Download Pseudoplatystoma tigrinum y Pseudoplatystoma fasciatum en la

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS
CARRERA BIOQUÍMICA
INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA - IRD
“VARIABILIDAD GENETICA DE Pseudoplatystoma tigrinum y
Pseudoplatystoma fasciatum EN LA CUENCA AMAZONICA
BOLIVIANA”
Programa: “Interaccion Genoma/Poblaciones/Medio Ambiente de los
peces tropicales”
TESIS DE GRADO
Para optar al titulo de Licenciatura en Bioquímica
Tutor: Dr. Jean François Renno (IRD)
Postulante: Rosario Violeta Rivera Mancilla
LA PAZ - BOLIVIA
2003
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RESUMEN
La Amazonía, contiene los más extensos y continuos bosques húmedos
tropicales, estas áreas son habitadas por variedad de poblaciones, especies y
complejo de especies. Dentro de las familias de peces más importantes en los
Siluriformes, esta la familia Pimelodidae a la que pertenecen Pseudoplatystoma
tigrinum (chuncuina)
y Psedoplatystoma fasciatum (Surubí), ambas especies
constituyen un considerable potencial para la acuicultura de la región.
El objetivo de este estudio es analizar la
estructuración genética
intraespecífica de ambas especies y relacionarla con fenómenos históricos o
fenómenos actuales ecológicos, para tal efecto se tomó muestras de músculo de
peces de poblaciones de las cuencas de Itenez, Mamoré en su parte media y
Orthon,
de las que se analizó el ADN mitocondrial por RFLP utilizando 15
enzimas de restricción, de ellas, cinco mostraron polimorfismo en relación con diez
mutaciones de sitio. La topología consensus obtenida usando la parsimonía de
Wagner muestra valores de bootstrapt igual a 75%donde se bifurcan las ramas de
los dos grupos monofiléticos. Dentro de cada grupo monofilético la topología es
débil.
El análisis Fst (índice de fijación), para P. tigrinum muestra significancia
(P< 5%) cuando se compara las poblaciones de las cuencas Itenez con las de
Orthon y Mamoré medio, en el caso de P. fasciatum
no existe significancia
(P<5%). En ambas especies existe mayor diversidad haplotípica en las
poblaciones de la cuenca Itenez que en Orthon y Mamoré medio este fenómeno
podría ser explicado por la Teoría de Refugios.
La diversidad haplotípica presente en las poblaciones de Itenez hace que
cepas extraídas de esta cuenca sean mejores candidatas para la acuicultura.
Abstract
Amazon has the extended and continues tropical rain forest; this area is inhabited by
variety of populations, species and species complexes. Pimelodidae family is within
most important Siluriphorm fish families, that include Pseudoplatystoma tigrinum
(chuncuina) and Pseudoplatystoma fasciatum (Surubi), both species have an important
potential to agriculture in the region.
The objective of this study is to analyze the intraespecific genetic structure of
both species and relate it with historical phenomena or actual ecological phenomena, to
do so muscle samples were taken from populations from Itenez basin, Mamoré in its
middle part and Orthon basins, and from which RFLP from mitochondrial DNA was
analyzed. Out of 15 restriction enzymes that were used five show polymorphism in
relation to ten mutation sites. Consensus topology obtained using Wagner’s parsimony
shows bootstrapt values equal to 75% where the two monophyletic group branches
bifurcate. Topology is very weak within each group.
The Fst (fixation index) analysis, for P. tigrinum shows significance (P< 5%)
when Itenez basin populations are compared to Orthon´s and middle Mamore
populations. In P. fasciatum there is not significance (P < 5%). There is more haplotipic
diversity in both species in Itenez basin populations then in Orthon and middle Mamore,
that could be explained by the refuge theory. Haplotipic diversity in Itenez basin
populations makes strains from this river more suitable for aquiculture.
INDICE
I. INTRODUCCIÓN
1
I.1. PROBLEMÁTICA
3
I.2.BIOLOGÍA EVOLUTIVA
4
I.2.a Microevolución
5
I.2.b. Macroevolución
5
I.2.c.Equilibrio de Hardy Weimberg.
6
I.2.d. Las fuerzas de la evolución.
6
I.2.d.1.La selección
6
I.2.d.2. La mutación
7
I.2.d.3.La deriva
7
I.2.d.4. La migración
8
I.2.e.Mecanismos de aislamiento reproductivo
9
I.2.e.1. Mecanismos prezigóticos
9
I.2.e.2. Mecanismos postzigóticos
10
I.2.f. La especiación
11
I.2.g. Marcadores moleculares
13
I.2.g.1. Generalidades del ADN mitocondria
14
I.2.g.2. Utilización de ADN mt como marcador molecular
16
I.2.g.3. Análisis RFLP
17
I.3. PRESENTACIÓN DE LAS ESPECIES EN ESTUDIO:
Pseudoplatystoma fasciatum y Pseudoplatystoma tigrinum
18
I.3.a. Medio de vida
18
I.3.b. Morfología
19
I.3.Edad y Crecimiento
20
IV.4. Alimentación
20
IV.5. Reproducción y Migración
21
V. OBJETIVOS
22
VI. METODOLOGÍA
23
VI.1. Puntos de muestreo
23
VI.2. Muestras
23
. Extracción de ADN
VI.3. Análisis RFLP de ADN mitochondrial
24
25
. Amplificaciónde la region control y la región del citocromo B del ADNb
mitocondrial
25
. Digestión de los productos amplificados con enzimas
de restricción
VI.4. Análisis de datos
25
26
. Identificación y estructura haplotípica
26
. Identificación de las mutaciones
27
. Construcción filogenética
28
VII. RESULTADOS
29
VII.1. Identificación de haplotipos
29
VII.2. Distribución geográfica de los haplotipos
31
VII.3. Estructura geográfica
35
VII.4. Identificación de las mutaciones
36
VII.5. Filogenia
40
VIII. DISCUSIÓN
42
IX. CONCLUSIONES
45
X. BIBLIOIGRAFIA
46
I. INTRODUCCION
La Cuenca Amazónica tiene una superficie de 6059000 Km2 , extendida en
los países Sudamericanos de Brasil, Colombia, Ecuador, Perú, Venezuela, Bolivia,
siendo el sistema hidráulico más grande del mundo (Montes de Oca, 1997). En el
territorio boliviano la Cuenca Amazónica ocupa 724000 Km2 , de los cuales las
cuencas más importantes son: Madre de Dios, Beni, Mamoré, Itenez, los cuales
son navegables y presentan un alto potencial para la pesca (Muñoz H. y Van
Damme,1998).
La Amazonía, contiene los más extensos y continuos bosques húmedos
tropicales; se considera que es un centro muy rico en variedad de especies y de
relativamente alto endemismo para plantas y animales. Frecuentemente estas
áreas son habitadas por variedad de subespecies (razas) de la misma especie, o
por diversidad de especies similares del mismo complejo de especies.
Durante el Mioceno medio
(16 -
10 millones de años BP (antes del
presente)) aún había conexión entre el Río Amazonas (actual) y el Caribe a través
del área de Maracaibo, y probablemente también con el Pacífico. Los ríos del
noroeste de la Amazonía fueron dirigidos hacia el oeste, al Pacífico, y hacia el
Caribe formando el sistema de ríos paleo-Orinoco, alcanzando el Caribe en el área
de Maracaibo. Las incursiones marinas en el Amazonas durante períodos de altos
niveles de “marea”, han promovido cambios extensivos en la vegetación en la
actual área de
bosques
tropicales (Hoorn et al, 1995). Las fases estuario –
lacustre ocurrieron en períodos de niveles bajos de “marea” dando vía a muchos
tipos de vegetación pantanosa y a bosques inundados estacionalmente. Estas
alteraciones temporales entre ecosistemas de aguas dulces y saladas, han
causado en diferentes áreas geográficas, una dinámica y diversidad histórica con
1
aumento de la biodiversidad en algunas y extinciones en otras (en Coronel, 2000).
Como un efecto del trastorno de la Cordillera Este de los Andes del norte, la
desembocadura del Río Paleo – Orinoco fue cerrada durante el Mioceno tardío y
fue formado el actual Río Orinoco. Los ríos en la parte noroeste del actual río
Amazonas tuvieron
cambios en su curso hacia el este, formando parte del
sistema del Río Amazonas, tal como ahora lo conocemos (Hooghiemstra y Van
Der Hammen, 1998).
La gran diversidad de la Amazonía puede ser explicada por varios
fenómenos no exclusivos, que han conducido a menos extinciones y a más
formación de especies por especiacion alopatrica, en relacion con: los Ríos
Barreras (Wallace, 1852), los Paleoarcos (Paton,1994) y los Refugios (Haffer,
1982) citados en Da Silva y Paton 1998)
De acuerdo con los Paleoarcos, inmediatamente al crecimiento de los
Andes se han formado relieves en arcos, fragmentando la red hidrográfica y las
poblaciones que la habitan.
De acuerdo con la teoría de los Refugios (áreas relativamente pequeñas
donde aún prevalece climas muy húmedos en los que permanecieron y se
diversificaron especies vegetales y animales), las poblaciones de especies de gran
envergadura dependientes de bosques tropicales, llegaron a ser aisladas a partir
de su primer habitat fragmentado de las épocas secas al máximo glacial en las
latitudes temperadas actualmente. Este período glacial se piensa que fue lo
suficientemente largo como para que haya divergencia evolutiva entre poblaciones
hermanas aisladas en diferentes refugios. En períodos inter-glaciales estos
bosques tropicales húmedos expandidos y eventualmente reconectados formaron
el bosque continuo de la Amazonía. La alternancia de fragmentacion y de
coalescencia del medio ambiente se ha traducido en la alternancia de especiacion
y dispersión de las especies de la Amazonía. En lo referente a los peces se ha
2
demostrado que la estructuración de la ictiofauna Guyanesa es dependiente de
dos refugios (Renno, et al, 1990 y 1991).
De acuerdo con los Ríos y Barreras, la amplitud de los ríos variaron y como
consecuencia de aquello se produjo el efecto barrera de los ríos para parte de las
especies. En la época de lluvia (glaciación) los ríos estaban más amplios y jugaron
un rol de barrera más que en la época interglacial.
I.1 PROBLEMATICA
Dentro de las especies de peces económicamente importantes en la
Cuenca Amazónica, la familia Pimelodidae es la más grande y diversa entre los
Siluriformes Neotropicales
(Coronel, 2000). Esta familia está constituída por
varios géneros, de los cuales los más importantes para la pesca local son:
Brachyplatystoma flavicans (plateado o dorado), B. Filamentosum (bacalao),
Phractocephalus hemiliopterus (general), Pseudoplatystoma fasciatum (surubí), P.
tigrinum (simicuyo o chuncuina), Goslinea sp.(bagre) y Paulicea lutkeni (bagre)
(Lauzane y Loubens, 1985).
Para la realización del presente estudio, nos planteamos las siguientes
preguntas:
-¿ En P. fasciatum y P. tigrinum existe una estructuración genética intra
específica?
-¿Se puede relacionar esta estructuración con fenómenos “actuales”
(biológicos y ecológicos ) o fenómenos históricos (paleo ecológicos)?
Coronel (2000) realizando un estudio
genético sobre el genero
Pseudoplastytoma mediante análisis isoenzimático, de muestras colectadas del
Río Ichilo (arriba del Río Mamoré) y del Río Beni, determinó que existe alta
diferenciación genética entre las especies de P. fasciatum y P. tigrinum. Dentro de
P. fasciatum, poblaciones de las lagunas del Río Ichilo y Río Beni, mostraron
3
pequeñas diferencias, al igual que entre las poblaciones del Río Ichilo y Río Beni.
El cálculo de flujo genético
entre poblaciones
dan resultados con alta
diferenciación entre P. fasciatum y P. tigrinum, confirmando que ambas
poblaciones son dos especies diferentes. Resultados de diversidad genética de P.
fasciatum tomados de Claus (2000), muestran que el valor de variabilidad entre las
poblaciones del Río Ichilo y el del Río Beni, es baja.
En el presente estudio se analizó por RFLP (Restriction Fragment Length
Polimorphysm)
un fragmento de ADNmt a partir de muestras de músculo de P.
fasciatum y P. tigrinum provenientes de las cuencas: Itenez, Mamoré en su parte
central
y
Orthon.
Este
estudio
preliminar sobre
las
poblaciones
de
Pseudoplatystoma tigrinum y Pseudoplatystoma fasciatum se realizó con el
propósito de relacionar
la estructuración genética intraespecífica y el sitio
geográfico donde se desarrollan estas especies.
I.2 BIOLOGIA EVOLUTIVA
El presente estudio se desarrolló en el marco de los conceptos y
herramientas de la biología evolutiva.
La biología evolutiva estudia los cambios en las propiedades biológicas de
poblaciones de organismos, estos cambios son considerados evolutivos si son
heredables de generación en generación, por medio del material genético
(Futuyma, 1986). La biología evolutiva abarca: (1) Investigación de la historia de
vida en la tierra, tomando en cuenta la relación ancestro – descendiente y la
filogenia de todas las especies, los tiempos en los cuales se originaron y se
extinguieron,
el origen
y la relación en el curso de los cambios
de sus
características. (2) Comprensión de las causas de los procesos evolutivos,
tomando en cuenta los orígenes de las variaciones hereditarias, los procesos que
actúan para afectar esas variaciones, la relativa importancia de procesos que coactúan en los procesos de cambio, la velocidad con la que ocurren estos cambios,
4
los procesos de mutación, selección natural y deriva genética que dieron lugar a
las características moleculares, anatómicas, de comportamiento y otras
características de los diferentes organismos.
En la evolución existen fenómenos de: Macroevolución y Microevolución.
I.2.a. Microevolución. Se refiere a cambios en la frecuencia de alelos de
poblaciones, en pequeña escala y en pocas generaciones.
Estos cambios pueden ser debido a procesos tales como:
-
Mutación, cambios heredables en el ADN.
-
Flujo genético, cambios en las frecuencias alélicas en una población por
individuos inmigrantes o emigrantes, el flujo génico también puede
neutralizar otras diferencias genéticas que se habrían acumulado.
-
Deriva genética, fluctuaciones al azar en la frecuencia de alelos, debido a
que afecta en gran medida a poblaciones pequeñas (especies en riesgo),
en los que influyen fenómenos tales como el efecto fundador y el cuello de
botella.
-
Selección natural, estabilización de la frecuencia de alelos
debido a
diferencias de sobrevivencia y reproducción en una población, ésta puede
ser direccional, disruptiva, estabilizante, balanceada y selección sexual.
I.2.b.Macroevolución. Se refiere a cambios en gran escala en la
frecuencia genética en una población sobre un largo período de tiempo (y puede
culminar en la evolución de una nueva especie). Los mecanismos que rigen la
macroevolución son:
- Especiación, que incrementa la diversidad biológica. Existen dos tipos
comunes de especiación: alopátrica y sympátrica; las dos difieren en la
distribución geográfica de las poblaciones en cuestión.
- Extinción, la historia de vida sobre la tierra incluye muchos episodios de extinción
en los cuales muchos grupos de organismos desaparecieron de la faz del planeta.
5
Los periodos de extinción son seguidos por períodos de radiación donde nuevas
especies llenaron los nichos que antes fueron despoblados.
- Equilibrio puntuado, es una inferencia a cerca del proceso de macroevolución a
partir de los patrones de especies documentadas en fósiles.
I.2.c. Equilibrio de Hardy y Weinberg.
Hardy y Weinberg (1908) demostraron que la composición genética de
una población permanece en equilibrio mientras no actúen ni la selección ni
ningún otro factor que altere éste equilibrio y no se produzca mutación alguna. La
mezcla de genes que
implica la reproducción sexual y la persistente
reorganización de estos, no cambia la frecuencia de alelos
en las sucesivas
generaciones. Es decir, la herencia mendeliana, por sí misma, no engendra
cambio evolutivo, no es un mecanismo de alteración de las frecuencias de los
genes en las poblaciones, principio conocido como equilibrio Hardy-Weinberg.
cuando esta Ley se altera en una población, entran en acción las fuerzas de la
evolución.
I.2.d. Las fuerzas de la evolución
En la evolución biológica, al ser proceso de cambio y diversificación de las
poblaciones y las especies a través del tiempo, interviene la mutación, la deriva,
la selección natural y la migración.
I.2.d.1 La selección
La selección natural es el proceso que promueve la adaptación y
mantiene a raya los efectos desorganizadores de los otros procesos evolutivos,
puede ser definida simplemente como la reproducción diferencial de variantes
genéticas alternativas (Ayala,1984), es la principal fuerza evolutiva, es la
manifestación de las diferencias de aptitud (valor adaptativo, parámetro utilizado
6
para medir la selección natural) entre los individuos, basada en la capacidad
relativa para transmitir genes a las generaciones siguientes (Santos).
La selección natural está en relación con la naturaleza adaptativa
y áltamente organizada de los seres vivos. Explica la diversidad de los organismos
porque promueve su adaptación a diferentes formas de vida (Ayala, 1984).
Wallace y Darwin propusieron que la selección natural puede explicar cómo ocurre
la evolución, pero no pudieron explicar el origen de las variaciones de genes que
proporciona la materia prima para la evolución, ni como tales variaciones se
mantienen en una población o en una especie (Williams y Cummings, 1999).
I.2.d.2. La mutación
La mutación es el origen inicial de la variación genética en una
población; implica un error en la replicación de una secuencia nucleotídica, o
alguna otra alteración en el genoma (Futuyma, 1986). Aunque sea fuente básica
de toda variabilidad genética, ocurre con una frecuencia muy baja. Los rangos de
mutación están comprendidos en el orden de 10-4 a 10-6 mutaciones, por locus,
por generación (Ayala, 1984). La tendencia de cambio de frecuencias alélicas
como un resultado de recurrente mutación (presión de mutación) es muy pequeña
en el curso de unas pocas generaciones (Hartl, 1981).
I.2.d.3. La deriva
La deriva genética se refiere a los cambios en las frecuencias
génicas debidas a la variación en el muestreo de generación en generación. La
deriva genética es un proceso de puro azar. El principio general es que la
magnitud de la deriva está relacionada inversamente con el tamaño de la
muestra. Con respecto a los organismos, este principio significa que cuanto más
pequeño sea el número de individuos reproductores en una población, mayores
7
serán probablemente los cambios de frecuencia alélica debidos a la deriva génica
(Ayala, 1984).
Debido al proceso provocado por la deriva genética las frecuencias
génicas entre subpoblaciones van diferenciándose progresivamente. Otra de las
consecuencias genéticas de esta dispersión es la deficiencia de heterocigotos y un
exceso de homocigotos (efecto Wahlund), con respecto a las proporciones HardyWeinberg, que se observa al considerar conjuntamente todas las subpoblaciones.
I.2.d.4 La migración
La migración se refiere al proceso de movilización de individuos de
una población a otra; como consecuencia de ello se lleva a cabo la introducción de
genes por los migrantes, alterando de esta manera la frecuencia de alelos y
genotipos dentro de una población y alterando el equilibrio de Hardy-Weinberg, sin
embargo este equilibrio puede ser restaurado si en una población que ha recibido
migrantes, los cruces son al azar. La incorporación de alelos llevados por
migrantes depende de la habilidad de los migrantes para sobrevivir en una nueva
área. El flujo de migración no cambia las frecuencias alélicas de toda la especie,
pero
puede cambiarlas localmente cuando las frecuencias alélicas de los
migrantes son diferentes a las de los individuos residentes (Ayala, 1984)
Existen diversos modelos de flujo de genes que corresponde a
diferencias en la estructura de una población (Williams y Cummings, 1999).
- El modelo “continente- isla”, el cual es efectivamente una vía de movimiento de
una población grande (“continental”) a una población pequeña, población aislada.
- El modelo “isla” , en el cual la migración ocurre al azar entre un grupo de
pequeñas poblaciones.
- El modelo “stepping- stone”, en el que cada población recibe migrantes
solamente de poblaciones vecinas.
8
- El modelo “aislamiento-por- distancia” en el cual el flujo de genes ocurre entre
vecinos locales en poblaciones distribuidas continuamente.
La mayoría de los modelos considera el flujo de genes en una
proporción aproximadamente constante en cada generación. Es importante
reconocer que la cantidad de movimiento de genes, medida por la proporción o
porcentaje de flujo de genes (m) es a menudo mucho menor que el movimiento
migratorio de los organismos (Maynard Smiht, 1988).
I.2.e. Mecanismos de aislamiento reproductivo.
Las
propiedades
biológicas
que
impiden
el
apareamiento
(mecanismos de aislamiento reproductivo) se pueden clasificar en:
I.2.e.1. Mecanismos prezigóticos.
Son aquellos que impiden la fecundación del óvulo, y que pueden
ser ecológicas o geográficos, estacionales, conductuales, mecánicas y gaméticas.
Aislamiento geográficos o ecológico, individuos que ocupan el mismo
territorio viven en diferentes habitats y, por tanto no tienen oportunidad de
cruzarse.
Aislamiento estacionales o temporales, los organismos pueden madurar
sexualmente en diferentes estaciones u horas del día.
Aislamiento conductual o etológico, la atracción entre machos y hembras, o
entre gametos masculinos y femeninos, en el caso de plantas y
organismos
acuáticos, es necesaria para que se produzca la unión sexual; entre los animales
es, quizá, el más poderoso. La cópula es a veces imposible entre individuos de
9
diferentes especies, ya sea por el tamaño incompatible de sus genitales o por
variaciones en la estructura floral.
Aislamiento mecánico, La fecundación se evita o se restringe por
diferencias en los aparatos reproductores (genitales en animales y flores en
vegetales)
Aislamiento gamético o fisiológico, en los animales con fecundación interna
los espermatozoides son inviables en los conductos sexuales de las hembras de
diferentes especies. En las plantas, los granos de polen de una especie
generalmente no pueden germinar en el estigma de otra (Williams y Cummings,
1999).
I.2.e.2. Mecanismos postzigóticos.
Tiene lugar en la fecuindación y la formación de zigotos híbridos,
pero estos no son viables o dan lugar a híbridos débiles o estériles)
Inviabilidad o debilidad de los híbridos.
Esterilidad en el desarrollo del híbrido, Los híbridos son estériles porque sus
gónadas se desarrollan anormalmenteo porque la meiosis se interrumpe antes de
su terminación.
Esterilidad en la segregación del híbrido, Los híbridos son estériles porque
presentan segregación anormal hacia los gametos de cromosomas completos, de
segmentos de cromosomas o de combinaciones de genes.
Desintegración en F2, Los híbridos F1 son normales, vigorosos y fértiles,
pero en F2 hay muchos individuos débiles o estériles. (Williams y Cummings,
1999).
10
I.2.f. La especiación.
La especiación ha jugado un papel crítico en la evolución de vida de la
tierra. Irónicamente, existe todavía mucho debate acerca de cual es el mecanismo
responsable para la mayoría de eventos de especiación. El proceso de
especiación divide un pool de genes en dos o más. Las poblaciones son
separadas reproductivamente. Esta división puede estar acompañada por cambios
en la morfología, la fisiología y la adaptación a un nicho ecológico, pero no son
imprescindibles en un proceso de especiación.
De acuerdo con Wagner (Williams y Cummings, 1999),el primer paso
para la especiación es la acción de barrera para el flujo de genes entre
poblaciones, que ejercen los accidentes geográficos como lagos, ríos y montañas.
El segundo paso, es que las poblaciones aisladas sufren cambios genéticos
independientes y divergen para producir dos especies distintas.
De acuerdo con
Ernest Mayr (Williams y Cummings, 1999). las
especies se originan predominantemente de dos maneras . En la primera,
denominada evolución filética o anagénesis, la especie A se transforma en la
especie B durante un largo período de tiempo . En la segunda, denominada
cladogénesis, una especie da lugar a dos o mas especies (fig 1). Este segundo
proceso puede ocurrir durante largos períodos de tiempo o raramente en una o
dos generaciones.
11
Anagénesis
Especie A
Especie B
Cladogénesis
Especie B
Especie A
Especie C
Tiempo
)LJ(QODHYROXFLyQILOpWLFDRDQDJpQHVLVXQDHVSHFLHVHWUDQVIRUPDFRQHOWLHPSRHQRWUD
HVSHFLH(QWRGRPRPHQWRVRORH[LVWHXQDHVSHFLH(QODFODGRJpQHVLVXQDHVSHFLHVHHVFLQGHHQ
GRVRPiVHVSHFLHV(Williams y Cummings, 1999).
En 1963, Ernst Mayr y Theodosius Dobzhansky (Williams y Cummings,
1999) llegaron a la conclusión de que la especiación tiene lugar a través de la
alopatria, o el aislamiento geográfico manteniendo los aspectos generales del
modelo de Wagner, este modelo requiere que la población quede aislada, es decir,
se debe interrumpir el flujo de genes. La ausencia o interrupción de flujo de genes
es un prerrequisito para el desarrollo de diferencias génicas conseguidas para la
adaptación a las condiciones locales. La diversidad genética que surge por
mutación o por deriva genética al azar, quedará reflejada en la presencia de
nuevos alelos, cambios en las frecuencias alélicas o por la presencia de nuevas
ordenaciones cromosómicas. Finalmente se alcanzará un punto en el que las
poblaciones tengan suficientes diferencias genéticas como para que puedan
identificarse como razas distintas o semiespecies. Este proceso puede continuar
ininterrumpidamente hasta que se formen dos o mas especies.
12
Si en cualquier momento durante el proceso de divergencia genética
las condiciones que evitan el flujo génico entre las poblaciones desaparecen, son
posibles dos resultados:
1.Las dos poblaciones se pueden fusionar en un solo conjunto de genes.
2.Los acervos génicos de las poblaciones pueden haber divergido hasta el
punto en el que pueden haber surgido mecanismos de aislamiento reproductivo y
las poblaciones no podrán cruzarse acabando como dos especies distintas.
Sin embargo es posible que se desarrolle suficientes diferencias entre individuos
de
una población y producir dos especies a partir de una sola. Este tipo de
especiacion se llama especiacion simpatrica, este importante mecanismo
diversificacion de las especies de ha sido responsable de producir la diversidad de
los peces Cichlidés de los lagos del Africa del este (Meyer, Axel 1987).Estas
especies son ecológicamente muy diversas y la especiación puede haber sido el
resultado de la selección disociadora de los diferentes nichos ecológicos.
I.2.g. Marcadores Moleculares.
Los marcadores de ADN están representados por secuencias que
actúan como marcaje para otro gen estrechamente relacionado, estos pueden ser:
ADN mitocondrial (ADN mt), ADN ribosomal (ADN r), minisatélites o número
variable de repetición en tandem (VNTR) y microsatélites o simple secuencias
repetitivas (SSR). A parte de los marcadores moleculares representados por ADN
existen marcadores moleculares que constutuyen la expresión del ADN nuclear,
estos últimos se denominan alozimas o isoenzimas, al respecto, para
Pseudolplatystoma se desarrollaron trabajos utilizando como marcadores
moleculares a las isoenzimas (Coronel, 2000 y Montaño).
13
I.2.g.1. Generalidades del ADN mitocondrial.
La mitocondria contiene múltiples copias de moléculas de ADN. El
genoma mitocondrial de los animales es circular, pequeño, de doble hebra;
típicamente, el tamaño de genomas mitocondriales en animales es alrededor de
16500 + 500 pares de bases (bp). En peces, existen diferencias de tamaño
intraespecíficas así como entre especies (Meyer, 1993). El genoma mitocondrial
de animales contiene trece genes codificantes para proteínas, dos genes
codificantes para ARNs ribosomal, veintidos genes codificantes para ARNs de
transferencia y una región mayor no codificante (región control en vertebrados)
que contiene sitios de iniciación para la replicación del
ADN mitocondrial
y
transcripción (fig 2) (Meyer, 1993).
Las dos hebras del genoma mitocondrial son designadas como
hebra "L" (light) y hebra "H" (heavy). Con pocas excepciones, todo los genes en el
genoma mitocondrial de vertebrados están codificados por la hebra H (Meyer,
1993). La disposición regular de los genes tARN y genes codificantes de proteínas
sugiere que la estructura secundaria de los genes tARN sirven como una señal
puntual durante la transcripción. Cuando dos genes codificantes de proteína no
están separados por un gen tARN (por ejemplo ATPasa 6-COIII), a veces puede
ser requerida una estructura loop para la propia transcripción (Meyer, 1993). Esta
estructura secundaria puede también existir en algunos peces. La estructura loop
de consta 29 bp (Meyer, 1993). La velocidad de evolución de la región control es
de dos a cinco veces más alta que la de los demás genes mitocondriales. La
región control está caracterizada por el "desplazamiento loop (D-loop)", una
extensión de ADN que es complementaria a la hebra liviana (L strand), la hebra Dloop desplaza la hebra H. El sitio de iniciación de la síntesis de D-loop y el orígen
de replicación de la hebra H son idénticos, pero, el sitio de terminación (s) para la
hebra D-loop y la hebra H están separados (Meyer, 1993). El extremo variable en
la región control (en términos de sustitución y longitud de mutación) fue
descubierto a principios de 1970. La región control varía en longitud 200 bp a
14
4100bp, generalmente a causa de las duplicaciones en tandem y es responsable
de la variación observada en el total de la longitud del genoma mitocondrial de los
vertebrados. Esta también contiene una alta frecuencia
de mutación a nivel
poblacional (Meyer, 1993)
T
F
T
F
PISCINA
MITOCONDRIAL
PISCINA
MITOCONDRIAL
Fig2. Orden de genes mitocondriales. Los orígenes de replicación de la hebra H y L están
indicadas en la figura. El origen de la hebra H está en la región control, el origen de la hebra L está en el
cluster de gene YCNA t-RNA. Los genes tARN son mostrados como cajas sombreadas. Las secuencias
codificantes (templates) de todas las proteínas (excepto ND 6) y la mayoría de genes Tarn están sobre la
hebra H. Los genes tARN codificados por la hebra L están señalados fuera del círculo, los genes tARN
codificados por la hebra H están señalados dentro. (Meyer, 1993)
El ADN mt. tiene una velocidad de sustitución de bases mucho más alto
que el ADN nuclear (Fig 3 ). Un estimado de la velocidad de divergencia de
secuencia es 20 x 10-9 por sitio por año, El rango de sustitución de nucleótidos en
el ADN mt. es generalmente de cinco a diez veces mayor que el ADN nuclear,
debido a la alta frecuencia de mutaciones puntuales (Maynard, 1997 y Meyer,
15
1993). Las transiciones (A <-> G,
T <->
C) son mas comunes que las
transversiones (A <-> T , G <-> C) (Maynard,1997). En animales existen
solamente unos pocos casos de transferencia de genes mitocondriales al núcleo, y
no se ha encontrado transferencia de genes nucleares a mitocondriales (Maynard,
1997).
d
i
v
e
r
g
e
n
c
i
a
d
e
s
e
c
u
e
n
c
i
a
Tiempo de divergencia (M años)
Fig.3 El rango de sustitución de nucleótidos en (a) ADN mitocondrial y (b) simple copia ADN
nuclear (Maynard, 1997).
I.2.g.2.Utilización del ADNmt. como marcador molecular.
La molécula de ADN mitocondrial tiene dos propiedades que son
usadas en la determinación de variación genética intra e inter poblacional:, es
haploide, no recombinante y es casi exclusivamente de herencia maternal. La
mitocondria paterna parece ser degradada durante la fertilización o talvez no se
replique, entonces solo se hereda la mitocondria materna (Maynard,1997).
Debido a su alta velocidad de evolución, alto polimorfismo inter e
intra especie y acoplada con la herencia materna el ADN mt puede ser usado en
16
estudios de flujo genético mediado por hembras, para análisis de la estructura
geográfica de una población, o para investigación de pequeños grupos de
especies relacionadas (Harrison, 1989), igualmente se presta para el estudio de
eventos fundadores, origen de clonalidad y también es utilizado para identificar
eventos de hibridación (Meyer, 1993).
La mayoría de los trabajos sobre estructura poblacional y
relacionados a la filogenia de peces sobre datos de ADN mt, estuvieron basados
en el análisis de Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP).
Dentro las especies a veces se encuentran altos niveles de polimorfismo y
diferenciación geográfica (Meyer, 1993). La relativa facilidad con la que las
secuencias de los genes mitocondriales pueden ser determinadas a través de
reacciones de PCR y secuenciación ha dado a luz nueva información (Meyer,
1993).
Tsigenopoulos y Berrebi (1999) usaron secuencias de ADN
mitocondrial en el estudio del género Barbus en Europa, para inferir relaciones
filogeográficas entre poblaciones geográficamente distintas. (William y Cummings
(1999) usaron secuencias de ADN para establecer relaciones filogenéticas entre
peces asesinos africanos. Recientemente, Claus (2000) usó ADN mt para
determinar la filogeografía de peces gato (Pseudoplatystoma fasciatum) en Sud
America.
I.2.g.3. Análisis RFLP.
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) o Polimorfismo
de la Longitud de los Fragmentos de Restricción, es el evento en el que ocurre
cortes por enzimas de restricción (endonucelasa que cortan las moléculas de ADN
en sitios específico) en diferentes sitios de ADN de diferentes individuos de la
misma especie. Estos cortes dan como resultado diferentes periles de fragmentos
17
restricción, que pueden ser visualizados a travez de eletroforésis en geles de
agarosa teñidos con etidio, en luz ultravioleta.
I.3. PRESENTACION DE LAS ESPECIES EN ESTUDIO: Pseudoplatystoma
fasciatum Y P. tigrinum.
Pseudoplatystoma fasciatum Y P. tigrinum, pertenecen al Orden
Siluriformes y a la familia Pimelodidea.
En Bolivia el surubí (P. fasciatum) y la chuncuina (P. tigrinum) son dos
especies comunes, ambas especies son comercialmente importantes, siendo
clasificadas al respecto, por la Misión Británica, como especies "clase A” (juntas
forman mas de la mitad de los aportes de la pesca comercial en esta región, por
su alta calidad de carne - 17% de proteína y 2% de grasa-), (Lauzane y Loubens,
1990).
I.3.a. Medio de vida
El género Pseudoplatystoma, está ampliamente distribuido en Sud
América. Muy extendidos en el bajo Amazonas pero raros o ausentes en los
estuarios, P. tigrinum y P. fasciatum están presentes en los tributarios altos de
todos los tipos de ríos (Barthem y Goulding,1997), en los canales, en los planos de
inundación a lo largo de los arroyos de la selva lluviosa, tanto en aguas corrientes
como tranquilas (Muñoz
y Van Damme 1998). En el Amazonas boliviano,
Pseudoplatystoma fasciatum se encuentra en la llanura, a lo largo de Chapare
hasta Villa Tunari (Gèrard Loubens et Jacques Panfili,2000).
Como consecuencia de sus hábitos migratorios es más abundante en
los tramos medios de los ríos amazónicos. (Muñoz, H. y Van Damme, 1998). Se
advierte dos fenómenos de repartición heterogénea durante el tiempo de aguas
bajas: P. fasciatum prefiere los medios lóticos mientras, P. tigrinum está difundida;
18
para las dos especies los machos son más abundantes en los ríos y las hembras
en las lagunas (Gèrard Loubens et Jacques Panfili,2000).
I.3. b. Morfología
Las características morfológicas de P. fasciatum y P. tigrinum son
muy semejantes. Siendo estos difícilmente confundidos con otros, ya que se
caracterizan por poseer dientes en el paladar, puente óseo en el cráneo, la aleta
dorsal muy deprimida y barbillas siempre largas (Lauzane y Loubens, 1990). P.
fasciatum se diferencia de P. tigrinum por presentar la fontanela más corta, hocico
más ancho y un patrón de coloración con más barras negras verticales.( Muñoz,
H. y Van Damme, 1998)
Pseudoplatystoma fasciatum
Pseudoplatystoma tigrinum
19
I.3.c. Edad y Crecimiento.
La edad individual de los peces es estimada a través de la técnica de
observación de cortes frontales de vértebras, en estas especies la longevidad es
por lo menos de 10 años para P. fasciatum y 15 para P. tigrinum. Entre las dos
especies los machos alcanzan la madurez sexual con más precocidad, y las
hembras crecen con más velocidad. El crecimiento durante el primer año es de 29
cm para P. fasciatum y 36 cm para P. tigrinum (Gèrard Loubens y Jacques Panfili,
2000). Se observa un período de crecimiento muy débil durante el estiaje y la
crecida de los ríos. El crecimiento resulta rápido y se acompaña de acumulación
de grasa en la cavidad abdominal durante la decrecida.
I.3.d. Alimentación
Los Pimelódidos corresponden a niveles tróficos altos siendo en su
mayoría predadores, ictiófagos y omnívoros. A partir de 40 cm las dos especies
resultan únicamente ictiófagas y de comportamiento oportunista (Gèrard Loubens
y Jacques Panfili, 2000). Su alimentación se compone predominantemente de
cardúmenes de carácidos. En ambas especies la categoría peces representa mas
del 99% del peso total del alimento, los camarones representan un porcentaje
mínimo del peso total de los alimentos, sin embargo en los peces de menor
tamaño desempeñan un papel mayor. La presencia de insectos es significativa tan
solo en los juveniles menores de 10 cm y el material vegetal parece incidental. Las
presas seleccionadas por ambas especies son diversas incluyendo P. tigrinum en
el caso de P. fasciatum. (Gèrard Loubens et Jacques Panfili, 2000). P. tigrinum y
P. fasciatum son capaces de tragar presas que miden hasta 30% de su longitud
estándar.
20
I.3.e. Reproducccion y Migracion
P. tigrinum y P. fasciatum tienen un período de desove corto, en la
segunda parte de la crecida (Mamoré) entre enero y febrero. Esta estrategia de
reproducción durante las aguas altas favorece mucho a larvas y juveniles, los
cuales encuentran un ambiente diverso y una protección natural contra
depredadores (Lauzanne, Loubens y Le Guennec; 1990). Para su reproducción
parecen migrar hasta las estribaciones de los Andes, por lo menos por el río
Sécure hasta Puerto San Lorenzo, el único lugar donde se encuentran en
maduración avanzada. Los Pseudoplatystoma del Orinoco medio, tiene su época
de reproducción en la segunda parte de la crecida (junio y julio) (Lauzanne y
Loubens, 1990). Las migraciones de reproducción son las que llaman más la
atención. Los Pimelódidos aparentemente realizan largos recorridos desde las
zonas mas bajas (ríos brasileños y bolivianos de llanura) hacia sus zonas de
reproducción aun no conocidas, río arriba (Lauzanne y Loubens, 1990).
Las migraciones de reproducción de estas especies comerciales
comienzan en septiembre y terminan a principios de enero (Lauzanne y Loubens,
1985).
21
II. OBJETIVOS
•
Determinar la diferenciación genética interespecífica de P. tigrinum y P.
fasciatum, utilizando como marcador molecular el genoma
mitocondrial,
mediante análisis RFLP.
•
Determinar si existe estructuración genética intraespecífica en P. tigrinum y P.
fasciatum, utilizando como marcador molecular el genoma mitocondrial, por
medio de análisis de RFLP.
•
Relacionar
esta estructuración con fenómenos “actuales” (biológicos y
ecológicos) o fenómenos históricos (paleo ecológicos).
22
III. METODOLOGIA.
III.1. Puntos de muestreo
Los peces fueron colectados de las cuencas de: Itenez, Mamoré, en su
parte media y Orthon, de la Amazonía boliviana (Fig. 4).
Fig 4. Puntos de muestreo en las cuencas:, (1) Orthon,, (2) Itenez y (3) Mamoré en su parte media.
III.2. Muestras.
Constituyeron trozos pequeños de músculo (0,5 g aprox.) de individuos
de peces de las especies en estudio, distribuídos de la siguiente manera:
Pseudoplatystoma fasciatum, 19 de la cuenca Itenez, 22 de la cuenca Orthon, 20
de la cuenca Mamore medio; Pseudoplatystoma tigrinum, 20 de la cuenca Itenez,
8 de la cuenca Orthon, 20 de la cuenca Mamoré medio.
23
III.2.a. Extracción de ADN.
La extracción de ADN fue realizada a partir de un fragmento de
músculo conservado en alcohol, utilizando el
estuche comercial QIAGEN, de
acuerdo con las instrucciones del fabricante:
-Realizar un corte fino de un trozo (aproximadamente 12 mg) de tejido muscular y
colocar en un tubo de centrífuga.
-Añadir la solución de lisis (180 ul de Buffer ATL + 20 ul de proteinaza K), mezclar
vigorosamente e incubar a 55ºC hasta la lisis completa (usualmente 6 a 8 hrs).
-Mezclar en vortex por 15 segundos y añadir 400 ul de la mezcla buffer AL +
etanol absoluto 1:1, y mezclar vigorosamente hasta formar una solución
homogénea.
-Recolectar dentro de una minicolumna (colocar la mini columna dentro de un tubo
nuevo recolector).
-Centrifugar a 8000rpm por un minuto.
-Descartar el tubo colección y su contenido.
-Añadir a la columna 500 ul de buffer AW1 y centrifugar a 8000 rpm por un minuto
(primer lavado).
-Descartar el tubo colección y su contenido.
-Añadir a la columna 500 ul de buffer AW2 y centrifugar a 14000 rpm por tres
minutos (segundo lavado).
-Descartar el tubo colección y su contenido.
-Añadir a la columna 200 ul de buffer AE, colocar la columna en un eppendorf
nuevo de 2 ml e incubar a temperatura ambiente por un minuto.
-Centrifugar a 8000 rpm por un minuto (para eluir).
-Repetir la elusión (opcional).
24
III.3. Analisis RFLP de ADN mitochondrial
. Amplificación de la región control y la región del citocromo B del ADN
mitocondrial.
Fig 6. Región de amplificación del ADN mitocondrial.
La región amplificada (Fig 6) tiene un tamaño aproximado de 2300 bp,
obtenida
utilizando
los
siguientes
cebadores:
(5’TGAYATGAAAAACCATCGTTGTAA3’)
y
ND
5/6
C
HN20
(5’GTGTTATGCTTTAGTTAAGC3’), utilizado originalmente por Bernatchez y
colaboradores en 1992 (Bernatchez y Danzmann, 1993).
Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1.5mM de cloruro de
magnesio, 0.2mM de uno de dNTP's, 0.5uM de cada uno de los cebadores, 2.5
Unidades de taq polimerasa (Promega), 1 X de tampón de taq polimerasa y 5ul
(20ng) de extracto de ADN en un volumen final de 50 ul. El programa de
amplificación consta de: 95.ºC por 2min, 91 ºC por 1 min, 50ºC por 1 min 30seg,
72 ºC por 2 min 30 seg, (35 ciclos), y una elongación final a 72 ºC por 10 min.
III.3.b. Digestión de los productos amplificados con enzimas de restricción
Se utilizó 10ul (160ng) del producto amplificado por PCR, 2.5 U de
endonucleasa de restricción, 1X de tampón correspondiente a la enzima. La
25
digestión de los productos fue realizada a 37ºC durante toda la noche. Los perfiles
fueron visualizados en geles de agarosa al 3% con bromuro de etidio.
III. 4. Análisis de datos
III.4.a. Identificación y estructura haplotÍpica
La digestión de los productos con enzimas de restricción
proporcionan perfiles particulares ( uno o varios). En caso de que la digestión con
una enzima presente un solo perfil para todo los individuos, se le denominará
“perfil A” y si presenta varios perfiles se designarán éstos como “A”, “B”, “C”, etc.,
cada perfil constituye un fenotipo. Al conjunto de fenotipos (perfiles de restricción)
se denomina haplotipo.
Para los individuos de P. fasciatum los haplotipos se
identificaron con la letra "F" y para P. tigrinum se identificaron con la letra "T". Los
haplotipos fueron ordenados tomando en cuenta la distribución geográfica del
origen de las muestras.
Para el estudio de la diferenciación genética entre poblaciones se
utilizó el estimador del índice de fijación (Fst), que sirve como una medida de las
diferencias genéticas entre poblaciones. Fst presenta como valor mínimo "0"
(indicando que no existe divergencia genética) y un valor máximo de "1"
(indicando fijación para alelos alternativos en las subpoblaciones). El rango de 0 a
0,05 para Fst puede ser considerado como una pequeña diferenciación genética,
0,05 a 0,15 como moderada diferenciación, 0,15 a 0,25 como diferenciación mayor
y sobre 0,25 como diferenciación superior al rango anterior.
La diferenciación entre entidades genéticas tomadas de dos en
dos son medidas utilizando el estimador de Fst (Weir & Cockerham 1984). La
26
significancia de los estimadores reales son medidos por comparación de los Fst
obtenidos bajo la hipótesis de una estructuración no real Para este trabajo solo
utilizamos los test por permutaciones de genotipos en cada locus, entre diferentes
unidades, para compararlas de dos en dos (1000 permutaciones). El porcentaje de
Fst obtenido luego de las permutaciones superiores, donde iguala en valor
absoluto al estimador real, da la probabilidad P que el valor observado sea debido
al azar y entonces no corresponde a una estructura real. La estructura es
considerada como significativa cuando P<5%.
III.4 b. Identificación de las mutacciones
Los diferentes perfiles de restricción obtenidos con una misma
enzima, fueron utilizados para la construcción de una matriz de mutaciones.
Cuando se presenta una sola mutación se codifica con “0” para uno de los perfiles
y con “1” para el otro perfil. En caso de que exista más de una mutación se
codificará con: "00", "01", "11" para tres tipos de perfil (fig.7). Este tipo de
codificación permite el ingreso de datos en el programa estadístico Genetix (para
test bootstrapt) para llevar a cabo la construcción del árbol filogenético.
Perfiles de restricción visualizados en gel de agarosa
Perfil A
1348
Perfil B
Perfil C
1348
1148
A
00
C
11
794
B
01
C
11
A
00
B
01
1000
794
200
2x200
Fig. 7. Ejemplo de interpretación de perfiles de restricción: Para pasar del perfil A a C hay dos
mutaciones, para pasar de B a C ó de A a B hay una mutación.
27
III.4.c. Construcción filogenética
En la construcción del árbol filogenético en primer lugar se lleva a
cabo un test bootstrapt basándose en combinaciones sucesivas al azar de las
columnas de la matriz original. Luego se utiliza un método de algoritmo de
parsimonía de Wagner (Programa: MIX – Mixed method parsimony) el cual
considera que los cambios en una mutación ocurre de 0 Æ 1 o viceversa con la
misma probabilidad. Posteriormente se aplica
“Consensus tree program” que
básicamente analiza la frecuencia de aparición grupos monofiléticos en los datos.
Si un grupo ocurre mayoritariamente
respecto de todos los árboles (datos)
introducidos, este podría definitivamente aparecer en el árbol consensus. En
relacion con el bootstraap una bifurcación del árbol se considera
significante
cuando esta se ha producido más del 50% de las veces.
28
IV. RESULTADOS
IV.1. Identificación de haplotipos.
Se probó la existencia de sitios de restricción con 15 enzimas y se
observó un total de veinte perfiles de restricción: 5 para Nde II; 3 para Hinf I, Hha I
y Eco RI; 2 para Hpa II y uno para Hae III, Alu I, Nde I, Rsa I y Taq I (Tabla 1). Los
perfiles de restricción y los haplotipos son mostrados en la Tabla 2 para P.
fasciatum y en la Tabla 3 para P. tigrinum.
Tabla 1.
Denominación de perfiles de restricción de ADN mt. de P. fasciatum y P. tigrinum
Hae III Alu I
A
A
Nde I Nde II Hpa II Hinf I
A
Hha I Eco RI Rsa I
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
C
C
C
C
A
Taq I
Sal I
Sac I
A
X*
X*
Sac II Hind III Dra I
X*
X*
X*
D
E
X* No tiene sitio de corte.
29
BamH
I
X*
Tabla 2
Conformación
de
haplotipos
identificados
en
ADN
mitocondrial
de
Pseudoplatystoma tigrinum por análisis RFLP.
Hae III
Nde I
Alu I
Hpa II
Hinf I
Hha I
Eco R I
Nde II HAPLOTIPO
A
A
A
B
B
A
A
A
T1
A
A
A
A
B
A
A
C
T2
A
A
A
A
B
A
B
C
T3
A
A
A
A
B
A
B
D
T4
A
A
A
B
B
A
A
C
T5
A
A
A
A
B
C
B
C
T6
A
A
A
A
B
A
C
C
T7
A
A
A
B
B
A
B
C
T8
Tabla 3
Conformación
de
haplotipos
identificados
en
ADN
mitocondrial
de
Pseudoplatystoma fasciatum por análisis RFLP.
Hae III
Nde I
Alu I
Hpa II
Hinf I
Hha I
EcoR I
Nde II
HAPLOTIPO
A
A
A
A
A
B
C
B
F1
A
A
A
B
A
B
C
B
F2
A
A
A
A
A
C
C
B
F3
A
A
A
B
A
C
C
B
F4
A
A
A
A
A
B
C
A
F5
A
A
A
A
A
C
C
A
F6
A
A
A
A
A
B
C
E
F7
A
A
A
A
C
B
C
B
F8
30
IV.2. Distribución geográfica de los haplotipos.
Para P. fasciatum el haplotipo más frecuente es F1 y está presente en
las poblaciones de los tres ríos, F3 se encuentra con menor frecuencia que el
anterior, pero también está presente en las mismas poblaciones. F2, F4 y F5 son
haplotipos particulares de la población de Itenez. F8 se encuentra solamente en
poblaciones de Mamoré. Finalmente F6 y F7 de Orthon (Fig 8 y 9).
31
5%
5%
(1)
5% (1)
(1)
20%
(4)
16%
(3)
53%
(10)
75%
(15)
21%
(4)
A
B
9%(2)
5%
(1)
14%
(3)
72%
(16)
C
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
Figura 8. Frecuencia de haplotipos de Pseudoplatystoma fasciatum en relación a la región geográfica de las
poblaciones de: A: Cuenca del Itenez, B: Cuenca del Mamoré medio C: Cuenca del Orthon. Los números
entre paréntesis indican el número de individuos para cada haplotipo dentro de cada población.
32
.
F1
F5
F2
F6
F3
F7
F4
F8
Figura 9. Distribución geográfica de los haplotipos de Pseudoplatystoma fasciatum. La figura
muestra mayor diversidad haplotíca en la cuenca Itenez (en el lado del escudo brasilero), y la existencia de
haplotipos compartidos entre las poblaciones de las tres cuencas en estudio.
En el caso P. tigrinum el haplotipo más frecuente es T3 y está presente en
las poblaciones de los tres ríos. El haplotipo T2 comparten las poblaciones de
Mamoré medio y Itenez. T1, T4 T5 y T8 son haplotipos particulares de la población
de Itenez; T7 de Mamoré medio y finalmente T6 de Orthon (Fig 10 y 11).
33
5%
(1)
5%
11% (1)
(2)
14%
(3)
11%
(2)
31%
(6)
11%
(2)
81%
(16)
31%
(7)
B
13%
(1)
A
87%
(7)
C
T1
T5
T2
T3
T4
T6
T7
T8
Figura 10. Frecuencia de haplotipos de Pseudoplatystoma tigrinum en relación a la región
geográfica de las poblaciones de: A: Cuenca de Itenez, B: Cuenca de Orthon C: Cuenca de Mamoré medio.
Los números entre paréntesis indican el número de individuos para cada haplotipo dentro de cada población.
34
T1
T5
T2
T3
T4
T6
T7
T8
14
Figura 11. Distribución geográfica de los haplotipos de Pseudoplatystoma tiginum, la figura muestra
mayor diversidad haplotíca en la cuenca Ienez, en el lado del escudo brasilero, y la existencia de haplotipos
compartidos entre poblaciones de regiones geográficas cercanas y entre las poblaciones de las tres cuencas
en estudio.
35
IV.3. Estructura geográfica.
El análisis con el estimador del índice de fijación Fst, en el caso de P.
fasciatum no muestra valores significantes comparando las poblaciones de las tres
cuencas (P < 5%). En cambio para P. tigrinum muestra significancia cuando se
compara las poblaciones de la cuenca de Itenez con las de Orthon y Mamoré
medio (Fst= 0.19 y Fst = 0.15 respectivamente)(Tabla 3).
Tabla 3.
Resultados del análisis con el estimador Fst
comparando las poblaciones de las tres
cuencas, tomando de dos en dos.
Psedoplatystoma fasciatum
Cuenca
Orthon
Mamoré medio
Itenez
0.04
0.04
Orthon
0.00
Pseudoplatystoma tigrinum
Cuenca
Orthon
Mamoré medio
Itenez
0.19*
0.15*
Orthon
0.00
Los datos resaltados con * son significativos (P<5)
VII. 4 Identificacion de las mutaciones.
Dentro de la región amplificada se observa 7 mutaciones con las enzimas
Hpa II, Hinf I, Hha I, Eco RI y 3 para NdeII, las mutaciones con esta última no
fueron utilizadas porque no se logró relacionar las dos especies.
36
Hpa II
Perfil A
HpaII
A
1130
O
B
970+100
1
Perfil B
1130
1080
2210
1080
970
100
2150
HpaII. Se obtuvo dos perfiles: El perfil A presenta una banda de 1130pb, en
cuya secuencia existe un sitio de restricción para formar el perfil B que presenta
dos bandas una de 970pb y otra de 100pb, sumando el peso de ambas bandas
resulta 1070 (aproximadamente el peso de la banda del perfil A)
37
Hinf I
Perfil A
Hinf I
Perfil B
Perfil C
749
C
652
OO
A
607+131
O1
A
749
O1
C
749
652
OO
B
528+185
11
B
528+185
594+131
11
749
652
607
580
594x2
528
580
221
131
221
185
131
2288
2253
2202
221
Hinf I. La digestión con esta enzima produce tres perfiles de restricción. El
perfil C presenta una banda de 652pb, en cuya secuencia existe un sitio de
restricción para formar dos bandas del perfil A una de 607pb y otra de 131pb. La
banda de 749pb del perfil A presenta un sitio de restricción, y como producto
tenemos una banda de 528pb y otra de 185 pb. La banda de 749pb del perfil C
presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 528pb y
otra de 185pb que forman parte del perfil B, así mismo existe otro sitio de
restricción en C que forma otras dos bandas del perfil B, una de 594 y otra 131pb.
38
Hha I
Perfil A
Hha I
A
1230
OO
C
958
O1
A
1230
1096
OO
C
775+532
O1
Perfil B
Perfil C
1230
1096
958
B
775+349
11
B
775+532
775+349
11
775
775
532
532
349
2326
2431
2265
Hha I. Se ha obtenido tres perfiles de restricción. El perfil A presenta una
banda de 1230pb, en cuya secuencia existe un sitio de restricción para formar dos
bandas del perfil C, una de 775pb y otra de 532pb. La banda de 958pb del perfil B
presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 775pb y
otra de 349pb. La banda de 1230pb del perfil A presenta un sitio de restricción, y
como producto tenemos una banda de 775pb y otra de 532pb que forman parte
del perfil B, así mismo existe otro sitio de restricción en A y forma otras dos
bandas del perfil B, una de 775 y otra 349pb.
39
ECORI
Perfil A
Perfil B
Perfil C
EcoR I
A
1348
1000
C
1148+200
794+200
OO
B
1348
O1
A
1000
OO
11
C
1148+200
11
B
794+200
O1
1348
1348
1148
1000
2348
794
794
200
200x2
2342
2342
EcoR I. Se visualizó tres perfiles de restricción. El perfil A presenta una
banda de 1348pb, en cuya secuencia existe un sitio de restricción para formar dos
bandas del perfil C, una de 1148pb y otra de 200pb, así mismo existe otro sitio de
restricción en A que forma otras dos bandas del perfil C, una de 794pb y otra
200pb. La banda de 1348 perteneciente a B presenta un sitio de restricción, y
como producto tenemos una banda de 1148pb y otra de 200pb correspondiente al
perfil C. La banda de 1000 pb del perfil A presenta un sitio de restricción, y como
producto tenemos una banda de 794pb y otra de 200pb que forman parte del perfil
B.
VII.5 Filogenia.
La topología consensus obtenida usando la parsimonía de Wagner
(Fig 11) muestra valores de bootstrapt igual a 75% donde se bifurcan las ramas
40
de las dos especies, indicando notoria diferenciación genética entre las dos
especies. Dentro de cada especie la topología es muy débil.
7
7
7
7
7
7
7
RAIZ
75%
)
)
)
)
)
)
)
)
Fig .11. La topología concensus muestra la relación filogenética en base a los haplotipos de la
región control y citocromo B del genoma mitocondrial de P.tigrinum (T) y P. Fasciatum (F). La topología
fue construída en base a la parsimonía de Wagner y en la bifurcación de las ramas muestra valores de
bootstrapt de 75%.
41
V. DISCUSION
Pseudoplatystoma tigrinum y Pseudoplatystoma fasciatum son especies
ampliamente distribuidas en la cuenca amazónica,
de acuerdo con sus
características morfológicas, estas son especies muy semejantes. De acuerdo con
los resultados del tratamiento de cladística, presentados en el presente estudio, a
nivel genético las dos especies constituyen dos grupos monofiléticos distintos. En
cada grupo monofiletico la estructuración es débil, en relación con las mutaciones
de frecuencia baja, por lo tanto existe una divergencia genética débil entre los
haplotipos, lo cual puede mostrar una radiación reciente de las poblaciones de
cada una de las especies en estudio de la amazonía boliviana.
Coronel (2000), en un estudio sobre variabilidad genética en ADN nuclear
(isoenzimas), indica que poblaciones de P. fasciatum y P.tigrinum se constituyen
en dos especies claramente diferenciadas.
En P. fasciatum, no se observa diferencia genética significativa con el
análisis Fst de la distribución de los haplotipos entre las poblaciones de las tres
cuencas. En P. tigrinum existe diferencia genética significativa entre poblaciones
de la Cuenca de Itenez en relación con las poblaciones de las cuencas Mamoré
medio y Orthon, entre Orthon y Mamoré el test no muestra diferenciación
significativa, en este caso podría relacionarse con el pequeño número de muestras
tomadas de la cuenca de Orthon y la menor variabilidad genética de Mamoré con
respecto a Itenez. La diferenciación y la estructuración geográfica de los
haplotipos entre las dos especies puede tener su explicación relacionada en la
diferencia de la historia de vida de cada una de las especies. Al mismo tiempo
también puede estar relacionada con su distribución geográfica, P.tigrinum se
halla río arriba en relación a P. fasciatum que se encuentra en las partes más
42
bajas de la cuenca. En consecuencia P. fasciatum tiene mas facilidad que P.
tigrinum de pasar, por la confluencia, de un río a otro.
Coronel (2000) ha realizado un estudio relacionado con poblaciones de P.
fasciatum en el río Beni (no estudiado aquí) y el río Ichilo (Alto Mamore) cuyos
resultados
con
intraespecífica de
el
análisis
isoenzimático
ha
mostrado
baja
variabilidad
poblaciones de P. fasciatum del Río Ichilo y Beni. Sus
resultados son comparables con datos de variabilidad ADN mt de P. fasciatum
analizados por Claus (2000) quien encontró baja diversidad genética para las
mismas poblaciones que tomó Coronel. Sobre el punto en discusión, Montaño y
colaboradores, realizaron un trabajo sobre variabilidad genética en P. fasciatum en
la cuenca del río Magdalena, Colombia, utilizando isoenzimas, sus resultados
también indican polimorfismo relativamente bajo, La baja diferenciación genética
entre poblaciones de esta especie,
sugiere que existe un importante flujo de
individuos migrantes entre poblaciones de los ríos que estos autores tomaron en
cuenta. Estas observaciones apoyan nuestros resultados sobre la diferencia entre
las posibilidades migratorias de las dos especies y las consecuencias sobre su
estructuración genética.
Para las dos especies, P. tigrinum y P. fasciatum, existe mayor diversidad
haplotípica en las poblaciones de la cuenca Itenez que en las cuencas Orthon y
Mamoré medio. Si esta observación de una mayor diversidad genética en las
poblaciones de la cuenca Itenez que en las poblaciones de las otras cuencas se
confirma para varias otras especies de peces, entonces este fenómeno podría
estar relacionado con el funcionamiento de un refugio cuaternario del lado del
escudo brasilero.
Esta coincidencia de diversidad haplotípica presente en las
poblaciones de Itenez hace que cepas extraídas de esta cuenca sean mejores
candidatas para acuicultura, con un mayor potencial genético ( B. Chevassus,
1989).
43
Se sugiere que en un estudio posterior se podría aumentar el número de
individuos de cada cuenca y con más sitios de muestreo. Así se podrá diferenciar
con más seguridad los haplotipos de gran distribución, que podrían ser ancestros
de los haplotipos particulares de una población que tendrían origen después de la
colonización. También la secuenciación del fragmento Dloop+CytoB daría más
precisiones sobre la evolución del genoma mitocondrial de estas especies. Para
finalizar, se sugiere realizar la comparación de variabilidad genética entre varias
especies, en varios lugares de la Amazonía boliviana y fuera de ella, e investigar
las diferencias y características genéticas comunes de las filogeografías, lo cual
nos permitiría entender más la evolución de la ictiofauna amazónica.
44
VI. CONCLUSIONES
- Se ha establecido una clara diferenciación genética interespecífica de ambas
especies, constituyendo cada una dos grupos monofiléticos distintos, lo cual fue
determinado realizando un tratamiento de cladística.
- Existe una débil estructuración intraespecífica para cada grupo monofilético,
esto en relación con las mutaciones obtenidas del análisis de los perfiles
conseguidos con la digestión con enzimas de restricción.
- El análisis RFLP también muestran visiblemente marcada diferenciación en el
genoma mitocondrial de ambas especies, revelando haplotipos particulares para
cada especie.
- Con el análisis Fst la diferencia genética es significativa para P. tigrinum entre
las poblaciones de la cuenca Itenez y las poblaciones de las otras dos cuencas,
para las poblaciones de P. fasciatum no existe diferencia genética significativa, lo
cual puede estar relacionada con la distribución geográfica y el comportamiento
migratorio de ambas especies.
45
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