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Replicación del DNA
Síntesis de DNA
1
Replicación del DNA
•
Requerimientos DNA
polimerasas
– Molde de DNA simple
cadena
•Problemas para replicar
DNAdc
–Separación de las cadenas
–Primer
– Extremo 3’OH libre
apareado
– Síntesis de 5’ a 3’
–Síntesis simultánea de
ambas cadenas
2
Inicio Síntesis
Distintas estrategias de
generar extremos 3’OH
para iniciar la síntesis del
DNA
1) Primer de RNA
2) Nick en el DNA
3) Nucleótido
unido a proteína
iniciadora
3
Separación de
cadenas
Replicación por
Desplazamiento de cadena y
círculo rodante
4
Separación de
cadenas
Replicación bidireccional
5
Síntesis simultanea de ambas cadenas
Horquilla de replicación
6
Etapas de la Replicación
• Iniciación
– Reconocimiento del sitio de inicio de replicación
 Elongación
• Terminación
7
Elongación
• Replicación continua en cadena líder (“leader strand”)
• Replicación discontinua en cadena retrasada (“lagging strand”)
• Síntesis de primer
– Cadena líder único primer
– Cadena retrasada múltiples primers
• Fragmentos de Okazaki:
» 1000-2000nt (bacterias)
»
200nt (eucariotas)
8
DNA polimerasas E.coli
•
DNA polimerasa I (polA)
– Único polipéptido
– Actividades:
• 5’3’ polimerasa
• 3’5’ exonucleasa
Fragmento Klenow
• 5’3’ exonucleasa
9
DNA polimerasa I
•Actividad Polimerasa
5’ 3’
•Actividad
exonucleasa 3’ 5’
10
The shuttle mechanism of editing in DNA polymerases (21).
Steitz T A J. Biol. Chem. 1999;274:17395-17398
©1999 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
11
The two-metal ion mechanism of DNA polymerase (24).
Steitz T A J. Biol. Chem. 1999;274:17395-17398
©1999 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
12
13
•DNA polimerasa III
–Holoenzima: múltiples subunidades
(900kDa)
–Altamente procesiva
–Actividades
•5’3’ polimerasa (subunidad )
•3’5’ exonucleasa (subunidad )
14
15
16
17
Replicación coordinada de ambas cadenas en
procariotas
18
Replicación coordinada de ambas cadenas en
procariotas
19
DNA polimerasas implicadas en replicación
Enzyme
Exonuclease
activities
Subunits 3 5 5 3 Function
Bacterial DNA polymerases
DNA
1
Yes
polymerase I
DNA
At least Yes
polymerase 10
III
Eukaryotic DNA polymerases
DNA
4
No
polymerase 
DNA
2
Yes
polymerase 
DNA
2 or 3
Yes
polymerase 
DNA
At least 1 Yes
polymerase 
DNA
1 or 2? ?
polymerase 
Yes
DNA repair, replication
No
Main replicating enzyme
No
Priming during replication
No
Mitochondrial DNA replication
No
Main replicative enzyme
No
Required for detection of DNA damage
during genome replication (Section 13.3.2)
Required for attachment of cohesin
proteins which hold sister chromatids
together until the anaphase stage of
nuclear division (Section 13.2.3)
?
Bacteria and eukaryotes possess other DNA polymerases involved primarily in
repair of damaged DNA. These enzymes include DNA polymerases II, IV and V of
Escherichia coli and the eukaryotic DNA polymerases , , ,  and .
20
21
Elongación
• Procariotas
– Primosoma helicasa +
primasa
– SSB
– DNA pol III
– DNA pol I
– Ligasa
– Girasa
• Eucariotas
– Primosoma helicasa +
primasa + DNApol 
– RPA
– DNA pol 
– DNA pol 
– RCF
– PCNA
– RNasaH / FEN 1 endon.
– Ligasa
– Girasa
22
Síntesis de primer
Bacterias Primasa : 4-15nt
Eucariotas Primasa: 8-12nt
DNA pol : 20nt
23
Remoción de primer y unión
de fragmentos en Procariotas
24
Remoción de primer y unión de fragmentos en Eucariotas
25
Mantenimiento de los extremos de los cromosomas
TELOMERASA: ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa reversa)
26
27
Mantenimiento de los extremos de los cromosomas
• Drosophila
– Repeticiones en tandem de secuencias de 6 a 10kb
– Copias completas de retrotransposones (tipo LINES-1)
• Het-A
• TART (RT)
28
29
ADN polimerasas en Técnicas de ADN recombinante
• Rellenado de extremos simple cadena de ADN (extremos 5’ protruyentes) o
digestión de extremo 3’ protruyente)
• Síntesis de sondas de ADN
• PCR
• Secuenciación de ADN
• Síntesis de ADN copia de ARNm
• Mutagénesis dirigida
30
ADN polimerasas
3'->5'
Proofreading
Strand
Displacement
Primary Applications
Mesophilic DNA Polymerases
T4 DNA Polymerase
++++
-
Polishing Ends, 2nd Strand Synthesis
DNA Polymerase I
++
-
Nick Translation
DNA Polymerase I, Klenow Fragment
++
++
Polishing Ends
-
++
Labeling
++++
-
Site Directed Mutagenesis
Phusion™ High Fidelity DNA Polymerase new
+++++
-
PCR (high fidelity)
DyNAzyme™ EXT DNA Polymerase
new
++++
-
PCR (high fidelity, long)
+
-
PCR (hot start)
PCR (routine), Primer Extension
Klenow Fragment (3' -> 5' exo-)
T7 DNA Polymerase
Thermophilic DNA Polymerases
DyNAzyme™ II Hot Start DNA
Polymerase new
Taq DNA Polymerase
+
-
VentR DNA Polymerase
+++
++
PCR (high fidelity), Primer Extension
VentR (exo-) DNA Polymerase
++
+++
PCR, Sequencing
Deep VentR DNA Polymerase
+++
++
PCR (high fidelity), Primer Extension
Deep VentR (exo-) DNA Polymerase
++
++
PCR (long), Primer Extension
-
+
Chain Terminator Applications
-
+++
Therminator DNA Polymerase
Other Polymerases
M-MuLV Reverse Transcriptase
cDNA Synthesis
31
Propiedades de las DNA polimerasas
Taq
VentR
VentR
(exo-)
Deep
VentR
Deep
VentR
(exo-)
Therminator
T7
DNA
E. coli
Poly I
Klenow
Frag
Poly. I
Klenow
Frag
exo-
M-MulV
Reverse
Transcriptase
T4
DNA
5'—>3'
Exonuclease
+
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
3'—>5'
Exonuclease
-
++
-
+++
-
-
++++
++
++
-
-
++++
285c
57b
190b
15b
9q
18w
100w
Strand
Displacement
-
++g
+++g
++
++
+
-
-
++
++
+++
-
Nick
Translation
+
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
Thermal
Stability
++
+++
+++
+++
+++
+++
-
-
-
-
-
-
18
µMs
µMh
18
nMs
Ratea
Error
(x10-6)
Km dNTPs
Km
DNAd
13
µMg
2
nMg
60
µMg
0.1
nMg
40
µMg
0.1
nMg
50
µMg
0.01
nMg
1-2
5
2
µMk
<1q
18
µMp
2 µMu
nMh
Extend RNA
Primery
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
Extension
From Nick
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
32
DNA polimerasas termoestables
Vent
Vent (exo-)
Deep Vent
Deep Vent
(exo-)
Taq
9°Nm
Phusion
DyNAzyme
EXT
DyNAzymeII
Hot Start
Exonuclease Activities
3'—>5'
proofreading
exonuclease
yes
no
yes
no
no
1-5%
yes
yes
no
5'—>3'
exonuclease
activity
no
no
no
no
yes
no
no
yes
yes
Half life at
95°C
6.7 hours
6.7 hours
23 hours
23 hours
0.9 hours
6.7 hours
>6hours
at 96°C
3.5 hours
at 96°C
0.9 hours
Half life at
100°C
1.8 hours
1.8 hours
8 hours
8 hours
<0.1 hours
1.8 hours
2 hours
at 98°C
Thermal Stability
<0.1 hours
Primer Extension Characteristics
Units/100 µl
Primer
Extension
Rxn
1-2 units
2-4 units
1-2 units
2-4 units
2-5 units
1-2 units
1-2 units
Error Rate
(x10-6 base
insertions)
57
190
~20
~190
285
in prograss
.44
Resulting
DNA Ends
blunt ends
3´ A
blunt ends
3´ A
3´ A
3´ A
blunt
Strand
Displacement
yes;
temp.
dependent
yes;
temp.
dependent
yes;
temp.
dependent
yes;
temp.
dependent
no
13.2 kb
15.0 kb
14.0 kb
15.0 kb
8.1 kb
Longest
Primer
Extension to
Date
1-4 units
1-4 units
blunt
3´ A
blunt
3´ A
yes
no
yes;
temp.
dependent
no
14.0 kb
37 kb
40 kb
3 kb
33
Método enzimático de secuenciación (Sanger 1978)
Base del método:
• Capacidad de las ADN polimerasas de utilizar 2’3’ddNTP como sustrato
además de los nucleótidos dNTP normales.
• La incorporación de un ddNTP en la cadena sintetizada produce un stop
en la elongación
34
• Molde de ADN simple cadena
• Primer específico
• ADN polimerasa apta para secuenciación
• Reacciones de elongación separadas para cada ddNTP
• Proporción de dNTP/ ddNTP adecuada para permitir la síntesis de
una colección de fragmentos que termine en cada nucleótido del ADN a
secuenciar
• Marca radioactiva, quimio- luminiscente o fluorescente en primers o
dNTP para visualizar los fragmentos sintetizados
• Separación de la colección de fragmentos en un gel de poliacrilamida
desnaturalizante (permite detectar diferencias de 1 nucleótido en
fragmentos de ADN)
35
36
37
Secuenciación Automática
38
Secuenciación automática de DNA
39
Secuenciación Automática
40
ADN Polimerasas usadas en secuenciación
• Klenow
• T7 DNA polimerasa modificada (Sequenase)
•Alta procesividad (componente tioredoxina)
•Eficiente uso de ddNTP
•Eliminación de actividad exonucleasa 3’- 5’
• Polimerasas Termoestables
•Requieren menor cantidad de molde a secuenciar
41
Etapas de la Replicación
 Iniciación
– Reconocimiento del sitio de inicio de replicación
• Elongación
• Terminación
42
Iniciación
• Bacteria
– Único origen de replicación
E.coli oriC
• 245pb
• 2 motivos repetidos:
– 9nt 5 copias (unión de DnaA)
– 13nt 3 copias (ricos en AT)
• Eucariotas
– Múltiples orígenes de replicación
• Levaduras  300 ori
• Humanos  20000 ori
43
Iniciación de la replicación en
E.coli  ori C
44
DnaA: reconocimiento del
origen de replicación,
apertura de las cadenas
DnaB-DnaC: Dna A recluta
2 complejos DnaB-DnaC al
origen de replicación.
Cargado de DnaB (helicasa)
 Extensión de la región
simple cadena
DnaG: primasa  síntesis
de primers. Activada por
DnaB.
También se requiere:
Girasa
SSB
HU
45
Regulación de la Replicación
• Bacterias
– Hemi-metilación de sitios GATC en ori (11 sitios GATC en ori). Dam
metilasas: transfieren un grupo metilo de la S-adenosil-metionina al
grupo amino de la A en la secuencia 5′-GATC-3′
-Retraso en la metilación de sitios GATC
-Sitios hemimetilados: unión a proteína Seq A
-Sitios hemimetilados en promotor de DnaA: Unión de
Seq A  Inhibe su expresión
FEMS Microbiol Rev. 2007 Jul;31(4):378-87. Epub 2007 Apr 25.
Regulation of the initiation of chromosomal replication in bacteria.
Zakrzewska-Czerwińska J, Jakimowicz D, Zawilak-Pawlik A, Messer W.
46
Jon M. Kaguni.
Annu. Rev. Microbiol. 2006.60:351-371.
Mecanismos regulatorios negativos
1) Inactivación de DnaA :
DnaA-ATP  DnaA-ADP : estimulado por elementos del replisoma: Sub  pol III y
protHda (RIDA)
2) Titulación de DnaA :
Clusters de sitios de unión de DnaA de alta afinidad: dat A locus.
3) Secuestro de oriC hemimetilado y promotor DnaA: prot SeqA
Unión de oriC hemimetilado a SeqA y membrana. Retardo en la metilación.
47
Origen de replicación en eucariotas
• S.cerevisiae
– ARSs
– 100-150pb
– Subdominios  ACS y B1 unión de
ORC
– Subdominio B3  unión de ABF 1
– Subdominio B2  apertura de
cadenas
• S.pombe
– 800-1000pb
– Muchos elementos que contribuyen
parcialmente (secuencias AT
asimétricas)
• Metazoos
– > 1000pb
48
49
Características de los orígenes de replicación en
eucariotas multicelulares (Metazoa)
•
Orígenes de replicación variados en tamaño y complejidad
•
Regulación del número y localización de orígenes de replicación
durante el desarrollo (regulación epigenética del uso de ori)
•
Localización de ori regulada por :
– Estructura de la cromatina
– Modificación del DNA
– Transcripción
50
Proteínas de unión al ori en eucariotas
Formación del pre-RC
• ORC (complejo de reconocimiento del origen)
– Complejo de 6 proteínas ORC1 6
– Mediador entre ori y señales regulatorias que coordinan replicación con ciclo
celular
• Cdc6p (unión a ORC)
• Cdt1p (unión a Cdc6p)
• Complejo MCM (unión a ambos lados de sitios ORC/cromatina)
51
52
Complejo ORC (6 subunidades):
En levaduras unido al origen
durante todo el ciclo. En
metazoos, la unión de ORC1 es
regulada en ciclo celular.
Transición Mitosis-G1: PreRC
ORC recluta CDC6 y CTD1 
facilita unión de MCM 2-7
(complejo helicasa)
PreRC  PreIC:
Reclutamiento de factores
adicionales
Iniciación de Replicación:
Requiere Fosforilación
53
54
55
56
•Eucariotas
–Coordinación de replicación con ciclo
celular
•Kinasas fase S
–inhibición de formación de preRC
–Activación de preIC
•Geminin
–inhibición de formación de preRC
(ensamblado de MCM)
57
Regulación de los orígenes
de replicación
58
Etapas de la Replicación
• Iniciación
– Reconocimiento del sitio de inicio de replicación
• Elongación
 Terminación
59
Terminación en Bacterias
E.coli
60
Replicación del genoma de
mitocondrias
No hay mecanismos para asegurar la
replicación de todos los genomas. El DNA
mitocondrial replica incrementando el
número de genomas en forma proporcional a
la masa mitocondrial.
61
Replicación de ADN
extracromosomal: Mitocondria
62
Replicación de ADN extracromosomal: Mitocondria
The EMBO Journal (2001) 20, 1807–1817,
doi:10.1093/emboj/20.7.1807
63
Plásmidos
Regulación del número de copias
• Plásmidos relajados
– Alto número de copias
– Inhiben la replicación cuando se alcanza un cierto número de
copias
• Plásmidos no relajados (“stringent”)
– Mecanismo preciso de regulación
•
Col E1 RNA
•
Plásmido R RNA + proteína
•
Plásmido F Iterones
64
Regulación por RNA: Col E1
65
66
Regulación por RNA
+ proteína
Plásmido R
67
Regulación por
Iterones
Plásmido F
68