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FITOPATOLOGÍA
Tema 7. DIAGNÓSTICO DE VIRUS
VEGETALES
(DIAGNOSIS II)
Por qué los virus requieren de
técnicas especiales de diagnóstico ?

Son parásitos OBLIGADOS e INTRACELULARES

Son parásitos NO CELULARES (ACELULARES)

Son partículas o moléculas de ADN o ARN + proteínas

NO SON VISIBLES con equipos ópticos comunes.


Provocan importantes enfermedades PERSISTENTES E
INCURABLES.
NO SIEMPRE PRESENTAN SÍNTOMAS VISIBLES
(LATENCIA)
REQUIEREN DE MÉTODOS O TÉCNICAS ESPECIALES
PARA SU DIAGNÓSTICO
POSTULADOS DE KOCH




1. EL AGENTE CAUSAL DEBE ESTAR O HABER ESTADO ASOCIADO CON LA
ENFERMEDAD Y VICEVERSA.
 SINTOMATOLOGÍA (PUEDE CONFUNDIRSE CON FITOTOXICIDAD)
 NO PRESENTAN SIGNOS.
2. EL AGENTE PATÓGENO DEBE SER AISLADO AL ESTADO PURO, EN
PLANTAS HOSPEDANTES PARA ESTUDIAR SUS CARACTERÍSTICAS
MORFOLOGICAS, SEROLÓGICAS, MOLECULARES, PROPIEDADES IN VITRO.
 No se cultivan, cómo los aíslo? Con qué métodos los detecto o estudio
sus propiedades?
 MÉTODOS BIOLÓGICOS, SEROLÓGICOS O MOLECULARES
3. UNA PLANTA HOSPEDANTE SANA DE LA MISMA ESPECIE Y EDAD AL SER
INOCULADA CON EL AGENTE AISLADO EN CONDICIONES FAVORABLES
DEBERÁ REPRODUCIR LOS SÍNTOMAS CARÁCTERISTICOS DE LA
ENFERMEDAD,
 Pruebas de patogenicidad?
 TRANSMISIBILIDAD
4. EL AGENTE FITOPATÓGENO DEBE SER REAISLADO DEL HOSPEDANTE
INOCULADO AL ESTADO PURO E IDENTIFICADO CON EL AISLADO
PRIMERAMENTE.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS DE PLANTAS
1- MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Estudia la ARQUITECTURA DE LAS PARTÍCULAS
VIRALES (forma y tamaño)





Requiere de instrumental sofisticado
Requiere de técnicos especialistas (capacitación)
Es poco sensible
Consume mucho tiempo
No siempre se puede identificar la especie o el género
2- TÉCNICAS BIOLÓGICAS
ESTUDIA LAS CARACTERISTICAS DEL VIRUS A
TRAVÉS DE SU EXPRESIÓN EN PLANTAS
HOSPEDANTES (BIOENSAYOS)

SINTOMATOLOGÍA

RANGO DE HOSPEDANTES – PLANTAS INDICADORAS

TRANSMISIBILIDAD

ANÁLISIS DE LAS PROPIEDADES “IN VITRO”
 Punto de inactivación termal (PIT)
 Punto de dilución final (PDF)
 Desecamiento
 Longevidad “in vitro”
SINTOMATOLOGÍA
•Son indispensables para la valoración de los daños
provocados por las virosis.
•Son en muchos casos los únicos recursos para un
reconocimiento rápido en el cultivo.
• En pocos casos sirve por si sóla como método de
diagnóstico. Ej Corcovo del tabaco causado por GRSV
Peste negra del tomate
i- SISTÉMICOS
(CAMBIOS DE COLOR)
• MOSAICOS (HOJAS)
•MOTEADOS (HOJAS)
•ESTRIADO (TALLOS)
Fotos de otra autoría.
SISTÉMICOS
(CAMBIOS DE COLOR)
QUEBRADO (FLORES)
ANILLADOS (FRUTOS)
Fotos de otra autoría.
SISTÉMICOS
(DEFORMACIONES)
•CORDÓN DE ZAPATOS (HOJAS)
•AMPOLLADURAS
•HENDIDURAS (TRONCOS)
Fotos de otra autoría.
SISTÉMICOS (NECROSIS)
Fotos de otra autoría.
SISTÉMICOS (DETENCIÓN DE CRECIMIENTO,
ENANISMO, ACHAPARRAMIENTO)
Fotos de otra autoría.
ii-SÍNTOMAS LOCALES
(LESIONES CLORÓTICAS O NECRÓTICAS
Fotos de otra autoría.
SINTOMATOLOGÍA
iii-AUSENCIA DE SÍNTOMAS
• INAPARIENCIA,
• ENMASCARAMIENTO
• RECUPERACIÓN
RANGO DE HOSPEDANTES




BIOENSAYOS
RANGO DE HOSPEDANTES conjunto de
plantas que pueden ser infectadas por un virus
determinado.
Plantas indicadoras son aquellas que
responden de forma consistente y distintivas
frente a las infecciones virales en condiciones de
invernáculo.
Pueden manifestar síntomas locales o sistémicos
INOCULACIÓN MECANICA
TRANSMISIBILIDAD
EN LA NATURALEZA los VIRUS pueden transmitirse por:









INSECTOS
POLEN
SEMILLA (Virus del Mosaico del pepino, Mosaico común de la soja)
CUSCUTA (holoparásita)
ÓRGANOS DE PROPAGACIÓN VEGETATIVA (yemas de citrus CTV,
Psorosis; en tubérculos de papa PVY, en estacas c. de azúcar ScMV)
ÁCAROS (Fam. Eriophydae)
NEMÁTODES (Nepovirus – Xiphinema, Longidorus, Trichodorus)
HONGOS (Olpidium brassicae - necrosis del tabaco)
CONTACTO ENTRE PLANTAS ENFERMAS A SANAS (TMV, PVX)
CON LA INTERVENCIÓN DEL HOMBRE:



POR EL HOMBRE (HERRAMIENTAS, LABORES CULTURALES, ETC)
INJERTO (TODOS)
INOCULACION MECÁNICA (RANGO DE HOSPEDANTES)
TRANSMISIÓN POR INSECTOS
RELACIÓN VIRUS -VECTOR
Adquisición
Incubación
Transmisión
Persistente
Trips – TSWV
Circulativo
propagativo
> 1 HORA
Días a
Semanas
Toda la vida
No persistente
Pulgón – PVY
No circulativo
No propagativo
Pocos
segundos
NO TIENE
Pocos
minutos
Semi-persistente
Pulgón – CTV
Circulativo
No propagativo
Minutos a
horas
Horas a días Depende de
la
adquisición
PROPIEDADES IN VITRO
•Punto de inactivación termal (PIT)
Es la máxima temperatura que soporta el jugo viroso tratado durante 10
minutos sin perder su infectividad.
•Punto de dilución final (PDF)
Es la máxima dilución que soporta el jugo viroso sin perder su
efectividad.
•Desecamiento
Es la capacidad de las partículas virosas de soportar el desecamiento de
los tejidos donde se hallan incluidas, sin perder su infectividad.
•Longevidad “in vitro”
Es el máximo tiempo que un virus permanece infectivo en el extracto
vegetal, mantenidos en tubos cerrados, a temperatura de laboratorio.
Ej. Tobacco Mosaic Virus: PIT 92ºC, PDF 1/1.000.000, Desec. 50 años
Interpretación de los resultados de
las técnicas biológicas

Los resultados se comparan con valores o respuestas YA
DETERMINADAS Y VALIDADAS PARA CADA ENTIDAD
VIRAL CONOCIDA (BIBLIOGRAFÍA , BANCOS DE DATOS)

SIRVEN PARA CARACTERIZAR UN VIRUS.

Son engorrosas, costosas, insumen mucho tiempo.

Ninguna por si sola permite la identificación de un virus.

Siempre es necesario complementar dos o mas técnicas.
3 - TÉCNICAS SEROLÓGICAS
SERODIAGNÓSTICO = DIAGNÓSTICO MEDIANTE
SEROLOGÍA = TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
ESTUDIA LAS PROPIEDADES DE LA CUBIERTA
PROTÉICA DE LOS VIRUS.
SE BASAN EN LA IDENTIFICACIÓN DE UN VIRUS
(EL ANTÍGENO) A TRAVÉS DE LA REACCIÓN
CON SUS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS.
REACTIVOS EN SEROLOGÍA

ANTÍGENO cualquier sustancia capaz de
inducir una respuesta inmune cuando es
introducida en un animal apropiado, lo que
implica producción de nuevos anticuerpos.
Molécula AJENA al hospedante.
  complejidad y de  peso molecular.
 Proteínas, glúcidos, polímeros de ácidos
nucleicos, VIRUS, BACTERIAS, HONGOS O
ALGUNOS DE SUS CONSTITUYENTES

REACTIVOS EN SEROLOGÍA

ANTICUERPOS son moléculas proteicas
(inmunoglobulinas) producidas en respuesta
al antígeno que las originó. Circulan en el
suero sanguíneo (ANTISUERO) y se unen
específicamente con el/ los antígenos que
los originaron.



Existen distintos tipos: IgG (80 %), IgA, IgM,
IgD y IgE.
Se localizan en suero sanguíneo
Reaccionan ESPECÍFICAMENTE con “su
Antígeno” mediante uniones no covalentes.
OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS



Los fitopatógenos inoculados en animales
vertebrados desencadenan “respuesta inmune”
sin provocar enfermedad a los mismos.
Se pueden producir anticuerpos inyectando
virus fitopatógenos purificados en animales.
Los anticuerpos
técnicas.
se
emplean
en
diferentes
INMUNIZACIÓN
VIRUS
VIRUS
VIRUS PURIFICADOS
Antígenos
Anticuerpos
ESPECÍFICOS
Para inmunizar el animal se inyecta el virus purificados con un adyuvante
(sustancias que estimulan la respuesta inmune, aumenta la
producción de anticuerpos).
La sangría del animal se realiza varias semanas después de la
inmunización.
La sangre se centrifuga, se precipita la fraccion sólida y se separa el
suero (donde están los anticuerpos = antisuero)
TÉCNICAS SEROLÓGICAS

PRUEBAS CON MOLÉCULAS INDICADORAS
O MARCADORES se emplean anticuerpos
y/o antígenos que
están unidos a
moléculas que tienen actividad propia y
amplifican
el
poder
de
la
prueba
aumentando su sensibilidad.
 Marcadores radioactivos
 Marcadores fluorescentes.
 Ensayos inmunoenzimáticos
E.L.I.S.A.  marcadores enzimáticos
ELISA
(Enzime Linked Inmunosorbent Assay)
E
ANTICUERPOS:
especificidad para
reconocer al antígeno
que lo originó
ENZIMA: actividad
catalítica
CONJUGADO ENZIMÁTICO:
Anticuerpo marcado con una enzima
•La interacción específica Ag - Ac es reconocida por la acción de una
enzima unida a uno de los reactivos.
Distintas técnicas: DAS ELISA, NC ELISA, etc
DAS - ELISA
(Double sandwich antibody – ELISA)
ESQUEMA DE LA TECNICA
Anticuerpos
conjugados con
enzima
Sustrato
Virus (Antígeno)
Anticuerpos
Celda
1- COBERTURA DE LA PLACA CON
ANTICUERPOS (SENSIBILIZACION)
2- PREPARACION Y AGREGADO DE LA
MUESTRA (ANTIGENO)
LAVADO
3- AGREGADO DEL
CONJUGADO ENZIMATICO
4- ADICIÓN DEL SUSTRATO
LAVADO
LECTURA DE LOS RESULTADOS
Lectura de absorbancia a longitud de onda de 405
nm mediante un ESPECTROFOTÓMETRO de
lectura vertical .
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La presencia de color (mayores valores de
absorbancia) indica la presencia del virus, la
intensidad del color puede usarse para estimar la
concentración de virus en la muestra.
VENTAJAS 







ALTA ESPECIFICIDAD
ALTA SENSIBILIDAD ( 1- 10 NG/ML)
SIMPLICIDAD
RAPIDEZ (LOS RESULTADOS SE OBTIENEN EN
POCAS HORAS)
NUMEROSAS MUESTRAS SIMULTÁNEAMENTE
(96 CELDAS/PLACA)
NO REQUIERE TRATAMIENTO ESPECIAL DE LAS
MUESTRAS (EXTRACTO CRUDO)
POCO INFLUENCIADA POR LA MORFOLOGÍA DE
LOS PATÓGENOS
EL MÉTODO ELISA ES, POR LEJOS, LA TÉCNICA
INMUNOLÓGICA MÁS UTILIZADA EN AGRICULTURA
PARA LA IDENTIFICACION DE VIRUS
TÉCNICAS SEROLÓGICAS: Aplicaciones

Baja concentración de patógenos en la muestra

Gran número de muestras (lotes de papa semilla,
semillero de caña de azúcar)

Rigor científico
del análisis (Certificación de
yemas de citrus, papa semilla, controles
cuarentenarios)

Análisis de material asintomático (Inapariencia,
latencia)


Urgencia en entrega de los resultados
Concentración o movimiento de los virus en la
planta
4- TÉCNICAS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO
ESTUDIA O DETECTA LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS O
GENES DE LOS VIRUS
SE BASAN EN LA PRESENCIA DE SECUENCIAS ÚNICAS
EN LOS ACIDOS NUCLEICOS DEL GENOMA DE CADA
VIRUS.
REQUIERE DEL CONOCIMIENTO PREVIO DE LAS
SECUENCIAS GENÉTICAS DEL VIRUS A DETECTAR (GENE
BANK).
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)



Es una herramienta de extrema utilidad tanto por
su sensibilidad y especificidad como por su
simplicidad.
Consiste en la multiplicación "in vitro" de una
o unas pocas cadenas de ácido nucleico (DNA o
RNA) de una longitud discreta hasta niveles
tales que permitan su fácil detección en geles de
agarosa.
Se fundamenta en los mecanismos naturales
de
la
replicación
del
ácido
desoxirribonucleico (DNA)
Representación esquemática de la
molécula de DNA
REPLICACIÓN



1- Es semi-conservativa, REQUIERE UNA HEBRA
MOLDE (ADN VIRAL)
2- Requiere de CEBADORES (FRAGMENTOS DE
ADN ESPECÍFICO Y COMPLEMENTARIO AL ADN
VIRAL) para comenzar
3- La enzima POLIMERASA SINTETIZA LAS
NUEVAS CADENAS
Nueva hebra sintetiz ada
La secuencia ADN VIRAL a detectar
(amplificar) se somete a 30 ciclos de
copiado en un pequeño tubo de
ensayo.MOLDE.
OH
H
H
3'
H
CH2
O
O
Base
CH2
A
O
T
O
-
P
O
H
H
H
H
O
H H
H
CH2
O
H
O
Base
O
P
O
O
O-
P
O
Base
O
Base
CH2
G
O
H
H
HO
H
O
C
P
O
5'
O
-
O
H
H
H
H
H
O
CH2
O
O
P
O
P
O CH2
O
O
-
O
P
-
-
P
O
H
O
H
H
HO
-
O
Base
O
H
O
O
Base
O
O
H
H
O
CH2
H H
Base
O
P
O
O
Deoxiribonuc leósido 5' trif osf ato a ser
incorporado.
-
O
OH
H
Pi rofo sfato i norgán ico
l ib erado
H
O
CH2
Base
O
P
O
O
Dirección de síntesis
de la nueva c adena
de DNA
-
O
OH
H
H
O
CH 2
O
O
P
-
O
Base
O
OH
H
H
O
La polimerasa termoestable es la que
sintetiza múltiples copias de una hebra
de ADN complementaria a la porción
de ADN comprendida entre los dos
cebadores
H
O
Fragmentos
cortos
de
ADN
(cebadores)
complementarios
a
porciones
específicas
del
acido
nucleico viral se adhieren al ADN
VIRAL.
Hebra molde
Síntesis de DNA:
La adic ión de deoxiribonuclótidos al extremo 3' de una c adena
polinucleotídica es la reac ción f undamental para la síntes is de DNA. El apareamiento de
bases entre los deoxiribonucleótidos inc orporados y la c adena molde es la guía para la
f ormación de la nueva c adena que tendrá una secuencia nucleótidica complementaria.
ETAPAS DE CADA CICLO 1-Desnaturalización del DNA,
2-hibridación de cebadores y 3-extensión de la nueva
cadena
DNA con sus cadenas
complementarias
desnaturalizadas
5'
3'
Primers
5'
3'
Síntesis de DNA
5'
3'
3'
5'
específicos
PROGRAMA DE TERMOCICLADO
Materiales necesarios
Para desarrollar una reacción de PCR
se colocan en un tubo de microcentrífuga los
siguientes reactivos:
DNA molde (ADN VIRAL)
CEBADORES (DISEÑADOS EN FUNCIÓN AL
VIRUS A DETECTAR)
DNA polimerasa,
Desoxirribonucleósidos trifosfato (A,T,C,G)
Tampón adecuado
 TERMOCICLADOR
Para visualizar la reacción
 GELES DE AGAROSA
 CUBA ELECTROFORESIS
 TRANSILUMINADOR
Partiendo de una molécula de DNA y asumiendo
una eficiencia del 100% en cada ciclo se obtienen:
N° de ciclos
3
5
10
20
30
31
32
N° de doble
cadenas con la
longitud prevista
2
8
256
262.144
268.435.456
536.870.912
1.073.741.824
EL PRODUCTO DE LA PCR PUEDE DETECTARSE USANDO ELECTROFORESIS
EN GEL, POR CORRIENTE ELECTRICA SE SEPARAN A LAS MOLECULAS DE
DISTINTOS TAMAÑOS.
LUEGO LOS FRAGMENTOS SE TIÑEN EN EL GEL CON UN PIGMENTO
ESPECÍFICO PARA ACIDOS NUCLEICOS.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1
2
3
4
5
6
Calles 1: marcador
de peso molecular
Calle 2: Testigo
positivo TMV
Calles 3-5:
muestras problema
infectadas con TMV
Calle 6: muestra sin
infeccion de TMV
LA VISUALIZACION DE UNA BANDA DEL TAMAÑO APROPIADO INDICA LA
PRESENCIA DEL VIRUS PARA EL CUAL SE DISEÑARON LOS CEBADORES
Bibliografía complementaria



Fernandez Valiela, M.V. 1995. Virus
patógenos de las plantas y su control.
Tomos 1 y 2. 4ta Edición.
Ramallo, J.C. y S. Hongn. 1997. Síntomas,
propiedades, transmisión y diagnóstico de
virus vegetales. Serie didáctica Nº 33.
FAZ, UNT.
Agrios, G. 1985. Fitopatología.