Download 1. introduccion - Tesis Electrónicas UACh

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Ingeniería en Alimentos
Determinación del efecto inhibidor In Vitro del jugo de
Cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait) sobre
microorganismos patógenos
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de
licenciado en Ingeniería en Alimentos.
Profesor Patrocinante: Sr. Haroldo Magariños H. - Técnico en Lechería Magíster en Ciencia y Tecnología de la leche - Instituto de Ciencia y
Tecnología de los Alimentos.
Carolina Sahr Corral
Valdivia Chile 2004
Profesores Informantes
Sra. Marcia Costa L. - Ingeniero Civil Bioquímico - Instituto de Ciencia y Tecnología de
los Alimentos.
Sr. Fernando Figuerola R. - Ingeniero Agrónomo - M. SC. - Instituto de Ciencia y
Tecnología de los Alimentos.
Dedicatoria
Dedicada a mi Mamá
María Soledad Corrales Llanos
Agradecimientos
En
forma muy especial y con mucho cariño a la Sra. Sade Selaive
Villarroel y el Sr. Haroldo
Magariños Hawkins, quienes fueron los
principales impulsores de esta investigación, gracias por su fundamental
guía, consejos y constante apoyo en cada una de las sucesivas etapas de
esta Tesis. También quiero agradecer a mis profesores informantes, la Sra
Marcia Costa Lobos y el Sr. Fernando Figuerola Rivas por manifestarse
siempre dispuestos y receptivos a las consultas realizadas. Muy
especialmente a toda mi familia y hermanos: Toño, Rocío y Solcito por
estar siempre conmigo en los momentos difíciles que se me presentaron
durante los años de estudio. A mi querida Abuelita por preocuparse de mi
incondicionalmente, apoyarme y brindarme todo su cariño, a mi querida
perrita “Nani” por despertarme en las mañanas y acompañarme a tomar
desayuno en los fríos días de invierno.
A mi amiga y compañera Mirtza Flores Parra, por su cooperación
generosa y acertadas sugerencias que contribuyeron a elevar la calidad de
este trabajo.
Finalmente manifiesto mis mas sinceros agradecimientos a todas aquellas
personas que de una u otra forma contribuyeron a que el esfuerzo realizado
durante el desarrollo de esta investigación se vea gratamente compensado
en estas páginas, y a todos mis profesores del Instituto de Ciencia y
Tecnología de los Alimentos quienes me dieron las herramientas para
crecer y la posibilidad de ser una profesional.
Carolina Sahr Corral.
RESUMEN
El propósito de la presente investigación fue determinar el efecto inhibidor del jugo de
cranberry sobre microorganismos patógenos. Los microorganismos estudiados fueron
Escherichia coli proveniente de pacientes con infecciones urinarias, Salmonella spp,
Listeria monocytogenes, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus.
Para tal objetivo, se utilizó el método del disco para determinar la sensibilidad de las
bacterias al jugo de cranberry, determinando halos de inhibición medidos en mm. Para
ello se sembró en superficie un césped aproximado de 106 ufc/mL y se colocaron sobre
ellas discos Whatman que fueron previamente impregnados en concentrado, y en las
diluciones de jugo de cranberry 1:1 hasta 1:50 mas un disco control ajustado a pH 2,7.
Posteriormente, las placas con los discos fueron incubados por 24 horas a las
temperaturas de Escherichia coli uropatógena, Salmonella spp, Staphylococcus aureus a
35 ±1°C y de Listeria monocytogenes y Pseudomona aeruginosa a 30 ±1°C. De los
resultados obtenidos se pudo concluir que el microorganismo Staphylococcus aureus
presentó una mayor sensibilidad a la inhibición del jugo de cranberry que los
microorganismos Salmonella spp, Escherichia coli uropatógena,
Pseudomona
aeruginosa y Listeria monocytogenes. Listeria monocytogenes en cambio, resultó ser
más resistente a la acción inhibitoria del jugo de cranberry la cual presentó diferencias
estadísticamente significativas a la inhibición de los microorganismos Pseudomona
aeruginosa, Escherichia coli uropatógena, Salmonella spp y Staphylococcus aureus.
Este estudio demostró que la actividad inhibitoria de jugo del jugo de cranberry para la
Escherichia coli se produjo hasta una dilución 1:20.
SUMARY
The purpose of the present research was to determine the inhibiting effect of cranberry
juice on pathogen microorganisms. Escherichia coli from urinary infected patients,
Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Pseudomona aeruginosa and Staphylococcus
aureus were the studied microorganisms.
The disc method to determine the bacteria sensibility of cranberry juice was used,
determining halos of inhibition measured in mm. A lawn surface of about 10 6 ufc/mL
was seeded and small Whatman discs-previously inoculated with concentrate-were put
on it, and in Cranberry juice dilutions of 1:1 to 1:50. A control disc adjusted to a pH of
2,7 was also used. Subsequently, the plates with discs and were incubated for 24 hrs at
35 ± 1º C for Escherichia coli spp, Salmonella spp, Staphylococcus aureus and at 30
±1ºC for Listeria monocytones and Pseudomona aeruginosa.
From the obtained results, it can be concluded that Staphylococcus aureus presented a
greater sensitivity to the cranberry juice discs than Salmonella spp, Escherichia coli
urinary pathogen, Pseudomona aeruginosa y Listeria monocytogenes.
Listeria
monocytogenes in turn, were found to be more resistant to the inhibitory action of the
cranberry juice and presented significant statistical differences with the microorganisms
Pseudomona aeruginosa,
Escherichia coli urinary pathogen, Salmonella spp y
Staphylococcus aureus. This study demonstrated that the inhibition of the Escherichia
coli was produced until a dilution of 1:20.
1. INTRODUCCION
La importancia de determinar la actividad antimicrobiana e inhibitoria del jugo de
cranberry sobre microorganismos patógenos, se debe principalmente al beneficio que
este producto puede aportar a la salud humana, debido a que dichos microorganismos se
hacen cada vez más resistentes a los tratamientos realizados por fármacos y antibióticos.
El jugo de cranberry ha sido ampliamente utilizado para el tratamiento y prevención de
las enfermedades del tracto urinario, siendo potente inhibidor de la adherencia de la
bacteria Escherichia coli a las paredes de las células de la vejiga. De acuerdo a lo
anterior, es posible que este producto tenga posibilidades de aplicación en
microbiología, medicina, farmacología, alimentación humana, y como
sanitizante
industrial. No obstante los conocimientos que se tienen sobre los positivos efectos del
jugo de cranberry en la inhibición de la bacteria Escherichia coli spp, no existen estudios
específicos cuantitativos in vitro respecto del grado de sensibilidad de otros
microorganismos al jugo de cranberry y por consiguiente su función como agente
inhibidor o bactericida.
Por lo tanto, parece importante determinar si el jugo de
cranberry presenta un mayor espectro de actividad antibacterial.
Así, la finalidad de este estudio es determinar el efecto inhibidor del jugo de cranberry,
ya sea concentrado o a través de sus respectivas diluciones acuosas sobre distintas cepas
bacterianas y Escherichia coli uropatógena, esta última muestra obtenida de pacientes
con infecciones urinarias provenientes del Instituto de microbiología del Hospital
Regional de la Ciudad de Valdivia.
HIPOTESIS:
Si el jugo de cranberry en su forma concentrada o diluida e independiente a su pH, tiene
efecto inhibidor sobre microorganismos patógenos de interés para la salud pública, dada
la propiedad antimicrobiana sobre la bacteria Escherichia coli.
En relación con la hipótesis señalada anteriormente se plantean los siguientes objetivos.
Objetivo general
Determinar el efecto inhibidor in vitro del jugo de Cranberry proveniente de la especie
Vaccinium macrocarpon Ait, sobre las bacterias Escherichia coli uropatógena,
Staphylococcus
aureus,
Salmonella spp,
Pseudomona aeruginosa
y Listeria
monocytogenes.
Objetivo específico
Estudiar la actividad inhibitoria del jugo concentrado de cranberry y sus diluciones
acuosas desde 1:1 hasta 1:50, sobre las bacterias Escherichia coli uropatógena,
Staphylococcus
monocytogenes.
aureus,
Salmonella spp,
Pseudomona aeruginosa
y Listeria
2. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. Cranberry
Según señala BUZETA (1997) el cranberry americano o cranberry de fruto grande
(Vaccinium macrocarpon Ait) ha sido clasificado por los taxónomos dentro de la familia
Ericaceae y el genero Vaccinium. Otra especie muy relacionada a la anterior, es el
cranberry europeo denominado "mosberry" o cranberry de fruta pequeña (vaccinium
oxycoccus L.) existiendo además, el "lingonberry" (vaccinium vitis-idaea L) y el
arándano o "blueberry" (vaccinium corymbosum L).
Dentro de las características del fruto, este corresponde a una baya de color rojo que
cuando madura alcanza un diámetro de 1 a 2 cm con su interior hueco, factor que le
imprime facilidad para suspenderse en el agua
y de esta manera cosecharse por
flotación. El color de la fruta varia entre rosado muy pálido o amarillo hasta un rojo
púrpura oscuro (BUZETA, 1997).
CHILE,
MINISTERIO
DE
AGRICULTURA,
FUNDACION
PARA
LA
INNOVACION AGRARIA (2002), señala que esta especie crece en forma silvestre en
los Estados Unidos y fue encontrado por los colonizadores a través de todo el noreste y
centro norte de ese país, descubriendo que los indios americanos consumían la fruta
fresca y preparaban con ella una salsa dulce que la utilizaban como medicina para curar
heridas y como tratamiento contra el envenenamiento. Por otra parte, ZUO et al. (2002),
señalan que el cranberry es un prominente producto de la agricultura de Massachusetts,
Wisconsin, Michigan, New Jersey, Oregón y Washington, debido a que el tamaño anual
de la cosecha es aproximadamente de 227 mil toneladas, los cuales son procesados 5%
en producto fresco, 35% como aderezos y concentrado ( varias aplicaciones) y un 60%
en jugos para beber.
El cranberry fue introducido en Chile a fines de la década de los 70, en la IX y X
Regiones, por una empresa norteamericana que actualmente maneja desde su producción
agrícola hasta su exportación en forma procesada hacia ese mismo mercado. Chile
cuenta con ventajas importantes en cuanto a condiciones de clima y suelo para el cultivo
y comercialización del cranberry. La potencialidad económica de este cultivo en nuestro
país radica en que los costos de mano de obra, tierra y riego son menores a los de
Estados Unidos. (FIA, 2002).
2.2. Composición química de los frutos y jugo de cranberry
Según relata, en forma general, BUZETA (1997) los frutos cranberry presentan bajas
calorías, alto contenido de vitaminas, minerales y buen porcentaje de fibras.
Adicionalmente, MILNER (2002) indica que contiene numerosos componentes
bioactivos, incluyendo tocotrienoles, antocianinas, flavonas y proantocianidinas. Este
último componente corresponde a un tanino condensado que ha demostrado exhibir una
gran actividad de antiadhesión bacterina. (Foo et al. citado por HOWELL, 2002).
Por otro lado, BUZETA (1997), señala que el contenido de azúcares solubles que
presenta el fruto es de gran importancia en su industrialización y comercialización,
indicando además, que el contenido de azúcares aumenta continuamente hasta que éste
logra su color característico, pudiendo variar entre un 5% y 10%. En el CUADRO 1 se
muestra la composición química de los frutos de cranberry maduros.
CUADRO 1. Composición química de los frutos cranberry.
Sustancia
Porcentaje
Humedad
Azúcares reductores
Acido cítrico
Acido málico
Acido quínico
Acido benzoico
Pectinas
Lípidos
Proteínas
Fibras
Cenizas
Vitaminas:
Vitamina A
Vitamina C
88,0
4,2
1,1
0,26
0,5 – 1,0
0,065
1,2
0,4
0,2
1,6
1,6
x 100 g. de fruta
40 UI
10,5 – 7,5 mg
FUENTE: BUZETA et al. (1997).
Por su parte, KUZMINSKI (1996), indica que el jugo de cranberry de 7,5% Brix
presenta una singular mezcla de ácidos orgánicos quínico, málico y cítrico, cuya
proporción permanece constante y permite que generalmente sea usada para asegurar la
autenticidad del jugo de cranberry. En el CUADRO 2 se muestra la composición
analítica del jugo de cranberry natural.
CUADRO 2. Composición de fruta y jugo de cranberry.
Ingrediente
Fruta de cranberry
Jugo de cranberry
Agua (%)
Sólidos (%)
Carbohidratos totales (g)
Azúcares (g)
Fibra dietética (g)
Proteína (g)
Grasa (%)
Minerales
Sodio (mg)
Potasio (mg)
Vitamina C (mg)
pH
86,5
13,5
12,7
No Analizados
1,2
0,4
0,2
92,9
7,1
6,8
3,7
0,1
<0,1
<0,1
1
71
13,5
NA
3,8
85,2
2
2,5
FUENTE: KUZMINSKI et al. (1996).
Por otro lado, ZUO et al. (2002) han cuantificado e identificado los componentes
antioxidantes fenólicos y bezoicos del cranberry americano por la técnica de iones
corriente totales (TIC), demostrando que el fruto tiene un alto contenido de ácidos
benzoico y fenólico (5,7 g/kg de fruta fresca), siendo el ácido benzoico el más abundante
(4,7 g/kg de fruta fresca), seguido por el ácido p- cumárico (0,25 g/kg fruta fresca) y
sinápico (0,21g/kg de fruta fresca). Complementario a lo señalado, ZHENG y WANG
(2003), han indicado que la actividad antioxidante de compuestos fenólicos en frutos
como el blueberry, cranberry, chokeberry y lingonberry varía entre las distintas especies.
2.3. Efectos del jugo de cranberry sobre la inhibición de la
Escherichia coli
Según los autores AVORN et al. (1994) y HAMILTON y MILLER (1994), LEE et al.
(2000), KONTIOKARI et al. (2001), ZUO y HOWELL (2002), OFEK y FOO (2003),
los mayores beneficios a la salud atribuidos al consumo de jugo de cranberry es la
prevención de las infecciones del tracto urinario, ya que este producto
inhibe la
adherencia de la bacteria Escherichia coli a las paredes de las células uroepiteliales
evitando de esta manera la infección.
SOBOTA (1984), investigó la inhibición de la adherencia bacterial in vitro aislando
cepas de Escherichia coli uropatógenas de 77 casos clínicos. En este estudio, el jugo de
cranberry inhibió a la bacteria sobre un 75%, además de inhibir otras especies,
incluyendo Proteus, Klebsiella, Enterobacter y Pseudomonas. El jugo también se
suministró a ratas por un periodo de 14 días, detectándose en la orina recolectada
inhibición en la adherencia de la Escherichia coli en un 80%. A su vez, la actividad de
antiadherencia fue detectada en la orina humana, donde 15 de 22 pacientes mostraron
inhibición de esta bacteria luego de 1 a 3 horas después de haber consumido una
cantidad aproximada de 466,5 g de jugo.
FLEET (1994), señala que para reducir las infecciones del tracto urinario utilizando jugo
de cranberry como medio no-farmacológico, éste debe ingerirse diluido a una
concentración 1:10 (100 mL de concentrado en 1 litro de agua) en cantidades de 300 a
500 mL por día, durante 6 meses. AVORN et al. (1994), demostraron que la ingestión de
jugo de cranberry previene la bacteriuria en ancianos principalmente por la acción del
ácido hipúrico, ya que el consumo de cranberry produce grandes cantidades de este
ácido que posteriormente es excretado en la orina. De acuerdo a los resultados,
concluyeron que al consumir 350 g de cranberries se producen 4,7 g de ácido hipúrico
(1.34%p/p), y que al ingerir aproximadamente 330 g de cranberries, 1,9 g del ácido
(0,58%p/p) se excreta en la orina, indicando además, que el origen del ácido hipúrico es
presumiblemente el ácido benzoico y el ácido quínico, los cuales tienen efecto
bacteriostático para la Escherichia coli en concentraciones de 1 a 2 mg/mL, pero para
lograr lo señalado anteriormente el pH de la orina debe reducirse hasta 5,5 para tener
efecto inhibitorio sobre la bacteria.
Igualmente, HOWELL (2002), señala que el ácido quínico del cranberry es el precursor
del ácido hipúrico el cual es un fuerte agente antibacterial. Para que este ácido realice el
efecto bacteriostático sobre la Escherichia coli, el pH de la orina debe ser reducido a un
mínimo de 5,0, a una concentración de 0,02 M, pero para alcanzar esos niveles, los
humanos necesitarían ingerir por lo menos 1500 mL de jugo de cranberry por día diluido
1:10, lo cual es considerado una alta ingesta para una persona.
No obstante lo anterior, actualmente se señala que la acidificación de la orina no es el
mayor factor responsable del efecto inhibidor del jugo de cranberry. Investigaciones
señalan que taninos condensados del cranberry llamados “proantocianidinas” pueden
inhibir la adherencia de la Escherichia coli, (MILNER, 2002). Las proantocianidinas del
cranberry son compuestos polifenólicos que pueden influenciar varios procesos
biológicos, incluyendo su alta capacidad antioxidante y propiedades anticancerígenas
(ZHENG y WANG 2003). Por su parte, HOWELL et al. (1998), señalan que las
proantocinidinas muestran otro tipo de actividades, tales como producción de enzimas
cancer-protectivas e inhibición de radicales superóxidos. YAN et al, (2002) sostienen
que los compuestos fenólicos en los cranberries son un diverso grupo, que incluyen
antocianinas, flavonas, proantocianidinas y ácidos fenólicos de bajo y alto peso
molecular.
De acuerdo a lo señalado por MARWAN y NAGEL (1986), quienes estudiaron el efecto
de los inhibidores microbianos de los cranberries sobre Saccharomyces bayanus y
Pseudomonas fluorescens, los componentes que aportaron en mayor proporción a la
inhibición de estos microorganismos son las proantocianidinas 21,3%, seguido a las
flavonas 18,5% y en menor proporción el ácido benzoico 15,6%.
Diversos autores, y entre ellos FOO et al. (2000 a), KONTIOKARI et al, (2001) y ZUO
et al (2002), indican que el mecanismo de inhibición consiste en que las
proantocianidinas del jugo de cranberry bloquean la adhesión de la fimbria-p de la
Escherichia coli uropatógena (antibiótico – resistentes) a las células del uroepitelio.
De acuerdo a lo indicado, HOWELL (2002), señala que la adherencia a las células
susceptibles de ser infectadas es facilitada por fimbrias que se encuentran unidas a la
pared celular bacteriana, las fimbrias producen adhesinas específicas que se adhieren a
su correspondiente receptor, el carbohidrato “alfa-Gal(1-4)ß-Gal” que se encuentra sobre
la superficie de las células uroepiteliales, de esta manera la bacteria libera las toxinas y
provoca la infección. Se ha determinado que la Escherichia coli presenta fimbrias tipo 1
y tipo p. El cranberry inhibe la adherencia de las especies uropatógenas con fimbrias tipo
p implicada en la cistitis, y en la más severa infección del riñón conocida como
pielonefritis (FOO et al.,2000 b).
AHUJA et al. (1998), indicaron que el jugo de cranberry inhibe irreversiblemente las
subunidades fimbriales tipo-p controlando y previniendo su expresión genética. Por su
parte, FOO et al. (2000a) aislaron extractos de proantocianidinas del cranberry por
fraccionamiento bio - ensayo dirigido. La fracción aislada exhibió una fuerte actividad
de antiadherencia a una concentración menor a ±75 g /mL.
Por otra parte, REID et al. (2001), en un estudio piloto con 15 pacientes con daños en la
médula espinal, población altamente susceptible a las infecciones urinarias,
determinaron que el jugo de cranberry reduce significativamente el biofilm del
uroepitelio disminuyendo la adhesión de bacterias Gram positivas y negativas sobre las
células de la vejiga.
BIERING et al. (2001), señalan que la población polimicrobiana uropatógena
frecuentemente aislada de pacientes con lesiones a la medula espinal, y que es sometida
a tratamientos con jugo de cranberry está compuesta generalmente por Escherichia coli,
Pseudomonas spp, Klebsiella spp, Proteus spp. Serratia spp, Providencia spp,
Enterococcus y Staphylococcus.
2.4. Actividad anti-adherencia del jugo de cranberry sobre
especies bacterianas no urinarias.
Diversos autores han señalado los efectos antimicrobianos del jugo de cranberry sobre la
bacteria Escherichia coli; sin embargo, se ha estudiado también su actividad de
antiadherencia sobre bacterias no urinarias. Tal es el caso de la inhibición de la
adherencia de bacterias bucales realizado por un material no dializable (MND) de alto
peso molecular aislado del jugo de cranberry en concentraciones de 0,6 a 2,5 mg/mL.
Por su parte, HAFFAJJEE y SOCRANSKY (2000), señalan que la formación de la placa
dental que provocan las caries involucra dos procesos, unión de la bacteria a la película
de saliva que cubre el diente y posteriormente la coagregación de dos diferentes tipos de
bacterias, generalmente de los géneros Streptococcus y Actinomyces.
Asimismo, WEISS et al. (2002), pudieron concluir que se requieren bajas
concentraciones de MND para inhibir la formación de tales coagregados, indicando que
el MND actúa preferencialmente sobre pares de bacterias bucales en la cual una de
ambos miembros es anaerobia Gram negativa.
A su vez, estudios preliminares
demostraron que el MND redujo el recuento de Streptoccoccus mutans, indicando que la
actividad de antiadhesión del jugo de cranberry tiene gran efectividad al alterar la
población microbiana subgingivial, controlando las enfermedades periodontales.
Conforme a lo indicado, BURGER et al. (2002), sostienen además que el (MND)
constituyente de alto peso molecular del cranberry también inhibe la adhesión especifica
de las especies de Helicobacter pylori que actúan sobre el mucus humano, las células de
cultivo gástrico epitelial y los eritrocitos. Según lo señalado, las especies de H. pylori se
diferenciaron en su afinidad al constituyente del jugo de cranberry, los resultados
indicaron que el MND inhibió la adhesión in vivo de las bacterias espirales, pudiendo
ser eventualmente útil en la prevención de úlceras estomacales causadas por esta
bacteria.
En la actualidad existe preocupación por las bacterias que se hacen cada vez más
resistentes a los fármacos y antibióticos. Una efectiva solución es el uso de agentes que
interfieran con la habilidad de algunas bacterias a adherirse a los tejidos del huésped.
Debido a que estos agentes antiadhesivos no son bactericidas, la propagación y
diseminación de especies resistentes es mucho menos probable como ocurre como
resultado a la exposición de agentes bactericidas tales como los antibióticos. Una vez
desarrollados fármacos anti-adhesivos, pueden servir como un nuevo medio para
combatir las enfermedades infecciosas (OFEK, et al 2003).
Es así como LEE et al. (2000), demostraron la actividad
bactericida del jugo
concentrado de cranberry, verificando un amplio espectro antibacterial al utilizar un
inóculo de 104 ufc/mL de cultivo colección tipo americano ATCC, utilizando Klebsiella
Pneumoniae como indicador.
CUADRO 3. Actividad bactericida del jugo concentrado de cranberry a 35 °C.
Bacteria
Escherichia.coli
Recuentos (ufc/mL)*
90 min. incubación
24 h de incubación
cultivo solo
cultivo
con cultivo solo
cultivo
con
concentrado de
concentrado de
cranberry
cranberry
7,7x103
8x102
3,7x108
0
Staphylococcus.a
Pseudomona. a
Enterococcus.f
Klebiella.pneum.
Proteus mirabilis
Salmonella. e
5,9x103
5,0x102
4,8x103
7,0x102
2,7x103
3x102
5x102
1,5x102
2,4x103
0
3x102
3x102
9x107
2,4x108
4,1x108
4,3x108
1,9x108
2x108
0
0
7,5x102
0
0
2,3x101
* Indica unidades formadoras de colonias; ATCC colección de cultivo tipo americano.
FUENTE: LEE et al. (2000).
3. MATERIAL Y METODO
El ensayo fue realizado en el laboratorio de Microbiología del Instituto de Ciencia y
Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) dependiente de la Facultad de Ciencias Agrarias
de la Universidad Austral de Chile (UACH), ubicada en la ciudad de Valdivia.
3.1. Cepas utilizadas
Los microorganismos utilizados corresponden a cepas de Escherichia coli de pacientes
con infecciones urinarias provenientes del Hospital Regional de la ciudad de Valdivia, y
cepas de Staphylococcus aureus, Salmonella spp, Pseudomona aeruginosa, Listeria
monocytogenes proporcionadas y analizadas en el Laboratorio de Microbiología del
Instituto de Ciencias y Tecnología de los Alimentos (ICYTAL).
3.2. Jugo concentrado de cranberry
Se utilizó jugo concentrado de cranberry de 55°Brix elaborado por las empresas
Agrícola Cran Chile y Bayas del Sur, ubicadas en la Décima Región.
3.3. Ensayos preliminares
Con el propósito de determinar el rango de concentraciones en el cual el jugo de
cranberry tiene efecto antibacterial sobre las distintas bacterias involucradas en este
estudio, se realizaron trabajos preliminares que consistieron en la identificación de las
cepas bacterianas mediante pruebas presuntivas y confirmativas según la metodología
descrita por IDF/FIL (1995) para los microorganismos Escherichia coli uropatógena,
Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y Pseudomona
aeruginosa.
3.3.1. Aislamiento de Escherichia coli uropatógena. Se aislaron cepas de Escherichia
coli uropatógenas proporcionadas en agar nutritivo (Nutrient Agar, Merck AG,
Darmstadt), provenientes de pacientes con infecciones urinarias no sometidos a
tratamiento con antibióticos, y posteriormente se confirmaron mediante pruebas
presuntivas y confirmativas, que continuación se detallan.
Pruebas presuntivas
Las colonias de Escherichia coli uropatógenas sospechosas, se sembraron en agar VRB
Bilis Rojo Violeta (Merck AG, Darmstadt) e incubadas a 30 ± 1°C por 24 ± 2 horas.
Luego del periodo de incubación, aquellas colonias rojas con o sin precipitado a su
alrededor, se sometieron a tinción de Gram, siendo observados bacilos característicos
Gram negativos. Posteriormente, las cepas se repicaron en agar nutritivo (Nutrient Agar
Merck AG) e incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48 horas.
Para la mantención y viabilidad de los microorganismos, estas cepas presuntivas se
almacenaron en condiciones de refrigeración a ± 7 °C.
Pruebas confirmativas
Las colonias presuntivas se sometieron posteriormente a medios de identificación
selectivos. De esta manera, se repicaron en tubos con caldo lactosado Bilis Verde
Brillante BVB (Brilliant-green 2%-Bile Broth Merck AG) con campana de Durham,
incubándose en baño maría a 35 ± 1°C por 24 a 48 horas, y en Caldo EC (Merck AG) a
44,5 °C por 24 a 48 horas observándose producción de gas en la campana de Durham.
Finalmente, se realizó la prueba de reacciones características de IMVIC para
Escherichia coli: Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato, confirmándose para
I (+), M (+), V (-), C (-).
3.3.2. Aislamiento de Salmonella spp. Se tomaron colonias sembradas previamente en
estría en placas de Agar SS (Salmonella Shigella Agar Merck AG) y Agar Sulfito de
Bismuto (Bismuth Sulfite Agar, acc. to Wilson-Blair, Merck AG) ambas incubadas a 35
a 37 °C durante 24 a 48 horas. A partir de estas placas, se aislaron colonias sospechosas
que fueron posteriormente sembradas en medios de diferenciación selectivos como son
agar TSI (Triple Sugar Iron Agar, Merck AG),en el cual se observó, luego del periodo
de incubación de 24 a 48 hr a 35°C, el cambio de color del medio desde rojo anaranjado
hasta amarillo con producción de H2S (Sulfuro de Hidrógeno) en el fondo del tubo. En
agar LIA (Lysine Iron Agar Merck AG) se verificó la descarboxilación de la lisina con
producción de Sulfuro de Hidrógeno (H2S) y viraje de color del medio a un violeta
oscuro característico de la especie Salmonella spp. Posteriormente, se realizaron pruebas
de reacciones características de Indol (-) Rojo de Metilo(-), Fenilalanina (-), Sorbitol(+)
y Urea (-).
3.3.3. Aislamiento de Pseudomona aeruginosa. A las colonias previamente sembradas
en superficie en Agar Cerebro Corazón (Brain Heart Agar Merck AG) adicionado con
inhibidores de la flora acompañante cefaloridina, ácido fusídico y cetrimida e incubados
previamente en aerobiosis a 25 °C durante 48 horas, se les realizó tinción de Gram,
donde se pudo observar la presencia de bacilos pequeños Gram negativos.
Posteriormente, se realizaron las pruebas de confirmación oxidasa y catalasa. Para ello
se colocó sobre un papel filtro, estrías de las colonias mediante un rastrillo de vidrio y
luego se agregó 2 a 3 gotas del reactivo tetrametil parafenilendiamina dihidroclorida
donde se pudo observar la reacción oxidasa positiva de coloración rosada intensa o
púrpura oscuro, en la zona con el cultivo. Para la prueba de la catalasa se colocó una
colonia en un portaobjeto, y luego se adicionó unas gotas de peróxido de hidrógeno (
H2O2 al 0,3%) donde se verificó la formación de burbujas por la liberación de oxígeno,
característico de la especie Pseudomona aeruginosa.
3.3.4. Aislamiento de Listeria monocytogenes. La identificación presuntiva se efectuó
por medio de la aislación de colonias café oscuras con halo o negras típicas de Listeria
monocytogenes en agar OXA (Oxford Listeria Selective Agar, Base Merck AG) y agar
LPM (PALCAM Listeria Selective Agar Base acc, Merck AG). Como prueba presuntiva
se realizo tinción de Gram, donde se comprobó la presencia de coco bacilos Gram
positivos de agrupación en empalizada, al mismo tiempo se realizó la prueba de
confirmación de la catalasa (reacción positiva). Finalmente, se realizaron las pruebas
bioquímicas de reacciones características del genero Listeria monocytogenes, mediante
la metodología descrita por IDF/FIL(1995): Motilidad a 25°C “tumbos” (+),
requerimiento de oxígeno (facultativa), crecimiento a 35°C (+), producción de H2S (-),
reacción del rojo metilo (+), reacción de Voges-Proskauer (+), producción de indol (-),
utilización del citrato (-), ácido desde la glucosa (+), hidrólisis de la Esculina (+),
fermentación de maltosa (+), fermentación de dextrosa (+), actividad de la ureasa(-).
3.3.5.
Aislamiento de Staphylococcus aureus. Colonias sospechosas de cepas de
Staphylococcus aureus, negras brillantes con o sin halo en medio selectivo, Agar BairdParker (Staphylococcus Selective Agar Base acc, to BAIRD-PARKER Merck AG), se
sometieron a la prueba de la coagulasa. Para ello las colonias se sembraron en forma
separada en tubos con caldo Cerebro Corazón (Brain Heart Broth, Merck AG) y se
incubaron a 35 ± 1°C por 30 horas. Posteriormente se traspasó 0,1 mL de cada cultivo a
tubos pequeños estériles conteniendo 0,3 mL de plasma de conejo adicionado con
EDTA, incubándose a 35°C durante 6 a 24 horas. Los tubos fueron chequeados
verificando la coagulación total o parcial, observándose la reacción positiva del
microorganismo Staphylococcus aureus (coagulación total en los tubos). A modo de
verificación se realizó tinción de Gram.
3.4. Inhibición bacteriana por el método del disco filtro
3.4.1. Activación de las cepas. Cada uno de los cultivos puros de Escherichia coli
uropatógena, Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y
Pseudomona aeruginosa se repicó en 5 mL de caldo Cerebro Corazón (Brain Heart
Broth, Merck AG) y se incubó durante 2 hr a 35 ± 1°C Escherichia coli uropatógena,
Salmonella spp, Staphyolococcus aureus, y a 30 ± 1°C Listeria monocytogenes y
Pseudomona aeruginosa, para obtener una concentración aproximada de 106 ufc/ mL.
Posteriormente, se sembró 0,1 mL de cada bacteria en la superficie de una placa con
Agar Plate Count (Casein-Peptone Dextrose Yeast Agar, Standard Methods Agar Merck
AG) para Escherichia coli uropatógena, Staphylococcus aureus, Salmonella spp y
Pseudomona aeruginosa, y con Agar Tripticasa de Soja (Tryptic Soy Agar, Merck AG)
para Listeria monocytogenes.
3.4.2. Ensayo de sensibilidad de la bacteria frente al jugo de cranberry. El ensayo
de la inhibición bacteriana se realizó haciendo una modificación de la técnica de
difusión sobre agar. Para ello se utilizaron las placas previamente sembradas con un
césped de una concentración de 106 ufc/mL (ver punto 3.5.1). Paralelamente, se
prepararon diluciones con agua destilada estéril del jugo concentrado de cranberry de 55
°Brix a pH 2,7. Las preparaciones fueron las siguientes:
Jugo concentrado de cranberry
Diluido a: 1:1, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50
Control: agua destilada ajustada a pH 2,7.
Mediante una pinza estéril se tomó el disco Whatman estéril de 9 mm de diámetro, el
cual fue impregnado en la respectiva dilución de jugo de cranberry, como testigo se
impregnó un disco con agua destilada estéril ajustado a pH 2,7 utilizado como control
del efecto ácido del cranberry. Los discos, posteriormente fueron depositados sobre la
superficie de la placa que contiene el césped de cultivo bacterial. Posteriormente, las
placas fueron incubadas invertidas por 24 horas a las temperaturas respectivas para cada
bacteria, para luego determinar halos de inhibición formados alrededor de los discos. El
tamaño del halo de inhibición se midió mediante un pie de metro digital, midiendo en
milímetros la distancia correspondiente entre el borde del disco y el inicio del cultivo.
Todas las mediciones se realizaron en triplicado.
Paralelamente, se le realizó un recuento total en placa en superficie al cultivo puro en
agar Plate Count (Casein-Peptone Dextrose Yeast Agar, Standard Methods Agar Merk
AG, Darmstadt), mediante una modificación de la metodología de APHA (1992),
descrita a continuación:
Se tomó 1 mL del caldo de cultivo puro, y se realizaron las siguientes diluciones: (-3,-4,
-5) en tubos de tapa rosca con 9 mL de diluyente (buffer fosfato a pH 7,0) y luego se
sembró en superficie 0,1 mL de cada dilución en placa de Petri con Agar Plate Count
(PC) para Escherichia coli uropatógena, Staphylococcus aureus, Salmonella spp y
Pseudomona aeruginosa, y en agar tripticasa de soja (ATS) para Listeria
monocytogenes.
Posteriormente, las placas se incubaron invertidas: Escherichia coli uropatógena,
Salmonella spp, Staphylococcus aureus, incubadas a 35 ± 1°C y las colonias de Listeria
monocytogenes y Pseudomona aeruginosa incubadas a 30± 1°C durante 24 a 48 h. La
lectura de las placas se realizó en la dilución cuya placa presentara un número entre 25
y 250 colonias, expresando el resultado en ufc/mL.
3.5. Diseño experimental para la inhibición bacteriana por
medio de discos
El diseño experimental utilizado consistió en un diseño multifactorial 5X12X3 de 2
factores representados por bacteria y concentración, cuyos parámetros corresponden a
los 5 microorganismos afectados por la inhibición Escherichia coli uropatógena,
Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y Pseudomona
aeruginosa. El factor 12 corresponde a los tratamientos efectuados con las
concentraciones de jugo de cranberry incluido el control, y el factor 3 involucra el
número de repeticiones.
3.6. Análisis estadísticos
La inhibición bacterial por efecto del jugo de cranberry fue evaluada mediante
estadística descriptiva y análisis de varianza de una vía (ANDEVA) utilizando el
software estadístico Statgraphics 5.1. En caso de encontrarse diferencia significativa (p <
0,05) entre resultados se realizó una prueba de rango múltiple con el fin de determinar la
magnitud de la diferencia.
4. PRESENTACION Y DISCUSION DE
RESULTADOS
4.1. Inhibición bacteriana por medio de discos filtro
En el CUADRO 4 se muestran los halos en milímetros de los microorganismos
Escherichia coli uropatógena, Staphylococcus aureus, Salmonella spp, Pseudomona
aeruginosa y Listeria monocytogenes, formados al aplicar discos impregnados en las
distintas diluciones del jugo de cranberry.
Según el análisis estadístico (ANDEVA) en general se encontraron diferencias
significativas(p0,05) entre las distintas concentraciones de jugo de cranberry estudiadas
y los distintos microorganismos afectados por la inhibición. Como lo indican las letras
mayúsculas diferentes en las columnas y letras minúsculas diferentes en las filas del
CUADRO 4.
Según los resultados presentados en el CUADRO 4, no hubo inhibición microbiana por
parte del agente ácido, disco control (agua destilada ajustada a pH 2,7), ya que la
inhibición de Listeria monocytogenes, Escherichia coli uropatógena y Salmonella spp
fue de 0 ± 0 mm, una mínima inhibición de 0,03 ± 0,02 para Pseudomona aeruginosa y
0,03 ±0,02 mm para Staphylococcus aureus. Por lo anterior, en este estudio el efecto
inhibidor del jugo de cranberry no se debió a su bajo pH, sino a sus componentes
antimicrobianos. Aunque en esta investigación no se estudiaron los componentes
específicos del jugo de cranberry
que tienen efecto inhibidor sobre los
microorganismos, los resultados se relacionaron con las investigaciones realizadas por
diversos autores. FOO et al. citado por HOWELL (2002) LEE, et al. (2002) MILNER
(2002), quienes señalaron que el jugo de cranberry contiene numerosos componentes
bioactivos responsables de la inhibición, principalmente flavonas y proantocianidinas.
CUADRO 4. Halos de inhibición bacteriana.
Halos de inhibición (mm)a
Listeria m Pseud. a
E.coli
Salmonella
Staphy. a
9,50±1,01 12,16±2,97
A
A
11,07±0,48
A
12,62±2,18
A
14,58±1,03
A
1:1
a
b
6,76±1,57 9,43±3,13
B
B
bc
9,81±1,77
B
c
11,96±1,17
B
d
12,27±1,35
B
1:10
a
b
0,66±0,58 1,75±0,40
C
C
bc
3,24±0,82
C
c
4,84±1,31
C
d
5,63±0,9
C
1:15
a
b
0,01±0,01 1,13±0,94
D
D
bc
1,42±0,35
D
c
1,30±0,68
D
d
4,24±1,41
D
1:20
a
0±0
DE
b
0,25±0,11
DE
bc
0,96±0,32
DE
c
0,94±0,29
DE
d
2,73±0,56
DE
1:25
a
0±0
DE
b
0,13±0,02
DE
bc
0±
DE
c
0 0,55±0,04
DE
d
2,37±0,49
DE
1:30
a
0±0
E
b
0,12±0,02
E
bc
0±0
E
c
0,21±0,01
E
d
2,0±0,17
E
1:35
a
0±0
E
b
0,07±0,05
E
bc
0±0
E
c
0,17±0,15
E
d
1,15±0,03
E
1:40
a
0±0
E
b
0,06±0,05
E
bc
0±0
E
c
0,07±0,06
E
d
0,84±0,60
E
a
b
bc
c
d
Concentra
ciones
Concentrado
0±0
E
0,07±0,04
E
0±0
E
0,01±0,01
E
0,75±0,05
E
1:50
a
0±0
E
b
0,03±0,03
E
bc
0±0
E
c
0,01±0,01
E
d
0,35±0,3
E
Control
a
0±0
E
b
0,03±0,02
E
bc
0±
E
c
0 0±0
E
a
b
bc
c
1:45
a
d
0,03±0,02
E
d
Corresponde al promedio de tres repeticiones ± Desviación Estándar.
Letras mayúsculas diferentes en las columnas, indican diferencia significativa estadística entre concentraciones de
acuerdo a la prueba de rango múltiple de Tukey al 95%.Letras minúsculas diferentes en las filas, indican diferencia
significativa estadística entre bacterias de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Tukey al 95%.
FIGURA 1.
Inhibición de Escherichia coli uropatógena, Salmonella spp, Listeria
monocytogenes, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus por efecto de las
distintas diluciones de jugo de Cranberry.
Según el CUADRO 4 y la FIGURA 1 se puede inferir que dentro de los
microorganismos involucrados en este estudio Staphylococcus aureus es el que presentó
una mayor sensibilidad a los tratamientos con jugo de cranberry ya sea concentrado y
diluido. Los resultados indicaron que al utilizar un césped de 1,27x106 ufc/mL se
produjo una inhibición en el concentrado con un halo promedio de 14,58 ±1,03 mm
prolongándose hasta la dilución 1:50 con un halo de 0,35 ± 0,3 mm, también se logró
inhibición al utilizar el disco control con un halo de 0,03 ± 0,02 mm. En el CUADRO 4
se indican los valores promedios obtenidos en las tres repeticiones. Estos datos se
muestran en detalle en los ANEXOS 1.5 y 2.5.
Respecto de la inhibición de Staphylococcus aureus, resulta pertinente destacar las
propiedades de inhibición del jugo de cranberry sobre bacterias Gram positivas. WEISS
et al. (2002), aislaron constituyentes de alto peso molecular denominados MND
(material no dializable) del jugo de cranberry en concentraciones de 0,6 a 2,5 mg/mL,
ellos indicaron que el MND redujo el recuento de Streptoccocci Mutans, con lo cual se
altera la población microbiana sugingivial controlando las enfermedades periodontales.
De acuerdo a los resultados obtenidos al aplicar el disco con concentrado de jugo de
cranberry, Pseudomona aeruginosa presentó una inhibición de 12,16 ± 2,97 mm menor
que el Staphylococcus aureus de 14,58 ±1,03 mm de inhibición. A la vez, desde las
diluciones 1:35 a 1:50, las inhibiciones de Pseudomona euruginosa demostraron ser
menores al Staphylococcus aureus. Por su parte LEE et al, (2000), afirman que
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 fue reducida en 8.3 ciclos logarítmicos en un
cultivo con concentrado de cranberry diluido 1:1 en comparación al tratamiento sin el
jugo de cranberry, luego de inocular 104 ufc/mL por un periodo de 24 horas a 35°C.
Sin embargo, al analizar estadísticamente la inhibición bacterial mediante análisis de
varianza (ANDEVA) fue posible comprobar que existe diferencia significativa (p0,05)
en la inhibición de Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus, como se observa
en las letras minúsculas de las filas del CUADRO 4 y como se puede comprobar en el
ANEXO 4.
Por otra parte, los resultados difieren a lo señalado por HABASH, et al. (1999), quienes
en un estudio in vivo administraron agua, ácido ascórbico y jugo de cranberry. Se pudo
demostrar que en la orina se redujo el recuento y la adherencia de Escherichia coli y
Enterococcus faecalis, pero no de Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus epidermis y
Candida albicans.
En el caso de la bacteria Salmonella spp, se determinó que al utilizar un césped de
5,3x106 ufc/mL, se verificó una mayor inhibición en el concentrado de 12,62 ± 2,18 mm,
hasta un menor halo de inhibición registrado en la dilución 1:50 de 0,01±0,01 mm, en el
disco control no se observó inhibición, tal como se observa en el CUADRO 4 y en la
FIGURA 1.
Sin embargo, esta bacteria no presenta diferencia estadística significativa (p 0,05)
respecto a la inhibición de la Escherichia coli uropatógena. Pero, sí presenta diferencia
significativa estadística (p 0,05) con Listeria monocytogenes, Pseudomona aeruginosa
y Staphylococcus aureus, como lo indican las letras minúsculas de las filas del
CUADRO 4 y ANEXO 4.
Por su parte LEE et al. (2000), indicaron que al diluir 1:1 el jugo concentrado de
cranberry e inocular 104 ufc/mL de la bacteria Salmonella enteritidis ATCC 14028, a las
24 horas de incubación a 35°C, se obtuvo un recuento de 2,3x101 ufc/mL, 7.1 ciclos
logarítmicos menos que el cultivo sin jugo de cranberry, en que se obtuvo un recuento
de 2,8x108 ufc/mL.
Para la bacteria Escherichia coli uropatógena, en un césped de 9,2x106 ufc/mL, se
observó que su máxima inhibición fue registrada en el concentrado de jugo de cranberry
con un halo de 11,06 ± 0,48 mm, y una menor inhibición en la dilución 1:20 con un
halo de 0,96 ± 0,32 mm, por consiguiente no es inhibida desde la dilución 1:25 hasta el
control, tal como se muestra en el CUADRO 4 y en la FIGURA 1, pudiendo consultarse
los detalles en el ANEXO 1.1 y 2.1.
Esto concuerda y amplía lo señalado por FLEET (1994), quien indicó que para reducir
las infecciones del tracto urinario causada por la bacteria Escherichia coli, el jugo de
cranberry debe ingerirse diluido a una concentración 1:10 (100 mL de concentrado en 1
litro de agua), en una cantidad de 300 a 500 mL por día, durante 6 meses. Sin embargo,
se pudo determinar en este estudio que el jugo de cranberry inhibe a la bacteria a una
dilución 1:20, mayor a la especificada por el autor para una población de 9,2 x106
ufc/mL.
Tal como se señala en el CUADRO 4 al analizar estadísticamente los datos mediante
análisis de varianza (ANDEVA) se detectó diferencia estadística (p 0,05) entre la
inhibición de Escherichia coli uropatógena, Listeria monocytogenes y Staphylococcus
aureus. Sin embargo esta bacteria no presentó diferencia estadística (p  0,05) con los
microorganismos Pseudomona aeruginosa y Salmonella spp. como se observa en el
CUADRO 4 y en la FIGURA 1.
Al respecto, puede señalarse la actividad bactericida del jugo concentrado de cranberry
sobre cepas de cultivo tipo americano ATCC de Escherichia coli, al inocular de 104
ufc/ml del cultivo ATCC en un caldo
solo y otro con jugo de cranberry ambos
incubados a 35 °C. Se pudo determinar a las 24 horas actividad antibacterial en el jugo
de cranberry diluido a un máximo de 1:32, en que la Escherichia coli fue reducida en el
cultivo solo a 3.7 x108 ufc/mL y a 0 ufc/mL en caldo con jugo de cranberry (LEE, et al.
2000).
De los resultados obtenidos se desprende que, aunque la mayoría de las investigaciones
sobre la inhibición microbiana con jugo de cranberry se centraron en la bacteria
Escherichia coli, según los autores AVORN et al y HAMILTON y MILLER (1994),
LEE et al. (2000), KONTIOKARI et al. (2001), ZUO y HOWELL (2002), OFEK y
FOO (2003), también se puede relacionar con la inhibición de algunos microorganismos
patógenos como lo son Salmonella spp y Pseudomona aeruginosa ya que según este
estudio el jugo de cranberry las inhibe de igual manera.
De acuerdo a esta investigación fue posible notar que la bacteria menos inhibida fue
Listeria monocytogenes en comparación a los demás microorganismos involucrados en
el ensayo como se muestra en el CUADRO 4, en el cual presentó una inhibición
utilizando el disco impregnado en el concentrado de jugo de cranberry de 9,50 ± 1,01
mm y una menor inhibición en la dilución 1:15 de 0,01± 0,01 mm al utilizar un césped
de 5,5X106 ufc/mL tal como se observa en la FIGURA 1.
Al igual que las bacterias Escherichia coli uropatógena
y Salmonella spp no fue
inhibida por el disco control. Aunque no existen datos específicos sobre la actividad
inhibitoria del jugo de cranberry sobre Listeria monocytogenes se han obtenido
resultados acerca de las propiedades antimicrobianas relacionada a compuestos fenólicos
tales como catequinas y ácidos como el ácido clorogénico, cafeico, quínico y gálico
sobre Listeria monoytogenes y Escherichia coli O157:H7 (YOUNG, 2004). Cabe
recordar que el fruto cranberry contiene un alto contenido de ácido benzoico y fenólico,
5,7 g/kg de fruta fresca, (ZUO et al., 2002) y ácidos cítrico, málico y quínico, como se
observó en el CUADRO 1.
Al analizar estadísticamente los datos para el factor inhibición, se detecto diferencia
estadística (p0,05) entre la inhibición de Listeria monocytogenes con respecto a los
microorganismos Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli uropatógena, Salmonella y
Staphylococcus aureus, tal como se observa en las letras minúsculas en las filas del
CUADRO 4.
4.2. Inhibición bacterial por efecto de la concentración del
jugo de cranberry
Según indica el CUADRO 4, para las cinco bacterias sometidas a este estudio, los halos
con radio de inhibición mayor fueron observados en el tratamiento con el concentrado y
las diluciones 1:1, 1:10, 1:15 tal como se observa en la FIGURA 1 los halos de
inhibición producidos por el jugo de cranberry sobre los distintos microorganismos.
Se pudo determinar según la presente investigación que el jugo de cranberry inhibe a la
bacteria Escherichia coli uropatógena a una dilución 1:20, mayor a la especificada por
FLEET (1994) demostrando además actividad antibacterial al ser diluido 1:10 contra los
microorgansimos Salomonella spp, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus y
Listeria monocytogenes.
Según el análisis de varianza (ANDEVA) se detectó diferencia estadística significativa
(p0,05) entre las concentraciones 1:1, 1:10 y 1:15 siendo el concentrado el que aporta
mayor inhibición. A la vez se observó que no existe diferencia estadística significativa
entre las diluciones 1:15 y 1:20, lo que indica que tienen el mismo efecto inhibitorio
para los microorganismos tratados en el ensayo. Por su parte, las menores inhibiciones
fueron registradas desde la dilución 1:20 hasta 1:50 no encontrándose diferencias
estadísticas significativas (p >0,05) con el disco control, lo que demuestra que en este
rango de concentraciones comienza a disminuir la actividad inhibitoria del jugo de
cranberry, tal como se muestra en las columnas del CUADRO 4 y el ANEXO 5.
FIGURA 2.
Morfología de los halos de inhibición del jugo de cranberry sobre
Escherichia coli uropatógena, Salmonella spp, Staphylococcus aureus, en placas de agar
Plate Count incubadas a 35 ± 1°C y Listeria monocytogenes y Pseudomona aeruginosa
en placas de agar tripticasa de soja a 30 ± 1°C durante 24 a 48 h.
5. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos en la presente investigación se pueden extraer las
siguientes conclusiones:
El jugo de cranberry, proveniente de la especie Vaccinium macrocarpum Ait. de
55°Brix, presentó efecto inhibidor in vitro sobre los microorganismos Escherichia coli
uropatógenas, Staphylococcus aureus, Salmonella spp, Pseudomona aeruginosa y
Listeria monocytogenes, independiente a su pH ácido.
El efecto inhibitorio sobre la Escherichia coli uropatógena causante de las infecciones
urinarias, puede producirse al utilizar una dilución acuosa 1:20 del jugo concentrado de
cranberry.
En general, mediante discos filtro se evidenció un mayor efecto inhibitorio del jugo de
cranberry sobre microorganismos patógenos al estar este en su forma concentrada y
diluida a 1:1, 1:10 y 1:15.
Staphylococcus aureus presentó una mayor sensibilidad a la inhibición por parte del
jugo de cranberry que los microorganismos Salmonella spp, Escherichia coli
uropatógena Pseudomona aeruginosa y Listeria monocytogenes.
Listeria monocytogenes, resultó ser más resistente a la acción inhibitoria del jugo de
cranberry.
Los resultados obtenidos en este estudio establecen una base de información útil para
continuar investigando sobre posibles aplicaciones prácticas beneficiosas para la salud
humana.
BIBLIOGRAFIA
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. ( APHA ) 1992.
Standard
Methods for the Examination of Dairy Products. Robert T. Marshall, Editor. 16th ed.
Washington. 546 p.
AHUJA, S.,KAACK, B., y ROBERTS, J. 1998. Loss of fimbrial adhesion with the
addition of Vaccinium macrocarpon to the growth medium of P-fimbriated Escherichia
coli. Journal Urology. 159(2): 559-562.
AVORN,J.,MONAME,M.,GURWITZ,J.H.,GLYNN,R.J.,CHOODNOVSKIY,I.,LIPSIT
Z. 1994. Reduction of bacteriuria and pyuria after ingestion of cranberry juice. The
Journal of the American Medical Association. 1(271):751-754.
BEACHEY, E.H.1981.Bacterial adherence:adhesion-receptor interactions mediating the
attachment of bacterial to mucosal surface. J.Infect.Dis. 143(3):325-354.
BIERING,S.,BAGI,P., y HOIBY,N. 2001. Urinary tract infections in patients with spinal
cord lesions: treatment and prevention. Drugs. 61(9):1275-1287.
BUZETA, A. 1997. Chile: Berries para el 2000. Departamento Agroindustrial
Fundación Chile. Pp. 15-19.
BURGER, O., OFEK, I., TABAK,M.,WEISS, E., SHARON,N., y NEEMAN, I. 2002. A
high molecular mass constituent of cranberry juice inhibits helicobacter pylori adhesion
to human gastric mucus. Fems Immunology Med Microbiol. 29(4): 295-301.
CHILE,
MINISTERIO
DE
AGRICULTURA,
FUNDACION
PARA
LA
INNOVACION AGRARIA, (FIA). 2002. Estrategia de Innovación Agraria para
Producción de Berries. Santiago de Chile. 19 p.
FLEET JC.1994. New support for a folk remedy: Cranberry juice reduces bacteriuria
and pyuria in elderly women. Nutrition Reviews. 52(5):168-170.
FOO, l., LU, Y., HOWELL, A.B., y VORSA, N. 2000a. The structure of cranberry
proanthocyanidins which inhibit adherence of uropathogenic P-fimbriated Escherichia
coli in vitro. Phytochemistry, 54: 173-181.
FOO, I., LU,Y., HOWELL,
AB., y VORSA, N. 2000b. A-type proanthocyanidin
trimers from cranberry that inhibit adherence of uropathogenic P-fimbriated Escherichia
coli. Journal Nat. Prod. Chemistry. 63(9):1225-1228.
HABASH,M.,VAN DER MEI,H.,BUSSHER,H.,REID. 1999. The effect of water,
ascorbic acid, and cranberry derived supplementation on human urine and uropathogen
adhesion to silicone rubber. Can Journal Microbiology. 45(8):691-694.
HAFFAJJEE, A., y SOCRANSKY, S. 2000. Microbial etiological agents of destructive
periodontal diseases. Microbiology and Immunology of Periodontal Diseases.201-223p.
HAMILTON y MILLER. 1994. Reduction of bacteriuria and pyuria using cranberry
juice. The Journal of the American Medical Association. 8(272):24-3.
HOWELL, A.B. 2002. Cranberry proanthocyanidins and the maintenance of urinary
tract health. Critical reviews in food science and nutrition. 42(suppl.):273-278.
(IDF/FIL) INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION. 1995. Detection of Salmonella
spp and Listeria monocytogenes. Bulletin 93A –143B: 2-7.
HOWELL,A.B, N,VORSA , MADEROSIAN,A., y FOO,LY.1998. Inhibition of the
adherence of p-fimbriated Escherichia coli to uroepithelial-cell surfaces by
proanthocyanidin extracts from cranberries. N.Engl.J.Med. 339(15):1085-1086.
KONTIOKARI,T.,SUNDQVIST,K.,NUUTINEN,M.,PKKA,T.,KOSKELA,M.y UARI,
M. 2001. Randomized trial of cranberry lingonberry juice and lactobacillus GG drink for
the prevention of urinary tract infections in women. Br. Med.J.322.1571-1573.
KUZMINSKI, L.N. 1996. Cranberry juice and Urinarry Tract Infections: Is There a
Beneficial Relationship?. Nutrition Reviews, 54 (11):87-90
LEE,L.,Y, OWENS,J, THRUUPP,L, y CESARIO, T. 2000. Does cranberry juice have
antibacterial activity?. The Journal of the American Medical Association. 13(283): 1691.
MARWAN, A., y NAGEL, C. 1986. Microbial Inhibitors of Cranberries. Journal of
Food Science, 51(4): 1009-1013.
MILNER,J.,A, 2002. Foods and health promotion: The case for cranberry. Critical
reviews in food science and nutrition. 42(suppl):265-266.
OFEK, I.,HASY,DL., y SHARON,N. 2003. Anti-adhesion therapy of bacterial diseases:
prospects and problems. Fems Inmunology and Medical Microbiology. 38 (3): 181-191.
OFEK, I., y FOO,I. 2003. Anti-Escherichia adhesin activity of cranberry and blueberry
juices. N.England.J.Med. 324(22):1599.
REID,G.,HSIEHL,J.,POTTER,P.,MIGHTON,J.,LAM,D.,WARREN,D.,y
STEPH
ENSON, J. 2001. Cranberry juice consumption may reduce biofilms on uroepithelial
cells. Spinal Cord.39(1):26-30.
SOBOTA, A. 1984. Inhibition of bacterial adherence by cranberry juice: Potential use
for the treatment of urinary tract infections. The Journal of Urology. (131):1013-1016.
WEISS, E, BURGER,O.,SHARON,N, TABAK,M, NEEMAN, I., y OFEK,I. 2002.
Inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucus by a high-molecularweight constituent of cranberry juice. Critical reviews in Food Science and Nutrition.
42(suppl.): 279-284.
YAN, X.,MURPHY, B., HAMMOND, G., VINSON, J., y NETO,C. 2002. Antioxidant
activities and antitumor screening of extracts from cranberry fruit (Vaccinium
macrocarpon). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50(21):5844-5849.
ZHENG, W. y WANG, S.Y. 2003. Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in
Blueberries, Cranberries, Chokeberries, and Lingonberries. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 51(2): 502-509.
ZUO, Y., WANG, C y ZHAN, J. 2002. Separation, Characterization, and Quantitation
of Benzoic and Phenolic Antioxidants in American Cranberry Fruit by GC-MS. Journal
of Agricultural and Food Chemistry. 50 (13): 3789-3794.
ANEXOS
ANEXO 1
Halos de inhibición de microorganismos, formados por el control, concentrado y
las diluciones 1:1, 1:10, 1:50 (método del disco).
1.1. Escherichia coli uropatógena.
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
Halos de inhibición (mm)
control
concentrado
0
10,98
0
11,58
0
10,64
0
11,07
1:1
7,78
10,93
10,73
9,81
1:10
3,82
3,61
2,30
3,24
1:50
0
0
0
0
0
1,76
0,82
0
0,48
1.2. Salmonella spp.
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
Halos de inhibición (mm)
control
concentrado
0
14,45
0
10,21
0
13,20
0
12,62
1:1
13,08
12,07
10,74
11,96
1:10
6,20
4,73
3,58
4,84
1:50
0
0,01
0,01
0,01
0
1,17
1,31
0,006
Halos de inhibición (mm)
control
concentrado
0
10,42
0
9,66
0
8,42
0
9,50
1:1
8,57
5,75
5,97
6,76
1:10
0
1,04
0,95
0,66
1:50
0
0
0
0
0
1,57
0,58
0
Halos de inhibición (mm)
control
concentrado
0,02
9,39
0,01
11,81
0,05
15,29
0,03
12,16
1:1
6,94
8,4
12,95
9,43
1:10
1,94
1,29
2,03
1,75
1:50
0,06
0
0,04
0,03
0,02
3,13
0,4
0,03
2,18
1.3. Listeria Monocytogenes
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
1,01
1.4. Pseudomona aeruginosa
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
2,97
1.5. Staphylococcus aureus
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
Halos de inhibición (mm)
control
concentrado
0,01
14,20
0,02
13,80
0,50
15,75
0,03
14,58
1:1
11,95
11,10
13,75
12,27
1:10
5,34
4,92
6,64
5,63
1:50
0,50
0
0,55
0,35
0,02
1,35
0,9
0,30
1,03
ANEXO 2
Halos de inhibición de microorganismos, formados por las diluciones entre 1:10 y
1:50 (método del disco)
2.1. Escherichia coli uropatógena.
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
Halos de inhibición (mm)
1:15
1:20
1:25
1,76
1,33
0
1,07
0,81
0
1,44
0,74
0
1,42
0,96
0
1:30
0
0
0
0
1:35
0
0
0
0
1:40
0
0
0
0
1:45
0
0
0
0
0,35
0
0
0
0
1:30
0,20
0,21
0,22
0,21
1:35
0,23
0
0,27
0,17
1:40
0,1
0
0,1
0,07
1:45
0,01
0
0,01
0,01
0,32
0
2.2. Salmonella spp.
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Halos de inhibición (mm)
1:15
1:20
1:25
1,49
0,80
0,52
0,54
0,75
0,54
1,86
1,28
0,60
1,30
0,94
0,55
Desv.
estándar.
0,68
0,29
0,04
0,01
0,15
0,06
0,01
Concentración de jugo de cranberry en los discos
1:15
1:20
1:25
1:30
1:35
1:40
0,02
0
0
0
0
0
0,02
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,01
0
0
0
0
0
1:45
0
0
0
0
0,01
0
2.3. Listeria monocytogenes
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
0
0
0
0
0
2.4. Pseudomona aeruginosa
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
Concentración de jugo de cranberry en los discos
1:15
1:20
1:25
1:30
1:35
1:40
0,16
0,15
0,11
0,12
0,12
0,11
1,20
0,23
0,15
0,1
0,06
0,06
2,04
0,36
0,14
0,13
0,02
0,01
1,13
0,25
0,13
0,12
0,07
0,06
1:45
0,12
0,05
0,05
0,07
0,94
0,05
0,04
Concentración de jugo de cranberry en los discos
1:15
1:20
1:25
1:30
1:35
1:40
4,50
2,13
2,92
2,16
1,17
0,15
2,71
2,82
1,98
1,82
1,12
0,15
5,50
3,24
2,21
2,02
1,15
1,22
4,2366 2,73
2,37
2,0
1,15
0,84
1:45
0,8
0,76
0,7
0,75
1,4135
0,05
0,11
0,02
0,02
0,05
2.5. Staphylococcus aureus
Repetición
1
2
3
Promedio.
aritmético
Desv.
estándar.
0,56
0,49
0,17
0,03
0,60
ANEXO 3
Análisis de varianza para la inhibición – suma de cuadrados tipo III.
Fuentes de variación Suma de
cuadrados
A: Bacteria
122,13
Gl
F
p
4
Cuadrado
medio
30,78
42,95
0,0000
B: Concentración
2793,17
11
253,93
354,32
0,0000
Interacción AB
99,67
44
2,27
3,16
0,0000
Error
85,99
120
0,72
TOTAL
3101,97
179
Todos los valores de F están basados en el cuadrado medio del error residual.
ANEXO 4
Prueba de rango múltiple para la inhibición por bacteria
Method: 95,0 percent tukey LSD
ANEXO 5
Prueba de rango múltiple para la inhibición por concentración