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Herramientas
biotecnológicas para
la producción de
planta forestal en el
futuro escenario de
cambio climático
Paloma Moncaleán
BIOECONOMIA, Argentina 2015
Intergovernmental Panel of Climate Change (IPCC)
Temperaturas
Supervivencia
Disponibilidad de agua
Productividad
1º Alternativa: mejora de la
producción forestal
Plan Nacional de Investigación
“ … Análisis y mejora de los sistemas de
producción agrícola y forestal, actuando sobre la
mejora genética y la biotecnología de especies
vegetales, la fisiología vegetal y el manejo de
cultivos...”
El protocolo de Kyoto insta a
los gobiernos tanto a incrementar
la superficie forestal como a
mejorar la eficiencia de los
sistemas forestales.
CULTIVO DE TEJIDOS
La mejor alternativa de producción de planta de alta calidad es la
multiplicación vegetativa de individuos seleccionados que hayan
expresado características fenotípicas de interés.
Inconvenientes:
Evaluar características deseables en fases maduras, mientras que
su multiplicación se limita a las fases juveniles.
PROGRAMAS DE MEJORA
MEJORA CLÁSICA
Polinización
controlada,
establecimiento de
huertos semilleros, etc.
NUEVAS HERRAMIENTAS
BIOTECNOLÓGICAS:
CULTIVO IN VITRO
Organogénesis,
embriogénesis somática
CULTIVO DE TEJIDOS
 Obtención de plantas libres de enfermedades.
 Disminución del tiempo para la obtención de
un gran número de individuos
genéticamente idénticos.
 La producción de plantas no está condicionada por las estaciones del año, ni por
la climatología dentro de las mismas.
 Conservación del germoplasma (especies en peligro de extinción, relictas, etc….).
 Almacenamiento de gran cantidad de material vegetal en un espacio pequeño.
 Disponibilidad de material vegetal a demanda del mercado.
 Posibilidad de propagar plantas que no tienen semillas viables.
 Superar las dificultades de la propagación vegetativa tradicional en algunas
especies.
NEIKER experiences: Pinus spp.
Organogenesis
Juvenile
Material
De Diego et al. 2011
Montalbán et al. 2011a
Somatic embryogenesis
Montalbán et al. 2010; 2011b; 2012;
2013; 2014
Organogenesis
Adult
Material
De Diego et al. 2010
De Diego et al. 2008
Cortizo et al. 2009
Somatic embryogenesis
Montalbán et al. 2011c
NEIKER experiences: Seed organogenesis
Pinus radiata D. Don:
Montalbán et al. 2011. Forestry 84: 363-373.
Pinus pinea L.:
Moncaleán et al. 2005. Tree physiology 25 (1):1-9.
Alonso et al. 2006. Annals of forest Science 63: 879-885.
Pinus pinaster Ait.:
De Diego et al. 2011. Scandinavian Journal of Forest
Research 26 (3): 201-211.
NEIKER experiences: organogenesis from adult trees
Pinus pinaster Ait.
De Diego et al. 2008.
Can J For Res 38(10): 2607-2615.
Pinus pinea L.
Cortizo et al. 2009.
Trees-Struc Fun 23(4): 835-842.
Pinus sylvestris L.
De Diego et al. 2011.
Journal of Forest Research 76 (1):158-162.
NEIKER experiences:Embriogénesis somática
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
 PRODUCCIÓN
DE
PLANTA
SELECCIONADA
TOLERANTE
A
ESTRÉS BIÓTICO Y ABIÓTICO
PRODUCCIÓN MASIVA A LA CARTA
 SILVICULTURA CLONAL DE ALTO
RENDIMIENTO.
 CLONACIÓN DE MATERIAL CON
FINES DE INVESTIGACIÓN
NEIKER experiences:Embriogénesis somática
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
 PRODUCCIÓN
DE
PLANTA
SELECCIONADA
TOLERANTE
A
ESTRÉS BIÓTICO Y ABIÓTICO
INICIATION AND PROLIFERATION PERCENTAGES
MATURATION SUCCESS
GERMINATION RATES
PRODUCCIÓN MASIVA A LA CARTA
 SILVICULTURA CLONAL DE ALTO
RENDIMIENTO.
 CLONACIÓN DE MATERIAL CON
FINES DE INVESTIGACIÓN
Somatic embryogenesis juvenile material: initiation and proliferation
100
100
a
a
b
60
b
c
c
40
d
d
20
0
EDM
CGM
16 jun
EDM
CGM
EDM
CGM
23 jun
30 jun
Collecting date and culture media
EDM
EDM
CGM
Proliferation (%)
Initiation (%)
80
80
60
a
b
40
c
20
d
0
16 jun
23 jun
30 jun
7 jul
7 jul
CGM
Proliferation (%)
100
2 a 4 stages of zygotic embryo
development
80
60
b
a
40
20
0
EDM
Pinus radiata D. Don:
Montalbán et al. 2012. Acta physiologia plantarum 34 (2): 451-460.
CGM
nº of somatic embryos/ 100 mg
fresh weight
Maduración del tejido embriogénico: el cuello de botella
160
Mejor dato
publicado hasta la
fecha en el género
Pinus spp.
140
120
100
80
60
40
20
0
Testado en
más de 30
lineas
Maturation medium
AMINOACIDOS
MEDIO
ABA
L-glutamine (550 mg L-1)
asparagine (525 mg L-1)
SACAROSA
arginine (175 mg L-1)
L-citruline (19,75 mg L-1)
L-1
A6S3ED
60 µM
30 g
A9S3ED
90 µM
30 g L-1
A6S6ED
60 µM
60 g L-1
A9S6ED
90 µM
60 g L-1
A6S3CG
60 µM
30 g L-1
A9S3CG
90 µM
30 g L-1
A6S6CG
60 µM
60 g L-1
A9S6CG
90 µM
60 g L-1
Montalbán et al. 2010. Trees-Structure and Function 24 (6): 1061-1071.
EDM
L-ornitine (19 mg L-1)
L-lysine (13,75 mg L-1)
L-alanine (10 mg L-1)
L-proline (8,75 mg L-1)
CGM
Casein hydrolysate (1 gL-1)
L-glutamine (500 mgL-1)
Then, what’s the problem?
When using immature seeds for SE initiation, the competence window is
narrow, around 4 weeks.
When mature seeds are used as initial explant, low frequencies of
initiation have been found in some Pinus species.
Often, low frequencies of maturation of valuable embryogenic lines.
Sometimes, low regeneration capacity of cryopreserved tissue after clonal
test.
Some embryogenic lines show recalcitrance to be cryopreserved.
Development of a combined somatic embryogenesis and organogenesis
Lookinga for
methods
protocol including
coldnew
storage
step.to preserve the valuable material
Development of a combined somatic embryogenesis and organogenesis protocol
Montalbán et al. 2014.
New Forest DOI 10.1007/s11056-014-9457-1.
Combined somatic embryogenesis and organogenesis protocol
60 % rooting
>19
shoots/embryo
150 embryos/100 mg
ET
Cambio Climático (IPCC 2007- actualidad)
Temperaturas
Supervivencia
Disponibilidad de agua
Productividad
2ª Alternativa: búsqueda de especies y/o genotipos
tolerantes al estrés
ESTUDIO DE PROCESOS
FISIOLÓGICOS
BUSQUEDA DE
MARCADORES DE
TOLERANCIA
Plant Material
Six Pinus radiata ecotypes
O2: P. radiata var. radiata
(Basque Country)
O3: P. radiata var. radiata
(Australia)
O6: P. radiata var. radiata
(New Zealand)
Variety hybrid
O1: P. radiata var. binata  var. radiata
O4: P. attenuata x P. radiata
Species hybrid
O5: P. radiata var. cedrosensis  P. radiata var. radiata
Variety hybrid
Híbridos Pinus spp.
O5- var. Cedrosensis x P. radiata var. radiata
O5  O4 but  Biomass
O4: P. attenuata x P. radiata
Tolerance
Physiology
Morphology
Phytohormones
leaf, t, RWC
Heigh
= JA and ACC
 Active OA
=Diameter
SA
 < 4MPa
Substomatal
chamber
ABA and IAA
Put, Spd, Spm
Hardening
Active OA
Pro, GABA, Glu
O1- P. Radiata var. Binata X P. Radiata
Híbridos Pinus spp.
Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD)
(2014):Development of productive contingency species for
forestation in Spain and New Zealand may be better adapted to
predicted changes in climate due to global warning.
P. attenuata x P. radiata
SCION (Nueva Zelanda)
Desarrollo de protocolos
de embriogénesis
somática de híbridos de
Pino
NEIKER
Estudio de procesos
organogénicos
de embriones somáticos
Cambio Climático (IPCC 2007………….)
Temperaturas
Disponibilidad de agua
Supervivencia
Productividad
3ª Alternativa: Modular la tolerancia al estrés
Somatic embryogenesis
Cell lines
High number
of somatic
embryos
Ex vitro
adaptation,
clonal plants
Montalbán et al. 2010,
2011, 2012, 2013, 2014
Are we able to modulate the
response of somatic pines to
drought stress?
Antecedentes
Semillas de hortícolas sometidas a tratamientos con NaCl, mostrataban
en su etapa productiva mayor tolerancia a suelos con elevada salinidad.
Plantas de Picea procedentes de semillas originadas en ambientes fríos,
mostraban mayor tolerancia a las heladas
CAMBIOS EPIGENÉTICOS
Objective
The aim of this work was to analyse the effect of physical
and chemical conditions at initial stages of radiata pine SE
in order to evaluate if the environment of cultures at
initiation stage is critical to modulate the tolerance of
somatic plants to drought stress months later.
Material and methods
Initiation
18
ºC
23º
C
2 g/L
3 g/L
4 g/L
Proliferation
Maturation
Germination
2880 megagametophytes
124 embryogenic cell lines maturated
2 g/L
3 g/L
4 g/L
EDM
28º
C
2 g/L
3 g/L
4 g/L
23ºC
4.5 g/L
9 g/L
7 g/L
Results
a
25
25
20
a
Initiation (%)
Initiation (%)
20
a
15
10
b
a
15
10
b
b
2
3
5
5
0
0
18
23
28
Temperature (ºC)
Gelling agent (g L-1)
100
100
a
60
b
b
80
Proliferation (%)
Proliferation (%)
80
40
4
60
a
40
a
a
20
20
0
0
18
23
Temperature (ºC)
28
2
3
Gelling agent (g L-1)
4
Results
100
a
a
a
100
a
a
a
75
Maturation (%)
Maturation (%)
75
50
25
0
50
25
0
18
23
28
2
Temperature (ºC)
4
600
a
500
400
ab
b
300
200
100
0
18
23
Temperature (ºC)
28
Nº of somatic embryos/g fresh
weight
600
Nº of somatic embryos/g fresh
weight
3
Gelling agent (g L-1)
500
a
400
a
300
a
200
100
0
2
3
Gelling agent (g
4
L-1)
Scheme of Drought Experiment
Initiation
18º
C
Proliferation, Maturation and
Germination
Control plants
23º
C
Stressed plants
28º
C
Parameters analyzed
Somatic plants
Analysis of
survival and
quality
Physiological
characterization
• Water status
determination
• Gas exchange
parameters
• Phytohormone
concentration
• Protein profile
Water potential measurements
Leaf Potential (MPa)
0
5
10
15
20
25
Time
0
ψ
Leaf (MPa)
-0,5
-1
D 28ºC
D 23ºC
D 18ºC
-1,5
W CONTROL
TLP
-2
-2,5
Water Use Efficiency
WUE
70
60
50
40
WUE
D 28ºC
W CONTROL
30
D 23ºC
D 18ºC
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Time
Conclusions
•Stressful conditions during initiation of the embryogenic tissue affect the
quantity and quality of plantlets produced at the end of maturation stage.
•It seems that the embryogenic tissue has a “memory” to remember after 15
months the conditions in which it has been initiated.
•It seems possible to modulate the tolerance to water stress by changing
environmental conditions in the initiation phase of embryonal masses.
My tresure
•
•
•
•
Krystyna Klimaszewska (Canadian Forest Services, Canada)
Cathy Hargreaves (SCION, New Zealand)
Jorge Canhoto (Univ. Coimbra, Portugal)
Mirek Strnad (Palacky University, República Checa)
Funding:
Basque Government
(DAPA)
Spanish Government
(Ministerio de Ciencia y Tecnología)
OECD (Organisation for Economic
Co-operation and Development)
2008 Quebec
2010 Corea
2012 Brno (República
Checa)
2014 Vitoria (España)
2016 Argentina
• Yill-Sung Park, Natural Resources Canada – Canada
• Jean-François Trontin, FCBA Technological Institute,
Francia
• Mariano Toribio, IMIA, España
• Heung-Kyu Moon, Korea Forest Research Institute, Corea
• Jana Krajnakova, Forestry and wood technology. Brno,
Czech Republic.
• Paloma Moncaleán, Neiker, España
130 investigadores de 60 países
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