Download Revista de la Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y

Revista de la Sociedad Argentina de Endocrinología
Ginecológica y Reproductiva
AFILIADA A LA INTERNATIONAL SOCIETY OF GYNECOLOGICAL ENDOCRINOLOGY
VOLUMEN XIX - NÚMERO 3 - noviembre DE 2012 - www.saegre.org.ar - [email protected]
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2012-2013
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Protesorera
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Esther Rocher
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(1000X). Autora: Daiana Fornes
PPARγ en placenta de pacientes diabéticas (1000X). Autora: Daiana Fornes
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1
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
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2003 Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva
ISSN 1515-8845. Propietario: Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva
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2
Índice
Índice
Trabajo original
PREMIO PROF. DR. ABRAHAM GUITELMAN
5
La activación de receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPAR) como
reguladora del metabolismo lipídico en la placenta de pacientes con diabetes
Evangelina Capobianco, Nora Martinez, Daiana Fornes, Romina Higa, Melisa Kurtz, Ingrid
Di Marco, María Natalia Basualdo, Cristina Faingold y Alicia Jawerbaum
Actualización
¿El reconocimiento alogénico debe bloquearse para lograr un embarazo exitoso?
Esteban Grasso, Laura Fraccaroli, Vanesa Hauk, Lucila Gallino, Guillermina Calo,
Claudia Pérez Leirós y Rosanna Ramhorst
18
Epigenética, el futuro es hoy
David Fusaro y Mariano Grilli
23
Revisión
Utilidad del estudio del organizador nucleolar en la infertilidad masculina
28
Adriana Rocher, Melba Sardi, Mercedes Pugliese, Patricia Chenlo, Herberto Repetto, Julia
Ariagno, Susana Curi, Luis Palaoro y Gabriela Mendeluk
Implicancia de las prostaglandinas en la fisiopatología de la endometriosis
Gabriela F. Meresman y Carla N. Olivares
40
Análisis crítico por expertos de trabajos seleccionados
Óxido nítrico sintasa y nitración en tirosina en la aztenozoospermia: un estudio inmunológico
Fertility and Sterility 2012; 97:554-560
Comentarios: Dra. Silvina Pérez Martínez y Dr. Uriel Pragier
57
Novedades bibliográficas
Inducción de la pubertad por trasplante autólogo de tejido ovárico criopreservado Lancet 2012; 379:588
60
La exposición a líquido folicular rico en lípidos se asocia a estrés del retículo endoplásmico liso y alteración de la maduración ovocitaria en los complejos
cúmulo-ovocito
Fertility and Sterility 2012; 97:1438-1443
61
Calendario de eventos
Reglamento de publicaciones
62
63
3
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Index
Original article
PROF. DR. ABRAHAM GUITELMAN AWARD
The activation of peroxisome proliferator activated receptors (PPARs) as the regulator of lipid metabolism in the placenta of patients with diabetes
Evangelina Capobianco, Nora Martinez, Daiana Fornes, Romina Higa, Melisa Kurtz,
Ingrid Di Marco, María Natalia Basualdo, Cristina Faingold and Alicia Jawerbaum
Updates
Should the alloantigen recognition be blocked to reach a successful pregnancy?
Esteban Grasso, Laura Fraccaroli, Vanesa Hauk, Lucila Gallino, Guillermina Calo,
Claudia Pérez Leirós and Rosanna Ramhorst
Epigenetics, the future is now
David Fusaro and Mariano Grilli
5
18
23
Review
Utility of the study of nucleolar organizer in male infertility 28
Adriana Rocher, Melba Sardi, Mercedes Pugliese, Patricia Chenlo, Herberto Repetto, Julia
Ariagno, Susana Curi, Luis Palaoro and Gabriela Mendeluk
Role of prostaglandins in the pathophysiology of endometriosis
Gabriela F. Meresman and Carla N. Olivares
40
Critical analysis of selected articles: experts´opinions
Nitric oxide synthase and tyrosine nitration in idiopathic asthenozoospermia: an
immunohistochemical study
Fertility and Sterility 2012; 97:1438-1443
Comments: Dr. Silvina Pérez Martinez and Dr. Uriel Pragier
57
Novel articles
Induction of puberty by autograft of criopreserved ovarian tissue
Lancet 2012; 379:588
60
Exposure to lipid-rich follicular fluid is associated with endoplasmic reticulum stress and impaired oocyte maturation in cumulus-oocyte complexes
Fertility and Sterility 2012; 97:554-560
61
Upcoming events
Instructions for authors
4
62
63
Trabajo Original
PREMIO PROF. DR. ABRAHAM GUITELMAN
La activación de receptores activados por proliferadores
peroxisomales (PPAR) como reguladora del metabolismo lipídico en la
placenta de pacientes con diabetes
The activation of peroxisome proliferator activated receptros (PPARs) as the regulator
of lipid metabolism in the placenta of patients with diabetes
Dres. Evangelina Capobianco1, Nora Martínez1, Daiana Fornes1, Romina Higa1, Melisa Kurtz1,
Ingrid Di Marco2, María Natalia Basualdo2, Cristina Faingold3, Alicia Jawerbaum1
Laboratorio de Reproducción y Metabolismo, CEFYBO-CONICET, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Paraguay 2155, Piso 17 (1121) Ciudad Autónoma de Buenos Aires
2
División Obstetricia del Hospital Materno-Infantil “Ramón Sardá”, Esteban de Luca 2151 (1246)
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
3
Hospital César Milstein, La Rioja 951 (1221) Ciudad Autónoma de Buenos Aires
1
Resumen
Dadas las alteraciones metabólicas inducidas por
la diabetes materna y la capacidad de los receptores nucleares PPAR de regular el metabolismo lipídico, se propuso como objetivo evaluar los niveles de lípidos y PPAR
en la placenta de pacientes sanas y con diabetes tipo 2, y
determinar si la activación de los PPAR regula los niveles
y peroxidación lipídica en dichos tejidos. Metodología:
las placentas se obtuvieron luego del alumbramiento, se
determinaron los niveles de lípidos mediante cromatografía, los niveles de PPAR mediante Western blot y la peroxidación lipídica mediante la cuantificación de TBARS.
Resultados: se evidenciaron mayores niveles de lípidos y
menores niveles de PPARa y PPARγ en placenta de pacientes diabéticas en relación con el control (P<0,05). Los
agonistas de PPARa redujeron la masa lipídica en la placenta de pacientes sanas y diabéticas, mientras que la activación de PPARδ la redujo sólo en la placenta de pacientes sanas. Al activar PPARγ aumenta la masa lipídica y la
expresión de la enzima de síntesis de ácidos grasos FASN
(P<0,05). La peroxidación lipídica, incrementada en placenta de pacientes diabéticas (P<0,001), se reguló negativamente al activar los tres isotipos de los PPAR (P<0,05).
Conclusión: se identificaron en este estudio noveles funciones de los PPAR en la placenta humana, relevantes en
la regulación del metabolismo lipídico y la lipoperoxidación. La diabetes tipo 2 induce a nivel placentario alteraciones en los niveles y función de los PPAR vinculadas a
las importantes anomalías en el metabolismo lipídico y un
estado prooxidante inducidas por esta patología.
Palabras clave: receptores activados por proliferadores
peroxisomales (PPAR), diabetes, placenta, lípidos, lipoperoxidación.
Abstract
Due to the metabolic alterations induced by
maternal diabetes and the capacity of nuclear receptors
PPARs to regulate lipid metabolism the aim of this study
was to evaluate the concentrations of lipids and PPARs
in the placenta from healthy and type 2 diabetic patients
and to determine whether PPARs activation regulate
lipid concentrations and peroxidation in these tissues.
Methods: Placentas were obtained after delivery, lipid
levels were determined by chromatography, concentrations of PPARs isotypes were evaluated by Western blot
and the lipid peroxidation determined by TBARS quantification. Results: There are higher levels of lipids and
lower concentrations of PPARα and PPARg in the placenta from diabetic patients when compared to controls
(P<0.05). PPARα agonists decreased the lipid mass in
the placenta from healthy and diabetic patients, while
PPARd activation decreased the lipid mass only in the
placenta from healthy patients. When PPARg was activated, the lipid mass and the expression of the fatty acid
synthase enzyme (FASN) were increased. Lipid peroxidation, increased in the placenta from diabetic patients
(P<0.001), was negatively regulated when the three
PPARs were activated (P<0.05). Conclusion: We identified in this work novel PPAR functions in the human
placenta as relevant regulators of lipid metabolism and
peroxidation. Type 2 diabetes induced in the placenta
alterations in PPARs expression and function, related
to the important anomalies in lipid metabolism and the
pro-oxidative state induced by this pathology.
Key words: Peroxisome Proliferator Activated Receptors
(PPARs), diabetes, placenta, lipids, lipoperoxidation.
5
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Introducción
La diabetes materna afecta el desarrollo fetal y
placentario, por lo que se producen incrementos en los
índices de abortos espontáneos, malformaciones congénitas y patologías perinatales (1,2). La macrosomía y la
placentomegalia constituyen el fenotipo más frecuente
en la diabetes materna (3). La macrosomía conduce a
complicaciones maternas y fetales en el período perinatal y constituye un marcador fenotípico de anómala
programación intrauterina, ya que conlleva a mayores
índices de patologías como la hipertensión, diabetes y
enfermedad coronaria en la vida adulta de la descendencia (4,5). El feto adquiere su característica macrosómica
hacia fines de la gestación. Producto de la mayor secreción insulínica del páncreas fetal en respuesta a la hiperglucemia materna, se promueve en el feto un estado
anabólico que conduce a una mayor acumulación de lípidos en diferentes órganos fetales, ampliamente facilitada y promovida por una mayor transferencia de lípidos
a través de la placenta (3,6). La transferencia lipídica se
regula en el tejido placentario. Los ácidos grasos provenientes de la circulación materna son reesterificados
en forma transiente en este tejido, y luego catabolizados
mediante la acción de lipasas para luego ser transferidos al feto en desarrollo (7). Los receptores activados
por proliferadores peroxisomales (PPAR) son factores
de transcripción activados por ligandos involucrados en
múltiples procesos de diferenciación, desarrollo y regulación de la homeostasis lipídica (8). Se conocen tres
subtipos: PPARa, PPARg y PPARd; estos heterodimerizan con el receptor nuclear del ácido 9-cis-retinoico,
formando complejos que interactúan con elementos de
respuesta específicos en el ADN (9). La activación de
estos receptores por sus ligandos específicos media el
reclutamiento de factores coactivadores y la consecuente
transcripción de genes de importancia en el control del
metabolismo de lípidos y carbohidratos, la inflamación
y el desarrollo (10,11). En efecto, en diferentes tejidos,
agonistas de los PPAR regulan la transcripción de genes
blanco vinculados con procesos de síntesis, oxidación y
transporte de lípidos y ejercen transrepresión de factores de transcripción que estimulan procesos inflamatorios (8,11). Los agonistas endógenos de los PPAR son
moléculas lipídicas (prostaglandinas y ácidos grasos poliinsaturados, entre otros). Sus agonistas farmacológicos
(glitazonas y fibratos, entre otros) poseen claros efectos
reguladores del metabolismo lipídico e hidrocarbonado
y de la inflamación, y son utilizados en el tratamiento de
la obesidad, las dislipidemias y la diabetes (12).
Modelos experimentales de diabetes y preñez
han permitido identificar la capacidad de agonistas de
PPAR de regular el metabolismo lipídico y procesos
proinflamatorios durante la organogénesis temprana y en
6
el desarrollo fetal y placentario (13,14). Estudios realizados en la placenta humana identificaron a los PPAR como
reguladores de la diferenciación e invasión trofoblástica y
evidenciaron importantes alteraciones en la expresión de
PPAR en la diabetes gestacional (15,16). En la diabetes
pregestacional tipo 1, no se encontraron alteraciones en
la expresión de PPARg, aunque sí, menores niveles de su
agonista endógeno, alteración vinculada a la anómala producción de óxido nítrico (17). No se sabe, sin embargo, si
se encuentran alterados los niveles y función de PPAR en
la placenta de pacientes con diabetes tipo 2.
Cobra relevancia el estudio de la diabetes tipo
2 en la gestación debido a la creciente y más temprana
incidencia de este tipo de diabetes y al incremento en
la edad materna que se evidencia en la actualidad. En
forma similar a la diabetes tipo 1, la diabetes tipo 2 pregestacional incrementa el riesgo de malformaciones y
abortos espontáneos (1,18). Además, la diabetes tipo 2
comparte con la diabetes gestacional y la diabetes tipo 1
el mayor riesgo de morbilidad y mortalidad perinatal, y
la programación de enfermedades metabólicas y cardiovasculares en la vida adulta del neonato (5,19).
Sobre la base de los antecedentes descriptos, el
objetivo del presente estudio fue evaluar los niveles de
PPAR y la capacidad de los agonistas de PPAR de regular el metabolismo lipídico y la lipoperoxidación en
la placenta a término de gestantes sanas y con diabetes tipo 2. Los resultados obtenidos han revelado una
clara participación de los PPAR en la regulación del
metabolismo lipídico y el entorno prooxidante en la
placenta humana. Además, han permitido identificar
importantes anomalías en el metabolismo lipídico, en
los niveles de PPAR y un entorno prooxidante en la
placenta de pacientes con diabetes tipo 2, alteraciones
posiblemente vinculadas con las anomalías de crecimiento fetoplacentario y la programación intrauterina
de enfermedades metabólicas en la diabetes materna.
Metodología
Población
La población en estudio corresponde a pacientes
de la Unidad II de Alto Riesgo de la Maternidad Ramón
Sardá de Buenos Aires. Se incluyeron pacientes sanas
(controles) y con diabetes tipo 2 (diagnosticadas mediante historia clínica y sin comorbilidades asociadas).
En todos los casos, se excluyeron aquellas pacientes que
presentaban alguna de las siguientes complicaciones:
preeclampsia, trombofilia, complicaciones vasculares
y/o renales, anemias con hemoglobina total ≤8%, nacimiento pretérmino (<37 semanas de gestación), rotura
prematura de membranas, positividad de serologías de
HIV, VDRL y hepatitis B, corioamnionitis, desprendimiento prematuro de placenta y sufrimiento fetal.
PREMIO PROF. DR. ABRAHAM GUITELMAN - Dra. Evangelina Capobianco
Trabajo Original
El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética
y Docencia del Hospital Materno-Infantil “Ramón Sardá”.
De acuerdo con las normas institucionales, se obtuvo el
consentimiento informado de las pacientes voluntarias.
Preparaciones placentarias y diseño experimental
Las placentas (n=12 tanto en el grupo control
como diabético) se obtuvieron a término mediante cesárea, llevada a cabo debido a razones obstétricas. Luego del alumbramiento, el tejido placentario fue inmediatamente trasladado al laboratorio para su procesado.
Se separaron la placa basal y coriónica y se obtuvieron
explantes de vellosidades coriónicas placentarias (100
mg); estos fueron inmediatamente congelados a -80 ºC
para posterior determinación de los niveles de PPARα,
PPARγ y PPARδ, de lípidos neutros y polares y de la peroxidación lipídica. Se conservó el tejido en RNA later®
para determinar la expresión génica de PPAR y de FASN
(sintasa de ácidos grasos).
Por otro lado, las vellosidades placentarias (100
mg) fueron incubadas en baño metabólico bajo atmósfera de 5% CO2 en aire a 37 ºC, con y sin adiciones de agonistas de los tres isotipos de PPAR (PPARα: LTB4 1 mM,
clofibrato 20 mM; PPARγ: 15deoxydelta12,14 PGJ2 2 mM;
rosiglitazona 3 mM; PPARδ: carbaprostaciclina 1 mM,
GW501516 100 nM). Luego de tres horas de cultivo, el
tejido se conservó a -80 oC para luego analizar los niveles de lípidos neutros y polares (triglicéridos, colesterol,
ésteres de colesterol y fosfolípidos) y la lipotoxicidad
placentaria (dosaje de TBARS).
Materiales y métodos
Niveles de PPAR: se evaluaron los niveles de
PPARα, PPARγ y PPARδ mediante Western blot. Brevemente, cantidades equivalentes de proteínas en los
extractos placentarios se sometieron a electroforesis
vertical en gel SDS-PAGE, posteriormente se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se realizó la
inmunodetección con anticuerpos específicos (Cayman
Co.) y revelados con un sistema y equipo especial de detección por quimioluminiscencia (ECL e ImageQuant,
GE Healthcare). Como control interno se utilizaron anticuerpos antiactina. Se incluyó además un marcador de
peso molecular comercial de detección por quimioluminiscencia (Magic Mark, Invitrogen). Las imágenes obtenidas se analizaron con el programa Image J.
Niveles de lípidos: se analizaron los niveles de
triglicéridos, fosfolípidos, colesterol y ésteres de colesterol en tejido placentario mediante cromatografía en
capa delgada y análisis densitométrico. Brevemente, los
lípidos fueron extraídos y las distintas especies lipídicas separadas mediante cromatografía en capa delgada,
donde se sembraron tanto las muestras como la curva es-
tándar que contenía cantidades conocidas de las distintas
especies lipídicas por analizar. Las placas se desarrollaron en mezclas de solventes acordes con la separación
de lípidos neutros y fosfolípidos, para luego revelar la
ubicación de las especies lipídicas con vapores de yodo.
Las imágenes fueron digitalizadas y analizadas mediante el programa de análisis de imágenes Sigmagel.
Expresión de PPAR y FASN: la expresión génica se estudió mediante RT-PCR. Brevemente, el ARN
fue extraído de la placenta utilizando Trizol® y luego se
realizó la transcripción reversa de los ARNm mediante
cebadores específicos (Invitrogen) y la enzima M-MLV
(Promega). A partir del ADNc obtenido se realizó la
PCR que amplificó segmentos específicos de los genes
de interés, y del gen de la proteína ribosomal humana
RPL30 utilizada como control interno. La secuencia de
cebadores para amplificar el ADNc fueron: 1) FASN:
5’ CATCCAGATAGGCCTCATAGAC 3’ (sentido) y 5’
CTCCATGAAGTAGGAGTGGAAG 3’ (antisentido)
(20); PPARγ: 5’ CAGATCCAGTGGTTGCAG 3’ (sentido) y 5’ GTCAGCGGACTCTGGATT 3’ (antisentido)
(21); RPL30: 5’ CCGCAAAGAAGACGAAAAAG 3’
(sentido) y 5’ AAAGCTGGGCAGTTGTTAGC 3’ (antisentido), diseñados utilizando el programa PRIMER
3. Las condiciones de PCR fueron las siguientes para
FASN, PPARγ o RPL30 respectivamente: un ciclo a 95
ºC por 5 min.; 36, 32 o 36 ciclos a 95 ºC por 30 seg., 56
ºC por 30 seg., 72 ºC por 30 seg. Los productos de reacción fueron separados por electroforesis en geles de 2%
de agarosa con bromuro de etidio, se revelaron y digitalizaron bajo luz UV en equipo ImageQuant (GE Healthcare), y se utilizó el programa Image J para el análisis de
la intensidad de las bandas.
Niveles de peroxidación lipídica: la peroxidación lipídica genera malondialdehído, que fue cuantificada mediante la reacción colorimétrica con ácido tiobarbitúrico (método de TBARS).
Estadística: los valores presentados fueron
comparados empleando ANOVA (complementado con
test paramétricos cuando corresponde) o el test t de Student, mediante el programa PRISMA de Graphpad. Las
diferencias entre grupos se consideraron significativas
cuando P fue menor o igual a 0,05.
Resultados
Las características del grupo de pacientes sanas
(control) y pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DM2)
en estudio se describen en la Tabla I. El grupo de pacientes
diabéticas fue tratado con una dieta controlada de 1800 a
2000 Kcal diarias y con insulina (tratamiento personalizado). El monitoreo glucémico de estas pacientes demostró
que este tratamiento logró mantener los niveles de glucemia en ayunas entre los parámetros normales. Sin embargo,
7
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
este grupo de pacientes diabéticas mostró un incremento
en el peso placentario y neonatal con respecto al control.
Con respecto a las complicaciones en los neonatos de madre diabética, 1 de 12 casos presentó síndrome de distrés
respiratorio y 2 de 12 casos presentaron macrosomía.
Los datos representan el promedio ± S.E.M.
Test estadístico: t-Student.
a
Primer trimestre de gestación, bTercer trimestre
de gestación, cParto.
Abreviaturas: IMC: índice de masa corporal;
DM2: diabetes mellitus tipo 2; SDR: síndrome de distrés
respiratorio. *P<0,05, ***P<0,001 versus pacientes sanas (control).
Conociendo la relevancia de la placenta como
órgano que media y regula la transferencia, acumulación
y transporte de lípidos fetoplacentario, se estudiaron los
niveles de lípidos en las placentas a término de pacientes sanas y diabéticas. Se observó un incremento en los
niveles de fosfolípidos (p<0,05, Figura 1.A), ésteres de
colesterol (P<0,001; Figura 1.B), triglicéridos (P<0,05;
Figura 1.C) y colesterol (P<0,05; Figura 1.D) en las
placentas de pacientes diabéticas comparadas con las
placentas de pacientes sanas.
Tabla I. Datos antropométricos y metabólicos de la población en estudio.
Pacientes control (n=12)
Edad materna (años)
Paridad
Primíparas
Multíparas
Glucemia en ayunas (mg/dl)a,b
Pacientes DM2 (n=12)
27,7±1,7
32,4±1,7
1
11 (paridad: 2 a 6)
1
11 (paridad: 2 a 7)
<99
75-100
IMC materno (kg/m2) a
26±1,8
29±1,6
Tratamientosb
Dieta (Kcal)
Insulina (U por día)
-----
1800-2000
24-138
38,5±0,2
38,6±0,3
Edad gestacional (semanas)c
Peso placentario (g)
c
Peso fetal (g)c
Complicaciones neonatalesc
508±12
581±28 *
3217±96
3795±113 ***
Ninguna
SDR (n=1)
Macrosomía (n=2)
Figura 1. Niveles de lípidos en placentas de pacientes sanas (control) y pacientes diabéticas. Los lípidos evaluados son (A) fosfolípidos; (B) ésteres de colesterol; (C) triglicéridos y (D) colesterol. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12.
Test estadístico: t-Student. * P<0,05; *** P<0,001 vs. control.
8
PREMIO PROF. DR. ABRAHAM GUITELMAN - Dra. Evangelina Capobianco
Trabajo Original
Dado que los PPAR son importantes reguladores del metabolismo lipídico en diferentes tejidos, nuestro
principal objetivo ha sido estudiar la posible vinculación
entre las alteraciones encontradas en los niveles de lípidos
placentarios, con posibles alteraciones en los niveles de
PPAR, como así también evaluar los efectos regulatorios
de sus agonistas endógenos y farmacológicos en la regulación de los niveles lipídicos. Se analizaron los tres isotipos
de este receptor: PPARα, PPARd y PPARg.
Al evaluar las concentraciones placentarias de
PPARa, pudimos observar que sus niveles se encuentran
reducidos en el tejido placentario de pacientes con diabetes en relación con el control (Figura 2).
Al estudiar el efecto de agonistas de PPARa sobre las concentraciones lipídicas en placentas de pacientes sanas, observamos que LTB4, su agonista endógeno,
fue capaz de reducir los niveles de todos los lípidos analizados (P<0,05; Figura 3), mientras que el agonista farmacológico, clofibrato, redujo los niveles de ésteres de
colesterol (P<0,05; Figura 3.B).
Al evaluar el efecto de la activación de PPARa
en la placenta de pacientes diabéticas observamos que
LTB4 redujo significativamente las concentraciones de
todos los lípidos evaluados (P<0,05; Figura 4), mientras
Figura 2. Niveles de PPARα. A) Western blot representativo
de los niveles de PPARa en placentas de pacientes sanas (control) y con diabetes. B) Análisis densitométrico de los niveles de
PPARa en placentas de mujeres sanas (control) y con diabetes.
Los datos representan la media ± S.E.M. n=8. Test estadístico:
t-Student. * P<0,05 vs. control.
Figura 3. Concentraciones de lípidos en explantes placentarios de pacientes sanas, cultivados sin adiciones
o en presencia de LTB4 (1 µM) o clofibrato (20 µM). Los lípidos evaluados son (A) fosfolípidos; (B) ésteres de colesterol;
(C) triglicéridos y (D) colesterol. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: ANOVA. *P<0,05; ***P<0,001
vs. sin adiciones.
9
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Figura 4. Concentraciones de lípidos en explantes placentarios de pacientes diabéticas, cultivados sin adiciones o en presencia de LTB4 (1 µM) o clofibrato (20 µM). Los lípidos evaluados son (A) fosfolípidos; (B) ésteres de colesterol;
(C) triglicéridos y (D) colesterol. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: ANOVA. * P<0,05; **P<0,01 vs.
sin adiciones.
que el clofibrato redujo los niveles de ésteres de colesterol, triglicéridos y colesterol (P<0,05; Figura 4.B-D).
De esta forma, se evidenció la capacidad regulatoria de PPARα sobre la masa lipídica placentaria, evidente tanto en las placentas de pacientes sanas como de
pacientes diabéticas, sugiriéndose que los menores niveles
de este receptor nuclear identificados en las placentas de
pacientes diabéticas estarían involucrados en la mayor
acumulación de diferentes especies de lípidos placentarios.
Se continuó el estudio con el análisis de PPARd.
Al evaluar sus niveles, pudimos observar que los mismos no se modifican en el tejido placentario de pacientes
con diabetes en relación al control (Figura 5).
Al estudiar el efecto de agonistas de PPARd sobre las concentraciones lipídicas en placentas de pacientes sanas, observamos que la carbaprostaciclina (cPGI2),
análogo de PGI2 y activador de PPARd, fue capaz de reducir los niveles de fosfolípidos (P<0,01; Figura 6.A),
ésteres de colesterol (P<0,001; Figura 6.B) y colesterol (P<0,001; Figura 6.D), mientras que GW 501516,
agonista farmacológico de PPARd redujo los niveles de
ésteres de colesterol (P<0,01; Figura 6.B) y colesterol
(P<0,01; Figura 6.D).
En forma diferente, al estudiar el efecto de la
activación de PPARd en la placenta de pacientes diabéticas, observamos que cPGI2 y GW501516 no fueron capaces de modificar los niveles de ninguna de las especies
lipídicas estudiadas (Figura 7).
10
Figura 5. Niveles de PPARd. A) Western blot representativo
de los niveles de PPARδ en placentas de mujeres sanas y con
diabetes. B) Análisis densitométrico de los niveles de PPARδ en
placentas de mujeres sanas (control) y con diabetes. Los datos
representan la media ± S.E.M. n=8. Test estadístico: t-Student.
PREMIO PROF. DR. ABRAHAM GUITELMAN - Dra. Evangelina Capobianco
Trabajo Original
Figura 6. Concentraciones de lípidos en explantes placentarios de pacientes sanas, cultivados sin adiciones
o en presencia de cPGI2 (1 µM) o de GW 501516 (100 nM). Los lípidos evaluados son (A) fosfolípidos; (B) ésteres de
colesterol; (C) triglicéridos y (D) colesterol. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: ANOVA. **P<0,01; ***
P<0,001 vs. sin adiciones.
Figura 7. Concentraciones de lípidos en explantes placentarios de pacientes diabéticas, cultivados sin adiciones o en presencia de cPGI2 (1 µM) o de GW 501516 (100 nM). Los lípidos evaluados son (A) fosfolípidos; (B) ésteres
de colesterol; (C) triglicéridos y (D) colesterol. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: t-Student.
11
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
De esta forma, el estudio de PPARδ no demuestra alteraciones en sus niveles en la placenta de
pacientes diabéticas, sin embargo, los efectos lipolíticos
evidentes cuando dicho receptor nuclear se activa en la
placenta de pacientes sanas, no se evidencian en la placenta de pacientes diabéticas, alteración funcional que
podría estar involucrada en el mayor contenido lipídico
presente en la placenta de pacientes con diabetes.
Se continuó el estudio con el análisis de PPARg
en la placenta a término. El estudio de sus niveles reveló
que en placentas de pacientes con diabetes sus niveles
están disminuidos con respecto a los encontrados en placentas control (Figura 8).
Al estudiar el efecto de agonistas de PPARg sobre las concentraciones lipídicas en placentas de pacientes sanas, observamos que 15dPGJ2, agonista endógeno
de PPARg, aumenta los niveles de ésteres de colesterol, triglicéridos y colesterol (P<0,01; Figura 9.B-E),
mientras que la rosiglitazona, agonista farmacológico de
Figura 8. Niveles de PPARg. A) Western blot representativo
de los niveles de PPARg en placentas de mujeres sanas y con
diabetes. B) Análisis densitométrico de los niveles de PPARg en
placentas de mujeres sanas (control) y con diabetes. Los datos
representan la media ± S.E.M. n=8. Test estadístico: t-Student.
*P<0,05 vs. control.
Figura 9. Concentraciones de lípidos en explantes placentarios de pacientes sanas, cultivados sin adiciones
o en presencia de 15dPGJ2 (2 μM) o de rosiglitazona (3 μM). Los lípidos evaluados son (A) fosfolípidos; (B) ésteres de
colesterol; (C) triglicéridos y (D) colesterol. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: ANOVA. **P<0,01;
***P<0,001 vs. sin adiciones.
PPARg, aumentó los niveles de todos los lípidos evaluados (P<0,01; Figura 9).
Dada la capacidad de los agonistas de PPARγ
de incrementar los niveles de lípidos neutros y polares
en la placenta humana, evaluamos el efecto de su agonista endógeno 15dPGJ2 sobre la expresión de la enzima
sintasa de ácidos grasos FASN que, como su nombre lo
indica, participa en el proceso de lipogénesis y también
su efecto sobre el propio receptor nuclear PPARγ.
Observamos que en placentas de pacientes
sanas la expresión de FASN se incrementa al activar
PPARγ (P<0,05, Figura 10.A), mientras que no se modifica la expresión del propio receptor PPARγ al activar
este receptor nuclear (Figura 10.B).
Por otro lado, al evaluar la placenta de pacientes
diabéticas, observamos que las adiciones de 15dPGJ2, agonista endógeno de PPARγ, aumenta los niveles de ésteres
de colesterol (P<0,05; Figura 11.B) y rosiglitazona,
12
Figura 10. Expresión de (A) FASN y (B) PPARγ en explantes placentarios de pacientes sanas, cultivados
sin adiciones o en presencia de 15dPGJ2 (2 μM). Los
datos representan la media ± S.E.M. n=8. Test estadístico: tStudent. *P<0,05 vs. sin adiciones.
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Trabajo Original
Figura 11. Concentraciones de lípidos en explantes placentarios de pacientes diabéticas, cultivados sin adiciones o en presencia de 15dPGJ2 (2 μM) o rosiglitazona (3 μM). Los lípidos evaluados son (A) fosfolípidos; (B) ésteres
de colesterol; (C) triglicéridos y (D) colesterol. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: ANOVA. **P<0,01;
*** P<0,001 vs. sin adiciones.
agonista farmacológico de dicho receptor, incrementa los niveles de fosfolípidos y ésteres de colesterol
(P<0,01; Figura 11.A-B).
Considerando la capacidad de los agonistas de
PPARγ de incrementar los niveles de lípidos en las placentas de pacientes diabéticas, estudiamos el efecto de
su agonista endógeno 15dPGJ2 tanto sobre la expresión
de la enzima sintasa de ácidos grasos FASN como sobre
la expresión del receptor nuclear PPARγ. Observamos
que el agonista PPARγ estimuló la expresión de FASN
en placentas de pacientes diabéticas (P<0,05, Figura
12.A). Además, a diferencia de lo observado en placentas de pacientes sanas (control), 15dPGJ2 incrementó la
expresión de PPARγ en la placenta de las pacientes con
diabetes (P<0,05, Figura 12.B).
De esta forma, el estudio de PPARγ nos muestra los menores niveles de este isotipo de PPAR, y su
capacidad de regular mecanismos vinculados a la acreción de lípidos placentarios, de relevancia para su función regulatoria de la cantidad y clase de lípidos que se
transfieren al feto en desarrollo.
Por último, considerando la sobreacumulación
lipídica observada y el conocido estado prooxidante que
puede inducir la diabetes en la gestación (22,23), se evaluó la presencia de peroxidación lipídica en la placenta de
pacientes con diabetes tipo 2, como así también la posible
acción de agonistas de PPAR sobre la formación de lipoperóxidos, marcadores de estrés oxidativo e indicadores
de daño a lípidos bioactivos y con función estructural.
12. Expresión de (A) FASN y (B) PPARγ en explantes
placentarios de pacientes diabéticas, cultivados sin
adiciones o en presencia de 15dPGJ2 (2 μM). Los datos
representan la media ± S.E.M. n=8. Test estadístico: t-Student.
*P<0,05 vs. sin adiciones.
La peroxidación lipídica ha sido evaluada cuantificando las especies reactivas al ácido tiobarbitúrico
(TBARS). Se observó que los niveles de TBARS se
encuentran incrementados al compararlos con el tejido
control (P<0,001; Figura 13).
13
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Para analizar la posible acción de agonistas de
PPAR en la regulación de la formación de lipoperóxidos,
los explantes placentarios de pacientes sanas y pacientes con diabetes fueron cultivados en presencia o ausencia de LTB4 (1 μM) o clofibrato (20 μM), agonistas de
PPARα; PGI2 (1 μM) o GW 501516 (100 nM), agonistas
de PPARd; y 15dPGJ2 (2 µM) o rosiglitazona (3 µM) agonistas de PPARg.
Al estudiar los efectos de agonistas de PPARα
sobre los niveles de lipoperóxidos observamos que su
agonista endógeno LTB4, no modificó los niveles de lipoperóxidos en placentas de pacientes controles (Figura 14.A), pero fue capaz de reducir dichos niveles en
placentas de pacientes con diabetes (P<0,05; Figura
14.B). El clofibrato, agonista farmacológico de PPARα,
no fue capaz de modificar los niveles de lipoperóxidos
en ninguno de los dos grupos (Figura 14).
El estudio del efecto de agonistas de PPARd reveló que tanto su agonista endógeno, la cPGI2, como su
agonista farmacológico, el GW 501516 fueron capaces
de reducir los niveles de lipoperóxidos en placentas de
pacientes sanas (P<0,01; Figura 15.A). En cambio, en
placentas de pacientes con diabetes, sólo la cPGI2 fue
capaz de reducir los niveles de lipoperóxidos (P<0,05;
Figura 15.B).
La adición de 15dPGJ2 redujo los niveles de
TBARS en placentas de pacientes sanas (P<0,01; Figura
16.A) y diabéticas (P<0,05; Figura 16.B). La adición del
agonista farmacológico de PPARg, rosiglitazona, sólo fue
capaz de disminuir los niveles de TBARS en placentas de
pacientes diabéticas (P<0,01; Figura 16.B).
Sobre la base de estos resultados, es importante destacar que en placentas de pacientes diabéticas la
deficiencia en los niveles de PPARα y PPARγ podría
contribuir a la inducción del estado prooxidante que se
pone de manifiesto en esta patología.
Discusión
Los resultados obtenidos han permitido identificar alteraciones del metabolismo lipídico y en la lipoperoxidación en la placenta de gestantes con diabetes
tipo 2. Además, permitieron establecer la relevancia del
sistema PPAR como regulador de procesos metabólicos
y prooxidantes en la placenta humana, y determinar que
las alteraciones en este sistema podrían vincularse con
fallas de regulación metabólica en la placenta de pacientes con diabetes tipo 2.
Si bien estudios previos han caracterizado el estado proinflamatorio en la placenta de gestantes con diabetes
tipo 1 y gestacional (22), poco se conoce de la DM2 en la
gestación, patología cuya prevalencia aumenta día a día,
debido a su aparición en edades más tempranas y al aumento de la edad en la cual las mujeres planean un embarazo.
14
Figura 13. Niveles de TBARS en placentas de pacientes sanas y pacientes diabéticas a término. Los datos
representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: t-Student.
***P<0,001 vs. control.
Figura 14. Efecto de LTB4 (1 μM) y clofibrato (20 μM),
agonistas de PPARα, sobre los niveles de lipoperóxidos en placentas a término de (A) pacientes sanas
(control) y (B) pacientes diabéticas. Los datos representan
la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: ANOVA. # P<0,05
vs. diabéticas.
Los resultados indican que acompañando al
incremento de peso placentario y fetal, se evidencia en
las placentas de mujeres con diabetes tipo 2, una mayor
acumulación lipídica, acompañada de una mayor lipoperoxidación (indicando estrés oxidativo). Estas alteraciones posiblemente estén vinculadas con el incremento
en el peso tanto placentario como fetal, ya que la placenta es el órgano donde se regula el transporte de nutrientes hacia el feto, y tanto la sobreacumulación de lípidos como el anómalo entorno generado por las mayores
concentraciones de especies reactivas de oxígeno, podrán
condicionar un estado donde a la mayor concentración de
PREMIO PROF. DR. ABRAHAM GUITELMAN - Dra. Evangelina Capobianco
Trabajo Original
FIGURA 15. Efecto de cPGI2 (1μM) y GW 501516
(100nM), agonistas de PPARd, sobre los niveles de
lipoperóxidos en placentas a término de (A) pacientes sanas (control) y (B) pacientes diabéticas. Los datos
representan la media ± S.E.M. n=12. **p<0,01, ***p<0,001
vs. control; Test estadístico: ANOVA. # P<0,05 vs. diabéticas.
Figura 16. Efecto de 15dPGJ2 (2 μM) y rosiglitazona
(3 μM), agonistas de PPARg, sobre los niveles de lipoperóxidos en placentas a término de (A) pacientes
sanas (control), y (B) pacientes diabéticas. Los datos representan la media ± S.E.M. n=12. Test estadístico: ANOVA.
*P<0,05 vs. control; ##P<0,01, ###P<0,001 vs. diabéticas.
sustratos derivados de circulación materna, se sume la
falta de control adecuado a nivel placentario de los nutrientes a ser transferidos al feto en desarrollo.
Se han demostrado fallas en los sistemas regulatorios, posiblemente evidentes en diferentes vías de
señalización vinculadas al crecimiento y desarrollo fetoplacentario, en este estudio en el análisis de los niveles y
función de los receptores nucleares PPAR. Estos factores
de transcripción activados por ligandos, claramente relevantes en procesos de diferenciación celular, homeostasis lipídica y desarrollo (8,24), han mostrado en este
estudio ser importantes reguladores de la masa lipídica
placentaria y la lipoperoxidación en la placenta humana
a término.
Estudios previos habían identificado anomalías
en la expresión de PPARα y PPARγ, sin evidenciar fallas
en la expresión de PPARδ, en la placenta de pacientes
con diabetes gestacional (25,26). En forma diferente, no
se evidencian alteraciones en los niveles de PPARγ en
la placenta de pacientes con diabetes tipo 1 (25). Este
estudio revela que en forma semejante a lo observado en
la placenta con diabetes gestacional, existen anomalías
en la expresión de PPARα y PPARγ, y no en la expresión de PPARδ en la placenta a término de pacientes con
diabetes tipo 2.
Resultados interesantes surgen del análisis de la
funcionalidad de los tres isotipos de PPAR.
Observamos que PPARα regula en la placenta humana a término los niveles de diferentes especies
lipídicas, y que su acción es diferencial al utilizar activadores endógenos y farmacológicos, tal como se ha
demostrado en diferentes estudios previos en diferentes
tejidos (11). Su activación es efectiva y capaz de regular
en la placenta de pacientes con diabetes la masa lipídica
y la peroxidación lipídica. Estos hallazgos nos indican
que tal como fue previamente observado en modelos experimentales de diabetes, su activación podría ser eficaz
en la regulación de alteraciones placentarias inducidas
por la diabetes materna, y quizás, tal como se estudió
en modelos animales, podría ejercer efectos benéficos
a nivel fetal (14,27,28). Se destaca de esta forma que
la activación de PPARα es relevante en la regulación
de anomalías del metabolismo lipídico y del entorno
prooxidante en la placenta de pacientes con diabetes
tipo 2, y que los niveles endógenos de este receptor nuclear se encuentran reducidos en la diabetes materna.
A diferencia de lo observado para PPARα, el
isotipo PPARδ no presenta anomalías en su expresión en
el tejido placentario de pacientes con diabetes tipo 2 en
relación con el control, sin embargo, los estudios efectuados evidencian que la regulación de tipo catabólica
de los niveles de lípidos placentarios no se efectúa en el
tejido diabético tal como ocurre en el tejido de pacientes
sanos, alteración que podría contribuir a la mayor masa
lipídica en el tejido diabético. Además, la activación de
este isotipo del receptor conduce a la reducción de la
peroxidación lipídica tanto en el tejido sano como en el
proveniente de pacientes diabéticos. De esta forma, si
15
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
bien la activación de PPARδ no tendría efectos regulatorios del metabolismo lipídico placentario cuando
el tejido proviene de pacientes con diabetes tipo 2, se
evidencia en la placenta de las gestantes diabéticas estudiadas efectos benéficos vinculados a la reducción de
la peroxidación lipídica, posiblemente relevantes para
el desarrollo y la función del tejido placentario.
Por último, en este estudio hemos encontrado
que la activación de PPARγ en las placentas de pacientes
diabéticas incrementa la masa lipídica placentaria. Este
efecto había sido previamente observado en la placenta
de animales sanos y diabéticos, y en trofoblastos aislados de placentas humanas sanas a término (14,29). Este
efecto podría estar vinculado a la acción de agonistas de
PPAR sobre la expresión de FASN, enzima de síntesis de
ácidos grasos. Se destaca que se evidenció un incremento en la expresión de PPARγ en la placenta de pacientes diabéticas en presencia de agonistas de este receptor
nuclear, lo que nos marca la capacidad de retroalimentación positiva de estos agonistas, de relevancia ante la
reducción de este receptor nuclear evidenciado en la placenta de mujeres con diabetes.
En cuanto a marcadores de estrés oxidativo, observamos que la peroxidación lipídica se encuentra negativamente regulada por la activación de PPARγ tanto en la
placenta de mujeres sanas como en aquellas provenientes
de mujeres con diabetes tipo 2. Nuevamente, este efecto
es relevante ya que mejoraría la funcionalidad placentaria
y, en consecuencia, la clase y tipo de nutrientes transferidos y las moléculas señal producidas, involucrados en el
crecimiento y desarrollo del feto. De esta forma, la activación de PPARγ sería relevante mayormente por su capacidad de regular negativamente la sobreproducción de
especies reactivas de oxígeno en la placenta de mujeres
con diabetes tipo 2, y sus menores niveles podrían estar
vinculados a las anomalías de tipo prooxidantes evidentes en el tejido placentario en esta patología.
Conclusiones
Los hallazgos de este estudio demuestran importantes anomalías en el metabolismo de lípidos y la
presencia de un estado prooxidante en la placenta de pacientes con diabetes tipo 2, anomalías que se acompañan
de diferentes alteraciones en la expresión y función de
los receptores nucleares PPAR, particulares para cada
isotipo, y que condicionarían la función placentaria y, en
consecuencia, el desarrollo fetal. La importante función
metabólica y reguladora de parámetros prooxidantes
ejercidas por los agonistas de PPAR que ha sido identificada en la placenta humana a término de pacientes
sanas y diabéticas nos brinda un aporte básico necesario para comprender mecanismos reguladores del anómalo entorno metabólico y proinflamatorio que induce
16
la diabetes tipo 2 materna en forma intrauterina, base
para el diseño de estrategias terapéuticas necesarias
para prevenir estas anomalías y sus adversas consecuencias en la vida del neonato.
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17
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Actualizaciones
¿El reconocimiento alogénico debe bloquearse
para lograr un embarazo exitoso?
Should the alloantigen recognition be blocked to reach a successful pregnancy?
Lic. Esteban Grasso, Lic. Laura Fraccaroli, Lic. Vanesa Hauk, Lucila Gallino, Guillermina Calo,
Dra. Claudia Pérez Leirós y Dra. Rosanna Ramhorst
Laboratorio de Inmunofarmacología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
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Resumen
Desde el punto de vista inmunológico, el desarrollo del embarazo normal comprende tres fases asociadas a procesos biológicos distintos. La primera etapa se
caracteriza por el predominio de una respuesta proinflamatoria que facilita la implantación embrionaria. Este
proceso involucra, entre otros eventos, la ruptura del
epitelio uterino, la invasión del endometrio y la remodelación de los vasos maternos que sostendrán la nueva
demanda de oxígeno y nutrientes.
La segunda fase inmunológica abarca aproximadamente desde el final del primer trimestre hasta
pocas semanas antes del parto y es un período de crecimiento y desarrollo fetal caracterizado por un microambiente antiinflamatorio y tolerogénico. En la última etapa, nuevamente se genera una respuesta proinflamatoria
asociada al desencadenamiento del parto. Estos cambios
en la respuesta inmunológica materna durante el embarazo están controlados por distintas poblaciones celulares
y mediadores que forman una red interdependiente. En
este sentido, los linfocitos T regulatorios desempeñan un
rol clave para permitir, por un lado, la implantación del
embrión y la invasión de la placenta, y por el otro, evitar
la generación de una respuesta materna potencialmente
dañina. En el presente trabajo describiremos cómo el reconocimiento de antígenos paternos y trofoblásticos por
parte de la madre contribuye a la inducción de linfocitos T regulatorios, así como los antígenos maternos no
heredados por el feto inducen linfocitos T regulatorios
fetales. Por último, discutiremos algunas patologías del
embarazo asociadas a la falla de los mencionados mecanismos.
Palabras clave: tolerancia materna, aloantígenos, células T regulatorias, respuesta inmune materna.
Abstract
From an immunological point of view, the development of normal pregnancy involves three phases
which are associated with different biological processes.
18
The first stage is characterized by the predominance of
pro-inflammatory response which makes it easier for the
embryo to implant. This process involves, among other
events, the rupture of the uterine epithelium, invasion of
the endometrium and remodelling of the maternal vessels that will support the new demand for oxygen and
nutrients. The second immunological stage covers the
period that extends from the end of the first quarter to a
few weeks before delivery approximately, and constitutes
a period of fetal growth and development characterized
by an anti-inflammatory and tolerogenic microenvironment. During the last stage, once again a new pro-inflammatory response associated with the delivery triggering
is generated. These changes in maternal immunological
response during pregnancy are controlled by different
cell populations and mediators that form an interdependent network. In this direction, regulatory T cells play
a key role to enable, on the one hand the implantation
of the embryo and the invasion of the placenta and on
the other, to avoid the generation of potentially harmful maternal response. In this study we will describe how
recognition by the mother of paternal and trophoblastic
antigens contributes to the induction of regulatory T cells
as well as how maternal antigens not inherited by the
fetus induce fetal regulatory T cells. Finally, we will discuss some pregnancy-related pathology associated to the
failure of the mechanisms mentioned above.
Key words: maternal tolerance, aloantigens, regulatory
T cell, maternal immune response.
El desafío inmune del embarazo
Durante el embarazo, el feto está en continuo
contacto con el sistema inmune materno, y a pesar de
que expresa proteínas distintas a las de la madre, el sistema inmune materno lo tolera.
En la década de los 80, se arraigó erróneamente
la hipótesis de que el feto se comporta como un semiinjerto y por ello, la madre genera una respuesta de rechazo, la cual debe ser bloqueada para lograr un embarazo
Contribución de los aloantígenos al éxito del embarazo - Lic. Esteban Grasso
Actualización
exitoso. Este concepto fue presentado por primera vez
en 1953, por Sir Medawar y Billingham, basados en observaciones realizadas entre cruzas de ratones de distintas cepas, en las cuales observaban una potente respuesta
de rechazo luego del trasplante de explantos de piel entre
éstas (1).
Más tardíamente, Peter Doherty y Rolf Zinkernagel describieron las responsables de esta respuesta de
rechazo, las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), en el hombre llamado sistema
HLA (human leukocyte antigen, antígeno leucocitario
humano). Así, describieron las “reglas de la restricción
y la función de moléculas CMH”, que les valió el premio
Nobel de Fisiología y Medicina en 1996 (2).
Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH)
Básicamente las moléculas HLA se clasifican
en tres clases; las de clase I y las de clase II se relacionan
directamente con las respuestas de rechazo entre individuos no relacionados.
Mientras que las HLA de clase I, más precisamente los productos clásicos (HLA-A, HLA-B, HLAC), se expresan en la membrana de todas las células
nucleadas y están involucrados en la presentación antigénica de péptidos endógenos y de proteínas extrañas,
los productos no clásicos (HLA-E, HLA-F, HLA-G) se
expresan solo en algunas poblaciones celulares y presentan funciones más específicas (3).
Una de las características de estas moléculas es
que se expresan de forma codominante, es decir, el feto
expresa tanto las moléculas de origen materno como paterno. Por lo tanto, desde el punto de vista materno, las
moléculas HLA paternas se comportan como aloantígenos: si bien todas las moléculas HLA presentan una estructura semejante, difieren en su composición genética lo
suficiente para ser reconocidas por el sistema inmune materno como moléculas extrañas. Asimismo, no todas las
moléculas HLA maternas son heredadas por el feto, por lo
cual, aquellas que no hayan sido heredadas serán aloantígenos desde el punto de vista del feto (Figura 1) (4).
De esto se desprende que el sistema inmune de
la madre puede reconocer y potencialmente atacar las células del feto que expresan estos aloantígenos de origen
paterno. Este ataque conduciría al rechazo del feto y la
pérdida del embarazo y, por lo tanto, si esto sucediera, el
sistema inmune sería incompatible con la reproducción.
Es importante notar que si bien los aloantígenos
constituirían los principales disparadores de la respuesta
inmune materna, también participarían otros antígenos
paternos o expresados por las mismas células trofoblásticas capaces de despertar en la madre una respuesta inmune innata que luego condicionará la respuesta adaptativa.
Durante los últimos 10 años, gracias a la investigación científica, se ha progresado mucho en la comprensión de los mecanismos que permiten la supervivencia del feto.
En primer lugar, se describió que las células
trofoblásticas expresan atípicamente las moléculas HLA
como estrategia para evitar el reconocimiento del sistema
inmune materno (5). El sinciciotrofoblasto, la capa más
externa de origen fetal y que está en contacto con la sangre
materna, no expresa moléculas HLA de clase I. Además,
la capa celular más interna, el citotrofoblasto extraviloso,
solo expresa la molécula clásica HLA-C y las moléculas
no clásicas HLA-E y HLA-G, las cuales están asociadas
con la inhibición de la citotoxicidad y la neovascularización en la interfase materno-placentaria (5).
Figura 1. Reconocimiento alogénico materno-fetal.
La madre reconoce aloantígenos paternos presentes en el feto
mientras que el feto reconoce los aloantígenos maternos no heredados.
Fases inmunológicas del embarazo
Actualmente, desde el punto de vista inmunológico, podemos identificar en el embarazo tres fases
diferentes: la fase temprana, la media y la tardía, caracterizadas por procesos biológicos y perfiles de respuesta
inmune y mediadores particulares de cada fase (6).
La fase temprana se caracteriza por un perfil
proinflamatorio. En esta etapa, el embrión debe implantarse en el útero (invasión del trofoblasto) dañando el
epitelio, la matriz endometrial y la capa endotelial de los
vasos sanguíneos, con el objetivo de alcanzar la vasculatura materna, asegurándose de esta forma un buen suministro de nutrientes, oxígeno y la correcta eliminación
de desechos tóxicos. Este microambiente inflamatorio,
provocado por la producción de diferentes mediadores,
19
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
también debe asegurar la reparación y remoción de células dañadas o muertas durante esta etapa. La segunda
fase se caracteriza por la inducción de un estado antiinflamatorio/tolerogénico, en el cual un correcto control
de las interacciones inmunes y endocrinas, asegura el
crecimiento y desarrollo fetal. En la última fase, nuevamente se produce un ambiente proinflamatorio que promueve la contracción del útero y la expulsión del bebé y
la placenta (Figura 2) (7).
Esto nos demuestra que en condiciones normales
de gestación existe una fina regulación de la respuesta inmune, tanto a nivel local como sistémico, que acompaña
los mencionados cambios de la respuesta inmune. Cuando existen fallas en esta regulación, sobrevienen distintas
patologías dependiendo del momento del embarazo en el
que ocurre la falla, tales como el aborto recurrente espontáneo de causa inmunológica, preeclampsia, fallas reiteradas en la implantación embrionaria, etc. (8).
Hasta el momento se ha descripto la participación de distintas poblaciones celulares en el control de la
respuesta inflamatoria inicial y el posterior cambio a una
respuesta tolerogénica o antiinflamatoria: los macrófagos deciduales, las células natural killer uterinas, las células dendríticas y los linfocitos T regulatorios (Tregs)
(9,10). Todas estas poblaciones contribuirán a mantener
un perfil tolerogénico materno a través de distintas estrategias. En este artículo, enfocaremos particularmente el
rol de los linfocitos T regulatorios en la respuesta inmune contra aloantígenos.
Los linfocitos T regulatorios
Los linfocitos T regulatorios (Tregs) son una
subpoblación de linfocitos T conocidos por su capacidad de suprimir la respuesta inmune a través de la limitación de su alcance y duración. Poseen marcadores
fenotípicos característicos de superficie (los receptores
CD4 y CD25) e intracelulares (el factor de transcripción
FoxP3). Esta subpoblación ha sido estudiada amplia-
mente por su participación en gran cantidad de enfermedades autoinmunes, y en los últimos años se ha estudiado en detalle su papel en la tolerancia materno-fetal,
donde se postula que cumplirían un rol clave (11).
Según el origen de las células Tregs, las podemos clasificar dentro de dos categorías básicas: las
Tregs naturales (nTregs) y las Tregs inducidas (iTregs).
Las nTregs se originan en el timo, en la selección tímica durante la maduración de los linfocitos T, basado
en su capacidad de reconocer autoantígenos. En cambio,
las iTregs surgen a partir de linfocitos T vírgenes que
reconocen su antígeno-específico en un microambiente
inmunosupresor, en presencia de las moléculas factor
de crecimiento tumoral beta (TGF-β) e interleuquina 10
(IL-10) (12).
Independientemente de su origen, la acción
inmunosupresora de las Tregs se manifiesta al reconocer su antígeno específico pero, una vez activada, es
capaz de ejercerla sobre todas las células inmunes del
microambiente donde se encuentra. Por otra parte, debido a su origen, las nTregs solo serán capaces de suprimir respuestas contra antígenos propios, mientras
que las iTregs también serán capaces de suprimir respuestas contra antígenos extraños (13). En el endometrio, las nTregs se modulan durante el ciclo menstrual
por las hormonas sexuales, en preparación para la posible implantación del trofoblasto. En mujeres fértiles,
las nTregs se expanden en la fase tardía folicular y su
frecuencia se correlaciona con altos niveles de estradiol,
para luego disminuir en la fase lútea (14).
En el contexto del embarazo, este concepto
puede traducirse en que las nTregs modularían la respuesta inmune contra los antígenos fetales heredados de
la madre, mientras que las iTregs modularían la respuesta frente a aloantígenos fetales de origen paterno.
Las iTregs se originan en los ganglios drenantes de la interfase materno-fetal a partir de linfocitos T
vírgenes que reconocen a aloantígenos en un contexto
tolerogénico (11). Dependiendo del origen de los lin-
Figura 2. Fases inmunológicas del embarazo. Inicialmente una respuesta proinflamatoria durante la implantación permite
la invasión de células trofoblásticas. Luego una respuesta antiinflamatoria asegura el crecimiento y desarrollo del feto. Por último,
un cambio hacia una respuesta proinflamatoria se asocia al parto.
20
Contribución de los aloantígenos al éxito del embarazo - Lic. Esteban Grasso
Actualización
focitos T y de los aloantígenos que estos reconocen, las
iTregs pueden tener dos orígenes: linfocitos T maternos,
que reconocen aloantígenos paternos expresados en las
células trofoblásticas, y linfocitos T fetales, que reconocen aloantígenos maternos no heredados (Figura 3) (15).
mismo, las células trofoblásticas secretan quimioquinas
(citoquinas con capacidad para atraer distintas poblaciones celulares inmunes), que reclutan las iTregs originadas por contactos previos, así como también a nTregs
maternas con alta capacidad supresora (19).
Generación de iTregs maternas hacia aloantígenos paternos
La exposición de los linfocitos T maternos a los
aloantígenos paternos se produce principalmente en dos etapas: un contacto inicial durante el coito dado por las células
en el fluido seminal, y luego un segundo contacto dado por
las células trofoblásticas al invadir el endometrio (16).
El semen contiene varios antígenos HLA de
clase I (clásicos y no clásicos) y de clase II, asociados
al esperma, leucocitos seminales o a células epiteliales
descamadas (17). Estos conducen a la activación y proliferación de linfocitos T maternos. El líquido seminal
contiene, además, TGF-β y prostaglandina E2 (PGE2),
que crean un microambiente antiinflamatorio propicio
para la diferenciación de linfocitos T vírgenes a iTregs
(18). Estos aloantígenos paternos son capturados por
células dendríticas que luego migran a los ganglios linfáticos donde los presentan a linfocitos T vírgenes. Al
reconocer su antígeno específico en un contexto tolerogénico, los linfocitos T se diferencian a iTregs (Figura
4). De esta manera, el semen contribuiría a la generación
y el mantenimiento de una población de iTregs antígeno-específicas contra los aloantígenos paternos previo a
la implantación del embrión (17).
Las células trofoblásticas expresan aloantígenos
de origen paterno que son reconocidos por los linfocitos
T maternos como extraños, en un ambiente tolerogénico.
Esto conduce a la activación y diferenciación de estos
linfocitos a iTregs de la misma forma que ocurre ante los
aloantígenos paternos presentes en el semen (14). Asi-
Generación de iTregs fetales hacia aloantígenos maternos no heredados
Desde el punto de vista del feto, las células maternas presentan una serie de aloantígenos que no fueron
heredados y, por lo tanto, le son extraños (21). A partir
de la semana 10 de gestación ya se pueden detectar células inmunes fetales y evidencias recientes muestran que,
en la semana 20 de embarazo, el sistema inmune del feto
ya es maduro, activo y capaz de generar una respuesta
inmune contra antígenos extraños. Sin embargo, en esta
etapa, el sistema inmune del feto está principalmente
orientado a generar una respuesta tolerogénica, a través
de la generación de iTregs fetales (22).
Recientemente se ha propuesto que durante el
embarazo, las células inmunes fetales migran a la placenta donde se encuentran con células maternas que expresan
aloantígenos no heredados. Estas células se activan y migran al ganglio linfático fetal donde activan los linfocitos
T fetales y, debido al ambiente altamente tolerogénico y
supresor donde esto ocurre, los diferencian a iTregs fetales. Luego, las iTregs fetales migran a la placenta donde
suprimen la respuesta inmune fetal hacia los aloantígenos
maternos no heredados (Figura 5) (21). Por otra parte,
evidencias recientes indican que los linfocitos T maternos son capaces de migrar hacia los nódulos linfáticos del
feto, y allí estimular la activación y diferenciación de los
linfocitos fetales vírgenes a iTregs (23).
Figura 3. Reconocimiento de aloantígenos por linfocitos T. Los linfocitos T maternos reconocen aloantígenos paternos expresados en las células trofoblásticas mientras que los linfocitos T fetales reconocen aloantígenos maternos no heredados
expresados en la decidua.
Figura 4. Generación de iTregs maternas. Antígenos
procedentes del fluido seminal o de las células trofoblásticas son
capturados y procesados por células dendríticas (CD) tolerogénicas. Estas migran a los ganglios linfáticos drenantes del útero
donde presentan su antígeno tanto a Tregs como a linfocitos T
vírgenes, diferenciando estos últimos a iTregs. Las Tregs luego
son reclutadas por el trofoblasto al sitio de implantación donde
suprimirán la respuesta potencialmente deletérea de linfocitos T
efectores. Figura adaptada de Guerin y cols., 2009 (20).
21
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
La relevancia de la generación de las iTregs fetales se ve reflejada en el hecho de que el número de niños
con una mutación totalmente nula de FoxP3, el factor de
transcripción indispensable para la generación de Tregs,
es prácticamente cero. Se postula que, posiblemente al
no regularse la respuesta inmune fetal, ésta dañaría la
placenta y, por tanto, al suministro de oxígeno y nutrientes, lo que genera que el embarazo sea inviable (15).
Conclusiones
De la idea original de que el sistema inmune
no debía reconocer como extraño al feto para que este
sobreviviera, se ha pasado a una hipótesis donde el reconocimiento de los aloantígenos fetales por parte de la
madre y de los aloantígenos maternos no heredados por
parte del feto es crucial para la generación de una respuesta inmune que permita la implantación del embrión
y la invasión de la placenta, y al mismo tiempo sea lo
suficientemente controlada para evitar el rechazo. Tanto
la falta de reconocimiento de los aloantígenos como la
incapacidad de controlar la respuesta inmune hacia ellos
por parte de la madre y/o del feto son causas inmunológicas de problemas en el embarazo.
Por otra parte, del concepto de la “placenta
como una barrera pasiva” pasamos a la “placenta como
un órgano inmune altamente activo en la generación de
la inmunotolerancia”. Asimismo, hoy en día se sabe que
el feto tampoco tiene un rol pasivo, sino que presenta
un sistema inmune maduro y participa activamente en la
generación de células inmunes regulatorias.
Desde la ciencia básica se nos plantea entonces,
como desafío para los próximos años, el estudio de los
mecanismos implicados en la interacción entre el sistema inmune materno, fetal y la placenta involucrados en
la generación de tolerancia, con el objetivo de desarro-
Figura 5. Generación de iTregs fetales. Células dendríticas fetales capturan aloantígenos maternos no heredados e inducen la diferenciación en el ganglio regional de células iTregs
fetales. Luego, las iTregs fetales migran a la placenta donde
suprimen la respuesta inmune fetal hacia los aloantígenos maternos no heredados.
22
llar nuevas técnicas de diagnóstico y posibles tratamientos médicos.
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2009;360:1355-1357.
Actualización
Epigenética: el futuro es hoy
Epigenetics: the future is today
Dr. David Fusaro1 y Dr. Mariano Grilli2
Médico Ginecólogo, Director Médico del Instituto Ginecológico Buenos Aires
Especialista Consultor en Climaterio, Fellow ACOG, [email protected]
2
Doctor en Medicina UNLP. Jefe de Clínica, Cátedra B de Ginecología, Facultad de Ciencias Médicas UNLP. Director
Científico del Instituto de Ginecología de Mar del Plata.
E-mal: [email protected]; [email protected]
1
Resumen
La genética recorrió un largo y exitoso camino.
Sin embargo, a pesar de los extraordinarios avances, no
puede explicar por sí sola la diversidad de fenotipos que
existen en una población, ni puede revelar por qué idénticas secuencias de ADN en gemelos homocigotas o animales clonados tienen diferentes fenotipos y diferentes
susceptibilidades a diversas enfermedades.
Surge entonces la epigenética, que consiste en
el estudio de los cambios o modificaciones del código
genético humano que se realizan sin ser controlados por
la secuencia original del ADN.
La epigenética está reavivando la confrontación
de las dos grandes teorías biológicas: Darwin versus Lamarck, genoma versus medioambiente, destinada a descifrar la programación del genoma bajo la influencia del
ambiente.
Sin lugar a dudas el futuro inmediato nos encontrará vinculándonos con una epigenética ubicada en
el epicentro de la tocoginecología posmoderna.
Palabras clave: epigenética, genoma humano,
medioambiente.
Abstract
Genetics has made a long and successful way.
However, despite enormous advances, can not explain
by itself, the diversity of phenotypes that exists in a population, nor reveal identical DNA sequences in homozygous twins or cloned animals that have different phenotypes and susceptibilities to various diseases.
Epigenetic then arises, as the study of changes
or modifications of the human genetic code performed
without being controlled by the original sequence of DNA.
Epigenetics is reviving the confrontation between the two major biological theories: Lamarck versus
Darwin, genome versus environment; aiming to decode
the programming of the genome under the environment
influence.
Undoubtedly the immediate future will find us
linked with epigenetics, placed it in the epicenter of the
post-modern gynecology.
Keywords: epigenetics, the human genome, environment.
Introducción
La genética es la rama de las ciencias biológicas
que investiga cómo comprender la herencia biológica
que se transmite de generación en generación.
William Bateson, gran defensor del trabajo de
Mendel, acuñó la palabra genética en 1905, que, deriva
de la palabra griega génesis (‹γενεσις),
‘origen’, y fue
´
utilizada por primera vez en un sentido biológico en 1860,
obteniendo el significado de descendencia. La genética
23
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
estudia los genes y nos ayuda a comprender la replicación celular y cómo en los seres vivos se transmiten
características biológicas por el genotipo, contenido del
genoma específico de un individuo en forma de ADN,
que a su vez controla la estructura y el funcionamiento
de cada célula con la capacidad de crear copias exactas
de sí misma (1,2).
Bateson popularizó el uso de la palabra “genética” para describir el estudio de la herencia en su discurso inaugural de la Tercera Conferencia Internacional
sobre la hibridación de plantas en Londres, Inglaterra,
en 1906 (2).
La genética recorrió un largo y exitoso camino desde las primeras apreciaciones del monje Gregor
Mendel en 1865, luego Tatum y Beadle que en 1941 describen los genes (ARNm) que codifican las proteínas y
más tarde, en 1953, Watson y Crick determinan que la
estructura del ADN es una doble hélice de direcciones
antiparalelas (3).
A comienzos del siglo XX la genética era considerada la ciencia de la herencia y la embriología, la del
desarrollo. Waddington trató de demostrar que ambas
disciplinas estaban estrechamente ligadas entre sí y con
la evolución, de manera que la explicación del desarrollo
desde el genotipo al fenotipo tendría que necesariamente
integrar el conocimiento de ambas ciencias (4).
En los últimos años de la década de los 70, Sanger, Gilbert y Maxam secuencian el ADN completo del
genoma del bacteriófago, un virus que infecta exclusivamente a bacterias (5), y en 1990 se funda el Proyecto
Genoma Humano (6).
Bajo la dirección de James Watson, con un presupuesto de 90.000 millones de dólares y con un plazo de 15 años se inició el proyecto y dos años antes de
lo esperado, en 2003, se presentó finalmente a toda la
comunidad el genoma completo (http://www.genome.
gov/11510908). El genoma humano es la secuencia de
ADN de un ser humano, conformado por los 23 pares
de cromosomas (22 pares de autosomas y 1 par de cromosomas sexuales) y a su vez contiene entre 25.000 y
30.000 genes distintos. El genoma humano es absolutamente único excepto en los gemelos homocigotas y los
organismos clonados (7).
Ahora bien, a pesar de los extraordinarios avances, la genética clásica por sí sola no puede explicar la
diversidad de fenotipos que existen en una población, ni
tampoco puede revelar por qué idénticas secuencias de
ADN en gemelos homocigotas o animales clonados tienen diferentes fenotipos y diferentes susceptibilidades a
diversas enfermedades.
Surge entonces la era de la epigenética, área
clave de investigación que combina la genética y el
medioambiente para direccionar sistemas biológicos
24
complejos. Concretamente consiste en el estudio de
los cambios o modificaciones del código genético humano que se realizan sin ser controlados por la secuencia original del ADN. Los fenómenos epigenéticos
desempeñan un importante papel en el desarrollo y la
evolución, e incluyen las modificaciones de las histonas
y la metilación del ADN y que el fenotipo o propiedades
morfológicas y funcionales de un organismo está definido por la programación del genoma bajo la influencia
del ambiente (8).
El término epigenética fue concebido por C.
Waddington en 1939 y está provocando que se reavive
la confrontación de las dos grandes teorías biológicas:
Darwin versus Lamarck (8,9).
Charles Darwin (1809-1882), con su teoría de
la selección natural de las especies, implica una separación del organismo del medioambiente. Previamente,
Jean Baptiste Lamarck (1744-1829) expresó su teoría
sobre las transformaciones de un organismo a través de
su propia interacción con el medioambiente. Durante
muchos años prevaleció la teoría Darwiniana, pero quizás a la luz de los nuevos hallazgos de la epigenética, la
teoría Lamarckiana sería mucho más cercana a la realidad (10-12).
Así como surgió el proyecto Genoma Humano,
se está desarrollando el proyecto Epigenoma Humano, a
través de un consorcio que incluye Wellcome Trust Sanger
Institute en Reino Unido, Epigenomics AG, en Alemania,
y el Centre National de Génotypage en Francia (13).
Hoy se está complementando lo genético con lo
epigenético. De qué se está hablando ahora, lo sintetizan
las siguientes definiciones conceptuales (14,15):
Genoma: es el set completo de ácido desoxirribonucleico (ADN) de la célula, que posee todas las
instrucciones para la construcción de las proteínas que
harán que cada ser vivo sea único.
Epigenoma: “por arriba” del genoma. Consiste en componentes químicos que modifican o marcan
al genoma durante su camino. Estas marcas que no son
parte del ADN pueden pasar de célula en célula mientras
esta se divide y puede pasar de una generación a otra. El
epigenoma funciona como un puente entre el genoma,
estático e inflexible y el ambiente que rodea al individuo, altamente variable y dinámico.
Ambioma: relación entre la genética, el ambiente y las experiencias propias. Cada ser humano es
producto de su genoma único, pero quizás en mayor medida, producto de las experiencias únicas de “su mundo”, es decir, el conjunto de sus experiencias que hacen
de ese ser humano un ser irrepetible.
Epigenética: es el estudio de los cambios en
la función de los genes que son heredables por mitosis
y meiosis, pero que no conlleva una modificación de la
Epigenética - Dr. David Fusaro
Actualización
secuencia del ADN y que pueden ser reversibles, es decir, variabilidad genética sin cambios en la secuencia de
nucleótidos.
Procesos epigenéticos: son las modificaciones
que contribuyen a activar o inhibir los procesos de transcripción, afectando así el grado de expresión del ARN
mensajero, lo que puede influir en el desarrollo de patologías.
Mecanismos epigenéticos: son aquellos por
los cuales se controla la expresión de los genes a nivel
molecular.
En la iniciación y mantenimiento de las modificaciones epigenéticas están implicados en principio
cuatro mecanismos (4, 15-21):
1. Metilación del ADN: adición de un grupo metilo
(CH3) en posición 5 al nucleótido citosina por acción
de la enzima ADN metiltransferasa, que transforma la
citosina en 5 metil-citosina.
2. Modificaciones postransduccionales de las histonas de
la cromatina: las colas aminoterminales de las histonas
sobresalen del nucleosoma. Dichas colas, sobre todo
H3 y H4, constituyen una fuente de variabilidad, ya
que muchos de sus aminoácidos son modificados después de la traducción. Existen modificaciones activadoras como la acetilación de las histonas, y también la
metilación de la arginina y de la lisina. Por otro lado,
coexisten modificaciones represoras. Las histonas
cambian su densidad y permiten el acceso a los genes
y su expresión. La metilación del ADN y la acetilación
de las histonas son procesos que funcionan en forma
coordinada. A diferencia de las mutaciones, la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas son
reversibles.
3. Silenciado de genes asociados al ARN: existen varios tipos de ARN, en especial uno pequeño de 21-27
nucleótidos denominado micro-ARN (miARN), que
participa en la regulación de la expresión endógena
de los genes.
4. Impronta genómica (imprinting): mecanismo celular
que “marca” o “etiqueta”, deja una impronta en los
genes con impronta paterna o materna.
A partir del desarrollo de esta reciente y nueva área de la medicina se plantea una nueva comprensión del concepto salud-enfermedad. A pesar del poco
tiempo transcurrido, existen múltiples publicaciones de
estudios en varios capítulos de la medicina, como por
ejemplo, en oncología, obesidad, psiquiatría, diabetes,
dolor y envejecimiento.
Holliday propuso por primera vez en 1987 el
posible rol de la epigenética en la herencia de enfermedades. Holliday distinguió funciones de los genes en dos
niveles: primero, en la transmisión del material genético
de generación en generación, lo que sería el campo de la
genética; segundo, cómo ellos funcionan durante el desarrollo de un organismo desde la fertilización del óvulo
hasta el adulto, lo que sería el campo de la epigenética.
Actualmente se define como epigenética al estudio de
los cambios en la función de los genes que son heredables por mitosis y/o meiosis, que no entrañan una modificación en la secuencia del ADN y que pueden ser
reversibles (22).
En lo referente a la mujer, la epigenética se relacionará con nuevos escenarios clínicos como medicina pre y posnatal, climaterio, oncología ginecológica,
reproducción, endometriosis, osteoporosis, etc. En el
cáncer de mama, especialmente en terapéutica, se están
viendo avances promisorios en el desarrollo de nuevos
esquemas de tratamiento.
Terapia epigenética en el cáncer de mama
La metilación del ADN es indispensable para la
vida, ya que regula la adecuada expresión de los genes,
pero su producción en exceso o escasa trae problemas.
El cáncer es una alteración de la metilación global, es
decir, hay donde no debería y falta donde es necesaria.
Esta descompensación hace que el material genético se
rompa más fácilmente y acumule mutaciones y alteraciones, o que se inserten señales de stop inadecuadas que
inhiben la expresión de genes supresores de tumores,
sin los cuales las células tienen la irresistible tentación
de dividirse, proliferar e invadir tejidos: la metástasis.
Por ello, desde hace más de dos décadas, la patogénesis y progresión del cáncer se estudian también desde la
epigenética, ya que la combinación de cambios en este
nivel se asocia con la inhibición de la transcripción de
genes clave en la regulación celular, control del ciclo
celular y apoptosis (23).
El gen BRCA1 es un claro ejemplo del efecto epigenético en los procesos cancerígenos. Chiang y
cols. (2006) han demostrado que:
- Los patrones aberrantes de metilación en el promotor
de BRCA1 tienen relación con la aparición de cáncer de
mama.
- La hipermetilación del promotor de BRCA1 en carcinomas de ovario y mama reduce los niveles de expresión
de ARNm de BRCA1.
Estos datos sugieren que la metilación del promotor de BRCA1 está asociada a peor pronóstico y que
BRCA1 podría formar parte de esquema global de genes
metilados asociados a enfermedades agresivas (20).
A diferencia de las mutaciones, la metilación del
ADN y las modificaciones de las histonas son reversibles.
Los genes supresores de tumores que se encuentran (inactivados) hipermetilados, pueden ser activados por drogas
25
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
(9). Los efectos adversos comunes que se pueden advertir en estos tratamientos son: toxicidad cardíaca, fatiga,
náusea, diarrea, trombocitopenia y linfopenia.
Por ejemplo, si se demetila el gen MLH1 en la
región promotora, lleva a la reactivación del gen y aumenta la quimiosensibilidad (4).
Además, la demetilación y reactivación de la Ecaderina, MYOD, antígenos tumorales, DAPK1 y p16,
producen: adhesión celular, diferenciación, aumento
de la inmunogenicidad, inducción de apoptosis e inhibición del crecimiento celular incontrolado, respectivamente (24).
Actualmente los tratamientos para el cáncer de
mama están siendo evaluados haciendo foco en la recomposición de la metilación del ADN y la acetilación
de las histonas en los genes supresores de tumores y genes involucrados en la respuesta terapéutica. Combinar
terapia epigenética con quimioterapia puede proveer un
camino para resensibilizar a los tumores resistentes a las
drogas, logrando una sinergia que aumenta la respuesta
terapéutica (20).
La ADN metiltransferasa (ADNMT) y los inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) se probaron para reactivar la expresión del receptor estrogénico
(RE), mostrando sinergia para silenciar la expresión génica del RE (20,25,26).
El vorinostat, panobinostat y entinostat están
siendo probados en mujeres con cáncer avanzado o con
enfermedad metastásica. En estudios fase II el panobinostat, solo en HER2(-), está siendo evaluado en mujeres con
recurrencia local o mestástasis en el NCI Clinical Trial
Protocol NCT00777049. El vorinostat o panobinostat han
mostrado reversión a la resistencia al trastuzumab en el
NCI Clinical Trial NCT00567879 (27).
Estudios preclínicos: se usó vorinostat y tamoxifeno en mujeres con receptores de estrógeno positivo y metástasis óseas, en las cuales el tumor seguía
avanzando durante el tratamiento con inhibidores de la
aromatasa, pero no presentaban metástasis cerebrales o
eventos tromboembólicos con buena respuesta (26,27).
Otros estudios están evaluando una combinación de vorinostat y panobinostat con inhibidores de la
aromatasa (27).
Actualmente 3 proyectos sobre cáncer de mama
del International Cancer Genome Consortium han sido
anunciados donde se analizarán al menos 1500 tumores
de mama a nivel genético, transcriptómico (la parte del
genoma que se expresa en una célula en una etapa específica de su desarrollo) y epigenético (28).
Conclusión
Finalmente y sin lugar a dudas, el futuro inmediato nos encontrará vinculándonos con una epigenética
26
ginecológica global, que se ubicará en el epicentro de la
tocoginecología posmoderna.
Los conceptos epigenéticos aportarán un nuevo
enfoque para los escenarios clínicos ginecológicos por
nosotros conocidos, como por ejemplo, reproducción,
endometriosis, climaterio, osteoporosis, medicina prenatal, oncología ginecomamaria. Aún más, otros grandes temas de la medicina como oncología en general,
diabetes, dolor, psiquiatría, obesidad, envejecimiento,
entre otros, serán fuertemente influenciados por los conceptos epigenéticos.
Y estos aportes serán de suma utilidad no solo
en la compresión de los procesos etiopatogénicos, sino
en el desarrollo de innovadoras terapéuticas basadas en
la epigenética.
En la actualidad, ya existen numerosos protocolos de investigación clínica, en diversos estadios de
progresión, que trabajan sobre el desarrollo de drogas
basadas en el conocimiento logrado hasta ahora por la
epigenética.
Como hemos leído en un editorial de nuestro
amigo el Dr. Roberto Adamow, una de las principales
características del pensamiento científico es la caducidad, ya que será modificado y superado por nuevos descubrimientos e innovaciones, basados en la hipótesis,
errores, dudas, críticas, pruebas etc. Estos conceptos, en
nuestra opinión, se ajustan a esta nueva disciplina de la
epigenética, donde la verdad de hoy puede ser superada
por otra verdad del mañana.
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27
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Revisiones
Utilidad del estudio del organizador nucleolar
en la infertilidad masculina
Utility of the study of nucleolar organizer in male infertility
Dres. Adriana Rocher*, Melba Sardi*, Mercedes Pugliese*, Patricia Chenlo*, Herberto Repetto**, Julia
Ariagno*, Susana Curi*, Luis Palaoro***, Gabriela Mendeluk***
*Especialista en Bioquímica Clínica, Área Citología
**Especialista en Bioquímica Clínica, Área Química Clínica
***Doctor en Bioquímica
Laboratorio de Citología y Fertilidad Masculina, Dpto. de Bioquímica Clínica, Hospital de Clínicas
“José de San Martín”, Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA, Córdoba 2351, 1° piso, CABA
E-mail: [email protected]
Resumen
El nucléolo, considerado históricamente como
el sitio único de síntesis de los ribosomas, representa actualmente una estructura dinámica que participa en importantes procesos celulares, principalmente como regulador del ciclo celular. Es el lugar de reserva de proteínas
fundamentales que intervienen en la mitosis.
Las regiones organizadoras nucleolares (NOR)
son segmentos de ADN que codifican el ARN ribosómico (ARNr), se encuentran asociadas íntimamente a
un conjunto de nucleoproteínas ácidas específicas que
pueden ser detectadas mediante técnicas de impregnación argéntica, que se denominan regiones organizadoras nucleolares argirofílicas (AgNOR). La cantidad de
AgNOR en interfase está estrictamente relacionada con
la rapidez de la proliferación celular y se ha asociado
fundamentalmente a procesos neoplásicos.
Realizaremos una actualización del estudio del
nucléolo en el tracto masculino como marcador de la espermatogénesis y su probable transferencia al laboratorio de fertilidad masculina.
Palabras clave: nucléolo, regiones organizadoras nucleolares, AgNOR, células germinales, espermatogénesis.
Abstract
The nucleolus has been considered historically as the unique synthesis site of ribosomes, currently
represents a dynamic structure that participates in important cellular processes, mainly as a regulator of cell
cycle. It is the place to reserve key proteins involved in
mitosis. The nucleolar organizer regions (NOR) are segments of DNA encoding ribosomal RNA, are intimately
associated to a specific set of acid nucleoproteins that
can be detected by silver staining techniques, which are
called argyrophilic nucleolar organizer regions (AgNORs). The number of interphase AgNORs is strictly
28
related to the rate of cell proliferation and has been associated mainly to neoplastic processes. We will update
the study of the nucleolus in the male tract as a marker
of spermatogenesis and its possible transfer to the laboratory of male fertility.
Keywords: nucleolus, nucleolar organizer regions, AgNORs, germ cells, spermiogenesis.
Introducción
Estructura y función del nucléolo
El nucléolo fue descripto por Fontana hace más
de 200 años como “un cuerpo ovoide visible en el núcleo”. Con el advenimiento de la microscopía electrónica pudo conocerse su estructura y a través de la genómica y proteómica, se sigue estudiando su función.
Cuando la célula está en interfase, en mamíferos
superiores, el nucléolo es un compartimiento subnuclear
que está generalmente constituido por tres regiones reconocidas por microscopía electrónica de transmisión (1).
La primera región denominada centro fibrilar
es la más interna. Está compuesta por finas fibrillas de
~50Å de diámetro y contiene cientos de genes en tándem que transcriben para ARNr. A estas zonas se las
denomina regiones del organizador nucleolar (NOR).
También se encuentran las proteínas: ARN-polimerasa I,
ADN-topoisomerasa I y el factor de transcripción UBF
(upstream binding factor).
Alrededor del centro fibrilar se encuentra el
componente fibrilar denso, el cual se observa como
una capa compacta compuesta principalmente por fibrilarina. Esta proteína está involucrada en la 2’o-metilación de ribosas del ARNr y en los primeros estadios del
procesamiento de los ARNr.
Toda la zona fibrilar está dentro de una región
más grande, compuesta principalmente por gránulos
de 15-20 nm de diámetro, y denominada componente
Infertilidad masculina - Dra. Adriana Rocher
Revisión
granular, la cual es la tercera región y la más externa
que conforma el nucléolo, donde se realiza el ensamblaje de las partículas prerribosomales destinadas a ser
transportadas al citoplasma. En el componente granular
se concentran la fosfoproteína nucleolar B23 y NOP52,
las cuales participan en los estadios intermedios y tardíos de la biogénesis de los ribosomas (2) (Figura 1).
Figura 1. Estructura del nucléolo. CG: componente granular; CF: centro fibrilar; CFD: componente fibrilar denso.
Funciones del nucléolo
El nucléolo es una estructura dinámica del núcleo de la célula que regula importantes procesos, como
la síntesis ribosomal.
Ha sido propuesto como el paradigma de la
compartimentalización funcional nuclear (3). Esta estructura nucleolar es altamente dinámica. Mediante
estudios de videomicroscopía confocal y por medición
de la velocidad de recuperación de fluorescencia o de la
pérdida de la señal fluorescente, se ha demostrado que
las proteínas nucleolares encargadas de la transcripción
(subunidades de la ARN polimerasa I y factores de transcripción), del procesamiento de los ARNr (como B23,
NOP52, nucleolina y RPP29) y la fibrilarina se intercambian continuamente con el citoplasma y con otros
compartimientos nucleares (4).
Sobre la base de los avances recientes en proteómica nucleolar y la dinámica de las proteínas nucleolares,
algunos autores proponen que la estructura tripartita del
nucléolo es aún más compleja, abarcando además otros
componentes como cromatina condensada perinucleolar
e intranucleolar, intersticios y vacuolas nucleolares (5).
Recientemente se observó que la nucleolina
puede unirse a una zona de untranslated regions (UTR)
del ARN mensajero (ARNm) que codifica la síntesis del
p53, inhibiendo su síntesis si la célula no está dañada;
caso contrario, otra proteína nucleolar, la RPL26, toma
el lugar de la nucleolina induciendo la expresión de p53.
De esta forma, la producción de esta proteína de un gen
supresor parece ser controlada primariamente por proteínas de origen nucleolar (6).
También se ha demostrado que la proteína del
retinoblastoma puede inhibir la síntesis de ARNr por la
ARN polimerasa I, a través de la asociación con el factor
de transcripción UBF. Se ha observado que durante la diferenciación celular hay una disminución de la actividad
transcripcional del ADN ribosomal y una rápida acumulación de proteínas del retinoblastoma en el nucléolo (7).
En síntesis, parecería que el nucléolo intervendría en el
mecanismo de acción de genes supresores que regulan
el ciclo celular.
¿Qué son las AgNOR?
Las regiones organizadoras nucleolares (NOR)
son segmentos de ADN que codifican al ARNr y fueron descriptas por primera vez por Heitz y McClintock
(8). Se localizan en las constricciones secundarias del
brazo corto de los cromosomas 13,14, 15, 21 y 22 (9)
en metafase de las células eucariotas. Estas regiones se
encuentran asociadas íntimamente a un conjunto de nucleoproteínas ácidas específicas que pueden ser detectadas mediante técnicas de impregnación argéntica, que se
denominan regiones organizadoras nucleolares argirofílicas (AgNOR).
Esta técnica fue llevada a cabo inicialmente por
Howel y Black (1982) y por Ploton y cols. (1986) (10).
Posteriormente, con técnicas electroforéticas, las proteínas han sido identificadas tanto en interfase (nucleolina
y proteína B23) como en mitosis (subunidades de ARN
polimerasa I y factor de transcripción UBF) (11).
La plata (Ag) se une selectivamente a estas proteínas; su cantidad y estado de fosforilación determinan
la cantidad de tinción NOR, la cual se relaciona con la
actividad proliferativa de una célula dada (12).
Las AgNOR se visualizan en forma de puntos
localizados en el núcleo. El nucléolo de una célula con
bajo nivel de biogénesis ribosomal se caracterizará con
un punto único y grande, mientras que el nucléolo de células activas (como por ejemplo, linfocitos activados por
fitohemoaglutinina) tendrá un gran número de pequeños
puntos de AgNOR (13).
El área ocupada por estos puntos negros teñidos
con plata dentro del nucléolo está relacionada con el área
nucleolar total y con el nivel de síntesis de ribosomas (Derenzini) (5). Es evidente que en células proliferativas la
cantidad de AgNOR se incrementará progresivamente en
la fase G1 temprana, alcanzando un valor máximo en el fin
de la fase S que permanecerá constante en la fase G2 (11).
La cantidad de AgNOR en interfase está estrictamente relacionada con la rapidez de la proliferación
celular. Se ha reportado que en líneas celulares tumorales humanas in vitro, con tiempo de duplicación celular
corto, había un alto número de AgNOR (14-16). Estos
datos fueron confirmados in vivo en un estudio que relacionaba cantidad de AgNOR con tiempo de duplicación
de masa tumoral de células cancerígenas humanas en
xenoinjertos en ratones atímicos (17).
El tamaño nucleolar y la actividad de la ARN polimerasa I en líneas celulares neoplásicas humanas están
en relación inversa al tiempo de duplicación de dichas células. Estos hechos apoyan la idea de la medición del área
nucleolar como parámetro de proliferación celular (18).
29
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Antecedentes
A partir de los primeros trabajos de Howell, en
1982, y de Ploton y cols., en 1986, diferentes grupos
de investigación se interesaron en valorar las posibilidades diagnósticas y pronósticas de la determinación de
regiones organizadoras nucleolares (NOR) en diversas
neoplasias de los animales y del hombre.
La primera aplicación de este procedimiento de
tinción con plata realizada por Ploton y cols. (19) para
visualizar nucléolos de células cancerígenas de tumores
humanos demostró que las células humanas con cáncer
de próstata tenían un número mayor de AgNOR que las
correspondientes benignas o hiperplásicas.
Después de este trabajo pionero, se estudiaron
las características nucleolares de casi todos los tipos de
cáncer humano y sus lesiones benignas con la idea de
que el tamaño nucleolar diferente era suficiente para diferenciar una célula benigna de una neoplásica (20).
Se concluyó que sólo en pocos casos el tamaño
nucleolar serviría para diferenciar entre células malignas y benignas, ya que existe una frecuente superposición de los resultados, lo que ha generado reportes de
diverso tipo pero escasamente comparables entre sí. Para
unificar resultados, el protocolo de la técnica debe estar
estandarizado y deben establecerse normas procedimentales (21).
Estandarización del método
Existen diferencias en la técnica de impregnación y el procedimiento utilizado para cuantificar e interpretar las AgNOR (21). Dos métodos se han propuesto
para el análisis cuantitativo de las AgNOR: el método de
conteo y el método morfométrico. El primero consiste
en la enumeración de cada punto impregnado por plata,
lo que resulta difícil, ya que a veces éstos se superponen y además su tamaño es variable, particularmente
en las células cancerosas (22). El método morfométrico
requiere de instrumental costoso, pero preciso; mide el
área ocupada por las estructuras impregnadas en plata y
constituye la forma más objetiva de cuantificar las AgNOR, para comparar y reproducir (21).
En nuestro laboratorio se realizaron ambos métodos. El de conteo fue empleado para estudiar derrames
de serosas, lo que permite diferenciarlos en malignos
y reactivos. Más recientemente y contando con nuevas
tecnologías de análisis de imágenes (Image Pro-plus),
realizamos la morfometría de las AgNOR en lesiones
de cuello uterino como marcador pronóstico de lesiones
premalignas (23).
Trabajos recientes sobre AgNOR
Se propuso su utilización para diferenciar tumores prostáticos de patología benigna junto con otros
30
marcadores de proliferación (PCNA) y de estirpe tumoral (citoqueratina 34ßE12) con resultados superadores
al diagnóstico morfológico (hematoxilina-eosina) (24).
Datos similares fueron reportados en casos de lesiones
macroscópicas orales sospechosas de malignidad; la
sensibilidad fue del 100% para las AgNOR, y fue del
91,17% para la coloración de Papanicolaou (25)
En cáncer de mama se halló alta correlación
negativa entre los receptores para estrógenos y las AgNOR, lo que indica que este último sería un buen marcador pronóstico (26). Por otra parte, tanto por el método
morfométrico como el de conteo, se pudo diferenciar
carcinoma papilar de tiroides de lesiones tiroideas benignas en punciones con aguja fina (27).
Reportes de utilización de AgNOR en testículo
Hay escasos trabajos referidos a este tema, y todos están focalizados en el diagnóstico de malignidad.
Así, Loftus y cols. (28) logran aumentar la sensibilidad
del diagnóstico de neoplasia germinal intratubular testicular empleando fosfatasa alcalina placentaria y AgNOR (84% vs. 70% sólo con la técnica de hematoxilinaeosina). La media del número de puntos de AgNOR por
núcleo para carcinoma in situ de testículo fue de 26,86
(19-52, SD: 2,58); fue de 8,18 (5-14, SD: 2,20) para las
espermatogonias y de 12,96 (9-18, SD: 2,44) para las células de Sertoli, sin que se observara solapamiento entre
los grupos (29). Los mismos resultados se reportaron al
analizar las imágenes por morfometría (30).
Nuestra experiencia: reporte de un caso
Al estudiarse un eyaculado y realizarse el recuento diferencial de células no espermatozoides, se
hace especial hincapié en diferenciar un cuadro infeccioso y/o inflamatorio de uno que denote fallas en la espermatogénesis. Si bien se habla en general de porcentaje
de células germinales, la coloración de Papanicolaou
permite diferenciar por criterio morfológico espermatocitos de espermátides. La detención de la espermatogénesis puede ocurrir a diferentes niveles, espermatogonia,
espermatocito o espermátide (31, 32). Las alteraciones
en la espermatogénesis dependen de múltiples factores:
exposición a altas temperaturas, factores nutricionales,
agentes alquilantes, radiación, edad avanzada, patología
genética, infecciones, alteraciones del eje gonadal o pueden ser de origen testicular (torsión testicular, hidrocele,
criptorquidea, varicocele) (32). La degeneración del epitelio germinal puede deberse al consumo de drogas empleadas para diversas patologías aún no relacionadas con
el tracto genital. La interacción molecular de las drogas
con los constituyentes biológicos puede causar cambios
citológicos profundos y tener efecto tóxico. La acumulación de drogas en los lisosomas puede generar cambios
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33
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Infertilidad masculina - Dra. Adriana Rocher
Revisión
citológicos característicos que hablan de la etiología del
daño (33).
Hasta el momento, sólo se emplea la biopsia testicular para evaluar la detención de la espermatogénesis.
La detención en el proceso de diferenciación de las células germinales puede ser parcial o total, causando oligospermia o azoospermia respectivamente. De hecho esta
condición puede ser transitoria o permanente. La citología
espermática es un excelente marcador de funcionalidad
del epitelio germinal (34) y una señal de alerta en casos
de oligozoospermia que podría evolucionar a azoospermia (35). Su estudio podría optimizarse con el empleo de
un marcador de proliferación como son las AgNOR, para
lo cual describiremos un caso paradigmático.
Realizamos el seguimiento de un paciente del
Programa de Inseminación Intrauterina del Hospital de
Clínicas “José de San Martín”. El paciente consumía alprazolam y enalapril (20 mg/día). Nos sorprendió el hallazgo de un número bajo de espermatozoides acompañado de una alta celularidad (Tabla I), lo que habla de un
trastorno de la espermatogénesis (36). Lo estudiamos en
cinco oportunidades, en la segunda el cuadro se agravó y
disminuyó el número de espermatozoides; la concentración de células germinales en el eyaculado (CG) superó el valor absoluto de espermatozoides hallados (S), lo
que da un índice CG/S >1. Decidimos estudiar en dicha
oportunidad las células germinales con técnicas suplementarias. Así empleamos la técnica de TUNEL para
evidenciar fragmentación del ADN (37), eosina para
detectar necrosis y AgNOR para evaluar proliferación
(22). Paralelamente, realizamos la coloración de Papanicolaou y microscopía electrónica, correlacionando las
observaciones morfológicas con las estructurales.
La Tabla II muestra los resultados hallados a los
15 días de iniciado el estudio. Mientras que la mitad de
las células evidencian un estado apoptótico prenecrótico (el 46% de las células tenían su ADN fragmentado)
(Figura 2), el 53% de ellas expresó el marcador de proliferación celular (Figura 3) y el resto mostró franca necrosis (Figura 4) (38).
Comenzó entonces el tratamiento del paciente
con una forma comercial mezcla de vitaminas y antioxidantes (L-carnitina fumarato 1,725 g, fructosa 1 g,
acetil-L-carnitina 500 mg, vitamina E 60 mg, ácido cítrico 50 mg y vitamina C 30 mg). El cuadro no revirtió;
siguió agravándose, aumentando el índice CG/S y disminuyendo el marcador de proliferación que fue del 3%
y del 2% a los tres y cuatro meses de iniciado el estudio,
lo que refuerza el concepto de que el daño en la espermatogénesis estaba en progreso. Finalmente, el cuadro
revirtió (CG/S: 0,5) cuando se le suministró al paciente
citrato de clomifeno.
Figura 2. Ensayo de TUNEL en
células germinales (400X).
Figura 3. Coloración de AgNOR en células germinales
(1000X).
Figura 4. Test de vitalidad (eosina) (400X).
Discusión
Si bien el estudio de las AgNOR es empleado
junto con otras determinaciones para aumentar la sensibilidad en el diagnóstico de malignidad, en realidad se
trata de un marcador de proliferación celular.
Al realizar el seguimiento de un paciente que presentaba franca disminución del número de espermatozoides
y alta celularidad, notamos que la AgNOR fue positiva en
la mitad de las células germinales estudiadas, lo que indica actividad nucleolar, mientras que la otra mitad presentó
signos de muerte evidenciada a través de la fragmentación
37
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
del ADN (TUNEL) y el test de vitalidad (eosina). El empeoramiento del cuadro citológico se correlacionó con
la brusca disminución de la AgNOR. Se trata de una experiencia única y preliminar que dio lugar a la formulación de una hipótesis que debería ser probada poblacionalmente. Nuestra propuesta es que en el eyaculado,
la disminución de células germinales que expresan las
AgNOR orientarían al diagnóstico de falla en la espermatogénesis. Esta idea se basa en la observación por microscopía óptica y electrónica de cambios apoptóticos y
degenerativos de las células de progenie. Estos cambios
aumentan a medida que disminuye la expresión de las
AgNOR, que se convertiría así en un marcador temprano
de disminución de proliferación en casos de oligozoospermias que podrían evolucionar a azoospermia.
Tabla II. Estudios complementarios realizados en la
muestra II.
Técnica empleada
Células positivas
Eosina
51%
AgNOR
53%
TUNEL
46%
Tabla I. Evolución del espermograma del paciente en el tiempo.
Mta Tpo.
I
II
III
IV
V
0
15 d
3m
4m
7m
Vol. Cc Ez
Cc CG
Ez/eyac. Cél./eyak CG C G
(ml) (mill/ml) (mill/ml) (mill)
(mill)
(%) eyac.
(mill)
6,5 8,75
4,40
56,9
28,60
93 26,6
5,6 0,77
1,00
4,30
5,60
92 5,10
3,7 0,55
1,45
1,85
5,40
90 4,90
4,4 0,99
2,80
4,35
12,30
92 11,30
5,3 6,80
3,90
36,00
20,7
86 17,8
/ CG/Ez Tratamiento
0,5
1,2
2,6
2,6
0,5
Ninguno
Ninguno
Antioxidantes
Antioxidantes
Antioxidantes + citrato de clomifeno
Cc Ez: concentración de espermatozoides; Cc CG: concentración de células germinales; Ez/eyac.: espermatozoides/eyaculado; Cél./eyac.: células/eyaculado; CG/eyac.: células germinales/eyaculado; CG/Ez: células
germinales/espermatozoides.
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39
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Revisión
Implicancia de las prostaglandinas en la
fisiopatología de la endometriosis
Role of prostaglandins in the pathophysiology of endometriosis
Gabriela F. Meresman y Carla N. Olivares
Doctoras de la Universidad de Buenos Aires (Ph.D.)
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME-CONICET)
Vuelta de Obligado 2490, (1428) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
E-mail: [email protected]
Resumen
Las prostaglandinas son lípidos bioactivos que
poseen múltiples y variadas funciones. En biología reproductiva, participan en la regulación de la ovulación,
en la fisiología endometrial y en el proceso de menstruación. Asimismo, los niveles de las ciclooxigenasas
(COX), enzimas clave en la producción de prostaglandinas, se han hallado aumentados en procesos patológicos
tumorales e inflamatorios. En endometriosis, las prostaglandinas no sólo están implicadas en el dolor, sino
que son partícipes clave del desarrollo y establecimiento
de la enfermedad. Los altos niveles de prostaglandina
E2 (PGE2) hallados en el líquido peritoneal de las pacientes con endometriosis, no sólo favorecen la proliferación celular estimulando la actividad de aromatasa
con su consiguiente producción de estrógenos, sino que,
además, los mismos estrógenos aumentan la síntesis de
PGE2 estimulando la actividad de las COX-2. La PGE2
además estimula la angiogénesis y está involucrada en
la alteración inmunológica peritoneal que se observa en
endometriosis. Los inhibidores de las COX-2 fueron y
son actualmente utilizados en numerosos ensayos preclínicos y clínicos en distintos tipos de cáncer. En estudios
realizados tanto in vitro como in vivo, hemos demostrado que el inhibidor selectivo de las COX-2, el celecoxib, fue eficaz para inhibir la endometriosis experimental. Resulta importante buscar nuevos horizontes en la
terapéutica de la endometriosis. Las prostaglandinas y
sus enzimas clave de síntesis, las ciclooxigenasas, representan hoy un blanco atractivo para desarrollar nuevas
terapéuticas que ataquen directamente a las moléculas
involucradas en las causas de esta patología.
Palabras clave: endometriosis, prostaglandinas, ciclooxigenasa (COX), inhibidor de COX-2.
Abstract
Prostaglandins are bioactive lipids that possess
multiple and diverse functions. In reproductive biology,
they are involved in the regulation of ovulation, in endometrial physiology and in the process of menstruation.
40
Furthermore, cyclooxygenases (COX) levels, which are
key enzymes for the synthesis of prostaglandins, have
been found to be elevated in pathologic, tumoral and
inflammatory processes. In endometriosis, prostaglandins are not only implicated in pain, but they are also
critical for the establishment as well as for the development of the disease. The high levels of prostaglandin E2
(PGE2) found in the peritoneal fluid from patients with
endometriosis, not only favor cellular proliferation by
stimulating the activity of aromatase with the consequent estrogen production, but also these estrogens are
responsible for enhancing PGE2 synthesis by stimulating COX-2 activity. PGE2 also stimulates angiogenesis
and is implicated in the peritoneal immunologic alterations observed in endometriosis. COX-2 inhibitors were
and are used in a vast number of preclinical and clinical
studies in different types of cancer. In studies conducted
both in vitro and in vivo, we have demonstrated that the
selective COX-2 inhibitor, celecoxib, was efficient in
inhibiting experimental endometriosis. It is important
to search for new horizons in endometriosis treatment.
Prostaglandins and the enzymes in charge of their synthesis, COXs, represent an attractive target for developing new therapies that target directly the molecules
involved in the causes of this pathology.
Keywords: endometriosis, prostaglandins, cyclooxygenases (COX), COX-2 inhibitor.
1. Las prostaglandinas
Las prostaglandinas (PG), los tromboxanos
(TX) y los leucotrienos (LT), denominados en forma colectiva eicosanoides, son productos de la actividad de
ciclooxigenasas (COX) y lipooxigenasas (LOX). Los
prostanoides, PG y TX son efectores de una amplia variedad de acciones en una enorme cantidad de células y
tejidos. Se han descripto acciones de los eicosanoides en
diversos mecanismos fisiopatológicos como contracción
y relajación muscular, neurotransmisión, fiebre, inducción del sueño, apoptosis, proliferación celular, oncogénesis. Asimismo, se sabe que estas moléculas son clave
Prostaglandinas y endometriosis - Dra. Gabriela F. Meresman
Revisión
en la funcionalidad del sistema reproductor femenino y
en endometriosis, que es el tema que vamos a abordar en
este capítulo (1,2).
1.1 Síntesis de prostaglandinas
La COX-2 pertenece a la familia de las ciclooxigenasas, enzimas responsables de la producción de PG a
partir de ácido araquidónico (AA). Se han descripto dos
genes COX hasta el momento y están altamente conservados entre las especies. El gen de COX-1 posee distintas variantes de corte y empalme o “splicing”: la enzima
COX-1, que es la más conocida, y las menos conocidas, COX-3 y otras proteínas más pequeñas, variantes
de COX-1 (3,4). La proteína COX-1 se expresa de manera ubicua y constitutiva. Por mucho tiempo se creyó
que la COX-1 estaba involucrada solamente en procesos
fisiológicos, pero se ha demostrado su sobreexpresión
en varios carcinomas y su participación en tumorigénesis (5-7). Por otro lado, se conoce una única variante de
splicing para el gen de COX-2. La enzima COX-2 es estimulada fisiológica y patológicamente por factores de
crecimiento y citoquinas e interviene en la síntesis de
PG cuando las concentraciones de AA son bajas (8).
La fosfolipasa A2 escinde el AA de los fosfolípidos de membrana y, una vez en el citosol, las enzimas COX lo ciclan, oxigenan y reducen al intermediario
PGH2. Existen sintetasas específicas que toman este in-
termediario para producir los distintos prostanoides terminales: la sintetasa de PGE2 (PGES) sintetiza PGE2; la
sintetasa de PGF2α (PGFS) sintetiza PGF2α, la sintetasa
de prostaciclina (PGIS) sintetiza prostaciclina (PGI2), la
sintetasa de PGD2 (PGDS) sintetiza PGD2, y la sintetasa de tromboxano (TXS) sintetiza tromboxano (TX) A2
(Figura 1).
Una vez sintetizados, los prostanoides son rápidamente exportados fuera de la célula a través de un
transportador de PG y actúan muy cerca de su lugar de
liberación de manera autocrina o paracrina. Sus funciones biológicas las realizan a través de receptores específicos para cada prostanoide. Estos receptores son de la
familia de los receptores de siete pasos transmembrana
acoplados a proteína G (GPCR). Los DP, EP, FP, IP y
TP son los receptores para PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2 y
TXA2, respectivamente. Hasta el momento se conocen
4 subtipos para EP (EP1-4), cada uno de los cuales está
codificado por un gen distinto, y el EP3 tiene además 8
variantes de splicing, lo que le otorga una gran variabilidad en las funciones que realiza la PGE2. Por otro lado,
los receptores TP y FP tienen dos variantes de splicing
cada uno (8). En la Figura 1 se resumen las acciones de
cada uno de estos prostanoides.
En cuanto a la señalización intracelular, luego de
la unión del ligando con los receptores GPCR, se genera
una serie de segundos mensajeros solubles, responsables
Figura 1. Esquema de la síntesis de prostaglandinas y sus vías de señalización.
El ácido araquidónico es el precursor de la síntesis de leucotrienos y prostaglandinas. Cada prostaglandina se une a un receptor
de siete pasos transmembrana específico y dispara una cascada de señales característica. LOX: lipooxigenasa; LT: leucotrienos;
COX-1/2: ciclooxigenasa-1/2; PGI2: prostaciclina; PGIS: sintetasa de PGI2; TXA2: tromboxano A2; TXS: sintetasa de TXA2; PGD2:
prostaglandina D2; PGDS: sintetasa de PGD2; PGE2: prostaglandina E2; PGES: sintetasa de PGE2; PGF2α: prostaglandina F2α; PGFS:
sintetasa de PGF2α; IP, TPα/β, DP, EP1-EP4, FPα/β: receptores específicos de cada prostaglandina; AMPc: adenosín monofosfato
cíclico; Ca2+: calcio; IP3: inositol trifosfato.
41
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
del inicio de la señal. El receptor DP se acopla a Gq
e incrementa la concentración de adenosín monofosfato cíclico (AMPc). El receptor IP se acopla con Gs y
estimula no sólo los niveles de AMPc, sino que actúa
a través del fosfatidilinositol, incrementando la concentración de Ca2+ (1). A su vez, ambas isoformas de TP activan la fosfolipasa C (PLC), sin embargo, el TPα activa
la adenilato ciclasa, mientras que el TPβ la inhibe (1). Los
receptores FP actúan a través de Gq, PLC y secreción de
Ca2+, mientras que los receptores EP poseen señales distintivas dependiendo de cada subtipo: el EP1 se acopla
a Gi y a los canales de Ca2+, EP2 y EP4 comparten la
vía de señalización acoplándose a Gs e incrementando la
concentración de AMPc intracelular, mientras que el EP3
posee una respuesta específica que depende de la variante
de splicing, pero usualmente se asume como un receptor
inhibitorio acoplado a Gi (8) (Figura 1).
Las PG son lípidos bioactivos que poseen múltiples y variadas funciones. En biología reproductiva
se ha encontrado que participan en la regulación de la
ovulación, en la fisiología endometrial y en el proceso
de menstruación (9). Se ha observado que en procesos
patológicos como en distintos tipos de cáncer (mama,
próstata, vejiga, páncreas, pulmón, colon), muchas veces la expresión de COX-2 se encuentra aumentada y
su alta expresión se correlaciona con un mal pronóstico
para el paciente. En otros procesos inflamatorios, como
en adenomiosis y endometriosis, también su expresión
se ha hallado incrementada (10-12).
2. Función de las prostaglandinas en la fisiología reproductiva
El útero cumple una función crucial en el proceso de implantación del óvulo fertilizado. Si no ocurre la
fertilización, parte del tejido endometrial de las mujeres
y de las hembras primates del viejo mundo se descama.
Este proceso cíclico se encuentra minuciosamente regulado: el endometrio es un tejido dinámico que atraviesa
por etapas controladas de proliferación, diferenciación y
degradación en forma constante. Las PG son actores importantes de ese proceso y se ha reportado que las COX
y sus productos juegan un rol activo en diferentes etapas
de la reproducción (9).
La COX-2 se expresa en forma fisiológica a
lo largo del ciclo menstrual. Se ha demostrado que los
niveles de COX-2 son bajos durante la ovulación y comienzan a aumentar durante la fase secretoria, alcanzando un pico en la fase secretoria tardía y menstrual, luego
de la cual comienzan nuevamente a decaer (13).
La importancia de la COX y de las PG en reproducción fue evidenciada a partir de estudios que se
realizaron en animales deficientes de estas moléculas
o knock-out. A pesar de que los ratones deficientes en
42
COX-1 demostraron ser fértiles, se observó que su período de gestación fue más prolongado y el número de
partos y de nacidos vivos disminuyó. Estos hallazgos
demostraron que la expresión de COX-1 resulta esencial
para que se desarrolle el parto en forma adecuada en el
ratón (9,14).
Por otro lado, la ablación selectiva de COX-2
provocó desórdenes en la ovulación, fertilización e implantación; y la combinación de la inhibición de COX-2
en los ratones COX-1(-/-) provocó una falla reproductiva
completa, lo que sugiere una ausencia de vías alternativas para la síntesis de PG (15).
Asimismo, otros autores que estudiaron ratones
deficientes en EP y FP han demostrado que las PGE2
y PGF2α cumplen roles específicos en reproducción. En
estos trabajos se ha observado que los receptores EP2
son esenciales para que se produzca la ovulación y la
fertilización (16,17) y los receptores FP son indispensables para la correcta presentación del parto (18). De esta
manera, estos estudios sugieren no sólo un rol crítico de
la PGE2 en el proceso de fertilización, sino también la
importancia de la PGF2α en el parto natural.
Además, ha sido descripto que las PG cumplen funciones de ligandos endógenos de receptores
nucleares. Al respecto, algunos prostanoides han sido
identificados como agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR). Entre
ellos, 15-deoxi-Δ-12,14-prostaglandina J2 (15dPGJ2), es
un ligando natural que posee una alta afinidad por los
PPAR-γ y ha sido propuesto como un regulador de la
respuesta inflamatoria (19,20). Otro ligando endógeno,
en este caso del receptor nuclear PPAR-δ, es PGI2 que
cumple una función importante en los procesos de decidualización e implantación (21).
El proceso de implantación embrionaria es
considerado análogo a un evento proinflamatorio y, por
consiguiente, se ha sugerido que las PG juegan un papel
fundamental en su regulación (22-24). En consecuencia,
se ha reportado que diversos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), entre ellos los inhibidores selectivos
de COX-2, están implicados en la inhibición de la permeabilidad vascular endometrial y en la disminución de
la implantación en diversas especies animales (25,26).
En particular en el endometrio, tanto las COX
como las PG están involucradas en la iniciación de la decidualización y en la implantación embrionaria (22,27).
Desde hace varios años se conoce que la permeabilidad
vascular y la proliferación y diferenciación de las células estromales endometriales a células deciduales son
procesos que están mediados por las PG (24,28). Específicamente, los estudios de Chakraborty y colaboradores
sugirieron un papel fundamental de las PG en el proceso
de implantación, al demostrar la importancia crítica de la
Prostaglandinas y endometriosis - Dra. Gabriela F. Meresman
Revisión
expresión de COX-2 específicamente durante la adhesión
del embrión al sitio de implantación (29).
A pesar de que distintos autores confirmaron la
presencia de receptores de PGE y PGF en el endometrio
periimplantatorio, no se ha podido identificar a un único
tipo de PG asociada inequívocamente a este evento, habiéndose hallado diferencias entre las distintas especies
evaluadas (27).
3. Función de PGE2 en la etiopatogénesis de la
endometriosis
3.1 Endometriosis
La endometriosis se define como la presencia
de focos de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina (30). Una vez en su sitio ectópico, este tejido prolifera
y se vasculariza, formando los quistes o lesiones característicos de la enfermedad.
Los sitios más comunes donde se pueden encontrar las lesiones son: los ovarios, los ligamentos
uterosacros, la fosa ovárica peritoneal, el peritoneo de
fondo de saco y el septo rectovaginal (31). Sin embargo, se han descripto lesiones endometriósicas en sitios
ectópicos extraordinarios como vejiga urinaria, pulmón,
pleura, apéndice, recto, intestino delgado, ombligo, espacio retroperitoneal, cuello uterino y vagina (32,33).
Aproximadamente el 10% de la población femenina en edad reproductiva padece de endometriosis; existen además casos aislados de mujeres posmenopáusicas y
de niñas prepúberes con anomalías uterinas que sufren de
esta enfermedad (34). En mujeres que presentan problemas de infertilidad, los casos de endometriosis aumentan
al 25-40% (35,36) y pueden llegar al 50% cuando, además, presentan una dismenorrea moderada a severa (37).
En mujeres fértiles, el padecimiento de la enfermedad
varía entre el 0,5 y 5% (35). Además, otro inconveniente importante para las pacientes con endometriosis es la
elevada frecuencia de recidivas luego de la finalización de
los tratamientos, que varía entre el 4 y el 25% (38).
Si bien se conocen casos de pacientes asintomáticas, los síntomas comúnmente asociados a la endometriosis son el dolor pelviano y la infertilidad (39).
El dolor pelviano puede manifestarse en forma de dismenorrea, dispareunia o dolor crónico, e incluso si las
lesiones se ubican sobre la vejiga o sobre el recto, las
pacientes pueden tener episodios de disuria y proctalgia (36,40). Se ha reportado que dado que las lesiones
endometriósicas responden a las hormonas sexuales de
manera similar al endometrio eutópico, el dolor también
puede manifestarse de forma cíclica (36).
Es sabido además que la infertilidad y la endometriosis están altamente asociadas y llegan a afectar
aproximadamente al 50% de las pacientes (41,42). Los
mecanismos por los cuales gran parte de las mujeres con
endometriosis son infértiles no se conocen aún con certeza. Algunas de las causas posibles propuestas para explicar el origen de la infertilidad en endometriosis son:
presencia de adherencias endometriósicas que causan
distorsiones anatómicas y/o impedimentos mecánicos
que afectan una correcta fertilización (43), alteraciones
inmunológicas y activación macrofágica en el líquido
peritoneal que resulta tóxico para la función espermática
o para la supervivencia embrionaria (44), defectos endometriales implantatorios y defectos en la calidad ovocitaria (45,46). Además, el dolor que experimentan algunas pacientes con lesiones infiltrantes profundas puede
ser tan fuerte, que consigue provocar largos períodos de
abstinencia sexual, con la consiguiente disminución de
la tasa de natalidad (47).
Asimismo, la calidad de vida de las pacientes que
sufren esta enfermedad muchas veces se ve afectada debido no sólo a los fuertes dolores que padecen, sino al hecho
de que deben someterse a tratamientos largos e invasivos,
los cuales no siempre resultan realmente efectivos (30).
3.2 Crecimiento de las lesiones endometriósicas y
desarrollo de la enfermedad
La hipótesis mejor aceptada para explicar la
etiología de la endometriosis peritoneal es la teoría de la
implantación propuesta por Sampson (48), la cual postula que el paso de fluido menstrual en sentido retrógrado a través de las trompas de Falopio esparce fragmentos endometriales en la cavidad peritoneal, los cuales
tienen la capacidad de sobrevivir, adherirse y establecer
una lesión ectópica en la superficie de los órganos peritoneales. Cabe destacar que el paso retrógrado de fluido
menstrual es un evento muy frecuente. Alrededor del
90% de las mujeres presenta menstruación retrógrada,
sin embargo, sólo el 10% de ellas desarrolla endometriosis. Esto sugiere que existirían más elementos que
provocan susceptibilidad en determinadas mujeres para
desarrollar la enfermedad.
Las pacientes con endometriosis presentan alteraciones inmunológicas y hormonales que favorecen el
establecimiento, implantación y crecimiento del tejido
endometrial en un sitio ectópico (42).
Se ha reportado que debris celular recolectado
de la cavidad peritoneal al momento de la cirugía se adhiere y prolifera de manera más rápida in vitro, cuando
procede de pacientes con endometriosis comparado con
el mismo tejido de mujeres sanas (49). Esto indica que
las mismas características de las células endometriales
juegan un papel central en la implantación y posterior
desarrollo de la enfermedad (47).
En las mujeres sanas con menstruación retrógrada, es el sistema inmunológico el que se encarga de eliminar las células endometriales que alcanzan la cavidad
43
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
peritoneal. Las pacientes con endometriosis presentan
alteraciones en este sistema y se ha propuesto que éstas favorecen la implantación del tejido endometrial en un sitio
ectópico. Se sugirió que en las mujeres con endometriosis,
las células endometriales provenientes del reflujo menstrual no son destruidas en forma eficaz. Esto sucedería por
una incapacidad del sistema inmunológico de la paciente
para responder a los antígenos endometriales, ya sea porque esos antígenos son anormales o porque el reflujo es tan
abundante que supera la capacidad de desafío de las células
inmunitarias peritoneales (50). Asimismo, varios investigadores, de manera independiente, han reportado defectos
funcionales en la población de células citotóxicas naturales
o “natural killer” (NK) periféricas y/o peritoneales provenientes de pacientes con endometriosis (51-53). Las células
NK son linfocitos citotóxicos efectores que pueden reconocer e inducir la lisis de células deletéreas (54). Se desconoce si la disminución en la funcionalidad de células NK es
causa o consecuencia de la endometriosis. Algunos autores
postulan que esta anormalidad se produce como resultado
de un estímulo antigénico prolongado, como es el caso del
tejido endometrial implantado en un sitio ectópico (55) y
otros consideran que se debe a factores solubles presentes
en el líquido peritoneal que inhibirían la actividad de las
células NK (56-58).
Los macrófagos son componentes habituales
del líquido peritoneal. Su función fisiológica en la cavidad peritoneal se remite a la degradación de restos endometriales, espermatozoides y células foliculares. Las
pacientes con endometriosis presentan un aumento tanto
en el número de macrófagos peritoneales como en su
activación funcional (59-61). Los macrófagos activados
segregan una serie de factores de crecimiento e interleuquinas que resultan de suma importancia en el proceso
de la enfermedad (62,63). La interleuquina-1b (IL-1b)
es una citoquina producida por macrófagos en estado de
activación cuyos niveles se encuentran aumentados en el
líquido peritoneal de pacientes con endometriosis y que
ha sido involucrada en la alteración de la fertilidad en las
pacientes que sufren esta patología (64,65).
Por otro lado, las hormonas esteroides juegan un
importante papel en la patogénesis de la endometriosis.
Aunque se han reportado casos de mujeres menopáusicas
con endometriosis (66,67), éstos son raros, y es aceptado
que la enfermedad retrocede en esta etapa de la vida de la
mujer (68). Los datos experimentales y clínicos sugieren
que los estrógenos son importantes en el crecimiento y
mantenimiento de las lesiones endometriósicas (69).
En un estudio realizado por Tenenbaum y colaboradores, se observó un aumento en la concentración de
estrógenos en el líquido peritoneal proveniente de pacientes
de todos los estadios de la endometriosis y un aumento de
los niveles de progesterona en estadios III y IV, respecto de
44
mujeres sanas (70). Sin embargo, estos datos son controvertidos, ya que otros autores no han hallado diferencias
significativas en la concentración de estas hormonas en
el líquido peritoneal de mujeres con endometriosis (59).
Para explicar la mayor predisposición de algunas mujeres a desarrollar endometriosis, varios estudios
se han focalizado en las diferencias de expresión de los
receptores hormonales entre el tejido endometrial eutópico y el ectópico (71,72). Se hallaron polimorfismos
tanto de los receptores para estradiol (71) como para los
de progesterona (PR) (73,74), así como alteraciones en
la expresión de PR-A y PR-B (75) en asociación con
endometriosis. Sin embargo, los resultados no son concluyentes ya que existen diferencias entre los autores en
cuanto al hallazgo de alteraciones de estos receptores
asociadas a la endometriosis.
En los últimos años, el estudio del endometrio
eutópico de las pacientes con endometriosis ha cobrado
real importancia (76). La apoptosis o muerte celular programada es un proceso fisiológico fundamental para el
mantenimiento de la homeostasis de distintos tejidos en
organismos multicelulares (77). El proceso de apoptosis
está involucrado en el mantenimiento del ciclo menstrual actuando activamente en la eliminación de células
senescentes de la capa funcional del endometrio uterino
durante la fase secretoria tardía y la fase menstrual (78).
Diferentes autores han detectado anormalidades en el tejido endometrial eutópico de las pacientes con endometriosis (79-82). En ese sentido, datos previos de nuestro
grupo han demostrado que las pacientes con endometriosis poseen una actividad proliferativa aumentada e
índices de apoptosis disminuidos en el tejido endometrial eutópico, hechos que favorecerían su crecimiento y
supervivencia en un sitio ectópico (83). Asimismo, este
estudio reveló un aumento significativo en la expresión
de la proteína antiapoptótica Bcl-2 en el endometrio de
pacientes con endometriosis con respecto a las mujeres
del grupo control (83). Además, se observaron niveles
de apoptosis disminuidos en el endometrio ectópico
comparado con el endometrio eutópico (84). Estos hechos sugieren una predisposición de las células endometriales a ser resistentes a la apoptosis y a continuar
sobreviviendo, lo que tendría importantes consecuencias
en el crecimiento del tejido endometrial ectópico.
Como hemos señalado anteriormente, la endometriosis ha sido identificada como una patología dependiente de estrógenos (69,71). En ese sentido, uno
de los hallazgos más relevantes ha sido la detección de
aromatasa P450, enzima responsable de la conversión de
andrógenos a estrógenos, en el tejido endometrial eutópico y ectópico de pacientes con endometriosis (85,86).
Además, se ha visto que los estrógenos estimulan la actividad de COX-2 y, en consecuencia, la síntesis de PGE2.
Prostaglandinas y endometriosis - Dra. Gabriela F. Meresman
Revisión
Se ha propuesto, entonces, que la producción de
estradiol (E2) en el tejido endometriósico estaría induciendo
un proceso de retroalimentación positiva hacia el aumento
de transcripción de COX-2, síntesis de PGE2 y expresión
de aromatasa P450 (9,69,87,88). Este proceso favorecería
la acumulación de estrógenos y potenciaría la inflamación.
En la Figura 2 se resumen las alteraciones más
importantes halladas en las pacientes con endometriosis
relacionadas con el establecimiento y desarrollo de la
enfermedad.
portado que esta capacidad citotóxica alterada de los
macrófagos peritoneales en endometriosis es regulada
por la síntesis de PG (94). Más recientemente, para dilucidar el mecanismo molecular implicado en esta regulación, trabajos realizados in vitro e in vivo demostraron
que la PGE2, a través de la unión al receptor EP2, inhibe
la expresión del receptor que media la fagocitosis CD36
en los macrófagos peritoneales. La reducción de la expresión de este tipo de receptores produce una disminución de la capacidad fagocítica de los macrófagos (95).
Por otro lado, se ha sugerido que tanto la expresión como la actividad enzimática de MMP-9, una metaloproteinasa que cumple importantes funciones en la
regulación de la actividad fagocítica de los macrófagos,
se ven inhibidas por la PGE2 en los macrófagos peritoneales provenientes de las mujeres con endometriosis en
comparación con los controles (96). Wu y colaboradores
reportaron también que el efecto inhibitorio de PGE2 es
mediado por la vía EP2/EP4-dependiente de PKA (96).
Estos datos permiten explicar algunas de las
disfunciones halladas en los macrófagos peritoneales de
pacientes con endometriosis (59,97).
3.4 Ciclooxigenasa-2 y prostaglandinas como actores
involucrados en la etiopatogenia de la endometriosis
De manera similar al hallazgo de la expresión
Figura 2. Alteraciones que favorecen el desarrollo de aumentada de aromatasa en endometriosis, el descubrila endometriosis.
miento de la sobreexpresión de la enzima COX-2 en paResumen de las alteraciones más importantes halladas en las
lesiones endometriósicas, en el tejido endometrial y en la cavi- cientes con la enfermedad respecto a mujeres controles
dad peritoneal en endometriosis. Todos estos parámetros están fue un hecho sumamente importante. La presencia de
además, asociados a la etiopatogenia de la enfermedad.
estas dos enzimas clave en la síntesis de estrógenos y
de PGE2 explica en gran parte el estado de activa pro3.3 Las prostaglandinas como mediadores inmunológicos liferación de las lesiones endometriósicas y los fuertes
dolores que experimentan las pacientes.
e inflamatorios en endometriosis
Tanto en la fase proliferativa como en la secretoComo ya hemos señalado, es un hecho conocido que la endometriosis es una enfermedad que involucra ria del ciclo menstrual, la COX-2 se encuentra altamente
desarreglos inmunológicos, evidenciados sobre todo en expresada en pacientes con endometriosis comparadas
la cavidad peritoneal (62,89). Ya hemos expuesto que el con mujeres sin la enfermedad (12). Asimismo, Wu y
número de macrófagos está aumentado en el líquido peri- colaboradores describieron que la COX-2 se expresa en
toneal de pacientes con endometriosis y que estas células células estromales y epiteliales provenientes de paciense hallan en un estado de hiperactivación (60,61). En con- tes con endometriosis y confirmaron que su expresión
secuencia, la producción por parte de estos macrófagos de es mayor en mujeres que sufren de esta patología (98).
Los niveles elevados de PG que se encuentran
citoquinas proinflamatorias como MCP-1, IL-1β, TNF-α
e IL-6 se encuentra aumentada en el líquido peritoneal de en el líquido peritoneal de pacientes con endometriosis
las pacientes con endometriosis (90). Además, los macró- son principalmente producidos por los macrófagos perifagos presentan un aumento de la expresión de COX-2 así toneales y el tejido endometriósico (59,60,98,99) donde
también se observa una expresión aumentada de COX-2
como de la secreción de PGE2 (12,60,91,92).
La deficiencia de la capacidad fagocítica de los con respecto a mujeres controles (12,96,98,100).
macrófagos peritoneales en las pacientes con endomeLos altos niveles de PG no sólo favorecen la
triosis ha sido sugerida como uno de los mecanismos proliferación celular estimulando la actividad de aromainvolucrados en la implantación y en el crecimiento del tasa con su consiguiente producción de estrógenos, sino
tejido endometrial en un sitio ectópico (93) (Figura 3). que además los mismos estrógenos aumentan la síntesis
En estudios previos, Braun y colaboradores habían re- de PGE2 estimulando la actividad de COX-2 (101).
45
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
La PGE2 además estimula la producción del
factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF)
(102,103). Esta molécula es central para la formación
de una red vascular nueva en la lesión endometriósica, lo
que resulta indispensable para su desarrollo y crecimiento. Se describió además que pacientes con endometriosis
poseen concentraciones elevadas de VEGF en el líquido
peritoneal (104) y que además este factor es capaz de
estimular la expresión de COX-2 (105).
De esta forma, se establece un círculo de retroalimentación positivo en el que intervienen aromatasa,
estrógenos, COX-2, PGE2 y VEGF; todos ellos interrelacionados de manera tal que se activan y aumentan la
producción y/o actividad de los otros, y estimulan la proliferación celular, la angiogénesis, la inflamación y, por
consiguiente, el dolor (Figura 3).
3.5 Las prostaglandinas y el dolor pelviano
La endometriosis ha sido tradicionalmente incluida entre las causas más importantes de dolor pelviano
en las mujeres en edad reproductiva. Al respecto, un estudio realizado por Ballard y colaboradores ha demostrado
que el 73% de las mujeres con endometriosis había reportado dolor abdomino-pelviano, dismenorrea o menorragia
contra sólo el 20% de mujeres controles que eventualmente presentaron algunos de estos síntomas (106).
Las PG han sido identificadas como las moléculas responsables del dolor en mujeres que padecen
menorragia y dismenorrea (23). La dismenorrea se define como el dolor excesivo durante la menstruación y
la menorragia como el sangrado abundante durante el
período menstrual. Estos eventos pueden ser desórdenes
primarios, o bien, pueden ser secundarios a una patología endometrial, como la endometriosis (23,107).
En cuanto a la dismenorrea, se ha adjudicado
una relación directa entre la severidad de los síntomas
y la producción de PG en endometriosis (108-110). Asimismo, el análisis de fluido menstrual de mujeres que
sufren de dismenorrea reveló niveles aumentados de
PGE2 y PGF2α (111-113).
El incremento de la síntesis de PGE2 y PGF2α
en el endometrio posee importantes implicancias en el
proceso de menstruación (114). La PGE2 es un potente vasodilatador involucrado en el edema y contribuye
a la aparición del dolor durante la menstruación. Asimismo, el aumento de COX-2 y la amplificación de la
producción de AMPc dependiente de PGE2–EP, han sido
reportados por Smith y colaboradores en el endometrio
de mujeres con abundante flujo menstrual. Estos autores
sugirieron que la expresión aumentada de las enzimas
limitantes de la síntesis de PG en el endometrio de estas
pacientes conlleva un aumento de su producción y una
magnificación de la inflamación (115).
Las propiedades hiperalgésicas de las PG han
sido reportadas por diversos autores en distintas patologías. Se ha demostrado además que la PGE2 es capaz
Figura 3. Alteraciones del ambiente peritoneal en endometriosis.
Los macrófagos peritoneales sintetizan y liberan PGE2 además de citoquinas y factores de crecimiento, como IL-1β y VEGF. Todos
estos factores estimulan la expresión y/o actividad de COX-2 produciéndose de esa manera concentraciones aún más altas de
PGE2 en el ambiente peritoneal. La PGE2 estimula la expresión del factor proangiogénico VEGF y de aromatasa, aumentando la
síntesis de E2 y, en consecuencia, la proliferación celular endometriósica. El resultado de estas interacciones implica niveles de
angiogénesis e inflamación aumentados y de apoptosis disminuidos. La PGE2 también disminuye la capacidad fagocítica de los
macrófagos, lo que impide la fagocitosis del tejido endometrial que alcanzó la cavidad peritoneal de forma retrógrada y permite
la implantación y proliferación de la lesión endometriósica. A: androstenediona; AA: ácido araquidónico; AromP450: aromatasa
P450; COX-2: ciclooxigenasa-2; E2: estradiol; PGE2: prostaglandina E2; VEGF: factor de crecimiento de endotelio vascular; PPARγ:
receptor activado por proliferadores de peroxisomas gamma.
46
Prostaglandinas y endometriosis - Dra. Gabriela F. Meresman
Revisión
de inducir dolor en pacientes sanas (116). Asimismo, los
receptores EP se han hallado elevados en neuronas sensoras, lo que se relacionó con un aumento de la percepción del dolor (117,118). Siendo así, no es sorprendente
hallar que la inhibición de la síntesis de PG usualmente
resuelva el dolor.
Por otro lado, la manipulación hormonal y la cirugía han sido eficaces en el manejo del dolor pelviano
asociado a la endometriosis (119). Un estudio reciente sugiere que la mejor modalidad para aliviar sustancialmente
el dolor en endometriosis es la supresión de la función
ovárica llevando a la paciente a una anovulación y eventualmente a una amenorrea (119). Los anticonceptivos
orales, los agonistas de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), el danazol y las progestinas han demostrado que reducen la producción de PG y, por lo tanto,
alivian el dolor pelviano en endometriosis (30,120).
Sobre la base de estos datos, se torna necesario
continuar investigando nuevas estrategias destinadas a inhibir la producción de PG en endometriosis con el objeto de
lograr controlar el dolor y el desarrollo de esta patología.
3.6 Tratamiento del dolor en endometriosis con inhibidores de la síntesis de prostaglandinas
El fuerte dolor pelviano que sufren las pacientes con endometriosis es uno de los síntomas que provoca más problemas a las mujeres que pretenden llevar un
ritmo de vida normal. Este síntoma se puede manifestar como dolor pelviano crónico, dolor previo o durante
el período menstrual, dispareunia, disuria o proctalgia.
Frente a esta problemática, es importante poder ofrecerles a las pacientes un alivio de sus síntomas y una mejor
calidad de vida.
Las concentraciones elevadas de PGE2 en el líquido peritoneal de las pacientes se consideran la principal causa del proceso del dolor y de inflamación en la
endometriosis (98). Con el objeto de reducir los niveles
de PG en endometriosis, se han realizado numerosos estudios que se han enfocado en la inhibición de la actividad de la COX, ya sea bloqueando en forma simultánea
las COX-1 y COX-2 o utilizando inhibidores selectivos
de las COX-2.
Los AINE son una gran familia de drogas que
inhiben la actividad de las COX disminuyendo la producción de PG y, en consecuencia, el dolor. Son comúnmente utilizados para el tratamiento de todo tipo de dolencia.
Entre ellos se encuentran: ibuprofeno, naproxeno, aspirina,
diclofenac. Todos estos compuestos inhiben de manera indiscriminada la actividad de las dos isoformas de la COX y
no es raro que a largo plazo produzcan efectos secundarios
adversos como una úlcera gastrointestinal debido a la inhibición de la actividad de COX-1 (121). Justamente para
hacer frente a estos efectos, se desarrollaron inhibidores
específicos de COX-2, comúnmente llamados coxibs.
Los coxibs desde su desarrollo fueron y son utilizados
en el tratamiento de la artritis.
El celecoxib pertenece a esta categoría de AINE
que inhiben de manera selectiva la COX-2. Otros coxibs
como valdecoxib o rofecoxib fueron desarrollados, pero
luego fueron retirados del mercado por la Administración de Alimentos y Drogas de Estados Unidos (FDA,
por su sigla en inglés) por causar efectos cardiovasculares adversos. El celecoxib no ha sido aprobado aún para
ser utilizado en el tratamiento de la endometriosis y no
se han realizado estudios que evalúen su capacidad antiinflamatoria en mujeres que sufren la enfermedad. Sólo
se ha reportado un estudio piloto, en el que se utilizó rofecoxib un tiempo antes de ser retirado del mercado, que
arrojó resultados muy positivos respecto a la utilización
de este tipo de drogas en el manejo del dolor asociado a
endometriosis (Cobellis 2004).
4. Terapéutica de la endometriosis
Hasta el momento, los tratamientos para la endometriosis se basan en la extirpación de las lesiones
endometriósicas durante la laparoscopía y en el mantenimiento de un ambiente hipoestrogénico para evitar el
crecimiento de las lesiones. Durante la laparoscopía exploratoria, en el momento que se obtiene material tisular
para realizar el diagnóstico preciso, las lesiones son extirpadas y las adherencias, liberadas. Este es el primer paso
en el tratamiento de la enfermedad. Luego de la cirugía se
puede administrar un tratamiento hormonal o no, según
criterio médico. Los tratamientos hormonales incluyen
los anticonceptivos orales y los análogos de la hormona
liberadora de gonadotrofinas (GnRH) como tratamientos
de primera línea; también se utilizan los progestágenos y,
en menor medida, los agentes androgénicos.
Los anticonceptivos orales combinados son
utilizados en el tratamiento de la endometriosis ya sea
en forma cíclica o continua, especialmente en mujeres
jóvenes que no buscan un embarazo y/o que padecen
grados variables de dismenorrea. También se los utiliza
como método preventivo para evitar la recurrencia de la
endometriosis en pacientes que han sido tratadas quirúrgicamente, aunque la eficacia de este tipo de tratamiento
no tiene una documentación sólida en la literatura.
Los anticonceptivos orales inhiben la ovulación, disminuyen los niveles de gonadotrofinas y reducen el flujo menstrual (122). En estudios realizados en
nuestro laboratorio se observó también que disminuyen
la proliferación celular y aumentan la apoptosis del tejido endometrial eutópico proveniente de pacientes con
endometriosis (123).
Las píldoras anticonceptivas son utilizadas en
el tratamiento de esta patología por tener muy buena
47
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
tolerancia, menor costo y menor impacto metabólico que
el danazol y los agonistas de GnRH (122). Algunos efectos secundarios no deseados incluyen: sangrado irregular,
ganancia de peso, hinchazón y dolores de cabeza (30). Es
importante tener en cuenta también que los anticonceptivos orales tienen un componente estrogénico y esto podría
producir una estimulación de la enfermedad (122). Además, los que se administran en forma cíclica, al permitir
la menstruación, provocarían contaminación de la cavidad
peritoneal con tejido endometrial y podrían estimular el
crecimiento de los implantes endometriósicos (30).
Los agonistas de GnRH se han constituido en la
opción terapéutica médica más utilizada, particularmente
en pacientes con dolor pelviano severo, donde esta forma de tratamiento administrada por vía inyectable y en
forma mensual ha mostrado una eficacia significativa
en la reducción de las lesiones (124). Los agonistas de
GnRH de depósito generan un estado de hipoestrogenemia a través de un mecanismo de supresión hipofisaria y
secundariamente gonadal, lo que lleva a la atrofia de los
implantes endometriósicos peritoneales. Es justo mencionar que este tipo de terapia no ha mostrado ser eficaz para
revertir la esterilidad, ya que luego de la finalización del
tratamiento con agonistas de GnRH la tasa de embarazo
no se ve modificada en comparación con las mujeres a las
que se les administra placebo (125-127). Por otro lado,
los agonistas de GnRH tampoco han sido eficaces como
tratamiento en algunas pacientes peri o posmenopáusicas
con endometriosis y dolor pelviano, ya que en estos casos
la fisiopatología del mantenimiento de los implantes estaría basada en un mecanismo extragonadal, distinto al de la
producción ovárica de estrógenos (30).
Por su modo de acción, los agonistas de GnRH
son hipoestrogénicos y provocan síntomas menopáusicos. Algunos ejemplos de estos compuestos utilizados
para tratar la endometriosis son: nafarrelina, buserrelina
y leuprolide (30). Los efectos colaterales a corto plazo
incluyen sofocones, sequedad vaginal, pérdida de la libido e inestabilidad emocional; asimismo utilizándolos
por largos períodos de tiempo provocan disminución de
la densidad ósea (34,36). Por esta razón se eligen esquemas cortos de tratamiento con agonistas de GnRH y
en la actualidad se están utilizando en combinación con
otros medicamentos para disminuir los efectos negativos
sobre el hueso.
Las progestinas constituyen otra opción terapéutica y actúan suprimiendo el eje hipotálamo-hipófisis-ovario, lo que provoca una represión de la ovulación
y disminución de los niveles de estrógenos en plasma
(128). Tienen efectos directos sobre el endometrio causando la atrofia tanto del tejido endometrial eutópico
como de las lesiones endometriósicas (129) y se han
demostrado también sus efectos antiangiogénicos (130).
48
La eliminación del flujo menstrual, evitando la contaminación de la zona peritoneal, sumado a los efectos
descriptos anteriormente, significan un beneficio para la
paciente que se somete a este tipo de tratamiento (131).
Dado que estos compuestos tienen buena tolerancia y
reducidos efectos metabólicos, su utilización de forma
prolongada en el tratamiento de la endometriosis puede
ser una alternativa apropiada si la paciente no busca el
embarazo (131).
El danazol es un agente androgénico de administración oral que induce la amenorrea suprimiendo
el eje hipotálamo-hipófisis-ovario, aumentando la concentración sérica de andrógenos y disminuyendo la de
estrógenos (34). Varios estudios realizados confirmaron la eficacia del danazol en el alivio de los dolores
asociados a la endometriosis (132-134). Sin embargo,
este compuesto tiene la desventaja de poseer propiedades anabólicas, lo que se traduce en efectos secundarios
tales como ganancia de peso, mialgia, acné, piel grasa,
bochornos e hirsutismo (135). El límite de duración del
tratamiento recomendado debido a estos efectos es de
seis meses, y en los últimos años su uso ha disminuido y
ha sido reemplazado por las otras opciones terapéuticas
mencionadas (34).
4.1 Inhibidores de la ciclooxigenasa-2 y control del crecimiento de las lesiones endometriósicas
Los tratamientos disponibles hasta el día de hoy
para tratar la endometriosis no son enteramente eficaces,
ya que si bien los síntomas de la enfermedad disminuyen
mientras se los está administrando, ninguna de estas terapias reduce de manera real las recidivas a las que las pacientes están expuestas. Es importante también recordar
que la terapéutica que se les ofrece a las pacientes con endometriosis posee efectos secundarios adversos. Además,
la imposibilidad del embarazo mientras se está bajo los
efectos del tratamiento es un factor que limita su uso por
períodos prolongados en mujeres deseosas de concebir.
Por estos motivos, la investigación en endometriosis se centra principalmente en la búsqueda de nuevas
alternativas terapéuticas para minimizar los efectos colaterales, disminuir los casos de recidivas y para permitir
que las mujeres puedan tener la posibilidad de intentar un
embarazo aunque se encuentren bajo tratamiento médico.
Los avances en los conocimientos sobre la fisiopatología
de la endometriosis han permitido que los investigadores
piensen en nuevos medicamentos que actúen en forma
más directa sobre los implantes en sí, que inhiban los mecanismos involucrados en el desarrollo de la enfermedad,
y que potencialmente sean más eficaces en su acción de
erradicar las lesiones endometriósicas (30,124).
Los cultivos de células epiteliales de endometrio eutópico fueron utilizados en nuestro laboratorio
Prostaglandinas y endometriosis - Dra. Gabriela F. Meresman
Revisión
como modelo para estudiar el impacto del inhibidor de
la COX-2, celecoxib, sobre el crecimiento endometrial.
Este trabajo lo comenzamos estudiando los efectos de
este compuesto sobre células en cultivo provenientes de
pacientes con endometriosis y de mujeres sin la enfermedad. Obtuvimos resultados alentadores al descubrir
que el celecoxib no sólo lograba inhibir la proliferación
celular, sino que aumentaba los niveles de apoptosis tanto para el caso de las células endometriales de pacientes
como de mujeres sin endometriosis (136). Estos datos
coinciden con los reportados por otros autores, que utilizaron inhibidores de la COX-2 y lograron inhibir el crecimiento tumoral (137-140).
Los inhibidores específicos de la COX-2 han
mostrado poseer la habilidad de inhibir el crecimiento
celular e inducir apoptosis y detención del ciclo celular
en distintos modelos in vivo y en líneas celulares tumorales (138,141,142). El tratamiento de distintas líneas
celulares tumorales con celecoxib induce la detención
del ciclo celular en fase G1, lo que está acompañado
de una disminución en la expresión de las ciclinas A,
B y D, un aumento en la expresión de inhibidores del
ciclo celular y una pérdida en la actividad de las quinasas dependientes de ciclinas (143,144). Asimismo se
ha propuesto que el celecoxib estaría inhibiendo el ciclo
celular a través de la inhibición de la proteína quinasa B
o por la enzima río arriba de ésta, la quinasa dependiente
de fosfoinositol 1 (145,146). Es posible que el mecanismo de la inhibición de la proliferación celular observado
en los cultivos de células epiteliales endometriales utilizados en nuestro trabajo sea semejante a los observados
en los modelos descriptos más arriba, sin embargo, son
necesarios estudios complementarios para dilucidar los
procesos moleculares implicados.
La importancia de estos resultados en la búsqueda
de nuevas alternativas terapéuticas para tratar la endometriosis es promisoria dado que, como ya hemos aclarado,
la COX-2 se sobreexpresa en las lesiones endometriósicas
(12). La sobreexpresión de la COX-2 induce la proliferación celular e inhibe la apoptosis (147). Siendo así, es
posible especular que el celecoxib resultaría eficaz para el
control del crecimiento endometriósico. Sin embargo, la
inhibición de la actividad de la COX-2 no sería la única
vía posible de acción del celecoxib en la disminución del
crecimiento celular ya que algunos trabajos advierten que
esta droga podría actuar por una vía independiente de la
expresión de la COX-2 (141,147,148).
La angiogénesis es un proceso fundamental implicado en la vascularización y, por lo tanto, en el desarrollo de la lesión endometriósica (59,149). Se han hallado
altos niveles de VEGF, principalmente producido por las
células endometriósicas y por los macrófagos peritoneales, en el fluido peritoneal de pacientes con endometriosis
(98,99,150). Se ha propuesto al VEGF como uno de los
factores responsables del establecimiento de la lesión y
de la angiogénesis patológica en endometriosis. Siendo
así, la importancia de hallar una droga que además de
inhibir el crecimiento endometrial reduzca los niveles de
este factor angiogénico es primordial.
La sobreexpresión de la COX-2 en células tumorales induce la angiogénesis ya que el aumento de
eicosanoides aumenta la expresión del VEGF y estimula la migración y proliferación de células endoteliales
(151,152). Inhibiendo la actividad de la COX-2, se eliminaría también la producción de PG, lo que llevaría a
una menor producción de VEGF y, por consiguiente, a
una inhibición de la angiogénesis así como de la progresión de la endometriosis (102). En consecuencia, nos
propusimos investigar el efecto del celecoxib sobre la
producción de PGE2 y VEGF en células endometriales
provenientes de pacientes con endometriosis.
Nuestros resultados indicaron que el celecoxib
fue eficaz para inhibir la producción de PGE2 por parte
de las células epiteliales endometriales en cultivo en todas las concentraciones evaluadas (136). Este efecto es
el reflejo de la inhibición de la actividad de la COX-2 por
parte del celecoxib y coincidió con lo observado en distintos trabajos realizados in vitro (137,144,147,153,154).
Sin embargo, y coincidiendo con lo reportado anteriormente, la concentración de celecoxib requerida para
inhibir la proliferación celular e inducir apoptosis en
nuestro sistema (50 mM) fue mayor que la necesaria para
inhibir la actividad de la COX-2 (25 mM), lo que indica
que el bloqueo de la actividad enzimática no sería suficiente para inhibir el crecimiento endometrial (137,154).
Más aun, cuando se adicionó de manera exógena PGE2
a los cultivos, no se obtuvo une reversión en los efectos
sobre la proliferación celular (136).
En nuestro estudio, además, hemos observado
que el celecoxib indujo una disminución significativa de
la producción de VEGF por parte de las células epiteliales
endometriales, hecho que se relacionaría con la inhibición de la angiogénesis (136). Estos datos son coincidentes con trabajos previos que reportaron que el celecoxib
inhibe la angiogénesis e induce la apoptosis de células
endoteliales tanto in vivo como in vitro (102,155). Acordando con nuestros resultados se ha observado también
que este compuesto disminuye los niveles de VEGF en
distintos sistemas celulares (102,137,139).
Estudios recientes advierten que la administración de agonistas del receptor nuclear PPARγ en combinación con inhibidores selectivos de la COX-2 resulta
efectiva para inhibir el crecimiento tumoral (156). Basándonos en esos datos y en nuestros estudios realizados en
células en cultivo, administramos celecoxib en conjunto
con rosiglitazona a ratones con endometriosis inducida
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Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
quirúrgicamente. El modelo de endometriosis en ratón
con el que contamos en el laboratorio está amplia y extensamente aceptado para el estudio de esta enfermedad
(157-159).
Nuestros resultados nos permitieron confirmar
que el tratamiento con celecoxib inhibió tanto el establecimiento como el crecimiento de las lesiones endometriósicas luego de cuatro semanas de tratamiento. Además, la terapéutica combinada tuvo efectos inhibitorios
sobre el número de lesiones establecidas. De acuerdo
con nuestros datos, podemos sugerir que el celecoxib
sería el responsable de la inhibición del número de lesiones provocada por la terapéutica combinada ya que
la rosiglitazona administrada de manera individual no
tuvo efecto sobre este parámetro y tampoco mejoró el
resultado individual del celecoxib al administrarla de
manera conjunta. Por lo tanto, podemos especular que
en el tiempo de tratamiento y con las dosis utilizadas, el
celecoxib resultaría ser un inhibidor más potente del establecimiento endometriósico que la rosiglitazona (159).
Para investigar acerca de los mecanismos implicados en la inhibición de la endometriosis experimental
estudiamos la proliferación celular, la apoptosis y la densidad vascular en las lesiones endometriósicas desarrolladas luego de los distintos tratamientos administrados.
Pudimos observar que luego de administrar celecoxib, rosiglitazona o su combinación, las lesiones endometriósicas presentaron una disminución significativa
de células en activa proliferación celular, una reducción
de la densidad vascular y un aumento de los niveles de
apoptosis. Sin embargo, en ningún caso obtuvimos un
efecto benéfico adicional al combinar las drogas que al
administrarlas por separado (159).
En cuanto a la inhibición del crecimiento y vascularización, y en concordancia con nuestros datos, se
ha reportado que los inhibidores de la COX-2 suprimen
el crecimiento de tumores establecidos en animales, reducen el riesgo de cáncer en pacientes y previenen la tumorigénesis (160). Asimismo, se han probado diversos
inhibidores selectivos de la COX-2 en distintos modelos
de roedores, y se ha demostrado su eficacia para prevenir el establecimiento de los implantes endometriósicos
(161) y el crecimiento de las lesiones ya establecidas
(162,163). Además, el grupo de Ozawa demostró que el
kk51NS398, otro inhibidor de la COX-2, posee actividad antiangiogénica en un modelo de endometriosis en
ratones con inmunodeficiencia combinada severa (162).
Para culminar, evaluamos el contenido de PG en
el líquido peritoneal de los ratones y observamos que solamente el grupo que había sido tratado con el inhibidor
de la COX-2 presentaba una menor concentración de los
metabolitos de PGE respecto al control (159). Este dato
resultó coherente con el mecanismo de acción del celeco50
xib ya que actúa inhibiendo la actividad enzimática y, por
lo tanto, disminuyendo los niveles de su producto. Esta información resulta también complementaria a los resultados obtenidos in vitro previamente mencionados (136). El
hecho de no obtener una disminución de este parámetro
luego del tratamiento con rosiglitazona no nos sorprendió,
ya que se ha reportado que el tratamiento con agonistas de
PPARγ no sólo no disminuye la síntesis de PGE, sino que
en algunos casos puede verse aumentada (164).
Conclusiones
La importancia de las PG en la fisiopatología
de la endometriosis fue abordada en este trabajo desde
varios puntos de vista. Hoy conocemos que estas moléculas no sólo están implicadas en el dolor asociado a la
enfermedad, sino que son partícipes clave del desarrollo
y establecimiento de la endometriosis.
La investigación básica y clínica en la terapéutica del cáncer muchas veces nos inicia en nuevas drogas
utilizadas para inhibir la progresión tumoral que pueden
ser pensadas también para detener el crecimiento de la
lesión endometriósica. Los inhibidores de la COX-2 fueron y son actualmente utilizados en numerosos ensayos
preclínicos y clínicos en distintos tipos de cáncer.
El celecoxib es el único AINE que está actualmente aprobado por la FDA para el tratamiento de la poliposis adenomatosa familiar (PAF). Este tipo de cáncer
hereditario es responsable del 1% de los casos de cáncer
colorrectal que se diagnostican (165). Además, son diversos los protocolos que han combinado la quimioterapia estándar con celecoxib para el tratamiento del cáncer
(166-172). El celecoxib ha mostrado ser el AINE más potente en inhibir la proliferación celular. Se ha observado
que otros AINE tradicionales y selectivos, si bien inhiben
eficazmente la producción de PGE2, no poseen las cualidades antiproliferativas que posee el celecoxib (144). Además del tratamiento de la PAF, el celecoxib está indicado
para aliviar los síntomas de la artritis y osteoartritis, para
la dismenorrea y luego de cirugías dentales u ortopédicas.
Resulta importante buscar nuevos horizontes en
la terapéutica de la endometriosis. Las PG y sus enzimas
clave de síntesis, las COX, representan hoy un blanco
atractivo para desarrollar nuevas terapéuticas que ataquen directamente a las moléculas involucradas en las
causas de esta patología.
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Análisis crítico por expertos de trabajos seleccionados
Resumen del trabajo seleccionado para el análisis crítico
Óxido nítrico sintetasa y nitración en tirosina en la astenozoospermia:
un estudio inmunológico
Nitric oxide synthase and tyrosine nitration in idiopathic asthenozoospermia:
an immunohistochemical study
Eleonora Salvolini, Eddi Buldreghini, Guendalina Lucarini, Arianna Vignini, Roberto Di Primio y
Giancarlo Balercia
Resumen
Objetivo: caracterizar el patrón de expresión de
las isoformas constitutivas e inducible de la no sintetasa
de espermatozoides aislados de donantes fértiles normozoospérmicos y astenozoospérmicos infértiles, mediante
el uso de inmunocitoquímica. Además, evaluar la expresión de citrulina, un marcador de la actividad de la no
sintetasa y de nitrotirosina, la que indica la formación de
peroxinitrito, que podría afectar la funcionalidad espermática a través de su acción citotóxica.
Diseño: estudio prospectivo. Fuente de pacientes: centro académico de infertilidad masculina. Pacientes:
29 pacientes infértiles con astenozoospermia idiopática y
26 donantes fértiles normozoospérmicos emparejados por
edad. Intervención: se evaluaron parámetros espermáti-
cos y se realizó inmunocitoquímica en espermatozoides
aislados. Medidas realizadas: análisis seminal para determinar volumen, conteo espermático, motilidad y morfología. Expresión inmunocitoquímica de isoformas de
no sintetasa, citrulina y nitrotirosina.
Resultados: la expresión de isoformas constitutivas de no sintetasa fue mayor en espermatozoides
aislados de pacientes con astenozoospermia.
Conclusión: nuestros resultados refuerzan la
hipótesis de que una mayor actividad de no sintetasa y
un exceso de nitración en residuos tirosina podrían afectar la funcionalidad de espermatozoides en la astenozoospermia idiopática.
Palabras clave: astenozoospermia, células espermáticas, no sintetasa, nitrotirosina, inmunocitoquímica.
Dra. Silvina Pérez Martínez
Investigadora Adjunta CONICET
La infertilidad afecta aproximadamente al 15%
de las parejas en edad reproductiva y el factor masculino
es importante en casi la mitad de estos casos. El papel
del estrés oxidativo como una de las principales causas de
infertilidad masculina ha sido bien establecido (Agarwal
y cols., 2011). De hecho, las especies reactivas del oxígeno como el óxido nítrico (NO) pueden afectar todos los
componentes celulares, incluyendo los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas, las proteínas y los ácidos
nucleicos (Kothari y cols., 2010; Baker y cols., 2004).
La astenozoospermia es una causa común de infertilidad masculina y, aunque en la mayoría de los casos
su origen es desconocido, se la puede asociar con infecciones en el tracto reproductor, varicocele, autoanticuerpos y, a nivel celular, con alteraciones morfológicas
de los flagelos (Afzelius y cols., 1979; Escalier, 1984;
Chemes y cols., 1998; Mitchell y cols., 2006; Moretti y
cols., 2008). La etiología de esta patología incluye una
serie de defectos bioquímicos, estructurales y funcionales, entre ellos la sobreproducción de NO.
El NO es un radical libre que se produce por la
oxidación de la L-arginina a L-citrulina por acción de tres
isoformas de la NO sintasa (NOS): la neuronal nNOS,
la endotelial eNOS y la inducible iNOS. El NO tiene un
importante rol en la patofisiología espermática dado que
sus concentraciones bajas favorecen el proceso de capacitación espermática, la reacción acrosomal y la unión a
zona pelúcida (Herrero y cols., 2007; Zini y cols., 1995;
Sengoku y cols., 1998). Sin embargo, las concentraciones
elevadas de NO llevan a la formacion de peroxinitritos, un
poderoso agente oxidante, lo que conduce a la célula espermática a un estado de estrés oxidativo y de esta manera, a la alteración de su funcionalidad, como la motilidad
(Weinberg y cols., 1995; Balercia y cols., 2004).
En este trabajo los autores evalúan, mediante la
técnica de inmunohistoquímica, la expresión de las enzimas NOS, de la L-citrulina (como indicador de la actividad
de NOS) y la de nitrotirosina (como indicador del daño celular por exceso de NO) en espermatozoides de pacientes
normospérmicos y astenozoospérmicos idiopáticos.
57
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Los resultados muestran que los espermatozoides provenientes de los pacientes astenozoopérmicos
poseen una sobreexpresión de la enzima iNOS y un incremento en la producción de citrulina, así como también
una mayor proporción de células espermáticas con marcación para nitrotirosina, comparados con los normospérmicos. Esto sugiere una mayor producción de NO, lo
que podría tener efectos negativos sobre la estructura y
función de las proteínas (Radi y cols., 2004), y traducirse en una disfunción espermática y en la disminución
de la capacidad fecundante de los espermatozoides. Previamente, estos mismos autores reportaron una sobreproducción de NO en los espermatozoides de pacientes
astenozoospérmicos que se correlaciona negativamente
con la motilidad. Por lo tanto, lo novedoso de este trabajo
es el desarrollo de la técnica de inmunohistoquímica para
determinar in situ la producción de NO y la posibilidad
de evaluar el daño celular por esta molécula.
La base molecular de la astenozoospermia aún
es desconocida. Hasta el momento es escasa la información acerca del estudio de la expresión y función de
posibles moléculas espermáticas que pueden correlacionarse con el fenotipo de los espermatozoides de pacientes astenozoospérmicos. La búsqueda de moléculas
marcadoras de esta patología, tanto para el diagnóstico
como para la identificación de blancos terapéuticos, es
un tema de constante estudio. En los últimos 5 años, mediante el desarrollo de la proteómica, varios grupos están
investigando la sobreexpresión o subexpresión proteica
como posibles blancos para el diagnóstico (MartínezHeredia y cols., 2008). Sin embargo, hasta la fecha, no
hay disponible una terapia realmente eficaz para la astenozoospermia, y estos pacientes deben recurrir a los
tratamientos con las técnicas de reproducción asistida.
El trabajo del grupo de Balercia es interesante en
cuanto al aporte para la búsqueda de nuevas estrategias
terapéuticas para este tipo de patología que tiene gran implicancia en la fertilidad masculina. Además, la determinación de los niveles de las especies reactivas del oxígeno
en el semen de pacientes antes de una fecundación in vitro
(FIV) puede ser útil en la predicción del resultado de la
FIV y en el asesoramiento a los pacientes seleccionados
con el factor masculino o infertilidad idiopática.
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on the heterogeneity of the immotile-cilia syndrome. J Ultrastruct Res. 1979;69(1):43-52.
- Agarwal A, Allamaneni SS. Free radicals and male reproduction. J Indian Med Assoc. 2011;109(3):184-87.
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- Balercia G, Moretti S, Vignini A, Magagnini M,
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nitric oxide promote sperm capacitation in vitro. J
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Análisis crítico
Dr. Uriel Pragier
Endocrinólogo, Sexólogo clínico, Hospital Churruca
Salvolini y cols., en esta ocasión, demuestran
nuevamente el efecto deletéreo del estrés oxidativo sobre la fertilidad.
Sabemos que el NO, sustancia ampliamente
distribuida en el organismo, es producido a partir de la
arginina y da como resultado, además, la citrulina, por
la NO sintetasa, de la que se conocen varias isoformas.
En los espermatozoides el NO se combina con
el superóxido y se obtiene el peroxinitrito, que genera
las nitrotirosinas por nitración de los residuos tirosina
de diversas proteínas. Esta nitración dificultará su fosforilación y, con ello, las vías normales de señalización
celular. El aumento del estrés oxidativo exacerbará este
mecanismo.
Se analizan, en este trabajo, los espermatozoides de 29 astenozoospérmicos idiopáticos infértiles y de
26 normozoospérmicos fértiles y se determina, por inmunohistoquímica, la presencia y el grado de expresión
de distintas isoformas de la NO sintetasa. La neuronal y
la endotelial, isoformas constitutivas, se expresan predominantemente en espermatozoides normales y la inducible, en espermatozoides de astenozoospérmicos.
Estos hallazgos concuerdan con evidencias previas que le dan un rol fisiológico a las isoformas constitutivas y patológico a la isoforma inducible al generar
esta última mucha cantidad de NO (y, por ende, de nitración proteica).
En la misma línea encuentran mayores niveles
de citrulina (signo de mayor producción de NO) y de
nitrotirosina (evidencia de mayor nitración proteica) en
espermatozoides de astenozoospérmicos.
Hay que tener presente que, no obstante lo
anteriormente expuesto, el NO es un componente fundamental de la fisiología espermática (interviene en la
capacitación, reacción acrosomal, etc.), lo mismo que
un determinado nivel de estrés oxidativo. Esto queda
evidenciado, en este trabajo, por la detección de NO
sintetasa, citrulina y nitrotirosina en espermatozoides
normales.
Los autores trabajan en la relación entre estas
alteraciones y la astenozoospermia idiopática en pacientes infértiles. Probablemente en pacientes fértiles con astenozoospermia idiopática pueda observarse lo mismo,
aunque lo que ocurre en el caso de pacientes normozoospérmicos infértiles y/o teratozoospérmicos idiopáticos,
infértiles o no (por ejemplo, aquellos con aumento de la
fragmentación de ADN, algo muy vinculado al aumento
del estrés oxidativo), no necesariamente es extrapolable
al caso de los pacientes estudiados.
También constituye un interrogante los potenciales efectos deletéreos de estos procesos sobre el desarrollo embrionario posterior.
La evidencia arrojada por estos autores podría
ayudar a abrir nuevas estrategias terapéuticas en el futuro. La disminución de la nitración proteica podría, por
ejemplo, beneficiar a aquel grupo de pacientes astenozoospérmicos con probada disminución de la actividad
Na/K ATPasa, de relacionarse esta disfunción con trastornos en la fosforilación secundarios a nitración proteica.
59
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Novedades bibliográficas
Inducción de la pubertad por trasplante autólogo de
tejido ovárico criopreservado
Induction of puberty by autograft of criopreserved ovarian tissue
Catherine Poirot, Fadi Abirached, Marie Prades, Christiane Coussieu, Francoise Bernaudin, Pascal Piver
Unit of Reproductive Biology and Medical Biochemistry Department, Group Hospitalier Pitié-Saletriére, Paris, France;
Gynecology-Obstetric Department and Reference Centre for Sickle Cell Disease, Department of Pediatrics, Intercomunal
Créteil Hospital, Créteil, France; Gynaecology-Obstetric Department, Limoges France and Université Pierre et Marie
Curie, Paris, France.
Lancet 2012; 379:588
En noviembre de 2003, una niña de 10 años, con
enfermedad severa homocigota de células falciformes,
fue referida a nuestra unidad de biología reproductiva
solicitando criopreservación de tejido ovárico previo a
régimen mieloablativo seguido de trasplante alogénico
de células madre hematopoyéticas. La falla ovárica es
común en pacientes en estas condiciones. La niña medía
1,42 cm, pesaba 31 kg y no presentaba signos de desarrollo puberal. Se realizó ooforectomía derecha por laparoscopía bajo anestesia general. El tejido ovárico fue
transferido al laboratorio de reproducción donde se aisló
la corteza y se seleccionaron 23 fragmentos, que fueron
criopreservados según protocolo de enfriamiento lento.
El análisis microscópico de los fragmentos mostró una
densidad de 8,6 folículos primordiales por mm2. Veintisiete meses después del trasplante, la paciente de 13
años y su madre retornaron al laboratorio de reproducción para solicitar autotrasplante de tejido ovárico con
el objeto de inducir la pubertad. La anemia de células
falciformes se había curado. Ella medía 1,56 cm, pesaba
39 kg, y aún no mostraba signos de pubertad. Su edad
ósea era de 13 años. Los ensayos hormonales mostraron
concentraciones de FSH de 71,7 UI/l y LH de 24,1 UI/l,
estradiol menor de 73 pmol/l, inhibina B menor de 0,71
pmol/l. El trasplante se realizó en enero de 2007, bajo
anestesia local de acuerdo con el procedimiento descripto por Roux y colaboradores. La localización del trasplante autólogo se realizó en el tejido subcutáneo en la
pared abdominal izquierda a la altura del crecimiento del
futuro vello púbico, entre la piel abdominal y el músculo. Se abrió un pequeño bolsillo y se depositaron dentro
60
de él tres fragmentos de ovario. Los perfiles hormonales
en el primer día del trasplante mostraron los siguientes valores: FSH: 89 UI/l; LH: 36 UI/l; estradiol menor
de 37 pmol/l y AMH menor de 0,18 pmol/l. Dos meses
después del trasplante autólogo, comenzó el crecimiento mamario bilateral y alcanzó el estadio de Tanner S3.
A los tres años y tres meses después del autotrasplante
nuestra paciente medía 1,72 cm y pesaba 52 kg. Menstruó regularmente durante 2 años después del trasplante
y posteriormente presentó irregularidades.
La criopreservación de tejido ovárico previo a
un tratamiento que provoque esterilidad puede preservar
la función ovárica. Trece niños han nacido en el mundo
como consecuencia de autotrasplante de fragmentos de
tejido ovárico. Este reporte muestra por primera vez que
la pubertad puede ser inducida por trasplante autólogo
de tejido ovárico criopreservado previo a un procedimiento que ocasione esterilidad. Esto puede lograrse
con algunos fragmentos de tejido ovárico que muestren
una densidad normal de folículos primordiales. Este
caso muestra por primera vez la restauración de la función ovárica con tejido obtenido previo a la pubertad.
Todos los pasos del procedimiento fueron realizados
con el mayor cuidado posible con el objeto de minimizar los riesgos para la paciente y permitieron preservar
el tejido previo al trasplante alogénico de células madre
hematopoyéticas, único tratamiento curativo para la enfermedad de células falciformes. El trasplante autólogo
de tejido ovárico puede restaurar la fertilidad e inducir la
pubertad, sustituyendo así los tratamientos hormonales.
Novedades bibliográficas
La exposición a líquido folicular rico en lípidos se asocia a estrés del
retículo endoplásmico liso y alteración de la maduración ovocitaria en
los complejos cúmulo-ovocito
Exposure to lipid-rich follicular fluid is associated with endoplasmic reticulum stress and
impaired oocyte maturation in cumulus-oocyte complexes
Xing Yang, M.D., PhD.,a,b Linda L. Wu, PhD.,b Lindsay R. Chura,b Xiaoyan Liang, M.D.,a Michelle Lane, PhD.,b
Robert J. Norman, M.D.,b and Rebecca L. Ronker, PhD.b
a
Reproductive Medical Center, Sixth Affiliated Hospital of Sun Yan-sen University, Guangzhou,
People’s Republic of China; and b Robinson Institute, School of Paediatrics and Reproductive Health,
University of Adelaide, South Australia, Australia
Objetivo: determinar si el alto contenido de lípidos del líquido folicular humano influye en la maduración ovocitaria.
Diseño: ovocitos de ratón en reemplazo de ovocitos humanos fueron expuestos a fluidos foliculares con
diferente contenido de lípidos y monitoreados en su desarrollo.
Lugar: clínica privada de infertilidad y laboratorio universitario.
Pacientes: setenta y cuatro mujeres que requieren reproducción asistida, y ratones estimulados con gonadotrofinas.
Intervención(es): dosaje de triglicéridos y ácidos grasos libres en líquido folicular, y estimulación de
complejos cúmulo-ovocitarios de ratón hasta la madurez
in vitro en presencia de fluido folicular pobre o rico en
lípidos.
Mediciones/parámetros principales: el contenido lipídico de ovocitos, la expresión de genes marcadores de estrés del retículo endoplásmico, y la maduración ovocitaria en complejos cúmulos-ovocitarios de
ratón expuestos a fluido folicular rico en lípidos fueron
comparados con complejos cúmulo-corona expuestos a
fluidos foliculares pobres en lípidos y complejos madurados in vivo.
Resultado(s): los fluidos foliculares fueron obtenidos de mujeres con IMC conocido sometidas a aspiración ovocitaria en una clínica privada de infertilidad,
y se midió en ellos el contenido de triglicéridos y ácidos
grasos libres; se seleccionaron aquellos con los más altos y los más bajos niveles. Los complejos de cúmuloovocito de ratón expuestos a los fluidos de mayor contenido lipídico durante su maduración tuvieron niveles
aumentados de lípidos en los ovocitos, mayor expresión
de marcadores génicos de estrés en el retículo endoplásmico y alteración de la maduración nuclear ovocitaria.
Conclusión(es): un IMC aumentado se asocia a
aumento de triglicéridos y ácidos grasos libres en fluido
folicular ovárico. La maduración ovocitaria en ambientes ricos en lípidos va en detrimento de los ovocitos (Fertil Steril. 2012;97:1438-43).
Palabras clave: ATF4, ATF6, endoplasmic reticulum stress, free fatty acids, GRP78, lipotoxicity, obesity, triglycerides.
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Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
Calendario de Eventos
Calendario de eventos nacionales
e internacionales
Noviembre 2012
XVII Congreso Internacional de Ginecología
Infanto-Juvenil: “40 años de SAGIJ. Ayer y Hoy
de la Ginecología Infanto-Juvenil”
22 y 23 de noviembre
Panamericano Hotel & Resort
Carlos Pellegrini 551
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Informes e inscripción:
E-mail: [email protected]
Workshop “Steroid Hormones in Physiology and
Disease: from Bench to bedside”
12 de noviembre
Instituto de Biología y Medicina Experimental
Vuelta de Obligado 2450, Ciudad Autónoma de
Buenos Aires
Informes e inscripción:
E-mail: [email protected]
Diciembre 2012
The world congress of clinical lipidology
6-8 de diciembre
Budapest, Hungría
Informes e inscripción: [email protected]
Febrero 2013
5th Latin American Symposium on Maternal fetal
interaction and Placenta (SLIMP) and 4th Latin
American Symposium on Reproductive
Immunology (LASRI)
18-20 de febrero
Cataratas del Iguazú, Brasil
Informes e inscripción: [email protected]
Marzo 2013
15th World Congress on Human Reproduction
13-16 de marzo
Venecia, Italia
Informes e inscripción: http://www.humanrep2013.com
62
17th World Congress of Pediatric and Adolescent
Gynecology
15-17 de marzo
Hong Kong, China
Informes e inscripción: [email protected];
http://pag.obg.cuhk.edu.hk/congress
Society for Gynecological Investigation 60th
Annual Scientific Meeting
20-23 de marzo
Orlando, Florida, EE.UU.
Informes e inscripción: http://www.sgionline.
org/2013-annual-meeting
Mayo 2013
12th Meeting International Society for Immunology
of Reproduction
29 de mayo-2 de junio
Boston, Massachusetts, EE.UU.
Informes e inscripción: http://www.isir.org.in/meetings.htm
Octubre 2013
24th Annual Meeting of The North American
Menopause Society (NAMS)
9-12 de octubre
Dallas, Texas, EE.UU.
Informes e inscripción: [email protected]; www.
menopause.org
IFFS 21st World Congress on Fertility & Sterility
International Federation of Fertility Societies
(IFFS)
12-17 de octubre
Boston, MA, EE.UU.
Informes e inscripción:
[email protected]
www.iffs-reproduction.org
[email protected]
69th Annual Meeting American Society for
Reproductive Medicine (ASRM)
12-17 de octubre
Boston, MA, EE.UU.
Informes e inscripción: [email protected], www.asrm.org
Reglamento de publicaciones
Reglamento de Publicaciones
Generalidades
Los manuscritos deben tipearse a doble espacio
en papel tamaño A4, en Word for Windows, fuente Times New Roman, tamaño 12, con márgenes de al menos
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compacto).
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La Revista consta de los siguientes espacios:
Informe de Secretaría; Actualización; Revisión;
Trabajo original; Trabajos distinguidos; Monografía;
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Novedades bibliográficas; Industria informa; Calendario
de eventos; Reglamento de publicaciones; Reglamento
interno SAEGRE; Casos clínicos; Correo de lectores.
Se podrán enviar artículos para publicar en las
siguientes secciones: Actualización; Revisión; Trabajo
original de investigación; Casos clínicos y Correo de
lectores.
Todos los artículos enviados deberán incluir en la
primera página:
Título completo del artículo en castellano y en
inglés; nombre y apellido del/los autor/es; título profesional; institución/es afiliada/s; dirección postal y electrónica del autor principal. Se deberá incluir además un
título breve, de menos de 50 caracteres.
Se debe utilizar el formato que se ejemplifica a continuación:
La endometriosis es un factor de riesgo de hemoperitoneo espontáneo durante el embarazo
Endometriosis is a risk factor for spontaneous hemoperitoneum during pregnancy
Ivo A. Brosens, Luca Fesi, Jan J. Brosens
Leuven Institute for Fertility and Embryology, Leuven,
Belgium
E-mail: [email protected]
Los artículos de Actualización, Revisión y Trabajos
originales de investigación deberán además incluir:
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Actualizaciones y Revisiones
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con el reglamento de la Revista de SAEGRE. Se solicita
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Revisión y Trabajos originales de investigación
Se deberá configurar el manuscrito de la siguiente forma:
El resumen deberá incluir: objetivo, diseño, metodología, resultados y conclusiones. Extensión no superior a las 250 palabras.
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Resultados; Discusión; Agradecimientos; Referencias;
Tablas; Figuras; Epígrafes.
Casos clínicos
Los casos clínicos deben ser concisos, informativos y con un límite de hasta 10 páginas a doble espacio,
con hasta dos tablas/figuras.
Correo de lectores
Esta sección consiste en un espacio para comentarios de artículos publicados o comunicaciones de
interés. Las cartas no deben exceder las 600 palabras, a
doble espacio y con un límite de hasta 10 referencias. Incluir dirección completa, teléfono/fax y dirección de correo electrónico. No incluir resumen ni título en inglés.
El editor de la REVISTA SAEGRE se reserva el
derecho de acortar las cartas que no se ajusten a las especificaciones mencionadas y realizar todo cambio que
considere necesario con el objetivo de mantener el estilo
de la Revista.
Referencias bibliográficas
Se debe utilizar el estilo Vancouver. El número de referencias máximo por artículo es 50. Numerar
las referencias bibliográficas en forma consecutiva, en
el orden en que fueron mencionadas por primera vez en
el texto y entre paréntesis (Ejemplos: Texto (1), Texto
(1-3), que identifica las citas 1 y 3, Texto (1,4), que identifica las citas 1 y 4, Texto (1, 5-7) que identifica las citas
1 y 5 a 7). En cada una de ellas deben figurar todos los
autores si el trabajo tuviera hasta 6 autores, o 6 autores,
seguido de “et al.” si tuviera más de 6 autores. Las referencias bibliográficas que aparecen por primera vez en
tablas y figuras deben ser numeradas en el orden que
sigue el texto en donde se menciona el texto o la figura.
Las observaciones personales no publicadas
o comunicaciones personales no podrán ser utilizadas
como referencias. Pueden incluirse referencias a textos aceptados no publicados aún agregando la frase “en
63
Revista SAEGRE - Volumen XIX - Nº 3 - Noviembre de 2012
prensa”. La información de artículos en vías de aceptación puede ser incluida como “observaciones no publicadas”.
Se debe utilizar el formato de referencias bibliográficas
que se ejemplifica a continuación:
• Artículos de Revistas
1. Takihara H, Sakatoku J, Cockett ATK. The pathophysiology of varicocele in male infertility. Fertil Steril 1991;
55:861-8.
• Libros
2. Colson JH, Armour WJ. Sports injuries and their treatment, 2nd ed rev. London: S. Paul; 1986:478.
3. Weinstein L, Swartz MN. Pathologic properties of invading microorganisms. En: Sodeman WA Jr, Sodeman
WA, eds. Pathologic physiology: mechanisms of disease, Vol. 1. Philadelphia: WB Saunders; 1974:457-72.
• Resúmenes publicados en actas de Congresos y Simposios
4. O’Hanley P, Sukri N, Intan N. Morbidity and mortality trends of typhoid fever due to Salmonella typhi at
the Infectious Disease Hospital (IDH) in North Jakarta
from 1984 to 1991 [abstract no. 945]. En: Program and
abstracts of the 32nd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC:
American Society for Microbiology; 1992:268.
• Cartas
6. Kremer J. Yardsticks for successful donor insemination [letter]. Fertil Steril 1991; 55:1023-4.
• En Prensa
7. Lillywhite HB, Donald JA. Pulmonary blood flow regulation in an aquatic snake. Science 2009 (En prensa).
• Textos electrónicos, bases de datos y programas informáticos.
8. Library of Congress. History and development of the
Library of Congress machine-assisted realization of
the virtual electronic library [en línea]. [Washington,
DC: Library of Congress], 15 June 1993. <gopher://
lcmarvel.loc.gov:70/00/about/history> [Consulta: 5
mayo 1997].
Las características de las citas electrónicas son:
64
Responsable principal. Título [tipo de soporte].
Responsable(s) secundario(s)*. Edición. Lugar de publicación: editor, fecha de publicación, fecha de actualización/revisión. Descripción física*. (Colección)*. Notas*. Disponibilidad y acceso** [Fecha de consulta]**.
Número normalizado*.
Los elementos en letra cursiva deben ir en cursiva o subrayados en la referencia; los elementos entre corchetes
deben anotarse con esta puntuación; los elementos señalados con un asterisco (*) son opcionales; los elementos señalados con dos asteriscos (**) son obligatorios
en el caso de los documentos en línea.
Abreviaturas y símbolos
Utilizar sólo abreviaturas estándar; en caso contrario, definirlas la primera vez que son utilizadas y procurar no incluirlas en exceso.
Tablas, ilustraciones, epígrafes y permisos
• Tablas
Deberán tipearse a doble espacio en páginas separadas y deberán ser numeradas en números arábigos
en el orden que fueron citadas en el texto por primera
vez. Los textos explicativos se incluirán en la forma de
notas de pie de página, no en el encabezado. Para las notas de pie de página, utilizar letras minúsculas en forma
secuencial (a, b, c, etc.) en superíndice. Las tablas se referirán en el texto entre paréntesis, en letra mayúscula, y
en números arábicos consecutivos, ejemplo (TABLA 1).
• Ilustraciones y epígrafes
No se aceptarán gráficos ni fotos en color. Las
fotografías se enviarán en blanco y negro, en formato digital y con la mayor resolución posible (mayor de 200 ppp
o, de ser posible, mayor de 280 ppp). Las ilustraciones se
referirán en el texto entre paréntesis, en letra mayúscula
y en números arábigos consecutivos, ejemplo (FIGURA
1). Los epígrafes (aclaraciones de las figuras) deberán tipearse a doble espacio al pie de la figura correspondiente.
• Permisos
Todo material tomado de otras fuentes deberá
estar acompañado de un consentimiento por escrito que
otorgue el permiso a la REVISTA DE SAEGRE para su
reproducción.