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“Determinación serológica de la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina (IBR) en el Municipio de San Miguel de Horcasitas Sonora” Tesis que para obtener el título de Médico Veterinario Zootecnista Presenta Iván Edyzael Ochoa Esparza Ciudad, Obregón Sonora; Mayo de 2012 DETERMINACIÓN SEROLÓGICA DEL LA RINOTRAQUEITIS INFECCIOSA BOVINA EN EL MUNICIPIO DE SAN MIGUEL DE HORCASITAS SONORA TEMA DE TESIS PARA OBTENER EL TITULO DE MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: IVÁN EDYZAEL OCHOA ESPARZA MVZ JOSÉ MARÍA ACEVES GUTIERREZ ASESOR Vo.Bo. M. A. A INÉS ENRÍQUEZ RAMOS CORDINADORA DE LA CARRERA DE MVZ. COMITÉ: PRESIDENTE:______________________________________________________ SECRETARIO:______________________________________________________ VOCAL:___________________________________________________________ DEDICATORIAS La tesis la dedico con todo amor y cariño. A ti DIOS que me diste la oportunidad de vivir y regalarme una familia maravillosa. Con mucho cariño principalmente a mis padres que me dieron la vida y han estado conmigo en todo momento. Gracias por todo Papá y Mamá, por darme una carrera para mi futuro y creer en mi, aunque han pasado momentos difíciles siempre han estado apoyándome y brindándome su cariño, por todo esto les agradezco con todo mi corazón el que estén conmigo a mi lado. A mis hermanos Abelardo y Mariaisabel por estar conmigo siempre los quiero mucho. Para mi novia, Marilyn Salinas León por estar a mi lado en esta etapa de mi vida muchas gracias por todos los momentos buenos y malos que pasamos juntos y me comprendiste, por eso y muchas cosas más te amo. Para los médicos Pedro Alan y Aceves por ser dos grandes maestros y amigos, por ser un ejemplo de lo que quiero ser. Muchas gracias por todo su apoyo. Para mis amigos Beto, Chicano, Arturo, Martha por estar todo este tiempo juntos por ser como mis hermanos los quiero. Por que como dice el dicho a un hermano nunca lo vas a querer como a un amigo, pero a un amigo si lo puedes llegar a querer como un hermano gracias por todo. i AGRADECIMIENTOS A los productores del municipio de San Miguel de Horcasitas, Sonora por su apoyo en la realización de este trabajo. Mi asesor de tesis MVZ. José María Aceves Gutiérrez. A los revisores MC. Pedro Alan Lopez Castro, MC. Pablo Luna Nevares MVZ. Inés Enríquez Ramos. MC. Carlos M. Aguilar Trejo. ii INDICE DEDICATORIAS i AGRADECIMIENTOS ii INDICE DE FIGURAS v RESUMEN vi l. INTRODUCCION 1 1.1 Antecedentes 2 1.2 Planteamiento del problema 2 1.3 Objetivo 2 1.4 Justificación 3 1.5 Limitaciones del estudio 3 ll. FUNDAMENTACION TEORICA 4 2.1 Definición 4 2.2 Etiología 4 2.3 Epidemiologia 4 2.4 Sinónimos 5 2.5 Patogenia 5 2.6 Forma respiratoria 7 2.7 Signos de forma respiratoria 7 2.8 Enfermedad ligera 7 2.9 Enfermedad sub aguda 7 2.10 Enfermedad aguda 8 2.11 Epizootiología 8 2.12 Hallazgos a la necropsia 9 2.13 Tratamiento 9 2.14 Vacunas y plan de vacunación 9 2.15 Diagnostico 10 2.16 Técnica de ELISA 11 iii lll. METODOS Y MATERIALES 13 3.1 Localización del área y materiales de estudio 13 3.2 Método 14 3.3 Variables a analizar 15 3.4 Método estadístico 16 RESULTADOS Y DISCUCIONES 17 CONCLUCIONES 21 BIBLIOGRAFIAS 22 iv INDICE DE FIGURAS Figura 1. Seroprevalencia a IBR de los animales muestreados . 17 Figura 2. Nivel de inmunidad en los animales muestreados basado en la revisión según la escala InmunoComb. 20 v RESUMEN Iván Edyzael Ochoa Esparza. Presencia serológica de anticuerpos contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina en bovinos explotados extensivamente en el municipio de San Miguel de Horcasitas, Sonora, Asesor: MVZ José Ma. Aceves Gutiérrez. El objetivo de la presente investigación fue evidenciar los anticuerpos presentes para la enfermedad de Rinotraqueitis Infecciosa Bovina, por medio de la técnica de ELISA. El estudio se realizo en bovinos explotados extensivamente en el municipio de San Miguel de Horcasitas, Sonora. Siendo una región en donde se ignoraba el estatus sanitario de los animales (IBR). Con un total de 40 animales muestreados, sin importar raza, sexo y edad, se obtuvo la muestra sanguínea por punción de la vena caudal en animales no vacunados. Los resultados obtenidos fueron de 3 animales positivos equivalente a un 8% a la prueba de ELISA. Esto hace notar la importancia de la realización de estudios serológicos y de monitoreo en los bovinos de este municipio. Se concluye que si no se cuenta con animales vacunados en esta región es muy probable que sean infectados. La presencia de anticuerpos para (IBR) manifiesta que los animales muestreados de el municipio de San Miguel de Horcasitas, Sonora puedan estar enfermos manifestando o no signos, lo que puede ser una causa de problemas productivos en los animales, o bien pone de manifiesto que los animales estuvieron enfermos y presentan la infección latente. vi I. INTRODUCCIÓN Los bovinos son los principales animales de granja para la producción de carne y leche para consumo humano, pero a pesar de su importancia, los sistemas de producción bovina son descuidados por la poca atención al bienestar animal. En México existe ganado con enfermedades que interfieren en la producción y se hace énfasis en las enfermedades infecciosas del aparato respiratorio que afectan a las vías altas, es decir, las que se encuentran por encima de la glotis y comprenden a las fosas nasales, senos de la cara, nasofaringe y tráquea. Estas enfermedades logran desarrollarse y extenderse debido a la influencia de otros agentes tanto patógenos como factores ambientales que lo favorecen. Las enfermedades infecciosas del aparato respiratorio son muy variadas. Bajo distintos términos colectivos como Síndrome Respiratorio Bovino y complejo respiratorio bovino, se reúnen enfermedades del tracto respiratorio que no dependen de un solo curso patológico típico o cuadro sintomático característico de un microorganismo, sino de la interacción de varios. Uno de los agentes etiológicos más importantes de estas infecciones es el herpesvirus tipo 1 que provoca la enfermedad de Rinotraqueítis Infecciosa Bovina (IBR), la cual tiene tres manifestaciones: La forma respiratoria de la enfermedad es de presentación súbita. Las pérdidas por mortalidad son bajas generalmente, pero presenta una alta morbilidad. No es rara la observación de conjuntivitis en las epizootias de la (IBR) (Marchant, 1980). Puede presentarse también la forma genital y/o forma encefálica. 1 1.1 Antecedentes Los primeros datos referentes a la IBR corresponden a un caso ocurrido en ganado lechero de California, EUA en 1954. (Correa, 1988). El virus de la IBR fue descrito por primera vez por Madin, et al. (1956). La enfermedad se había observado antes por otros investigadores en Colorado y California (Marchant, 1980). Se ha postulado que el virus de la IBR fue introducido en el oriente de Estados Unidos desde Europa, y en esta región permaneció en hatos de ganado vacuno como infección del aparato genital. Cuando llegó al occidente de los Estados Unidos, donde existían un gran número de reses reunidas en los pastizales, el virus se adaptó a las vías respiratorias y produjo la enfermedad (Mohanty, 1983). En México, la IBR fue diagnosticada por primera vez en 1971 y a la fecha se ha aislado el virus a partir de bovinos con signos sospechosos de hatos de diferentes partes de la República Mexicana (Correa, 1988). 1.2. Planteamiento del problema En estudios anteriores se encontró la presencia de anticuerpos contra el virus de la IBR en algunas comunidades vecinas al municipio de San Miguel de Horcasitas, Sonora, y actualmente se han estado presentando casos con signos clínicos característicos a IBR, lo cual ha provocado que baje la producción del ganado en este municipio, despertando un interés por parte de los productores a realizar este tipo de estudios. 1.3. Objetivo Determinar la presencia de anticuerpos del virus de la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina por medio de la prueba de inmunoensayo, para conocer el grado de diseminación de la enfermedad en el municipio de San Miguel de Horcasitas, Sonora. 2 1.4. Justificación En el Estado de Sonora la ganadería es una de las actividades pecuarias más importantes ya que el ganado bovino tiene gran capacidad para adaptarse a terrenos áridos y semiáridos comunes en esta región, lo cual implica una actividad de bajo costo comparada con otros animales. Con la finalidad de mejorar los hatos se han introducido animales de alta calidad genética al estado de Sonora trayendo como consecuencia la introducción de nuevos agentes patógenos que interfieren en la salud de los animales disminuyendo la productividad de esta actividad pecuaria. Con esta investigación, se pretende determinar el porcentaje de seroprevalencia de IBR para implementar medidas de prevención de enfermedades, diseñando y evaluando programas de manejo y vacunación. 1.5. Limitaciones del estudio La principal limitación del presente estudio es la distancia que hay entre cada rancho lo cual dificulta el traslado, otra limitante es el costo de los kit de ELISA para correr las pruebas, al igual que la falta de manejo de los animales. 3 II. FUNDAMENTACIÓN TEORICA 2.1 Definición La Rinotraqueítis Infecciosa Bovina (IBR) es una enfermedad infecciosa ocasionada por un virus herpes que se puede presentar en forma aguda o latente (Correa, 1988). Se ha observado que el herpesvirus puede afectar a varios sistemas orgánicos (Blowey, 1992). 2.2 Etiología Virus de DNA, clasificado como Herpes Tipo I (Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria, 2002). Pertenece como Vericellovirus a la subfamilia Alphaherpesviridae, dentro de la familia Herpesviridae (Brunner, 2002). 2.3 Epidemiología La especie susceptible que en condiciones de campo y experimentales se pueden infectar es el ganado bovino; los borregos, caballos, cuyos, ratones, perros y gatos son refractarios (Correa, 1988). El padecimiento puede afectar de forma natural a los cerdos, tanto en la modalidad respiratoria como en la genital. Con base a estudios serológicos, el virus tiene amplia distribución en la fauna africana, sobre todo en el búfalo. Son susceptibles los bovinos de todas las razas y edades en la infección experimental, pero la enfermedad natural se observa, principalmente, en animales de mas de 6 meses de edad, quizá por hallarse mas expuestos a la infección (Blood, 1992). El ganado recién nacido con niveles bajos de anticuerpos maternales se afecta más severamente que el ganado de mayor edad (Blood, 1992). El virus de la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina ha sido aislado del semen 12 meses después de su almacenamiento (Blood, 1992). Se estima que el aislamiento del virus en el semen es más bien de origen prepucial que 4 testicular. Los toros pueden transmitir el virus sin manifestar signo alguno de la infección (Mohanthy, 1983). El período de incubación en lotes de engorda es de 10- 20 días (Blood, 1992). La morbilidad oscila entre el 20 y 100% (Bruner, 2002). La tasa de mortalidad en el ganado de carne se debe invariablemente a la traqueítis bacteriana secundaria y a la bronconeumonía, y puede alcanzar una cifra del 10 % (Blood, 1992). O bien con una infección vírica concomitante con el virus de la diarrea vírica bovina (VDVB) o con el virus respiratorio sincitial bovino (Rebhun, 1999). No se registran variaciones estacionales en la incidencia, salvo una mayor ocurrencia en bovinos en lotes de engorde en los meses de otoño e invierno, cuando se encuentran mayor número de animales susceptibles (Blood, 1992) La infección por HVB1 está distribuida entre el ganado de todos los continentes causando una variedad de enfermedades y pérdidas económicas significativas (Kaashoek et al., 1996). 2.4 Sinónimos Vulvovaginitis postulosa infecciosa, balanopostitis pustulosa infecciosa, exantema coital y rinotraqueítis infecciosa bovina (Fenner, 1992). También llamada Nariz roja, IBR (Blowey, 1992). 2.5 Patogenia El virus ataca primero las mucosas de la cabeza, luego la tráquea y pulmones, no siendo raro que después de una fase de viremia ocasione inflamación del sistema nervioso central, y abortos en las vacas gestantes. La inflamación edematosa de las mucosas, que mas tarde pueden transformarse en necrosis, especialmente después del asiento bacteriano secundario, motiva una secreción al principio serosa o mucosa y luego mucopurulenta (flujo nasal, lagrimal, salivación abundante). Los exudados fibrinosos provocan la aparición 5 de revestimientos pseudomembranoso en las mucosas nasal, laringe y tráquea. En los pulmones se instaura una bronconeumonía catarral que puede ser supurativa si ademas participan, bacterias, que posiblemente obedecen a la actuación de un virus de acompañamiento (Schulz, 1993). Después de la infección por vía respiratoria, el virus se replica en los linfonodulos linfáticos regionales; de ahí por vía sanguínea, se localiza en el tracto respiratorio alto, produciendo la enfermedad respiratoria (Instituto Nicaragüense de Investigación Agropecuaria, 2002). La conjuntivitis en el proceso respiratorio se produce mediante aerosoles (Fenerr, 1992). Siendo la propagación desde las cavidades nasales hacia los tejidos oculares, probablemente, a través de los conductos lagrimales (Blood, 1992). La encefalitis parece ser el resultado de la difusión neural directa a partir de la cavidad nasal, faringe y tonsilas a través de las ramas maxilar y mandibular del nervio trigémino y ganglio trigémino (Blood, 1992; Fenerr, 1992). La invasión sistémica por el virus va seguida de la localización de este en varios tejidos diferentes. El virus puede ser transportado por leucocitos periféricos hacia la placenta, y se transfiere al feto causando aborto (Blood, 1992). El proceso genital puede ser el resultado del coito o de la inseminación artificial aunque en algunos brotes, especialmente en vacas lecheras, puede no estar relacionado con el coito (Fenerr, 1992). 6 2.6 Forma respiratoria La enfermedad respiratoria es usualmente vista en ganado mayor de 6 meses pero puede ocurrir en animales jóvenes (Blowey, 2004). En el ganado lechero, pueden detenerse los signos clínicos y el animal se cura por completo en 10 a 14 días. En animales de engorde, la enfermedad suele ser más larga, el periodo febril más largo, las secreción nasal mas profusa y purulenta, y puede haber una enfermedad prolongada hasta 4 meses (Blood, 1992). 2.7 Signos de la forma respiratoria Se manifiesta por fiebre, flujo óculo-nasal, inapetencia, aumento de la frecuencia respiratoria y tos. Fiebre de 40.56 °C a 42.22°C, respiración rápida de 40 a 80 resp/min. (; Rebhun, 1999; Brunner, 2002). Los pulmones son normales a la auscultación y la incapacidad respiratoria se manifiesta durante el ejercicio (Blood, 1992). 2.8 Enfermedad ligera En esta sólo se presentan conjuntivitis y enrojecimiento delgado en la línea de los ojos párpados con descarga usualmente limpia y acuosa. Regularmente ocurre cuando la tensión de la enfermedad es suave o el grado de infección es bajo o el animal es resistente (Blowey, 2004). 2.9 Enfermedad subaguda. Es común en ganado adulto y a menudo es de corta duración. Existe un aumento marcado de la temperatura (40 °C) que dura un día o dos. La frecuencia existe una marcada caída en la producción de leche, lagrimeo y descarga nasal. En los animales habrá ptialismo, una corta y expresiva tos, taquipne y los animales se recuperan de 10 a 14 días (Blowey, 2004). 7 2.10 Enfermedad aguda Los signos son similares a la forma subaguda pero la temperatura tiende a ser mayor (40- 41 °C). Los signos se presentan particularmente en ganado de 6 meses a 2 años. Los signos respiratorios son comúnmente tos y desórdenes respiratorios. La descarga de los ojos y nariz tiende a volverse profusa, las cuales consisten en tejido muerto (costras) (Blowey, 2004). Durante la infección aguda o en las 4 u 8 semanas siguientes puede haber aborto. Aunque puede existir mortalidad de los fetos en cualquier fase de la gestación, la mayoría de los abortos aparecen en el tercer trimestre de la preñez (Rebhun, 1999). 2.11 Epizootiología La IBR pese a tratarse de un mismo virus, no se presenta simultáneamente en la enfermedad respiratoria y la erupción vesicular (presumiblemente se han adaptado determinadas cepas de virus a los respectivos sistemas orgánicos). Si bien el virus puede sobrevivir durante un tiempo relativamente largo fuera del cuerpo animal, el contagio se verifica, por lo general, mediante el contacto entre los animales. Los brotes nuevos de la enfermedad se atribuyen al ingreso de nuevos animales infectados. Superada la enfermedad, deja una prolongada inmunidad (para toda la vida), que se trasmite al ternero mediante el calostro. La rara presentación de enzootias obedece probablemente a que los terneros tienen tiempo para constituir una inmunidad activa mientras se hallan bajo los efectos de los anticuerpos calostrales. (Schulz, 1993). 8 2.12 Hallazgos a la necropsia La necropsia de los casos mortales de IBR mostrara inflamación difusa, ulceración, y membranas diftéricas a lo largo de todos los conductos nasales, en la laringe y en la tráquea. La mucosa nasal inflamada, y a veces en otras zonas de la nasofaringe o de la tráquea, serán visibles las características placas de color blanco. Alguna que otra vez de encuentra ulceración de la mucosa oral. La bronconeumonía bacteriana secundaria o las infecciones víricas superpuestas pueden enmascarar algunas lesiones de IBR (Rebhun, 1995). 2.13 Tratamiento Hay una divergencia considerable en cuanto a utilizar o no antibióticos (Blowey, 2004, Blood, 2004).Como todas las enfermedades de origen viral, no existe tratamiento efectivo, se trata de contrarrestar el efecto secundario de las bacterias contaminantes con terapia antibiótica(Instituto Nicaragüense de Investigación Agropecuaria 2002), (INTA). 2.14 Vacunas y plan de vacunación Las vacunas vivas pueden aplicarse a partir de las 2 semanas de edad y las vacunas inactivadas a partir del tercer mes de vida. Si se vacuna con productos inactivados a bovinos menores de tres meses de vida, ya que la inmunidad puede verse afectada por existencia de anticuerpos maternos. La revacunación se realiza por lo común con intervalos de medio a un año. (Brunner, 2002). Existen dos tipos de vacunas elaboradas con virus vivo modificado disponible. Una es de uso intramuscular, elaborada por lo general, con cultivos tisulares de riñón bovino y la otra es una vacuna intranasal elaborada con tejido tisular de conejo. También se dispone de vacunas intranasales de cultivos celulares de bovino que contiene un mutante sensible a la temperatura (Blood, 1992). 9 Con base a trabajos experimentales las ventajas de una vacuna intranasal son: que puede usarse en hembras gestantes y proporciona protección más rápida y eficaz contra la forma respiratoria. La reacción casi no produce reacción sistémica, y todos los animales en contacto en un brote pueden vacunarse con seguridad (Blood, 1992). Además de las vacunas convencionales como son las monovalentes o la compuesta por varios antígenos asociados polivalentes, se utilizan vacunas marcadoras (Marcadores deletéreos) (Brunner, 2002). Las vacunas marcadoras son las que permiten la diferenciación serológica de ganado infectado en una población vacunada (Obando, 1999). 2.15 Diagnóstico Generalmente cuando existen los signos característicos y las placas patognomónicas en la mucosa nasal, el diagnóstico de IBR se basa en el examen físico. La confirmación de laboratorio es posible mediante la técnica de anticuerpos fluorescentes durante la fase aguda de la enfermedad (las lesiones más apropiadas son las de menos de 7 días). Los raspados de las lesiones de la mucosa y de las placas de color blanco deben ser positivos en la mayoría de los casos agudos. Además, durante este tiempo es posible el aislamiento del virus. (Rebhun, 1995). En ocasiones el diagnóstico morfológico no es suficiente para realizar el diagnóstico definitivo, por lo tanto es necesario recurrir a pruebas adicionales como el aislamiento del virus en células de riñón fetal bovino o en células de riñón de hámster joven (B.H.K). los tejidos de preferencia para aislamiento son: cornete nasal, hígado fetal, riñón fetal, mucosa vaginal lesionada, placenta, encéfalo (forma juvenil) bazo y ganglios linfáticos (INTA, 2002). El diagnostico incluye: serología solicitada por seroneutralización en cultivos celulares o a la prueba de ELISA (INTA, 2002). Estas pruebas se procesan con 10 las muestras de sueros pares (sueros obtenidos de la fase aguda de la enfermedad y sueros del animal convaleciente obtenidos de 14 a 21 días después). Un incremento al cuádruple del título se considera positivo (Mohanty, 1983; Rebhun, 1999) 2.16 Técnica de ELISA El acrónimo ELISA representa: E= Encima L= Linked (enlace) I= Inmuno S= Sorbente A= Assay Valora anticuerpos específicos según el antígeno que se emplee, produciéndose una reacción antígeno- anticuerpo. Al final de la reacción se obtiene una solución de color que se mide con un espectrofotómetro, cuya intensidad está en la relación directa con la cantidad de anticuerpos (Ángel y Ángel, 2000). En ELISA el anticuerpo (o antígeno) se fija a una superficie, ya sea en contenedor de una placa de microtitulación o una partícula de plástico. El espécimen a prueba se aplica y el material adherido se detecta y caracteriza a través de un anticuerpo secundario marcado enzimáticamente. Estos ensayos son rápidos sencillos y fáciles de adaptar a analizadores automáticos, pero requieren de reactivos muy purificados (Parslow, Stites, Terr, imboden, 2002). Existen distintas variedades de ELISA pero las más utilizadas y sensibles es el análisis tipo Sándwich o indirecto. Un anticuerpo marcado con encimas (mAb) dirigido contra un antígeno específico se fija a placas de microtitulación. Los contenedores se incuban con 11 diluciones seriadas del espécimen del paciente para permitir la adherencia del antígeno al anticuerpo de superficie, posteriormente se lavan los contenedores. El antígeno adherido se detecta mediante un anticuerpo secundario marcado enzimáticamente. Después de otro lavado, los contenedores se incuban con un sustrato de encimas y se cuantifica la reacción enzimática (aparición del producto de la reacción) (Parslow, Stites, Terr, imboden, 2002). 12 III. MÉTODO Y MATERIALES 3.1 Localización del área de estudio El municipio está ubicado en el centro del Estado de Sonora, su cabecera es la población de San Miguel de Horcasitas y se localiza en el paralelo 29° 29' de latitud norte y a los 110° 43' de longitud al oeste del meridiano de Greewich, a una altura de 518 metros sobre el nivel del mar. Colinda al noroeste con Rayón, al este con Ures, al sur con Hermosillo y al noroeste con Carbó. Este municipio cuenta con un clima seco cálido, con temperatura media máxima mensual de 30.8°C en los meses de julio y agosto, y temperatura media mínima mensual de 15.4°C en los meses de diciembre y enero. La temperatura media anual es de 23°C. La época de lluvias se presenta en los meses de julio y agosto con una precipitación media anual de 294 milímetros. Se tienen heladas ocasionales en febrero y marzo. La flora en el municipio está compuesta de matorral subtropical en la parte oeste que limita con el municipio de Ures; en las colindancias con Hermosillo y Carbó existen algunas áreas de vegetación de matorral desértico. Una gran parte del territorio municipal está formado de matorral sarcocaule como el copal, torote, hierba del burro, cardón y choya, Otras áreas de la superficie adyacente a la anterior está formada por mezquital: palo verde, palo fierro, huisaches, acacia y mezquites; en la parte sur y centro el uso del suelo se destina para agricultura de riego sobre todo a orillas del arroyo El Zanjón y del río San Miguel (http://www.elocal.gob.mx/work/templates/enciclo/sonora/municipios/26056a.htm) 13 3.2 Método Se llevara a cabo un muestreo en bovinos de diferentes razas, sexo y edad, extrayendo sangre de de la vena caudal utilizando jeringas de 5ml. Una vez colectada la sangre esta será depositada en tubos de ensayo de 13 x 100 sin anticoagulante, retirando la aguja de la jeringa al momento de vaciarla, esto para evitar turbulencia y por consiguiente la hemólisis de la muestra. Posteriormente, las muestras serán refrigeradas para su traslado al laboratorio de Bacteriología del Departamento de Ciencias Agronómicas y Veterinaria del Instituto Tecnológico de Sonora, Se centrifugaron las muestras para la extracción del suero y se congelarán a una temperatura de 0°C para la realización de la prueba después de la extracción del suero. Una vez extraído el suero se tomará con la micropipeta 0.05 μl y se depositará en los contenedores del Kit de ELISA, después de esto se procediera a realizar cada uno de los pasos de la prueba, e inmediatamente se realizó la lectura de los resultados. Para el diagnóstico se utilizara el kit llamado InmunoComb el cual está diseñado para determinar en sueros de bovinos títulos de anticuerpos para IBR. Este se basa en el principio de examen inmunológico, y consiste en una tarjeta plástica en forma de peine en donde los antígenos de IBR están adjuntos. Este kit trabaja bajo la versión más común de ELISA es el ensayo de Sandwich o llamado también indirecto. Este análisis utiliza 2 tipos distintos de anticuerpos que reaccionan con el antígeno cuya concentración se requiere medir. Se fija una cantidad constante de un anticuerpo en una serie de soportes sólidos repetidos tales como pocillos de microtitulación de plástico. Se añade a estos pocillos la solución problema que contiene el antígeno en una concentración desconocida o una serie de 14 soluciones patrón con concentraciones conocidas del antígeno y se deja que se unan. Se elimina mediante lavado el antígeno no unido y se permite la unión del segundo anticuerpo ligado a una enzima (Abul, 2002).La intensidad del color de la muestra se compara con el control positivo incluido en la prueba para determinar el título. El control positivo (c+) es calibrado para 200 unidades de ELISA. Las muestras con idéntica o más alta intensidad de color que el control positivo son consideradas positivas. El valor de la Comboescala en rangos de color va del 0 al 10, siendo a partir del numero 3 la intensidad de color adecuado para el control positivo. Proporcionando los siguientes valores según unidades ELISA comparadas: arriba de 200 unidades de ELISA a partir del número 3 al 4 se considera baja inmunidad, de 4 al 4 es nivel de inmunidad medio y del número 5 en adelante con 800 unidades ELISA presenta una inmunidad alta, es decir que el animal posee un alto titulo de anticuerpos para IBR. Valores menores de 3 son considerados negativos. 3.3 Variables a analizar Frecuencia de reactores positivos y negativos a la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina. 15 3.4 Método estadístico Se utilizará un muestreo simple aleatorio utilizando la siguiente fórmula n= (N) (p) (q) (N -1) B2 + p q 2 (20500) (.87) (.13) (20499) (.1)2 + (.87) (.13) n= 2 2318.5 102.5 + .113 n= 2318.5 102.6 n= n= (20500) (.87) (.13) (20499) (.1)2 + (.87) (.13) 2 n= 22.5 Donde: N= Tamaño de la población = 20,500 n= Tamaño de la muestra = 22.5 p= Probabilidad de éxito = .87 q= probabilidad de fracaso = .13 B= Limite en el error = .1 La información se analizará por medio de estadística utilizando gráficas descriptivas indicando las frecuencias de los resultados o 16 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se evaluaron las muestras de 30 bovinos hembra para determinar la presencia de Rinotraqueítis Infecciosa Bovina en el municipio de San Miguel de Horcasitas, Sonora. Se encontraron 3 animales positivos a IBR, siendo éstos el 8%, y 37 negativos que representan el 92%. Figura 1. Seroprevalencia a IBR en los animales muestreados. Los resultados obtenidos en el presente trabajo coinciden con otros estudios realizados en México en cuanto que hay animales positivos a IBR, el numero de muestras es muy variable en los distintos estudios lo que se observa es gran parte de estos presentes niveles de seropositividad arriba del 30%. Blood en 1992, informó que la IBR se había identificado en Estados Unidos, Australia, Inglaterra, Canadá, Nueva Zelanda, Sudáfrica, Zimbabue y Europa Continental. La enfermedad ocurre por lo común en vacas productoras de leche. En ganado productor de carne al norte de Australia, hasta un 96% de los toros y un 52% de las vacas muestran evidencia serológica de infección, presumiblemente venérea, pues la IBR respiratoria es poco común en bovinos en condiciones de ganadería extensiva. Sin embargo esto es muy subjetivo, ya que el 17 mismo Blood 1992 señala que existe evidencia epidemiológica de que la virulencia o especificidad de hospedador cambian debido a factores desconocidos esto apoya en cierto modo el resultado arrojado en el presente estudio que fue de 3 animales positivos (8%) a IBR. Blood 1992, estipuló que la aparición repentina de los brotes de la IBR en los países en que antes ocurría la enfermedad leve, quizá se deba a la importación de bovinos infectados con una cepa más virulenta después de la mutación de una cepa doméstica. En 1994, se analizaron las muestras de 54 hatos mexicanos encontrando el 54.91% de animales positivos a IBR (n=621). En el 2000 se evaluó 1179 para IBR, provenientes de 120 ranchos del estado de Tamaulipas, Veracruz, Tabasco, Chiapas y Yucatán, se obtuvo el 53.35% de animales positivos a IBR (n=1179). (Reyes JM; Vásquez R y García JA, 2004). En el 2001, Leal GAJ y col; evaluaron sueros de 87 animales productores de leche pertenecientes de 7 establos del Distrito Federal, México, y obtuvieron 32.18% positivas a IBR; esta cantidad de animales muestreados se asemeja al presente estudio, sólo que es en vacas lecheras y se tiene un porcentaje de positivas más bajo comparado con el de este estudio, quizás sea por la característica de manejo en los animales ya que los sistemas de producción láctea presentan más avances y mejoras en medidas profilácticas. En 2002 Córdova IA y col; analizaron 180 sueros de bovinos con antecedentes de aborto en el clima trópico húmedo, resultando el 13% positivas a IBR. En el 2003 Córdoba IA y col; valoraron 2664 muestras de bovinos lecheros con antecedentes de aborto procedentes de 7 unidades de producción del centro de México, resultando positivas un 27.49% para IBR. Los porcentajes de positividad de los trabajos antes mencionados son aun más bajos y se observa que hace énfasis en 18 que los problemas presentados en estos animales eran de tipo reproductivo, es sumamente importante realizar estudios en animales con problemas de aborto que el agente etiológico de la IBR puede provocar aborto. En 2004, Reyes JM et al, encuentran en muestreos provenientes de 14 establos de la República Mexicana: Veracruz, Tabasco, Campeche, Chiapas, Aguascalientes, Yucatán, Tamaulipas, Querétaro, Sinaloa, Chihuahua, Durango, Jalisco, Baja California Norte y Michoacán, un 57.29% de positividad a IBR; en el estado de Sonora a pesar de ser muy importante su actividad ganadera se conoce muy poco acerca de valores de estudios serológicos a la IBR. Esto puede atribuirse a la escasa investigación en el ganado de carne respecto a este padecimiento. En 2006 Palomares C. encuentra en 85 muestras de bovinos no vacunados explotados en sistemas extensivos, de los municipios de la Colorada, Suaqui Grande, Ures, y Villa Pesqueira, Sonora el 87% de positividad a IBR. En 2012 Valenzuela M. en 141 muestras de bovinos no vacunados explotados en sistemas extensivos, en el municipio de Moctezuma sonora el 57 % de positividad a IBR. En ganado de carne en un sistema extensivo. 19 Figura 2. Nivel de inmunidad en los animales muestreados basado en la revisión según la escala del InmunoComb. En la prueba diagnóstica el nivel inmunologico en los animales muestreados arrojaron los siguientes datos: Un 92% negativo equivalente a 37 animales y un 8% positivo equivalente a 3 animales, de los cuales 1 animal con el 2% tienen un nivel de positividad inmunológico bajo, 1 animal el 3% tienen un nivel de inmunidad medio y 1 animal el 3% tiene un nivel de inmunidad alta. (Véase figura 2) 20 V. CONCLUSIONES De los 30 animales muestreados se encontraron 3 animales positivos (8%) a la prueba de ELISA, con distinta reactividad. Aquellos con una baja inmunidad o baja intensidad de color en la prueba son animales que pudieron estar en contacto con el virus, por lo que pueden ser animales portadores y los de alta intensidad de color pudieran ser animales recientemente infectados. La Rinotraqueitis Infecciosa no se caracteriza por una alta mortalidad, pero si se presenta una morbilidad alta, que asociada con agentes secundarios puede causar grandes estragos en la producción de ganado, desde problemas respiratorios como neumonías hasta poder ocasionar una alta mortalidad. Existe información sobre la presencia de la Rinotraqueitis Infecciosa bovina en sistemas de producción intensiva, como son los establos lecheros, pero hace falta crear conciencia acerca de la presencia de esta enfermedad en sistemas extensivos, engordas de ganado y doble propósito etc. Este trabajo puede ser un estudio inicial para aplicarse a otros municipios en el estado de Sonora con el propósito de determinar la presencia de IBR en animales no vacunados. Además este estudio sirve para crear conciencia en los productores y diseñar un programa de vacunación del ganado de esta zona, lo cual favorecerá la salud del ganado y con ello notables beneficios en la producción. 21 VI. BIBLIOGRAFIA Abul, K. 2002. Inmunología Celular.INTERAMERICANA MC GRAW HILL. Aravaca, Madrid. Pp.540. Angel, G., Angel, M. 2000. Clínica del laboratorio PANAMERICANA. Bogotá, Colombia. Pp. 174. Blood, D. Rodostits, O 1992. Libro de Texto de las Enfermedades del Ganado Vacuno, Ovino, Porcino, Caprino, y Equino. 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