Download CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE GRANULOVIRUS TesoGV

Cher François,
Ci-joint un plan de travail d’une des actions prévues pour 2006 dans le cadre de notre
projet de lutte biologique contre les teignes de la pomme de terre (le document concerne
une demande de financement supplémentaire faite à la PUCE). Je vous propose de
prendre à votre charge un travail similaire sur un autre granulovirus (GV) que
nous sommes en train de multiplier massivement et sur lequel on ne connaît rien. S’y
ajouterait la comparaison de séquences spécifiques de ce GV (amplifiées par PCR au
labo puis séquencées par un prestataire de service extérieur) avec les séquences des
mêmes gènes d’autres GV (disponibles dans GenBank). Cela afin d’établir les relations
phylogénétiques de ce virus avec le PhopGV et les autres granulovirus connus (et, si
possible, 2 autres GV nouveaux isolés de la même espèce, T. solanivora). Par ailleurs,
vous serez amené à participer à d’autres activités du laboratoire en fonction des temps
libres que vous laisseront ces travaux principaux. Enfin, il serait bon qu’avant votre
départ vous passiez par le laboratoire de collègues de notre groupe afin de voir une
technique d’infection virale par aérosol. Normalement, 2 ou 3 jours maximum devraient
suffire. Tous les frais relatifs à cette visite seront pris en charge par le projet. Nous
pourrons coordonner cette visite un peu plus tard.
Faites-vous également établir un permis international car vous serez peut-être amené à
conduire l’un des véhicules de l’IRD.
Nous verrons ultérieurement pour les aspects logistiques (hébergement entre autres). Il y
existe plusieurs options possibles dont je vous ferai part.
Cordialement,
Jean-Louis Zeddam
PS : S’il y a une convention de stage, il faudrait mieux l’établir avec l’IRD qu’avec la
PUCE pour des écourter les délais d’obtention des signatures. Il faudra aussi que vous
vous occupiez d’avoir souscrit une assurance couvrant les activités liées à votre stage.
Jean-Louis Zeddam
Pontificia Universidad Católica del Ecuador (¨PUCE)/IRD
Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Bioquímica
Av. 12 de Octubre, entre Patria y Veintimilla
Apartado 17-01-2184
Quito
Ecuador
Tel: (593) 299 1700 - Ext. 1812
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE GRANULOVIRUS TesoGV CC1 Y
ESTUDIO DE SU EFICIENCIA BIOLÓGICA PARA EL CONTROL DE LA
POLILLA DE LA PAPA Tecia solanivora (LEP., GELECHIIDAE)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Laboratorio de bioquímica y Microbiología Molecular
Introducción
En los últimos años los agricultores ecuatorianos se ha visto enfrentados al ingreso y
establecimiento de plagas exóticas que causan grandes pérdidas económicas en sus
cultivos. Uno de estos insectos es la polilla guatemalteca, Tecia solanivora (Povolny)
que ingresó al Ecuador en 1996 y actualmente es considerada la plaga más perjudicial
para la producción de papas en nuestro país, así como en Centro América, Venezuela,
Colombia, Ecuador y últimamente en Las Islas Canarias en la Comunidad Europea
(Salazar & Escalante, 1984; Mollet et al. 2003; Barragán et al. 2004).
Las pérdidas reales y potenciales causadas por la plaga en Colombia, Ecuador y Perú
bordean los 150 millones de dólares anuales (Palacios et al. 2004). En Colombia, en
1994, se sembraban 184 397 ha/año y se producían 2 938 631 toneladas de papa. En el
mismo año la incidencia de la plaga afectó en promedio el 15% de la producción, lo que
representó una pérdida de 276 323 toneladas de papa (Benavides, 1997). En Ecuador,
durante el 2001 y 2002, el daño causado por T. solanivora se estimó en un 20% de
tubérculos afectados en el Carchi, con un abandono del 10% de dicho cultivo; mientras
que en el Chambo (Chimborazo) el daño del campo llegó al 60% (Gallegos et al. 2004).
Sin embargo, la polilla guatemalteca es solo una más de las especies del “Complejo de
Polillas de la Papa”, pertenecientes a la familia Gelechiidae. Es así que se ha reportado
tres especies más que pueden atacar al cultivo, de las cuales se han encontrado a:
Pthorimaea operculella, conocida a nivel mundial y de la que existen numerosos
trabajos; Tuta absoluta, que por el momento no representa un peligro local en el cultivo
de papa, pero sí en el de otras solanáceas como el tomate riñón; y Symmetrischema
plaesiosema (sin: tangolias) que fue registrada en campos de papa del Ecuador en el
2001, después de importaciones del tubérculo procedentes del Perú.
Todas estas especies tienen ciclos de vida diferentes, que debido a diferentes factores
pueden tener pululaciones que afecten al cultivo y a las bodegas de almacenamiento de
la semilla. Este es el caso de S. plasiosema, de la que se han registrado infestaciones
importantes en las provincias de Cañar y Cotopaxi en los últimos años. Es importante
anotar que existen zonas en donde hemos observado ataques conjuntos de esta especie y
de la polilla guatemalteca.
A partir de las encuestas realizadas en la primera fase del proyecto PROMSA 103, se ha
demostrado que la polilla guatemalteca no solo afecta la producción y la economía
local, sino también ponen en evidencia la excesiva utilización de insumos químicos que
no tienen eficacia para el control de las poblaciones de la plaga y causan daños a la
salud de los agricultores y la calidad del ambiente.
Antecedentes
Los primeros datos sobre la virología de P. operculella fueron dados a conocer por los
investigadores australianos del CSIRO al final de los años 1960. Steinhaus y Marsh
(1967) encontraron el primer virus afectando a una polilla de la papa, un granulovirus (o
GV) ahora denominado PhopGV, cuyo genoma fue completamente secuenciado por el
grupo INRA-IRD hace poco. Los GV pertenecen a la familia Baculoviridae
(comúnmente llamados baculovirus) y las larvas que infectan son generalmente fáciles
de identificar porque toman muy a menudo una coloración blanquecina. Con la
excepción de dos virus de la sub-familia Densovirinae descubiertos por nuestro partner
IRD en cultivo de tejidos del insecto (Lery et al., 1998), este PhopGV es el único virus
conocido de las polillas de la papa hasta ahora. Este patógeno es ampliamente usado en
diversos países para formular un bioplaguicida que es un componente esencial de la
estrategia de manejo integrado de la plaga. Los trabajos que permitieron establecer este
MIP fueron desarrollados por el Centro Internacional de la Papa (CIP) y sus
colaboradores (Raman et al., 1987, 1988, 1990; International Potato Center, 1995,
1996).
Si el programa de control de P. operculella se reveló exitoso, los problemas causados
por las otras dos especies, presentes en las zonas andinas, todavía no han recibido una
repuesta adecuada. Se ha tratado de usar el PhopGV para controlar a S. plaesiosema y T.
solanivora; la primera especie es poco sensible al virus y la segunda parece tener una
sensibilidad variada a veces satisfactoria y en otros casos menos.
El convenio PUCE-IRD ha desarrollado varios estudios y talleres de difusión sobre la
polilla guatemalteca, con la ayuda financiera del PROMSA (Programa de
Modernización de los Servicios Agropecuarios). Entre ellos tenemos: El II taller
Internacional de la Polilla Guatemalteca, en junio del 2002; cartillas y folletos de
información sobre Manejo Integrado de Plagas (MIP), publicaciones científicas (Léry et
al., 2005 a; Léry et al., 2005 b; Carrera et al., 2005, además de las ya citadas), la
formulación de un modelo para predecir la explosión de la plaga con dos y tres meses de
anticipación, utilizando equipos sencillos de muestreo. Además, se han identificado una
gran diversidad de virus de Tecia solanivora, pertenecientes a diferentes familias:
Baculoviridae, Nodaviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, así como un miembro de
una nueva familia de virus, nunca reportada previamente. Hace muy poco, en larvas
muertas de Tecia solanivora, se encontró una nueva especie de granulovirus (nombrada
TesoGV CC1). Se trata del primer virus ocluido encontrado en las polillas de la papa
desde 1967.
Área de estudio
Los trabajos programados se llevarán a cabo en el Laboratorio de Bioquímica y
Microbiología molecular (606 y 605) de la PUCE. Las larvas a utilizarse para los
experimentos serán producidas en el insectario que tenemos en la PUCE a partir de
insectos colectados en la Parroquia Anchilibí, Cantón Salcedo, Provincia de Cotopaxi.
Esta zona fue elegida por la facilidad de encontrar cultivos de papa durante todo el año
y por haber observado poblaciones de las tres especies de polillas: T. solanivora, P.
operculella y S. plaesiosema. Además, se encuentra relativamente cerca de Quito, lo
que facilitaría la programación de las salidas.
Objetivo general
Producción de un bioplaguicida a base del granulovirus TesoGV CC1 que sea eficiente
para el control de la polilla de la papa Tecia solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae),
evitando el uso indiscriminado de productos químicos, lo que permitirá bajar los costos
de producción y mejorar la salud de los agricultores y de las condiciones ambientales.
Objetivos específicos
Mediante bio-ensayos a nivel de laboratorio:
1) comparar la eficiencia del granulovirus TesoGV CC1 con la del granulovirus
PhopGV para el control de larvas de Tecia solanivora.
2) comprobar la potencialidad del granulovirus TesoGV CC1 al infectar las otras
especies de polillas de la papa, P. operculella y S. plaesiosema
Mediante estudios bioquímicos y moleculares: caracterizar a este nuevo virus patógeno
de polillas de la papa.
Metodología
Primera actividad: Multiplicación del virus TesoGV CC1 en condiciones de laboratorio.
Necesitamos infectar una gran cantidad de larvas de T. solanivora, morirán por
infección de TesoGV CC1, que nos servirán para preparar las diferentes dosis virales
necesarias para la realización de bio-ensayos, y para la caracterización bioquímica y
molecular del entomopatógeno. Durante esta fase también se realizará la purificación
del virus y su cuantificación, que serán necesarias para el desarrollo de las otras
actividades.
Segunda actividad: Bio-ensayos a nivel de laboratorio para determinar si TesoGV CC1
dispone de una buena capacidad para infectar a las otras 2 especies de polillas de la papa:
P. operculella y S. plaesiosema. Los experimentos se llevarán a cabo mediante
contaminación de la superficie de los tubérculos, sobre los cuales se colocarán neonatas.
Tercera actividad: Bio-ensayos a nivel de laboratorio para comparar la eficiencia
infectiva de TesoGV CC1 y la de PhopGV (las formulaciones tendrán la misma
concentración de virus, expresada como el número de cuerpos de oclusión por mililitro).
La metodología será similar a lo anterior (con controles) y se realizarán análisis
estadísticos de los resultados obtenidos en el caso de los diferentes tratamientos.
Cuarta actividad: La caracterización bioquímica y molecular de TesoGV CC1 se la
realizará mediante electroforesis en geles de poliacrilamida para la proteína de oclusión,
electroforesis en geles de agarosa para los productos de PCR obtenidos con primers
específicos, secuenciación de los mismos y establecimiento de perfiles de restricción del
ADN viral usando diferentes enzimas (endonucleasas).
Adicionalmente, en las 3 primeras actividades, se procederá a realizar un análisis
molecular de los especímenes muertos para saber si es TesoGV CC1 el causante de la
mortalidad o si existe contaminación de otros patógenos.
Resultados esperados
Se dispone de un virus bien caracterizado que tiene una potencialidad superior al
PhopGV para ser el componente activo del bioplaguicida para el control de la polilla de
la papa Tecia solanivora, optimizando así las bases para producir a nivel industrial un
insumo importante de un programa de MIP-Polillas. Se dispone de la información
preliminar para determinar si TesoGV CC1 podría ser también usado para el control de
las otras especies de polillas de la papa: P. operculella y S. plaesiosema.
Aplicabilidad
La gran demanda de un producto eficaz en contra de la polilla de la papa Tecia
solanivora se ha demostrado en la amplia y variada utilización de pesticidas químicos
por parte de los papicultores ecuatorianos que, sin embargo, no han podido frenar el
avance inexorable de la plaga a casi la mayoría de las zonas de cultivo del tubérculo.
Por esta razón la búsqueda de una alternativa biológica que pueda ser incorporada en un
manejo integrado de plagas MIP es indispensable
Al mismo tiempo, a pesar de existir un virus (PhopGV) muy promocionado por varias
instituciones y organismos de investigación, la falta de una evaluación precisa de la
virulencia de ciertos aislamientos del virus ha puesto de manifiesto resultados
contrapuestos, que pueden afectar la aceptación de un bioplaguicida (eso es muy obvio
en el caso de PhopGV que se usa en diferentes paises, principalmente contra P.
operculella; el efecto del insecticida depende de la cepa, pero no se optimizó este
aspecto dado que cada grupo usó lo que tenía a la mano). Por otra parte, en base a
ciertos datos, PhopGV no tendría la misma eficiencia en el control de T. solanivora que
en el control de P. operculella. Se espera que el aislamiento de nuevos virus del mismo
grupo de PhopGV (granulovirus), tal como es TesoGV CC1 encontrado en larvas de T.
solanivora, proporcionen alternativas más satisfactorias que la única opción que se tiene
en la actualidad (es decir PhopGV).
Finalmente, la existencia de más de una especie de polilla de papa pone en jaque al
único aislado conocido hasta el momento: PhopGV (muy eficaz contra P. operculella
pero ineficaz contra S. tangolias, y no siempre satisfactorio contra T. solanivora). Con
esto se evidencia la falta de un bio-plaguicida que posea un amplio espectro de
hospederos y que tenga la potencialidad de controlar simultáneamente a T. solanivora
y/o P. operculella y/o S. plaesiosema en las zonas donde ciertas de estas especies se
encuentren juntas. Si TesoGV revela capacidad de provocar una mortalidad significativa
en larvas de S. plaesiosema, tendríamos el primer agente de control biológico realmente
prometedor contra esta especie.
Duración
Un año.
Cronograma

Multiplicación masiva de purificación de los virus TesoGV CC1 y PhopGV: dos
meses.

Bio-ensayos en laboratorio y análisis de las muestras tratadas para verificar la
causa de la muerte: seis meses.

Caracterización molecular de TesoGV CC1: 3 meses.

Análisis, interpretación de resultados y escritura del informe: un mes.
Personal participante

Dr. Jean-Louis Zeddam: Virólogo del IRD, actualmente Profesor visitante de la
Escuela de Ciencias Biológicas e Investigador del proyecto de control biológico
de la polilla guatemalteca.

MSc. Betty Yangari, técnica en laboratorio para el trabajo de aislamiento y
caracterización del granulovirus TesoGV CC1 de la polilla de la papa.

Jeaneth Padilla (50%), técnica de la unidad de crianza masiva de las polillas de
la papa (insectario).

David Páez, tesista de licenciatura, encargado de los bio-ensayos con el virus
TesoGV CC1.
Literatura citada
Barragán, A. R., A. Pollet, G. Onore, I. Aveiga, J. M. Prado, P. D. Gallegos, y C. Ruiz.
2004. Distribución de la polilla guatemalteca en el Ecuador. Pp. 9599. En A. Pollet, G.
Onore, F. Chamorro, y A. R. Barragán (Eds.) Memorias del II Taller Internacional de
polilla guatemalteca “Avances en investigación y manejo integrado de la polilla
guatemalteca de la papa, Tecia solanivora.” 45 julio del 2002. PUCE, Quito, Ecuador.
Benavides, M. 1997. Prevención y Manejo Integrado de la polilla guatemalteca de la
papa en el Departamento de Cundinamarca. Informe de Convenio ICA-FEDEPAPA,
Bogotá, Colombia.
Carrera, M., Léry, X., Zeddam, J-L., Pollet, A., López-Ferber, M. 2005.
Evaluation of the biological activity of PhopGV by a precise surface contamination
method.
Biological control (submitted)
Gallegos, P. D., J. P. Suquillo, F. Chamorro, y C. R. Asaquibay. 2004. Alternativas de
manejo de Tecia solanivora (Povolny) (Lepidoptera: Gelechiidae) en Ecuador. Pp.
9599. En A. Pollet, G. Onore, F. Chamorro, y A. R. Barragán (Eds.) Memorias del II
Taller Internacional de polilla guatemalteca “Avances en investigación y manejo
integrado de la polilla guatemalteca de la papa, Tecia solanivora.” 45 julio del 2002.
PUCE, Quito, Ecuador.
International Potato Center. 1995. Program report: 19931994. Lima, Peru, 194 pp.
Léry, X., J. L. Zeddam, J. Giannotti, S. Abol-Ela. 1998. Evidence for two small viruses
persistently infecting established cell lines of Phthorimaea operculella deriving from
embryos of the potato tuber moth. Microbiologica (21)103107.
Léry, X., Zeddam, J-L. y López-Ferber, M. 2005a.
Genetic study of variable regions of several isolates of PhopGV found on Phthorimaea
operculella, Tecia solanivora and Symmetrischema tangolias.
Journal of General Virology (submitted).
Léry, X., Taha, A., Croizier, G., Zeddam, J-L. y López-Ferber, M. 2005b.
Physical map and genome organization of different isolates of Phthorimaea operculella
granulovirus.
Archives of Virology (submitted).
Palacios, M., A. Lagnaoui, y O. Ortiz. 2004. La necesidad de un proyecto regional
andino para el control y la prevención de la polilla guatemalteca de la papa Tecia
solanivora (Povolny) (Lepidoptera: Gelechiidae). Pp. 207213. En A. Pollet, G. Onore,
F. Chamorro, y A. R. Barragán (Eds.) Memorias del II Taller Internacional de polilla
guatemalteca “Avances en investigación y manejo integrado de la polilla guatemalteca
de la papa, Tecia solanivora.” 45 julio del 2002. PUCE, Quito, Ecuador.
Pollet, A., A. Barragán, A. Lagnaoui, M. Prado, G. Onore, I Aveiga, X. Léry, y J. L.
Zeddam. 2003. Predicción de daños de la polilla guatemalteca Tecia solanivora
(Povolny) 1973 (Lepidoptera: Gelechiidae) en el Ecuador. Boletín de Sanidad Vegetal
Plagas. Vol. 29. España.
Raman, K.V, R. H. Booth y M. Palacios. 1987. Control of potato tuber moth
Phthorimaea operculella (Zeller) in rustic potato stores. Trop. Sci., 27: 175194.
Raman, K. V. y J. Alcazar. 1988. Biological control of potato tuber moth Phthorimaea
operculella (Zeller) using a granulosis virus in Peru. In Proceedings of Second Triennal
Conference of Asian Potato Association (APA), June 1226, Kuming, China,
19731974.
Raman, K.V. y J. Alcazar. 1990. Biological control of potato tuber moth Phthorimaea
operculella (Zeller) using a granulosis virus. In Proceedings 74th Annual meeting of
PAA, Quebec, Canada, July 2226.
Salazar J. y W. Escalante. 1984. La polilla guatemalteca de la papa, Scrobipalpopsis
solanivora, nueva plaga del cultivo de papa en Venezuela. Compendio de los trabajos
presentados en las XI Jornadas agronómicas. Sociedad Venezolana de Ingenieros
Agrónomos 9:2428.
Proforma presupuestaria
Actividad
Salarios +
seguros
Identificación
molecular
(reactivos +
desechables)
Viajes y
Viáticos
Multiplicación del virus
$1 640
$200
Caracterización del virus
$4 440
$3 500
--
Bioensayos con el virus
$1 800
$200
--
Subtotal (Presupuesto Total del Proyecto)
$7 880
$3 900
Menos: Fondos de Otras Fuentes
$6 080
Fondos solicitados a la PUCE
$1 800
Materiales
(papa, cajas,
etc)
$100
Imprevistos
$500
Total
$200
$2 640
$200
$8 140
$200
$200
$2 400
$100
$700
$600
$13 180
$1 800
$100
$200
$2 100
--
$500
--
--
$8 180
$600
$5 000
Información adicional
Es importante anotar que el problema de las polillas de la papa no es solamente local
sino que se presenta como una amenaza regional, pues la polilla guatemalteca está
presente en Centroamérica, Venezuela, Colombia, Ecuador y las Islas Canarias,
mientras que S. plaesiosema es una plaga que está presente en Bolivia, Perú y Ecuador.
Por esta razón estratégica, nuestro grupo de investigaciones PUCE – IRD tiene la
competencia a nivel regional para realizar este tipo de investigaciones, lo cual es una
ventaja competitiva importante que otros países e institutos de investigación no tienen.