Download análisis genético en anoftalmia/microftalmia familiar

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN BIOMEDICINA MOLECULAR
“ANÁLISIS GENÉTICO EN
ANOFTALMIA/MICROFTALMIA FAMILIAR”
T E S I S
que para obtener el grado de:
MAESTRA EN CIENCIAS EN
BIOMEDICINA MOLECULAR
Presenta:
Lic. Opt. ERIKA LISSELLY PELCASTRE LUNA
Directores de Tesis
Dr. JUAN CARLOS ZENTENO RUÍZ
Dr. DAVID GUILLERMO PÉREZ ISHIWARA
México, D.F. 2009
Este
ste trabajo fue realizado en la Unidad de Investigación del Instituto de
Oftalmología “Fundación Conde de Valenciana” I.A.P. bajo la dirección de los
doctores Juan Carlos Zenteno Ruíz y David Guillermo Pérez Ishiwara.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Juan Carlos Zenteno Ruíz
Al Dr. David Guillermo Pérez Ishiwara
A los miembros del comité tutorial: Dra. Consuelo Gómez García, Dra. Irene
Mendoza Lujambio y Dr. Juan Santiago Salas Benito.
A todos mis compañeros de la Unidad de Investigación del “Conde”
A mi familia y a Chac.
INDICE GENERAL
PÁGINA
INDICE GENERAL ………………………………………………………………………I
INDICE DE FIGURAS ………………………………………………………………….III
INDICE DE TABLAS ……………………………………………………………………V
RESUMEN …………………………………………………………………………...…VI
ABSTRACT ………………………………………………………………………….…VII
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Anatomía del ojo …………………………………………………...…….……..1
1.2 Desarrollo embrionario del ojo ………………………………………….……..2
1.3 Malformaciones oculares ...…………………………………………………..10
1.3.1 Anoftalmia ……………………………………………………………....10
1.3.1.1 Concepto …………………………………………………….….10
1.3.1.2 Clasificación …………………………………………………….11
1.3.2 Microftalmia ……………………………………………………………..11
1.3.2.1 Concepto ………………………………………………………..11
1.3.2.2 Clasificación …………………………………………………….12
1.4 Genes asociados a formas hereditarias de malformaciones oculares ….13
1.4.1 CHX10 …………………………………………………………………..14
1.4.2 RAX ……………………………………………………………………...16
1.4.3 OTX2 …………………………………………………………………….18
1.4.4 SOX2 …………………………………………………………………….20
1.4.5 NDP ……………………………………………………………………...24
1.5 Prevalencia de anoftalmia/microftalmia ….…………………………………..29
1.6 Valoración ...……………………………………………………………………30
1.7 Manejo …….…………………………………………………………………….31
1.8 Síndromes asociados a anoftalmia/microftalmia …………………………...31
2. JUSTIFICACIÓN .......…………………………………………………….............32
3. OBJETIVOS .….……….…..………………………………………………………33
3.1 General ………………………………………………………………………….33
3.2 Específico ……………………………………………………………………….33
I
4. PACIENTES Y MÉTODOS
4.1 Criterios de inclusión …………………………………………………………..34
4.2 Criterios de exclusión ………………………………………………………….34
4.3 Selección de pacientes y familiasestudiadas………………………………...35
5. METODOLOGÍA
5.1 Obtención y extracción de DNA genómico ……………………………….…37
5.2 Determinación de la concentración y pureza del DNA obtenido ....………37
5.3 Amplificación por PCR de los genes de interés ………………………….…38
5.4 Secuenciación automatizada de los productos de PCR ……………….….40
5.5 Análisis de haplotipos …………………………………………………….…..42
6. RESULTADOS
6.1 Análisis molecular de los genes CHX10 y RAX en familias con patrón de
herencia autosómico recesivo ……………………………………………….43
6.2 Análisis molecular de los genes OTX2 y SOX2 en familias con patrón de
herencia autosómico dominante …………………………………………….45
6.3 Análisis del gen NDP en familias con patrón de herencia recesivo ligado al
cromosoma X .…………………………………………………………………46
6.3.1 Análisis de haplotipos …………………………………………………50
7. DISCUSIÓN ………………………………….......………………………………..51
8. CONCLUSIONES ………………………………………………………………....55
9. PERSPECTIVAS ……...…………………………………………………………..56
10. BIBLIOGRAFÍA …………………………………………………………………….57
11. ANEXO 1 ………..…………………………………………………………………73
II
INDICE DE FIGURAS
FIGURA
PÁGINA
Figura 1. Anatomía del globo ocular …………………………………………………1
Figura 2. Desarrollo embrionario del ojo ……………………………………..…….3
Figura 3. Retina Madura ………………………………………………………………5
Figura 4. Dessarrollo del cristalino …………………………………………………..7
Figura 5. Desarrollo de la córnea ……………………………………………………8
Figura 6. Fotografía clínica de un paciente con anoftalmia ……………………..10
Figura 7. Fotografía clínica de un paciente con microftalmia ….......................12
Figura 8. Dominios de CHX10 ………………………………………………………15
Figura 9. Dominios de RAX ………………………………………………………....17
Figura 10. Dominios de OTX2 ………………………………………………………..19
Figura 11. Dominios de SOX2 ………………………………………………………..21
Figura 12. Interacción entre Sox2, Otx2, Rax y Chx10 …………………………....23
Figura 13. Dominios de NDP ………………………………………………………....25
Figura 14. Norrina en la vía Wnt …………………………………………………......25
Figura 15. Familias con patrón de herencia autosómico recesivo …………......35
Figura 16. Familias con patrón de herencia autosómico dominante …………….36
Figura 17. Familias con microftalmia ligada al cromosoma X ………….………….36
Figura 18. Gel de productos de amplificación de CHX10 y RAX …………….…..43
Figura 19. Gel de productos de amplificación de SOX2 y OTX2 …………………45
Figura 20. Gel de productos de amplificación de NDP ………………………........46
III
Figura 21. Secuencia nucleotídica parcial del exón 2 del gen NDP en la familia
1-RLX ……………………………………………………………………….47
Figura 22. Secuencia nucleotídica parcial del exón 2 del gen NDP en la familia
2-RLX …………………………………………………………………........48
Figura 23. Secuencia nucleotídica parcial del exón 3 del gen NDP en la familia
3-RLX ……………………………………………………………………….49
Figura 24. Análisis de haplotipos …………………………………………………….50
IV
INDICE DE TABLAS
TABLA
PÁGINA
Tabla 1. Mutaciones en el gen CHX10 ………………………………....…………..16
Tabla 2. Mutaciones en el gen RAX …………………………………………………17
Tabla 3. Mutaciones en el gen OTX2 ………………………………………………..20
Tabla 4. Mutaciones en el gen SOX2 …………………………………………….....22
Tabla 5. Mutaciones en el gen NDP ……………………………………..…27, 28, 29
Tabla 6. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen CHX10 ......39
Tabla 7. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen RAX ………39
Tabla 8. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen OTX2 …….39
Tabla 9. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen SOX2 …….39
Tabla 10. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen NDP ….…40
Tabla 11. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de marcadores
microsatélites …………………………………………………………………………..42
V
RESUMEN
La anoftalmia y microftalmia son malformaciones oculares genéticamente
heterogéneas que ocupan el segundo lugar como causa de ceguera en humanos.
En nuestro país no existe ningún estudio previo que haya determinado las causas
genéticas en sujetos con malformaciones oculares. En el presente estudio se
realizó el análisis molecular de los genes CHX10, RAX, OTX2, SOX2 y NDP, en
10 familias mexicanas afectadas con anoftalmia/microftalmia y transmisión
mendeliana. El análisis genético se realizó por amplificación por PCR y
secuenciación nucleotídica de los genes CHX10, RAX, OTX2, SOX2 y NDP. Se
incluyó además DNA de 50 sujetos control sanos (100 alelos) para confirmar las
mutaciones identificadas en los pacientes. En éste estudio se identificó 1 mutación
nueva (p.R41T) en el gen NDP, responsable de la malformación ocular en 2
familias no relacionadas aparentemente y una mutación previamente reportada
(p.R121W) también en NDP causante de la enfermedad en una familia. En los
genes CHX10, RAX, OTX2 y SOX2, no se identificó ninguna mutación en el resto
de las familias incluidas. Se identificó un polimorfismo nuevo (F308F) en el gen
RAX mientras que en el gen CHX10 se identificó un polimorfismo previamente
reportado (S157S). Aunque mutaciones en los genes analizados se han reportado
en diversos casos de anoftalmia/microftalmia en el mundo, es posible que existan
mutaciones otros genes participantes en el desarrollo del globo ocular. Es
necesario desarrollar futuros análisis para determinar la etiología genética en los
pacientes afectados con anoftalmia/microftalmia.
VI
ABSTRACT
Anophthalmia
(absent
eye)
and
microphthalmia
(small
eye)
are
ocular
malformations genetically heterogeneous which are the second cause of blindness
in humans. Mutations in several genes such as CHX10, RAX, OTX2, SOX2 and
NDP in patients with anophthalmia/microphthalmia have been identified as
responsible from monogenic forms of these ocular malformations. In this work, we
have developed the molecular analysis of these genes in 10 Mexican families with
mendelian transmission of anophthalmia and microphthalmia. The molecular
analysis included PCR amplification of coding regions and exon-intron boundaries,
and direct automated sequencing of the five genes. The novel p.R41T mutation in
NDP gene was identidfied in two apparently unrelated families while the p.R121W
mutation which was previously reported was identified in 1 family. No mutations in
CHX10, RAX, OTX2 and SOX2 were found. We identified a novel synonymous
polymorphism (F308F) in RAX gene and a known synonymous polymorphism
(S157S) in CHX10 gene. Although mutations in CHX10, RAX, OTX2 and SOX2
genes are common in anophthalmia/microphthalmia patients from other countries,
in our sample no anomalies in these genes were demonstrated. In consequence
the analysis of other genes associated with anophthalmia and microphthalmia is
necessary.
VII
1. INTRODUCCIÓN
1.1
ANATOMÍA DEL OJO
El ojo es un órgano complejo que se desarrolla a través de procesos altamente
organizados durante la embriogénesis. En el ojo se diferencian varias estructuras,
en un corte sagital se pueden distinguir tres capas: La capa externa ó fibrosa
integrada por la córnea y la esclera; la capa intermedia ó vascular que a su vez se
divide en anterior y posterior donde se encuentran el iris, el cuerpo ciliar y la
coroides; la capa interna ó nerviosa que está formada por la retina. El cristalino
se encuentra situado detrás del iris y está sostenido por ligamentos unidos al
cuerpo ciliar, los cuales contribuyen en el proceso de acomodación. Existen dos
cámaras (anterior
anterior y posterior) formadas por la córnea, el iris, el cristalino y los
ligamentos suspensorios que se encuentran llenas de humor acuoso. Por otro
lado, la cavidad vítrea situada entre el cristalino y la retina se encuentra ocupada
por el humor vítreo (Fig.1).
Fig.1 Anatomía del globo ocular
1
1.2
DESARROLLO EMBRIONARIO DEL OJO
El desarrollo del ojo inicia a principios de la cuarta semana y es consecuencia de
una serie de señales inductoras genéticas y celulares. Los ojos derivan de cuatro
estructuras:
•
neuroectodermo del prosencéfalo
•
ectodermo de la superficie de la cabeza
•
mesodermo
•
células de la cresta neural
El neuroectodermo del prosencéfalo se diferencia en la retina, las caras
posteriores del iris y el nervio óptico. El ectodermo de la superficie de la cabeza
forma el cristalino y el epitelio corneal. El mesodermo comprendido entre el
neuroectodermo y el ectodermo de superficie da lugar a las capas fibrosa y
vascular del ojo. Las células mesenquimales proceden del mesodermo, pero las
células de la cresta neural migran hacia éste desde la cresta y se diferencian en la
coroides, la esclerótica y el endotelio corneal. 1
El desarrollo del ojo inicia a principios de la cuarta semana (Fig. 2). En los pliegues
neurales del extremo craneal del embrión aparecen los surcos ópticos. A medida
que los pliegues neurales se unen para formar el prosencéfalo, los surcos ópticos
se evaginan dando lugar a las vesículas ópticas, que se proyectan desde la pared
del prosencéfalo hacia el mesénquima adyacente. Las cavidades de las vesículas
ópticas se continúan con la cavidad del prosencéfalo. La formación de estas
2
vesículas es inducida por e
ell mesénquima adyacente hacia el encéfalo en
desarrollo. Conforme crecen las vesículas ópticas, sus extremos distales se
expanden y sus conexiones con el prosencéfalo se contraen para formar los tallos
ópticos huecos. En poco tiempo, las vesículas ópticas h
hacen
acen contacto con el
ectodermo de superficie. Simultáneamente, el ectodermo de superficie adyacente
a las vesículas sufre un engrosamiento y da lugar a las placodas cristalinianas que
son primordios de los cristalinos. Las vesículas ópticas inducen la formación
form
de
éstas placodas cuando el mesénquima subyacente ha condicionado el ectodermo
de superficie. El mensaje inductor pasa desde las vesículas, estimulando la
formación de los primordios del cristalino por parte de las células del ectodermo de
superficie.. Las placodas ópticas se evaginan a medida que se hunden en el
ectodermo de superficie, formando la fóvea del cristalino. Los bordes de la fóvea
se acercan entre sí y se fusionan para formar las vesículas cristalinianas esféricas
que pronto pierden su conexión
exión al ectodermo de superficie. 2
Fig. 2 Desarrollo embrionario del ojo. Modificado de Graw J, 2003
3
A medida que se desarrollan las vesículas del cristalino, las vesículas ópticas se
invaginan y forman copas ópticas de pared doble. La apertura de cada copa es
grande al principio, pero su borde se pliega hacia dentro alrededor del cristalino.
En ésta fase, las vesículas cristalinianas han perdido su conexión con el
ectodermo de superficie y han penetrado a las cavidades de las copas ópticas. A
lo largo de la superficie ventral de las copas ópticas y de los tallos ópticos se
desarrollan unos surcos lineales, las cisuras retinianas. 1
Las cisuras retinianas contienen mesénquima vascular a partir del cual se originan
los vasos sanguíneos hialoideos. La arteria hialoidea, una rama de la arteria
oftálmica irriga la capa interna de la copa óptica, la vesícula cristaliniana y el
mesénquima de la copa óptica. La vena hialoidea transporta sangre desde esas
estructuras. A medida que se produce la fusión de los bordes de la cisura
retiniana, los vasos hialoideos se engloban dentro del nervio óptico primitivo.
Finalmente, las porciones distales de los vasos hialoideos degeneran pero sus
partes proximales se mantienen como la arteria y la vena de la retina. 1
La retina se desarrolla a partir de las paredes de la copa óptica, una evaginación
del prosencéfalo. La capa externa más delgada de la copa óptica se convierte en
el epitelio pigmentario retiniano (EPR) y la capa interna de mayor grosor se
transforma en la retina neural (Fig. 3). 3
4
Fig. 3 Retina madura. Modificado de Graw J, 2003
Bajo la influencia del cristalino en desarrollo, la capa interna de la copa óptica
prolifera para formar un neuroepitelio grueso. Posteriormente, las células de ésta
capa se diferencian en la retina neural. Esta región contiene fotorreceptores
(conos y bastones)
tones)
y cuerpos celulares de las neuronas (células bipolares y
ganglionares). La retina neural se “invierte” dado que la vesícula cristaliniana se
invagina a medida que forma la copa óptica y de ésta forma las partes de los
fotorreceptores sensibles a la luz se sitúan junto al epitelio pigmentario retiniano.
Los axones de las células ganglionares de la capa superficial de la retina neural
crecen proximalmente en la pared del tallo óptico hacia el encéfalo. Como
resultado, la cavidad del tallo óptico se ob
obstruye
struye de modo gradual conforme los
axones de numerosas células ganglionares forman el nervio óptico. 4
El cuerpo ciliar es una extensión cuneiforme de la coroides. Su superficie interna
se
proyecta
hacia
el
cristalino,
formando
prolongaciones
ciliares.
L
La
5
porciónpigmentada del epitelio ciliar deriva de la capa externa de la copa óptica y
es continua con el epitelio pigmentario retiniano. La porción carente de
pigmentación del epitelio representa la prolongación anterior de la retina neural, en
la cual no se diferencian elementos neurales. El músculo ciliar se desarrolla a
partir del mesénquima situado en el borde de la copa óptica en la región situada
entre la condensación escleral anterior y el epitelio pigmentario ciliar. 5
El iris se desarrolla a partir del borde de la copa óptica que crece hacia dentro y
recubre parcialmente el cristalino. En ésta zona, las dos capas de la copa óptica
se mantienen delgadas. El epitelio del iris representa ambas capas de la copa; es
continuo con el epitelio en bicapa del cuerpo ciliar, así como con el epitelio
pigmentario retiniano y la retina neural. El estroma del iris deriva de las células de
la cresta neural que migran hacia él. Los músculos dilatador y esfínter del iris
proceden del neuroectodermo de la copa óptica. Ambos músculos parecen surgir
de las células epiteliales anteriores del iris. Estos músculos lisos son consecuencia
de la transformación de las células epiteliales en células musculares lisas. 6
El cristalino se desarrolla a partir de la vesícula cristaliniana, un derivado del
ectodermo de superficie. La pared anterior de ésta, formada por epitelio cúbico,
se convierte en el epitelio subcapsular del cristalino. Los núcleos de las células
cilíndricas altas que componen la pared posterior de la vesícula cristaliniana se
disuelven y estas células se alargan considerablemente para originar células
epiteliales transparentes, las fibras primarias del cristalino. El borde del cristalino
6
se conoce como zona ecuatorial debido a que se localiza en posición intermedia
intermed
entre los polos anterior y posterior del mismo. Las células de dicha zona son
cúbicas; a medida que se alargan pierden sus núcleos y se convierten en las fibras
secundarias del cristalino.
7
Estas nuevas fibras del cristalino se incorporan a los
lados externos
xternos de las fibras primarias (Fig. 4).
Fig. 4 Desarrollo del cristalino. Modificado de Graw J, 2003
El cuerpo vítreo se forma dentro de la cavidad de la copa óptica. Está formada por
humor vítreo, una masa avascular de sustancia intercelular gelatinosa
g
transparente. El humor vítreo primario deriva de células mesenquimales de la
cresta neural. No aumenta, sino que es rodeado por un humor vítreo secundario
gelatinoso de origen desconocido. No obstante, por lo general se cree que
procede de la capa
a interna de la copa óptica. El humor vítreo secundario consta de
hialocitos primitivos, material colágeno y trazas de ácido hialurónico.
8
La cámara
anterior del ojo se desarrolla a partir de un espacio en hendidura que se forma en
el mesénquima situado entre
ntre el cristalino en desarrollo y la córnea. El mesénquima
localizado por encima de éste espacio origina la sustancia propia de la córnea y el
7
mesotelio de la cámara anterior. Después de haberse establecido el cristalino,
éste induce la transformación del ectodermo de superficie hacia el epitelio de la
córnea y la conjuntiva. La cámara posterior del ojo se constituye a partir de un
espacio formado en el mesénquima posterior al iris en desarrollo y anterior al
cristalino en desarrollo. Cuando desaparece la membrana pupilar y se forma la
pupila, las cámaras anterior y posterior del ojo se pueden comunicar entre sí a
través de un seno venoso escleral circunferencial denominado canal de Schlemm.
Esta estructura vascular que rodea a la cámara anterior representa el lugar de
salida del flujo del humor acuoso hacia el sistema venoso.
6
La córnea se forma a
partir de tres fuentes: el epitelio corneal que deriva del ectodermo de superficie, el
estroma que procede del mesodermo y es continuo con la esclerótica en
desarrollo
rrollo y el endotelio corneal que está formado por células de la cresta neural
que migran desde el borde de la copa óptica a través del estroma (Fig. 5).
Fig. 5 Desarrollo de la córnea. Modificado de Graw J, 2003
8
El mesénquima que rodea a la copa óptica reacciona frente a la influencia
inductora del epitelio pigmentario retiniano y se diferencia en una capa vascular
interna, la coroides, y otra fibrosa externa, la esclerótica. Esta última se desarrolla
a partir de una condensación de mesénquima externo a la coroides y es continua
con el estroma de la córnea. Hacia el borde de la copa óptica, la coroides se
modifica
para
formar
los
núcleos
de
los
procesos
ciliares,
formados
fundamentalmente por capilares apoyados por tejido conjuntivo. Los primeros
vasos sanguíneos de la coroides aparecen durante la semana 15 y hacia la
semana 22 se pueden distinguir con claridad arterias y venas.1
Los párpados se desarrollan a
lo largo de la sexta semana a partir del
mesénquima de la cresta neural y de dos pliegues de piel que crecen por encima
de la córnea. Los párpados se adhieren entre sí a comienzos de la décima
semana y permanecen unidos hasta la semana 26 a 28. Mientras se encuentran
adheridos existe un saco conjuntival cerrado anterior a la córnea. Cuando los ojos
comienzan a abrirse, la conjuntiva bulbar es visible en la parte anterior de la
esclerótica. La conjuntiva palpebral reviste la superficie interna de los párpados.
Las pestañas y las glándulas de los párpados proceden del ectodermo de
superficie. Las placas tarsales y el tejido conjuntivo proceden del mesénquima de
los párpados en desarrollo. El músculo orbicular de los ojos deriva del
mesénquima del segundo arco faríngeo. 2
9
1.3
MALFORMACIONES OCULARES
Debido a la complejidad del desarrollo del ojo, es frecuente la aparición de
defectos en la estructura ocular. El tipo y la gravedad de cada anomalía dependen
de la etapa embrionaria durante la cual se altere su desarrollo.
Los defectos congénitos del ojo ocurren con relativa frecuencia en la población.
Después de la catarata congénita, las anomalías más comunes son la anoftalmia y
la microftalmia, las cuáles constituyen una causa común de ceguera en el
humano. 9
1.3.1 ANOFTALMIA
1.3.1.1 CONCEPTO
La anoftalmia (Fig. 6) se refiere a la ausencia, unilateral o bilateral, de tejido ocular
en la órbita con anexos oculares conservados (párpados, conjuntiva y aparato
lagrimal). 10, 11
Fig. 6 Fotografía clínica de un paciente con anoftalmia bilateral.
Instituto de Oftalmología “Conde de Valenciana”
10
1.3.1.2 CLASIFICACIÓN
Se reconocen tres tipos de anoftalmia:
•
Anoftalmia primaria: El desarrollo del ojo se interrumpe al comienzo de la
cuarta semana y es debida a la falta de formación de la vesícula
cristaliniana. 2
•
Anoftalmia secundaria: Se suprime el desarrollo del prosencéfalo y la
ausencia de uno ó ambos ojos es una de las distintas formas de
presentación. 2
•
Anoftalmia consecutiva ó degenerativa: causada por atrofia o degeneración
de la vesícula óptica después de que ésta se ha formado inicialmente. 12
1.3.2 MICROFTALMIA
1.3.2.1 CONCEPTO
La longitud axial ocular máxima en el neonato es de 17 mm y en el adulto de 23.8
mm. La mayor parte del crecimiento posnatal del ojo se da en los primeros 3 años
de vida con la expansión del segmento posterior por arriba de un 90%.
El término microftalmia se usa para un ojo con una longitud axial menor a 21 mm
en adultos 11 y menor de 15 mm en neonatos (Fig. 7). 12
11
Fig. 7 Fotografía clínica de un paciente con microftalmia.
Instituto de Oftalmología “Conde de Valenciana”
1.3.2.2
CLASIFICACIÓN
La microftalmia se clasifica en simple y compleja. En la microftalmia simple el
globo ocular es pequeño pero funcionalmente normal. También es llamada
microftalmia pura o nanoftalmia. En la microftalmia compleja ó complicada el globo
ocular presenta otras anomalías acompañantes. 13
La etiología de la anoftalmia/microftalmia es variada, ya que puede originarse por
ingesta materna de agentes teratogénicos tales como alcohol, talidomida y ácido
isoretinoico o por enfermedades maternas como diabetes gestacional ó rubeóla. 14,
15
La microftalmia también puede ser parte de asociaciones como CHARGE
(coloboma ocular, alteraciones cardíacas, atresia de coanas, retraso en el
desarrollo) ó VATER (anomalías vertebrales, anales, fístula traqueo-esofágica y
alteraciones renales).
malformación
es
16
bajo.
En todos estos casos el riesgo de recurrencia de la
Sin
embargo,
existen
formas
hereditarias
de
malformaciones oculares en las que el riesgo de repetición en la familia se eleva
considerablemente, estas últimas formas se deben a mutaciones en genes
específicos. 17
12
1.4
GENES
ASOCIADOS
A
FORMAS
HEREDITARIAS
DE
MALFORMACIONES OCULARES
En los últimos años se han logrado identificar varios genes maestros encargados
de dirigir distintas rutas de desarrollo y diferenciación del ojo. Estos genes se
expresan durante la embriogénesis temprana e inician una cascada de regulación
de genes que son responsables de linajes celulares específicos.
PAX6 es el modelo de gen maestro en el desarrollo del ojo, la pérdida de función
produce el fenotipo eyeles (ey) en Drosophila y también causa defectos oculares
severos en otros animales.
18
Los modelos murinos mutantes heterocigotos para
PAX6 presentan ojos pequeños mientras que los mutantes homocigotos sólo
presentan remanentes de tejido ocular y mueren al poco tiempo de nacidos.
19, 20
En humanos, las mutaciones heterocigotas en PAX6 causan principalmente
aniridia, sin embargo algunos casos han presentado también hipoplasia macular,
queratitis y anomalía de Peters. 21
Además de PAX6, diferentes estudios han evidenciado que mutaciones en otros
genes implicados en el desarrollo del ojo como CHX10, RAX, OTX2, y SOX2 son
responsables de malformaciones oculares tales como microftalmia, anoftalmia y
coloboma ocular. 22, 23, 24, 25
13
1.4.1
CHX10
Desde hace varios años se ha conocido un modelo de ratón con microftalmia
originado por el alelo “or”, que después se demostró que era causado por una
mutación en el gen Chx10.
El modelo murino “or” tiene una mutación en el
dominio homeobox de Chx10 que cambia de tirosina a un codón de paro
prematuro; ésta mutación reduce la apoptosis en las células de la retina y el ciclo
celular parece ser más lento.
26
En el humano el gen CHX10 se localiza en
14q24.3, un locus asociado previamente a anoftalmia/microftalmia en pacientes
con diversas alteraciones cromosómicas estructurales que afectan esa región. 27
Chx10, es un homólogo en vertebrados del gen Ceh10
del nemátodo
Caernohabditis elegans, gen homeótico que se expresa abundantemente en la
retina humana y juega un papel muy importante para el desarrollo del ojo.
28
CHX10 está formado por cinco exones y codifica un producto de 361 aminoácidos
con función de factor de transcripción expresado en la vesícula óptica. La proteína
CHX10 contiene 4 dominios (Fig. 8) que se han identificado en proteínas
homeobox de humano, ratón, pez, Drosophila y nemátodo. Estos dominios
comprenden el octapéptido (FGIQEILG), el dominio homeótico de unión a DNA y
los dominios OAR (de OTP, Aristaless y Rax) y CVC (de Chx10, Vsx1 y Ceh10) a
los que se les ha nombrado de esa manera porque se les ha identificado en otras
proteínas con dominios homeóticos. 29
14
Fig. 8 Dominios de CHX10
Se ha demostrado que este producto es importante para la proliferación de las
células progenitoras y para la diferenciación de las células bipolares de la retina
persistiendo su expresión en la edad adulta en la capa nuclear interna y
preferentemente en las células bipolares. 30
En los últimos años se han identificado al menos seis mutaciones distintas de
CHX10 en familias con microftalmia no sindrómi
sindrómica
ca y de herencia autosómica
recesiva (Tabla 1). 22, 31, 32, 33
La alta conservación de CHX10 en vertebrados, su patrón de expresión y
fenotipos causados por sus mutaciones demuestran la importancia evolutiva de la
red genética a través de la que este gen regula el desarrollo del ojo.
15
Tabla 1. Mutaciones en el gen CHX10
1.4.2
RAX
Retina and anterior neural fold homeobox gene
gene) es un gen homeótico
RAX (Retina
expresado en retina y dirige la especificación de los diferentes tipos celulares de la
retina durante la embriogénesis temprana, por lo que es crucial para la formación
de la vesícula óptica.
34
La deleción de RAX en ratones produce el fenotipo de
anoftalmia debido a falta de formación de las copas ópticas y por lo tanto no se
forman estructuras oculares. Además, el fenotipo ocular se acompaña de una
reducción en el tamaño del cerebro.
35
En 2004, Voronina y cols. realizaron el
análisis del gen RAX en 75 sujetos con anoftalmia/microftalmia e identificaron 2
mutaciones distintas, confirmando a RAX como un gen asociado a malformaciones
oculares con patrón autosómico recesivo;
23, 36
sin embargo, estudios recientes
han demostrado que mutaciones
aciones heterocigotas también son responsables de la
enfermedad. 27
16
A la fecha se han demostrado cinco mutaciones distintas del gen RAX en sujetos
con malformaciones oculares. (Tabla 2).
Tabla 2. Mutaciones en el gen RAX
RAX consta de tres exones y la proteína codificada contiene un dominio homeótico
de unión a DNA, un dominio octapéptido y el dominio OAR del cuál no se conoce
su función (Fig. 9).
Fig. 9 Dominios de RAX
17
1.4.3
OTX2
OTX2 es un gen perteneciente a la familia de genes homeóticos que se expresan
en la porción cefálica en desarrollo. Específicamente OTX2 se expresa en la
región diencefálica y se ha demostrado que es esencial para la determinación del
tipo celular de los fotoreceptores de la retina
38
y tiene un papel importante en la
diferenciación terminal de las células bipolares. 39
OTX2 es el homólogo en vertebrados del gen orthodenticle (Otd) de Drosophila el
cual es requerido para la formación del cerebro, ojo y antena
40
y para la
regulación del desarrollo de fotoreceptores y la expresión de rodopsina
41
. En el
ratón se expresa en el cerebro, oído, ojo y naríz; los ratones knockout
homocigotos para OTX2 mueren presentando severas anomalías en el cerebro
mientras que los knockout heterocigotos exhiben fenotipos variables que pueden
incluir anencefalia, micrognatia, anoftalmia y microftalmia. 42, 43
En el humano OTX2 está situado en el cromosoma 14q21-q22 y está constituido
por tres exones que codifican una proteína de 289 aminoácidos con función de
factor de transcripción que contiene un dominio homeótico de unión a DNA y los
dominios de transactivación N- terminal y C-terminal (Fig. 10). 44
18
Fig. 10 Dominios de OTX2
Debido a su expresión en el ojo en desarrollo, OTX2 se consideró un gen
candidato para malformaciones oculares congénitas.
En 2005, Ragge y cols. realizaron el análisis de 3
333
33 pacientes con diversas
malformaciones oculares e identificaron 11 sujetos con mutaciones dominantes en
OTX2,, validando a este gen como causante de alteraciones estructurales de ojo
en el humano. 24
Sin embargo, se ha observado que la penetrancia de la
las
s mutaciones varía, ya que
ocasionalmente familiares de pacientes afectados que también presentan la
mutación en OTX2 tienen un desarrollo ocular normal. En humanos las
alteraciones oculares asociadas a mutación de OTX2 pueden ocurrir de manera
aislada o estar acompañadas de anomalías hipotálamo
hipotálamo-hipofisarias. 45, 46, 47
A la fecha se han demostrado 16 mutaciones distintas en el gen OTX2
responsables de malformaciones oculares severas (Tabla 3).
19
Tabla 3. Mutaciones en el gen OTX2
1.4.4
SOX2
En el año 2003 y a partir del estudio genético de un paciente con anoftalmia
bilateral y portador de una translocación 3;11, se definió un locus de 740 kb en
3q27 que estaba deletado en el paciente. Dentro de esa región se sitúa el gen
SOX2. 25 Debido al conocimiento
onocimiento previo de la función de SOX2 en el desarrollo del
sistema nervioso y del ojo
48, 49
se consideró como un candidato excelente para el
20
fenotipo de anoftalmia en el humano. En ese estudio se identificó que de un grupo
de 35 sujetos con anoftalmia, cuatro presentaban mutaciones puntuales
heterocigotas en el gen SOX2. Interesantemente, todas las mutaciones originaron
codones de terminación prematuros, se identificaron en sujetos con anomalías
bilaterales (anoftalmia bilateral o anoftalmia/microftalmi
anoftalmia/microftalmia)
a) y fueron mutaciones de
novo.
25
De esta manera, SOX2 demostró ser el primer gen reconocido como
causante de anoftalmia aislada autosómica dominante en el humano.
25
SOX2 es
un gen que consta de un exón y codifica una proteína compuesta por 317 residuos
con función de factor de transcripción. SOX2 se expresa durante la formación del
ojo y del sistema nervioso central y tiene además una función reguladora en el
desarrollo del cristalino. Se encuentra altamente conservado filogenéticamente y
pertenece a la familia de proteínas que poseen un dominio HMG (del inglés High
Mobility Group)) de unión a DNA (Fig. 11). 50
Fig. 11 Dominios de SOX2
A la fecha se han identificado 26 mutaciones en SOX2 las cuáles ocupan un
10 a 20%
de mutaciones en sujetos afectados con anoftalmia/microftalmia y
coloboma (Tabla 4). 25, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61
21
Tabla 4. Mutaciones en el gen SOX2
22
En 2007, se realizaron estudios en Xenopus que demostraron
straron la relación que
existía entre sox2 y otx2 para la regulación de rax, encontrando que sox2 y otx2
interactúan directamente y se unen a una secuencia denominada CNS1
conservada en varios vertebrados y que está localizada aproximadamente 2 kb río
arriba
ba del promotor de rax y que es importante para su regulación transcripcional
(Fig. 12).
62
Por otro lado, se sabe que en humanos CHX10 se expresa un poco
después que PAX6 y éstos a su vez son co
co-expresados
expresados en las células
progenitoras de la retina (RPC) ssiendo
iendo PAX6 esencial para la multipotencialidad
de las RPC y CHX10 importante para la proliferación de éstas células. 30
Fig. 12 Interacción entre SOX2, OTX2, RAX y CHX
CHX10. Modificado de Danno et al. 2008
23
1.4.5
NDP
Sthepens en 1937 y Roberts en 1947 reportaron casos de microftalmia aislada
con un patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma X. Sin embargo, una
revisión posterior de éstos casos realizada por Warburg demostró que no se
trataba de microftalmia aislada ya que los pacientes presentaban algún grado de
sordera y retraso mental.
63,64
Por tal motivo, estos casos fueron reclasificados
como enfermedad de Norrie. 65
La enfermedad de Norrie es un transtorno recesivo ligado al cromosoma X, el cual
se caracteriza por cambios fribrovasculares en la retina que progresan hasta
provocar la pérdida de la visión y cerca del 30 al 50% de los afectados padecen
sordera neurosensorial y retraso mental.
66
Éste padecimiento es ocasionado por
mutaciones en el gen NDP localizado en Xp11.4 y constituido por 3 exones. El
exón 1 corresponde a la región 5’ no traducida y se ha demostrado que tiene
función regulatoria
67
, mientras que el exón 2 y 3 codifican una proteína de 133
aminoácidos denominada Norrina ó Norrie Disease Protein que contiene dominios
ricos en cisteína (Fig. 13), altamente conservados en varios factores de
crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor
transformante de crecimiento- β , gonadotropina coriónica humana y el factor de
crecimiento nervioso,
68
los cuáles son importantes para la conformación nativa
de la proteína. 69
24
Fig. 13 Dominios de NDP
Se ha identificado que la norri
norrina
na actúa como ligando del receptor Frizzled-4
Frizzled y
activa la vía canónica de señalización Wnt (Fig. 14).
70
La proteína es expresada
predominantemente en la retina (capa nuclear externa, nuclear interna y capa de
células ganglionares), coroides y cerebro
71
y ha sido reconocida como un
importante factor angiogénico para los vasos sanguíneos de la retina sin embargo
ésta función no está estrictamente limitada a la vasculatura ocular. 72,73
Fig. 14 Norrina en la vía Wnt. Modificado de Masckauchán y Kitajewski 2007
25
Hasta el momento se han identificado más de 80 mutaciones en el gen NDP en
pacientes con enfermedad de Norrie (Tabla 5).
74, 75, 76
La mayoría de las
mutaciones causantes de enfermedad de Norrie son cambios de una sola base sin
embargo también se han identificado deleciones parciales ó completas del gen.
77
Varias mutaciones en NDP han sido asociadas a otras retinopatías hereditarias
tales como vitreoretinopatía exudativa familiar,
la enfermedad de Coat´s
81
78
retinopatía del prematuro,
79,80
y
pero hasta ahora no se ha podido establecer una
correlación genotipo – fenotipo.
26
Tabla 5. Mutaciones identificadas en el gen NDP
27
Tabla 5. Mutaciones identificadas en el gen NDP
28
Tabla 5. Mutaciones identificadas en el gen NDP
1.5
PREVALENCIA DE ANOFTALMIA/MICROFTALMIA
Se ha estimado que la prevalencia de la anoftalmia y microftalmia a nivel mundial
es de 3 y 14 por cada 100,000 nacimientos, respectivamente.
82
Datos de tres
grandes registros de malformaciones congénitas (Francia, Suecia y California)
mostraron que la prevalencia
evalencia de anoftalmia/microftalmia es de 1.5 por cada
10,000.
83
10,000.
84, 85
Entre 1984 y 1988 la prevalencia en Inglaterra fué de 1.0 por cada
El sistema de anomalías congénitas de Alberta identificó una
prevalencia de 1.4 por cada 10,000.
86
Datos de International Clearinghouse for
29
Birth Defects Monitoring System reportan que en México en el año 2005 la
prevalencia fué de 1.36 casos de anoftalmia por 10,000 nacimientos mientras que
de microftalmia no hubo ningún reporte. 87
1.6
VALORACIÓN
Establecer la causa específica de anoftalmia/microftalmia en un individuo implica
una adecuada historia médica, valoración física, historia familiar, estudios de
imagen cerebral, ultrasonido renal, y cariotipo. La valoración genética molecular
es
útil
para
el
análisis
de
mutaciones
en
genes
asociados
con
anoftalmia/microftalmia. La valoración clínica comprende una inspección gruesa
que consiste en la palpación de la órbita para obtener un estimado del tamaño del
globo ocular y medir el diámetro corneal cuyo rango normal es de 9 a 10.5 mm en
neonatos y de 10.5 a 12 mm en adultos. 88
Los estudios de imagen consisten en una ultrasonografía ocular para medir la
longitud axial total y la longitud del segmento anterior y posterior. La
ultrasonografía ocular en modo B sirve para evaluar las estructuras internas del
globo ocular. La tomografía computada y la resonancia magnética de cerebro y
órbita evalúan el tamaño y las estructuras internas del globo ocular, la presencia
del nervio óptico, músculos extraoculares y la presencia de malformaciones
cerebrales asociadas. 10
30
1.7
MANEJO
El tratamiento incluye una constante evaluación por un cirujano oculoplástico. En
casos de anoftalmia ó microftalmia severa será necesaria la cirugía y adaptación
de prótesis ocular. La intervención y terapia temprana para optimizar el desarrollo
psicomotor, independencia y movilidad son esenciales para personas afectadas
con anoftalmia/microftalmia además de vigilancia por un médico genetista para
valorar características de algún síndrome que se hagan aparentes a lo largo del
tiempo. 88
1.8
SÍNDROMES ASOCIADOS A ANOFTALMIA/MICROFTALMIA
La anoftalmia y la microftalmia se pueden asociar a síndromes en los que las
anomalías extraoculares asociadas ocurren hasta en 75% de casos. Se conocen
más de 100 síndromes genéticos (de transmisión Autosómica Dominante,
Autosómica Recesiva y Ligada al X) que pueden incluir anoftalmia/microftalmia. 89
Entre los síndromes que frecuentemente asocian anoftalmia/microftalmia se
encuentran la enfermedad de Norrie ,el síndrome de Walker-Warburg, la trisomía
13, el síndrome de Nance-Horan, el síndrome de Hallerman-Streiff, el síndrome
MICRO, y el síndrome de Lenz, entre muchos otros. 65, 90, 91
31
2.
JUSTIFICACIÓN
La anoftalmia/microftalmia son malformaciones oculares que constituyen la
segunda causa más común de ceguera en niños a nivel mundial. Una proporción
de estos casos se debe a mutaciones en genes involucrados en el desarrollo del
ojo. En nuestro país no existen estudios acerca de la frecuencia de las causas
genéticas de anoftalmia/microftalmia, ni el tipo de mutación en los genes
implicados.
El análisis de mutaciones en los genes asociados a anoftalmia/microftalmia
permitirá establecer el espectro mutacional en nuestros pacientes y permitirá
otorgar un asesoramiento genético adecuado a las familias.
32
3. OBJETIVOS
3.1
General
•
Identificar
las
alteraciones
genéticas
en
casos
familiares
de
anoftalmia/microftalmia en una muestra de sujetos mexicanos.
3.2
Específicos
•
Identificar las mutaciones causantes de anoftalmia/microftalmia aislada (sin
malformaciones extraoculares) en una muestra de sujetos mexicanos.
•
Determinar las bases moleculares de entidades sindromáticas asociadas a
anoftalmia/microftalmia.
33
4. PACIENTES Y MÉTODOS
4.1
CRITERIOS DE INCLUSIÓN
•
Se incluyeron casos familiares de anoftalmia/microftalmia, aislada o
sindrómica diagnosticados en el Instituto de Oftalmología “Fundación
Conde de Valenciana” I.A.P en el periodo de enero de 2008 a marzo de
2009.
•
Sujetos con afectación bilateral.
•
Patrón de transmisión Mendeliana definido por árbol genealógico.
•
Sujetos que deseen participar en el estudio mediante la firma de
consentimiento informado (Anexo 1).
4.2
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
•
Sujetos con malformaciones oculares por agentes teratogénicos (valorados
en el servicio de genética del Instituto de Oftalmología “Fundación Conde
de Valenciana” I.A.P.)
34
4.3
SELECCIÓN DE PACIENTES Y FAMILIAS ESTUDIADAS
El diagnóstico de los pacientes fue realizado por médicos oftalmólogos del Instituto
de Oftalmología “Fundación Conde de Valenciana” I. A. P. además de ser
valorados en el servicio de Genética del Instituto para descartar malformaciones
oculares por agentes teratogénicos y para confirmar un patrón de herencia
mendeliano. Se reclutaron 10 familias diagnosticadas con anoftalmia/microftalmia,
cinco con patrón de herencia autosómico recesivo, dos con pa
patrón
trón autosómico
dominante y tres que presentaban patrón de herencia recesivo ligado al
cromosoma X. A continuación se presentan los árboles genealógicos de cada
familia:
Familia 1-AR
Familia 2-AR
Familia 4-AR
Familia 3-AR
Familia 5-AR
Fig. 15 Familias con patrón de herencia autosómico recesivo. Las familias 1-3
1
presentaron consanguinidad entre los padres de los enfermos.
35
Familia 1-AD
Familia 2-AD
Fig. 16 Familias con patrón de herencia autosómico dominante
Familia 1-RLX
Familia 2-RLX
Familia 3-RLX
Fig. 17 Familias con microftalmia ligada al cromosoma X (Enfermedad de Norrie)
36
5. METODOLOGÍA
5.1
OBTENCIÓN Y EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO
El DNA genómico de cada sujeto fue obtenido a partir de leucocitos de sangre
periférica (1 ml con anticoagulante EDTA). La extracción de DNA se realizó de
manera semiautomatizada utilizando el equipo de extracción de DNA QuickGene810 (FUJIFILM/AutoGen, USA), el cual permite la extracción por medio del empleo
de columnas de silica cargadas positivamente que atraen a los ácidos nucléicos
los cuáles son finalmente serán eluidos con una pureza de 1.7 a 1.9.
5.2
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y PUREZA DEL DNA
OBTENIDO
Se determinó la concentración y pureza del DNA extraído por medio de un análisis
de absorbancia de la muestra a 260/280 nm de longitud de onda en el
espectrofotómetro BioPhotometer Plus (Eppendorf, Alemania). La relación 260/280
permitió evaluar la pureza de la muestra, considerando que la lectura a 280 nm
corresponde a la fracción proteica. Se consideraron adecuadas relaciones entre
1.6 y 2.
37
5.3
AMPLIFICACIÓN POR PCR DE LOS GENES DE INTERÉS
A partir del DNA de los sujetos afectados se realizó la amplificación por PCR
de las regiones codificantes y las secuencias intrónicas flanqueantes de los
genes CHX10, RAX, SOX2, OTX2 y NDP asociados a anoftalmia/microftalmia.
Se utilizaron oligonucleótidos específicos derivados de la secuencia normal de
cada gen a estudiar (Tabla 6-10). Para la amplificación de cada fragmento
génico se utilizó un par de oligonucleótidos (sentido y antisentido) cuyo
producto de amplificación varía en tamaño en cada caso particular.
La
reacción de amplificación de PCR se realizó en un volumen total de 20 µl con
los siguientes componentes: amortiguador para PCR 1X, de 100-200 ngs de
DNA genómico, 0.3 mM de cada uno de los cuatro dNTP’s, 8.5U de
HotStartTaq Polimerasa, 1mM del oligonucleótido correspondiente (sentido o
antisentido), MgCl2 (1.5 mM) y agua bidestilada c.b.p. 20 µl. Se utilizó un
programa de
temperaturas que incluye 1 ciclo de 15 min a 95°C para la
desnaturalización inicial y activación de la DNA polimerasa, 38 ciclos con 1 min
de desnaturalización a 95°C, 1 min de alineamiento a temperaturas específicas
para cada oligonucleótido y 1 min a 72°C para la extensión. Por último, se
realizó 1 ciclo a 72°C por 10 min para la extensión final. Los productos
obtenidos de la amplificación se sometieron a electroforesis en geles de
agarosa al 1.5% con tinción de bromuro de etidio para identificar las bandas
específicas con el producto amplificado, utilizando como referencia un
marcador estándar de tamaño de 100 pb Gelpilot (QIAGEN, Maryland USA).
38
Tabla 6. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen CHX10
Tabla 7. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen RAX
Tabla 8. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen OTX2
Tabla 9. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen SOX2
39
Tabla 10. Oligonucleótidos empleados para la amplificación del gen NDP
5.4
SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA DE LOS PRODUCTOS DE PCR
La determinación de las mutaciones se realizó por secuenciación nucleotídica
directa. Se recortaron del gel de agarosa las bandas de interés con el DNA y
se purificó el producto amplificado utilizando el método de purificación por
columna (QIAGEN) basado en la solubilización de agarosa y la adsorción
a
selectiva y cuantitativa de ácidos nucléicos por medio de partículas de silica en
presencia de alta concentración de sales, mismo que fué eluido con agua o
empleando una solución con baja concentración de sales. La concentración
del DNA amplificado
o obtenido de la purificación se determinó por medio de la
comparación de la intensidad de las bandas obtenidas con respecto a un
marcador de masa estándar (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen) en un gel de
agarosa al 1.5%
teñido con bromuro de etidio. Se realizaron nuevas
reacciones de PCR para la secuenciación nucleotídica en un volumen de
reacción de 10 µl con 0.5 µl de BigDye Terminator Cycle Sequencing kit
(Applied Biosystems) que contiene los cuatro dideoxinucleótidos trifosfatados
(ddNTPs) marcados por fluorescencia, deoxionucleótidos trifosfatados (dNTPs)
no marcados, Tris-HCl
HCl (pH 9.0), MgCl2 y la enzima ampliTaq polimerasa; se
40
agregó además 0.5 µl del oligonucleótido sentido (del inglés Forward) o
antisentido (del inglés Reverse), 10-20 ng del DNA de cada producto de PCR
como templado y agua bidestilada para un volumen final de 10 µl. Para esta
PCR se utilizó un programa de 25 ciclos que incluyeron 30 s a 95°C para la
desnaturalización, 15 s a 50°C para el alineamiento y 4 min a 60°C para la
extensión. Los productos de esta segunda PCR se purificaron por medio de
columnas Centri-Sep (Applied, Biosystems) para eliminar
el exceso de
ddNTPs fluorescentes y de dNTPs no marcados. Cada muestra se
resuspendió
en 20 µl de formamida desionizada y posteriormente se
desnaturalizó
a 95°C por 5 min. Los productos se analizaron en un
secuenciador
automático
ABI
Prism
310
Genetic
analyzer
(Applied
Biosystems) y las secuencias de DNA obtenidas de los sujetos enfermos se
compararon con las secuencias silvestres de cada gen bajo estudio publicadas
en la base de datos Ensembl (www.ensembl.com), para identificar las
mutaciones correspondientes. En el caso de las mutaciones identificadas no
descritas previamente, se incluyeron 50 controles sanos para descartar que el
cambio correspondiera a un polimorfismo no asociado a la enfermedad.
41
5.5
ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS
Diversos estudios de ligamiento para NDP han utilizado entre 2 y 5
marcadores microsatélites. 92, 93, 94
El análisis de haplotipos en este estudio fue desarrollado utilizando tres
marcadores microsatélites flanqueantes del gen NDP (Cen-DXS8080
DXS8080-NDPMAOB-DXS7-Tel).
Tel). Cada marcador fue amplificado utilizando pares de
oligonucleótidos correspondientes (Tabla 11) ob
obtenidos
tenidos de la base de datos
del Centro Nacional para la Información Biotecnológica ((www.ncbi.nlm.nih.gov
www.ncbi.nlm.nih.gov)
y siguiendo las condiciones de PCR descritas anteriormente los cuáles se
sometieron a electroforesis capilar en el analizador genético ABI Prism 310
(Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando el software Genescan (Applied
Biosystems) para la determinación del tamaño del amplicón.
El análisis de haplotipos fue realizado manualmente comparando el tamaño
del amplicón de los afectados de cada familia analizada (1
(1-RLX
RLX y 2-RLX)
2
asignando a cada alelo un número que dependería del tamaño del amplicon
en cada paciente.
Tabla 11.. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de los marcadores DXS7, MAOB Y DXS8080
42
6. RESULTADOS
6.1
ANÁLISIS MOLECULAR DE LOS GENES CHX10 Y RAX EN
FAMILIAS CON PATRÓN DE HERENCIA AUTOSÓMICO RECESIVO
El estudio molecular de los genes CHX10 y RAX se realizó en 5 familias (1(1
AR, 2-AR, 3-AR, 4-AR
AR Y 5
5-AR) con patrón de herencia autosómico recesivo,
Se analizaron 5 sujetos afectados (3 del sexo masculino y 2 del sexo
femenino) los cuáles presentaban anoftalmia/microftalmia aislada.
La amplificación por PCR de los genes CHX10 y RAX en sujetos afectados de
las familias estudiadas demostró
mostró amplificación normal de cada exón (Figura
18) excluyendo un rearreglo génico como deleciones o duplicaciones
extensas.
B
A
M
M
Fig. 18 Geles de agarosa al 1.5 % A) P
Productos de amplificación de los cinco exones de
CHX10 B)Productos de amplificación de los tres exones de RAX
(Paciente representativo de la familia 11-AR, M representa el marcador de tamaño)
43
La comparación de la secuencia silvestre de CHX10 con las secuencias
obtenidas de los cinco exones del gen no demostró ninguna mutación en
ninguno de los cinco sujetos de las familias analizadas sin embargo, se
identificó el polimorfismo S157S previamente reportado en las familias 1-AR,
3-AR y 5-AR.
22
Por otra parte, la comparación de la secuencia silvestre de
RAX con las obtenidas de los pacientes no mostró alguna mutación causante
de la enfermedad. No obstante, fue posible identificar el polimorfismo sinónimo
en forma heterocigota en la familia 2-AR el cual no ha sido reportado
anteriormente en donde el codón normal TTC cambia a TTT en la posición
308, sin alterar a la fenilalanina codificada (F308F).
44
6.2 ANÁLISIS MOLECULAR DE LOS GENES SOX2 Y OTX2 EN FAMILIAS
CON PATRÓN DE HERENCIA AUTOSÓMICO DOMINANTE
El estudio molecular de los genes SOX2 y OTX2 se realizó en 2 familias con
patrón de herencia autosómico dominante con anoftalmia/microftalmia aislada
(1-AD Y 2-AD)
AD) en un paciente femenino y otro masculino.
La amplificación por PCR de los genes OTX2 y SOX2 en sujetos afectados de
las familias estudiadas fue normal en cada exón (Figura 19) lo cual excluye un
rearreglo génico extenso.
A
M
B
M
M
Fig. 19 Geles
es de agarosa al 1.5% A) Productos de amplificación de los tres exones
codificantes de OTX2 B)Productos de amplificación del exón 1 de SOX2
(Paciente representativo de la familia 11-AD,
AD, M representa el marcador de
tamaño)
La comparación de la
a secuencia silvestre de OTX2 y SOX2 con las secuencias
obtenidas de los exones codificantes de cada gen no mostró alguna mutación
en ninguno de los dos sujetos de las familias analizadas.
45
6.3 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GEN NDP EN FAMILIAS CON PATRÓN
DE HERENCIA RECESIVO LIGADO AL CROMOSOMA X
El estudio molecular del gen NDP fue realizado en tres familias con patrón de
herencia recesivo ligado al cromosoma X. La amplificación por PCR de los
exones codificantes de NDP resultó normal en los sujetos afectados
afectado de las
familias analizadas (Fig. 20).
Fig. 20 A) Geles
es de agarosa al 1.5% del producto de amplificación
ón de los dos
exones codificantes de NDP (Paciente representativo de la familia 1-RLX,
RLX, M
representa el marcador de tamaño)
Familia 1-RLX (Fig. 17)
Los probandos fueron dos hermanos de 19 y 17 años respectivamente los
cuáles presentaban microftalmia además de opacidad corneal, múltiples
opacidades vítreas y desprendimiento total de retina. No se identificó alguna
otra alteración extraocular sin embar
embargo,
go, la historia familiar reveló que algunos
familiares afectados presentaban sordera y retraso mental, lo que permite
establecer el diagnóstico clínico de Enfermedad de Norrie. La mutación
46
identificada en los probandos fue una transversión c.G122C en el exón
ex
2 de
NDP que predice el cambio de arginina por una treonina en la posición 41 de
la proteína (p.R41T) (Fig. 21). Se analizaron también a cuatro sujetos
afectados de esta familia (II
(II-7, III-2, III-14 y III-15)
15) en los cuáles se encontró la
misma mutación.
n. Además, se realizó el análisis en 8 mujeres (II
(II-5, II-8,
8, II-10,
II
II11, II-15, III-5, III-9 y III-10)
10) para identificar el estado de portadora en el cual
se identificaron 4 casos
A
B
C
Fig. 21 Secuencia nucleotídica parcial del exón 2 del gen NDP en DNA de la familia 11
RLX A)Secuencia control que señala el codón normal AGG B)Mutación G>C en el
nucleótido 122 que resulta en el cambio arginina por treonina en el residuo 41 C)
Secuencia de una portadora que muestra el cambio en estado heterocigoto
47
Familia 2-RLX (Fig. 17)
En ésta familia fueron estudiados el afectado y su madre. El afectado de 6
meses de edad presenta microftalmia y leucocoria congénita bilateral debida a
tejido
fibrovascular
retrolental,
estas
cara
características
cterísticas
clínicas
permiten
diagnosticar Enfermedad de Norrie. El análisis molecular de NDP demostró la
transversión c.G122C en el exón 2, la cual predice el cambio de una arginina
(AGG) por treonina (CGG) en el residuo 41 (p.R41T), así mismo, el análisis en
la madre del afectado confirmó su estado de portadora (Fig. 22).
Interesantemente, las familias
amilias 1
1-RLX y 2R-LX
LX presentan la misma mutación
sin embargo no hay relación aparente entre ellas.
A
D
B
E
C
E
Fig. 22 Secuencia nucleotídica parcial del exón 2 del gen NDP en DNA de las familias 1 y 2-RLX
2
A)
la Secuencia control en la que se señala en codón AGG normal B) Análisis en DNA de un varón
afectado que muestra la mutación G>C en el nucleótido 122 que resulta en el cambio arginina por
treonina en el residuo 41 C) SSecuencia
ecuencia de una portadora que muestra el cambio en estado
heterocigoto D)Leucocoria E)Ultrasonografía ocular que muestra las masas fibrosas retrolentales
características de la enfermedad de Norrie en el paciente afectado de la familia 22-RLX
RLX
48
Familia 3-RLX (Fig. 17)
En ésta familia fueron estudiados el propositus de 27 años y su hermana. El
sujeto afectado presenta microftalmia en ojo izquierdo y en ojo derecho
catarata congénita, queratopatía en banda, catarata nuclear y desprendimiento
de retina. La mutación encontrada fue una transición c.C361T (Fig. 23-A)
23
la
cual produce un cambio en el residuo arginina (CGG) por triptófano (TGG) en
la posición 121 (p.R121W) la cuál había sido previamente reportada.
95, 96
El
análisis molecular también permitió identificar el estado de portadora en la
hermana del sujeto afectado
ado (Fig. 23
23-C).
A
D
B
C
E
Fig. 23 Secuencia
cuencia nucleotídica parcial del exón 3 del gen NDP en DNA de la familia 3-RLX
3
A)Secuencia control señalando el codón CGG normal B)Mutación C>T en el nucleótido 361 que
resulta en el cambio arginina por triptófano en el resi
residuo
duo 121 C) Secuencia de una portadora
mostrando la mutación en estado heterocigoto (se muestra la cadena complementaria)
D)Catarata en el ojo derecho E)Microftalmia en ojo izquierdo en el paciente afectado de la
familia 3-RLX
49
6.3.1 ANALISIS DE HAPLOTIPOS DEL GEN NDP
El análisis de haplotipos con los marcadores microsatélites DXS8080, MAOB
Y DXS7 flanqueantes del gen NDP indicó que los sujetos de las familias 1 y 22
RLX que presentaban la mutación R41T compartían el mismo haplotipo
sugiriendo un efecto fundador para esta mutación (Fig. 24).
Familia 1-RLX
Familia 2-RLX
Fig. 24 El análisis con marcadores microsatélites indicó que ambas familias compartían
compartía el mismo
haplotipo, lo que sugiere un origen común de la mutación
50
7. DISCUSIÓN
Las malformaciones oculares congénitas son una causa frecuente de ceguera o
discapacidad visual en el humano. En años recientes se han identificado algunos
genes cuyas mutaciones originan formas monogénicas de anoftalmia/microftalmia,
sin embargo, en nuestro país no existe ningún estudio que haya determinado la
contribución de estos genes al origen de estas malformaciones. En este trabajo se
describe el análisis molecular de los genes NDP, CHX10, RAX, SOX2 y OTX2 en
10 casos de sujetos afectados con anoftalmia/microftalmia familiar.
En el análisis del gen NDP se identificó una mutación nueva (p.R41T) en dos
familias aparentemente no relacionadas. Mutaciones que afectan el residuo 41
han sido reportadas previamente en
pacientes con vitreoretinopatía exudativa
familiar recesiva ligada al cromosoma X (VREF-RLX) (p.R41K) 78 ó en el Síndrome
de vasculatura fetal persistente (p.R41S) 76. La mutación p.R41T observada en las
familias 1-RLX y 2RLX causa un fenotipo más severo como la enfermedad de
Norrie, esto sugiere que la severidad del fenotipo asociada con mutaciones en el
residuo 41 de NDP depende del cambio de aminoácido. El análisis de haplotipos
en las familias 1-RLX y 2-RLX
aparentemente no relacionadas
excluyen un
origen distinto de la mutación R41T en las 2 familias, lo cual sugiere la posibilidad
de un efecto fundador para esta mutación en la población mexicana,
desafortunadamente el
desconocimiento de las frecuencias alélicas de los
marcadores utilizados impide establecer cuál es la probabilidad de que estos
marcadores coincidan por azar.
51
La mutación p.R121W identificada en la familia 3-RLX ha sido reportada
previamente en pacientes con un fenotipo menos severo asociado a mutaciones
en el gen NDP como la VREF-RLX 95,96 y Retinopatía del Prematuro (ROP).
79
Los
hallazgos clínicos del sujeto afectado sugieren el diagnóstico de VREF lo cuál
indica que el cambio p.R121W no está asociado a un fenotipo tan severo como la
enfermedad de Norrie. De este modo, el cambio de arginina a triptófano es
heterogéneo ya que origina diferentes fenotipos.
Las mutaciones encontradas en el gen NDP en las familias analizadas con patrón
de herencia recesivo ligado al cromosoma X son mutaciones de sentido
equivocado que afectan el dominio Cysteine Knot Motif de Norrina, se ha sugerido
que mutaciones que afectan los residuos de cisteína en este dominio causan un
fenotipo más severo ya que son importantes para la formación de puentes
disulfuro lo cual contribuye a la conformación nativa de la proteína 97 sin embargo,
ninguna de las mutaciones descritas en nuestro trabajo, alteran algún residuo de
cisteína.
Se ha demostrado que mutaciones en los genes CHX10, RAX, SOX2 y OTX2 son
responsables de malformaciones oculares como anoftalmia/microftalmia sin
embargo, en nuestro estudio no se encontró ninguna alteración en éstos genes
causante del fenotipo de los afectados.
Estos resultados sugieren que la alteración se encuentra en regiones
responsables del control de la expresión de los genes o que otros genes
52
implicados
en
el
desarrollo
del
ojo
sean
los
responsables
de
éstas
malformaciones.
En 2007 se descubrió que la secuencia CNS1 conservada en varios vertebrados
localizada aproximadamente 2 Kb río arriba del promotor de RAX era importante
para su regulación transcripcional por medio de la interacción entre SOX2 y OTX2.
Sin embargo, en 2009 Chassaing y cols. realizaron el análisis de esa secuencia en
50 sujetos afectados con anoftalmia/microftalmia demostrando que alteraciones en
CNS1 no eran una causa de estas malformaciones.
98
Por otra parte, sería muy
importante realizar el estudio en regiones promotoras de estos genes para
descartar su responsabilidad en la aparición de anoftalmia/microftalmia, además
del análisis de la secuencia CNS1, ya que no se puede descartar como causante
del fenotipo en familias mexicanas.
En 2006 se demostró la importancia del gen GDF6 (Growth/differentiation Factor6) en la diferenciación neural del ojo y del sistema nervioso central en modelos
animales knowdown donde se propone que GDF6 es un regulador temprano del
desarrollo de la retina en vertebrados actuando a través de PAX6 para la
regulación del desarrollo del ojo y la subsecuente diferenciación retiniana. 99 Estos
hallazgos fueron importantes ya que en 2007 Asai-Coackwell y cols. realizaron el
análisis en un paciente con malformaciones oculares donde se identificó la
deleción de un segmento de 10.37 Mb en el cromosoma 8, en el que se confirmó
que GDF6 era el gen afectado en ese segmento perdido. Esto indica que es un
gen dominante para la enfermedad.
100
Recientemente, en 2008 White y cols.
53
analizaron el gen STRA6 en 18 sujetos afectados con anoftalmia/microftalmia en
quienes previamente se habían analizado los genes CHX10 y SOX2 sin encontrar
alguna alteración causante de la enfermedad.
101
STRA6 es un receptor
transmembranal para la proteína de unión al retinol el cual es un importante
sustrato para el desarrollo ocular y otras funciones celulares.
102, 103
En este
estudio se identificaron dos mutaciones heterocigotas en un paciente lo cual indica
que es un gen recesivo para la enfermedad.
Finalmente, debido al descubrimiento de nuevos genes implicados en el desarrollo
del ojo, es necesario realizar su análisis para establecer las causas genéticas que
originan anoftalmia/microftalmia en nuestros pacientes.
54
8. CONCLUSIONES
1. Aparentemente las mutaciones en los genes CHX10, RAX, SOX2 y OTX2
parecen no ser una causa frecuente de malformaciones oculares como
anoftalmia/microftalmia en familias mexicanas.
2. Los resultados del análisis molecular de los genes CHX10, RAX, SOX2 y
OTX2 en familias mexicanas con anoftalmia/microftalmia indican que las
mutaciones responsables se podrían encontrar en regiones reguladoras o
que existen otros genes responsables de éste fenotipo.
3. Se identificó una nueva mutación (p.R41T) en el gen NDP responsable de
la enfermedad de Norrie en dos familias mexicanas aparentemente no
relacionadas.
4. El análisis de haplotipos de las 2 familias con la mutación p.R41T sugiere la
posibilidad de un efecto fundador para la mutación en población mexicana
aunque es necesario profundizar los estudios de frecuencias alélicas y
aumentar el tamaño de la muestra.
5. Al comparar los fenotipos oculares asociados a mutaciones en NDP en la
literatura, concluimos que el cambio de arginina por triptófano en el residuo
41 es responsable de un fenotipo tan severo como lo es la enfermedad de
Norrie.
6. Esta misma correlación genotipo-fenotipo nos sugiere que mutaciones en el
residuo 121 son responsables de fenotipos menos severos.
55
9. PERSPECTIVAS
1. Analizar otros genes implicados en el desarrollo del ojo en familias
mexicanas con anoftalmia/microftalmia con patrón de herencia autosómico
recesivo y autosómico dominante.
2. Analizar regiones promotoras de los genes CHX10, RAX, SOX2 y OTX2
para descartarlas como responsables de la enfermedad.
3. Realizar estudios de bioinformática para establecer cuál es el efecto de la
mutación R41T en Norrina que altera su función en la unión con su
receptor.
4. Realizar ensayos funcionales de Norrina con la mutación R41T en modelos
animales, observar el fenotipo y efecto en la vascularización.
5. Emplear técnicas novedosas de análisis del genoma completo como los
microarreglos de DNA para identificar regiones ligadas a la enfermedad en
éstas familias.
56
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11. ANEXO 1
CARTA DE INFORMACION Y CONSENTIMIENTO
Yo______________________________________________________, declaro libremente
que acepto participar de manera voluntaria en el estudio “Estudio Genético en anoftalmia
y microftalmia familiar” que se realizará en el servicio de Genética del Instituto de
Oftalmología Fundación Conde de Valenciana y que estará bajo la responsabilidad del Dr.
Juan Carlos Zenteno Ruiz y la Lic. Opt. Erika Lisselly Pelcastre Luna. Se me ha explicado
que se requiere de la toma de una muestra de 1 mililitro de sangre venosa y que esta toma
no representa ningún riesgo para mi salud más que la posible formación de un pequeño
moretón en el área de la punción. Se me ha asegurado que el material genético que se
extraiga de mi muestra de sangre se utilizará exclusivamente para investigar las alteraciones
genéticas que produjeron mi enfermedad ocular. También me ha sido señalado que puedo
retirar mi consentimiento para participar en esta investigación en el momento en que yo lo
desee y que esta decisión no afectaría la calidad de la atención que recibo por parte del
personal de este hospital. Finalmente manifiesto que se me han respondido
satisfactoriamente todas mis dudas y que los médicos responsables han señalado su
compromiso de aclarar las que pudieran surgir eventualmente.
Atentamente, ________________________________________________ Nombre y firma
México, D.F., a _____ de_________________ de 200__
Dirección y teléfono_________________________________________________________
Médico responsable____________________________________________ Nombre y firma
Telefono del Médico responsable: 55 54 31 60 39
Testigo 1____________________________________________________ Nombre y firma
Testigo 2____________________________________________________ Nombre y firma
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