten el análisis de
secuencias de DNA.
- 21 -
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Detección y caracterización de las cepas de parvovirus canino presentes
U
en Uruguay
4.1.1. Obtención de las muestras
Se analizaron 47 muestras de materia fecal de canes presuntamente infectados con
parvovirus provistas por veterinarias de distintas partes del país durante el año 2007 (Tabla
II). En general son remitidas muestras de cachorros con gastroenteritis hemorrágica, ya que
esta sintomatología se asocia usualmente con la presencia de parvovirosis.
Nº
Sintomatología
Edad
Vacunación
Procedencia
56
57
58
60
61
62
64
65
67
68
69
70
71
72
76
77
78
79
80
82
83
84
85
86
87
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
Gastroenteritis hemorrágica.
Gastroenteritis. Anorexia. Fiebre. Depresión
Fiebre. Vómitos. Decaimiento
DND
Gastroenteritis. Depresión
Gastroenteritis hemorrágica.
Gastroenteritis hemorrágica.
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis. Vómitos
Gastroenteritis. Vómitos
Gastroenteritis hemorrágica.
Gastroenteritis hemorrágica.
Gastroenteritis hemorrágica.
Inflamación anal. Fiebre
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica.
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis. Vómitos
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis
Gastroenteritis
Gastroenteritis. Vómitos
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis
4 meses
3 meses
3 meses
DND
8 meses
10 meses
2 meses
6 meses
6 meses
DND
DND
3 años
7 meses
4 meses
2 meses
9 meses
7 meses
2 meses
DND
5 meses
3 años
4 meses
3 meses
5 meses
5 meses
6 meses
22 meses
18 meses
3 meses
40 días
9 meses
7 meses
35 días
3 meses
21 meses
Sin vacunas
3 dosis
2 dosis
DND
3 dosis
3 dosis
Sin vacunas
3 dosis
3 dosis
1 dosis
3 dosis
Sin vacunas
Sin vacunas
4 dosis
3 dosis
DND
3 dosis
Sin vacunas
Sin vacunas
2 dosis
1 dosis
3 dosis
2 dosis
2 dosis
2 dosis
4 dosis
2 dosis
Sin vacunas
Sin vacunas
Sin vacunas
3 dosis
3 dosis
Sin vacunas
Sin vacunas
4 dosis
Montevideo
Canelones
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Lavalleja
Canelones
Canelones
Montevideo
Canelones
Canelones
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Canelones
Montevideo
Canelones
Montevideo
Maldonado
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Maldonado
Maldonado
Maldonado
Montevideo
DND
Lavalleja
Maldonado
Maldonado
Montevideo
Canelones
Maldonado
Montevideo
DND
- 22 -
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
Gastroenteritis hemorrágica.
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis
Gastroenteritis hemorrágica
DND
DND
DND
DND
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis hemorrágica
Gastroenteritis
DND
7 meses
6 años
3 meses
2 meses
DND
DND
DND
4 meses
DND
3 meses
3 meses
DND
Sin vacunas
Vacunado*
2 dosis
2 dosis
Sin vacunas
Sin vacunas
Sin vacunas
Sin vacunas
2 dosis
2 dosis
2 dosis
Vacunado*
Canelones
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Canelones
Montevideo
Canelones
Montevideo
Montevideo
San José
Tabla II. Muestras empleadas en la presente pasantía. Se indica número de las muestras, sintomatología, edad y
vacunación de los canes, así como la procedencia de los mismos. Las muestras sombreadas corresponden a
aquellas que resultaron positivas para CPV-2. DND: Dato no disponible. *Sin información sobre cantidad de
dosis.
4.1.2. Extracción de DNA
La extracción del genoma viral a partir de materia fecal se realizó utilizando una
modificación del método de “fast boiling” descrito anteriormente por Schunk et al. (1995). La
técnica utilizada consistió en homogeneizar 0,1 g de materia fecal en 1 mL de PBS, hervir el
homogeneizado durante 10 minutos para romper las células y partículas virales presentes, y
enfriar en hielo por 5 minutos para inhibir posibles reacciones de enzimas presentes en la
muestra. Luego, los remanentes celulares y contaminantes se precipitaron por medio de una
centrifugación del homogeneizado a 3000 rpm durante 20 minutos. A continuación se extrajo
el sobrenadante con el DNA viral y se almacenó a -20º C para su posterior amplificación por
PCR.
4.1.3. PCR
La detección del virus en las muestras se realizó amplificando mediante PCR un
fragmento de 1316 pares de bases de la proteína estructural VP2. Los cebadores utilizados
fueron previamente diseñados en nuestro laboratorio y se detallan en la tabla III.
Cebador
Secuencia
Posición
F1Forward
AGATAGTAATAATACTATGCCATTT
3316 - 3340
R3Reverse
CCTATATCAAATACAAGTACAATA
4609 - 4632
Tabla III. Cebadores utilizados en la amplificación del fragmento de 1316 nts. Se indica nombre, secuencia en
sentido 5’-3’, y la posición del genoma en la que hibrida cada uno de ellos.
- 23 -
Para la amplificación de las muestras se preparó, una mezcla de reacción de 20 μL con
los reactivos que se detallan en la tabla IV. La PCR se realizó en un termociclador Perkin
Elmer modelo 2400 utilizando el programa de ciclado detallado en la tabla V.
Reactivo
Concentración inicial
Concentración final
Volumen utilizado
Buffer de la Taq pol
10 X
1X
2 μL
MgCl2
25 Mm
2 mM
1,6 μL
Mezcla de dNTPs
10 μM
0,2 μM
0,4 μL
Cebador F1forward
10 μM
1 μM
2 μL
Cebador R3 reverse
10 μM
1 μM
2 μL
5 U/μL
0,3 U/μL
0,12 μL
_
_
2 μL
_
_
Csp 20 μL
Taq pol (Fermentas
Inc. Hanover, MD)
DNA dilución 1:10
Agua bidestilada
estéril
Tabla IV. Reactivos y cantidades de los mismos utilizadas en la amplificación del fragmento de 1316 nts
(amplicón F1for/R3rev). Se indica la concentración inicial y final de los reactivos, así como el volumen utilizado
para cada uno de ellos. Csp: cantidad suficiente para.
30 ciclos
Etapa
Temperatura
Duración
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
Apareamiento
Elongación
Elongación final
94ºC
94ºC
42ºC
72ºC
72ºC
10 minutos
30 segundos
1 minuto
1 minuto
10 minutos
Tabla V. Programa de ciclado utilizado para la amplificación del fragmento de 1316 nts. Se describen las etapas
con sus respectivas temperaturas y duraciones, así como la cantidad de ciclos.
Los productos de PCR (5 µl) fueron corridos en un gel de agarosa al 0,8 % teñido con
bromuro de etidio (concentración final de 0,6 µg/µL) y visualizados en un transiluminador
con luz UV.
4.1.4. RFLP
La caracterización de las muestras de campo se llevó a cabo mediante el análisis del
tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP). El patrón de restricción se generó con la
enzima MboII (Fermentas) que reconoce la secuencia específica GAAGA.
La digestión del amplicón de las cepas CPV-2/2a/2b con dicha enzima genera dos
fragmentos de 703 y 612 pb con sitio de restricción en la posición 4006-4010 nts. Por otro
- 24 -
lado, el cambio nucleotídico T→A en la posición 4062 presente en la variante 2c (que
produce el cambio al residuo Glu en la posición 426 de la proteína VP2) origina un sitio de
restricción adicional para la enzima MboII, produciéndose dos cortes que generan tres
fragmentos de 703, 56 y 556 pb (Fig. 7).
CPV-2/2a/2b
703 pb
612 pb
703 pb
CPV-2c
556 pb
56 pb
Figura 7. Patrón de RFLP de las variantes CPV-2/2a/2b y de la variante 2c. Los sitios de corte de la enzima de
restricción MboII se representan con las flechas verticales. Las diferencias son producidas por la presencia de un
sitio de restricción adicional en la variante 2c.
En la digestión se utilizaron los reactivos y cantidades de los mismos detallados en la
tabla VI, la reacción fue incubada durante 2 horas a 37ºC. A continuación, los productos de la
digestión fueron analizados en geles de agarosa al 1,5 % teñidos con bromuro de etidio
(concentración final de 0,6 μg/μL) en un transiluminador con luz UV para determinar el
patrón de restricción de cada muestra.
Reactivo
Volumen (μL)
Producto de PCR
15,0
Buffer de la enzima (B) (Fermentas)
1,5
MboII (Fermentas)
0,6
Agua (Gibco)
12,9
Volumen total
30,0
Tabla VI. Reactivos y sus correspondientes volúmenes empleados en la reacción de restricción (RFLP).
4.2. Análisis de la región del segundo grupo de repetidos
U
Con el objetivo de caracterizar la región del segundo grupo de repetidos en las
muestras de campo, se diseñaron cebadores para amplificar dicha región.
4.2.1. Diseño de cebadores
El diseño de los cebadores que amplifican el fragmento que incluye el segundo grupo
de repetidos se realizó a partir de un alineamiento efectuado con el programa Clustal W del
- 25 -
BioEdit, en el mismo se utilizaron secuencias tomadas de la base de datos GenBank del
Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI). A continuación, utilizando la
herramienta Oligo Analizer 3.0 de Integrated DNA Technologies, se realizaron los cálculos de
temperaturas de melting (Tm) y contenido GC, así como se evaluó que no hubiese formación
de estructuras secundarias y dímeros. Los cebadores diseñados se detallan en la tabla VII, los
mismos amplifican un fragmento que abarca 365 pares de bases.
Cebador
Secuencia
Posición
REP forward
GCATAGAAATATTGTACTTG
4660 - 4679
REP reverse
GACAGTATACGAGGCCATTTAG
5004 - 5025
Tabla VII. Cebadores utilizados en la amplificación del fragmento de 365 nts que incluye el segundo grupo de
repetidos. Se indica nombre, secuencia en sentido 5’-3’, y la posición en el genoma en la que hibrida cada uno de
ellos. Las posiciones de hibridación están referidas a la secuencia de la cepa de referencia con número de acceso
M19296 a la base de datos GenBank.
4.2.2. Cepas de campo
Se utilizaron cinco cepas de campo (4 CPV-2c y 1 CPV-2a) caracterizadas en nuestro
laboratorio (Tabla VIII). Las muestras M6, M12 y M47 habían sido previamente tipificadas
por el grupo de investigación, las muestras M52 y M120 fueron caracterizadas como CPV-2c
en la presente pasantía.
Número de
Caracterización
Nº de acceso
muestra
M6
CPV-2a
EF375482
M12
CPV-2c
EF375479
M47
CPV-2c
No submitidas
M52
CPV-2c
No submitidas
M120
CPV-2c
No submitidas
Tabla VIII. Muestras de campo
utilizadas para el análisis de la
secuencia nucleotídica de la región que
contiene el segundo grupo de repetidos.
Se indica número y variante a la que
pertenece cada una, así como el
número de acceso a la base de datos
GenBank de las muestras que han sido
submitidas a la misma.
4.2.3. Cepas vacunales
También se utilizaron con fines comparativos cepas vacunales CPV-2, 2a y 2b,
incluidas en la formulación de las vacunas PDog, Vplus5 y DA2PPVL, respectivamente.
4.2.4. Extracción de DNA vacunal
Para la extracción del genoma viral a partir de las vacunas se resuspendió el material
liofilizado de las mismas en 1 mL de PBS para luego proseguir con el protocolo utilizado para
las muestras de campo.
- 26 -
4.2.5. PCR
La amplificación del fragmento que incluye el segundo grupo de repetidos se realizó
en un volumen final de reacción de 10 μL con los reactivos que se detallan en la tabla IX, la
secuencia y posición de hibridación de los cebadores utilizados en la misma se especifican en
la tabla VII. Se utilizó el mismo programa de ciclado en el termociclador usado para el
diagnóstico de CPV-2, excepto por la etapa de apareamiento, que se realiza en este caso a una
temperatura de 52ºC.
Reactivo
Concentración inicial
Concentración final
Volumen utilizado
Buffer de la Taq pol
10 X
1X
1 μL
MgCl2
25 mM
2 mM
0,8 μL
Mezcla de dNTPs
10 μM
0,2 μM
0,2 μL
Primer REP forward
10 μM
1 μM
1 μL
Primer REP reverse
10 μM
1 μM
1 μL
5 U/μL
0,3 U/μL
0,06 μL
_
_
1 μL
_
_
Csp 10 μL
Taq pol (Fermentas
Inc. Hanover, MD)
DNA dilución 1:10
Agua bidestilada
estéril
Tabla IX. Reactivos y cantidades de los mismos utilizadas en la amplificación del fragmento de 365nts
(amplicón REPfor/REPrev) que incluye el segundo grupo de repetidos. Se indica la concentración inicial y final
de los reactivos, así como el volumen utilizado para cada uno de ellos. Csp: cantidad suficiente para.
Luego, los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 0,8 % teñidos
con bromuro de etidio (concentración final de 0,6 μg/μL) en un transiluminador con luz UV.
4.2.6. Clonación
La clonación de los amplicones de las muestras detalladas en la tabla VIII se realizó
mediante el kit de clonación “GeneJet PCR Product Cloning kit” de FermentasTM utilizando
células de E. coli XL1 Blue competentes (Ver Anexo I: Protocolos).
Las bacterias que no adquieren el plásmido pJET1/blunt (Fig. 8), no sobreviven en la
placa LB agar ampicilina debido a que el plásmido es el responsable de conferir la resistencia
al antibiótico. Asimismo, sólo las colonias transformadas con el plásmido que contiene un
inserto se desarrollarán en la placa de petri, esto es así porque el plásmido pJET1/blunt posee
un gen que se expresa como letal en las colonias que no contienen el inserto.
- 27 -
Figura 8. Esquema del vector de clonación pJET1/blunt.
Para revelar la presencia del fragmento de interés en las colonias transformadas, se
realizó un “screening” por PCR empleando las mismos reactivos y cantidades utilizados para
la amplificación de las muestras, excepto por la aplicación directa de las colonias para obtener
el DNA molde. Asimismo, se incrementó el tiempo de desnaturalización inicial con el
objetivo de lisar completamente las bacterias dejando libre el DNA molde. Luego, los
productos fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 0,8 % teñidos con bromuro
de etidio y observados bajo luz UV.
A seguir, los clones positivos fueron extraídos de la placa LB agar ampicilina para ser
crecidos en 3 mL de medio LB líquido con 1,5 μL de ampicilina (200 mg/mL). Los clones se
incubaron a 37 ºC toda la noche en agitador a 200 rpm con el fin de extraer posteriormente el
DNA plasmídico de los mismos.
4.2.7. Extracción de DNA plasmídico
La extracción del DNA plasmídico de los clones positivos se efectuó mediante
“Minipreps” a través de la técnica fenol-cloroformo modificada de Sambrook (ver Anexo I:
Protocolos). La presencia del inserto en los minipreps obtenidos fue confirmada mediante la
realización de una nueva reacción de PCR utilizando diluciones de los minipreps. Se trabajó
utilizando el mismo programa de ciclado y cantidades de reactivos usados en el “screening”.
Luego, se procedió a visualizar en un transiluminador los productos de PCR mediante
electroforesis en geles de agarosa al 0,8 % teñidos con bromuro de etidio.
Los minipreps positivos para la PCR fueron cuantificados en gel de agarosa al 0,8 %
mediante comparación de intensidad de bandas con un miniprep de concentración conocida
para su posterior secuenciación.
- 28 -
4.2.8. Secuenciación
La secuenciación de los productos clonados se realizó en forma automática mediante
un secuenciador ABI prism 377 – Perkin Elmer Automated Sequencer, empleando cebadores
específicos del vector (pJET1f y pJET1r).
Los cromatogramas de las secuencias fueron revisados y editados utilizando el
programa SeqMan 4.00 (DNASTAR Inc).
4.2.9. Análisis comparativo de los repetidos
Mediante la aplicación del algoritmo BlastN (Basic Local Alignment Search Toolnucleotide) se buscaron secuencias similares en la base de datos GenBank, utilizando como
secuencia “query” (consulta) la primera unidad de repetición del segundo grupo de repetidos
de la cepa de referencia de CPV-2 con número de acceso M19296. Luego, se realizó un
alineamiento de la secuencia de referencia M19296, las secuencias obtenidas en el BlastN, y
las muestras clonadas aplicando el programa Clustal W del BioEdit.
- 29 -
5. RESULTADOS
5.1. Detección y caracterización del virus en las muestras
U
5.1.1. Detección del virus
Mediante PCR se obtuvo el amplicón de 1316 pb del gen de la proteína VP2 de CPV-2
(Fig. 9) en 34 de las 47 muestras analizadas (Tabla II).
1
2
1500
3
4
5
6
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8
% de los amplicones F1for/R3rev. 1- Marcador
de peso molecular. 2- M104. 3- M105. 4- M106.
5- M107. 6- M108.
1316
850
5.1.2. RFLP
Los amplicones obtenidos fueron caracterizados mediante RFLP a fin de determinar la
variante de CPV-2 a la que correspondían (Fig. 10). El patrón de restricción obtenido indica
que todas las muestras pertenecían a la variante 2c. No se detectó la presencia de muestras de
campo de tipo CPV-2, CPV-2a o CPV-2b.
1
2
703
703
3
4
1316
612
556
Figura 10. RFLP. Electroforesis en gel de
agarosa al 1,5 % de los productos de PCR
digeridos con la enzima de restricción MboII.
1- M6 (EF375482): muestra de campo tipo
2a utilizada como referencia. 2- M12
(EF37547): muestra de campo tipo 2c
utilizada como referencia. 3- M92. 4- M93.
El fragmento de 56 pb generado en la
digestión de la variante tipo 2c no se muestra
en el gel.
703
703
5.2. Análisis de la región del segundo grupo de repetidos
U
5.2.1. PCR
Se amplificó un fragmento que abarca el segundo grupo de repetidos presente en el
8B
genoma de CPV-2, con el fin de comparar el tamaño de los amplicones obtenidos en las
variantes de CPV-2 existentes en Uruguay. Comprobamos que el amplicón de la cepa
utilizada en la vacuna PDog, la cual corresponde a CPV-2 (M19296) y de la cual sabemos que
- 30 -
tiene tres monómeros de repetición, es de mayor tamaño que en las cepas de campo uruguayas
y en las vacunales Vplus5 (CPV-2a) y DA2PPVL (CPV-2b) (Fig. 11 y 12).
1
2
3
4
5
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa
al 0,8% de los amplicones REPfor/REPrev.
1- M6. 2- M12. 3- Vacuna PDog (CPV-2).
4- M52. 5- Control negativo (sin DNA).
365
1
2
3
4
5
Figura 12. Electroforesis en gel de
agarosa al 0,8% de los amplicones
REPfor/REPrev. 1- M6. 2- M12. 3Control negativo (sin DNA). 4- Vplus5
(CPV-2a). 5- DA2PPVL (CPV-2b).
5.2.2. Clonación
Los amplicones de las muestras de campo de la tabla VIII fueron clonados. A través
del “screening” por PCR se determinó cuales colonias habían sido transformadas con el
amplicón de interés (Fig. 13).
1
2
3
4
5
6
7
Figura 13. “Screening” de colonias de
M12. 1- Control negativo (sin DNA). 2Control positivo (M12). 3- Colonia 1 de
M12. 4- Colonia 2 M12. 5- Colonia 3 de
M12. 6- Colonia 4 de M12. 7- Colonia 5 de
M12.
Luego de la extracción del DNA plasmídico de las colonias que presentaban el
fragmento de interés, se realizó una nueva amplificación por PCR con el fin de verificar que
el plásmido purificado contenía efectivamente el amplicón REPfor/REPrev (Fig. 14), él que
posteriormente se envió a secuenciar.
1
2
3
4
5
6
Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa al
0,8 % de los amplicones REPfor/REPrev de los
minipreps obtenidos. 1- Control positivo (M6).
2- Colonia 3 de M6. 3- Colonia 2 de M12. 4Colonia 7 de M47. 5- Colonia 11 de M52. 6Colonia 3 de M120.
- 31 -
5.2.3. Secuenciación
El análisis de las secuencias de los amplicones clonados nos permitió constatar que las
cinco muestras efectivamente poseen un solo monómero de repetición (Fig. 15).
Figura 15. Análisis de las secuencias clonadas empleando el programa Seqman. Se muestra el cromatograma
de la secuencia de M6. El primer monómero de repetido abarca desde 4702-4764 y se encuentra en todas las
secuencias. Notar que los otros dos monómeros (4765-4826 y 4827-4888) están presentes en la cepa M19296
(CPV-2) pero no existen en los amplicones de las muestras uruguayas. Se simboliza con un guión las bases
ausentes
5.2.4. Análisis comparativo de los repetidos
Utilizando como query un monómero del segundo grupo de repetidos de la secuencia
M19296 en el algoritmo BlastN, se obtuvieron secuencias de distintos parvovirus (CPV-2,
- 32 -
FPLV, MEV y RPV) procedentes de varias partes del mundo (EEUU, Australia, Japón, Rusia
y China) y distintos años (1984 – 2007) (Tabla X). Se obtuvieron 21 secuencias, entre ellas la
propia secuencia utilizada como “query” que posee tres unidades de repetición, 19 secuencias
con un único monómero correspondiente al tercer monómero de M19296, y una secuencia
que posee dos monómeros (Fig. 16, Tabla X). La secuencia única (M10824) con dos unidades
de repetición posee la primer unidad con la última base deleteada, y una deleción de 10 bases
iniciales de la segunda unidad, la misma pertenece a FPLV y corresponde al año 1985 (Fig.
16, Tabla X).
Nº Acceso
Año
País
Virus
1er
monómero
2do monómero
M10989
1984
EEUU
CPV-2
Ausente
Ausente
M10824
1985
EEUU
FPLV
Ausente
Presente
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1989
1990
1990
1990
1991
1993
2004
2004
2004
2006
2007
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
EEUU
Australia
Japón
Japón
Rusia
Rusia
Rusia
China
China
CPV-2
CPV-2
MEV-1
CPV-2a
MEV-2
FPLV
CPV-2a
FPLV
RPV
CPV-2
FPLV
FPLV
MEV
MEV
FPLV
MEV
MEV
CPV-2a
MEV
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
ausente
M19296
M23255
M23999
M24000
M24001
M24002
M24003
M24004
M24005
M38245
M38246
X55115
D00765
D26079
AY665655
AY665656
AY665657
EF011664
EF428258
U
U
3er
monómero
Presente
Presente, deleción
de las 10 pb iniciales
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Tabla X. Secuencias obtenidas a partir del blastN utilizando como query el primer monómero del segundo
grupo de repetidos de la cepa de referencia CPV-2 con número de acceso M19296. Se indica el virus, el número
de acceso en la base de datos GenBank, año, país de procedencia y ausencia o presencia de cada monómero de
repetición del segundo grupo de repetidos. CPV-2: Parvovirus canino tipo 2; FPLV: Virus de la panleukopenia
felina; MEV: Virus de la enteritis del visón; RPV: Parvovirus del mapache. La secuencia utilizada como “query”
se subraya.
- 33 -
M19296
M6
M12
M47
M52
M120
AY665655
AY665656
AY665657
D00765
D26079
EF011664
EF428258
M10824
M10989
M23255
M23999
M24000
M24001
M24002
M24003
M24004
M24005
M38245
M38246
X55115
GTTTGTTAGATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAGGTTTGTTAGATGGTATACA
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACA
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
M19296
M6
M12
M47
M52
M120
AY665655
AY665656
AY665657
D00765
D26079
EF011664
EF428258
M10824
M10989
M23255
M23999
M24000
M24001
M24002
M24003
M24004
M24005
M38245
M38246
X55115
ATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAGGTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTGTATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
ATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATGGTTAGTA-----------TGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
-------------------------------------------GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGA
M19296
M6
M12
M47
M52
M120
AY665655
AY665656
AY665657
D00765
D26079
EF011664
EF428258
M10824
M10989
M23255
M23999
M24000
M24001
M24002
M24003
M24004
M24005
M38245
M38246
X55115
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATGGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATGGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
Figura 16. Alineamiento del segundo grupo de
repetidos realizado con el programa Clustal W del
BioEdit. Se incluyen la cepa de referencia de
CPV-2 (M19296) con tres monómeros de
repetición, así como las muestras clonadas en
estudio (M6, M12, M47, M52 y M120) y las
muestras obtenidas a partir del BlastN (Tabla X).
Notar que ninguna secuencia a excepción de
M19296 presenta los tres monómeros. Todas las
secuencias presentan el tercer monómero.
Solamente la secuencia M10824 posee dos
monómeros, presentando la última base del
primero y las 10 bases iniciales del segundo
monómero deleteadas. Se señala los sitios
variables.
- 34 -
M19296:
GTTTGTTAGATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG (1er monómero)
GTTTGTTAGATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG (2do monómero)
GTTTGTTAT ATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG (3er monómero)
M6:
GTTTGTTGTATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
M47:
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
M52:
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
M12:
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
P120:
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
AY665655, AY665656, AY665657, D26079, EF011664, EF428258, M10989, M23255, M23999, M24000,
M24001, M24002, M24003, M24004, M24005, M38245, M38246, X55115*:
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAG
D00765:
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATGGTTAGTAG
M10824:
GTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATGGTTAGTA_
_____________TGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATGGTTAGTAG
Figura 17. Esquema de las secuencias del segundo grupo de repetidos. Indicado con la fecha roja el sitio
informativo que sugiere que los monómeros corresponden al tercero. Con las estrellas se indican los sitios que
varían, y se colorean los correspondientes nucleótidos. Los sitios con deleciones se muestran con un guión.
*Para simplificar las secuencias idénticas se muestran como una sola.
La comparación de los monómeros (Fig. 17) parece indicar que el único monómero
presente en las secuencias clonadas y las obtenidas del GenBank, y el primer monómero de
M10824, corresponde al último de los tres de M19296. Esto se basa en la presencia de una T
en la novena posición (Fig. 17, flecha) en todas las secuencias con un único monómero y en el
tercer monómero de la secuencia M19296. Asimismo, constatamos que el monómero presenta
un bajo nivel de variación, observándose diferencias en solamente dos posiciones (Fig. 17,
estrellas) y que las mismas corresponden a transiciones.
- 35 -
6. DISCUSIÓN
89B
En la presente tesina se utilizó la técnica de PCR para la detección del parvovirus
canino en muestras de perros presuntamente afectados con parvovirosis. Otros métodos de
diagnóstico utilizados rutinariamente en nuestro país se basan en la detección de partículas
virales o anticuerpos anti-CPV-2. Los mismos presentan la desventaja de poseer menor
sensibilidad ya que requieren grandes cantidades de virus o anticuerpos. Adicionalmente, en
el caso de las técnicas que detectan partículas virales, la presencia de anticuerpos anti-CPV-2
en las muestras puede interferir en el resultado generando muchas veces falsos negativos. Si
bien la técnica de PCR demanda equipamiento y personal especializado, cabe destacar que
presenta un costo semejante a los de otras técnicas de laboratorio utilizadas en el diagnóstico
del parvovirus canino, siendo además muy eficaz, sensible e informativa.
En nuestro estudio la detección de CPV-2 en 34 muestras de las 47 analizadas (72,3
%) indica que la mayoría de los casos de gastroenteritis hemorrágica en cachorros son
causados por el CPV-2. El porcentaje restante de casos de gastroenteritis que resultaron
negativos para CPV-2, probablemente se debieron a otros patógenos o a complicaciones
vinculadas a la dieta y/o manejo del animal.
El trabajo aquí presentado también implicó la determinación de las variantes presentes
en las muestras de parvovirus del año 2007. La caracterización de las variantes virales
circulantes en una región dada es de gran importancia a la hora de entender varios aspectos
referentes a la evolución del virus, incluyendo su origen, distribución y relación con las cepas
de países vecinos. Dentro de la secuencia de la proteína mayoritaria de la cápside VP2 existen
cerca de cinco diferencias aminoacídicas entre CPV-2 y las demás variantes antigénicas (tipos
2a, 2b y 2c), y cerca de dos entre las variantes mismas. Sin embargo, la clasificación de las
variantes antigénicas se basa principalmente en la identidad del aminoácido presente en la
posición 426 de la proteína de la cápside VP2. El aminoácido puede ser asparagina, o
aspartato, o glutamato para las variantes antigénicas CPV-2a, CPV-2b, y CPV-2c,
respectivamente (Martella et al., 2006). Dicha diferencia genera un epítope mayor o epítope A
típico de cada variante que es reconocido por paneles distintos de anticuerpos monoclonales
específicos. No obstante, nosotros no utilizamos técnicas serológicas para tipificar las
variantes de CPV-2, sino que se empleó la técnica PCR-RFLP. La misma permite establecer
la presencia de glutamato en la posición 426 de la VP2, característico de la variante 2c, ya que
el codón de dicho aminoácido es parte de un sitio de corte para la enzima de restricción MboII
utilizada en el RFLP.
- 36 -
Durante el año 2006, nuestro laboratorio reportó 24 muestras tipo 2c y solamente una
tipo 2a (Pérez et al., 2007). Por lo tanto, aunque no existían estudios previos sobre los
genotipos que circulaban anteriormente al año 2006 en el Uruguay, podríamos presumir que
la variante CPV-2c estaba reemplazando completamente a otras variantes previas, entre las
cuales posiblemente se encontraba la variante 2a detectada. Este resultado previo se ve
confirmado con los datos presentados en esta tesina. Todas las muestras positivas aquí
identificadas correspondieron a CPV-2c, lo cual sugiere que esta variante sería la única que
actualmente se encuentra circulando en nuestro territorio. Uruguay se constituye en el único
país del mundo donde la variante 2c alcanza una proporción del 100% (Fig. 18). Estos
resultados nos están indicando que nuestro país puede ser considerado un paradigma de cómo
una variante es capaz de surgir en una población y reemplazar totalmente a las anteriores
variantes establecidas. Debido a que CPV-2c fue reportada por primera vez en Italia en el año
2000 (Buonavoglia et al., 2006), la presencia de dicha variante en las muestras de canes
uruguayos demuestra no sólo su alta capacidad de reemplazo sino también el corto tiempo que
requirió para hacerlo. Este hecho se ve confirmado por el análisis de las frecuencias a nivel
mundial (Fig. 18) donde se observa claramente que dicha variante se ha dispersado y
alcanzado una importante prevalencia en todos los continentes, excepto Oceanía.
Figura 18. Porcentajes observados de CPV-2c en los países donde fue detectada y analizada su frecuencia.
Referencias: (1) Nakamura et al., 2004; (2) Kapil et al., 2007; (3) Viera et al., 2008; (4) Touihri et al., 2008; (5)
Decaro et al., 2007.
- 37 -
La caracterización de las variantes circulantes en un determinado territorio no sólo
tiene importancia para el estudio evolutivo del virus, sino también para el estudio del impacto
que tiene la vacunación, la producción de vacunas, el esquema de vacunación y las estrategias
de control a ser seguidas, así como para estudiar su virulencia y epidemiología. Usualmente
los países en vías de desarrollo que no cuentan con datos de las variantes circulantes en su
territorio, se ven obligados a extrapolar la información de países que sí han caracterizado sus
genotipos, consecuentemente, muchas veces las vacunas a la que se recurre pueden no ser
efectivas contra la variante circulante en el país. Las cepas vacunales poseen determinados
antígenos que son reconocidos por anticuerpos específicos. Por esta razón, si los canes son
inmunizados con vacunas que no contienen las variantes circulantes de la región, es posible
que los mismos no estén adecuadamente protegidos. Debido a que algunos de los canes
infectados con CPV-2c en el presente estudio habían sido inmunizados, podemos suponer que
las vacunas utilizadas actualmente en nuestro territorio, que no contienen la variante 2c, son
ineficientes en cuanto a la protección contra la enfermedad. No obstante, no se puede
descartar la posibilidad de que la falla de la vacunación se deba a su administración
incorrecta, y no porque la cepa vacunal no proporcione protección contra la enfermedad. Esto
puede ocurrir si, por ejemplo, se vacuna a los cachorros cuando aún poseen anticuerpos antiCPV-2 adquiridos pasivamente a través de la madre, los cuales pueden unirse a los antígenos
virales vacunales y prevenir o disminuir la respuesta inmune que debería producirse. Por otro
lado, podemos hipotetizar que la falla de la vacunación pueda deberse a que los animales
hayan sido infectados con el virus poco tiempo antes de la vacunación, de manera que no
hayan podido desarrollar inmunidad a tiempo que proteja contra la enfermedad.
Desafortunadamente no contamos con información que pueda esclarecer estas dudas y que
demuestren si las vacunas que se usan actualmente en nuestro país ofrecen, o no, protección
contra la cepa CPV-2c. Varios trabajos presentados en otros países han planteado la necesidad
de desarrollar vacunas que contengan las variantes que circulan actualmente en la población
canina (Cavalli et al., 2008; Decaro et al., 2008). No obstante, otros trabajos indican que las
vacunas basadas en la cepa CPV-2 original y las variantes CPV-2a y CPV-2b utilizadas hoy
en día son efectivas contra la nueva variante CPV-2c (Spibey et al., 2008). Lo claro es que se
necesitarán estudios más exhaustivos de reactividad cruzada de las vacunas vigentes con las
variantes que actualmente circulan para esclarecer esta disyuntiva.
Como se indicó previamente, los numerosos estudios evolutivos en CPV-2 que se han
llevado a cabo indican que el virus ha evolucionado por la adquisición y fijación de
mutaciones puntuales, fundamentalmente en los genes de las proteínas de la cápside (Hoelzer
et al., 2008). No obstante, en el presente trabajo planteamos otro tipo de evolución a la que
- 38 -
estaría también sometido CPV-2, que implicaría variación en el número de repeticiones en el
genoma viral. Como se describió en la introducción, la cepa de referencia de CPV-2
(M19296) que data del año 1988, presenta dos grupos de repeticiones hacia el extremo 5’ del
genoma parvoviral (Reed et al., 1988) (Fig. 3). El primero compuesto por dos monómeros de
repetición, de 61 y 62 nucleótidos, respectivamente. El segundo grupo de repetidos está
compuesto por tres monómeros de secuencia diferente al primer grupo, y constan de 62
nucleótidos cada uno. En el primer grupo de repetidos los análisis de las secuencias
parvovirales de los últimos años muestran una tendencia evolutiva a la pérdida de un
monómero de repetición (Maya et al., en preparación). De acuerdo a nuestros resultados, el
segundo grupo de repetidos también ha sido sometido a determinado nivel de variabilidad.
Las muestras clonadas y secuenciadas en el presente estudio presentaron un sólo monómero
de repetición del primer grupo de repetidos (resultado no mostrado en el presente estudio) y
solamente un monómero de repetición en el segundo grupo de repetidos. Asimismo, se
demostró mediante PCR/electroforesis que las cepas vacunales CPV-2a (Vplus5) y CPV-2b
(DA2PPVL) presentaban un sólo monómero de repetición al igual que las muestras en estudio
(Fig. 12), y que la cepa vacunal CPV-2 (PDog), que corresponde a la cepa de referencia
M19296, presentaba un fragmento de mayor tamaño que correspondería a los tres monómeros
antes descritos (Fig. 11).
Mediante la aplicación del BlastN, utilizando un monómero de repetición del segundo
grupo, se obtuvieron 21 secuencias que contenían dicho monómero. Dichas secuencias
comprendidas entre los años 1984 y 2007, y pertenecientes a distintos países correspondieron
a distintos virus del género Parvovirus como el Virus de la panleukopenia felina (FPLV), el
Virus de la enteritis del visón (MEV), el Parvovirus del mapache (RPV), y el Parvovirus
canino (CPV-2). Todas las secuencias, a excepción de la M19296 y la M10824, poseen un
único monómero de repetición. Al igual que el monómero de las muestras clonadas, el mismo
correspondería al último de los monómeros de M19296. Esto se sustenta por la presencia de
una T en la novena posición del monómero (Fig. 17, flecha) que también se halla presente en
el tercer monómero de la secuencia M19296.
Solamente la secuencia de FPLV con número de acceso M10824 en la base de datos
GenBank presentó un monómero casi completo (con la última base deleteada) y un segundo
monómero con deleción de los 10 nucleótidos iniciales. La presencia de la T anteriormente
descrita (Fig. 17, flecha) en la primera unidad de repetición sugiere que ésta corresponde al
tercer monómero de M19296, y que la segunda unidad incompleta podría haberse originado
por duplicación de la primera. Esto se ve sustentado por la presencia de un cambio específico
- 39 -
(G en la posición 54) que se halla conservado entre ambos monómeros sugiriendo su origen
común.
Por otro lado, es llamativa la presencia única entre todas las secuencias de una G (Fig.
17, estrella) en la octava posición del monómero de la variante CPV-2a (M6). Este cambio no
se halló en ninguna de las cepas 2c analizadas, ni tampoco en secuencias tipo 2a tomadas del
GenBank. Sin embargo, estas últimas provenían de Estados Unidos y China, por lo que
podemos suponer que la transición A→G, constituye un cambio característico que se halla
presente sólo en algunas cepas sudamericanas. Esto podría estar indicando que la variante 2c
y las 2a uruguayas tienen diferencias que involucran más que el aminoácido 426, sustentando
un posible origen distinto.
El hecho de que exista solamente una secuencia que posee los tres monómeros de
repetición es llamativo, y debido a que dicha secuencia pertenece a una cepa vacunal
podríamos plantearnos la hipótesis de que la presencia de un mayor número de repetidos
podría ser resultado de la atenuación a la que fue sometida la cepa. No obstante, otras cepas
vacunales (Fig. 12), las cuales también fueron sometidas a atenuación, poseían solamente un
monómero de repetición, por lo cual sospechamos que no existe una relación directa entre
ambos fenómenos. Adicionalmente, muchas de las secuencias del presente estudio obtenidas
de la base de datos GenBank fueron sometidas a pasajes en cultivos celulares por lo cual
también sufrieron, en menor medida, un proceso de atenuación. Este hecho, junto con la
observación previa de la variación en el primer grupo de repetidos, sugiere que realmente
existe en la naturaleza un proceso de variación en el segundo grupo de repetidos. Es notorio
que existen cepas con un solo monómero que son de años anteriores a la cepa vacunal con tres
monómeros (i.e. M10989 del año 1984). Este hecho parece estar indicando que la ganancia o
pérdida de monómeros en el segundo grupo de repetidos no sigue una tendencia evolutiva (i.e.
de cepas antiguas a modernas), sino que debería ser considerado como un mecanismo extra de
variabilidad viral poco común que podría conducir en el futuro a la aparición de cepas con
nuevos reordenamientos en esta región particular del genoma. Se debe considerar que aunque
este mecanismo de variabilidad sea poco común, los altos niveles de replicación viral
incrementan su probabilidad de ocurrencia. Estudios en MVM estiman que ocurren 5 X 102
eventos de deleción por célula durante el ciclo infeccioso viral de 48 horas, lo que representa
un asombroso alto nivel de mutaciones comparado con la tasa de deleción espontánea de 10-5
observada en el gen lacI de E. coli (Hogan & Faust, 1984). La extremadamente alta tasa de
deleciones podría ser el resultado de los mecanismos de replicación del DNA parvoviral, que
consiste en un mecanismo de desplazamiento de hebra unidireccional. Alternativamente, las
proteínas virales podrían influenciar el proceso de deleción alterando la tasa de deslices de la
- 40 -
DNA polimerasa celular durante la replicación del genoma viral o, a través de la inducción de
altos niveles de enzimas celulares que normalmente catalizan dicho proceso (Hogan & Faust,
1984).
Aún no se ha designado ninguna función concreta a estos repetidos, no obstante, se ha
sugerido que algunas secuencias repetidas en MVM tienen similitudes con secuencias
potenciadoras de la transcripción (Parrish et al., 1988). Por otro lado, algunos autores
sugieren que las secuencias repetidas podrían ejercer una función pasiva en el ajuste del largo
del DNA a fin de obtener un tamaño óptimo para su empaquetamiento en la respectiva
cápside (Rhode, 1985). Según esta hipótesis, para que se mantenga el tamaño del genoma
viral, nuevas secuencias deberían estar duplicándose o insertándose en otras regiones del
genoma viral en las cepas que han perdido monómeros de repetición.
Nuestra observación del alto nivel de conservación del monómero de repetido sustenta
la funcionalidad del mismo. Solamente se observaron dos variaciones en 62 bases. En teoría
se esperaría mayor variación ya que se trata de una región no codificante del genoma viral, la
que hipotéticamente estaría sujeta a menores presiones selectivas. A esto se suma el hecho de
que los parvovirus de carnívoros presentan una alta tasa de sustitución nucleotídica más
semejante a las de virus RNA que a las de otros virus DNA (Shackelton et al., 2005). Sin
embargo, son necesarios estudios más profundos sobre estas secuencias repetidas con el fin de
dilucidar su funcionalidad, si es que efectivamente presentan alguna además de la generación
de variabilidad viral.
Por último es importante destacar que el alto nivel de conservación del monómero
analizado en este trabajo, sugiere su posible utilización en técnicas de diagnóstico, como por
ejemplo, el desarrollo de una sonda Taqman para rt-PCR que hibride dentro del mismo. No
obstante, son pocas las secuencias del mismo presentes en las bases de datos por lo que no se
puede realizar un análisis más exhaustivo de la variabilidad del mismo, y determinar si
efectivamente puede ser utilizado con dicho fin.
- 41 -
7. CONCLUSIONES
La detección del virus en muchas de las muestras analizadas indica que la mayoría de
los casos de gastroenteritis hemorrágica en cachorros es causada por el CPV-2.
La caracterización de CPV-2c en todas las muestras positivas analizadas sugiere que
esta variante podría ser la única circulante actualmente en nuestro país.
Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que la variante 2c tiene una
gran capacidad de reemplazo en un tiempo relativamente corto.
Todas las muestras analizadas presentaron un único monómero de repetición en el
segundo grupo de repetidos. El bajo nivel de variación dentro de los mismos sugiere su
importancia y reafirma la hipótesis de alguna posible funcionalidad.
Los estudios comparativos de la secuencia y el número de monómeros en el segundo
grupo de repetidos sugieren que su variación representa un mecanismo poco común de
variabilidad del virus.
- 42 -
8. PERSPECTIVAS FUTURAS
Como objetivo fundamental en el laboratorio nos proponemos continuar con el
diagnóstico y la caracterización de muestras en los años siguientes con el fin de colaborar en
el control de la enfermedad y analizar la evolución viral. Asimismo, intentaremos analizar
cepas antiguas de canes presuntamente infectados. Estas cepas se obtendrán de tejidos
incluidos en bloques de parafina (del año 2000 al 2005) que serán amablemente cedidos por la
Facultad de Veterinaria. De esta forma, podremos dilucidar el camino evolutivo que fue
recorrido por CPV en nuestro territorio y determinar cuales fueron las variantes que
circulaban en Uruguay. Este estudio también nos permitirá determinar si la variante CPV-2c
circulante en nuestro país fue importada de otras regiones del mundo o si surgió de novo a
partir de una variante que circulaba anteriormente.
También se intentará obtener la secuencia completa del genoma viral, incluyendo las
regiones codificantes, y no codificantes. Para ello, se están secuenciando la totalidad de los
genes virales así como se están poniendo a punto técnicas que permitan la amplificación de
los extremos del genoma parvoviral.
Por otro lado, pretendemos continuar con el análisis del monómero de repetición a fin
de determinar si el mismo puede ser utilizado para desarrollarse una sonda de hibridación para
diagnóstico de CPV-2 por rt-PCR.
El Departamento de Inmunología de la Facultad de Veterinaria, en conjunto con
nuestro laboratorio pretende cultivar el virus con el objetivo de desarrollar kits comerciales de
ELISA para diagnóstico de CPV-2, así como también para la realización de ensayos de
inmunidad cruzada entre las vacunas que se comercializan actualmente en nuestro país y las
cepas de campo que circulan en el presente en el territorio uruguayo.
- 43 -
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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10. ANEXO I: PROTOCOLOS
10.1. Clonación con el kit “GeneJet PCR Product Cloning kit” de Fermentas:
U
ƒ
U
Reacción de blunting:
Mezclar 10 μL de buffer 2X, 1-2 μL de producto de PCR, 1 μL de enzima DNA
1.
Blunting, y agua Nuclease-Free hasta completar un volumen final de 18 μL.
2.
Vortexear y spinear brevemente.
3.
Incubar a 70ºC por 5 minutos.
4.
Enfriar en hielo por varios segundos.
ƒ
Reacción de ligación de los productos de PCR al vector PJET1/blunt:
1.
Agregar 1 μL de vector PJET1/blunt (50 ng/μL).
2.
Agregar 1 μL de T4 DNA ligasa (50 U/μL).
3.
Vortexear y spinear.
4.
Incubar a 22ºC por 5 minutos.
ƒ
Transformación de células XL1 Blue competentes:
1.
Tomar 50 μL de células XL1Blue competentes e inocular 5 μL de ligación.
2.
Incubar en hielo por 15 minutos.
3.
Incubar en baño a 42ºC por 45 segundos.
4.
Transferir rápidamente a hielo por 2 minutos.
5.
En un falcon agregar 300 μL de medio SOC.
6.
Incubar en agitador a 200 rpm por 1-1,5 horas a 37ºC.
7.
Plaquear 100 μL por placa de LB agar ampicilina.
8.
Incubar la placa a 37ºC toda la noche.
10.2. “Minipreps”, técnica fenol-cloroformo modificada de Sambrook:
U
1.
U
Transferir 1.5 mL de medio de cultivo a un eppendorf y centrifugar a 12000 rpm
durante 1 minuto.
2.
Descartar el sobrenadante y repetir los pasos 1 y 2 hasta terminar el medio de cultivo.
3.
Resuspender el pellet en 100 μL de solución I (solución de resuspensión) (EDTA
0.25M, Tris 1M) y vortexear bien.
4.
Agregar 200 μL de solución II (solución de lisis) (NaOH 10N, SDS 10%) recién
preparada en cada eppendorf, agitar por inversión 5 veces y colocar en hielo (para inhibir la
actividad de DNAsas).
- 49 -
5.
Agregar 150 μL de solución III (solución de neutralización) (Acetato de Potasio 5M y
Ácido acético glacial), invertir durante 10 segundos y dejar en hielo de 3 a 5 minutos.
6.
Centrifugar durante 5 minutos a 12000 rpm y transferir el sobrenadante a un nuevo
eppendorf.
7.
Agregar 2μL cada 50 μL de sobrenadante de RNAsa A/T1 Mix (2 mg/mL y 5000
U/mL respectivamente) e incubar durante 30 minutos a 55ºC.
8.
Realizar dos extracciones consecutivas con 400 μL de fenol:cloroformo:isoamil y
centrifugar durante 5 minutos. Recuperar la fase superior y transferirla a un nuevo eppendorf.
9.
Realizar una extracción con 400 μL de cloroformo y centrifugar por 5 minutos.
Recuperar la fase superior y transferirla a un nuevo eppendorf.
10. Precipitar el ADN agregando dos volúmenes de etanol absoluto frío y 0.1 volúmenes
de acetato de sodio, agitar vigorosamente y dejar a -20ºC toda la noche.
11. Centrifugar durante 30 minutos a 12000 rpm y descartar el sobrenadante.
12. Lavar las sales del pellet de DNA plasmídico agregando 500 μL de etanol 70% frío
(4ºC) y centrifugar por 5 minutos.
13. Descartar el sobrenadante y dejar secar el pellet con el eppendorf abierto hasta
evaporar las trazas de etanol (puede secarse en estufa a 55ºC durante 5 minutos).
14. Resuspender el DNA en un volumen adecuado de agua (generalmente en 30 μL) y
guardar a -20ºC.
- 50 -
11. AGRADECIMIENTOS
A Ruben Pérez, por su paciencia y disposición en todo momento, por todos los conocimientos
y enseñanzas brindados.
A toda la Sección Genética Evolutiva, especialmente a Valeria Romero y Leticia Maya, por
las innumerables ayudas que nos han brindado a todos en el laboratorio.
A Ricardo Recarey y Leandro Giuliani, por todos los momentos compartidos, por el apoyo y
el cariño.
A Santiago Quevedo, por su paciencia y cariño, por su apoyo incondicional en todo
momento, y por la comprensión y contención que supo brindarme a diario, es a él a quien
afectuosamente dedico este trabajo.
- 51 -