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Propiedades del 5-hidroxitirosol, una nueva clase de microbicidas
frente al VIH-1
Jose Alcamí1, Luis-Miguel Bedoya1, 3, Patricia Obregón1, Manuela Beltrán1, Eduardo GómezAcebo2, David Auñón2, Laura Capa1
1 Instituto de Salud Carlos III, Unidad de Inmunopatología del Sida, Majadahonda, Madrid. 2 Seprox Biotech SL,
Madrid. 3 Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense, Madrid. Contacto AIMHIV: [email protected]. Web: http://aim-hiv.isciii.es
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
5-Hidroxitirosol (5-HT. Figura 1) es un
compuesto natural con estructura de polifenol
que ha mostrado previamente actividad frente
al VIH (1,2). En este trabajo mostramos como
5HT es capaz de disminuir la replicación viral
sin mostrar efecto tóxicos in vitro e in vivo.
OH
HO
HO
Figura 1. Estructura química
del 5-Hidroxitirosol (5-HT).
Virus recombinantes portadores de genes indicadores luciferasarenilla con diferentes propiedades (VIH wild type R5 y X4 tropicos,
pseudotipados con la envuelta de VSV o clones VIH resistentes a
distintos antiretrovirales ) fueron utilizados para infectar la línea celular
MT-2 o linfocitos primarios humanos (PBMCs). Se determinó la
potencia y toxicidad de 5HT a diferentes concentraciones de 5HT (3).
RESULTADOS
5HT es activo frente a la infección por diferentes subtipos y virus
fundadores in vitro
5-HT es activo frente a la infección por VIH en la sinapsis inmune
y en modelos de bicapa de células epiteliales
DC-SIGN
Founders
100
100
50
JR-Ren
S 5.1
S 8.1
S14(6.1)
80
60
100%
80%
%RLUs
A subtype
C subtype
D subtype
E subtype
F subtype
G subtype
%RLUs
%RLUs
150
60%
0%
0
100
1000
1
1
10
100
µM
1000
Untreated
µM
Figura 2. Actividad anti-VIH de hidroxitirosol (5-HT) en PBMCs preactivados
con PHA/IL-2 con los subtipos A, C, D, E, F and G (panel izquierdo) y con
virus fundadores (panel derecho). Los valores de IC50 estuvieron
comprendidos entre 30 y 60 µM sin diferencias significativas entre ellos.
5-HT es activo frente virus resistentes
NVP
5HT
250
NL-2169-Ren
NL4.3-Ren
NL-2169-Ren
150 NL-3INK-Ren
NL-3INK-Ren
100
%RLUs
%RLUs
200
5HT 200 mM
5-HT
“In vitro” la combinación de 5HT con Tenofovir es sinérgica,
mientras que con Lamivudina y Emtricitabina es aditiva
0
100
-50
0.01
1000
0.1
1
M
10
100
PBMCs
MT-2
1000
nM
Figura 4. Evaluación de la actividad de 5HT y Nevirapina (NVP) frente a
virus multiresistentes a ITNN, ITANs y IPs.
NL4.3-Luc
LTR-Luc
150
CI
CI
CI
5HT/TFV 5HT/FTC 5HT/3TC
0,237
1,110
1,070
0,558
0,897
1,100
Figura 5. Cálculo de los indices de combinación (CIs) para las
combinaciones de 5HT con Tenofovir (TFV), Emtricitabina (FTC) y
Lamivudina (3TC) (ratio 35/1, 250:1 y 100:1 respectivamente) en células MT2 y PBMCs preactivados con PHA/IL-2. Los datos fueron analizados
mediante el software Calcusyn.
La diana de 5HT es la transcripción viral y no actúa
en la entrada viral
5-HT
Transcription factors
150
150
150
100
100
%RLUs
%RLUs
100
50
CI: Combination Index:
>1.30 antagonismo fuerte
1.10–1.30 antagonismo débil
0.90–1.10 aditivo
0.70–0.90 sinergia débil
<0.70 sinergia fuerte
100
0
%RLUs
TDF 0,1 mM
Figure 3. Panel izquierdo: Inhibición de la infección por VIH mediada por
células DC-SIGN+. Cuando células DC-SIGN están presentes en el cultivo
celular, la potencia de 5HT es al menos 10 veces mayor, lo que sería esencial
para su activida microbicida, ya que la infección en mucosas está mediada
principalmente por celulas DC-SIGN+. Panel derecho: Inhibición de la
infección de PBCMs a través de monocapas de células de la mucosa uterina
(HEC-1A) o rectal (Caco2). 5HT inhibió la infección en ambos casos a niveles
similares a Tenofovir comparado con un control sin tratar (100%).
50
50
10
0%
100
NL4.3-Ren
150
1
10
50
0
NF-kB
NFAT
Sp1
50
%RLUs
10
Caco2
20%
20
1
Hec 1A
50%
40%
40
0
Dual chamber
100%
120%
%RLUs
5HT
HIV
HIV-VSV
100
50
0
-50
0
1
10
100
µM
1000
-50
1
10
100
µM
1000
1
10
100
µM
1000
0
0.1
1
10
100
1000
µM
Figura 6. Inhibición de la transcripción por 5HT. 5HT inhibe la transcripción del VIH completo (NL4.3-Luc) y la transcripción mediada por el promotor LTR (LTRLuc). El efecto es principalmente debido a la acción sobre NF-kB y Sp1. 5HT inhibe la replicación de virus VIH wild type y virus VIH pseudotipados con la
envuelta del VSV, lo que sugiere que el efecto antiviral es independiente de la entrada viral.
5HT no es tóxico in vivo
La administración tópica de un gel de 5HT a 3 concentraciones diferentes (30, 100 y 200 mM) no produjeron alteraciones significativas en la
mucosa vaginal de conejo.
CONCLUSIONES
A pesar de que la potencia no está en un rango alto, es activo es una amplia gama de situaciones, incluyendo virus resistentes a antiretrovirales
utilizados como microbicidas y virus fundadores y carece de toxicidad a concentraciones 100 veces más altas que su IC50. La formulación de
5HT en gel es fácil y barata y la combinación de 5HT con TFV, FTC y 3TC es sinérgica o aditiva in vitro. Estas características hacen al 5HT un
buen candidato a microbicida sólo o en combinación con otros fármacos.
AGRADECIMIENTOS
La investigación que ha conducido a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013) bajo el
acuerdo de subvención nº 305938 y nº 242135, y por el proyecto RD12/0017/0015, integrado en el Plan Nacional de I+D+I y cofinanciado por el ISCIIISubdirección General de Evaluación y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).
REFERENCIAS
1.
2.
3.
Lee-Huang S, Huang PL, Zhang D, Lee JW, Bao J, Sun Y, Chang YT, Zhang J, Huang PL. Discovery of small-molecule HIV-1 fusion and integrase inhibitors
oleuropein and hydroxytyrosol: part II. integrase inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 2007;354(4):879-84
Lee-Huang S, Huang PL, Zhang D, Lee JW, Bao J, Sun Y, Chang YT, Zhang J, Huang PL. Discovery of small-molecule HIV-1 fusion and integrase inhibitors
oleuropein and hydroxytyrosol: Part I. fusion [corrected] inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 2007;354(4):872-8
Garcia-Perez J, Sanchez-Palomino S, Perez-Olmeda M, Fernandez B, Alcami J. A new strategy based on recombinant viruses as a tool for assessing drug
susceptibility of human immunodeficiency virus type 1. J Med Virol. 2007;79(2):127-37