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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS CARRERA BIOQUÍMICA INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA - IRD “VARIABILIDAD GENETICA DE Pseudoplatystoma tigrinum y Pseudoplatystoma fasciatum EN LA CUENCA AMAZONICA BOLIVIANA” Programa: “Interaccion Genoma/Poblaciones/Medio Ambiente de los peces tropicales” TESIS DE GRADO Para optar al titulo de Licenciatura en Bioquímica Tutor: Dr. Jean François Renno (IRD) Postulante: Rosario Violeta Rivera Mancilla LA PAZ - BOLIVIA 2003 $'LRV $PLPDPi2WLOLD $PLSDSi$OIUHGR $PLHVSRVR/XFLR $PLVKHUPDQRV 0DUWtQ/LOLDQ\-XOLR $PLVVXHJURV 1LQID\:LOIUHGR $PLVDPLJRV 3RUWRGRHODPRUTXHPHHQWUHJDQ $*5$'(&,0,(1726 $PLWXWRUHO'U-HDQ)UDQFRLV5HQQRSRUEULQGDUPHHQVHxDQ]DGHGLFDFLyQ\ DSR\RHQHOGHVDUUROORGHHVWHSUR\HFWR $ OD 'UD 9ROJD ,xLJXH] /LF 5RODQGR 6iQFKH] \ DO /LF 3DEOR ,UDKROD SRU VX DPLVWDGLQFRQGLFLRQDO\SRUVXGHGLFDFLyQHQODUHYLVLyQGHHVWHSUR\HFWR $O/LF-XDQ3DEOR7RUULFR/LF)UHGHULFN0DKH\&ODXGLD$OLDJDSRUDSRUWDUWLHPSR \FRQRFLPLHQWRVHQHOGHVDUUROORGHHVWHSUR\HFWR $O 6HxRU 1DWDOLR 0HGUDQR SRU VX DSR\R \ SULQFLSDOPHQWH SRU HO FDULxR TXH PH EULQGD $PLIDPLOLDSRUODSDFLHQFLD\ODFRQILDQ]DGHSRVLWDGDVHQPLSHUVRQD $PLV$PLJRV/LF1DWDQLHO0DPDQL/LF-XDQ3DEOR7RUULFR,QJ-RUJH4XH]DGD /LF-XOLD%DUUHWD&ODXGLD$OLDJD5RVHQND7HMHUtQD3DROD5RPHFLQ/LF5RVDOtD 0DPDQL-XDQ5XGG\/XQD'DULR$FKD/LF6DPDQWD6iQFKH]/LF$QD(QFLQDV 5HQDWD6DODV/LF6KLUOH\$UDPD\R/LF)HUQDQGR&DUYDMDO0LOHQND$JXLODU-XDQ &DUORV%HUPHMR*DEULHOD9LOOHJDV/LF$QHWK9D]TXH]6RQLD6DFDFD$OYDURTXH FRQVWLWX\HQ OD JUDQ IDPLOLD GHO ,QVWLWXWR GH %LRORJtD 0ROHFXODU \ %LRWHFQRORJtD D HOORVOHVDJUDGH]FRVXDPLVWDGLQYDORUDEOH RESUMEN La Amazonía, contiene los más extensos y continuos bosques húmedos tropicales, estas áreas son habitadas por variedad de poblaciones, especies y complejo de especies. Dentro de las familias de peces más importantes en los Siluriformes, esta la familia Pimelodidae a la que pertenecen Pseudoplatystoma tigrinum (chuncuina) y Psedoplatystoma fasciatum (Surubí), ambas especies constituyen un considerable potencial para la acuicultura de la región. El objetivo de este estudio es analizar la estructuración genética intraespecífica de ambas especies y relacionarla con fenómenos históricos o fenómenos actuales ecológicos, para tal efecto se tomó muestras de músculo de peces de poblaciones de las cuencas de Itenez, Mamoré en su parte media y Orthon, de las que se analizó el ADN mitocondrial por RFLP utilizando 15 enzimas de restricción, de ellas, cinco mostraron polimorfismo en relación con diez mutaciones de sitio. La topología consensus obtenida usando la parsimonía de Wagner muestra valores de bootstrapt igual a 75%donde se bifurcan las ramas de los dos grupos monofiléticos. Dentro de cada grupo monofilético la topología es débil. El análisis Fst (índice de fijación), para P. tigrinum muestra significancia (P< 5%) cuando se compara las poblaciones de las cuencas Itenez con las de Orthon y Mamoré medio, en el caso de P. fasciatum no existe significancia (P<5%). En ambas especies existe mayor diversidad haplotípica en las poblaciones de la cuenca Itenez que en Orthon y Mamoré medio este fenómeno podría ser explicado por la Teoría de Refugios. La diversidad haplotípica presente en las poblaciones de Itenez hace que cepas extraídas de esta cuenca sean mejores candidatas para la acuicultura. Abstract Amazon has the extended and continues tropical rain forest; this area is inhabited by variety of populations, species and species complexes. Pimelodidae family is within most important Siluriphorm fish families, that include Pseudoplatystoma tigrinum (chuncuina) and Pseudoplatystoma fasciatum (Surubi), both species have an important potential to agriculture in the region. The objective of this study is to analyze the intraespecific genetic structure of both species and relate it with historical phenomena or actual ecological phenomena, to do so muscle samples were taken from populations from Itenez basin, Mamoré in its middle part and Orthon basins, and from which RFLP from mitochondrial DNA was analyzed. Out of 15 restriction enzymes that were used five show polymorphism in relation to ten mutation sites. Consensus topology obtained using Wagner’s parsimony shows bootstrapt values equal to 75% where the two monophyletic group branches bifurcate. Topology is very weak within each group. The Fst (fixation index) analysis, for P. tigrinum shows significance (P< 5%) when Itenez basin populations are compared to Orthon´s and middle Mamore populations. In P. fasciatum there is not significance (P < 5%). There is more haplotipic diversity in both species in Itenez basin populations then in Orthon and middle Mamore, that could be explained by the refuge theory. Haplotipic diversity in Itenez basin populations makes strains from this river more suitable for aquiculture. INDICE I. INTRODUCCIÓN 1 I.1. PROBLEMÁTICA 3 I.2.BIOLOGÍA EVOLUTIVA 4 I.2.a Microevolución 5 I.2.b. Macroevolución 5 I.2.c.Equilibrio de Hardy Weimberg. 6 I.2.d. Las fuerzas de la evolución. 6 I.2.d.1.La selección 6 I.2.d.2. La mutación 7 I.2.d.3.La deriva 7 I.2.d.4. La migración 8 I.2.e.Mecanismos de aislamiento reproductivo 9 I.2.e.1. Mecanismos prezigóticos 9 I.2.e.2. Mecanismos postzigóticos 10 I.2.f. La especiación 11 I.2.g. Marcadores moleculares 13 I.2.g.1. Generalidades del ADN mitocondria 14 I.2.g.2. Utilización de ADN mt como marcador molecular 16 I.2.g.3. Análisis RFLP 17 I.3. PRESENTACIÓN DE LAS ESPECIES EN ESTUDIO: Pseudoplatystoma fasciatum y Pseudoplatystoma tigrinum 18 I.3.a. Medio de vida 18 I.3.b. Morfología 19 I.3.Edad y Crecimiento 20 IV.4. Alimentación 20 IV.5. Reproducción y Migración 21 V. OBJETIVOS 22 VI. METODOLOGÍA 23 VI.1. Puntos de muestreo 23 VI.2. Muestras 23 . Extracción de ADN VI.3. Análisis RFLP de ADN mitochondrial 24 25 . Amplificaciónde la region control y la región del citocromo B del ADNb mitocondrial 25 . Digestión de los productos amplificados con enzimas de restricción VI.4. Análisis de datos 25 26 . Identificación y estructura haplotípica 26 . Identificación de las mutaciones 27 . Construcción filogenética 28 VII. RESULTADOS 29 VII.1. Identificación de haplotipos 29 VII.2. Distribución geográfica de los haplotipos 31 VII.3. Estructura geográfica 35 VII.4. Identificación de las mutaciones 36 VII.5. Filogenia 40 VIII. DISCUSIÓN 42 IX. CONCLUSIONES 45 X. BIBLIOIGRAFIA 46 I. INTRODUCCION La Cuenca Amazónica tiene una superficie de 6059000 Km2 , extendida en los países Sudamericanos de Brasil, Colombia, Ecuador, Perú, Venezuela, Bolivia, siendo el sistema hidráulico más grande del mundo (Montes de Oca, 1997). En el territorio boliviano la Cuenca Amazónica ocupa 724000 Km2 , de los cuales las cuencas más importantes son: Madre de Dios, Beni, Mamoré, Itenez, los cuales son navegables y presentan un alto potencial para la pesca (Muñoz H. y Van Damme,1998). La Amazonía, contiene los más extensos y continuos bosques húmedos tropicales; se considera que es un centro muy rico en variedad de especies y de relativamente alto endemismo para plantas y animales. Frecuentemente estas áreas son habitadas por variedad de subespecies (razas) de la misma especie, o por diversidad de especies similares del mismo complejo de especies. Durante el Mioceno medio (16 - 10 millones de años BP (antes del presente)) aún había conexión entre el Río Amazonas (actual) y el Caribe a través del área de Maracaibo, y probablemente también con el Pacífico. Los ríos del noroeste de la Amazonía fueron dirigidos hacia el oeste, al Pacífico, y hacia el Caribe formando el sistema de ríos paleo-Orinoco, alcanzando el Caribe en el área de Maracaibo. Las incursiones marinas en el Amazonas durante períodos de altos niveles de “marea”, han promovido cambios extensivos en la vegetación en la actual área de bosques tropicales (Hoorn et al, 1995). Las fases estuario – lacustre ocurrieron en períodos de niveles bajos de “marea” dando vía a muchos tipos de vegetación pantanosa y a bosques inundados estacionalmente. Estas alteraciones temporales entre ecosistemas de aguas dulces y saladas, han causado en diferentes áreas geográficas, una dinámica y diversidad histórica con 1 aumento de la biodiversidad en algunas y extinciones en otras (en Coronel, 2000). Como un efecto del trastorno de la Cordillera Este de los Andes del norte, la desembocadura del Río Paleo – Orinoco fue cerrada durante el Mioceno tardío y fue formado el actual Río Orinoco. Los ríos en la parte noroeste del actual río Amazonas tuvieron cambios en su curso hacia el este, formando parte del sistema del Río Amazonas, tal como ahora lo conocemos (Hooghiemstra y Van Der Hammen, 1998). La gran diversidad de la Amazonía puede ser explicada por varios fenómenos no exclusivos, que han conducido a menos extinciones y a más formación de especies por especiacion alopatrica, en relacion con: los Ríos Barreras (Wallace, 1852), los Paleoarcos (Paton,1994) y los Refugios (Haffer, 1982) citados en Da Silva y Paton 1998) De acuerdo con los Paleoarcos, inmediatamente al crecimiento de los Andes se han formado relieves en arcos, fragmentando la red hidrográfica y las poblaciones que la habitan. De acuerdo con la teoría de los Refugios (áreas relativamente pequeñas donde aún prevalece climas muy húmedos en los que permanecieron y se diversificaron especies vegetales y animales), las poblaciones de especies de gran envergadura dependientes de bosques tropicales, llegaron a ser aisladas a partir de su primer habitat fragmentado de las épocas secas al máximo glacial en las latitudes temperadas actualmente. Este período glacial se piensa que fue lo suficientemente largo como para que haya divergencia evolutiva entre poblaciones hermanas aisladas en diferentes refugios. En períodos inter-glaciales estos bosques tropicales húmedos expandidos y eventualmente reconectados formaron el bosque continuo de la Amazonía. La alternancia de fragmentacion y de coalescencia del medio ambiente se ha traducido en la alternancia de especiacion y dispersión de las especies de la Amazonía. En lo referente a los peces se ha 2 demostrado que la estructuración de la ictiofauna Guyanesa es dependiente de dos refugios (Renno, et al, 1990 y 1991). De acuerdo con los Ríos y Barreras, la amplitud de los ríos variaron y como consecuencia de aquello se produjo el efecto barrera de los ríos para parte de las especies. En la época de lluvia (glaciación) los ríos estaban más amplios y jugaron un rol de barrera más que en la época interglacial. I.1 PROBLEMATICA Dentro de las especies de peces económicamente importantes en la Cuenca Amazónica, la familia Pimelodidae es la más grande y diversa entre los Siluriformes Neotropicales (Coronel, 2000). Esta familia está constituída por varios géneros, de los cuales los más importantes para la pesca local son: Brachyplatystoma flavicans (plateado o dorado), B. Filamentosum (bacalao), Phractocephalus hemiliopterus (general), Pseudoplatystoma fasciatum (surubí), P. tigrinum (simicuyo o chuncuina), Goslinea sp.(bagre) y Paulicea lutkeni (bagre) (Lauzane y Loubens, 1985). Para la realización del presente estudio, nos planteamos las siguientes preguntas: -¿ En P. fasciatum y P. tigrinum existe una estructuración genética intra específica? -¿Se puede relacionar esta estructuración con fenómenos “actuales” (biológicos y ecológicos ) o fenómenos históricos (paleo ecológicos)? Coronel (2000) realizando un estudio genético sobre el genero Pseudoplastytoma mediante análisis isoenzimático, de muestras colectadas del Río Ichilo (arriba del Río Mamoré) y del Río Beni, determinó que existe alta diferenciación genética entre las especies de P. fasciatum y P. tigrinum. Dentro de P. fasciatum, poblaciones de las lagunas del Río Ichilo y Río Beni, mostraron 3 pequeñas diferencias, al igual que entre las poblaciones del Río Ichilo y Río Beni. El cálculo de flujo genético entre poblaciones dan resultados con alta diferenciación entre P. fasciatum y P. tigrinum, confirmando que ambas poblaciones son dos especies diferentes. Resultados de diversidad genética de P. fasciatum tomados de Claus (2000), muestran que el valor de variabilidad entre las poblaciones del Río Ichilo y el del Río Beni, es baja. En el presente estudio se analizó por RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphysm) un fragmento de ADNmt a partir de muestras de músculo de P. fasciatum y P. tigrinum provenientes de las cuencas: Itenez, Mamoré en su parte central y Orthon. Este estudio preliminar sobre las poblaciones de Pseudoplatystoma tigrinum y Pseudoplatystoma fasciatum se realizó con el propósito de relacionar la estructuración genética intraespecífica y el sitio geográfico donde se desarrollan estas especies. I.2 BIOLOGIA EVOLUTIVA El presente estudio se desarrolló en el marco de los conceptos y herramientas de la biología evolutiva. La biología evolutiva estudia los cambios en las propiedades biológicas de poblaciones de organismos, estos cambios son considerados evolutivos si son heredables de generación en generación, por medio del material genético (Futuyma, 1986). La biología evolutiva abarca: (1) Investigación de la historia de vida en la tierra, tomando en cuenta la relación ancestro – descendiente y la filogenia de todas las especies, los tiempos en los cuales se originaron y se extinguieron, el origen y la relación en el curso de los cambios de sus características. (2) Comprensión de las causas de los procesos evolutivos, tomando en cuenta los orígenes de las variaciones hereditarias, los procesos que actúan para afectar esas variaciones, la relativa importancia de procesos que coactúan en los procesos de cambio, la velocidad con la que ocurren estos cambios, 4 los procesos de mutación, selección natural y deriva genética que dieron lugar a las características moleculares, anatómicas, de comportamiento y otras características de los diferentes organismos. En la evolución existen fenómenos de: Macroevolución y Microevolución. I.2.a. Microevolución. Se refiere a cambios en la frecuencia de alelos de poblaciones, en pequeña escala y en pocas generaciones. Estos cambios pueden ser debido a procesos tales como: - Mutación, cambios heredables en el ADN. - Flujo genético, cambios en las frecuencias alélicas en una población por individuos inmigrantes o emigrantes, el flujo génico también puede neutralizar otras diferencias genéticas que se habrían acumulado. - Deriva genética, fluctuaciones al azar en la frecuencia de alelos, debido a que afecta en gran medida a poblaciones pequeñas (especies en riesgo), en los que influyen fenómenos tales como el efecto fundador y el cuello de botella. - Selección natural, estabilización de la frecuencia de alelos debido a diferencias de sobrevivencia y reproducción en una población, ésta puede ser direccional, disruptiva, estabilizante, balanceada y selección sexual. I.2.b.Macroevolución. Se refiere a cambios en gran escala en la frecuencia genética en una población sobre un largo período de tiempo (y puede culminar en la evolución de una nueva especie). Los mecanismos que rigen la macroevolución son: - Especiación, que incrementa la diversidad biológica. Existen dos tipos comunes de especiación: alopátrica y sympátrica; las dos difieren en la distribución geográfica de las poblaciones en cuestión. - Extinción, la historia de vida sobre la tierra incluye muchos episodios de extinción en los cuales muchos grupos de organismos desaparecieron de la faz del planeta. 5 Los periodos de extinción son seguidos por períodos de radiación donde nuevas especies llenaron los nichos que antes fueron despoblados. - Equilibrio puntuado, es una inferencia a cerca del proceso de macroevolución a partir de los patrones de especies documentadas en fósiles. I.2.c. Equilibrio de Hardy y Weinberg. Hardy y Weinberg (1908) demostraron que la composición genética de una población permanece en equilibrio mientras no actúen ni la selección ni ningún otro factor que altere éste equilibrio y no se produzca mutación alguna. La mezcla de genes que implica la reproducción sexual y la persistente reorganización de estos, no cambia la frecuencia de alelos en las sucesivas generaciones. Es decir, la herencia mendeliana, por sí misma, no engendra cambio evolutivo, no es un mecanismo de alteración de las frecuencias de los genes en las poblaciones, principio conocido como equilibrio Hardy-Weinberg. cuando esta Ley se altera en una población, entran en acción las fuerzas de la evolución. I.2.d. Las fuerzas de la evolución En la evolución biológica, al ser proceso de cambio y diversificación de las poblaciones y las especies a través del tiempo, interviene la mutación, la deriva, la selección natural y la migración. I.2.d.1 La selección La selección natural es el proceso que promueve la adaptación y mantiene a raya los efectos desorganizadores de los otros procesos evolutivos, puede ser definida simplemente como la reproducción diferencial de variantes genéticas alternativas (Ayala,1984), es la principal fuerza evolutiva, es la manifestación de las diferencias de aptitud (valor adaptativo, parámetro utilizado 6 para medir la selección natural) entre los individuos, basada en la capacidad relativa para transmitir genes a las generaciones siguientes (Santos). La selección natural está en relación con la naturaleza adaptativa y áltamente organizada de los seres vivos. Explica la diversidad de los organismos porque promueve su adaptación a diferentes formas de vida (Ayala, 1984). Wallace y Darwin propusieron que la selección natural puede explicar cómo ocurre la evolución, pero no pudieron explicar el origen de las variaciones de genes que proporciona la materia prima para la evolución, ni como tales variaciones se mantienen en una población o en una especie (Williams y Cummings, 1999). I.2.d.2. La mutación La mutación es el origen inicial de la variación genética en una población; implica un error en la replicación de una secuencia nucleotídica, o alguna otra alteración en el genoma (Futuyma, 1986). Aunque sea fuente básica de toda variabilidad genética, ocurre con una frecuencia muy baja. Los rangos de mutación están comprendidos en el orden de 10-4 a 10-6 mutaciones, por locus, por generación (Ayala, 1984). La tendencia de cambio de frecuencias alélicas como un resultado de recurrente mutación (presión de mutación) es muy pequeña en el curso de unas pocas generaciones (Hartl, 1981). I.2.d.3. La deriva La deriva genética se refiere a los cambios en las frecuencias génicas debidas a la variación en el muestreo de generación en generación. La deriva genética es un proceso de puro azar. El principio general es que la magnitud de la deriva está relacionada inversamente con el tamaño de la muestra. Con respecto a los organismos, este principio significa que cuanto más pequeño sea el número de individuos reproductores en una población, mayores 7 serán probablemente los cambios de frecuencia alélica debidos a la deriva génica (Ayala, 1984). Debido al proceso provocado por la deriva genética las frecuencias génicas entre subpoblaciones van diferenciándose progresivamente. Otra de las consecuencias genéticas de esta dispersión es la deficiencia de heterocigotos y un exceso de homocigotos (efecto Wahlund), con respecto a las proporciones HardyWeinberg, que se observa al considerar conjuntamente todas las subpoblaciones. I.2.d.4 La migración La migración se refiere al proceso de movilización de individuos de una población a otra; como consecuencia de ello se lleva a cabo la introducción de genes por los migrantes, alterando de esta manera la frecuencia de alelos y genotipos dentro de una población y alterando el equilibrio de Hardy-Weinberg, sin embargo este equilibrio puede ser restaurado si en una población que ha recibido migrantes, los cruces son al azar. La incorporación de alelos llevados por migrantes depende de la habilidad de los migrantes para sobrevivir en una nueva área. El flujo de migración no cambia las frecuencias alélicas de toda la especie, pero puede cambiarlas localmente cuando las frecuencias alélicas de los migrantes son diferentes a las de los individuos residentes (Ayala, 1984) Existen diversos modelos de flujo de genes que corresponde a diferencias en la estructura de una población (Williams y Cummings, 1999). - El modelo “continente- isla”, el cual es efectivamente una vía de movimiento de una población grande (“continental”) a una población pequeña, población aislada. - El modelo “isla” , en el cual la migración ocurre al azar entre un grupo de pequeñas poblaciones. - El modelo “stepping- stone”, en el que cada población recibe migrantes solamente de poblaciones vecinas. 8 - El modelo “aislamiento-por- distancia” en el cual el flujo de genes ocurre entre vecinos locales en poblaciones distribuidas continuamente. La mayoría de los modelos considera el flujo de genes en una proporción aproximadamente constante en cada generación. Es importante reconocer que la cantidad de movimiento de genes, medida por la proporción o porcentaje de flujo de genes (m) es a menudo mucho menor que el movimiento migratorio de los organismos (Maynard Smiht, 1988). I.2.e. Mecanismos de aislamiento reproductivo. Las propiedades biológicas que impiden el apareamiento (mecanismos de aislamiento reproductivo) se pueden clasificar en: I.2.e.1. Mecanismos prezigóticos. Son aquellos que impiden la fecundación del óvulo, y que pueden ser ecológicas o geográficos, estacionales, conductuales, mecánicas y gaméticas. Aislamiento geográficos o ecológico, individuos que ocupan el mismo territorio viven en diferentes habitats y, por tanto no tienen oportunidad de cruzarse. Aislamiento estacionales o temporales, los organismos pueden madurar sexualmente en diferentes estaciones u horas del día. Aislamiento conductual o etológico, la atracción entre machos y hembras, o entre gametos masculinos y femeninos, en el caso de plantas y organismos acuáticos, es necesaria para que se produzca la unión sexual; entre los animales es, quizá, el más poderoso. La cópula es a veces imposible entre individuos de 9 diferentes especies, ya sea por el tamaño incompatible de sus genitales o por variaciones en la estructura floral. Aislamiento mecánico, La fecundación se evita o se restringe por diferencias en los aparatos reproductores (genitales en animales y flores en vegetales) Aislamiento gamético o fisiológico, en los animales con fecundación interna los espermatozoides son inviables en los conductos sexuales de las hembras de diferentes especies. En las plantas, los granos de polen de una especie generalmente no pueden germinar en el estigma de otra (Williams y Cummings, 1999). I.2.e.2. Mecanismos postzigóticos. Tiene lugar en la fecuindación y la formación de zigotos híbridos, pero estos no son viables o dan lugar a híbridos débiles o estériles) Inviabilidad o debilidad de los híbridos. Esterilidad en el desarrollo del híbrido, Los híbridos son estériles porque sus gónadas se desarrollan anormalmenteo porque la meiosis se interrumpe antes de su terminación. Esterilidad en la segregación del híbrido, Los híbridos son estériles porque presentan segregación anormal hacia los gametos de cromosomas completos, de segmentos de cromosomas o de combinaciones de genes. Desintegración en F2, Los híbridos F1 son normales, vigorosos y fértiles, pero en F2 hay muchos individuos débiles o estériles. (Williams y Cummings, 1999). 10 I.2.f. La especiación. La especiación ha jugado un papel crítico en la evolución de vida de la tierra. Irónicamente, existe todavía mucho debate acerca de cual es el mecanismo responsable para la mayoría de eventos de especiación. El proceso de especiación divide un pool de genes en dos o más. Las poblaciones son separadas reproductivamente. Esta división puede estar acompañada por cambios en la morfología, la fisiología y la adaptación a un nicho ecológico, pero no son imprescindibles en un proceso de especiación. De acuerdo con Wagner (Williams y Cummings, 1999),el primer paso para la especiación es la acción de barrera para el flujo de genes entre poblaciones, que ejercen los accidentes geográficos como lagos, ríos y montañas. El segundo paso, es que las poblaciones aisladas sufren cambios genéticos independientes y divergen para producir dos especies distintas. De acuerdo con Ernest Mayr (Williams y Cummings, 1999). las especies se originan predominantemente de dos maneras . En la primera, denominada evolución filética o anagénesis, la especie A se transforma en la especie B durante un largo período de tiempo . En la segunda, denominada cladogénesis, una especie da lugar a dos o mas especies (fig 1). Este segundo proceso puede ocurrir durante largos períodos de tiempo o raramente en una o dos generaciones. 11 Anagénesis Especie A Especie B Cladogénesis Especie B Especie A Especie C Tiempo )LJ(QODHYROXFLyQILOpWLFDRDQDJpQHVLVXQDHVSHFLHVHWUDQVIRUPDFRQHOWLHPSRHQRWUD HVSHFLH(QWRGRPRPHQWRVRORH[LVWHXQDHVSHFLH(QODFODGRJpQHVLVXQDHVSHFLHVHHVFLQGHHQ GRVRPiVHVSHFLHV(Williams y Cummings, 1999). En 1963, Ernst Mayr y Theodosius Dobzhansky (Williams y Cummings, 1999) llegaron a la conclusión de que la especiación tiene lugar a través de la alopatria, o el aislamiento geográfico manteniendo los aspectos generales del modelo de Wagner, este modelo requiere que la población quede aislada, es decir, se debe interrumpir el flujo de genes. La ausencia o interrupción de flujo de genes es un prerrequisito para el desarrollo de diferencias génicas conseguidas para la adaptación a las condiciones locales. La diversidad genética que surge por mutación o por deriva genética al azar, quedará reflejada en la presencia de nuevos alelos, cambios en las frecuencias alélicas o por la presencia de nuevas ordenaciones cromosómicas. Finalmente se alcanzará un punto en el que las poblaciones tengan suficientes diferencias genéticas como para que puedan identificarse como razas distintas o semiespecies. Este proceso puede continuar ininterrumpidamente hasta que se formen dos o mas especies. 12 Si en cualquier momento durante el proceso de divergencia genética las condiciones que evitan el flujo génico entre las poblaciones desaparecen, son posibles dos resultados: 1.Las dos poblaciones se pueden fusionar en un solo conjunto de genes. 2.Los acervos génicos de las poblaciones pueden haber divergido hasta el punto en el que pueden haber surgido mecanismos de aislamiento reproductivo y las poblaciones no podrán cruzarse acabando como dos especies distintas. Sin embargo es posible que se desarrolle suficientes diferencias entre individuos de una población y producir dos especies a partir de una sola. Este tipo de especiacion se llama especiacion simpatrica, este importante mecanismo diversificacion de las especies de ha sido responsable de producir la diversidad de los peces Cichlidés de los lagos del Africa del este (Meyer, Axel 1987).Estas especies son ecológicamente muy diversas y la especiación puede haber sido el resultado de la selección disociadora de los diferentes nichos ecológicos. I.2.g. Marcadores Moleculares. Los marcadores de ADN están representados por secuencias que actúan como marcaje para otro gen estrechamente relacionado, estos pueden ser: ADN mitocondrial (ADN mt), ADN ribosomal (ADN r), minisatélites o número variable de repetición en tandem (VNTR) y microsatélites o simple secuencias repetitivas (SSR). A parte de los marcadores moleculares representados por ADN existen marcadores moleculares que constutuyen la expresión del ADN nuclear, estos últimos se denominan alozimas o isoenzimas, al respecto, para Pseudolplatystoma se desarrollaron trabajos utilizando como marcadores moleculares a las isoenzimas (Coronel, 2000 y Montaño). 13 I.2.g.1. Generalidades del ADN mitocondrial. La mitocondria contiene múltiples copias de moléculas de ADN. El genoma mitocondrial de los animales es circular, pequeño, de doble hebra; típicamente, el tamaño de genomas mitocondriales en animales es alrededor de 16500 + 500 pares de bases (bp). En peces, existen diferencias de tamaño intraespecíficas así como entre especies (Meyer, 1993). El genoma mitocondrial de animales contiene trece genes codificantes para proteínas, dos genes codificantes para ARNs ribosomal, veintidos genes codificantes para ARNs de transferencia y una región mayor no codificante (región control en vertebrados) que contiene sitios de iniciación para la replicación del ADN mitocondrial y transcripción (fig 2) (Meyer, 1993). Las dos hebras del genoma mitocondrial son designadas como hebra "L" (light) y hebra "H" (heavy). Con pocas excepciones, todo los genes en el genoma mitocondrial de vertebrados están codificados por la hebra H (Meyer, 1993). La disposición regular de los genes tARN y genes codificantes de proteínas sugiere que la estructura secundaria de los genes tARN sirven como una señal puntual durante la transcripción. Cuando dos genes codificantes de proteína no están separados por un gen tARN (por ejemplo ATPasa 6-COIII), a veces puede ser requerida una estructura loop para la propia transcripción (Meyer, 1993). Esta estructura secundaria puede también existir en algunos peces. La estructura loop de consta 29 bp (Meyer, 1993). La velocidad de evolución de la región control es de dos a cinco veces más alta que la de los demás genes mitocondriales. La región control está caracterizada por el "desplazamiento loop (D-loop)", una extensión de ADN que es complementaria a la hebra liviana (L strand), la hebra Dloop desplaza la hebra H. El sitio de iniciación de la síntesis de D-loop y el orígen de replicación de la hebra H son idénticos, pero, el sitio de terminación (s) para la hebra D-loop y la hebra H están separados (Meyer, 1993). El extremo variable en la región control (en términos de sustitución y longitud de mutación) fue descubierto a principios de 1970. La región control varía en longitud 200 bp a 14 4100bp, generalmente a causa de las duplicaciones en tandem y es responsable de la variación observada en el total de la longitud del genoma mitocondrial de los vertebrados. Esta también contiene una alta frecuencia de mutación a nivel poblacional (Meyer, 1993) T F T F PISCINA MITOCONDRIAL PISCINA MITOCONDRIAL Fig2. Orden de genes mitocondriales. Los orígenes de replicación de la hebra H y L están indicadas en la figura. El origen de la hebra H está en la región control, el origen de la hebra L está en el cluster de gene YCNA t-RNA. Los genes tARN son mostrados como cajas sombreadas. Las secuencias codificantes (templates) de todas las proteínas (excepto ND 6) y la mayoría de genes Tarn están sobre la hebra H. Los genes tARN codificados por la hebra L están señalados fuera del círculo, los genes tARN codificados por la hebra H están señalados dentro. (Meyer, 1993) El ADN mt. tiene una velocidad de sustitución de bases mucho más alto que el ADN nuclear (Fig 3 ). Un estimado de la velocidad de divergencia de secuencia es 20 x 10-9 por sitio por año, El rango de sustitución de nucleótidos en el ADN mt. es generalmente de cinco a diez veces mayor que el ADN nuclear, debido a la alta frecuencia de mutaciones puntuales (Maynard, 1997 y Meyer, 15 1993). Las transiciones (A <-> G, T <-> C) son mas comunes que las transversiones (A <-> T , G <-> C) (Maynard,1997). En animales existen solamente unos pocos casos de transferencia de genes mitocondriales al núcleo, y no se ha encontrado transferencia de genes nucleares a mitocondriales (Maynard, 1997). d i v e r g e n c i a d e s e c u e n c i a Tiempo de divergencia (M años) Fig.3 El rango de sustitución de nucleótidos en (a) ADN mitocondrial y (b) simple copia ADN nuclear (Maynard, 1997). I.2.g.2.Utilización del ADNmt. como marcador molecular. La molécula de ADN mitocondrial tiene dos propiedades que son usadas en la determinación de variación genética intra e inter poblacional:, es haploide, no recombinante y es casi exclusivamente de herencia maternal. La mitocondria paterna parece ser degradada durante la fertilización o talvez no se replique, entonces solo se hereda la mitocondria materna (Maynard,1997). Debido a su alta velocidad de evolución, alto polimorfismo inter e intra especie y acoplada con la herencia materna el ADN mt puede ser usado en 16 estudios de flujo genético mediado por hembras, para análisis de la estructura geográfica de una población, o para investigación de pequeños grupos de especies relacionadas (Harrison, 1989), igualmente se presta para el estudio de eventos fundadores, origen de clonalidad y también es utilizado para identificar eventos de hibridación (Meyer, 1993). La mayoría de los trabajos sobre estructura poblacional y relacionados a la filogenia de peces sobre datos de ADN mt, estuvieron basados en el análisis de Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP). Dentro las especies a veces se encuentran altos niveles de polimorfismo y diferenciación geográfica (Meyer, 1993). La relativa facilidad con la que las secuencias de los genes mitocondriales pueden ser determinadas a través de reacciones de PCR y secuenciación ha dado a luz nueva información (Meyer, 1993). Tsigenopoulos y Berrebi (1999) usaron secuencias de ADN mitocondrial en el estudio del género Barbus en Europa, para inferir relaciones filogeográficas entre poblaciones geográficamente distintas. (William y Cummings (1999) usaron secuencias de ADN para establecer relaciones filogenéticas entre peces asesinos africanos. Recientemente, Claus (2000) usó ADN mt para determinar la filogeografía de peces gato (Pseudoplatystoma fasciatum) en Sud America. I.2.g.3. Análisis RFLP. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) o Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción, es el evento en el que ocurre cortes por enzimas de restricción (endonucelasa que cortan las moléculas de ADN en sitios específico) en diferentes sitios de ADN de diferentes individuos de la misma especie. Estos cortes dan como resultado diferentes periles de fragmentos 17 restricción, que pueden ser visualizados a travez de eletroforésis en geles de agarosa teñidos con etidio, en luz ultravioleta. I.3. PRESENTACION DE LAS ESPECIES EN ESTUDIO: Pseudoplatystoma fasciatum Y P. tigrinum. Pseudoplatystoma fasciatum Y P. tigrinum, pertenecen al Orden Siluriformes y a la familia Pimelodidea. En Bolivia el surubí (P. fasciatum) y la chuncuina (P. tigrinum) son dos especies comunes, ambas especies son comercialmente importantes, siendo clasificadas al respecto, por la Misión Británica, como especies "clase A” (juntas forman mas de la mitad de los aportes de la pesca comercial en esta región, por su alta calidad de carne - 17% de proteína y 2% de grasa-), (Lauzane y Loubens, 1990). I.3.a. Medio de vida El género Pseudoplatystoma, está ampliamente distribuido en Sud América. Muy extendidos en el bajo Amazonas pero raros o ausentes en los estuarios, P. tigrinum y P. fasciatum están presentes en los tributarios altos de todos los tipos de ríos (Barthem y Goulding,1997), en los canales, en los planos de inundación a lo largo de los arroyos de la selva lluviosa, tanto en aguas corrientes como tranquilas (Muñoz y Van Damme 1998). En el Amazonas boliviano, Pseudoplatystoma fasciatum se encuentra en la llanura, a lo largo de Chapare hasta Villa Tunari (Gèrard Loubens et Jacques Panfili,2000). Como consecuencia de sus hábitos migratorios es más abundante en los tramos medios de los ríos amazónicos. (Muñoz, H. y Van Damme, 1998). Se advierte dos fenómenos de repartición heterogénea durante el tiempo de aguas bajas: P. fasciatum prefiere los medios lóticos mientras, P. tigrinum está difundida; 18 para las dos especies los machos son más abundantes en los ríos y las hembras en las lagunas (Gèrard Loubens et Jacques Panfili,2000). I.3. b. Morfología Las características morfológicas de P. fasciatum y P. tigrinum son muy semejantes. Siendo estos difícilmente confundidos con otros, ya que se caracterizan por poseer dientes en el paladar, puente óseo en el cráneo, la aleta dorsal muy deprimida y barbillas siempre largas (Lauzane y Loubens, 1990). P. fasciatum se diferencia de P. tigrinum por presentar la fontanela más corta, hocico más ancho y un patrón de coloración con más barras negras verticales.( Muñoz, H. y Van Damme, 1998) Pseudoplatystoma fasciatum Pseudoplatystoma tigrinum 19 I.3.c. Edad y Crecimiento. La edad individual de los peces es estimada a través de la técnica de observación de cortes frontales de vértebras, en estas especies la longevidad es por lo menos de 10 años para P. fasciatum y 15 para P. tigrinum. Entre las dos especies los machos alcanzan la madurez sexual con más precocidad, y las hembras crecen con más velocidad. El crecimiento durante el primer año es de 29 cm para P. fasciatum y 36 cm para P. tigrinum (Gèrard Loubens y Jacques Panfili, 2000). Se observa un período de crecimiento muy débil durante el estiaje y la crecida de los ríos. El crecimiento resulta rápido y se acompaña de acumulación de grasa en la cavidad abdominal durante la decrecida. I.3.d. Alimentación Los Pimelódidos corresponden a niveles tróficos altos siendo en su mayoría predadores, ictiófagos y omnívoros. A partir de 40 cm las dos especies resultan únicamente ictiófagas y de comportamiento oportunista (Gèrard Loubens y Jacques Panfili, 2000). Su alimentación se compone predominantemente de cardúmenes de carácidos. En ambas especies la categoría peces representa mas del 99% del peso total del alimento, los camarones representan un porcentaje mínimo del peso total de los alimentos, sin embargo en los peces de menor tamaño desempeñan un papel mayor. La presencia de insectos es significativa tan solo en los juveniles menores de 10 cm y el material vegetal parece incidental. Las presas seleccionadas por ambas especies son diversas incluyendo P. tigrinum en el caso de P. fasciatum. (Gèrard Loubens et Jacques Panfili, 2000). P. tigrinum y P. fasciatum son capaces de tragar presas que miden hasta 30% de su longitud estándar. 20 I.3.e. Reproducccion y Migracion P. tigrinum y P. fasciatum tienen un período de desove corto, en la segunda parte de la crecida (Mamoré) entre enero y febrero. Esta estrategia de reproducción durante las aguas altas favorece mucho a larvas y juveniles, los cuales encuentran un ambiente diverso y una protección natural contra depredadores (Lauzanne, Loubens y Le Guennec; 1990). Para su reproducción parecen migrar hasta las estribaciones de los Andes, por lo menos por el río Sécure hasta Puerto San Lorenzo, el único lugar donde se encuentran en maduración avanzada. Los Pseudoplatystoma del Orinoco medio, tiene su época de reproducción en la segunda parte de la crecida (junio y julio) (Lauzanne y Loubens, 1990). Las migraciones de reproducción son las que llaman más la atención. Los Pimelódidos aparentemente realizan largos recorridos desde las zonas mas bajas (ríos brasileños y bolivianos de llanura) hacia sus zonas de reproducción aun no conocidas, río arriba (Lauzanne y Loubens, 1990). Las migraciones de reproducción de estas especies comerciales comienzan en septiembre y terminan a principios de enero (Lauzanne y Loubens, 1985). 21 II. OBJETIVOS • Determinar la diferenciación genética interespecífica de P. tigrinum y P. fasciatum, utilizando como marcador molecular el genoma mitocondrial, mediante análisis RFLP. • Determinar si existe estructuración genética intraespecífica en P. tigrinum y P. fasciatum, utilizando como marcador molecular el genoma mitocondrial, por medio de análisis de RFLP. • Relacionar esta estructuración con fenómenos “actuales” (biológicos y ecológicos) o fenómenos históricos (paleo ecológicos). 22 III. METODOLOGIA. III.1. Puntos de muestreo Los peces fueron colectados de las cuencas de: Itenez, Mamoré, en su parte media y Orthon, de la Amazonía boliviana (Fig. 4). Fig 4. Puntos de muestreo en las cuencas:, (1) Orthon,, (2) Itenez y (3) Mamoré en su parte media. III.2. Muestras. Constituyeron trozos pequeños de músculo (0,5 g aprox.) de individuos de peces de las especies en estudio, distribuídos de la siguiente manera: Pseudoplatystoma fasciatum, 19 de la cuenca Itenez, 22 de la cuenca Orthon, 20 de la cuenca Mamore medio; Pseudoplatystoma tigrinum, 20 de la cuenca Itenez, 8 de la cuenca Orthon, 20 de la cuenca Mamoré medio. 23 III.2.a. Extracción de ADN. La extracción de ADN fue realizada a partir de un fragmento de músculo conservado en alcohol, utilizando el estuche comercial QIAGEN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante: -Realizar un corte fino de un trozo (aproximadamente 12 mg) de tejido muscular y colocar en un tubo de centrífuga. -Añadir la solución de lisis (180 ul de Buffer ATL + 20 ul de proteinaza K), mezclar vigorosamente e incubar a 55ºC hasta la lisis completa (usualmente 6 a 8 hrs). -Mezclar en vortex por 15 segundos y añadir 400 ul de la mezcla buffer AL + etanol absoluto 1:1, y mezclar vigorosamente hasta formar una solución homogénea. -Recolectar dentro de una minicolumna (colocar la mini columna dentro de un tubo nuevo recolector). -Centrifugar a 8000rpm por un minuto. -Descartar el tubo colección y su contenido. -Añadir a la columna 500 ul de buffer AW1 y centrifugar a 8000 rpm por un minuto (primer lavado). -Descartar el tubo colección y su contenido. -Añadir a la columna 500 ul de buffer AW2 y centrifugar a 14000 rpm por tres minutos (segundo lavado). -Descartar el tubo colección y su contenido. -Añadir a la columna 200 ul de buffer AE, colocar la columna en un eppendorf nuevo de 2 ml e incubar a temperatura ambiente por un minuto. -Centrifugar a 8000 rpm por un minuto (para eluir). -Repetir la elusión (opcional). 24 III.3. Analisis RFLP de ADN mitochondrial . Amplificación de la región control y la región del citocromo B del ADN mitocondrial. Fig 6. Región de amplificación del ADN mitocondrial. La región amplificada (Fig 6) tiene un tamaño aproximado de 2300 bp, obtenida utilizando los siguientes cebadores: (5’TGAYATGAAAAACCATCGTTGTAA3’) y ND 5/6 C HN20 (5’GTGTTATGCTTTAGTTAAGC3’), utilizado originalmente por Bernatchez y colaboradores en 1992 (Bernatchez y Danzmann, 1993). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1.5mM de cloruro de magnesio, 0.2mM de uno de dNTP's, 0.5uM de cada uno de los cebadores, 2.5 Unidades de taq polimerasa (Promega), 1 X de tampón de taq polimerasa y 5ul (20ng) de extracto de ADN en un volumen final de 50 ul. El programa de amplificación consta de: 95.ºC por 2min, 91 ºC por 1 min, 50ºC por 1 min 30seg, 72 ºC por 2 min 30 seg, (35 ciclos), y una elongación final a 72 ºC por 10 min. III.3.b. Digestión de los productos amplificados con enzimas de restricción Se utilizó 10ul (160ng) del producto amplificado por PCR, 2.5 U de endonucleasa de restricción, 1X de tampón correspondiente a la enzima. La 25 digestión de los productos fue realizada a 37ºC durante toda la noche. Los perfiles fueron visualizados en geles de agarosa al 3% con bromuro de etidio. III. 4. Análisis de datos III.4.a. Identificación y estructura haplotÍpica La digestión de los productos con enzimas de restricción proporcionan perfiles particulares ( uno o varios). En caso de que la digestión con una enzima presente un solo perfil para todo los individuos, se le denominará “perfil A” y si presenta varios perfiles se designarán éstos como “A”, “B”, “C”, etc., cada perfil constituye un fenotipo. Al conjunto de fenotipos (perfiles de restricción) se denomina haplotipo. Para los individuos de P. fasciatum los haplotipos se identificaron con la letra "F" y para P. tigrinum se identificaron con la letra "T". Los haplotipos fueron ordenados tomando en cuenta la distribución geográfica del origen de las muestras. Para el estudio de la diferenciación genética entre poblaciones se utilizó el estimador del índice de fijación (Fst), que sirve como una medida de las diferencias genéticas entre poblaciones. Fst presenta como valor mínimo "0" (indicando que no existe divergencia genética) y un valor máximo de "1" (indicando fijación para alelos alternativos en las subpoblaciones). El rango de 0 a 0,05 para Fst puede ser considerado como una pequeña diferenciación genética, 0,05 a 0,15 como moderada diferenciación, 0,15 a 0,25 como diferenciación mayor y sobre 0,25 como diferenciación superior al rango anterior. La diferenciación entre entidades genéticas tomadas de dos en dos son medidas utilizando el estimador de Fst (Weir & Cockerham 1984). La 26 significancia de los estimadores reales son medidos por comparación de los Fst obtenidos bajo la hipótesis de una estructuración no real Para este trabajo solo utilizamos los test por permutaciones de genotipos en cada locus, entre diferentes unidades, para compararlas de dos en dos (1000 permutaciones). El porcentaje de Fst obtenido luego de las permutaciones superiores, donde iguala en valor absoluto al estimador real, da la probabilidad P que el valor observado sea debido al azar y entonces no corresponde a una estructura real. La estructura es considerada como significativa cuando P<5%. III.4 b. Identificación de las mutacciones Los diferentes perfiles de restricción obtenidos con una misma enzima, fueron utilizados para la construcción de una matriz de mutaciones. Cuando se presenta una sola mutación se codifica con “0” para uno de los perfiles y con “1” para el otro perfil. En caso de que exista más de una mutación se codificará con: "00", "01", "11" para tres tipos de perfil (fig.7). Este tipo de codificación permite el ingreso de datos en el programa estadístico Genetix (para test bootstrapt) para llevar a cabo la construcción del árbol filogenético. Perfiles de restricción visualizados en gel de agarosa Perfil A 1348 Perfil B Perfil C 1348 1148 A 00 C 11 794 B 01 C 11 A 00 B 01 1000 794 200 2x200 Fig. 7. Ejemplo de interpretación de perfiles de restricción: Para pasar del perfil A a C hay dos mutaciones, para pasar de B a C ó de A a B hay una mutación. 27 III.4.c. Construcción filogenética En la construcción del árbol filogenético en primer lugar se lleva a cabo un test bootstrapt basándose en combinaciones sucesivas al azar de las columnas de la matriz original. Luego se utiliza un método de algoritmo de parsimonía de Wagner (Programa: MIX – Mixed method parsimony) el cual considera que los cambios en una mutación ocurre de 0 Æ 1 o viceversa con la misma probabilidad. Posteriormente se aplica “Consensus tree program” que básicamente analiza la frecuencia de aparición grupos monofiléticos en los datos. Si un grupo ocurre mayoritariamente respecto de todos los árboles (datos) introducidos, este podría definitivamente aparecer en el árbol consensus. En relacion con el bootstraap una bifurcación del árbol se considera significante cuando esta se ha producido más del 50% de las veces. 28 IV. RESULTADOS IV.1. Identificación de haplotipos. Se probó la existencia de sitios de restricción con 15 enzimas y se observó un total de veinte perfiles de restricción: 5 para Nde II; 3 para Hinf I, Hha I y Eco RI; 2 para Hpa II y uno para Hae III, Alu I, Nde I, Rsa I y Taq I (Tabla 1). Los perfiles de restricción y los haplotipos son mostrados en la Tabla 2 para P. fasciatum y en la Tabla 3 para P. tigrinum. Tabla 1. Denominación de perfiles de restricción de ADN mt. de P. fasciatum y P. tigrinum Hae III Alu I A A Nde I Nde II Hpa II Hinf I A Hha I Eco RI Rsa I A A A A A B B B B B C C C C A Taq I Sal I Sac I A X* X* Sac II Hind III Dra I X* X* X* D E X* No tiene sitio de corte. 29 BamH I X* Tabla 2 Conformación de haplotipos identificados en ADN mitocondrial de Pseudoplatystoma tigrinum por análisis RFLP. Hae III Nde I Alu I Hpa II Hinf I Hha I Eco R I Nde II HAPLOTIPO A A A B B A A A T1 A A A A B A A C T2 A A A A B A B C T3 A A A A B A B D T4 A A A B B A A C T5 A A A A B C B C T6 A A A A B A C C T7 A A A B B A B C T8 Tabla 3 Conformación de haplotipos identificados en ADN mitocondrial de Pseudoplatystoma fasciatum por análisis RFLP. Hae III Nde I Alu I Hpa II Hinf I Hha I EcoR I Nde II HAPLOTIPO A A A A A B C B F1 A A A B A B C B F2 A A A A A C C B F3 A A A B A C C B F4 A A A A A B C A F5 A A A A A C C A F6 A A A A A B C E F7 A A A A C B C B F8 30 IV.2. Distribución geográfica de los haplotipos. Para P. fasciatum el haplotipo más frecuente es F1 y está presente en las poblaciones de los tres ríos, F3 se encuentra con menor frecuencia que el anterior, pero también está presente en las mismas poblaciones. F2, F4 y F5 son haplotipos particulares de la población de Itenez. F8 se encuentra solamente en poblaciones de Mamoré. Finalmente F6 y F7 de Orthon (Fig 8 y 9). 31 5% 5% (1) 5% (1) (1) 20% (4) 16% (3) 53% (10) 75% (15) 21% (4) A B 9%(2) 5% (1) 14% (3) 72% (16) C F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 Figura 8. Frecuencia de haplotipos de Pseudoplatystoma fasciatum en relación a la región geográfica de las poblaciones de: A: Cuenca del Itenez, B: Cuenca del Mamoré medio C: Cuenca del Orthon. Los números entre paréntesis indican el número de individuos para cada haplotipo dentro de cada población. 32 . F1 F5 F2 F6 F3 F7 F4 F8 Figura 9. Distribución geográfica de los haplotipos de Pseudoplatystoma fasciatum. La figura muestra mayor diversidad haplotíca en la cuenca Itenez (en el lado del escudo brasilero), y la existencia de haplotipos compartidos entre las poblaciones de las tres cuencas en estudio. En el caso P. tigrinum el haplotipo más frecuente es T3 y está presente en las poblaciones de los tres ríos. El haplotipo T2 comparten las poblaciones de Mamoré medio y Itenez. T1, T4 T5 y T8 son haplotipos particulares de la población de Itenez; T7 de Mamoré medio y finalmente T6 de Orthon (Fig 10 y 11). 33 5% (1) 5% 11% (1) (2) 14% (3) 11% (2) 31% (6) 11% (2) 81% (16) 31% (7) B 13% (1) A 87% (7) C T1 T5 T2 T3 T4 T6 T7 T8 Figura 10. Frecuencia de haplotipos de Pseudoplatystoma tigrinum en relación a la región geográfica de las poblaciones de: A: Cuenca de Itenez, B: Cuenca de Orthon C: Cuenca de Mamoré medio. Los números entre paréntesis indican el número de individuos para cada haplotipo dentro de cada población. 34 T1 T5 T2 T3 T4 T6 T7 T8 14 Figura 11. Distribución geográfica de los haplotipos de Pseudoplatystoma tiginum, la figura muestra mayor diversidad haplotíca en la cuenca Ienez, en el lado del escudo brasilero, y la existencia de haplotipos compartidos entre poblaciones de regiones geográficas cercanas y entre las poblaciones de las tres cuencas en estudio. 35 IV.3. Estructura geográfica. El análisis con el estimador del índice de fijación Fst, en el caso de P. fasciatum no muestra valores significantes comparando las poblaciones de las tres cuencas (P < 5%). En cambio para P. tigrinum muestra significancia cuando se compara las poblaciones de la cuenca de Itenez con las de Orthon y Mamoré medio (Fst= 0.19 y Fst = 0.15 respectivamente)(Tabla 3). Tabla 3. Resultados del análisis con el estimador Fst comparando las poblaciones de las tres cuencas, tomando de dos en dos. Psedoplatystoma fasciatum Cuenca Orthon Mamoré medio Itenez 0.04 0.04 Orthon 0.00 Pseudoplatystoma tigrinum Cuenca Orthon Mamoré medio Itenez 0.19* 0.15* Orthon 0.00 Los datos resaltados con * son significativos (P<5) VII. 4 Identificacion de las mutaciones. Dentro de la región amplificada se observa 7 mutaciones con las enzimas Hpa II, Hinf I, Hha I, Eco RI y 3 para NdeII, las mutaciones con esta última no fueron utilizadas porque no se logró relacionar las dos especies. 36 Hpa II Perfil A HpaII A 1130 O B 970+100 1 Perfil B 1130 1080 2210 1080 970 100 2150 HpaII. Se obtuvo dos perfiles: El perfil A presenta una banda de 1130pb, en cuya secuencia existe un sitio de restricción para formar el perfil B que presenta dos bandas una de 970pb y otra de 100pb, sumando el peso de ambas bandas resulta 1070 (aproximadamente el peso de la banda del perfil A) 37 Hinf I Perfil A Hinf I Perfil B Perfil C 749 C 652 OO A 607+131 O1 A 749 O1 C 749 652 OO B 528+185 11 B 528+185 594+131 11 749 652 607 580 594x2 528 580 221 131 221 185 131 2288 2253 2202 221 Hinf I. La digestión con esta enzima produce tres perfiles de restricción. El perfil C presenta una banda de 652pb, en cuya secuencia existe un sitio de restricción para formar dos bandas del perfil A una de 607pb y otra de 131pb. La banda de 749pb del perfil A presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 528pb y otra de 185 pb. La banda de 749pb del perfil C presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 528pb y otra de 185pb que forman parte del perfil B, así mismo existe otro sitio de restricción en C que forma otras dos bandas del perfil B, una de 594 y otra 131pb. 38 Hha I Perfil A Hha I A 1230 OO C 958 O1 A 1230 1096 OO C 775+532 O1 Perfil B Perfil C 1230 1096 958 B 775+349 11 B 775+532 775+349 11 775 775 532 532 349 2326 2431 2265 Hha I. Se ha obtenido tres perfiles de restricción. El perfil A presenta una banda de 1230pb, en cuya secuencia existe un sitio de restricción para formar dos bandas del perfil C, una de 775pb y otra de 532pb. La banda de 958pb del perfil B presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 775pb y otra de 349pb. La banda de 1230pb del perfil A presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 775pb y otra de 532pb que forman parte del perfil B, así mismo existe otro sitio de restricción en A y forma otras dos bandas del perfil B, una de 775 y otra 349pb. 39 ECORI Perfil A Perfil B Perfil C EcoR I A 1348 1000 C 1148+200 794+200 OO B 1348 O1 A 1000 OO 11 C 1148+200 11 B 794+200 O1 1348 1348 1148 1000 2348 794 794 200 200x2 2342 2342 EcoR I. Se visualizó tres perfiles de restricción. El perfil A presenta una banda de 1348pb, en cuya secuencia existe un sitio de restricción para formar dos bandas del perfil C, una de 1148pb y otra de 200pb, así mismo existe otro sitio de restricción en A que forma otras dos bandas del perfil C, una de 794pb y otra 200pb. La banda de 1348 perteneciente a B presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 1148pb y otra de 200pb correspondiente al perfil C. La banda de 1000 pb del perfil A presenta un sitio de restricción, y como producto tenemos una banda de 794pb y otra de 200pb que forman parte del perfil B. VII.5 Filogenia. La topología consensus obtenida usando la parsimonía de Wagner (Fig 11) muestra valores de bootstrapt igual a 75% donde se bifurcan las ramas 40 de las dos especies, indicando notoria diferenciación genética entre las dos especies. Dentro de cada especie la topología es muy débil. 7 7 7 7 7 7 7 RAIZ 75% ) ) ) ) ) ) ) ) Fig .11. La topología concensus muestra la relación filogenética en base a los haplotipos de la región control y citocromo B del genoma mitocondrial de P.tigrinum (T) y P. Fasciatum (F). La topología fue construída en base a la parsimonía de Wagner y en la bifurcación de las ramas muestra valores de bootstrapt de 75%. 41 V. DISCUSION Pseudoplatystoma tigrinum y Pseudoplatystoma fasciatum son especies ampliamente distribuidas en la cuenca amazónica, de acuerdo con sus características morfológicas, estas son especies muy semejantes. De acuerdo con los resultados del tratamiento de cladística, presentados en el presente estudio, a nivel genético las dos especies constituyen dos grupos monofiléticos distintos. En cada grupo monofiletico la estructuración es débil, en relación con las mutaciones de frecuencia baja, por lo tanto existe una divergencia genética débil entre los haplotipos, lo cual puede mostrar una radiación reciente de las poblaciones de cada una de las especies en estudio de la amazonía boliviana. Coronel (2000), en un estudio sobre variabilidad genética en ADN nuclear (isoenzimas), indica que poblaciones de P. fasciatum y P.tigrinum se constituyen en dos especies claramente diferenciadas. En P. fasciatum, no se observa diferencia genética significativa con el análisis Fst de la distribución de los haplotipos entre las poblaciones de las tres cuencas. En P. tigrinum existe diferencia genética significativa entre poblaciones de la Cuenca de Itenez en relación con las poblaciones de las cuencas Mamoré medio y Orthon, entre Orthon y Mamoré el test no muestra diferenciación significativa, en este caso podría relacionarse con el pequeño número de muestras tomadas de la cuenca de Orthon y la menor variabilidad genética de Mamoré con respecto a Itenez. La diferenciación y la estructuración geográfica de los haplotipos entre las dos especies puede tener su explicación relacionada en la diferencia de la historia de vida de cada una de las especies. Al mismo tiempo también puede estar relacionada con su distribución geográfica, P.tigrinum se halla río arriba en relación a P. fasciatum que se encuentra en las partes más 42 bajas de la cuenca. En consecuencia P. fasciatum tiene mas facilidad que P. tigrinum de pasar, por la confluencia, de un río a otro. Coronel (2000) ha realizado un estudio relacionado con poblaciones de P. fasciatum en el río Beni (no estudiado aquí) y el río Ichilo (Alto Mamore) cuyos resultados con intraespecífica de el análisis isoenzimático ha mostrado baja variabilidad poblaciones de P. fasciatum del Río Ichilo y Beni. Sus resultados son comparables con datos de variabilidad ADN mt de P. fasciatum analizados por Claus (2000) quien encontró baja diversidad genética para las mismas poblaciones que tomó Coronel. Sobre el punto en discusión, Montaño y colaboradores, realizaron un trabajo sobre variabilidad genética en P. fasciatum en la cuenca del río Magdalena, Colombia, utilizando isoenzimas, sus resultados también indican polimorfismo relativamente bajo, La baja diferenciación genética entre poblaciones de esta especie, sugiere que existe un importante flujo de individuos migrantes entre poblaciones de los ríos que estos autores tomaron en cuenta. Estas observaciones apoyan nuestros resultados sobre la diferencia entre las posibilidades migratorias de las dos especies y las consecuencias sobre su estructuración genética. Para las dos especies, P. tigrinum y P. fasciatum, existe mayor diversidad haplotípica en las poblaciones de la cuenca Itenez que en las cuencas Orthon y Mamoré medio. Si esta observación de una mayor diversidad genética en las poblaciones de la cuenca Itenez que en las poblaciones de las otras cuencas se confirma para varias otras especies de peces, entonces este fenómeno podría estar relacionado con el funcionamiento de un refugio cuaternario del lado del escudo brasilero. Esta coincidencia de diversidad haplotípica presente en las poblaciones de Itenez hace que cepas extraídas de esta cuenca sean mejores candidatas para acuicultura, con un mayor potencial genético ( B. Chevassus, 1989). 43 Se sugiere que en un estudio posterior se podría aumentar el número de individuos de cada cuenca y con más sitios de muestreo. Así se podrá diferenciar con más seguridad los haplotipos de gran distribución, que podrían ser ancestros de los haplotipos particulares de una población que tendrían origen después de la colonización. También la secuenciación del fragmento Dloop+CytoB daría más precisiones sobre la evolución del genoma mitocondrial de estas especies. Para finalizar, se sugiere realizar la comparación de variabilidad genética entre varias especies, en varios lugares de la Amazonía boliviana y fuera de ella, e investigar las diferencias y características genéticas comunes de las filogeografías, lo cual nos permitiría entender más la evolución de la ictiofauna amazónica. 44 VI. CONCLUSIONES - Se ha establecido una clara diferenciación genética interespecífica de ambas especies, constituyendo cada una dos grupos monofiléticos distintos, lo cual fue determinado realizando un tratamiento de cladística. - Existe una débil estructuración intraespecífica para cada grupo monofilético, esto en relación con las mutaciones obtenidas del análisis de los perfiles conseguidos con la digestión con enzimas de restricción. - El análisis RFLP también muestran visiblemente marcada diferenciación en el genoma mitocondrial de ambas especies, revelando haplotipos particulares para cada especie. - Con el análisis Fst la diferencia genética es significativa para P. tigrinum entre las poblaciones de la cuenca Itenez y las poblaciones de las otras dos cuencas, para las poblaciones de P. fasciatum no existe diferencia genética significativa, lo cual puede estar relacionada con la distribución geográfica y el comportamiento migratorio de ambas especies. 45 X. BIBLIOGRAFÍA. 1. 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