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Universidad de la Habana
Facultad de Biología
Estudio de la respuesta inmune humoral inducida con la vacuna CIMAvax‐EGF y de su relación con la supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas Tesis presentada en opción al grado científico de
Doctor en Ciencias Biológicas
Autor: MCs Beatriz García Verdecia
Tutor: DrCs Agustín Lage Dávila
Centro de Inmunología Molecular
La Habana
2011
Abreviaturas
Abreviaturas
Acs
anticuerpos
AcM
anticuerpo monoclonal
ADCC
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (del inglés "antibody- dependent
cellular cytotoxicity")
ANOVA
análisis de varianzas (del inglés “analysis of variance”)
APC
célula presentadora de antígenos (del inglés "antigen presenting cell")
BR
buenos respondedores
BSA
albúmina de suero bovina (del inglés “bovine serum albumin”)
CD
moléculas de diferenciación (del inglés “cluster of differentiation”)
CPCNP
cáncer de pulmón de células no pequeñas
CTL
linfocitos T citotóxicos (del inglés "cytotoxic T lymphocytes")
DEC
dominio extracelular
DMEM
medio Dulbecco modificado (del inglés “Dulbecco’s modified Eagle’s medium”)
ELISA
ensayo inmunoenzimático colorimétrico en fase sólida (del inglés "enzime-linked
immunosorbent assay")
EGF
factor de crecimiento epidérmico (del inglés "epidermal growth factor”)
FGF
factor de crecimiento de fibroblastos (del inglés “fibroblast growth factor”)
GM-CSF
factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (del inglés
"granulocyte-macrophage colony stimulating factor)
HB-EGF
factor de crecimiento que une heparina (del inglés “heparin binding-EGF”)
HER2/neu
receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo 2 (del inglés "human epidermal
growth factor receptor type 2")
HSP
proteínas de estrés térmico (del inglés "heat-shock proteins")
Abreviaturas
ILGF
factor de crecimiento similar a insulina (del inglés “insuline-like growth factor”)
MAPK
proteína cinasa activada por mitógenos (del inglés “mitogen-activated protein
kinase”)
MR
malos respondedores
PDGF
factor de crecimiento derivado de plaquetas (del inglés “platelet-derived growth
factor”)
PI3K
fosfatidil inositol-3-cinasa (del inglés “phosphatidylinositol-3-kinase”)
RECIST
criterios de evaluación de respuestas en tumores sólidos (del inglés “response
evaluation criteria in solid tumors”)
REGF
receptor del EGF
SBR
súper-respondedores
SDS
dodecil sulfato de sodio (del inglés "sodium dodecylsulphate")
SDS-PAGE
geles de poliacrilamida con SDS
SSTF
solución salina tamponada con fosfato
TGFα
factor de crecimiento transformante α (del inglés "transforming growth factor α")
TKI
inhibidor tirosina cinasa (del inglés"tyrosine kinase inhibitor")
TLR
receptor tipo Toll (del inglés “Toll like receptor”)
VEGF
factor de crecimiento de la vasculatura endotelial (del inglés “vascular endotelial
growth factor”)
Síntesis
Síntesis
El sistema del receptor del factor de crecimiento epidérmico (REGF) y sus ligandos es
considerado un blanco atractivo para la inmunoterapia dirigida a los tumores de origen epitelial.
De los cánceres de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), entre el 40 y el 80% sobreexpresan el REGF, lo cual se ha asociado con mal pronóstico y con la resistencia a los agentes
citotóxicos. Esta localización tumoral se ha escogido para el desarrollo de varios ensayos clínicos
fase I/II con la vacuna CIMAvax-EGF que se basan en la inmunización activa con el factor de
crecimiento epidérmico (EGF), uno de los ligandos principales del REGF. En este trabajo se
evalúan dos esquemas de tratamientos diferentes para demostrar por primera vez que la
generación de anticuerpos neutralizantes anti-EGF en pacientes con CPCNP, es capaz de inhibir
la activación del REGF en presencia de este ligando y se encuentran correlaciones entre la
capacidad neutralizante y la magnitud de la respuesta de anticuerpos específicos generados con
la vacunación. Adicionalmente, se encontró una relación entre la edad y el beneficio clínico de la
vacunación, y se ofrecen datos sobre la relación entre las características de la respuesta de
anticuerpos anti-EGF generada y el beneficio clínico de los pacientes tratados con CIMAvaxEGF. Al mismo tiempo, se demostró la posibilidad de optimizar el esquema de vacunación
previamente usado con vistas a lograr una respuesta inmune específica más potente, sin toxicidad
relacionada.
Índice
ÍNDICE
1. Introducción .................................................................................................... 1 2. Revisión Bibliográfica ..................................................................................... 6 2.1 El cáncer de pulmón ....................................................................................................... 6 2.1.1 El cáncer de pulmón como problema de salud. ........................................................... 6 2.1.2 El carcinoma de células no-pequeñas: tratamiento y supervivencia. ......................... 7 2.1.3 Terapia biológica en el tratamiento del cáncer de pulmón ......................................... 9 2.2 El EGF y su receptor como blanco de terapias antitumorales................................. 10 2.2.1 Factores de crecimiento. ............................................................................................ 10 2.2.2 La familia del EGF. ................................................................................................... 10 2.2.3 El EGF. ...................................................................................................................... 11 2.2.4 El receptor de EGF: el REGF.................................................................................... 12 2.2.5 El REGF y el cáncer .................................................................................................. 15 2.3 Inmunoterapia del cáncer. ........................................................................................... 17 2.3.1 Inmunoterapia pasiva y el REGF............................................................................... 17 2.3.2 Inmunoterapia activa ................................................................................................. 20 2.3.3 Vacunas en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas. ............... 26 2.3.4 Tratamientos combinados en la inmunoterapia del cáncer. ...................................... 29 2.4 La vacuna CIMAvax-EGF. ......................................................................................... 32 2.4.1 Estudios pre-clínicos .................................................................................................. 32 2.4.2 Ensayos clínicos ......................................................................................................... 33 2.4.3 Variables inmunofarmacológicas en la optimización del esquema de vacunación... 35 3. Materiales y Métodos .................................................................................... 37 3.1 Materiales y Reactivos ................................................................................................. 37 3.1.1 Líneas celulares y medios de cultivo.......................................................................... 37 3.1.2 Anticuerpos y factores de crecimiento. ...................................................................... 37 3.1.3 Inmunógeno: Vacuna CIMAvax-EGF........................................................................ 38 3.2 Pacientes y Metodología............................................................................................... 39 3.2.1 Selección de los pacientes .......................................................................................... 39 3.2.2 Diseño de los estudios y evaluación de los pacientes ................................................ 40 3.2.3 Criterios de salida del ensayo clínico ........................................................................ 42 Índice
3.2.4 Evaluación de la toxicidad......................................................................................... 42 3.2.5 Extracción, separación y conservación de las muestras de sangre........................... 43 3.2.6 Beneficio clínico ......................................................................................................... 43 3.3 Determinaciones asociadas a la inmunidad específica. ............................................. 44 3.3.1 Determinación de títulos de anticuerpos anti-EGF y anti FTC. ............................. 44 3.3.2 Estimación de la concentración de EGF y TGF en suero. ...................................... 45 3.3.3 Determinación del epítopo inmunodominante del EGF. ........................................... 46 3.3.4 Determinación de la inhibición de la unión del EGF a su receptor. ......................... 47 3.3.5 Determinación de la fosforilación del REG. Western Blot. ....................................... 47 3.3.6 Métodos Estadísticos.................................................................................................. 49 4. Resultados ...................................................................................................... 50 4.1 Evaluación de la respuesta de anticuerpos generada tras la vacunación con
CIMAvax-EGF. ....................................................................................................................... 50 4.1.1 Inmunidad humoral inducida por la vacuna CIMAvax-EGF en el ensayo QVV....... 50 4.1.2 Inmunidad humoral inducida por la vacuna CIMAvax-EGF en el ensayo VQV....... 53 4.2 Relación entre las características de la respuesta inmune generada por la
inmunización y los títulos de anticuerpos naturales (pre-inmunización) en ambos
esquemas de tratamiento. ....................................................................................................... 55 4.3 Evaluación de las concentraciones de EGF en el suero de los pacientes incluidos en
los ensayos QVV y VQV. ........................................................................................................ 57 4.3.1 Concentraciones de EGF y TGFα en sueros no inmunes e inmunes de pacientes
tratados con el esquema QVV. .............................................................................................. 57 4.3.2 Concentraciones de EGF en los sueros de pacientes tratados en el esquema VQV. 60 4.4 Evaluación de epítopos inmunodominantes en la molécula de EGF. ...................... 64 4.4.1 Inmunodominancia del lazo B en pacientes tratados con el esquema QVV. ............. 64 4.4.2 Inmunodominancia del lazo B en pacientes tratados con el esquema VQV. ............. 66 4.5 Efecto de la respuesta de anticuerpos anti-EGF generada sobre la interacción del
EGF y su receptor. .................................................................................................................. 67 4.5.1 Capacidad neutralizante de los anticuerpos inducidos por la vacunación con
CIMAvax-EGF. ..................................................................................................................... 67 4.5.2 Inhibición de la fosforilación del REGF por los sueros inmunes. ............................. 71 4.6 Supervivencia y toxicidad asociada a la vacunación con CIMAvax-EGF. ............. 75 4.6.1 Supervivencia de pacientes tratados con el esquema QVV. Influencia de la edad ... 75 4.6.2 Supervivencia de pacientes tratados con el esquema VQV. ...................................... 79 Índice
4.6.3 Evaluación de la toxicidad......................................................................................... 81 4.7 Relación de la respuesta inmune específica con la supervivencia en pacientes de
CPCNP inmunizados con CIMAvax-EGF............................................................................ 81 4.7.1 Relación entre las características de la respuesta inmune específica y la
supervivencia de los pacientes de CPCNP tratados con el esquema QVV. ......................... 81 4.7.2 Relación entre las características de la respuesta inmune específica y la
supervivencia de los pacientes de CPCNP tratados con el esquema VQV. ......................... 83 5. Discusión ........................................................................................................ 86 6. Conclusiones ................................................................................................ 102 7. Recomendaciones ........................................................................................ 103 Referencias Bibliográficas ................................................................................. 104 Anexos ................................................................................................................. 123 Introducción
1.
INTRODUCCIÓN
La vacunación terapéutica para el tratamiento del cáncer depende de la inducción de una
respuesta inmune específica contra antígenos asociados al tumor, y es considerada actualmente
como una de las estrategias más prometedoras para la terapia de esta enfermedad (Geldmacher y
cols. 2011). El estudio de los mecanismos de acción de las vacunas en el control de la
proliferación celular es fundamental para el desarrollo de estas estrategias terapéuticas, y muchas
veces requiere de la evaluación inicial de la capacidad de diferentes esquemas de tratamiento
para inducir respuestas específicas contra moléculas propias que intervienen en la regulación y la
replicación celular.
Desde sus inicios la vacunología se ha basado en la inmunización mediante el empleo de
antígenos foráneos. Esto ha limitado en gran medida el conocimiento acerca de la reactividad del
sistema inmune hacia moléculas propias, lo cual ha sesgado los experimentos de
autoinmunización básicamente al campo de las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, existen
evidencias experimentales que sustentan la existencia de una reactividad por parte del sistema
inmune hacia moléculas propias. Entre las evidencias que sustentan esta teoría se encuentran: la
presencia de auto-anticuerpos naturales (Avrameas y cols. 1981) y células T autorreactivas
(Cohen 1986) en individuos sanos, el descubrimiento de la selección positiva para la generación
del repertorio de células T por péptidos propios a nivel del timo (Nikolic-Zugic y Bevan 1990), y
la existencia de un sistema inmune funcional en animales mantenidos en un ambiente libre de
patógenos (Pereira y cols. 1986) .
Estas evidencias sustentan la teoría de la existencia de un homúnculo inmunológico, la cual se
basa en la creencia de que la autoinmunidad natural no ocurre de manera aleatoria, sino más bien
que pudiera estar dirigida hacia una sub-población particular de auto-antígenos (Cohen y Young
1991; Cohen 1992). Por tanto, en su definición, el homúnculo inmunológico no es más que el
término aplicado al repertorio autoinmune natural dirigido contra los antígenos dominantes, el
cual se compone de células T y B capaces de reconocer epítopos dominantes de lo propio (Cohen
y Young 1991). Estas células autoinmunes son reguladas por redes celulares, las cuales incluyen
interacciones idiotipo/anti-idiotipo.
El EGF es reconocido por anticuerpos naturales en sujetos sanos, se expresa en el timo y cuando
se acompaña de señales secundarias (adyuvantes y proteínas transportadoras) se activa una
1
Introducción
respuesta inmune más eficiente contra él, la cual se incrementa con la supresión de la regulación
del sistema inmune (González y cols. 2002). Por todas estas características, puede considerarse
este factor de crecimiento como un componente del homúnculo inmunológico.
El EGF es uno de los ligandos principales del receptor del factor de crecimiento epidérmico
(REGF). La unión del EGF a la región extracelular del REGF induce una dimerización del
receptor que resulta en su autofosforilación y en la transmisión de señales mitogénicas (Prigent y
Lemoine 1992; Prenzel y cols. 2001). La sobre-activación y/o sobrexpresión del REGF puede
inducir la alteración de diversas funciones biológicas, tales como la proliferación celular, la
migración, la diferenciación y la apoptosis, que conducen finalmente a la transformación de una
célula normal en maligna. Existen múltiples evidencias acerca del valor pronóstico de la
expresión del REGF en el cáncer de mama, pulmón, colon, estómago y próstata (Pérez y cols.
1984; Macias y cols. 1987; Salomon y cols. 1995). De hecho, varios estudios en cáncer gástrico
que han examinado la expresión concurrente del REGF y sus ligandos (Yonemura y cols. 1992;
Tokunaga y cols. 1995; Nicholson y cols. 2001), informaron grandes desventajas en tiempos de
supervivencias o en la supervivencia libre de progresión tumoral cuando había co-expresión del
REGF y sus ligandos EGF o el factor de crecimiento transformante α (TGFα, del inglés
“transforming growth factor”).
El sistema del EGF/REGF constituye un blanco muy atractivo para el desarrollo de nuevas
terapias dirigidas al tratamiento del cáncer (Arteaga 2003). Entre las estrategias más conocidas
de bloqueo del sistema EGF/REGF se encuentran las del bloqueo directo del receptor a través de
anticuerpos monoclonales (AcMs) que se unen específicamente al dominio extracelular (DEC)
de la molécula (Barker y cols. 2001; Norman 2001), así como el empleo de moléculas de bajo
peso molecular con actividad tirosina cinasa del receptor, que compiten por el sitio de unión del
ATP (Crombet y cols. 2004).
La inmunoterapia activa contra el EGF es un concepto emergente, en el que se propone
manipular la respuesta inmune del individuo, para generar anticuerpos específicos contra el EGF,
capaces de bloquear la unión ligando/receptor y por consiguiente la señalización a través de este
último. Sobre la base de este concepto se generó la vacuna terapéutica CIMAvax-EGF, la cual
está formada por un conjugado químico entre el EGF humano recombinante y la proteína P64k
de la Neisseria menigitidis, mezclado con el adyuvante oleoso Montanide ISA 51 (EGF/P64k/
2
Introducción
Montanide ISA 51). Tanto en pacientes de cáncer avanzado como en experimentación con
animales, esta vacuna se ha administrado por vía intramuscular y se ha logrado generar una
respuesta de anticuerpos específicos por el EGF (González G y cols. 1997). La neutralización del
EGF mediada por los anticuerpos generados con la vacunación con CIMAvax-EGF, podría
impedir la activación del REGF y detener el ciclo celular de las células tumorales que lo sobreexpresan. De esa manera se pueden desencadenar otros mecanismos, como la apoptosis y la
inhibición de la angiogénesis, que pueden provocar la destrucción del tumor o, simplemente, la
detención de su crecimiento. Estos mecanismos no han sido estudiados previamente.
El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es una de las enfermedades malignas más
frecuentes en el mundo entero, con una tasa de mortalidad muy elevada. Solamente el 30% de
los pacientes pueden ser tratados quirúrgicamente. Los tratamientos tradicionales tienen una
eficacia modesta en la mayoría de los pacientes (Bunn y cols. 2003). Entre el 40 y el 80% de los
CPCNP sobre-expresan el REGF (Salomon y cols. 1995), lo cual se ha asociado con mal
pronóstico y con la resistencia a los agentes citotóxicos (Ryan y Chabner 2000). Por estas
razones, se han escogido pacientes con este tipo de tumor para el desarrollo de varios ensayos
clínicos fase I/II con la vacuna CIMAvax-EGF. Estos ensayos clínicos han demostrado que la
vacuna es inmunogénica y bien tolerada. También se ha observado un aumento en la
supervivencia de aquellos pacientes que logran alcanzar una elevada respuesta de anticuerpos
específicos contra el EGF (González y cols. 2003). Por otra parte, una publicación del año 2006
demostró que dosis mayores de EGF son bien toleradas y que existe una relación entre las dosis,
el título de anticuerpos y la supervivencia de los pacientes vacunados. (Ramos y cols. 2006)
Sin embargo, el mecanismo de acción y la potenciación de la respuesta inmune humoral
específica, así como la relación entre el efecto biológico de los Anticuerpos específicos
generados por la vacunación y el beneficio clínico de los pacientes tratados, no han sido
evaluado en profundidad en los estudios anteriores.
Sobre la base de los antecedentes descritos anteriormente, se formuló la siguiente hipótesis de
trabajo:
Los anticuerpos específicos generados por la vacunación con CIMAvax-EGF en combinación
con la quimioterapia, en dos esquemas de tratamiento diferentes, reducen la concentración de
3
Introducción
EGF en el suero de pacientes con CPCNP e interfieren la activación del REGF promovida por
este ligando.
Para demostrar esta hipótesis se trazaron los siguientes objetivos:
1. Evaluar la inmunogenicidad de la vacuna CIMAvax-EGF y su efecto en las
concentraciones de EGF en el suero de pacientes de CPCNP tratados con diferentes
esquemas de inmunización.
2. Evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-EGF de impedir la activación del REGF.
3. Evaluar la relación entre las características de la respuesta inmune humoral específica
generada y la supervivencia de los pacientes tratados con diferentes esquemas de
tratamiento.
Para lograr estos objetivos nos planteamos las siguientes tareas experimentales:

Determinación del título de los anticuerpos específicos por el EGF humano recombinante
en el suero de pacientes en estadios avanzados del CPCNP (IIIb/IV) inmunizados o no
con
la
vacuna
CIMAvax-EGF
en
dos
esquemas
de
tratamiento:
quimioterapia/vacuna/vacuna (QVV) y vacuna/quimioterapia/vacuna (VQV).

Determinación de la respuesta de anticuerpos específicos por diferentes regiones de la
molécula del EGF.

Determinación de la concentración de EGF en suero de los pacientes en evaluación.

Determinación del porcentaje de inhibición de la unión del EGF a su receptor in vitro
como medida de la capacidad neutralizante de los anticuerpos generados por la
vacunación.

Determinación del porcentaje de inhibición de la fosforilación del REGF, inducida in
vitro por el EGF, causada por los sueros de los pacientes.

Evaluación de la supervivencia de los pacientes incluidos en el estudio y de su
correlación con las variables inmunológicas estudiadas.
La novedad científica del presente trabajo consiste en que, por primera vez se demuestra en
pacientes de CPCNP tratados con la vacuna CIMAvax-EGF, la capacidad que tienen los
anticuerpos anti-EGF generados de neutralizar el EGF e impedir la fosforilación del REGF
mediada por dicho ligando y la relación directa de esta capacidad neutralizante con la magnitud
4
Introducción
de los títulos de anticuerpos específicos por el lazo B de la molécula de EGF. Adicionalmente, se
demuestra que con el esquema de tratamiento VQV se puede generar una respuesta inmune
específica anti-EGF más potente que cuando se utiliza el esquema de tratamiento QVV.
El aporte al conocimiento consiste en la demostración de que la respuesta inmune humoral
específica generada por la vacuna CIMAvax-EGF puede interferir en los lazos de regulación de
la proliferación celular asociados a la interacción entre el EGF y su receptor. De esta manera se
sustenta la actividad antitumoral de la inmunoterapia activa basada en EGF observada con el uso
de los dos esquemas de tratamiento actuales.
El valor práctico de los resultados consiste en sustentar el uso de la vacuna CIMAvax-EGF
como alternativa terapéutica para el tratamiento de tumores epiteliales dependientes del EGF
para su proliferación y en demostrar la posibilidad de optimizar el esquema de vacunación
previamente usado con vistas a lograr una respuesta inmune específica más potente.
Los presentes resultados han sido presentados en once eventos nacionales e internacionales; entre
ellos, los Talleres Internacionales de Inmunoterapia IT-2006 e IT-2008 (La Habana) y los
congresos EORTC 2006 (Praga, República Checa) y EACR20 2007 (Lyon, Francia); forman
parte de tres publicaciones aparecidas en revistas internacionales de alto índice de impacto
("Journal of Clinical Oncology", "Clinical Cancer Research" y "Journal of Immunotherapy") y se
encuentran avalados por el Premio de la Academia de Ciencias de Cuba en el año 2008. También
forman parte de un registro de la vacuna CIMAvax-EGF en Cuba y en Perú.
5
Revisión Bibliográfica
2.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1
El cáncer de pulmón
2.1.1
El cáncer de pulmón como problema de salud.
En el cáncer de pulmón se incluyen un conjunto de enfermedades resultantes del crecimiento
maligno de células del tracto respiratorio, en particular del tejido pulmonar, y es uno de los tipos
de cáncer más frecuentes a nivel mundial (1997; 2010 a). Se origina a partir de células
epiteliales, y puede derivar en metástasis e infiltración a otros tejidos del cuerpo.
Es una entidad clínica que fue considerada una rareza a principios del siglo XX. Vista por
algunos autores como una curiosidad médica, no figuraba registrada de forma individualizada en
el sistema de clasificación internacional de enfermedades (Shopland 1995).
El cáncer de pulmón encabeza la lista de cánceres en orden de frecuencia. A esta entidad se debe
el 12,5% de la incidencia de cáncer en el mundo (Nakagawa y cols. 2009). Además, constituye la
forma más letal de todos los cánceres, siendo la principal causa de muerte prevenible en el
mundo (Silvestri y Rivera 2005; Spiro y cols. 2006).
Con el transcurso del tiempo su frecuencia ha tenido un comportamiento ascendente, llegando a
alcanzar en varios países un carácter epidémico. A nivel mundial, el cáncer de pulmón es la
forma más frecuente de cáncer en términos de incidencia y de mortalidad (Prim y cols. 2010)
causando cerca de 1,0 - 1,18 millones de muertes cada año, con las tasas más elevadas en países
de Europa y Norteamérica (Rubin 2003). En la actualidad la tasa de mortalidad por cáncer de
pulmón en Estados Unidos es superior a 75 fallecidos por cada 100 000 habitantes entre los
hombres y 31 por cada 100 000 habitantes entre las mujeres; mientras que en el Reino Unido
representaba la primera causa de muerte por cáncer en mujeres y hombres.
Alrededor del 60% de los cánceres de pulmón se diagnostican en fase de enfermedad localmente
avanzada o metastásica, lo que acarrea un mal pronóstico para las personas que contraen esta
enfermedad. En consecuencia, el carcinoma pulmonar primario es un problema importante de
salud, con un pronóstico en general desfavorable. Solo el 10% de los pacientes que contraen esta
enfermedad sobreviven 5 años después del diagnóstico (Schiller y cols. 2002).
Existen muchos factores considerados como responsables del incremento de la incidencia de esta
enfermedad de manera global. Entre ellos se encuentra la influenza, con su efecto sobre la
6
Revisión Bibliográfica
mucosa bronquial de regeneración atípica, metaplasia y formación de nidos celulares. Estas
alteraciones se consideran factores predisponentes. Otros factores como el hábito de fumar, la
Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) asociada al tabaquismo, los gases emitidos
por los vehículos motores, y partículas de alquitrán también se consideran responsables del
incremento en la incidencia de esta enfermedad (Edwards 1946; Thun y cols. 2010).
La epidemiología de esta enfermedad también ha variado en diversas partes del mundo. En los
países industrializados por ejemplo, se ha establecido una tendencia a la disminución de la
incidencia en hombres y un incremento en las mujeres (Koyi y cols. 2002).
En cuanto a la edad, el cáncer de pulmón afecta mayormente a personas entre los 60 y los 65
años. Menos del 15% de los casos acontecen en pacientes menores de 30 años de edad. La edad
promedio de las personas a las que se les detecta cáncer de pulmón es 60 años. Sin embargo,
debido al aumento en la cantidad de fumadores jóvenes, se pronostican cambios en la mortalidad
por edades en las próximas décadas (Rubin 2003).
El cáncer de pulmón es una neoplasia muy agresiva: más de la mitad de los pacientes mueren
antes del primer año después del diagnóstico (Rubin 2003), fundamentalmente debido a que más
de dos tercios de los individuos con cáncer de pulmón se diagnostican en estadios avanzados de
la enfermedad, cuando se imposibilitan los tratamientos curativos ( 2006).
En Cuba, el cáncer de pulmón ocupa el primer lugar en incidencia en hombres y el segundo en
mujeres (solo sobrepasado por los tumores de mama). En el año 2006 ocurrieron 3210 nuevos
casos en hombres, lo que equivale a una tasa bruta de 56,8 y ajustada de 41,2 x 100 000
habitantes. En el sexo femenino se diagnosticaron 1599 casos con una tasa bruta de 28,4 y
ajustada de 19 x 100 000 habitantes (2009). Entre los años 1997 y 2009 se observó una tendencia
al incremento en la incidencia en ambos sexos, llamando la atención el incremento sostenido en
la mortalidad en el sexo femenino sobre todo entre los años 1995 al 2009. Las cifras que se
exhiben a lo largo de todo el país confirman que el cáncer de pulmón es una enfermedad que
constituye un problema de salud importante en nuestra sociedad.
2.1.2
El carcinoma de células no-pequeñas: tratamiento y supervivencia.
La gran mayoría de los tipos de cáncer de pulmón son carcinomas, es decir, tumores malignos
que nacen de células epiteliales. Hay dos formas de carcinoma pulmonar, categorizados de
7
Revisión Bibliográfica
acuerdo al tamaño y la apariencia de las células malignas vistas histopatológicamente bajo un
microscopio: los tumores de células no-pequeñas (80,4%) y los de células pequeñas (16,8%)
(Travis 1995). Esta clasificación está basada en criterios histológicos y tiene importantes
implicaciones para el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad ( 2008).
El carcinoma de células no pequeñas (CPCNP) representa más del 75% de todas las neoplasias
que se originan en el pulmón, la mayoría de los cuales se presenta en estadio de enfermedad
localmente avanzada o metastásica al diagnóstico (Jemal y cols. 2003; Jemal y cols. 2005).
La cirugía constituye la opción terapéutica con intención curativa, pero solo un tercio de los
casos en el momento de su diagnóstico presenta un estadio localizado que permite dicho
tratamiento (Esteban y cols. 2006). A pesar del esfuerzo quirúrgico muchos pacientes desarrollan
una recurrencia local o a distancia debido a lesiones no detectables en el momento de la cirugía
(Mountain 1997).
Los resultados alentadores obtenidos en el tratamiento del carcinoma de células pequeñas de
pulmón con la quimioterapia a mediados de la década del 80, volcó la atención hacia el
tratamiento del carcinoma de células no pequeñas basado en esta modalidad terapéutica. A partir
de entonces se han observado modestos progresos en términos de supervivencia; sin embargo,
por lo general, el índice de respuesta es inferior al alcanzado en el de células pequeñas.
Raramente se observa una respuesta completa y en solo un 40% de los pacientes puede lograrse
una respuesta parcial con las quimioterapias actuales (Silvestri y Spiro 2006).
El cisplatino (CDDP), o su similar, el carboplatino, son los agentes quimioterapéuticos que se
emplean con más frecuencia para tratar el CPCNP (Murray y cols. 2006). En el CPCNP en
estado avanzado, la tasa de respuesta obtenida para los primeros regímenes de quimioterapia con
sales de platino fue por lo general baja (10 a 15%), con solo 6 semanas de extensión de la
mediana de supervivencia (Group 1995).
Posteriormente, en la década de los años 90, se desarrollaron medicamentos nuevos para el
manejo del CPCNP que incluyen el docetaxel, paclitaxel, vinorelbina y gemcitabina. Esto
conllevó a la realización de un gran número de ensayos clínicos evaluando esos agentes solos o
en combinación con cisplatino o carboplatino. Estos estudios de combinación mostraron una
mejora significativa en la eficacia del tratamiento del CPCNP (Kelly y cols. 2001; Scagliotti y
cols. 2002). Con la introducción de estos nuevos agentes, se ha logrado extender la ventaja en la
8
Revisión Bibliográfica
supervivencia en los pacientes en un período de 3 a 4 meses cuando se compara con el
tratamiento paliativo solo . Los resultados del tratamiento con al menos 4 ciclos de quimioterapia
basada en las combinaciones actuales, ofrecen una mediana de supervivencia de 7,8 a 8,1 meses
comparado con 4 a 5 meses cuando solo se oferta tratamiento de soporte, con una supervivencia
al año de 31 a 36% comparada con el 18% obtenido sin la quimioterapia (Schiller y cols. 2002).
La mielosupresión, es decir, la reducción en la producción de la línea granulocítica de los
glóbulos blancos, es el único efecto adverso que limita la dosificación de estos medicamentos
(Katzung 2007). En la actualidad se continúa investigando en estudios clínicos la mejor manera
de utilizar esta combinación de medicamentos (Morera 2004). Por otro lado, la principal ventaja
que exhibe la quimioterapia moderna está relacionada con un mejor perfil de toxicidad que
incluye: menor incidencia de náuseas, vómitos, pérdida de cabello y sepsis por neutropenia
febril.
La quimioterapia se considera en la actualidad como el tratamiento estándar para el cáncer de
pulmón seguida de la resección curativa y se mantiene el debate acerca de la utilidad del
tratamiento adyuvante en los estadios tempranos (Ia y Ib); aunque sí existe clara evidencia a
favor de su uso en los estadios II y IIIa resecables (Esteban y cols. 2006). Sin embargo, en la
práctica clínica diaria hay pocos datos disponibles sobre el tratamiento de pacientes con
carcinoma de células no pequeñas de pulmón (Zietemann y Duell 2010).
2.1.3
Terapia biológica en el tratamiento del cáncer de pulmón
Dado el modesto éxito obtenido a partir de la aplicación de las terapias estándar en el tratamiento
del cáncer de pulmón, la comunidad científica se ha volcado al estudio de nuevos esquemas
terapéuticos para el manejo de esta enfermedad. La terapia biológica o inmunoterapia es una de
las nuevas estrategias utilizadas para el tratamiento del cáncer de pulmón. Estas terapias
biológicas utilizan el sistema inmune, ya sea directa o indirectamente, para combatir el cáncer o
para disminuir los efectos secundarios que pueden causar algunos tratamientos (2010 c). La
inmunoterapia puede indicarse en conjunto con la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia.
Algunos de los compuestos más empleados en esta modalidad terapéutica en la actualidad
incluyen: interferones, inhibidores de los factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales,
vacunas terapéuticas, terapia génica y agentes inmunomoduladores no específicos (2010 b).
9
Revisión Bibliográfica
El desarrollo de la inmunoterapia basada en dianas moleculares específicas presentes en las
células cancerosas está dado en gran medida por los progresos realizados en los últimos años en
la comprensión de la biología tumoral y de los mecanismos oncogenéticos del cáncer de pulmón.
Algunas de estas dianas moleculares incluyen el factor de crecimiento vascular y sus receptores,
así como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (Provencio y cols. 2010). Los agentes
empleados para este tipo de tratamiento parecen ser, de manera general, más seguros y eficaces
en ciertos subtipos histológicos del cáncer de pulmón, en particular el de células no-pequeñas y
en sus estadios avanzados (Rossi A 2010). La única desventaja hasta el momento es que
requieren de un adecuado diagnóstico histológico del cáncer.
2.2
El EGF y su receptor como blanco de terapias antitumorales.
2.2.1
Factores de crecimiento.
Los factores de crecimiento son un grupo de polipéptidos multifuncionales que están
involucrados en una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo la embriogénesis, la
diferenciación y proliferación celular, la angiogénesis y la activación del sistema inmune
(Klagsbrun 1990).
Los diferentes factores de crecimiento han sido agrupados en varias familias, basadas en su
estructura y su actividad biológica. Dichas familias están comprendidas por la familia del factor
de crecimiento epidérmico (EGF), la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), la
del factor de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) y la familia del factor de crecimiento
similar a insulina (ILGF), entre otras.
La familia del EGF está formada a su vez por varios factores de crecimiento. La unión de estos
factores de crecimiento a sus respectivos receptores resulta en la activación de una tirosina cinasa
asociada con un
dominio citoplasmático. Este evento desencadena un número de eventos
biológicos y enzimáticos, que finalmente conllevan a la síntesis de ADN y a la proliferación
celular.
2.2.2
La familia del EGF.
Esta familia de ligandos agrupa proteínas estructural y funcionalmente relacionadas que se unen
a los receptores ErbB y los activan. La base de esta relación estructural es el llamado dominio
tipo EGF, una secuencia de 45 a 50 aminoácidos que contiene 6 cisteínas espaciadas de una
10
Revisión Bibliográfica
forma específica y unidas entre sí por 3 puentes disulfuro intramoleculares, que determinan una
estructura terciaria compacta de tres lazos. Se tienen muchas evidencias de que esta estructura es
la responsable de la unión de esos ligandos a sus receptores y que regiones discontinuas de la
misma están involucradas en este reconocimiento (Todaro y cols. 1980).
Entre los miembros de este grupo además de su ligando natural, el EGF, encontramos el factor
de crecimiento transformante alfa (TGF, del inglés, “transforming growth factor α”) (Todaro y
cols. 1976), la anfirregulina (Shoyab y cols. 1989), el factor de crecimiento que une heparina
(HB-EGF, del inglés, “heparine binding growth factor”) (Higashiyama y cols. 1991), la
betacelulina (BTC) (Ciccodicola y cols. 1989) y la epirregulina (Groenen y cols. 1994). Otros
ligandos de la familia del REGF descritos posteriormente son las neurregulinas o herregulinas,
(Harari y cols. 1999) y la tomorregulina (Kinugasa y cols. 2004).
La mayoría de los ligandos de esta familia son sintetizados como precursores de membrana que
están formados por la estructura tipo EGF en el dominio extracelular, una extensión amino
terminal, una región transmembrana y una cola citoplásmatica. Los ligandos son liberados como
factores solubles, desde la superficie por un clivaje proteolítico en el dominio extracelular; este
evento representa una estrategia importante y eficiente para regular la actividad de una variedad
de proteínas de membrana (Dong y Wiley 2000).
2.2.3
El EGF.
El EGF fue aislado en 1962 de glándulas submaxilares de ratón y posteriormente, en 1975, a
partir de la orina humana se obtuvo la forma humana del EGF (Cohen y cols. 1975; Starkey y
cols. 1975). El descubrimiento de este factor de crecimiento condujo a la búsqueda e
identificación de su receptor celular (REGF) y a la detección y caracterización de otros
miembros de la familia.
El EGF es un polipéptido de 53 aminoácidos con un peso molecular de 6045 Da, y 6 residuos
conservados de cisteína que forman tres enlaces covalentes por puentes disulfuro, lo cual sugiere
que es una molécula estructuralmente estable. La secuencia del EGF también contiene un
número relativamente grande de residuos de glicina y tirosina (Cohen y cols. 1975; Gregory
1975). Es una molécula ubicua, y al igual que otros factores de crecimiento y a diferencia de las
hormonas clásicas, su producción parece ser sistémica y su acción paracrina (Carpenter y cols.
1975). El precursor del EGF (pro-EGF) se distingue por su gran talla (1200 aminoácidos) y sus
11
Revisión Bibliográfica
ocho secuencias “tipo EGF” en el dominio extracelular, donde cualquiera de ellas puede
funcionar como ligando del REGF (Gray y cols. 1983).
El EGF está presente en el plasma a muy bajas concentraciones y generalmente asociado a las
plaquetas y a otros elementos de la coagulación sanguínea (Savage y cols. 1986). En humanos se
han encontrado altos niveles de EGF en fluídos prostáticos, seminales y en el fluído cerebroespinal, así como en un amplio rango de células epiteliales tales como las de pulmón, estómago,
riñones, duodeno, páncreas, piel, mama, glándulas salivales, tiroides, ovario, útero y placenta. Se
plantea además que el hígado puede ser una fuente de EGF circulante (Laborde y cols. 1988).
Aunque no se conocen con exactitud todas las funciones del EGF, se han descrito una gran
variedad de efectos en mamíferos, tanto en animales experimentales como en cultivos de células
provenientes de esta especie. Entre estos efectos están: apertura precoz de los párpados y la
aparición de los dientes en ratones recién nacidos, estimulación in vitro de células normales y
tumorales de origen ectodérmico y mesodérmico (Carpenter y Cohen 1990), así como el
desarrollo y maduración de otros órganos tales como los pulmones, el tracto gastrointestinal, la
glándula mamaria, entre otros. Además, promueve la angiogénesis, inhibe la secreción gástrica
ácida y se ha demostrado su efectividad en la aceleración de la curación de las heridas (Schultz y
cols. 1991).
Todos los miembros de la superfamilia del EGF se unen al REGF o a otro miembro de esta
familia de receptores con actividad tirosina cinasa, pero exhiben actividades biológicas
diferentes.
2.2.4
El receptor de EGF: el REGF.
El REGF pertenece a una familia de receptores con actividad tirosina cinasa que traducen la
información de los factores de crecimiento extracelulares a las vías de señalización
intracelulares. Esta señales a su vez modulan diversas funciones biológicas, tales como la
proliferación celular, la migración, la diferenciación y la apoptosis (Holbro y Hynes 2004). Esta
familia, también conocida como familia ErbB, consta de cuatro receptores: el REGF o
Her1/ErbB1 (que fue el primero en ser clonado) (Ullrich y cols. 1984), el Her2/neu/ErbB2, el
Her3/ErbB3 y el Her4/ErbB4 (Normanno y cols. 2005).
12
Revisión Bibliográfica
Los receptores de la familia ErbB presentan una estructura modular que consiste en un dominio
extracelular de unión al ligando, un dominio hidrofóbico transmembranario y un dominio
intracelular. Este último posee un tallo citoplasmático muy conservado a través de la evolución,
con actividad tirosina cinasa, con la excepción de Her3, que posee sustituciones en aminoácidos
críticos, careciendo de actividad cinasa. Los dominios extracelulares son los menos conservados
en la familia, lo cual sugiere que los diferentes receptores tienen diferentes especificidades en la
unión a sus ligandos. Los receptores están frecuentemente co-expresados en las células y en
dependencia del ligando activador pueden formar homodímeros o heterodímeros, lo cual genera
una compleja red de transducción de señales (Alroy y Yarden 1997; Riese y Stern 1998).
1.1.1.1 Estructura del REGF
El REGF es una glicoproteína transmembranaria con un peso molecular de 170 kDa, cuya
cadena polipeptídica consta de 1186 aminoácidos, y contiene 40 kDa de oligosacáridos
enlazados a residuos de asparagina en 11 ó 12 sitios potenciales de glicosilación (Ullrich y cols.
1984; Stroop y cols. 2000). El REGF está formado por un dominio extracelular de unión al
ligando de 621 aminoácidos, un simple dominio transmembrana de alfa hélices hidrofóbicas de
23 aminoácidos y un dominio intracelular de 542 aminoácidos (Ullrich y Schlessinger 1990).
El dominio extracelular del REGF tiene un peso molecular de 105 kDa, y su conformación en el
espacio es independiente del resto de la molécula. Está formado por cuatro subdominios
denominados I (L1), II (S1), III (L2) y IV (S2). De ellos, el subdominio II posee la región crítica
para que ocurra la dimerización entre los receptores, y se le ha denominado “brazo de
dimerización” (Garrett y cols. 2002; Ogiso y cols. 2002).
El dominio intracelular comprende tres subdominios: el subdominio yuxtamembrana, que es
requerido para la retroalimentación mediada por proteína cinasa C; la cola carboxi-terminal, que
carece de actividad catalítica y posee seis tirosinas que son sitios de transfosforilación y de unión
de proteínas adaptadoras y/o efectoras como la Grb2 y la fosfolipasa Cγ, respectivamente; y el
subdominio central con actividad tirosina cinasa (src), que es un subdominio de homología 1
(SH1), el cual es responsable de la transfosforilación de los seis residuos de tirosina de la región
carboxi-terminal (Bazley y Gullick 2005). Se ha encontrado que las tirosinas fosforiladas en el
REGF dependen del ligando que haya producido la activación (Sweeney y Carraway 2000) y que
13
Revisión Bibliográfica
el patrón de fosforilación determina el tipo de segundo mensajero que será reclutado (van der
Geer y Pawson 1995).
1.1.1.2 Activación del REGF y transducción de las señales
Se postula que la unión de un mónomero de TGF- o EGF al dominio extracelular del REGF
estabiliza una conformación que permite la homodimerización o heterodimerización con otros
miembros de la familia del REGF. La unión del ligando a los subdominios I y III provocan
rearreglos espaciales que exponen el subdominio II o “brazo de dimerización” de la molécula. La
dimerización permite la fosforilación cruzada en los residuos de tirosina que sirven como sitios
de reclutamiento y anclaje de proteínas con dominios homólogos a Src tipo 2 (SH2, del inglés,
“Src homology 2”) (Koch y cols. 1991) o dominios de unión a fosfotirosina (PTB, del inglés,
“phospho-tyrosine-binding”) (Garrett y cols. 2003) que inician múltiples vías de señalización
intracelular.
La red de señales transmitidas a través del REGF es extremadamente compleja. La diversidad de
ligandos, unido a la posibilidad de formar combinaciones de homodímeros y heterodímeros en la
familia de ErbB, a su vez acoplados a diversas vías de señalización intracelular, determinan este
alto grado de complejidad en el denominado sistema EGF/REGF. Existen tres vías
fundamentales de señalización a través del sistema EGF/REGF. La primera de estas vías de
señalización es la llamada vía de las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPKs, del
inglés, “mitogen-activated protein kinases”). Esta vía constituye posiblemente la vía de
señalización intracelular más estudiada asociada al sistema EGF/REGF. Los efectos biológicos
observados luego de la activación por ligandos del REGF, pudieran estar asociados a la
activación de la vía Ras/Raf/ERK. Cuando la activación es mediada por el EGF, estos efectos
están fundamentalmente asociados a la proliferación celular (Di Fiore PP 1987).
Otra vía de señalización intracelular del REGF activado es la asociada a fosfatidil inositol 3kinasa (PI3K, del inglés, “phosphotidylinositol-3 kinase”), que estimula señales anti-apoptóticas
mediadas por el factor nuclear de transcripción  (NF-B, del inglés, “nuclear factor-B”) y
señales de división celular. Por tanto, la activación de la vía PI3K mediada por el REGF está
directamente relacionada con la supervivencia de las células tumorales.
Una tercera vía de señalización ocurre a través de c-Src, una tirosina cinasa citoplasmática
involucrada en numerosos procesos celulares, incluyendo las señales mitogénicas (Prenzel y
14
Revisión Bibliográfica
cols. 2001). Mediante esta proteína se activa la familia del factor de transcripción y transductor
de señales 3 (STAT3, del inglés, “signal transducer and activator of transcription 3”), la cual
tiene particular importancia en la proliferación y sobrevivencia de células tumorales (Rubin
Grandis y cols. 1998). Un miembro de esta familia, STAT3, regula la producción del factor de
crecimiento del endotelio vascular (VEGF, del inglés, “vascular endotelial growth factor”), el
cual incrementa la proliferación celular y está estrechamente ligado a fenómenos de angiogénesis
en los tumores (Niu y cols. 2002).
Todas las vías de señalización intracelular activadas a través de los receptores ErbB convergen
en el núcleo donde los reguladores del ciclo celular y los factores de transcripción controlan la
respuesta biológica a la activación de dichos receptores.
2.2.5
El REGF y el cáncer
Los efectos oncogénicos relacionados con la alteración de la fisiología del REGF han convertido
al sistema EGF/REGF en un blanco muy atractivo y prometedor para la intervención
inmunoterapéutica basada en agentes antagonistas específicos del REGF. A pesar de que el
REGF constituye una proteína ampliamente expresada en los tejidos del organismo, es
considerado un antígeno asociado a los tumores (TAA, del inglés, “tumor associated antigen”).
La primera línea de pensamiento que sugiere que el REGF está involucrado en la patogénesis de
los carcinomas humanos se deriva de un amplio número de estudios que han demostrado la
sobre-expresión de esta proteína en la mayoría de los tumores sólidos de origen epitelial. El
REGF tiene una expresión incrementada en tumores de pulmón (Hendler y Ozanne 1984), mama
(Pérez y cols. 1984), cabeza y cuello (Dassonville y cols. 1993), colon (Lockhart y Berlin 2005),
esófago, próstata (Liu y cols. 1993; Zhau y cols. 1996), vejiga (Neal y cols. 1985), páncreas (Tan
y cols. 2004), ovario (Gullick y cols. 1986) y tumores cerebrales (Salomon y cols. 1995). La
frecuencia de expresión del REGF en los tumores de origen epitelial es generalmente alta. Por
ejemplo, en el caso de los carcinomas de cabeza y cuello el REGF está expresado en el 100 % de
los casos estudiados, y en el carcinoma de pulmón de células no pequeñas esta frecuencia es de
aproximadamente un 80% (Normanno y cols. 2003). La sobre-expresión del REGF por las
células tumorales se debe a diversos mecanismos, que incluyen la amplificación génica, la
alteración de eventos transcripcionales, así como a deleciones o mutaciones que generan
receptores constitutivamente activos (Nicholson y cols. 2001).
15
Revisión Bibliográfica
Por otra parte, la sobre-expresión del REGF se asocia con un mal pronóstico de la enfermedad en
tumores de cabeza, cuello y pulmón (Brabender y cols. 2001; Khademi y cols. 2002), con un alto
riesgo de recurrencia de la enfermedad (Chow y cols. 1997; Turkeri y cols. 1998) y con
disminución de la sobrevida en pacientes con cáncer de ovario, colon, vejiga, tiroides y cabeza y
cuello (Akslen y cols. 1993; Fischer-Colbrie y cols. 1997; Grandis y cols. 1998). Además,
existen numerosos estudios que demuestran que la presencia de niveles elevados del REGF
correlaciona directamente con la resistencia a las terapias convencionales (Holbro y cols. 2003).
Los tumores que poseen una activación constitutiva del REGF tienden a ser más agresivos en
cuanto a la formación de metástasis. Existen evidencias en la literatura de que la sobre-expresión
del REGF conlleva a un incremento en la capacidad metastásica de las células tumorales en
algunos modelos, y que esto se debe a un incremento en la capacidad de intravasación de las
mismas (Xue y cols. 2006). Además, se ha encontrado que muchos tipos de células tumorales
migran estimuladas por la activación autocrina del REGF (El-Obeid y cols. 1997).
Los factores de crecimiento también juegan un papel crucial sobre el ciclo celular. Algunos de
ellos forman parte de los factores competentes, que conducen a las células de la fase G0 a la fase
más temprana de G1. El EGF en particular, constituye un factor de progresión del ciclo celular,
ya que es el encargado de estimular los eventos moleculares necesarios para que ocurra la
transición a través del punto de restricción (punto R) situado en la fase G1. Una vez superado este
punto, las células pueden progresar hacia la fase G2, y desde aquí continuar hacia las siguientes
fases del ciclo aun en ausencia de factores de crecimiento. Por esa razón, la presencia de
estímulos excesivos, provoca una progresión continua del ciclo y la consiguiente división celular,
conduciendo a una proliferación descontrolada de las células. Así ocurre en las células
tumorales, las cuales además llegan a hacerse independientes de estos estímulos a través de la
expresión incrementada de moléculas receptoras de señales, como el REGF (Lui y Grandis
2002).
Sin embargo, la correlación entre los niveles de expresión del REGF y la transformación
neoplásica in vivo es aún controversial (Gullick y Srinivasan 1998). Robertson y colaboradores
demostraron que de un 40 a un 60 % de las neoplasias examinadas muestran niveles normales de
expresión del REGF (Robertson KW 1996). En esos casos los cambios en los ligandos del
receptor pudieran tener más influencia en la actividad antitumoral que los cambios relativos a
16
Revisión Bibliográfica
los niveles de expresión del REGF. No obstante, en la actualidad se sabe que los niveles de
expresión del REGF son muy elevados en determinadas neoplasias y constituyen un marcador de
mal pronóstico. Por todo lo antes expuesto el sistema del REGF y sus ligandos constituyen en la
actualidad un blanco excelente para la terapia antitumoral.
2.3
Inmunoterapia del cáncer.
La mayoría de los pacientes de cáncer son tratados con una combinación de cirugía,
quimioterapia y radioterapia. La cirugía por sí sola no es suficiente para una erradicación
completa de las células cancerosas. Por otra parte, la radiación y la quimioterapia afectan tanto a
las células malignas como a las células normales, causando severos efectos adversos. Por lo
general el sistema inmune de un paciente no alcanza a suplantar estos tratamientos antitumorales,
en cambio elimina antígenos que reconoce como no propios mientras que generalmente ignora
aquellos que considera propios. Los tumores están formados por células propias que son
malignas y esa es la razón por la cual pueden eludir la vigilancia del sistema inmune (Cappuccio
y cols. 2007).
En los últimos años ha crecido el interés en la inmunoterapia del cáncer, como una manera de
incrementar la respuesta del sistema inmune contra el tumor. Existen dos estrategias
fundamentales para la evaluación de nuevas drogas oncológicas: la inmunoterapia pasiva y la
inmunoterapia activa.
2.3.1
Inmunoterapia pasiva y el REGF.
La inmunoterapia pasiva se basa en el empleo de anticuerpos monoclonales específicos por el
dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (REGF). La accesibilidad
que posee el dominio extracelular del REGF para los anticuerpos e inmunotoxinas, la expresión
diferencial del receptor en la superficie de las células (alta en células tumorales y baja en tejidos
epiteliales normales), y la propia biología del sistema REGF/ ligandos, lo ha convertido en una
molécula diana importante para el desarrollo de la inmunoterapia pasiva del cáncer de origen
epitelial. De hecho se han producido y caracterizado anticuerpos monoclonales contra el REGF
humano, que se unen al receptor con una afinidad similar a la de los ligandos naturales, compiten
con ellos e inhiben la activación inducida por el ligando (Kawamoto y cols. 1983; Sato y cols.
1983).
17
Revisión Bibliográfica
Los efectos derivados del empleo de terapias antitumorales con anticuerpos monoclonales contra
el REGF se atribuyen a la interferencia con las interacciones ligando-receptor que resultan en la
eliminación del estímulo proliferativo. Estos anticuerpos podrían jugar un papel fundamental en
el reclutamiento y activación de células efectoras citotóxicas interviniendo en un mecanismo
como el de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC, del inglés, “antibody
dependent cell citotoxicity”) (Bier y cols. 1998).
Uno de estos anticuerpos con actividad terapéutica es el anticuerpo monoclonal quimérico de
isotipo IgG1, ICM-C225/Cetuximab/Erbitux. El Cetuximab se une específicamente al
subdominio III del dominio extracelular del REGF, compitiendo con el ligando EGF. Por tanto
este anticuerpo bloquea la activación del receptor, afecta el proceso de dimerización, e induce
eficientemente la internalización y la degradación del REGF (Shiqing y cols. 2005). Además, se
ha demostrado que puede inducir ADCC a través de la activación de células mononucleares de
sangre periférica de humanos, sugiriendo otro mecanismo potencial de acción anti-tumoral de
dicha droga (Naramura y cols. 1993). El Cetuximab constituye el primer anticuerpo bloqueador
del REGF aprobado por la entidad regulatoria de drogas y alimentos en los EEUU (FDA, del
inglés, “US Food and Drug Administration”) para uso en pacientes. Inicialmente recibió la
aprobación para uso como monoterapia o en combinación con irinotecan en pacientes con
carcinoma colorrectal metastásico con expresión detectable del REGF (Systems-ImClone 2004)
y posteriormente, para su uso en pacientes con carcinomas de células escamosas de cabeza y
cuello en combinación con radioterapia. Además, existen estudios clínicos fases II y III en curso
donde ese están incluyendo pacientes con carcinoma de páncreas en estadios avanzados (Xiong y
cols. 2004). Para el carcinoma de células no pequeñas de pulmón (CPCNP) (Lynch TJ y cols.
2004; Rosell y cols. 2004) terminaron ya los ensayos fase III y se ha registrado este producto en
Europa. Aunque la terapia con Cetuximab es tolerada, con frecuencia aparecen efectos adversos
asociados al uso de la droga como las reacciones alérgicas, hipomagnesemia, fatiga y toxicidad
en la piel en forma de erupciones (Lacouture 2006). En ocasiones estos eventos adversos pueden
ser severos y conllevar a una reducción en la dosis o suspensión anticipada del tratamiento
(Tejpar y cols. 2007; Boland y Bebb 2010). Otro anticuerpo con resultados clínicos alentadores
es el anticuerpo monoclonal humanizado h-R3/TheraCIM/Nimotuzumab. El Nimotuzumab,
generado en los laboratorios del Centro de Inmunología Molecular se obtuvo a partir de su
18
Revisión Bibliográfica
predecesor murino, el ior egf/r3 desarrollado por inmunización previa de ratones con placenta
humana enriquecida con REGF (Fernández A y cols. 1992).
El Nimotuzumab, al igual que el Cetuximab, es un anticuerpo específico contra el dominio
extracelular del REGF. El Nimotuzumab obtuvo el registro en Cuba por el Centro para el Control
Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED) en el año 2004 para su uso en pacientes
con tumores avanzados de cabeza y cuello en combinación con radioterapia (Crombet y cols.
2004). Posteriormente este registro se extendió a otras localizaciones tumorales como tumores
cerebrales y de esófago. Igualmente se encuentran en fases avanzadas de estudios clínicos que
avalen su posible empleo en pacientes portadores de tumores de mama, próstata y pulmón, en los
cuales se han obtenido resultados alentadores (Crombet y cols. 2006).
Otros anticuerpos monoclonales específicos por el REGF que han obtenido su aprobación para
uso en pacientes son el ABX-EGF/Panitumumab (Tiseo y cols. 2004; Amato 2005; Tyagi 2005),
y el EMD 72 000/Zalutumumab (Graeven y cols. 2006).
Otra estrategia utilizada actualmente que se basa en el bloqueo de la señalización a través del
REGF es la inhibición de la actividad tirosina cinasa empleando drogas de bajo peso molecular:
los inhibidores tirosina cinasa (TKI, del inglés, “tyrosine kinase inhibitors”). Los resultados más
prometedores en fase clínica con este tipo de compuestos se han obtenido con los análogos del
ATP, de la familia de la piridopirimidina y la quinazolina, los cuales actúan bloqueando el sitio
de unión del ATP en el dominio cinasa del receptor, inhibiendo la activación del mismo. Los
estudios iniciales realizados con la quinazolina ZD1839/IRESSA/Gefinitib mostraron que esta
droga posee actividad anti-tumoral in vitro e in vivo, tanto como monoterapia, como en
combinación con terapias convencionales (Ciardiello y cols. 2000; Sirotnak y cols. 2000).
Otras estrategias empleadas para inhibir la actividad del REGF se asocian al uso de pequeñas
moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de interferencia (siRNA, del inglés, “small interfering
ribonucleic acid”) (Zhang y cols. 2004; Kang y cols. 2006); proteínas de fusión toxina-ligando
contra el REGF, a través de la conjugación del EGF o el TGF-α a formas truncadas de la
exotoxina A de Pseudomonas y otras toxinas celulares menos inmunogénicas (Fitzgerald 1996;
Shao y cols. 1998; Uckun y cols. 1998; Noonberg y Benz 2000).
19
Revisión Bibliográfica
2.3.2
Inmunoterapia activa
1.1.1.3 Bases de la inmunoterapia activa específica.
La inmunoterapia activa específica ha re-emergido vigorosamente desde finales de la década de
1990. Sin embargo, hace más de 100 años, William Coley describió por primera vez la remisión
de tumores en pacientes con cáncer tratados con bacterias o sus respectivos extractos (Wiemann
y Starnes 1994). Algunos de estos productos bacterianos eran potentes activadores del sistema
inmune y como consecuencia los tumores eran destruidos (Krieg y Wagner 2000). A partir de
este descubrimiento se ha acumulado una gran cantidad de evidencias sobre el reconocimiento de
los tumores por el sistema inmune. Se han descubierto y caracterizado muchos antígenos que se
encuentran sobrexpresados en las células malignas en comparación con sus niveles de expresión
en células normales. Además, se ha verificado la hipótesis de la vigilancia inmunológica del
cáncer, en la cual las células presentadoras de antígenos (APC, del inglés "antigen presenting
cells") reconocen células transformadas y mutágenos, y esto les permite activar a otros
componentes del sistema inmune para eliminarlos (Sahin y cols. 1995; Kaplan y cols. 1998). De
hecho, el auge en el empleo de la inmunoterapia activa específica ha estado motivado por las
múltiples evidencias científicas que demuestran la existencia de la inmunovigilancia tumoral
(Burnet 1970), la posibilidad de definir y caracterizar antígenos asociados al tumor (Ko y cols.
2003), y una mejor comprensión de los mecanismos moleculares de procesamiento y
presentación de antígenos y de inducción de la respuesta inmune. En la actualidad más de 50
vacunas están siendo evaluadas en estudios clínicos, y se han efectuado más de 400 ensayos
clínicos (Lage y cols. 2005). Las vacunas contra el cáncer son una aplicación de estos
conocimientos y están basadas en el principio de la inducción de una respuesta inmune eficaz
para eliminar el tumor.
Debido a que las vacunas de cáncer se evaluaron inicialmente en pacientes con tumores
avanzados y por lo tanto no podían prevenir la enfermedad, se les ha llamado vacunas
terapéuticas. En el campo de la inmunoterapia activa se considera que existen dos generaciones
de vacunas de cáncer, las cuales coexisten en la actualidad en diferentes ensayos clínicos: una
primera generación basada en preparaciones celulares, conocida como vacunas celulares y otra
basada en entidades moleculares, denominada vacunas moleculares.
20
Revisión Bibliográfica
Las vacunas de la primera generación, han utilizado células tumorales autólogas irradiadas o
extractos de las mismas como fuente de antígenos tumorales, en combinación con adyuvantes
(Mitchell y cols. 1988; Morton y cols. 2002). También, se han desarrollado vacunas con células
tumorales autólogas o heterólogas modificadas química, enzimática o genéticamente (Mach y
Dranoff 2000; Berd y cols. 2001; Salgia y cols. 2003).
El desarrollo de vacunas basadas en antígenos asociados al tumor, que constituyen a fin de
cuentas moléculas propias para las cuales en su mayoría operan los mecanismos de deleción
tímica central, encuentra su marco teórico en la teoría del daño, postulada por Polly Matzinger
(Matzinger 1994). Según esta teoría, la función principal del sistema inmune radica en la
necesidad de distinguir entre lo dañino y lo inocuo, en lugar de distinguir entre lo propio y lo no
propio. De esta forma, la vacunación contra lo propio pudiera tener éxito si la misma ocurre en
un contexto de “señales de peligro”, para lo cual desempeña un papel preponderante el diseño de
los adyuvantes.
Por tanto, las estrategias de vacunación empleadas en el tratamiento del cáncer dependerán en
gran medida de la calidad del antígeno seleccionado (Berzofsky y cols. 2004) y del adyuvante
utilizado para la activación de la respuesta inmune, conllevando a una eficiente activación de las
APC y a una consiguiente activación de los linfocitos T CD4+ y T CD8+ para ejercer sus
funciones.
En el campo de la vacunación contra los tumores también existen informes recientes que señalan
que la diversificación del reconocimiento antigénico que ocurre con algunas estrategias
vacunales puede ser beneficiosa para la respuesta antitumoral. Este fenómeno muy bien descrito
en los modelos de enfermedades autoinmunes, se inicia con la respuesta contra un simple epítopo
antigénico. Este epítopo es presentado en el MHC II de las células presentadoras, lo cual activa
células Th y células T efectoras que causan la inflamación crónica y la muerte de la célula
blanco. El desecho celular, que contiene otros antígenos, es capturado entonces por las células
presentadoras y presentado de forma cruzada por el MHC I, con la consiguiente activación de
nuevas células T CD8+ específicas por otros epítopos en el mismo antígeno (diversificación
intramolecular) o en otras moléculas (diversificación intermolecular). Existen algunas evidencias
experimentales que sustentan este fenómeno. El-Shami y colaboradores publicaron que en
ratones vacunados con un péptido de OVA (ovoalbumina) y retados con el EG7OVA (línea de
21
Revisión Bibliográfica
timoma EL-4 transfectada con OVA) son capaces de generar una respuesta CTL contra otros
antígenos. Dicha respuesta mostró protección al reto posterior con EL-4 que no expresa OVA
(el-Shami y cols. 1999). En el caso de estudios en humanos, se ha publicado que pacientes que
sobre-expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo 2 (HER-2/neu, del inglés
"human epidermal growth factor receptor type 2") en tumores de mama y ovario y que se han
vacunado con péptidos de esta molécula combinados con el factor estimulador de colonias de
granulocitos y macrófagos (GM-CSF, del inglés "granulocyte-macrophage colony stimulating
factor"), muestran respuesta inmune contra péptidos no incluidos en la vacuna. La presencia de
este tipo de respuesta correlaciona además con la respuesta antitumoral observada en los
pacientes vacunados (Brossart y cols. 2000).
Debido a la poca inmunogenicidad de las células tumorales y a la definición molecular de los
antígenos tumorales, en la década de los 80 las investigaciones desviaron su atención al uso de
entidades moleculares en la terapia activa contra el cáncer (Lage y cols. 2005). Una de las
estrategias usadas en este tipo de vacunas ha sido la inserción de los genes codificantes de estos
antígenos tumorales en vectores virales recombinantes (Liu 1998) y el uso del correspondiente
ácido nucleico desnudo (Polo y Dubensky 1998). Otro tipo de vacuna molecular son las
compuestas por péptidos derivados de varios antígenos tumorales. Entre estos, los más usados
son aquellos procedentes de antígenos de melanoma como son MART-1, gp-100, tirosinasa y los
antígenos de la familia MAGE. La vacunación con estos péptidos ha sido exitosa en la inducción
de células T CD8+ específicas, pero la respuesta clínica ha sido variable y poco efectiva
(Slingluff y cols. 2003; Akiyama y cols. 2005). Otras estrategias con vacunas moleculares
comprende el uso de proteínas sintéticas o purificadas a partir del tumor (Naftzger y cols. 1996).
Entre estas vacunas se incluyen aquellas que contienen proteínas de estrés térmico (HSP, del
inglés "heat shock protein"); oncoproteínas mutadas como K-ras y p53; glicoproteínas de la
familia de las mucinas tales como MUC-1; el antígeno carcinoembrionario (CEA, del inglés
"carcinoembryonic antigen"), expresado en tumores gastrointestinales; el antígeno prostático
específico (PSA, del inglés "prostatic-specific antigen"), sobrexpresado en el cáncer de próstata,
entre otras. En este sentido, se ha realizado un intenso esfuerzo para diseñar vacunas basadas en
las HSP autólogas derivadas de tumores (Belli y cols. 2002). Estas proteínas endógenas,
altamente conservadas, forman complejos con péptidos tumorales que inducen una respuesta de
células T específicas cuando son presentadas en las APC (Rivoltini y cols. 2003).
22
Revisión Bibliográfica
Otra estrategia, que ha sido ampliamente usada, es la vacunación con células dendríticas ( DCs)
(Nestle y cols. 2001). Estas células presentadoras capturan, procesan y presentan péptidos a
células T vírgenes en los órganos linfoides secundarios. Este proceso constituye la primera señal
que junto con la interacción de moléculas coestimuladoras entre las DCs y los linfocitos T
conduce a la activación de estos últimos y la posterior eliminación de las células tumorales que
expresan el antígeno. Las DCs pueden estimularse con células tumorales autólogas o alogénicas
(Celluzzi y Falo 1998), extracto de tumores (Ashley y cols. 1997; Nair y cols. 1997) y cuerpos
apoptóticos (Chang y cols. 2002). Además, se pueden fusionar mediante electroporación con
células tumorales irradiadas (Siders y cols. 2003). Es posible también la incorporación de ácido
desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) exógenos en estas células mediante
virus recombinantes, plásmidos o electroporación (Akiyama y cols. 2000; Esslinger y cols.
2002). La mayoría de estas preparaciones han sido inmunogénicas y han provocado rechazo del
tumor en los modelos animales. En el escenario clínico, la vacuna más avanzada de DCs es
Provenge, también conocida como Sipuleucel-T. Esta vacuna, usada en cáncer de próstata
avanzado, se basa en DCs cargadas ex vivo con una proteína de fusión recombinante que
contiene la fosfatasa ácida prostática y el GM-CSF. Los resultados del ensayo fase III
demostraron un aumento significativo en la sobrevida de los pacientes vacunados respecto al
control que solo recibió placebo, así como una disminución apreciable en los niveles séricos de
PSA (Basler y Groettrup 2007). Esta terapia constituye la primera vacuna terapéutica aprobada
por la FDA para cáncer (Kantoff y cols. 2010; Madan y Gulley 2011).
El beneficio principal de la inmunoterapia activa específica en el tratamiento del cáncer es la
posibilidad de dirigir el ataque del sistema inmune hacia las células tumorales del propio
individuo. Esta especificidad las hace más efectivas y probablemente menos tóxicas que otros
agentes terapéuticos empleados hasta el momento.
Por otra parte, a pesar de la experiencia acumulada hasta hoy en el campo de la inmunoterapia
activa específica, es muy común observar la falta de asociación entre la inducción de respuesta
inmune específica con una respuesta clínica favorable en los pacientes. Entre otras causas, esto
pudiera estar dado por una baja sensibilidad en las técnicas empleadas para medir las respuestas
generadas, por la incapacidad de medir la respuesta que tiene lugar en el sitio del tumor y/o en
los órganos linfoides secundarios o por el empleo de esquemas de vacunación subóptimos para la
generación de una respuesta específica realmente efectiva.
23
Revisión Bibliográfica
1.1.1.4 Optimización de las estrategias vacunales
Aunque no existen evidencias sólidas en la literatura científica acerca de los esquemas óptimos
de tratamiento con vacunas de cáncer, los estudios provenientes del campo de las enfermedades
infecciosas sugieren que en algunos escenarios, la aplicación de altas dosis de vacunas
compuestas por proteínas recombinantes está asociado a una robusta respuesta específica por el
antígeno y a un aumento en la frecuencia de individuos respondedores. Este es el caso de un
ensayo realizado en animales, los cuales se inmunizaron con dosis diferentes de una vacuna
contra el virus del herpes, obteniéndose mayores respuestas de linfocitos T específicos en
aquellos animales inmunizados con la dosis mayor (Martina y cols. 2003). En otro ensayo
conducido en donantes sanos, el grupo que recibió la mayor dosis de una vacuna basada en
proteínas recombinantes del virus del papiloma humano (HPV, del inglés “Human Papiloma
Virus”) generó la mayor frecuencia de respondedores entre los sujetos vacunados (de Jong y
cols. 2002). Por otra parte, la administración de altas dosis de vacuna se asocia tanto al desarrollo
de una respuesta de memoria después de la vacunación, como a la generación de una respuesta
de anticuerpos de alta avidez por el antígeno (Kundig y cols. 1996).
La correcta identificación de adyuvantes efectivos también constituye un aspecto crítico en el
desarrollo de las vacunas contra el cáncer. Los requisitos de un adyuvante empleado para el
desarrollo de vacunas terapéuticas para el tratamiento de pacientes de cáncer, difieren de los
requisitos de los adyuvantes convencionales. En primer lugar, los pacientes que recibirán la
inmunoterapia son pacientes inmunocomprometidos, que tienen dañados los mecanismos de
procesamiento y presentación de antígenos, y la inhibición de la reactividad a antígenos propios
controlada por las células T reguladoras está reforzada (O'Garra y Vieira 2004). En segundo
lugar, los antígenos tumorales son generalmente propios y por tanto relativamente poco
inmunogénicos. Por último, los tumores desarrollan mecanismos para evadir al sistema inmune,
como por ejemplo, los mecanismos de edición tumoral, la baja presencia o ausencia de expresión
de las moléculas de MHC-I, así como la secreción de citocinas o moléculas supresoras (Ko y
cols. 2003). Por tanto, los adyuvantes de las vacunas para el tratamiento del cáncer deben no solo
estimular respuestas a antígenos poco inmunogénicos, sino también revertir la inmunosupresión
inducida por los tumores. Estos adyuvantes tienen entonces que enfrentar diversos retos en las
diferentes etapas de la generación de inmunidad antitumoral durante la vacunación. De hecho,
sus funciones fundamentales dentro de los preparados vacunales son: servir de depósito para
24
Revisión Bibliográfica
liberar lentamente el antígeno a la zona de inflamación en la cual se reclutan las DCs; madurar
las DCs; mediar la presentación cruzada de antígenos acoplados a ellos, modular y polarizar la
respuesta inmune, así como activar los linfocitos T citotóxicos (CTL, del ingles: “cytotoxic T
lymphocytes”).
Entre las “señales de peligro” exógenas que han demostrado una excelente capacidad adyuvante
se encuentran el bacilo Calmette-Guérin (BCG) y el ADN bacteriano no metilado con secuencias
CpG (CpG). El BCG se ha utilizado con cierto éxito como un agente antitumoral en el
tratamiento del cáncer superficial de vejiga y en melanomas (Alexandroff y cols. 1999; Soiffer y
cols. 2003). Por su parte el CpG ha mostrado la capacidad de estimular potentes respuestas
específicas contra varios tipos de tumores en ensayos preclínicos (Brunner y cols. 2000). Estas
investigaciones preclínicas constituyeron el precedente para la realización de numerosos ensayos
clínicos que se encuentran actualmente en curso utilizando las secuencias de CpG o el BCG
como adyuvantes de vacunas terapéuticas contra el cáncer (Speiser y cols. 2005). Otro derivado
bacteriano al cual se le atribuyen propiedades inmunopotenciadoras importantes y un efecto
antitumoral en ensayos preclínicos es la proteína OmpA de la membrana externa de la bacteria
Gram-negativa Klebsiella pneumoniae (Jeannin y cols. 2000). La capacidad de todos estos
derivados de activar las DCs ha quedado demostrada en diversos escenarios. Por ejemplo, tanto
el BCG como el CpG activan a las DCs humanas y de ratón, promoviendo el aumento en la
expresión de las moléculas de los complejos principales de histocompatibilidad (MHC, del inglés
"major hiscompatibility complex") tipo I y II, de las moléculas CD80 y CD86 y de la secreción
de IL-12 (Jakob y cols. 1998; Goldmann y cols. 2002). Igualmente existen experimentos
realizados con la proteína OmpA de N. meningitidis expresada de forma recombinante, que
muestran su capacidad para inducir maduración completa de las DCs a través de los receptores
tipo Toll (TLR, del inglés "Toll like receptor") (Jeannin y cols. 2000).
Las rutas de administración empleadas para la vacunación también pueden tener una importancia
capital en la obtención de un efecto óptimo con un preparado vacunal específico. En los
esquemas de vacunaciones de cáncer se han empleado mayoritariamente las vías de
inmunización subcutánea o intradérmica. Los resultados derivados de numerosos ensayos
realizados en animales, así como algunos estudios clínicos, sugieren que las vías de
administración intratumoral o intraganglionar pudieran ser las más eficaces. Kudo-Saito y
colaboradores por ejemplo, demostraron que el uso secuencial de una vacuna por vía subcutánea
25
Revisión Bibliográfica
seguida por una estrategia de vacunación intratumoral es más eficaz en términos de efecto
antitumoral, que el empleo de una sola vía de inmunización (Kudo-Saito y cols. 2005b).
Por último, una estrategia que ha comenzado a aplicarse recientemente es la aplicación de
terapias combinadas dirigidas a obtener respuestas antitumorales eficaces. Para lograr este
objetivo se deben tener en cuenta terapias que combinen la eliminación de elementos supresores
tales como células T reguladoras y citocinas supresoras, la adición de componentes activos del
sistema inmune como la transferencia adoptiva de células T efectoras, las citocinas estimuladoras
y el uso de DCs como presentadoras. Además, se deben adicionar moléculas que actúen
directamente sobre las células malignas, como pueden ser aquellas que inhiban la angiogénesis y
el crecimiento del tumor.
2.3.3
Vacunas en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Históricamente el primer intento para tratar el CPCNP mediante inmunoterapia activa ha sido el
empleo de vacunas de células autólogas o alogénicas, que se hacen más antigénicas por medio de
manipulaciones genéticas para que expresen moléculas inmunoestimuladoras como el GM-CSF.
Esta aproximación terapéutica resulta atractiva porque no requiere del conocimiento previo de un
antígeno como blanco a tratar. El uso de estas vacunas ha tenido poco éxito en otras
localizaciones como melanoma y cáncer de próstata, no obstante una de ellas (Lucanix) ha
alcanzado la fase III de desarrollo para el tratamiento del CPCNP (Mellstedt y cols. 2011).
Con la identificación de antígenos tumorales expresados por el CPCNP se han desarrollado
productos mejor caracterizados para la inmunoterapia activa en el CPCNP, entre los que se
encuentran Gvax, LBLP25 o Stimuvax, Belagenpumatucel o Lucanix, vacuna Mage-A3, EP2101
(IDM 2101) y vacuna de células dendríticas (O'Mahony y cols. 2005; Nemunaitis y Murray
2006; Nemunaitis 2007; Barve y cols. 2008; Dy y Adjei 2009; Gerard y Debruyne 2009;
Hirschowitz y Yannelli 2009).
Gvax es una vacuna de células autólogas transfectadas con un adenovirus que tiene el gen del
GM-CSF. Esta vacuna es específica para cada paciente y requiere de una muestra de tejido
tumoral individual para su desarrollo. La manipulación genética induce la secreción de citocinas
y proteínas inmunosupresoras en el sitio de inyección. Ha sido investigada en un estudio Fase
I/II de 43 pacientes con CPCNP (33 con enfermedad avanzada). El perfil de toxicidad fue
satisfactorio con reacción local grado 1-2, mientras la secreción de GM-CSF se correlacionó con
26
Revisión Bibliográfica
la evolución de los pacientes. Un problema asociado al uso de esta vacuna es que se prepara con
tejido propio de pacientes en estadio avanzado de la enfermedad lo que puede producir una
demora desfavorable en el inicio de esta terapéutica.
Belagenpumatucel (Lucanix) está compuesta por múltiples líneas celulares de CPCNP
transfectadas con el gen del factor transformante de crecimiento β2 (TGF β2) que inhibe la
expresión celular del TGF β2 haciendo a las células tumorales más inmunogénicas. Lucanix ha
sido estudiada en ensayo fase II abierto en pacientes con CPCNP estadios II, III y IV después de
la primera línea de tratamiento con quimioterapia. En este ensayo los autores demostraron que no
se presentaron eventos adversos significativos. Los pacientes de estadios avanzados que
recibieron la dosis mayor presentaron un índice de respuesta mayor y ventajas en la
supervivencia a uno y dos años cuando se compararon con los que recibieron dosis menor de
tratamiento. Estos resultados permitieron el inicio de un ensayo Fase III (Nemunaitis y cols.
2006).
La vacuna liposomal MUC 1(STIMUVAX) (L-BLP25) tiene como blanco el núcleo del antígeno
tumor-asociado MUC1.El BLP25 es un lipopéptido de 25 aminoácidos que le brinda la
especificidad de MUC1 (Mucina 1). MUC1 es una proteína transmembrana, que se expresa en
las células epiteliales secretoras y contiene grandes cantidades de azúcares unidos por enlaces de
tipo O-glicosídicos. Se encuentra sobrexpresado en numerosos tipos de cáncer. La MUC1
asociada a tumores es antigénicamente distinta a la de las células normales (Nemunaitis 2007).
Su expresión se asocia a reducción de la apoptosis, inmunosupresión, resistencia a los
quimioterápicos y supervivencia limitada. Stimuvax es una vacuna liposomal que incorpora un
adyuvante lipídico y tres lípidos para aumentar la distribución de la vacuna a las células
presentadoras. En un ensayo fase II (Butts y cols. 2005) en pacientes con estadio IIIB/IV de
CPCNP, después de finalizar la primera línea de tratamiento y haber presentado respuesta
objetiva o estabilización de la enfermedad, LBLP25 fue administrada semanalmente durante 8
semanas en 4 sitios de inyección y con una dosis baja de ciclofosfamida 3 días antes de la
vacunación. El tratamiento resultó tolerable, los eventos adversos más comunes fueron: síntomas
gripales y reacciones en el sitio de inyección. La mediana de supervivencia fue de 17,4 meses
para el grupo vacunado en comparación con 13 meses para el grupo control. Los pacientes en
estadio IIIB fueron los de mayor supervivencia. Estos resultados conllevaron a la realización de
un estudio Fase III actualmente en curso.
27
Revisión Bibliográfica
EP2101 (IDM 2101) es una vacuna generada para inducir respuesta de linfocitos T citotóxicos
contra múltiples epítopos y antígenos tumor asociados. Se diseñó para inducir esa respuesta
contra cinco antígenos sobrexpresados con frecuencia en el CPCNP: antígeno carcinoembriónico
(CEA), proteína p53 (p53), HER-2/neu y antígenos de melanoma MAGE 2 y MAGE 3, que han
sido estudiados en ensayos con vacunas previas (Marshall y cols. 2000; Brabender y cols. 2001;
Fong y cols. 2001). Dos ensayos fase I previos demostraron la seguridad e inmunogenicidad de
esta vacuna, por lo que en un ensayo Fase II se incluyeron pacientes con estadio IIIB/IV de
CPCNP que resultaron HLA positivos (Barve y cols. 2008); no se encontraron eventos adversos
significativos, solo eritema y dolor leve en el sitio de inyección. La supervivencia al año fue del
60% y la mediana de supervivencia resultó de 17 meses.
La vacuna MAGE A3 fue diseñada para estimular al sistema inmune para responder al antígeno
MAGE A3 que fue aislado en primer lugar en células de melanoma. Ensayos fase I en melanoma
y CPCNP (Marchand y cols. 2003) dieron la evidencia de que esta proteína es poco
inmunogénicas por sí misma, por lo que requiere de un sistema adyuvante para que induzca una
respuesta inmune robusta y sostenida (Atanackovic y cols. 2004). Fue evaluada en un estudio
Fase II placebo-controlado en 182 pacientes, estadios Ib y II de CPCNP después de haber sido
resecado y en tumores que expresan MAGE A3. A los 28 meses de seguimiento se observó un
27% de incremento del intervalo libre de enfermedad cuando se comparó con el grupo control.
Los eventos adversos descritos en este ensayo fueron ligeros (Vansteenkiste y cols. 2007). Con
estos resultados se diseñó un ensayo Fase III multinacional que aún está en fase de reclutamiento
de pacientes.
Otras terapias ensayadas en pacientes de CPCNP son las basadas en vacunación con células
dendríticas. Las células dendríticas poseen todos los elementos necesarios para iniciar y
potenciar una respuesta inmune antígeno específica. Para estas terapias los precursores de células
dendríticas son obtenidos mediante leucoféresis, se cultivan y se suministran en forma de vacuna
al paciente. En un estudio fase I fueron generadas células dendríticas de precursores CD14+ que
fueron pulsados con cuerpos apoptóticos de una línea celular de CPCNP que sobre-expresó
Her2/neu, CEA, MAGE-2. De los 16 pacientes del grupo vacunado, ninguno experimentó
eventos adversos serios, demostrando que la vacuna es segura y presentó actividad biológica en
11 de los pacientes evaluados (Hirschowitz y Yannelli 2009). Sin embargo, ensayos posteriores
no han demostrado evidencias de efectividad en este tipo de tumor.
28
Revisión Bibliográfica
Por otra parte, el único estudio clínico relacionado con la terapia activa basada en el sistema del
REGF y sus ligandos para el tratamiento del CPCNP, lo constituye la vacunación contra el
ligando EGF. Resultados previos de nuestro grupo han demostrado la posibilidad de realizar una
inmunoterapia activa de cáncer basada en la inmunización con este ligando del REGF
(Rodriguez y cols. 2010).
2.3.4
Tratamientos combinados en la inmunoterapia del cáncer.
La terapia de cáncer ha evolucionado hacia la integración estratégica de distintas modalidades de
tratamiento con vistas a optimizar las oportunidades de curación. La cirugía y la radioterapia se
han empleado para lograr un control locoregional de la enfermedad, mientras que las terapias
sistémicas (la quimioterapia, la terapia endocrina, las terapias basadas en dianas moleculares) se
han empleado en el control de la enfermedad difusa (en neoplasias hematológicas) o de la que se
ha expandido más allá del sitio primario (en tumores sólidos) (Emens 2010). Además, múltiples
drogas con mecanismos de acción complementarios se combinan frecuentemente para obtener
eficacias antitumorales aditivas o sinérgicas.
La quimioterapia de cáncer típicamente interrumpe vías regulatorias fundamentales, esenciales
para la supervivencia y el crecimiento de las células tumorales, pero están limitadas por
mecanismos de resistencia a la droga y por el daño tóxico colateral sobre los tejidos normales.
Recientemente se ha descrito como determinante principal, tanto del curso clínico como de la
respuesta clínica en los tumores malignos, la interacción entre el tumor y el hospedero (Zitvogel
y cols. 2008; Formenti 2010; Pages y cols. 2010). Entre los elementos de la respuesta del
hospedero que son críticos para la progresión y el crecimiento del tumor se incluyen: los
fibroblastos del estroma, las células endoteliales del hospedero, los macrófagos asociados al
tumor, las células NK y los linfocitos tumor específicos. El mecanismo de acción de múltiples
drogas se basa en la manipulación de la interacción entre el tumor y el hospedero para favorecer
la regresión tumoral. El Bevazucimab, el Sunitinib y el Sorafenib actúan sobre la biología de la
célula endotelial de modo que afectan la vasculatura asociada al tumor (Heath y Bicknell 2009).
Algunos anticuerpos monoclonales se unen específicamente a su molécula diana en la célula
tumoral y provocan el reclutamiento de células efectoras de la inmunidad innata para que medien
en la citotoxicidad sobre las células tumorales (Weiner y cols. 2009).
29
Revisión Bibliográfica
Por su parte las vacunas de cáncer pueden inducir de forma activa, respuestas inmunes
específicas sobre los tumores tanto de tipo humoral como de tipo celular (Finn 2008). Las
ventajas de este tipo de inmunoterapia con respecto a las terapias tradicionales, se deben a la
exquisita especificidad por las células tumorales, con un mínimo de efectos adversos y a su
potencialidad para producir efectos de larga duración sin precisar una terapia activa continua
como consecuencia de la memoria inmunológica que se crea.
Al mismo tiempo se ha descrito la capacidad de determinadas quimioterapias de aumentar la
eficacia de las vacunas de células tumorales y de favorecer la actividad de células T tumor
específicas transferidas adoptivamente (Baxevanis y cols. 2010). Entre los mecanismos
propuestos para la potenciación de la respuesta inmune inducida por la quimioterapia se
encuentra la inducción de muerte celular, aumentando la presentación cruzada de antígenos
tumorales in vivo. Adicionalmente, la mielosupresión inducida por la quimioterapia puede
inducir la producción de citocinas que favorecen la proliferación homeostática y/o la ablación de
mecanismos de inmunosupresión.
De modo que la combinación del efecto de las terapias establecidas para el tratamiento del
cáncer con los efectos logrados por la inmunoterapia se ha convertido en una estrategia
terapéutica que promete ser más efectiva para el tratamiento del cáncer.
En la actualidad diversos ensayos clínicos han abordado estas estrategias combinatorias. Como
ejemplos de estas estrategias está el empleo de anticuerpos contra el antígeno anticitotóxico
expresado en células T (CTLA-4, del inglés "cytotoxic T lymphocyte antigen") con lo que se
bloquea la señal regulatoria negativa dada por esta molécula. En modelos animales, la
combinación de este anticuerpo con vacunas de células completas o vacunas peptídicas tuvo
como resultado un significativo incremento de la actividad antitumoral de dichos inmunógenos
(Davila y cols. 2003; Hurwitz y cols. 2003). De manera similar, la combinación de anticuerpos
contra las células T reguladoras CD4+CD25+ con vacunas de DCs es otra de las nuevas
estrategias de terapias combinadas que incluyen vacunación, dirigidas a elevar la eficacia de la
respuesta inmune contra el cáncer (Kudo-Saito y cols. 2005a; Prasad y cols. 2005).
En estudios clínicos fase II en CPCNP avanzado recurrente se ha observado un incremento en el
tiempo de progresión de la enfermedad y en la supervivencia global cuando se combina el
anticuerpo Bevacizumab (Avastin) con regímenes de platino (Adjei y cols. 2010). Se han
30
Revisión Bibliográfica
descrito eventos adversos severos incluyendo hemorragia pulmonar en pacientes con cáncer de
pulmón de histología escamosa. Basado en estos resultados el estudio Fase III 4599 ECOG (del
inglés: “Eastern Cooperative Oncology Group”) combinó el Bevacizumab en el mismo tipo de
pacientes pero de histología no escamosa.
Por otra parte, un ensayo fase II en primera línea de tratamiento combinado con quimioterapia en
CPCNP avanzado demostró un incremento en el índice de respuesta en los pacientes tratados con
la combinación Figitumumab/Quimioterapia en comparación con quimioterapia sola (54% vs
42%) (Karp y cols. 2009). El Figitumimab (CP- 751871) es un potente anticuerpo monoclonal
humanizado que se une selectivamente al receptor del factor de crecimiento de insulina (IGF1R)
e impide la unión del factor de crecimiento insulina-like tipo I a su receptor y como
consecuencia, inhibe el crecimiento tumoral (Cohen y cols. 2005).
La vacuna Oncophage, compuesta por la HSP 96 a la cual están acomplejados péptidos
tumorales, es un ejemplo del uso de este tipo de terapia, específicamente en pacientes de
carcinoma renal de estadio IV. Los resultados de un ensayo clínico fase III ya concluido,
mostraron un aumento en el intervalo libre de enfermedad en el grupo de pacientes tratados con
la combinación de cirugía, vacuna y la IL-2 comparado con el grupo tratado con cirugía e IL-2
(Belli y cols. 2002).
La inmunoterapia basada en el REGF también ha sido blanco de combinaciones terapéuticas.
Para el caso del Cetuximab, se ha comprobado que incrementa la sensibilidad a la quimioterapia
tanto in vitro como en humanos (Kim y cols. 2009). El Cetuximab ha sido estudiado en varios
ensayos clínicos en combinación con quimioterapia en primera y segunda línea. Resultados del
estudio multicéntrico Fase I/II de Cetuximab en combinación con paclitaxel y carboplatino en
pacientes con estadio IV de CPCNP demostraron que el tratamiento fue seguro y bien tolerado y
encontraron índice de respuesta, tiempo a la progresión y mediana de supervivencia ligeramente
superiores a los controles históricos tratados solamente con carboplatino y paclitaxel (Thienelt y
cols. 2005). Con posterioridad los autores del estudio Fase III denominado FLEX, indicaron que
la adición de Cetuximab al régimen de quimioterapia con cisplatino/vinorelbina en primera línea,
provocó un modesto incremento en la supervivencia global con incremento en el índice de
respuesta en pacientes con CPCNP avanzado que expresan en REGF (Pirker y cols. 2009;
31
Revisión Bibliográfica
Stinchcombe y Socinski 2009). El principal evento adverso que produce este anticuerpo es
erupción cutánea grado 2- 3.
Con todos estos conocimientos, el potencial para maximizar la actividad biológica y el beneficio
clínico de las inmunoterapias nunca ha sido mayor. La integración estratégica de la
inmunoterapia con las quimioterapias para transformar el microambiente tumoral y aminorar
distintos mecanismos de supresión y tolerancia inmune, podrían sustentar una respuesta inmune
antitumoral sostenida y vigorosa. Escogiendo cuidadosamente las dosis y los tiempos de
administración de las drogas en la interacción con la inmunoterapia, usando modelos de
laboratorio relevantes para la clínica y en ensayos clínicos pilotos, se podrá acelerar el desarrollo
de los ensayos clínicos en las fases superiores para convertir la quimio-inmunoterapia en una
realidad clínicamente significativa (Emens 2010).
2.4
La vacuna CIMAvax-EGF.
La inducción de una deficiencia de EGF como consecuencia de una inmunoterapia activa ha sido
un concepto emergente desarrollado por científicos cubanos del Centro de Inmunología
Molecular dese 1992. Este concepto involucra la manipulación del sistema inmune del individuo
para producir anticuerpos propios contra la molécula de EGF con el objetivo de prevenir la
progresión del tumor (Pérez y cols. 1984; Macias y cols. 1987; González y cols. 1996; Arteaga
2003; Lage y cols. 2003; González y Lage 2007).
CIMAvax-EGF es una vacuna terapéutica de cáncer basada en la unión del EGF humano
recombinante conjugado a una proteína tansportadora (P64k de Neisseria meningitidis) que ha
sido desarrollada completamente en Cuba. Resultados previos de nuestro grupo han demostrado
la posibilidad de realizar una inmunoterapia activa de cáncer con la vacuna basada en EGF. De
hecho, se han obtenido evidencias tanto preclínicas como clínicas acerca de su
inmunogenicicidad y baja toxicidad (González y cols. 1996).
2.4.1
Estudios pre-clínicos
Los estudios preclínicos para el desarrollo de la formulación más efectiva en la inducción de la
respuesta inmune contra el EGF autólogo comenzaron en la década de los 90. En un primer
ensayo se evaluó la posibilidad del reconocimiento del EGF propio en ratones y monos
(González y cols. 1996). Los ratones produjeron anticuerpos contra el EGF del ratón cuando
32
Revisión Bibliográfica
fueron inmunizados con EGF unido a la proteína transportadora. Los anticuerpos producidos
mostraron memoria inmunológica de isotipo IgG. En los monos también se observó la
producción de anticuerpos anti-EGF cuando fueron vacunados con EGF humano conjugado con
la proteína transportadora. Además se demostró que la inmunización con EGF modifica la
biodistribución del EGF inyectado en ratones (González y cols. 1996).
Adicionalmente, se realizaron 7 estudios en animales para mejorar la inmunogenicidad de la
vacuna de EGF humano recombinante con diferentes proteínas transportadoras y determinar la
mejor formulación. Las proteínas transportadoras estudiadas fueron: Toxoide Tetánico, la P64k
de la Neisseria meningitidis, el T3 (anticuerpo monoclonal murino que reconoce al CD3
humano) y el B7 (anticuerpo monoclonal murino que reconoce las células B humanas). Los
adyuvantes estudiados fueron: el adyuvante incompleto y completo de Freund (AIF/ACF), la
alúmina y el Montanide ISA 51 (adyuvante oleoso producido por SEPPIC, Francia). Se
estudiaron además diferentes rutas de administración, diferentes esquemas y tratamientos
combinados con quimioterapia y/o inmunosupresión (González G y cols. 1997; González y cols.
2002).
Todos los experimentos demostraron que la inmunización con el EGF unido a una proteína
transportadora en un adyuvante apropiado, genera una respuesta de anticuerpos anti-EGF que
tiene un efecto antitumoral en animales de experimentación. Además no se observó daño
histológico en ninguno de los animales tratados (González y cols. 1996).
2.4.2
Ensayos clínicos
El desarrollo clínico de CIMAvax-EGF comenzó en el año 1995 con un ensayo fase I/II
(piloto I) realizado en el hospital CIMEQ en La Habana. En este ensayo se incluyeron 10
pacientes con tumores malignos primarios en diferentes localizaciones, que habían recibido
previamente la primera línea de quimioterapia El objetivo principal de este estudio fue la
evaluación de la inmunogenicidad de la incipiente formulación vacunal (González y cols. 1998).
El resultado de este ensayo constituyó la primera evidencia científica publicada sobre la
posibilidad de inducir una respuesta inmune contra el EGF autólogo en pacientes con tumores en
estadio avanzado. Adicionalmente, se confirmó el uso de la proteína P64k como el
immunopotenciador apropiado para la conjugación y formulación de la vacuna CIMAvax-EGF.
33
Revisión Bibliográfica
Un factor clave en el desarrollo de la formulación final de la vacuna fue la selección de la
localización tumoral apropiada para la introducción de esta estrategia vacunal novedosa. El
CPCNP fue seleccionado por ser una patología muy frecuente y por la alta expresión del REGF
en los tejidos tumorales durante el desarrollo y progresión de las neoplasias de pulmón (Lage y
cols. 2003; González y Lage 2007). La magnitud de la expresión del REGF se ha informado en
la literatura como un factor predictivo de respuesta a las terapias biológicas en pacientes de
CPCNP (Toffoli y cols. 2007).
Los siguientes ensayos clínicos publicados coincidieron en el tiempo (piloto II, 1997–1999 y
piloto III, 1998–2001) y fueron también ensayos Fase I/II desarrollados en hospitales de la
Ciudad de la Habana. El ensayo Piloto II incluyó 20 pacientes con CPCNP en etapa avanzada
(IIIb y IV). Diez de los pacientes incluidos recibieron la vacuna en el adyuvante Alúmina y los
otros 10 recibieron la vacuna en el adyuvante Montanide ISA 51 (González y cols. 2003). El
ensayo Piloto III también incluyó 20 pacientes con iguales características a los del ensayo Piloto
II, pero esta vez ambos grupos de tratamiento recibieron ciclofosfamida (200 mg/m2 de
superficie corporal) 72 horas antes de comenzar la vacunación (González y cols. 2003). La
ciclofosfamida ha sido ampliamente estudiada en el tratamiento del cáncer. Sus efectos
inmunomoduladores tienen diferentes repercusiones de acuerdo a la dosis y el esquema
terapéutico utilizado (Man y cols. 2002; Ghiringhelli y cols. 2004). Este tratamiento previo a la
vacunación fue introducido con el objetivo de interferir la tolerancia inmunológica al EGF y
potenciar la inducción de la inmunogenicidad contra esta molécula propia desde la primera dosis
(González y cols. 2003).
Ambos ensayos clínicos confirmaron la inducción de una respuesta inmune humoral específica
contra el EGF e hicieron posible la clasificación de los pacientes inmunizados en dos subgrupos:
malos respondedores (MR) y buenos respondedores (BR) de acuerdo a la magnitud de la
respuesta de anticuerpos anti-EGF generada y a la seroconversión de la respuesta inicial.
En ambos estudios, la supervivencia fue mayor para el grupo de BR (media: 12,41 meses;
mediana: 9,1 meses), que para el grupo MR (media: 5,47 meses; mediana: 4,5 meses). La
diferencia en la supervivencia entre estos dos subgrupos de pacientes fue estadísticamente
significativa (Log rank; p<0,05). Adicionalmente, en estos estudios se observó una mayor
inmunogenicidad cuando se empleó el adyuvante Montanide ISA 51 en la formulación de la
34
Revisión Bibliográfica
vacuna así como los beneficios del tratamiento con bajas dosis de ciclofosfamida 72 horas antes
de iniciar la vacunación (González y cols. 2003; González y cols. 2007).
Por último, en el período 2000-2003 se desarrolló un cuarto ensayo clínico también fase I/II
(piloto IV) con el objetivo de evaluar dos niveles de dosis diferentes y superiores a los utilizados
en los ensayos previos. Cuarenta y tres pacientes con CPCNP en etapa avanzada (IIIb y IV) se
aleatorizaron en dos grupos para recibir 71 μg ó 142 μg de EGF. La dosis menor fue
administrada en una de las regiones deltoides y la superior fue distribuida entre las dos regiones
deltoides (Ramos y cols. 2006). Los pacientes tratados mostraron supervivencias superiores
(media: 9,83 meses; mediana: 8 meses) a las de un control histórico de pacientes con iguales
características demográficas (media: 6,2 meses; mediana: 4,1 meses).
2.4.3
Variables inmunofarmacológicas en la optimización del esquema de vacunación.
La inmunofarmacología de las vacunas de cáncer aún no se comprende totalmente y existen
datos muy escasos sobre los determinantes inmunofarmacológicos que influyen en las vacunas
terapéuticas para el tratamiento del cáncer (Starzl y Zinkernagel 1998; Zinkernagel y Hengartner
2001; Couch y cols. 2003; Berd y cols. 2004; Lage y cols. 2005; Aucouturier y cols. 2006;
Gardiner y cols. 2006). Variables como la dosis, la ruta de administración, el intervalo de
administración de las dosis y las combinaciones óptimas con las terapias establecidas, deberían
ser evaluadas con mayor profundidad. Este proceso es aún más complejo cuando se trata de
optimizar un esquema basado en la generación de anticuerpos contra una molécula propia, con la
intención de eliminar dicha molécula de circulación e impedir la interacción de la misma con su
receptor en las células tumorales (Rodriguez y cols. 2010).
Para hacer más eficiente la inmunización con la vacuna CIMAvax-EGF, los investigadores
retornaron a la experimentación preclínica con la hipótesis de generar una respuesta inmune más
potente, capaz de mantenerse durante un largo período de tiempo después de sucesivas
inmunizaciones. Con este fin inmunizaron animales de diferentes fondos genéticos (ratones
BALB/c y C57BL/6) con la vacuna CIMAvax-EGF (EGF/P64k/Montanide ISA 51) y probaron
diferentes dosis, número de inmunizaciones e intervalos de dosis, tanto durante la fase de
inducción como durante la fase de re-inmunización. De esta manera lograron inducir una
respuesta de anticuerpos anti-EGF, temprana, robusta y de larga duración (Rodriguez y cols.
2008). Para el período de activación, el fraccionamiento de la dosis y la administración
35
Revisión Bibliográfica
intramuscular en 4 sitios anatómicamente diferentes incrementaron los valores de títulos de
anticuerpos y extendieron la duración de la respuesta. Además se demostró que repetidas reinmunizaciones convirtieron los MR en BR. Los resultados de estos estudios conllevan a la
conclusión de que la vacunación debe ser administrada en altas dosis fraccionadas en sitios
anatómicamente diferentes para acercar la vacuna a los nódulos linfáticos regionales y lograr
sinergia de la respuesta inmune (Rodriguez y cols. 2008).
Entre otras vacunas diseñadas para el tratamiento del cáncer de pulmón, la vacuna CIMAvaxEGF es la única vacuna en el mundo que induce títulos de anticuerpos anti-EGF que neutralizan
al EGF endógeno, quitándole al tumor este importante factor de crecimiento (Hirschowitz y
Yannelli 2009).
Los resultados de seguridad e inmunogenicidad obtenidos con el uso de la vacuna EGF en
cáncer, constituyen un estímulo para investigaciones futuras y para el desarrollo de nuevos
esquemas terapéuticos en la inmunoterapia del cáncer.
36
Materiales y Métodos
3.
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1
Materiales y Reactivos
3.1.1
Líneas celulares y medios de cultivo.
Se utilizó la línea celular humana A431 derivada de un carcinoma de vulva (CRL- 1555, ATCC)
(Giard y cols. 1973), debido a su alta expresión del REGF. Esta línea se cultivó en el medio
Dulbecco Modificado (DMEM, Hyclone, EEUU) suplementado con 10% de suero fetal de
ternera (SFT, Hyclone), 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 µg/mL, L-glutamina 2 mM,
piruvato de sodio 1 mM, N-[2-hidroxietil]piperazina-N-[ácido-2-etanosulfónico] 18 mM
(HEPES, Sigma, EEUU), NaHCO3 26 mM y -mercaptoetanol 5x104M, con un pH 7,2 y a una
temperatura de 37ºC, en atmósfera de CO2 5%. Se utilizó en experimentos de Western blot.
3.1.2
Anticuerpos y factores de crecimiento.
3.1.2.1 Anticuerpos

El anticuerpo policlonal de conejo específico para el REGF humano (1005: sc-03), se
obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (EEUU) y se utilizó en experimentos de Western
blot.

El AcM de ratón anti p-Tyr (PY20: sc-508) es un anticuerpo monoclonal diseñado para
detectar específicamente residuos tirosina fosforilados. Santa Cruz Biotechnology
(EEUU)

El AcM anti EGF-1 se obtuvo en los laboratorios del Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología, Sancti-Spíritus, Cuba.
3.1.2.2 Factores de crecimiento

El Factor de crecimiento transformante (TGF) proveniente de la compañía R&D
Systems (EEUU) fue usado para el recubrimiento de placas de microtitulación en la
determinación de títulos de anticuerpos.

El EGF radiomarcado (125I-EGF) fue preparado en el Centro de Isótopos Radiactivos
(CENTIS), La Habana, Cuba; utilizando el método de la cloramina T (Korc y Finman
1989).
37
Materiales y Métodos
3.1.3
Inmunógeno: Vacuna CIMAvax-EGF.
3.1.3.1 Componentes de la vacuna CIMAvax-EGF.

El Factor de crecimiento epidérmico (EGF) humano recombinante, se produjo en el
centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB, La Habana, Cuba) por tecnología
de ADN. Se expresa en Sacaromise sereviciae y está compuesta de una mezcla de EGF
de 51 y 52 aminoácidos. Esta molécula no glicosilada ha demostrado una actividad
biológica equivalente a la de la molécula completa de 53 aminoácidos (Calnan y cols.
2000).

La proteína P64k de Neisseria meningitidis igualmente se produjo en el CIGB, La
Habana, Cuba. Es una proteína recombinante que se expresa en Escherichia coli,
contiene 599 residuos de aminoácidos incluyendo 7 residuos de cisteína (Raúl Gómez
1999).

El Montanide ISA 51(Seppic, Francia) fue el adyuvante utilizado en la preparación
vacunal. Es un adyuvante para vacunas listo para ser usado y debe ser mezclado
50/50(v/v) con la fase acuosa antigénica.
3.1.3.2 Preparación
La vacuna se compone del factor de crecimiento epidérmico (EGF) humano recombinante
conjugado a la proteína recombinante P64k de Neisseria meningitidis como proteína
transportadora. Para la conjugación se añadió a la mezcla de proteínas glutaraldehído al 0,05% y
se mantuvo la reacción durante una hora, en agitación constante y a temperatura ambiente
(25°C). Luego el conjugado se dializó y filtró en condiciones estériles. El conjugado final
contenía dos moléculas de EGF por cada molécula de P64k (González G y cols. 1997; González
y cols. 1998).
Todos los procederes se realizaron dando cumplimiento a las Buenas Prácticas de Manufactura.
Se usó Montanide ISA51 como adyuvante, éste se mezcló hasta la emulsificación con igual
volumen de la vacuna EGF, inmediatamente antes de la inyección.
38
Materiales y Métodos
3.2
Pacientes y Metodología
3.2.1
Selección de los pacientes
3.2.1.1 Ensayo Fase II
Se incluyeron pacientes, con diagnóstico confirmado por técnicas cito-histológicas, de cáncer de
pulmón de células no pequeñas en estadios IIIb-IV con lesiones medibles de acuerdo a los
criterios para la evaluación de la respuesta al tratamiento en tumores sólidos (RECIST, del inglés
“Response Evaluation Criteria in Solid Tumors“). Todos los pacientes recibieron el último ciclo
de quimioterapia al menos 4 semanas antes de la vacunación y tenían una expectativa de vida
superior a 3 meses. Los restantes criterios de inclusión se listan a continuación:

Pacientes portadores de lesiones medibles, definidas como aquellas que puedan ser
exactamente medidas en al menos una dimensión (se refiere al diámetro mayor) y poseen un
diámetro igual o mayor que 20 mm usando técnicas convencionales (tomografía por emisión
de positrones (PET), tomografía axial computarizada (TAC), resonancia magnética nuclear
(RMN) o rayos X) o un diámetro mayor o igual que 10 mm usando TAC espiral.
 Edad  18 años
 Estado general según ECOG  2 (Karnofsky  60 %).
 Pacientes que posean funcionamiento normal de órganos y de la médula ósea definidos
por los siguientes parámetros:
 Hemoglobina  9 g/L
 Leucocitos  3000/L
 Conteo absoluto de neutrófilos  1500/L
 Conteo de plaquetas  100000/L
 Bilirrubina total: Dentro de límites normales.
 Transaminasa glutámico pirúvica (TGP) y Transaminasa glutámico oxalacética. (TGO)
2.5 veces el límite normal superior institucional.
 Creatinina: Dentro de límites normales para cada institución.
39
Materiales y Métodos
 Pacientes del sexo femenino en edad fértil deberán poseer una prueba de embarazo
negativa y emplear métodos contraceptivos tales como dispositivos intrauterinos,
anticonceptivos hormonales, métodos de barrera o ligadura de trompas.
 Pacientes que hayan firmado el consentimiento informado.
3.2.1.2 Ensayo Piloto V.
Se incluyeron pacientes portadores de carcinoma de células no pequeñas de pulmón en estadios
IIIB/IV, vírgenes de tratamiento y con un buen estado físico general y no susceptible de recibir la
quimioterapia con intención curativa. El resto de los criterios de inclusión fueron iguales a los
mencionados anteriormente.
Todos los pacientes incluidos en ambos ensayos consintieron de forma voluntaria y por escrito a
recibir este tratamiento.
3.2.2
Diseño de los estudios y evaluación de los pacientes
3.2.2.1 Ensayo clínico fase II.
Para evaluar el efecto terapéutico de la vacuna EGF se realizó un ensayo clínico Fase II
aleatorizado y abierto. El objetivo principal de este ensayo fue la evaluación de los pacientes
sometidos a tratamiento con la vacuna EGF en comparación con un grupo control.
Fueron reclutados 80 pacientes desde abril del 2002 hasta junio del 2004. El seguimiento duró 24
meses. El protocolo clínico fue aprobado por los Comités de Ética de los centros involucrados y
por la Agencia Nacional Regulatoria de Control de Medicamentos (CECMED).
Los resultados del ensayo fueron validados por un Comité de Expertos Independiente. Solamente
74 pacientes resultaron evaluables según lo especificado en el protocolo de estudio. Cuatro
pacientes no cumplieron con los criterios de entrada en el protocolo, mientras que otros 2
pacientes se rehusaron a continuar participando en el ensayo después de haber sido aleatorizado
y antes de iniciar el tratamiento.
La obtención de suficiente muestra serológica para la realización de las determinaciones
planificadas en el curso del ensayo se afectó por diferentes razones. Del grupo control, cuatro
pacientes se rehusaron a realizarse extracciones frecuentes aun después de haber firmado el
consentimiento informado. Del resto de los pacientes, 28 (11 vacunados y 17 controles) se
40
Materiales y Métodos
colectaron menos de 3 muestras debido principalmente a la progresión del tumor y al deterioro
de las condiciones generales del paciente. De hecho, 23 de ellos fallecieron en los 3 primeros
meses de la inclusión en el ensayo debido al curso natural de la enfermedad.
De los 74 pacientes incluidos se seleccionaron 42 pacientes (26 vacunados y 16 controles) que
fueran evaluables para las determinaciones inmunológicas. Estos pacientes cumplieron los
siguientes requisitos:
1. Tener al menos 3 muestras de suero colectadas en un período de hasta 6 meses de
seguimiento, incluyendo la muestra correspondiente al inicio del tratamiento (día cero).
2. En el caso del grupo vacunado: haber recibido las 5 primeras dosis de vacuna.
3. Sueros colectados con buena calidad (no hemólisis).
3.2.2.1.1 Protocolo de inmunización
Veintiocho días después de haber finalizado la quimioterapia los pacientes fueron aleatorizados
para ser incluidos en el grupo de vacuna o en el grupo control. La aleatorización fue realizada
centralmente a través del sistema de aleatorización simple validado (ASAL) versión 1.2.
Los pacientes del grupo de la vacuna recibieron una dosis baja de ciclofosfamida (200mg/m2), 3
días antes de la primera inmunización. La vacuna CIMAvax-EGF fue administrada adyuvada en
Montanide ISA51 en los días 1, 7, 14, 28 y a continuación mensualmente hasta progresión de la
enfermedad; a este esquema de tratamiento le denominamos: QVV
(Quimioterapia/Vacunación/Vacunación).
Una dosis de la vacuna fue equivalente a 50 µg de EGF (ver Anexo I). Las inmunizaciones se
administraron por vía intramuscular en los miembros superiores.
Los pacientes del grupo control solo
recibieron el mejor tratamiento de paliativo basado
fundamentalmente en analgésicos, bronqueolíticos, etc, para tratar los síntomas y prevenir las
complicaciones derivadas de la enfermedad. Los pacientes vacunados también recibieron mejor
tratamiento de soporte en el momento en que fue necesario.
3.2.2.2 Ensayo piloto V
En este ensayo se incluyeron 20 pacientes vírgenes de tratamiento y con un buen estado físico
general. El principal objetivo de este ensayo fue evaluar la inmunogenicidad y la seguridad de la
vacuna CIMAvax-EGF en un esquema terapéutico nuevo. El protocolo clínico fue aprobado por
41
Materiales y Métodos
los Comités de Ética de los centros involucrados y por la Agencia Nacional Regulatoria de
Control de Medicamentos (CECMED).
3.2.2.2.1 Protocolo de inmunización
Los pacientes recibieron una dosis de 200 mg/m2 de ciclofosfamida 3 días antes de la primera
inmunización y a los tres días se les administraron dos dosis de 200 µg de la vacuna CIMAvaxEGF adyuvada en Montanide ISA51 en la fase previa a la quimioterapia, con un intervalo de 15
días entre cada dosis. La vacuna se administró en 4 sitios de inoculación, en las 2 regiones
deltoideas y en ambas regiones glúteas, por vía intramuscular. El día 32 se inició la
quimioterapia con el régimen de cisplatino 100 mg/m2 y vinblastina 6 mg/m2 cada 21 días hasta
completar los ciclos de tratamiento (entre 4 y 6 ciclos). Transcurridas 4 semanas del último ciclo,
se administró nuevamente una dosis de ciclofosfamida y luego de tres días se reiniciaron las
inmunizaciones con igual dosis de la vacuna de EGF a intervalos mensuales, mientras no
existieran cambios desfavorables en el estado clínico del paciente; este esquema de tratamiento
lo denominamos: Vacunación/Quimioterapia/Vacunación (VQV) (ver Anexo I). El tratamiento
con radioterapia se administró a criterio del investigador clínico.
3.2.3
Criterios de salida del ensayo clínico
En ambos ensayos se cumplieron los siguientes criterios para la salida definitiva del protocolo de
estudio:

A solicitud del paciente.

Por presentar reacciones adversas serias o severas, según criterios de la Organización
Mundial de la Salud (OMS).

Recaída o progresión de la enfermedad antes de concluir la evaluación prevista.

Muerte intercurrente (causas no relacionadas con el tumor y/o la toxicidad del preparado
vacunal).

Pérdida del seguimiento del paciente y desconocimiento de su evolución.
3.2.4
Evaluación de la toxicidad
Se realizó un examen físico exhaustivo a cada paciente antes de la administración del producto y
luego, cada 6 horas durante las primeras 24 horas post-tratamiento. A continuación, se practicó el
42
Materiales y Métodos
examen diariamente durante el período de hospitalización de los pacientes, que fue de al menos
72 horas después de la administración de la vacuna.
Adicionalmente, se realizaron exámenes complementarios de hematología y bioquímica
sanguínea en los siguientes tiempos: pre-inclusión en el protocolo, una semana después y luego
cada mes durante el tiempo de seguimiento de los pacientes. Se realizaron los siguientes
exámenes complementarios: hemoglobina, conteo de leucocitos, plaquetas, proteínas totales,
glucosa, albúmina, TGP, TGO, fosfatasa alcalina, bilirrubina, creatinina y urea.
La toxicidad fue valorada de acuerdo a la escala de la OMS. El estado general fue evaluado de
acuerdo a los criterios del ECOG.
3.2.4.1 QVV
La evaluación de los pacientes se realizó a la inclusión y después cada 4 semanas, e incluyó
examen físico y toma de muestra de sangre para estudios de laboratorio clínico (Anexos II y
III).Los estudios imagenológicos (radiografía de tórax, ultrasonido del abdomen y Tomografía
axial computarizada del tórax) se realizaron al inicio y luego cada 3 meses para evaluar la
respuesta clínica de acuerdo a los Criterios de Evaluación de Respuestas en Tumores Sólidos
(RECIST).
3.2.4.2 VQV
La evaluación de los pacientes se realizó a la inclusión, luego de finalizar el tratamiento con
quimioterapia y cada 3 meses, e incluyó examen físico. La toma de muestra de sangre para
estudios de laboratorio clínico y para los estudios inmunológicos se realizó antes de cada
inmunización (Anexo IV y V).
3.2.5
Extracción, separación y conservación de las muestras de sangre.
Las muestras de sangre fueron incubadas durante 30 minutos a 37ºC y luego durante una hora a
4ºC. Posteriormente fueron centrifugadas a 11000 g durante 10 minutos, se separó el suero y se
conservó a -20ºC para su posterior utilización.
3.2.6
Beneficio clínico
El beneficio clínico se consideró como la supervivencia lograda en cada caso. Para el análisis de
supervivencia global, los tiempos de supervivencias se determinaron desde el momento en que se
43
Materiales y Métodos
incluye el paciente en el ensayo, al diagnóstico hasta que fallece. Para la comparación entre los
dos ensayos clínicos, en el caso particular del ensayo VQV se calculó la supervivencia a partir
del primer mes de concluida la quimioterapia.
3.3
Determinaciones asociadas a la inmunidad específica.
Ensayo QVV: La evaluación de la cinética de la respuesta inmune específica contra el EGF y las
determinaciones de las concentraciones de EGF se realizaron en 42 pacientes (26 vacunados y 16
controles). De los 26 vacunados, se seleccionaron 13 pacientes con buena respuesta de
anticuerpos (BR) para caracterizar la influencia de la vacunación en las concentraciones de
TGFα, la fosforilación del REGF, la capacidad de inhibir la unión EGF/REGF y la
inmunodominancia de la respuesta inmune humoral contra péptidos de la molécula de EGF.
Como controles negativos se utilizaron sueros de 5 pacientes del grupo no vacunado.
Ensayo VQV: La evaluación de la cinética de la respuesta inmune específica contra el EGF y las
determinaciones de las concentraciones de EGF se realizaron en los 20 pacientes. De esto se
seleccionaron los 14 pacientes con más tiempo de evolución y altos títulos de anticuerpos, para
hacer el resto de las determinaciones inmunológicas.
3.3.1
Determinación de títulos de anticuerpos anti-EGF y anti FTC.
Las placas de microtitulación de 96 pozos de fondo plano (Costar) se recubrieron con 10μg/mL
de EGF humano recombinante en solución tampón de recubrimiento (Na2CO3/NaHCO3 0,1 M,
pH 9,6) durante una hora a 37C. Posteriormente las placas se bloquearon con una solución
compuesta por: solución salina tamponada con fosfato (SSTF), Tween 20 (0,05%) [v:v] y
Albúmina Bovina (1%) [v:v] (Solución A), durante 1 hora a 37C. Luego se añadieron los
sueros, diluidos en Solución A. Las diluciones de los sueros se realizaron dobles seriadas, se
ensayaron por triplicado y abarcaron un rango de 1:100 a 1:1024000. Las placas se incubaron en
las mismas condiciones que los pasos anteriores. A continuación se añadió suero de chivo antiinmunoglobulinas (Igs) humanas totales conjugado a la enzima fosfatasa alcalina (Sigma,
Alemania) diluido en solución A y se incubó 1 hora a 37C. Luego se adicionó solución sustrato,
consistente en 1 mg/mL de p-nitrofenilfosfato (Sigma, Alemania) en solución tampón
dietanolamina, pH 9,8. Finalmente se detuvo la reacción con NaOH 3M. La absorbancia del
producto de la reacción enzimática se midió, después de 30 minutos de incubación a 37C en la
44
Materiales y Métodos
oscuridad, en un lector de ELISA (Organon Teknica) a 405 nm. El volumen de la reacción fue
siempre 50μL. Al final de cada hora de incubación se realizaron lavados con SSTF, Tween 20
(0,05%) [v:v]. Como control negativo (ctrol-) se utilizó una mezcla a partes iguales de sueros de
10 donantes sanos y como control positivo (ctrol+) se utilizó una mezcla a partes iguales de
sueros de 10 pacientes inmunizados con alto título de anticuerpos anti EGF. Se definió el título
de anticuerpos contra el EGF como la máxima dilución sérica que produjo valores de
absorbancia mayores que el doble de la sumatoria de la media del blanco más tres desviaciones
estándar (DS).
Valor de corte= [2(media del blanco +3DS)].
Para la determinación de la respuesta específica contra el TGF, se empleó el mismo método
ELISA pero recubriendo la placa de microtitulación con 50 ng/mL de TGF en solución tampón
de recubrimiento.
3.3.1.1 Criterios de clasificación de los pacientes, relativos a la magnitud de la
respuesta inmune humoral específica desarrollada con la vacunación.
Para evaluar la inmunogenicidad del preparado vacunal se establecieron diferentes criterios de
respuesta. Se consideraron respondedores (seroconversión) aquellos pacientes que, producto de
la vacunación, al menos duplicaron sus niveles originales de títulos de anticuerpos anti-EGF.
Adicionalmente los pacientes se clasificaron como:
Buenos Respondedores (BR), si alcanzaron títulos de anticuerpos anti-EGF mayores o iguales
que 1:4000 (dilución del suero) y al menos 4 veces superiores al valor del título medido previo a
la primera inmunización.
Malos Respondedores (MR), si no cumplieron la condición de buenos respondedores.
Súper respondedores (SBR), si alcanzaron títulos de anticuerpos igual o mayores que 1:64000
(dilución del suero).
3.3.2
Estimación de la concentración de EGF y TGF en suero.
La concentración de EGF en suero se midió a través de un sistema ELISA comercial
(Quantikine, R&D Canadá). En el ensayo se utilizó un sistema cuantitativo inmunoenzimático
45
Materiales y Métodos
donde se utilizó una microplaca pre-recubierta con un anticuerpo monoclonal anti EGF. Después
se añade la curva de concentraciones conocidas de EGF y los sueros de los pacientes diluidas
1:20 en el diluente del ensayo. Se lavó y se añadió un anticuerpo específico por el EGF
conjugado a peroxidasa de rábano picante. Se volvió a lavar y se visualizó la reacción enzimática
con la adición de una solución que contiene el sustrato (tetratmetilbencidina). Se detiene la
reacción con una solución de acido sulfúrico 2N y se leyó la absorbancia a 450nm.
Se consideró que hubo reducción de las concentraciones de EGF cuando los valores fueron
menores de 168 pg/mL. Este valor de corte se estableció arbitrariamente (por ser la mitad del
valor de la media en sujetos sanos) para clasificar a los pacientes según la extensión de la
reducción del EGF en el suero. Para el análisis de la influencia de las concentraciones de EGF
existentes en el suero pre-inmune sobre la respuesta al tratamiento con el esquema VQV, se
calculó un valor de corte (1194 pg/mL). Este valor se calculó a partir de los valores de
concentración de la línea base y la supervivencia a los 12 meses de cada uno de los pacientes,
utilizando una curva ROC (del Inglés: Receiver-Operator Characteristic).
En el caso del TGFα igualmente se utilizó un juego de reactivos comerciales (Quantikine, R&D
Canadá) para determinar por ELISA (similar al anterior pero con anticuerpos específicos por el
TGFα) las concentraciones de este ligando en el suero.
El valor de corte utilizado (12,5 pg/mL) se estableció de la misma manera descrita para el EGF
pero esta vez utilizando los valores de TGF obtenidos en el suero inmune de los pacientes del
QVV que se evaluaron.
3.3.3
Determinación del epítopo inmunodominante del EGF.
Se evaluó la respuesta de Anticuerpos contra diferentes epítopos de la molécula de EGF en
sueros pre-inmunes e inmunes de los pacientes seleccionados. Se utilizó un método de ELISA,
similar al descrito en el acápite anterior. Esta vez las placas de ELISA se recubrieron con
péptidos (Anexo VI) que representan zonas diferentes en la molécula de EGF: N-terminal (1 a
14), lazo A (7-21), lazo B (15 a 33) y lazo C (34 a 46), lazo C-C-terminal (34-54) y C-terminal
(44-54) sintetizados como se informó previamente (González y cols. 2002). Se utilizó una
dilución 1:100 de cada uno de los sueros ensayados. El resto del ensayo siguió los mismos pasos
del ensayo ELISA descrito anteriormente (acápite 3.2.5.1) para la determinación de títulos de
Anticuerpos anti-EGF. Los valores de densidad óptica obtenidos para el control negativo contra
46
Materiales y Métodos
cada uno de los péptidos, fueron sustraídos a los obtenidos por los pacientes contra cada péptido
y se consideró positivo el valor de densidad óptica (D.O) resultante de esta sustracción en cada
caso.
3.3.4
Determinación de la inhibición de la unión del EGF a su receptor.
Las células A431 (2.0 X 105) se incubaron con las muestras de sueros diluidos 1:100 en DMEM,
albúmina de suero bovino (BSA, del inglés, “bovine serum albumin”) (Sigma) 0.1% y HEPES
0.4% (pH 7,2) por 30 minutos a 37ºC. Posteriormente las células fueron incubadas con EGF
humano marcado con la sal de sodio del isótopo
125
I (EGFh-125I) con una actividad de 105
conteos por min (cpm) durante una hora a temperatura ambiente (25ºC). Luego de detener la
reacción con la adición de 1mL de SSTF frío, las células se sedimentaron por centrifugación a
90 g durante 10 min. El sobrenadante se decantó y se lavó tres veces con SSTF. Una vez que las
células sedimentadas se dejaron secar, el ligando marcado unido al receptor se midió en un
contador automático de radiaciones gamma 1470 Wizard (Wallac, Finlandia). La inhibición de la
unión con un exceso de EGF (entre 1-10µg/mL) no radioactivo y un anticuerpo anti-EGF 1
(CIGB, Sancti Spíritus) en una concentración 20 µg/mL fueron usados como control positivo del
ensayo. Los valores obtenidos para los sueros pre-inmunes se utilizaron como control de
inhibición inespecífica. La unión total se midió incubando las células solamente con
125
I-EGF y
se consideró el 100% de unión al REGF. El porcentaje de inhibición de la unión de los ligandos
fue calculado como:
% inhibición= 100-[cpm tratamientos inmunesmedia X 100/ cpm células sin tratamientomedia ]
El valor de corte para declarar inhibición, se determinó promediando los valores de porcentajes
obtenidos en los sueros pre-inmunes y sumándole el doble de la DS. Se consideró inhibición
positiva si el porciento de inhibición fue superior al valor de corte.
Valor de corte= % de inhibiciónmedia+ 2DS
3.3.5
Determinación de la fosforilación del REG. Western Blot.
Para la determinación de los niveles de fosforilación del REGF las células A431 (105) se
cultivaron en placas de cultivo de 24 pozos (Costar, EEUU) en medio DMEM-F12 en ausencia
de SFT, a 37C en atmósfera de CO2 5 %, durante 24 horas. Posteriormente se le añadieron los
sueros (diluidos 1:100) provenientes de pacientes y se incubaron durante 1 hora a 37C. Las
diluciones de los sueros se hicieron en medio DMEM. El tyrphostin (AG 1478, es un inhibidor
47
Materiales y Métodos
tirosina cinasa) en una concentración de 1mol/L se empleó como control de inhibición de la
fosforilación. La estimulación con EGF se realizó con 100 ng/mL por 10 min a 37C.
Las células provenientes de los tratamientos antes descritos se homogenizaron con un tampón de
lisis que contenía: HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, Triton X-100 1%, NaF 50 mM,
Na3VO4 1 mM, EDTA 1 mM y fluoruro de fenilmetil sulfonilo 1 mM (Sigma, EEUU). La mezcla
se incubó durante 30 min en hielo. Seguidamente se realizó una centrifugación durante 10 min a
10 000 g a 4C, y se separó el sobrenadante que contenía las proteínas totales aisladas. La
concentración de proteínas se determinó mediante la técnica colorimétrica basada en el método
del ácido bicinconílico (Smith y cols. 1985), utilizando un juego de reactivos comerciales
(Pierce, EEUU). Se aplicaron en geles de poliacrilamida con duodecil-sulfato de sodio (SDS) al
1% [v:v] (SDS-PAGE) al 7,5% cantidades iguales de proteínas de los lisados celulares.
Posteriormente las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (del inglés,
“polyvinylidine difluoride”), según describen Towbin y colaboradores (Towbin y cols. 1979).
Las membranas se bloquearon con tampón NEGT (NaCl 0,15 M, EDTA 5 mM, Tris-HCl 500
mM, Tween 20 0,02%, Gelatina 0,04%) a pH 7,5. Se incubaron durante 1h a temperatura
ambiente (TA) con los Anticuerpos correspondientes, diluidos en tampón NEGT: el AcM 1005:
sc-03 para el reconocimiento del REGF y el AcM PY20: sc-508, para el reconocimiento del
REGF fosforilado. Los lavados se realizaron con tampón NEGT, tres veces durante 10 min.
Luego se añadieron anti-inmunoglobulinas totales de conejo y de ratón, ambos conjugados a
peroxidasa de rábano picante (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., EEUU), diluido según
las recomendaciones del fabricante en el tampón NEGT, por 1 h a TA en agitación. Después de
lavarse las membranas como se describió anteriormente, la señal se visualizó usando el sistema
ECLplus (del inglés, “enhanced chemiluminescence”), siguiendo las instrucciones del fabricante
(Amersham Biosciences, Reino Unido).
El análisis cuantitativo de las señales obtenidas se realizó por densitometría, utilizando el
programa ImageMaster 1D prime.
Se consideró inhibición de la fosforilación si los valores de los porcentajes de inhibición fueron
mayores que el valor de corte que resulta de la media de los porcentajes de inhibición alcanzados
por lo sueros de los pacientes no vacunados mas el doble de la desviación estándar (DS) de los
48
Materiales y Métodos
mismos. Como fosforilación máxima se tomó el valor obtenido en el tiempo cero para cada uno
de los pacientes.
3.3.6
Métodos Estadísticos.
Las características demográficas de los pacientes, las características de la enfermedad y los datos
de seguridad fueron analizados usando métodos descriptivos como Chi cuadrado y t de student
para muestras independientes.
Todos los análisis fueron realizados usando el programa estadístico SPSS para Windows,
Versión 11.5.1 (en Español) y el Graph Pad Prism la versión 4.0 de. En todas las variables se
evaluó la normalidad mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las concentraciones de los
ligandos y los títulos de anticuerpos no mostraron normalidad.
Las comparaciones entre las medias de los rangos de los títulos de anticuerpos fueron realizadas
utilizando la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon cuando la comparación fue entre dos
muestras relacionadas o a través de la prueba de la U de Mann-Whitney cuando la comparación
se realizó entre dos muestras no relacionadas.
En el resto de las variables, los datos mostraron una distribución normal y se realizó un análisis
de varianza de clasificación simple (ANOVA, del inglés, “Analysis of Variance”) y la prueba de
Tukey para las comparaciones entre los grupos. Las diferencias se consideraron significativas
cuando p<0,05.
Las estimaciones de los tiempos de supervivencia se realizaron a través del procedimiento de
Kaplan-Meier y fueron comparadas usando la prueba no paramétrica de Log-rank. La correlación
entre las variables fue estimada por el coeficiente de correlación de Pearson o de Spearman en
cada grupo estudiado.
Para calcular valores de cortes de determinadas variables se empleó la curva de ROC (del inglés:
Receiver Operator Characteristic).
49
Resultados
4.
RESULTADOS
4.1
Evaluación de la respuesta de anticuerpos generada tras la vacunación con
CIMAvax-EGF.
La respuesta inmune humoral inducida por la inmunización con la vacuna CIMAvax-EGF se
evaluó en los dos esquemas de tratamiento en ensayo (QVV y VQV). De manera general, se
observó la existencia de títulos de anticuerpos anti-EGF antes de inmunizar con la vacuna
CIMAvax-EGF en el 100% de los pacientes evaluados, con valores iguales o superiores a 1:500
en el 32 % de los mismos. Durante el primer mes de tratamiento se observó un incremento en los
títulos de los anticuerpos específicos generados en ambos con ambos esquemas de tratamiento.
Las particularidades de la respuesta inmune generada en cada ensayo se describen a
continuación.
4.1.1
Inmunidad humoral inducida por la vacuna CIMAvax-EGF en el ensayo QVV.
En este ensayo la vacunación fue administrada después de la quimioterapia. La evaluación de la
inmunogenicidad se realizó mediante la determinación de la respuesta específica de anticuerpos
anti-EGF en 42 pacientes (26 del grupo vacunado y 16 del grupo control).
Como se indicó anteriormente, en todos los pacientes se encontró un determinado nivel de título
de anticuerpos antes de la inmunización. De ellos, en el 31 % (n = 13) de los pacientes
evaluados (9 en el grupo vacunado y 4 en el grupo control) el título de anticuerpos totales
específicos por el EGF mostró valores superiores a 1:100 (entre 1:500 y 1:2000). La media
geométrica del inverso del título de anticuerpos específicos contra el EGF (anti-EGF) observado
previo a la inmunización fue 244 para el grupo vacunado y 158 para el grupo control, y esta
diferencia no fue estadísticamente significativa (prueba U de Mann Whitney ; p>0.05).
Como resultado de la inmunización, los títulos de anticuerpo aumentaron. En el caso del grupo
vacunado, a partir del primer mes de tratamiento se observó un incremento significativo del
título de anticuerpos totales específicos con respecto a los valores detectados antes del inicio de
la inmunización (Figura 1), según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon (p<0,05). La
diferencia en el título de anticuerpos específicos se mantuvo durante todo el tiempo de
evaluación de la respuesta, y se alcanzaron valores máximos de hasta 1:128000 en pacientes
50
Resultados
tratados por más de un año. Más del 70 % de los pacientes vacunados (n = 19) se clasificaron
como buenos respondedores (BR), teniendo en cuenta la magnitud del título de anticuerpos antiEGF (≥ 1:4000) y la seroconversión lograda. Ninguno de los pacientes del grupo control
cumplió con este criterio. La diferencia en los títulos de anticuerpos detectados después de la
inmunización, entre el grupo vacunado y el grupo control fue estadísticamente significativa,
según la prueba de la U de Mann Whitney (p<0.01).
Inverso del título de Acs
(media geométrica)
100000
vacunados
**
control
10000
1000
100
10
0
30
60
90 120 150 180 210 240
Tiempo (días)
Figura 1. Respuesta inmune humoral anti-EGF en pacientes con CPCNP incluidos en el ensayo
QVV. Los pacientes tratados con la vacuna recibieron (1 mes post-quimioterapia) inmunizaciones
semanales con 50 µg de EGF durante el primer mes de tratamiento y luego mensualmente durante la fase
de mantenimiento. Los pacientes del grupo control recibieron solo tratamiento paliativo después de la
quimioterapia. Se realizaron extracciones de sangre los días 0, 14, 28 y mensualmente durante el tiempo
de seguimiento de cada paciente. Los títulos de anticuerpos anti-EGF en el suero se midieron por ELISA.
Las placas se recubrieron con EGF humano recombinante y la reactividad de los sueros se detectó con un
antisuero de chivo anti-Igs humanas totales conjugado a fosfatasa alcalina. Se representa en escala
logarítmica la media geométrica y el intervalo de confianza 95% (IC 95%) de los títulos de anticuerpos
anti-EGF ensayados, en pacientes vacunados (n=26) y controles (n=16) en los diferentes tiempos. Los
asteriscos (**) indican las diferencias significativas entre ambos grupos, según la prueba U de Mann
Whitney, p0,01. La flecha señala el tiempo en que comienza el incremento significativo de los títulos
contra el EGF en el grupo vacunado con respecto al día cero, según la prueba de los rangos con signo de
Wilcoxon, p< 0,05.
La inmunización con la vacuna CIMAvax-EGF pudiera inducir una reactividad cruzada contra
el factor de crecimiento transformante (TGFα) humano, que es otra de las moléculas
perteneciente a la familia de ligandos del REGF. Esta posibilidad, se evaluó tanto en el suero
pre-inmune (día 0) como en el post-inmune (PI: entre 3 y 6 meses de tratamiento) de los
pacientes vacunados. Igualmente se determinó la existencia de anticuerpos anti-TGFα antes de
inmunizar.
51
Resultados
Al igual que para el EGF, se detectó la presencia de anticuerpos naturales específicos contra el
TGFα (media geométrica del inverso del título, 202) con títulos de anticuerpos entre 1:500 y
1:2000 en el 35 % de los pacientes evaluados.
La inmunización con EGF, que incrementó los títulos de anticuerpos contra este ligando no
indujo respuesta contra el TGFα. Después de la inmunización, los títulos de anticuerpos antiEGF (media geométrica del inverso del título, 8724) fueron significativamente mayores que los
títulos anti-TGFα (media geométrica del inverso del título, 208), según la prueba U de Mann
Whitney (p<0,0001). No se encontraron diferencias significativas entre los niveles de respuesta
contra el TGFα obtenidos antes de la vacunación y los medidos en la fase post-inmunización
(Figura 2).
Como resultado de estas evaluaciones podemos resumir que, utilizando el esquema de
tratamiento QVV, se incrementó la respuesta inmune humoral específica contra el EGF. Este
incremento se tradujo en que el 70 % de los pacientes desarrolló una buena respuesta de
anticuerpos anti-EGF. Asimismo, la inmunización con EGF no produjo un incremento de la
respuesta contra el TGFα.
Inverso del título de Acs
(media geométrica)
100000
***
***
10000
1000
100
10
Día 0
PI
Día 0
PI
TGF
EGF
Figura 2. Respuesta inmune humoral anti-TGFα y anti-EGF en pacientes con CPCNP incluidos en
el ensayo QVV. Los pacientes se trataron y evaluaron, según lo descrito en la Figura 1.Se representa en
escala logarítmica la media geométrica y el IC 95% del título de anticuerpos contra cada ligando del
REGF, en sueros pre-inmunes y post-inmunes (con 3 o hasta 6 meses de vacunación) de pacientes
tratados con CIMAvax-EGF. Los asteriscos (***) indican las diferencias significativas entre los grupos,
según la prueba de la U de Mann Whitney con p0,0001 para la comparación entre los tiempos postinmune (PI) y según la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon, para las comparaciones entre el Día
0 y el Post-I en cada caso.
52
Resultados
4.1.2
Inmunidad humoral inducida por la vacuna CIMAvax-EGF en el ensayo VQV.
En este segundo esquema de tratamiento los pacientes recibieron cuatro veces la dosis del
esquema anterior y además se administraron las primeras dos inmunizaciones antes de la
quimioterapia. Las dosis fueron distribuidas en cuatro sitios de inyección y se administraron con
intervalos de cada 14 días previo a la quimioterapia y mensualmente, posterior a la
quimioterapia.
En los 20 pacientes de este ensayo, en términos de respuesta natural de anticuerpos anti-EGF, se
obtuvieron resultados muy similares a los encontrados en el ensayo anterior. La media
geométrica del inverso de los títulos fue 242.
A partir de la segunda semana de tratamiento ocurrió un incremento significativo en la media
del inverso del título de anticuerpos totales específicos con respecto a los valores detectados
antes del inicio de la inmunización (Figura 3), según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon,
p<0,01. Esta diferencia se mantuvo durante todo el tiempo de evaluación de la respuesta, y se
alcanzaron valores máximos de títulos entre 1:128000 y 1:1024000 en varios pacientes (n=6) con
menos de un año de tratamiento.
Una de las observaciones más interesantes en este esquema de tratamiento fue el hecho de que
durante el período de quimioterapia no disminuyeron significativamente los títulos de
anticuerpos anti-EGF (p>0,05; prueba de Kruskal Wallis), a pesar de no estar recibiendo la
vacunación (Figura 3). Después de concluida la quimioterapia y previo al restablecimiento de las
inmunizaciones mensuales, la media geométrica del inverso de los títulos de anticuerpos
específicos contra el EGF fue 10642.
53
Resultados
QT
Inverso del título de Acs
(media geométrica)
100000
VQV
QVV
control QVV
10000
1000
100
0
30
60
90 120 150 180 210 240 270
Tiempo (días)
Figura 3. Respuesta inmune humoral anti-EGF medida en sueros de pacientes con CPCNP
incluidos en los ensayos QVV y VQV. Los pacientes tratados según el esquema VQV, recibieron
inmunizaciones cada 14 días, con 200 µg de EGF (distribuidos en 4 sitios de inyección diferentes) durante
el primer mes, luego recibieron los ciclos de quimioterapia correspondientes (4 ciclos, 1 cada 21 días) y
29 días después de finalizada la quimioterapia se retomaron las inmunizaciones pero esta vez,
mensualmente. Se realizaron extracciones de sangre los días 0, 14, 28 y mensualmente durante el tiempo
de seguimiento de cada paciente, y se midieron los títulos de anticuerpos anti-EGF en el suero por
ELISA. Las placas se recubrieron con EGF humano recombinante y la reactividad de los sueros se detectó
con un antisuero de chivo anti-Igs humanas totales conjugado a fosfatasa alcalina. El esquema de
tratamiento QVV fue descrito en la figura 1. Se representa en escala logarítmica la media geométrica y el
IC 95%, de los títulos de anticuerpos anti-EGF ensayados en pacientes vacunados (n=26) y controles
(n=16) incluidos en el estudio del esquema QVV y los vacunados según el esquema VQV (n=20) en los
diferentes tiempos. La flecha señala el tiempo en que comienzan el incremento significativo de los títulos
de anticuerpos anti-EGF con el esquema VQV, según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon,
p<0,01.
Aplicando el esquema de tratamiento VQV, donde se introdujeron múltiples cambios con
relación al esquema QVV: cambios en la dosis, la frecuencia de vacunación en la fase de
inducción, cuatro sitios de administración y combinación con la quimioterapia, el 95 % de los
pacientes se clasificaron como buenos respondedores (BR). Esta clasificación se alcanzó en el 80
% de los pacientes con solo un mes de tratamiento (Figura 4), mientras que utilizando el
esquema QVV se requiere de dos meses para lograr esta clasificación en el mismo porcentaje de
pacientes. Cuando aplicamos un criterio de clasificación de la magnitud de la respuesta de
anticuerpos más riguroso (títulos de anticuerpos iguales o mayores a 1:64000), el 55 % de los
pacientes tratados con el presente esquema se clasificaron como súper- respondedores (SBR),
mientras que con el esquema anterior solamente el 15.3% de los pacientes se ajustó a esta
clasificación.
54
Resultados
Estos resultados indican que el esquema de tratamiento se puede optimizar con vistas a lograr
respuestas de Anticuerpos de mayor magnitud, en un mayor número de pacientes y en menos
tiempo de tratamiento. Igualmente, los resultados obtenidos demuestran que cuando se vacuna
previo a la quimioterapia, los títulos anti-EGF no disminuyen notablemente durante este período.
Adicionalmente, es importante destacar que el incremento en la inmunogenicidad logrado
cuando se emplea el esquema de tratamiento VQV, no se asocia con un incremento en la
toxicidad (datos no mostrados).
100
VQV
QVV
% de BR
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
Tiempo (meses)
Figura 4. Porcentajes de pacientes buenos respondedores (BR) en los cuatro primeros meses de
inmunización con la vacuna CIMAvax-EGF en ambos esquemas de tratamiento, VQV y QVV. Se
cálculo, mensualmente, el porcentaje de pacientes que ha logrado la clasificación de BR durante los 4
primeros meses de tratamiento, para ambos esquemas de tratamiento. BR: si alcanzaron títulos de
anticuerpos mayores o iguales que 1:4000 (dilución del suero) y al menos cuatro veces superiores al valor
del título medido previo a la primera inmunización.
4.2
Relación entre las características de la respuesta inmune generada por la
inmunización y los títulos de anticuerpos naturales (pre-inmunización) en
ambos esquemas de tratamiento.
Los títulos de anticuerpos anti-EGF medidos antes de la vacunación reflejan la condición inicial
de la respuesta natural en los pacientes. Para evaluar si esta condición predice lo que sucede
después de la vacunación, se estudió la relación entre los títulos pre-inmune y el título máximo
que se alcanza después de la vacunación.
55
Resultados
En los pacientes del esquema QVV no se encontró correlación. Los pacientes con títulos de
anticuerpos naturales menores que 1:500 y aquellos con títulos de anticuerpos mayores que
1:500 no mostraron diferencias en cuanto a la respuesta inmunológica desarrollada después de la
vacunación. En estos pacientes el tiempo cero es antes de vacunar pero después de la
quimioterapia. Para los pacientes del esquema VQV, en los cuales esta medición se realiza antes
del inicio de la quimioterapia, se encontró una relación inversa (Spearman, p<0,05) entre los
títulos naturales anti-EGF y la respuesta de anticuerpos anti-EGF generada con la vacunación.
En los pacientes con títulos de Anticuerpos anti-EGF pre-inmunes menores que 1:500, se
desarrollaron altos niveles de títulos de Anticuerpos anti-EGF cuando se empleó el esquema de
tratamiento VQV (Figura 5). No obstante, teniendo en cuenta que este análisis se basa en 20
pacientes, esta conclusión debe ser tomada como preliminar.
250000
100
200000
80
150000
60
100000
40
50000
20
0
Pacientes SBR (%)
pacientes SBR (%)
Inverso de títulos máximos
(media geométrica)
Título anti-EGF(día 0)
0
< 1:500
>=1:500
Figura 5. Relación entre la respuesta natural de anticuerpos anti-EGF y la magnitud de la
respuesta de anticuerpos anti-EGF desarrollada por la vacunación con CIMAvax-EGF en el ensayo
VQV. Los pacientes tratados según el esquema VQV, recibieron inmunizaciones cada 14 días, con 200
µg de EGF (distribuidos en 4 sitios de inyección diferentes) durante el primer mes, luego recibieron los
ciclos de quimioterapia correspondientes (entre 4 y 6 ciclos, 1 cada 21 días) y 29 días después de
finalizada la quimioterapia se retomaron las inmunizaciones pero esta vez, mensualmente. Se realizaron
extracciones de sangre los días 0, 14, 28 y mensualmente, durante el tiempo de seguimiento de cada
paciente, y se midieron por ELISA los títulos de anticuerpos anti-EGF en el suero. La ordenada de la
izquierda representa la media geométrica del inverso de los títulos máximos de anticuerpos anti-EGF
desarrollados con la vacunación (barras negras). La ordenada de la derecha representa el porcentaje de
pacientes SBR para cada uno de los subgrupos estudiados (barras grises). SBR: Súper-respondedores, si
alcanzaron títulos de anticuerpos igual o mayores que 1:64000 (dilución del suero).
56
Resultados
4.3
Evaluación de las concentraciones de EGF en el suero de los pacientes
incluidos en los ensayos QVV y VQV.
Una vez evaluada la respuesta inmune humoral específica inducida por la vacunación en ambos
esquemas de tratamiento, el próximo paso en nuestro trabajo consistió en demostrar que era
posible reducir las concentraciones de EGF circulante en el suero de los pacientes inmunizados
con la vacuna CIMAvax-EGF. De manera general, se observó que la vacunación provoca una
reducción de las concentraciones de EGF en el suero de pacientes con CPCNP.
En los acápites siguientes se describen las cinéticas de reducción del EGF sérico y la relación
con la respuesta de Anticuerpos anti-EGF obtenidas con cada esquema de tratamiento empleado.
4.3.1
Concentraciones de EGF y TGFα en sueros no inmunes e inmunes de pacientes
tratados con el esquema QVV.
Las concentraciones de EGF en suero se evaluaron en 26 pacientes vacunados y en 16 pacientes
del grupo control. Previo al tratamiento, en el 70 % de los pacientes se detectaron niveles de
EGF humano por encima de la media de los valores informados para personas sanas (336
pg/mL). Los valores obtenidos oscilaron entre 124,3 y más de 5000 pg/mL (límite superior de
detección del juego de reactivos utilizado), para una media de 1663,79 pg/mL.
En el 65 % (n=17) de los pacientes vacunados se redujo la concentración de EGF sérico al menos
hasta 168 pg/mL. Esta reducción ocurrió gradualmente en el tiempo y correlacionó con los
títulos máximos alcanzado por cada paciente; los pacientes que redujeron sus niveles de EGF
hasta valores menores o iguales que 168g/mL fueron los que alcanzaron altos niveles de títulos
anti-EGF (Figura 6).
57
Resultados
Inverso del título máximo de Acs anti- EGF
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
N=
9
17
No reducen
Reducen
EGF ( pg/mL)
Figura 6. Reducción de los niveles del EGF en el suero de pacientes con CPCNP tratados según el
esquema QVV. Los pacientes tratados con la vacuna recibieron (1 mes post-quimioterapia)
inmunizaciones semanales con 50 µg de EGF durante el primer mes de tratamiento y luego mensualmente
durante la fase de mantenimiento. Se realizaron extracciones de sangre los días 0, 14, 28 y mensualmente
durante el tiempo de seguimiento de cada paciente. La concentración de EGF en los sueros se estimó por
ELISA, utilizando un juego de reactivos comerciales. Se agruparon los pacientes según la reducción o no
de las concentraciones de EGF a valores iguales o inferiores a 168 pg/mL, durante todo el período de
seguimiento. La ordenada representa la mediana del inverso de los títulos de Anticuerpos anti-EGF (línea
oscura), los percentiles 25 y 75 (caja) y los percentiles 5 y 95 (barras de error) en ambos grupos.
Cuando se estudió la relación entre las concentraciones de EGF y los títulos de anticuerpos antiEGF, se encontró una correlación inversa, a partir del segundo mes de tratamiento (Figura 7a).
Esta correlación fue estadísticamente significativa según el coeficiente de correlación de
Spearman (p<0,05). En el caso del grupo control, no se encontró ninguna relación entre el título
de anticuerpos anti-EGF y las concentraciones de EGF en suero (Figura 7b). De hecho, en este
grupo a partir del cuarto mes de tratamiento se observaron valores de EGF significativamente
superiores a los del grupo vacunado, según la prueba U de Mann-Whitney (p0,05).
58
Resultados
a)
b)
Acs anti-EGF
EGF en suero
3000
1000
2000
1000
100
0
10
0
30
60
90
120
Tiempo (días)
4000
10000
3000
1000
2000
100
10
150
5000
EGF (pg/ml)
4000
10000
Inverso del título de Acs
(media geométrica)
100000
5000
EGF (pg/ml)
Inverso del título de Acs
(media geométrica)
100000
1000
0
30
60
90
120
150
0
Tiempo (días)
Figura 7. Relación entre los niveles de EGF y los títulos de Anticuerpos anti-EGF en suero de
pacientes con CPCNP incluidos en el ensayo QVV. Los pacientes tratados con la vacuna recibieron (1
mes post-quimioterapia) inmunizaciones semanales con 50 µg de EGF durante el primer mes de
tratamiento y luego mensualmente durante la fase de mantenimiento. Los pacientes del grupo control
recibieron solo tratamiento paliativo después de la quimioterapia. Se realizaron extracciones de sangre los
días 0, 14, 28 y mensualmente durante el tiempo de seguimiento de cada paciente. Los títulos de
anticuerpos anti-EGF en el suero se midieron por ELISA. Las placas se recubrieron con EGF humano
recombinante y la reactividad de los sueros se detectó con un antisuero de chivo anti-Igs humanas totales
conjugado a fosfatasa alcalina. Se representa el título de anticuerpos anti-EGF generado y su relación con
la concentración de EGF en suero de pacientes inmunizados (a) y pacientes del grupo control (b). La
relación se evaluó según la correlación de Spearman (p<0,05). La flecha señala el tiempo en el que
aparece la correlación inversa entre la respuesta de anticuerpos y la concentración de EGF. Las ordenadas
de la izquierda representan en escala logarítmica la media geométrica y el IC 95 % del inverso de los
títulos de anticuerpos (■) y las ordenadas de la derecha muestran las medias y el IC 95 % de las
concentraciones de EGF (▲).
A diferencia del EGF, el cual se redujo post-inmunización en la mayoría de los pacientes
vacunados (Wilcoxon, p<0.05, Figura 8a), las concentraciones de factor de crecimiento
transformante (TGFα) no disminuyeron como consecuencia de la vacunación. Se evaluaron las
concentraciones de TGFα en el suero de 13 pacientes del grupo vacunado y cinco del grupo
control. En el grupo de pacientes vacunados la media de las concentraciones detectadas fue 8,48
pg/mL previo a la vacunación y 17,9 pg/mL posterior a la misma (Figura 8b). Estos resultados
denotan un incremento en las concentraciones de TGFα, que resultó significativo según la prueba
t de student (p<0,05). Esta tendencia al incremento en las concentraciones de TGFα en el grupo
vacunado no fue observada en el grupo control, pero la cantidad de pacientes evaluados fue
pequeña y se requerirán más datos para poder verificar e interpretar este fenómeno.
Con los datos obtenidos hasta el momento, podemos decir que utilizando el esquema de
tratamiento QVV, disminuyeron las concentraciones de EGF en el grupo de pacientes
vacunados; sin embargo, los valores de concentración de TGFα aumentaron (Figuras 8a y 8b).
59
Resultados
a)
b)
***
5000
50
TGF (pg/mL)
EGF (pg/mL)
4000
3000
2000
1000
0
Día 0
Post-inmune
*
40
30
20
10
0
Día 0
Post-inmune
Figura 8. Efecto de la vacunación con EGF sobre la concentración de ligandos del REGF en el
suero de pacientes de CPCNP tratados según el esquema QVV. La concentración de cada ligando se
midió en los sueros pre-inmunes y post-inmunes (con 3 o hasta 6 meses de vacunación) de pacientes
tratados con CIMAvax-EGF, utilizando juegos de reactivos comerciales que incluyen una microplaca prerecubierta con un anticuerpo monoclonal anti-ligando. La concentración de los ligandos en los sueros se
detectó por ELISA, con un anticuerpo específico por el ligando en cuestión conjugado a peroxidasa de
rábano picante. a) Efecto sobre la concentración de EGF. b) Efecto sobre la concentración de TGFα. Se
muestra la media y la desviación estándar (DS) de la media de los valores de las concentraciones de EGF
y TGFα medidas en los sueros pre-inmune y post-inmune de los pacientes vacunados.
4.3.2
Concentraciones de EGF en los sueros de pacientes tratados en el esquema VQV.
En el esquema optimizado VQV se observaron reducciones mayores y más rápidas de la
concentración de EGF. Con el objetivo de evaluar la cinética de la reducción de las
concentraciones de EGF y compararla con el ensayo anterior (QVV), se determinó la
concentración de EGF en los sueros inmunes y no inmunes de los 20 pacientes incluidos en este
ensayo.
La media de las concentraciones de EGF antes de la inmunización fue superior a la del ensayo
precedente (QVV). Sin embargo, esta diferencia no alcanzó la significación estadística. Esto
sugiere que, el tratamiento con quimioterapia previo a la vacunación no ejerce un efecto marcado
sobre las concentraciones del EGF.
En el esquema VQV, la reducción significativa de las concentraciones de EGF se alcanzó a partir
del primer mes de tratamiento (Figura 9a). La media de los valores de concentración una vez
administradas las dos primeras inmunizaciones previas a la quimioterapia, alcanzó un valor de
60
Resultados
1071,8 pg/mL, para un 56,7 % de reducción con relación a los valores al inicio del tratamiento
(2475,1 pg/ml), y esta reducción fue estadísticamente significativa según la prueba de los rangos
con signo de Wilcoxon (p< 0,01).
a)
b)
**
5000
4000
VQV
EGF (pg/mL)
EGF (pg/ml)
4000
QT
3000
2000
1000
0
0
18
32
60
90
120
2000
1000
0
150
Tiempo (días)
QVV
3000
*
0
30
60
90
120
150
Tiempo (días)
Figura 9. Niveles del EGF en el suero de pacientes con CPCNP vacunados con CIMAvax-EGF. a)
En pacientes tratados con el esquema VQV. Se representa la media y la DS, de las concentraciones de
EGF ensayadas en los diferentes tiempos hasta el momento en que se restablecen las inmunizaciones
después de terminada la quimioterapia. Los asteriscos (**) indican significación estadística según la
prueba de los rangos con signo de Wilcoxon (p< 0,01). La flecha señala el momento en que se reestablecen las inmunizaciones después de la quimioterapia. b) Se muestran las cinéticas de las
concentraciones de EGF para los tratamientos evaluados (VQV y QVV). Las flechas señalan los
momentos en que se logran reducciones de las concentraciones de EGF. El asterisco (*) indica
significación estadística según la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon (p< 0,05). Cada punto
representa la media y el error estándar (ES) de la media de las concentraciones de EGF de todos los
pacientes evaluables ensayados en ese tiempo.
Con el transcurso del tratamiento, en el 100 % de los pacientes tratados se observó una reducción
de los niveles de EGF hasta valores inferiores al límite mínimo de detección del ensayo
empleado. Un mes después de transcurrida la quimioterapia (150 días), momento en el que se
reinician las inmunizaciones, los niveles de EGF en el suero se redujeron a un 5 % (132 pg/ml)
de la concentración inicial. Esta dramática reducción también se observa en la figura 9b, donde
además se pueden apreciar las diferencias entre los dos esquemas utilizados con respecto al
tiempo en que se logra una reducción significativa de los niveles séricos de EGF. Los valores de
concentración de EGF séricos y los porcentajes de reducción logrados en el primer trimestre de
tratamiento transcurrieron de manera diferente en cada esquema de tratamiento (Tabla 1).
61
Resultados
Tabla 1. Reducción de las medias de las concentraciones de EGF
en el suero de los pacientes evaluados en ambos ensayos clínicos.
Concentraciones de EGF
a,
Esquema
VQV
(n=20)
QVV
(n=26)
Día 0
2475,1 pg/mL
1482,9 pg/mL
Mes 1
1071,8 pg/mL
p< 0.05a
1525,4 pg/mL
Mes 3
434,8 pg/mL
p< 0.05 a
1114,7 pg/mL
Diferencias significativas entre cada tiempo y el día cero: p< 0,05 según la prueba
de Wilcoxon..
Al igual que en el ensayo precedente, en el esquema VQV también se observó una relación
inversa entre la concentración de EGF y los títulos de anticuerpos medidos en el segundo mes de
inmunización. Posteriormente, la concentración de EGF se mantuvo tan baja para casi todos los
pacientes, que se perdió la correlación con el título de anticuerpos (Figura 10).
62
Resultados
Título anti-EGF
EGF en suero
4000
3000
10000
2000
1000
100
1000
0
30
60
90 120 150 180 210 240
Tiempo (días)
Concentración de EGF
(pg/mL)
Inverso del título Acs
(media geométrica)
100000
0
Figura 10. Relación entre la cinética de anticuerpos anti-EGF y la de la concentración de EGF en el
suero de pacientes tratados con el esquema VQV. Los pacientes tratados según el esquema VQV,
recibieron inmunizaciones cada 14 días, con 200 µg de EGF (distribuidos en 4 sitios de inyección
diferentes) durante el primer mes, luego recibieron los ciclos de quimioterapia correspondientes (4 ciclos,
1 cada 21 días) y 29 días después de finalizada la quimioterapia se retomaron las inmunizaciones pero
esta vez, mensualmente. Se realizaron extracciones de sangre los días 0, 14, 28 y mensualmente durante el
tiempo de seguimiento de cada paciente, y se midieron los títulos de anticuerpos anti-EGF en el suero por
ELISA. Las ordenadas de la izquierda representan, en escala logarítmica, el inverso de los títulos de
anticuerpos (●). Cada punto representa la media geométrica y el IC 95 %. Las ordenadas de la derecha
muestran las concentraciones de EGF en suero (▲). Cada punto representa la media y el IC 95 % de las
concentraciones de EGF de todos los pacientes evaluados en cada tiempo.
Otra observación interesante fue que en los pacientes del ensayo VQV hubo una correlación
directa (Spearman, p<0.05) entre el título de anticuerpos naturales y la concentración basal de
EGF sérico, antes de vacunar y antes de la quimioterapia (Figura 11). Esta correlación no se
encuentra en los pacientes del esquema QVV, donde las determinaciones de EGF en suero se
realizan siempre al menos un mes después de terminada la quimioterapia. De hecho, la
concentración de partida de EGF sérico en estos pacientes (en ese momento vírgenes de
tratamiento) fue mayor que la que se midió en los pacientes del esquema QVV, después de la
quimioterapia. Sin embargo, la concentración basal de EGF no se asoció con los niveles de
anticuerpos generados en respuesta a la vacunación en ninguno de los dos esquemas de
tratamiento ensayados.
63
Resultados
4000
Inve rso de títulos
Acs anti-EGF (día 0)
3500
3000
r2=0.3687
2500
2000
1500
1000
500
0
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
EGF(pg/mL)
Figura 11. Relación entre la respuesta natural anti-EGF y las concentraciones de EGF en sueros
pre-inmunes de pacientes de CPCNP previo a la quimioterapia. Se representa la regresión lineal del
gráfico de dispersión obtenido para la relación entre los niveles de EGF y el título pre-inmune en los
sueros de los pacientes incluidos en el ensayo VQV, correlación positiva y estadísticamente significativa
según el coeficiente de correlación Spearman (p<0.05).
Con los resultados obtenidos hasta el momento podemos decir que en el esquema VQV la
reducción de los niveles de EGF ocurrió en el 100 % de los casos evaluados, y esta reducción
fue mayor y ocurrió más rápido que cuando se empleó el esquema QVV.
4.4
Evaluación de epítopos inmunodominantes en la molécula de EGF.
4.4.1
Inmunodominancia del lazo B en pacientes tratados con el esquema QVV.
Para el estudio de la inmunodominancia se emplearon sueros de 13 pacientes vacunados con el
esquema QVV, previamente titulados al evaluar la respuesta específica contra el EGF y
clasificados como BR. Se evaluó la respuesta de anticuerpos en estos sueros contra seis péptidos,
previamente diseñados para representar regiones diferentes de la molécula del EGF (ver anexo
VI). Cuando se evaluó la respuesta natural específica contra cada uno de los péptidos se
comprobó que en la mayoría de los pacientes existían niveles de anticuerpos contra todos ellos
tal como se había descrito previamente (González y cols. 2002). Sin embargo, no existieron
diferencias significativas entre los niveles de respuestas naturales contra los diferentes péptidos
(análisis de varianza, ANOVA, p>0,05).
64
Resultados
Cuando se comparó la respuesta obtenida post-inmunización (en un período de entre 3 y 6 meses
de tratamiento) con la respuesta natural existente (Figura 12), se encontró un incremento
significativo en la respuesta contra el lazo B (región que comprende los aminoácidos 15 al 33).
Esta respuesta post-inmune contra el lazo B, fue significativamente mayor que las respuestas
post-inmunes halladas contra los péptidos correspondientes a las regiones N-terminal y C-Cterminal (prueba de comparaciones múltiples de Tukey, p<0,05).
Sin embargo, no en todos los pacientes evaluados se encontró una dominancia de la región
correspondiente al lazo B en la molécula del EGF. Solo en el 46 % (n=6) de los pacientes la
respuesta de anticuerpos anti-EGF se dirigió contra dicha región, la cual constituye la región
principal en la unión del EGF y su receptor. En dichos pacientes la absorbancia medida en el
ensayo de ELISA para la respuesta contra el lazo B, fue al menos dos veces la media de la
absorbancia de la respuesta obtenida contra cualquiera de los otros péptidos ensayados. En el
resto de los pacientes la respuesta se distribuyó contra todas las regiones de la molécula del EGF,
sin una dominancia de ninguna de ellas.
Pre-inmune (D0)
0.5
a
Post-inmune (PI)
D.O (405 nm)
0.4
c
0.3
0.2
c
D0
PI
N-terminal
D0
c
c
c
0.1
0.0
c
bc
PI
Lazo A
D0
PI
Lazo B
D0
bc
c
PI
Lazo C
D0
c
c
PI
C-C-terminal
D0
PI
C-terminal
Figura 12. Inmunodominancia de diferentes regiones de la molécula de EGF. La existencia de
anticuerpos contra diferentes regiones de la molécula de EGF, en los sueros de los pacientes de CPCNP
tratados con el esquema QVV (n=13) y clasificados como BR, se evaluó por la técnica ELISA, a una
dilución fija (1:100) del suero tomado previo a la vacunación (D0) y post-inmunización (PI: 3-6 meses de
tratamiento). Las placas se recubrieron con los péptidos correspondientes a las diferentes regiones de la
molécula EGF en evaluación y la reactividad de los sueros se detectó con un antisuero de chivo anti-Igs
humanas totales conjugado a fosfatasa alcalina. Cada barra representa la media de la densidad óptica del
grupo de pacientes evaluados en cada tiempo y su desviación estándar. Las letras indican las diferencias
encontradas entre todos los casos evaluados, según la prueba de comparaciones múltiples de Tukey,
(p<0,05).
65
Resultados
4.4.2
Inmunodominancia del lazo B en pacientes tratados con el esquema VQV.
Una vez demostrada la relevancia del péptido correspondiente al lazo B de la molécula del EGF
como inmunodominante cuando se usó el esquema de tratamiento QVV, se decidió estudiar si
ocurría algún cambio en la inmunodominancia de esta región de la molécula con el uso del nuevo
esquema de vacunación. Con este fin se seleccionaron los péptidos correspondientes a las
regiones del extremo N-terminal (aminoácidos del 1 al 14), la región central (lazo B) y la región
del lazo C-C-terminal (aminoácidos 34 al 54) de la molécula del EGF.
Se analizaron los sueros de 14 pacientes en cinco tiempos diferentes (días: 0, 32, 90, 240 y 330)
durante el primer año de tratamiento. Se evaluaron las cinéticas de las respuestas de anticuerpos
contra los péptidos que representan las tres regiones de la molécula del EGF escogidas para el
estudio (Figura 13). A partir de los ocho meses (240 días) de tratamiento, la respuesta observada
contra el lazo B de la molécula de EGF fue significativamente mayor que la respuesta generada
contra los otros dos péptidos estudiados (prueba de comparaciones múltiples de Tukey, p<0,01).
0.6
N-terminal
D.O (405nm)
0.5
Lazo B
C-C-terminal
0.4
a
0.3
0.2
a
b
0.1
b
0.0
0
30
60
90
120 150 180 210 240 270 300 330 360
Tiempo (días)
Figura 13. Curso temporal del reconocimiento de péptidos de la molécula EGF en el ensayo VQV.
Se evaluó por la técnica ELISA la existencia de anticuerpos totales contra diferentes regiones de la
molécula de EGF, en cuatro tiempos diferentes (días: 32, 90, 240 y 330) del tratamiento y en el suero preinmune, a una dilución fija (1:100). Las placas se recubrieron con los péptidos correspondientes a las
diferentes regiones de la molécula EGF en evaluación y la reactividad de los sueros se detectó con un
antisuero de chivo anti-Igs humanas totales conjugado a fosfatasa alcalina. Cada punto representa la
media y su ES obtenidos en cada tiempo para cada uno de los péptidos ensayados. La letras (a y b)
indican las diferencias significativas encontradas entre la respuesta contra el lazo B y la obtenida contra
las otras dos regiones ensayadas, en los dos últimos tiempos evaluados (post-quimioterapia), aplicando la
prueba de comparaciones múltiples de Tukey (p<0,05).
66
Resultados
Cuando se compararon las respuestas obtenidas contra el lazo B en los pacientes tratados en este
ensayo con los niveles de respuestas observados en el ensayo QVV contra la misma región de la
molécula EGF, y en los tiempos equivalentes al período de post-quimioterapia, no se constataron
diferencias significativas entre ambos grupos de pacientes para ninguno de los tiempos
ensayados. Sin embargo, con el esquema VQV en el período post-quimioterapia ensayado, la
respuesta de anticuerpos se desarrolló preferencialmente contra la región central de la molécula
EGF en un mayor número de pacientes (n=9, para un 64 %).
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, podemos decir que previo a la vacunación existe un
título bajo de anticuerpos naturales anti-EGF que reconocen por igual las diferentes regiones de
la molécula. Después de sucesivas inmunizaciones con el EGF, se genera una respuesta de
anticuerpos específica, que en nuestras condiciones de ensayo estuvo dirigida principalmente
contra el lazo B de la molécula de EGF en la mayoría de los pacientes evaluados.
4.5
Efecto de la respuesta de anticuerpos anti-EGF generada sobre la interacción
del EGF y su receptor.
La funcionalidad de la respuesta inmune humoral específica generada producto de la vacunación,
se evaluó a través de la capacidad de los anticuerpos inducidos para neutralizar la unión del EGF
a su receptor en un ensayo de competencia, y para inhibir la fosforilación del REGF.
4.5.1
Capacidad neutralizante de los anticuerpos inducidos por la vacunación con
CIMAvax-EGF.
4.5.1.1 Inhibición de la unión del EGF a su receptor por sueros inmunes de pacientes
vacunados con el esquema QVV.
Se realizó un ensayo de competencia con el objetivo de conocer si en los sueros inmunes
provenientes de pacientes inmunizados siguiendo el esquema QVV existían anticuerpos
neutralizantes capaces de inhibir la unión del EGF al REGF. Se evaluaron 18 sueros de pacientes
(13 vacunados y cinco no vacunados), diluidos 1:100. Este ensayo evidenció que los sueros
inmunes de 11 pacientes vacunados (76,9 %) inhibieron la unión del EGF al REGF en las células
A431 en un rango entre 22,4 y 58% de inhibición. Por el contrario, en el caso de los sueros de los
pacientes no vacunados no se observó inhibición de la unión del EGF al REGF de las células
A431. Las diferencias significativas entre los dos grupos evaluados (Figura 14) se alcanzaron
67
Resultados
post-inmunización (prueba t de student, (p<0,05). Adicionalmente, se encontró una correlación
directa entre el porcentaje de inhibición y el título de anticuerpos anti-EGF encontrado en los
sueros inmunes de los pacientes vacunados (Spearman, p<0,05).
40
Pre-inmune (D0)
% de Inhibición
*
Post-inmune controles (PI)
30
Post-inmune vacunados (VPI)
20
10
0
D0
PI
V PI
Figura 14. Inhibición de la unión EGF/REGF en sueros de pacientes del ensayo QVV. Los
porcentajes de inhibición se midieron a través de un inmunoensayo de competencia donde se utilizó el
EGF radiomarcado (EGF-125I) a una concentracion fija y células A431 con alta expresión de el REGF.
Los sueros de los pacientes controles (n=5) y vacunados (n=13) colectados, el día cero (D0) y entre 3-6
meses post-inmunización (PI), se ensayaron a una dilución 1:100. El conteo para el punto donde solo se
añade EGF-125I a las células A431, se consideró el 100% de unión al REGF. El asterisco (*) indica las
diferencias significativas entre los dos grupos post-inmunización, según la prueba t de student para
muestras no pareadas (p<0,05). Las ordenadas representan la media y la DS de los porcentajes de
inhibición. Los valores pre-inmunes que se muestran corresponden a los porcentajes de inhibición
encontrados para el total de los pacientes evaluados independientemente del grupo de tratamiento.
4.5.1.2 Inhibición de la unión del EGF a su receptor por sueros inmunes de pacientes
vacunados con el esquema VQV.
Con relación al segundo esquema (VQV), se midió el porcentaje de inhibición en sueros inmunes
de 13 pacientes, correspondientes a cinco tiempos diferentes y colectados durante el primer año
de tratamiento. Las diferencias significativas entre los porcentajes de inhibición alcanzados
después de la inmunización y los encontrados en los sueros pre-inmunes y pre-quimioterapia (día
32), comenzaron a observarse (Figura 15a) a partir del tiempo correspondiente a la quimioterapia
(90 días), según la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (p<0,05). En este ensayo se
observó el incremento en el tiempo de los porcentajes de inhibición. De hecho, siete meses
después de concluida la quimioterapia el 100 % de los sueros inmunes fueron capaces de inhibir
la unión del EGF a su receptor en un rango de inhibición 32 - 98% (media 67.8%), lo cual fue
superior a la inhibición que se obtuvo con el esquema QVV (Tabla 2).
68
Resultados
b)
b
a
80
bc
60
40
d
d
20
0
100000
100
32
90
240
título de Acs
80
10000
60
40
1000
20
100
0
% inhibición
0
330
50
100
150
200
250
300
% de Inhibición
% de Inhibición
100
Inverso del título de Acs
(media geométrica)
a)
0
350
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Figura 15. Inhibición de la unión del EGF/REGF en sueros de pacientes del ensayo VQV Los
porcentajes de inhibición se midieron según lo descrito en la figura anterior. Se evaluaron sueros de los
pacientes vacunados (n=13) correspondientes a, cinco tiempos diferentes (días: 0, 32, 90, 240 y 330). a)
Porcentajes de inhibición de la unión EGF/REGF. Las ordenadas representan la media y la DS de los
porcentajes de inhibición alcanzados para cada tiempo evaluado. Las letras indican las diferencias
significativas entre los porcentajes de inhibición alcanzados en los diferentes tiempos evaluados (prueba
de Tukey, p<0,05). b) Relación entre las cinéticas de anticuerpos anti-EGF y los porcentajes de inhibición
de la unión del EGF a su receptor. Las flechas indican el tiempo en que ocurren los incrementos
significativos para cada una de las variables.
También para este esquema se estudió la relación entre los porcentajes de inhibición y la
magnitud de los títulos de anticuerpos anti-EGF generados en cada uno de los cinco tiempos
ensayados. Nótese que entre el primer y el tercer mes de vacunación, a pesar de no haber un
incremento significativo de los títulos de anticuerpos, los porcentajes de inhibición de la unión
del EGF a su receptor sí incrementaron significativamente, según la prueba de comparaciones
múltiples de Tukey (p0,01) (Figura 15a y 15b). Los valores máximos de las medias de los
porcentajes de inhibición, se alcanzaron entre cuatro (240 días de tratamiento) y siete meses (330
días de tratamiento) después de concluida la quimioterapia, durante el período de reinmunizaciones (Tabla 2). Adicionalmente, se encontró una correlación directa entre los títulos
de anticuerpos logrados previo a las re-inmunizaciones y los porcentajes de inhibición
alcanzados durante el período de re-inmunizaciones (Spearman, p<0,05).
Otra de las observaciones relacionadas con la capacidad neutralizante de los anticuerpos
generados con la vacunación, fue la correlación directa y estadísticamente significativa entre los
porcentajes de inhibición de la unión ligando-receptor y la magnitud de la respuesta de
anticuerpos contra el lazo B de la molécula de EGF, en los dos tiempos ensayados después de la
69
Resultados
quimioterapia. La correlación significativa (Pearson, p<0,05) entre estas dos variables fue
similar para el cuarto y para el séptimo mes de tratamiento post-quimioterapia (Figura 16).
Tabla 2. Diferencias entre los porcentajes de inhibición de la unión EGF/REGF,
logrados con el esquema VQV, en sueros post- inmunes y lo encontrado en el
suero pre-inmune.
0
Sueros inmunes
que inhiben (%)
-
(n/total)
Inhibición (%)
11.3
p (tukey)
Inverso del título
anti-EGF
203.1
32
90
240
330
8.3
90.9
92.3
100.0
(1/12)
(10/11)
(12/13)
(13/13)
17.4
43.2
64.8
67.8
p >0.05
p <0.01
p <0.001
p <0.001
8979.7
9387.7
28763.2
54539.5
(media geométrica)
1.0
títulos Acs vs lazo B
D.O (405nm)
r2 = 0.3877
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
20
40
60
80
100
120
Inhibición EGF/REGF (%)
Figura16. Correlación entre la respuesta de anticuerpos contra el lazo B de la molécula de EGF y la
capacidad de neutralización del suero observada en el ensayo VQV. Se muestra la correlación entre
los porcentajes de inhibición y los títulos de anticuerpos anti-lazo B de la molécula de EGF siete meses
después de concluida la quimioterapia (Pearson, p<0,05).
En resumen, los resultados en esta sección indican que los anticuerpos anti-EGF generados por la
vacunación, cuando se emplea el esquema de tratamiento VQV, tuvieron la capacidad de inhibir
la unión del EGF a su receptor; que esta inhibición correlacionó directamente con el título de
70
Resultados
anticuerpos y que esta capacidad de inhibición se logró en el 100 % de los sueros inmunes
evaluados al cabo de siete meses de tratamiento post-quimioterapia. Adicionalmente, se observó
que el incremento significativo en los títulos de anticuerpos ocurrió primero que el incremento
significativo en la capacidad de inhibición de la unión ligando-receptor.
4.5.2
Inhibición de la fosforilación del REGF por los sueros inmunes.
Una de las consecuencias fisiológicas de la unión del EGF a su receptor es la fosforilación de
este último. Para analizar si los Anticuerpos presentes en el suero de los pacientes inmunizados
con la vacuna CIMAvax-EGF eran capaces de inhibir la activación del REGF en presencia del
EGF, se midió el estado de fosforilación de este receptor en las células A431 después de ser
incubadas con los sueros (post-inmunes y pre-inmunes) y el EGF.
4.5.2.1 Inhibición de la fosforilación del REGF por los sueros inmunes de pacientes
vacunados con el esquema QVV.
Para conocer la capacidad de los anticuerpos generados por la vacunación de inhibir la
fosforilación del REGF se evaluaron los sueros inmunes de 13 pacientes tratados con el esquema
QVV. Los sueros pre-inmunes de los pacientes vacunados y todos los sueros de los pacientes no
vacunados se utilizaron como control negativo de la inhibición de la fosforilación en presencia
del ligando. De esta evaluación se obtuvo que el 61 % (n=8) de los sueros inmunes inhibieron la
fosforilación del REGF, mientras que en los sueros de los pacientes no tratados no se encontró
una inhibición de la activación del REGF en presencia del EGF. A pesar de que se observó una
diferencia entre ambos grupos (Figura 17a), esta diferencia no alcanzó la significación estadística
según la prueba t de student (p=0,074).
Al igual que para los porcentajes de inhibición de la unión entre el EGF y su receptor, se
encontró una alta correlación entre los títulos de anticuerpos anti-EGF en los sueros inmunes y la
capacidad de inhibir la fosforilación (Spearman, p<0,01). Adicionalmente, se observó que a
pesar de mantenerse niveles similares de títulos de anticuerpos, la capacidad de inhibir la
fosforilación varia en el tiempo (Figura 17b). Cuando se analizaron muestras de suero inmune de
un mismo paciente extraído en diferentes tiempos durante 17 meses de vacunación, se observó
que con igual título de anticuerpos en el mes 3 y en el mes 6, se obtuvieron distintos porcentajes
de inhibición de la fosforilación. En el mes 3 no se constató ninguna capacidad de inhibición de
71
Resultados
la activación del REGF; sin embargo, en el mes 6 se obtuvo un 31,8 % de inhibición. Al cabo de
17 meses de tratamiento se observó la inhibición total de la activación del REGF con el suero del
mismo paciente, esta vez con un altísimo título de Anticuerpos anti-EGF (1:128000). Un
fenómeno similar, de incremento en la capacidad efectora de los anticuerpos en el tiempo sin
alteración significativa en los niveles de títulos de anticuerpos anti-EGF, se describió en la
sección precedente para el efecto sobre la unión del ligando al receptor.
a)
b)
Inhibición de fosforilación
del REGF(%)
70
60
50
40
30
20
10
0
No vacunados
Vacunados
Figura17. Inhibición de la fosforilación del REGF por los sueros inmunes de pacientes del ensayo
QVV. Células con alta expresión del REGF (A431), previamente cultivadas en medio libre de suero, se
incubaron con los sueros de pacientes diluidos 1:100. Los niveles de fosforilación del RFCE después de la
estimulación de estas células con EGF, se determinaron mediante Western Blot. Los sueros pre-inmunes
se utilizaron para fijar el 100% de activación de la señalización mediada por el EGF en cada caso. (a) Los
sueros inmunes de pacientes vacunados (n=13) se ensayaron y compararon con el grupo control (n=5).
Las ordenadas representan la media de los porcentajes de inhibición alcanzados para cada grupo de
pacientes. (b) Se muestran los niveles de expresión (anti-REGF) y fosforilación (anti-PY) del REGF en
diferentes tiempos, correspondientes a dos pacientes representativos de cada grupo. En la tabla asociada a
las radiografías aparece el inverso de los títulos de anticuerpos anti-EGF y los valores de porcentajes de
inhibición de la fosforilación de cada uno de los sueros evaluados.
72
Resultados
4.5.2.2 Inhibición de la fosforilación del REGF por los sueros inmunes de pacientes
vacunados con el esquema VQV.
Cuando se evaluó la capacidad de los sueros inmunes de pacientes tratados (n=14) con el
esquema VQV de inhibir la fosforilación en diferentes tiempos del tratamiento, se obtuvieron
resultados similares a los del esquema QVV.
De esta evaluación se obtuvo que, el 50 % de los sueros estudiados, correspondientes al período
post-quimioterapia (330 días) de los pacientes tratados según el esquema VQV, inhibieron la
fosforilación del REGF en presencia del EGF. Se lograron porcentajes de inhibición de la
fosforilación superiores (media=36 %) a los obtenidos para los pacientes del ensayo QVV
(media= 19,9 %), pero esta diferencia no alcanzó significación estadística (prueba U de Mann-
Inhibición de la fosforilación
del REGF(%)
Whitney, p=0,6 (Figura 18).
100
Figura 18. Inhibición de la fosforilación del
REGF por los sueros inmunes de pacientes
incluidos en los ensayos en evaluación
(QVV y VQV). La medición de los
porcentajes de inhibición de la fosforilación
del REGF se realizó según se describió en la
figura anterior. Las ordenadas representan los
porcentajes de inhibición alcanzados por cada
paciente evaluado en un período de entre 3 y 6
meses post-inmunización para el ensayo QVV
(n=13) y a los siete meses post-quimioterapia
para el VQV (n=14). Adicionalmente, se
muestran las medias de estos valores en cada
ensayo.
75
50
25
0
QVV
VQV
Ensayos
La evolución de esta característica de la respuesta inmune específica durante el tratamiento con
el esquema VQV, se estudió en varios pacientes (Tabla 3). En todos estos casos se obtuvieron
altos porcentajes de inhibición de la fosforilación para los tiempos post-quimioterapia (240 y 330
días). Nótese que los títulos de anticuerpos se incrementan desde la segunda inmunización (día
32), mientras que la inhibición de la fosforilación se hace evidente después, durante el período de
reinmunizaciones, incluso con títulos de anticuerpos menores a los obtenidos en la etapa previa
en algunos casos).
73
Resultados
Tabla 3. Relación entre los títulos de anticuerpos anti-EGF y los porcentajes
de inhibición de la fosforilación del REGF correspondientes al ensayo VQV.
Tiempo (días)
32
240
330
Paciente 1
Paciente 2
Paciente 3
Título
Anticuerpos
1:16000
1:64000
1:256000
% inhibición
0
84,9
94,6
Título
Anticuerpos
1:8000
1:16000
1:32000
% inhibición
0
64,6
73,3
Título
Anticuerpos
1:256000
1:8000
1:12800
% inhibición
0
96,7
99,1
Esta disociación se ilustra para un paciente representativo de lo que se puede lograr con este
esquema de tratamiento en pacientes SBR (Figura 19). Se puede observar que en el día 32, a
pesar se existir un título de anticuerpos elevado, no hubo inhibición. Sin embargo, con los sueros
inmunes correspondiente a los dos tiempos post-quimioterapia, se produjo una disminución de la
fosforilación del REGF de hasta 18,6 veces (en los 330 días) con respecto al suero pre-inmune.
Este dato corresponde a un 94,6 % de inhibición de la activación del REGF por el EGF.
Analizando de conjunto los resultados obtenidos con ambos esquemas de tratamiento, podemos
decir que los anticuerpos del suero de los pacientes vacunados con el EGF, tienen la capacidad
de inhibir la fosforilación del REGF inducida por el EGF. La adquisición de esta capacidad se
obtuvo en más del 70 % de los pacientes inmunizados, en un período aproximado de siete meses
de tratamiento después de finalizada la quimioterapia. Por lo tanto, al igual que para la capacidad
inhibir la unión EGF/REGF y para la inmunodominancia del lazo B de la molécula de EGF, se
requiere tiempo para alcanzar los valores máximos de este efecto biológico de los anticuerpos
específicos anti-EGF inducidos por la vacunación con CIMAvax-EGF.
74
Resultados
2.5
0.5
0.0
0
32
240
1:256000
1.0
1:64000
1.5
1:16000
2.0
1:100
Unidades P-REGF/REGF
3.0
330
Tiempo (días)
Figura 19. Inhibición de la fosforilación del REGF (P-REGF) por los sueros inmunes de un paciente
representativo del ensayo VQV. Células con alta expresión del REGF (A431), previamente cultivadas
en medio libre de suero, se incubaron con los sueros de pacientes diluidos 1:100. Los niveles de
fosforilación del RFCE después de la estimulación de estas células con EGF, se determinaron mediante
Western Blot. Los sueros pre-inmunes se utilizaron para fijar el 100% de activación de la señalización
mediada por el EGF en cada caso. La medición de los porcentajes de inhibición de la fosforilación del
REGF se realizó según se describió en la figura Se muestran los niveles de expresión (anti-REGF) y de
fosforilación (anti-PY) del REGF y los porcentajes de inhibición de la P-REGF para diferentes tiempos
representados. En el gráfico aparecen los valores de unidades densitométricas correspondientes a la
fosforilación mediada por los sueros y los títulos de anticuerpos anti-EGF, para cada uno de los tiempos
representados.
4.6
Supervivencia y toxicidad asociada a la vacunación con CIMAvax-EGF.
4.6.1
Supervivencia de pacientes tratados con el esquema QVV. Influencia de la edad
Para el total de pacientes evaluados clínicamente (n=74) en el ensayo QVV, la supervivencia de
los vacunados fue de 6,47 meses y de 5,33 meses en los pacientes no vacunados. La
supervivencia alcanzó la significación estadística dentro del subgrupo de los pacientes menores
75
Resultados
de 60 años de edad (11,57 meses vs. 5,33 meses en los controles). En los pacientes del grupo
control, la edad no fue un predictor de supervivencia (Neninger Vinageras y cols. 2008).
En la muestra de 42 pacientes escogidos para este estudio (Tabla 4), se verificó la tendencia al
aumento en la supervivencia como consecuencia de la vacunación, y se observaron las
diferencias entre las respuestas del grupo menor de 60 años y el grupo mayor de 60 años.
Tabla 4. Características demográficas de los 42 pacientes seleccionados para el
estudio del esquema QVV.
Control
(n=16)
Características
Edad (años)
Media
Rango
Sexo
Masculino
Femenino
Raza
Blanca
Negra
Otras
Estado general
0
1
2
Etapa
IIIB
IV
Histología
Células no pequeñas
Adenocarcinoma
Células escamosas
Carcinoma de células grandes
No.
Vacunados
(n=26)
%
54
30-72
No.
%
56
32-71
11
5
68.8
31.3
18
11
69.2
30.8
8
4
4
50.0
25.0
25.0
22
3
1
84.6
11.5
3.8
1
14
1
17.1
68.3
14.6
6
14
5
24.0
56.0
20.0
11
5
68.8
31.3
20
6
76.9
23.1
3
5
7
---
20.0
33.3
46.7
---
7
8
10
1
26.9
30.8
38.5
3.8
En congruencia con los resultados observados para la muestra total de pacientes evaluados
clínicamente en el ensayo QVV, la supervivencia (mediana, 13 meses) de los pacientes
vacunados menores de 60 años (n=17) fue superior (mediana: 7,03 meses) a la de los pacientes
controles (n=12) del mismo grupo etáreo (figura 20a) en el grupo de 42 pacientes seleccionados
para los estudios de la respuesta inmune específica. De la misma manera ocurrió dentro del
76
Resultados
grupo de pacientes vacunados (Figura 20b), donde el subgrupo de pacientes menores de 60 años
de edad, tuvo una supervivencia significativamente superior, a la de los pacientes tratados
mayores de 60 años (n=9; mediana: 7,43 meses). Por lo que podemos decir que, aunque con
valores algo superiores en las medianas de supervivencias, los pacientes seleccionados para el
estudio inmunológico conforman una muestra representativa de lo que ocurre en la muestra total
de pacientes incluidos en el ensayo QVV, en términos de supervivencia general.
a)
b)
100
vacuna
control
80
Supervivencia (%)
Supervivencia (%)
100
60
40
20
0
0
10
20
30
40
hasta 60
80
> 60
60
40
20
0
50
Tiempo (meses)
0
10
20
30
40
50
Tiempo (meses)
Figura 20. Funciones de supervivencia en pacientes escogidos para el estudio inmunológico del
ensayo QVV. a) Curvas Kaplan Meier que muestran la supervivencia de vacunados y controles en el
grupo de pacientes menores de 60 años. b) Se muestra la supervivencia del grupo vacunado atendiendo a
los grupos de edad (log rank, p<0,05).
Esta influencia de la edad en la respuesta a la vacunación fue independiente de los niveles de
respuesta de Anticuerpos anti-EGF, dado que los títulos de anticuerpos obtenidos por la
vacunación no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos etáreos y la proporción
de buenos y malos respondedores fue similar en ambos grupos de edad. De hecho, la influencia
de la edad en la supervivencia de los pacientes tratados con el esquema de tratamiento QVV, se
evidenció incluso dentro del grupo de buenos respondedores (BR) a la vacunación (Tabla 5). Los
pacientes con buena respuesta de anticuerpos anti-EGF, producto de la vacunación con
CIMAvax-EGF, y menores de 61 años de edad, mostraron mejor tiempo de supervivencia que
los pacientes mayores de 60 años.
77
Resultados
La edad no correlacionó con el efecto biológico de los anticuerpos en su función de neutralizar el
EGF e impedir la unión con su receptor REGF.
Tabla 5. Relación de la respuesta inmune y la edad con la supervivencia de los pacientes
vacunados según el esquema QVV.
Media
Mediana
Prueba de Log
Estratos/n
rank (p)
(meses)
(meses)
≤ 60 /17
20,33
13
> 60/9
7,07
7,43
BR y ≤ 60/12
25,62
15,03
BR y > 60/7
7,15
7,43
Edad (años)
BR y Edad
0,0057
0,0001
Sin embargo, se encontró una correlación inversa entre la edad y los valores de concentración de
TGFα, medido en el suero inmune de los pacientes vacunados. Los pacientes de 60 años o menos
que recibieron la vacunación, tuvieron un aumento de las concentraciones de TGFα en el suero
inmune (Figura 21). Quedaría por demostrar si este es un efecto dependiente de la edad o de la
vacunación, pues el grupo de control evaluado no contaba con suficiente muestra como para
abordar este tipo de análisis.
En resumen, la vacunación con CIMAvax-EGF produjo una ventaja de supervivencia dentro de
los pacientes menores de 60 años de edad del ensayo QVV. En este subgrupo de pacientes,
después de la vacunación se observaron niveles de TGFα superiores a los encontrados en los
mayores de 60 años.
78
Resultados
Figura 21. Incremento de las concentraciones de TGFα en los sueros de los pacientes vacunados en
el ensayo QVV, según el grupo etáreo. La ordenada muestra el intervalo de confianza y la media de las
concentraciones de TGFα. El asterisco (*) indica las diferencias significativas entre los valores
encontrados en los sueros inmunes de cada grupo de edad, según la prueba t para muestras
independientes, p<0,05.
4.6.2
Supervivencia de pacientes tratados con el esquema VQV.
En el ensayo VQV se evaluaron 20 pacientes con CPCNP avanzado. En el momento del
diagnóstico, el 50 % de los pacientes se encontraban en etapa IV y el otro 50 % en etapa IIIB de
la enfermedad (Tabla 6). Todos los pacientes recibieron dos dosis (de 200µg) de la vacuna
CIMAvax-EGF previo a la primera línea de quimioterapia y al menos una dosis después de haber
finalizado la quimioterapia.
El análisis de la respuesta al tratamiento de los 20 pacientes incluidos en este ensayo resultó en
un 85 % del control de la enfermedad, pues se lograron dos respuestas completas (RC), cinco
respuestas parciales (RP) y la estabilización de la enfermedad en 10 pacientes (EE). Cuando se
estudió la supervivencia, la mediana para los 20 pacientes fue de 12,8 meses. En el subgrupo de
17 pacientes donde se logró alguna respuesta objetiva (RC o RP) o al menos EE, se alcanzó una
mediana de supervivencia de 16,2 meses. Cuando se estimó la supervivencia a partir del primer
79
Resultados
mes de finalizada la primera línea de quimioterapia (tiempo que se corresponde con el momento
en que se comienza a medir la supervivencia cuando se empleó el esquema de tratamiento QVV),
se obtuvo una mediana de 9,3 meses de supervivencia. Este valor fue superior a la supervivencia
lograda para los pacientes vacunados según el esquema QVV (mediana: 6,47 meses), y cuando
se comparó con el grupo control de ese ensayo (mediana: 5,33 meses), fue significativamente
mayor (Log rank, p<0,05) (datos no mostrados).
Tabla 6.Características demográficas de los pacientes evaluados
en el ensayo VQV.
Características
Cantidad de pacientes %
(n=20)
Edad (años)
Media
58
Rango
32-70
Sexo
Masculino
16
80
Femenino
4
20
Raza
Blanca
12
60
Negra
8
40
Estado General
1
20
100
Fumadores
Si
19
95
No
1
5
Etapa
IIIB
10
50
IV
10
50
Histología
Células no pequeñas
13
65
Adenocarcinoma
4
20
Carcinoma Epidermoide
2
10
Carcinoma de células grandes
1
5
80
Resultados
4.6.3
Evaluación de la toxicidad.
En ambos esquemas de tratamiento la vacuna fue segura y bien tolerada. Los efectos adversos
más comunes observados fueron: escalofríos, fiebre, nausea, vómitos y fatiga; todos clasificados
como grado 1 o 2 (suaves o moderados) de acuerdo a los Criterios Comunes de Toxicidad del
Instituto Nacional de Cáncer. No se observó ningún efecto adverso de grado 3 o 4 que estuviera
relacionado con el tratamiento. En el caso del ensayo QVV, no se observaron diferencias entre
los parámetros químicos hematológicos y sanguíneos del grupo control y el vacunado (datos no
mostrados).
4.7
Relación de la respuesta inmune específica con la supervivencia en pacientes
de CPCNP inmunizados con CIMAvax-EGF.
4.7.1
Relación entre las características de la respuesta inmune específica y la
supervivencia de los pacientes de CPCNP tratados con el esquema QVV.
Dentro del grupo de pacientes vacunados en el ensayo QVV, los pacientes con buena respuesta
de Anticuerpos (BR; n=19) post-tratamiento, mostraron una supervivencia significativamente
mayor (mediana: 11,7 meses) que el grupo de malos respondedores (MR, n=7) al tratamiento
(Figura 22a), hallazgo previamente descrito para este tipo de vacunación (González y cols.
2003).
La supervivencia también se asoció con la reducción que produce la vacuna en las
concentraciones de EGF sérico. El 85 % de los pacientes clasificados como BR, lograron reducir
las concentraciones de EGF a valores inferiores a 168 pg/mL. En aquellos pacientes (n=17) en
los cuales la concentración de EGF se redujo a valores inferiores a 168 pg/mL, los tiempos de
supervivencia fueron significativamente mayores (mediana: 13 meses) que en los pacientes (n=9)
donde no se logró una reducción a niveles inferiores a los de este valor (mediana: 5,6 meses;
prueba de Log rank, p = 0,0023) (Figura 22b).
Con la medición del Factor de Crecimiento Transformante (TGFα) se obtuvo un resultado
diferente. Cuando se estudió la supervivencia asociada a los niveles del TGFα post-inmunización
(Figura 22c), se encontraron tiempos de supervivencia significativamente superiores en aquellos
pacientes (n=6) que mostraron mayores concentraciones de TGFα (mediana: 33,5 vs. 8,47
meses).
81
Resultados
a)
b)
100
BR
MR
Supervivencia (%)
Supervivencia (%)
100
50
0
EGF>168 pg/mL
50
0
0
10
20
30
40
EGF<168 pg/mL
50
0
10
Tiempo (meses)
c)
20
30
Tiempo (meses)
40
50
d)
100
TGF<12,5 pg/mL
no inhibición
TGF>12,5 pg/mL
Supervivencia (%)
Superviencia(%)
100
50
0
0
10
20
30
40
Tiempo (meses)
inhibición
50
0
50
0
10
20
30
Tiempo (meses)
40
50
e)
Supervivencia (%)
100
lazo B
no lazo B
50
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (meses)
Figura 22. Curvas de supervivencias relacionadas con las características de la respuesta inmune
humoral contra el EGF humano en pacientes con CPCNP tratados según el esquema QVV. a)
Supervivencia en función de la magnitud de la respuesta de Anticuerpos anti-EGF (Log rank; p=0,001).
b) La supervivencia de pacientes vacunados que reducen las concentraciones de EGF a valores menores
que 168 pg/mL vs. los que no reducen hasta esos niveles con el tratamiento (Log rank p = 0,0023). c) Se
muestra la supervivencia de los pacientes vacunados en función de la concentración de TGFα en sueros
inmunes (Log rank; p= 0,0073). d) Se muestra la supervivencia de pacientes vacunados según la
capacidad de los sueros inmunes de inhibir la unión EGF/REGF (Log rank; p = 0,0001). e) Supervivencia
de pacientes vacunados de acuerdo al reconocimiento del epítopo inmunodominante (lazo B) de la
molécula de EGF (Log rank; p = 0,012).
82
Resultados
Los pacientes (n=10) cuyo suero inmune fue capaz de inhibir la unión entre el EGF y su receptor,
mostraron tiempos de supervivencia superiores que aquellos pacientes en los cuales no se
observó una inhibición post-inmunización (mediana: 11,7 vs. 5,63 meses; prueba de Log rank, p
= 0,0001; Figura 22d).
En el caso de la inmunodominancia del lazo B de la molécula de EGF, los pacientes (n=6) en los
cuales la respuesta de anticuerpos generada fue preferencialmente contra el lazo central (lazo B)
de la molécula de EGF, alcanzaron tiempos de supervivencia superiores (mediana: 33,5 meses),
mientras que en aquellos en los cuales no se observó una inmunodominancia del lazo B de la
molécula, la mediana de supervivencia fue de 7,43 meses (prueba de Log rank, p = 0,012; Figura
22e).
Todas estas asociaciones ocurrieron en los pacientes vacunados pero no en los pacientes del
grupo control.
4.7.2
Relación entre las características de la respuesta inmune específica y la
supervivencia de los pacientes de CPCNP tratados con el esquema VQV.
En el esquema optimizado VQV también se verificó que hay una mayor supervivencia para los
pacientes con mejor respuesta de anticuerpos. En correspondencia con los resultados de los
ensayos clínicos realizados previamente, cuando se estudió la influencia de la magnitud de la
respuesta de anticuerpos en la supervivencia de los pacientes tratados, se observaron mayores
tiempos de supervivencia en los pacientes que mostraron títulos anti-EGF muy altos (SBR).
Los pacientes SBR (n=14) mostraron una supervivencia (Figura 23) significativamente mayor
(mediana: 19,3 meses) que los BR (mediana: 8,4 meses) según la prueba de Log rank
(p=0,0036).
83
Resultados
Supervivencia (%)
100
SBR
no SBR
50
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (meses)
Figura 23. Curva de supervivencia de pacientes con CPCNP incluidos en el ensayo VQV.
Supervivencia de pacientes de CPCNP vacunados, en función de la magnitud de la respuesta de
anticuerpos anti-EGF, según la prueba de Log rank (p=0,0036). SBR: Súper-respondedores, si alcanzaron
títulos de anticuerpos iguales o mayores que 1:64000.
Para el resto de los parámetros inmunológicos evaluados no se encontró relación con la
supervivencia, pues todos los pacientes escogidos para estas determinaciones fueron SBR y por
tanto tenían características similares en cuanto a la respuesta inmunológica específica
desarrollada post-vacunación y los tiempos de supervivencia.
Adicionalmente, en este ensayo se observó que los pacientes que tenían una alta concentración
de EGF sérico antes de iniciar la vacunación, tuvieron después una mejor supervivencia, y esta
diferencia fue estadísticamente significativa según la prueba Log rank (p=0,015). Igual tendencia
se observó en los pacientes del esquema QVV, pero en este caso no se alcanzó significación
estadística.
Con el objetivo de mostrar la relación de los niveles de EGF sérico y la supervivencia de los
pacientes tratados, se calculó un valor de corte (1194 pg/mL) teniendo en cuenta la relación entre
los valores de concentración de EGF obtenidos y la supervivencia a los 12 meses de todos los
pacientes evaluados (curva ROC). Los pacientes (n=12) con mayor concentración de EGF
alcanzaron tiempos de supervivencia superiores (mediana; 17,47 meses) con una p=0,015, según
la prueba de Log rank (Figura 24).
84
Resultados
Supervivencia (%)
100
EGF >1194 pg/mL
EGF<1194 pg/mL
50
0
0
10
20
30
Tiempo(meses)
40
50
Figura 24. Supervivencia de los pacientes tratados según el esquema VQV en función de la
concentración de EGF en el suero pre-inmune. Se representan las curvas correspondientes a un total de
18 pacientes comparados por la prueba de Log rank (p=0,015).
.
85
Discusión
5.
DISCUSIÓN
El cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer en el mundo, y la variedad de
células no pequeñas (CPCNP) constituye alrededor del 85 % de los nuevos diagnósticos (Gridelli
y cols. 2009). Aproximadamente el 65% de estos pacientes se encuentran en etapas avanzadas de
la enfermedad (IIIB/IV) al momento del diagnóstico. La mediana de supervivencia para estos
pacientes en etapas tan avanzadas de la enfermedad, y que han sido tratados con la quimioterapia
basada en platino, es solamente de entre 8 y 10 meses (Stinchcombe y cols. 2006), con la
excepción de un pequeño subgrupo de pacientes con un buen estado general, que presentan una
mínima o ninguna pérdida de peso y en los cuales es apropiada la aplicación de altas dosis de
radioterapia (Penland y Socinski 2004; Mac Manus y cols. 2006). De manera general, los
pacientes con CPCNP que no pueden ser operados, usualmente son considerados como
portadores de una enfermedad incurable, por lo que se impone el desarrollo de nuevas drogas con
mayor efectividad (Dubey y Schiller 2005).
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (REGF) forma parte de los receptores
encargados de iniciar los eventos de señalización que estimulan la progresión del ciclo celular.
La progresión descontrolada del ciclo celular ocurre como resultado de la acumulación de
defectos genéticos que conducen a un aumento de las funciones de los factores de crecimiento
cuyo receptor se encuentra sobrexpresado en numerosos tumores de origen epitelial (Normanno
y cols. 2005). Sus efectos oncogénicos incluyen la disminución de las señales pro-apoptóticas,
una potenciación de la proliferación, así como un aumento de la capacidad invasiva de las células
(Jones y Kazlauskas 2001). La sobre-expresión del REGF ha sido correlacionada con el mal
pronóstico de la enfermedad y una disminución de la supervivencia de los pacientes con cáncer
(Akslen y cols. 1993). Específicamente, este receptor se encuentra sobrexpresado en el 70 % de
los CPCNP y por esa razón una estrategia terapéutica muy interesante es el uso de agentes que
tengan como blanco el REGF y las vías de señalización relacionadas. De hecho, ya estas
estrategias se han introducido en la clínica a través del uso de diversos agentes pasivos, como los
ITK y los AcMs (Crombet y cols. 2004; Janne y cols. 2004; Crombet y cols. 2006; Felip y Rosell
2006).
A pesar de los múltiples tratamientos basados en la inmunoterapia pasiva, que han validado al
REGF como blanco de la terapia antitumoral, la inmunoterapia activa específica (vacunación)
86
Discusión
contra este blanco no ha sido abordada en la práctica clínica. Numerosas evidencias clínicas y
experimentales indican que el sistema inmune puede prevenir el desarrollo de un tumor de
manera natural, y a su vez sustentan la idea de tratar los tumores con vacunas terapéuticas. Las
vacunas de cáncer fueron originalmente diseñadas para enfrentar antígenos específicos de un
tumor, o sea, antígenos no propios expresados solamente en las células tumorales debido a
mutaciones relacionadas con el proceso de malignización. Existen también evidencias sobre el
reconocimiento de antígenos propios no mutados en células tumorales, lo que indica que el
sistema inmune tiene un repertorio de células T suficientemente grande como para generar
respuestas antitumorales contra los antígenos propios expresados por cada tumor. La idea de
utilizar vacunas de cáncer compuestas por antígenos completamente propios es ahora posible
(González y Lage 2007).
Nuestro enfoque, en el Centro de Inmunología Molecular, sobre la vacunación contra el ligando
EGF, ha sido la única aproximación a la terapia activa basada en el sistema del REGF que ha
trascendido hasta la fase de ensayos clínicos. Esta vacunación fue desarrollada con la intención
de reducir la disponibilidad de este importante ligando para el REGF. Después de extensos
estudios preclínicos y toxicológicos (González G y cols. 1997), la vacuna basada en un
conjugado químico entre el EGF humano recombinante y la proteína P64k de Neisseria
meningitidis se ha evaluado en la clínica en pacientes con CPCNP. Varios ensayos clínicos
pilotos se desarrollaron, con la finalidad de estudiar la respuesta inmune específica, la selección
de la proteína transportadora y la seguridad de la vacunación (González y cols. 1998), así como
para la selección del adyuvante apropiado, el pre-tratamiento con la ciclofosfamida (González y
cols. 2003) y el efecto del aumento de las dosis sobre la respuesta inmune (Ramos y cols. 2006).
Sin embargo, el estudio de los mecanismos de acción de la respuesta inmune humoral generada
no había sido abordado en estudios clínicos anteriores. Con el objetivo de estudiar las
características de la respuesta de anticuerpos, así como la existencia o no de posibles marcadores
sustitutos de la respuesta clínica a la vacunación, en el presente estudio se evaluaron diferentes
parámetros de la respuesta inmune específica y su relación con la supervivencia de los pacientes
tratados. Estas determinaciones se realizaron dentro del marco de dos ensayos clínicos, donde la
vacuna CIMAvax-EGF, se usó como parte de dos esquemas terapéuticos diferentes para el
tratamiento de pacientes con CPCNP avanzado.
87
Discusión
La vacunación con CIMAvax-EGF ha sido informada previamente por nuestro grupo como un
procedimiento seguro. Esta vacuna es capaz de generar anticuerpos anti-EGF específicos en
pacientes de CPCNP en etapas avanzadas (González y cols. 2003; Ramos y cols. 2006). Los
resultados obtenidos en nuestro estudio (en ambos ensayos clínicos), confirman que la vacuna es
muy bien tolerada y el perfil de seguridad es el mismo que el observado en los estudios
anteriores, incluso para el esquema VQV, donde se usan dosis muy superiores a las informadas
previamente. Estos resultados se corresponden con la evaluación de la toxicidad de un grupo de
58 pacientes vacunados con CIMAvax-EGF por más de un año, donde se demostró que la
vacunación mensual es posible y segura. No se encontraron evidencias de toxicidad acumulada y
la incidencia de eventos adversos fue la misma tanto para las primeras como para las últimas
inmunizaciones (González y cols. 2010).
De los estudios piloto previos también se sabe que la magnitud de la respuesta de anticuerpos
anti-EGF se ha asociado positivamente con el tiempo de supervivencia de los pacientes tratados
(Ramos y cols. 2006). Estos resultados concuerdan con lo descrito en la literatura sobre la
correlación entre la intensidad de la respuesta inmune a una vacunación y su actividad
antitumoral (Pérez -Diez y cols. 2002). Sin embargo, en ninguno de los ensayos anteriores se
contaba con un control concurrente tratado solamente con tratamiento de soporte, que nos
permitiera hacer comparaciones con las respuestas específicas generadas en vacunados y no
vacunados en tiempo real. Después de analizar los resultados obtenidos en nuestro primer estudio
controlado (QVV), se pudo comprobar que en el 100% de los pacientes con CPCNP avanzado
evaluados existían anticuerpos naturales que reconocen el EGF. La existencia de anticuerpos
naturales anti-EGF prevalentemente de tipo IgG fue descrita previamente incluso en sujetos
sanos. Para incrementar, mediante la vacunación, esta respuesta, fue necesario conjugar esta
proteína a una molécula transportadora efectiva y un adyuvante apropiado (González y cols.
2003). Paradójicamente, la respuesta a la inmunización con EGF pudo además ser ampliada
usando bajas dosis de ciclofosfamida como inmunosupresor de los mecanismos de control
activos (González y cols. 2002). Con la utilización de todas estas herramientas propuestas
previamente, en nuestro actual estudio observamos cómo los niveles de anticuerpos específicos
se incrementan después de la vacunación y alcanzan títulos elevados en el 70 % de los pacientes
vacunados post-quimioterapia. Esto no ocurre en el grupo de pacientes no vacunados.
88
Discusión
La mayoría de las vacunas de cáncer evaluadas recientemente en ensayos clínicos fase I,
muestran su eficacia en términos de inducción de inmunidad contra el antígeno tumor-específico.
Sin embargo, la eficacia clínica es limitada, de modo que los esfuerzos se han encaminado a
entender las bases de esta aparente falta de respuesta sobre los tumores. Por una parte, las
vacunas actuales son subóptimas; de manera general, tanto el número de dosis empleadas como
la frecuencia de vacunación han sido parámetros establecidos de manera empírica y se dificulta
encontrar en la literatura un esquema óptimo de inmunización, basado en los mecanismos
inductores de respuesta inmune efectiva, para cada tipo de vacuna y tumor (Lage y cols. 2005).
Los estudios provenientes de las enfermedades infecciosas han sugerido que, en algunos casos,
altas dosis de vacunas de proteínas recombinantes están asociadas a una robusta respuesta
antígeno-específica y a un aumento en la frecuencia de respondedores (Disis y cols. 2004). No
obstante, en el caso de las vacunas de cáncer, además de la optimización de las dosis, las rutas de
administración y los esquemas de tratamiento se necesitan antígenos tumorales apropiados y
fuertes adyuvantes. Por otra parte, se sabe que grandes cargas de antígenos tumorales
frecuentemente producen un microambiente tolerogénico que impide la generación de una
inmunidad efectiva contra los tumores (Romero 2008). La eliminación de esta tolerancia
inducida por el tumor podría contribuir a aumentar la efectividad de las vacunas.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la investigación preclínica (Rodriguez y cols.
2008) y en los ensayos clínicos previos (Ramos y cols. 2006), se diseñó un ensayo piloto (VQV).
Este ensayo tuvo el propósito de optimizar el esquema de vacunación QVV utilizado hasta el
momento, para lograr mayor número de pacientes buenos respondedores a la vacunación que los
alcanzados en ensayos previos e incrementar el tiempo de supervivencia de estos. Los estudios
previos demostraron que dosis más altas eran perfectamente toleradas (Ramos y cols. 2006) y
que tanto la distribución en más de un sitio de inyección como la frecuencia de administración de
las múltiples dosis y la combinación con quimioterapia, eran favorables para el incremento de la
respuesta de anticuerpos específicos (Rodriguez y cols. 2008). En el ensayo VQV, a diferencia
del ensayo anterior, se usaron 200 µg de EGF distribuidos en cuatro sitios de inyección y la
vacunación se inició un mes antes de la primera línea de quimioterapia, con una frecuencia de 15
días. Las inmunizaciones se reiniciaron un mes después de finalizada la primera línea de
quimioterapia. En este ensayo se logró un incremento marcado de la respuesta de anticuerpos
contra el EGF en el 95 % de los pacientes. Este incremento ocurre más rápido y se generan
89
Discusión
títulos de mayor magnitud que los obtenidos con el esquema de tratamiento previamente
utilizado. Sin embargo, esta potenciación de la respuesta inmune específica no se asoció con un
aumento en la toxicidad.
Cuando se analizó el efecto de la quimioterapia sobre la respuesta de anticuerpos lograda con las
inmunizaciones previas, se observó que los niveles de títulos de anticuerpos anti-EGF no
disminuyeron significativamente durante el período de quimioterapia. Esto pudo deberse a que se
administraron dos vacunaciones previo a la quimioterapia, la cual comenzó un mes después del
primer reto antigénico, lo cual es un tiempo suficiente para que se generen células B de memoria,
secretoras de anticuerpos IgG (Abul K.Abbas 2004). Este tipo de respuesta no se afecta
grandemente a consecuencia de la quimioterapia (Mackall y cols. 1994). En estudios de
pacientes con cáncer tratados con quimioterapias similares a la que han recibido los pacientes
incluidos en este estudio, se ha descrito la capacidad de la inmunidad humoral de responder
activamente frente a la reactivación del citomegalovirus (CMV) producida durante el curso de la
quimioterapia. Con este tipo de quimioterapia, no ocurre una supresión total de la inmunidad
celular como sucede cuando se emplean análogos de las purinas, ciclofosfamida o grandes dosis
de esteroides sistémicos (Kuo y cols. 2008).
Adicionalmente, en el esquema VQV se encontró correlación directa entre la respuesta natural
anti-EGF y las concentraciones de EGF en el suero pre-inmune. Estos datos, unidos al hecho de
las altas concentraciones de EGF encontradas en el suero pre-inmune de pacientes de CPCNP en
estados avanzados de la enfermedad, previamente tratados con la primera línea de quimioterapia,
(Ramos y cols. 2006) avizora la relevancia de este factor de crecimiento en la evolución del
CPCNP en esas etapas de la enfermedad.
La resistencia adquirida a las terapias basadas en la familia de receptores ErbB como blanco
antitumoral, aprobadas actualmente para el tratamiento del cáncer, y la frecuente asociación de
esa resistencia con la sobre-expresión de ligandos (Ishikawa y cols. 2005; Valabrega y cols.
2005; Zhou y cols. 2006) y otros receptores de la familia ErbB (Bianchi y cols. 2006; Engelman
y cols. 2007; Karamouzis y cols. 2007; Ritter y cols. 2007), ha limitado la eficacia de estas
drogas. Como consecuencia de dicha resistencia y de las eficacias moderadas que se han logrado
con los anticuerpos anti-REGF y los inhibidores tirosina cinasa, otras estrategias alternativas
90
Discusión
basadas en la neutralización de los ligandos de manera pasiva están siendo consideradas
actualmente en estudios preclínicos (Lindzen y cols. 2010).
En nuestro estudio la generación de una respuesta de anticuerpos contra el ligando EGF se
manejó como una manera de modular las concentraciones sistémicas del EGF, uno de los
factores de crecimiento más relevantes en el desarrollo de tumores de origen epitelial que sobreexpresan el REGF. A diferencia de las hormonas, los factores de crecimiento se secretan de
forma sistémica y su eliminación por cirugía o por irradiación de las glándulas no sería posible
(González y Lage 2007). En este sentido, la generación de grandes cantidades de anticuerpos
neutralizantes capaces de secuestrar el EGF e impedir la unión al REGF constituye una vía
expedita para lograr reducciones importantes de las concentraciones de EGF circulante, e
impedir así el desarrollo de los tumores dependientes de este factor de crecimiento.
En un ensayo piloto previo desarrollado por nuestro grupo, se observó una correlación inversa
entre los títulos de anticuerpos anti-EGF y los niveles de EGF detectados en sueros de pacientes
de CPCNP avanzado, tratados con dos dosis diferentes de EGF (Ramos y cols. 2006). Sin
embargo, ese estudio carecía de un grupo control que permitiera demostrar que la reducción de
las concentraciones de Cimavax-EGF se debía a la vacunación y no a fluctuaciones naturales de
la concentración de esta molécula en el suero de este tipo de pacientes. En el presente estudio se
demuestra que definitivamente la vacunación con CIMAvax-EGF provocó una disminución de
las concentraciones séricas de EGF pre-existentes en pacientes con CPCNP avanzado. En el caso
del control concurrente no se observa ninguna reducción de los niveles de EGF, sino más bien
niveles elevados de EGF, cuando se compara con el grupo vacunado. Este efecto de la
vacunación sobre la reducción de las concentraciones de EGF fue mucho más rápido y potente
cuando se optimizó el esquema de tratamiento. De hecho, se lograron reducciones hasta valores
inferiores a los límites de cuantificación del juego de reactivos empleado, en el 100 % de los
pacientes evaluados, este resultado no tiene precedentes en ninguno de los ensayos clínicos
realizados anteriormente. En ambos esquemas de tratamiento se encontró una correlación inversa
entre el título de anticuerpos anti-EGF y las concentraciones de EGF en el suero de pacientes
vacunados, después de transcurridos dos meses de tratamiento. Esta correlación se pierde para el
caso de los pacientes tratados con el esquema optimizado por la reducción tan fuerte de las
concentraciones de EGF.
91
Discusión
Por otra parte, se evaluó la posible existencia de una respuesta contra el TGFα y su relación con
la respuesta generada contra el EGF. Según lo descrito en la literatura, el TGFα es uno de los
principales ligandos del REGF y frecuentemente se encuentra sobrexpresado junto al REGF en
tumores de origen epitelial. Esta sobrexpresión conjunta potencia la estimulación autocrina del
crecimiento de las células tumorales (Mulet y cols. 2006). En nuestros pacientes no se encontró
un incremento de los títulos anti-TGFα durante el período de tratamiento con la vacuna. Se sabe
que ambas moléculas (TGFα y EGF) son factores de crecimiento que están relacionadas en
cuanto a estructura y función (Plowman y cols. 1990); que sus estructuras se caracterizan por
presentar tres puentes disulfuro intramoleculares altamente conservados y que ambos son
ligandos del REGF; sin embargo, sus secuencias solamente comparten entre un 30 y un 40 % de
identidad. De hecho, nuestros resultados evidencian que estas moléculas no están
inmunológicamente relacionadas. No obstante, los niveles de esta proteína en el suero de los
pacientes vacunados aumentaron y este aumento estuvo inversamente relacionado con la edad.
En el grupo control no se observaron variaciones, pero debido a las pocas muestras evaluadas no
podemos dilucidar si este comportamiento se debe al efecto de la vacunación o a la evolución
natural de la enfermedad. De conjunto con resultados pre-clínicos previos donde se demuestra la
relevancia de la vacunación basada en TGFα en el bloqueo de la estimulación autocrina del
REGF mediada por este ligando (Mulet y cols. 2006), nuestros resultados sugieren la necesidad
de una inmunización complementaria basada en la molécula de TGFα como una vía para la
potenciación de la respuesta antitumoral en el tratamiento de tumores de origen epitelial.
La dominancia de diferentes epítopos del EGF humano se ha descrito previamente (González y
cols. 2002), asociada a un estudio sobre la autoinmunidad contra el EGF como componente del
homúnculo inmunológico. Los resultados de la evaluación de pacientes vacunados con el
esquema QVV, pre-tratados o no con ciclofosfamida como inmunomodulador, demostraron que
existe reconocimiento de todos lo péptidos ensayados tanto por el suero pre-inmune como por el
suero post-inmune. Sin embargo, los péptidos amino-terminales que cubren las zonas entre los
aminoácidos 1-14 (región N-terminal) y 7-21 (lazo A), fueron reconocidos de manera
preferencial por los anticuerpos naturales, mientras que para la respuesta post-inmunización, el
lazo B (aminoácidos 15-33) de la molécula EGF fue el epítopo inmunodominante (González y
cols. 2002). En el presente estudio se caracterizó la respuesta de anticuerpos específicos
generados contra determinadas regiones de la molécula de EGF, para su evaluación como
92
Discusión
marcador sustituto de la respuesta a la vacunación y para estudiar su interrelación con el resto de
los parámetros inmunológicos evaluados. Aunque la vacunación pudiera inducir una respuesta
parcialmente artefactual contra el EGF humano recombinante utilizado en la vacunación, o
contra algún neo-epítopo formado producto del proceso de conjugación entre el EGF y la
proteína transportadora, nuestros resultados evidencian que con la vacunación se puede inducir
una fuerte respuesta contra la molécula de EGF en humanos. Esta potente respuesta, capaz de
reducir las concentraciones de EGF en el suero de pacientes inmunizados, desplegó un
reconocimiento específico por el lazo B de la molécula de EGF, el cual constituye una región
muy importante, desde el punto de vista estructural, en la interacción del EGF y su receptor
(Richter y cols. 1995). Este resultado se hizo más evidente cuando se optimizó el esquema de
vacunación en el ensayo VQV, donde esta característica de la respuesta se desarrolló en un
mayor número de pacientes y donde se comprueba que, aun con la potenciación de la respuesta
inmune, se requieren varias inmunizaciones para lograr esta especificidad de la respuesta.
Adicionalmente, no se observaron preferencias de la respuesta natural evaluada, previa o postquimioterapia, por ninguna de las regiones representadas por los distintos péptidos ensayados.
Tan relevante como la medición de la magnitud de la respuesta de anticuerpos específicos
lograda con los diferentes esquemas de tratamiento resultó la evaluación de la actividad
biológica de esto sobre la interacción entre el EGF y su receptor, así como la determinación del
período de tiempo que se requiere para lograr una respuesta teóricamente efectiva en la
inhibición de la proliferación tumoral. En estudios previos, las propiedades neutralizantes de los
anticuerpos específicos generados por la vacunación se evaluaron midiendo la capacidad del
suero de inhibir la unión del EGF a su receptor (González y cols. 2003). Esos estudios
describieron la inhibición de la unión del EGF a su receptor en el 95 % de los sueros de los
pacientes clasificados como BR a la vacunación; esto no ocurrió en el grupo clasificado como
MR, donde se constató inhibición solo para el 30 % de los sueros de los pacientes vacunados.
Adicionalmente, se observaron mejores tiempos de supervivencia en el grupo de pacientes
clasificados como BR.
En nuestro estudio se corroboró que el suero de pacientes inmunizados contenía anticuerpos
neutralizantes capaces de inhibir la unión del EGF al REGF. Esto no ocurrió en el caso de los
pacientes no vacunados evaluados. También se encontró una correlación entre la magnitud de la
respuesta de anticuerpos específicos y el porcentaje de inhibición, lo que concuerda con los
93
Discusión
resultados obtenidos en los ensayos previos para el grupo de pacientes clasificados como BR.
Cuando se estudió la cinética de estas respuestas durante el esquema de tratamiento VQV, se
observó que los porcentajes de inhibición aumentaron en el tiempo, incluso durante el período de
quimioterapia (sin vacunación), donde los títulos de anticuerpos se mantuvieron prácticamente
invariables. Al cabo de siete meses de concluida la quimioterapia, se alcanzó una notable
inhibición en el 100 % de los pacientes vacunados. Un hallazgo interesante de nuestro estudio,
fue el hecho de que en ambos esquemas de tratamiento los porcentajes de inhibición
correlacionaron directamente con los niveles de respuesta de anticuerpos contra el lazo B de la
molécula EGF en el período de las reinmunizaciones. Teniendo en cuenta que esta región de la
molécula es clave en la interacción con su receptor, esta relación pudiera explicar la capacidad
neutralizante de los anticuerpos inducidos y también podría poner en consideración la evaluación
de la inmunodominancia como un marcador sustituto de la inhibición entre el EGF y su receptor.
Otra de las formas de evaluar la actividad biológica de los anticuerpos específicos generados con
la vacunación, fue la medición de la capacidad de estos para inhibir la fosforilación del REGF en
presencia del EGF. La evidencia de la relación entre los anticuerpos específicos generados contra
el EGF y la inhibición de la fosforilación del REGF, constituye uno de los resultados más
novedosos del presente estudio. El suero inmune fue capaz de impedir la activación del REGF en
presencia del EGF, en más del 50 % de los pacientes tratados con la vacuna, independientemente
del esquema de tratamiento utilizado. Cuando se estudió la cinética de esta propiedad de la
respuesta inmune específica generada, se confirmó que altos títulos de anticuerpos son
importantes pero no suficientes para impedir la activación del REGF. En este sentido, la
obtención de una respuesta efectiva requiere de tiempo, no solo para lograr una
inmunodominancia contra la región clave en la interacción del EGF y el REGF se vio
previamente, sino también para lograr un elevado porciento de inhibición y un secuestro efectivo
del ligando. En ambos esquemas de tratamientos, se tuvieron diferentes muestras de un mismo
paciente con valores de título de anticuerpos anti-EGF iguales, y sin embargo, los porcentajes de
inhibición de la fosforilación del receptor fueron muy diferentes. Estos hechos revelan la
existencia de una diversidad en la eficacia de los anticuerpos generados que no es totalmente
dependiente de la magnitud del título. De hecho, los resultados sugieren que se necesitan varios
meses de tratamiento para poder lograr una maduración de la respuesta de anticuerpos que
permita neutralizar el EGF con suficiente avidez para impedir su efecto sobre el REGF. En el
94
Discusión
grupo no vacunado no hubo inhibición de la fosforilación del REGF en ninguno de los pacientes
evaluados.
Cuando se evaluó la relación entre las propiedades de la respuesta post-inmune de los pacientes
tratados con el esquema QVV, se observó correlación de la capacidad de inhibir la unión del
EGF al REGF con la magnitud de la respuesta de anticuerpos anti-EGF generada y con la
respuesta de anticuerpos desarrollada específicamente contra el lazo B de la molécula de EGF.
Con los datos obtenidos del ensayo VQV, se demuestra que se necesitan varios meses de
tratamiento para observar estas correlaciones que representan un cambio cualitativo de la
respuesta inmune, y que el cambio pudiera estar asociado a la avidez de los anticuerpos
específicos, logrado con sucesivas inmunizaciones en un período de tiempo determinado.
La relación entre las características de la respuesta inmune anti-EGF y la supervivencia de los
pacientes de CPCNP tratados en ambos ensayos, constituye uno de los resultados más
importantes de este estudio. Numerosas publicaciones describen que no siempre existe relación
entre la respuesta inmune generada tras una vacunación antígeno-específica y el beneficio clínico
de los pacientes tratados (Kim y cols. 2011), aunque paradójicamente existan algunos subgrupos
de pacientes en los que se encuentra esta correlación. Otros informes recientes, destacan el uso
de la inmunoterapia en cáncer como una forma de inducir respuestas clínicas favorables en un
número significativo de pacientes, y plantean la necesidad de identificar biomarcadores
inmunológicos capaces de predecir las respuestas clínicas a determinados tratamientos (Disis
2011). En nuestro estudio, también se observó una relación entre los títulos de anticuerpos y la
supervivencia en todos los pacientes vacunados.
Para el caso del esquema QVV, cuando se analizó la supervivencia de los pacientes en función
de la actividad biológica de la respuesta inmune humoral específica contra el EGF, se encontró
una influencia de tres de los parámetros evaluados. La disminución de la concentración de EGF,
la capacidad de inhibir la unión entre este ligando y su receptor y la inmunodominancia del lazo
B de la molécula de EGF, se relacionaron de manera independiente con mejores supervivencias
de los pacientes tratados. Esto no se observó en el caso de los pacientes no vacunados, lo que
indica que el resultado obtenido en los pacientes inmunizados está asociado a la vacunación. En
el caso particular del ensayo VQV, no se encontró relación entre estos parámetros inmunológicos
95
Discusión
y la supervivencia, debido a que se seleccionaron para el estudio los pacientes con mejores
respuestas de anticuerpos y mayor tiempo de seguimiento después de la quimioterapia.
Cuando los pacientes tratados con el esquema QVV se agruparon para evaluar la supervivencia,
de acuerdo a las características demográficas, se encontraron ventajas para los pacientes
vacunados de hasta 60 años de edad. Esta ventaja no se reprodujo para el caso de los pacientes
del mismo grupo de edad tratados solamente con la quimioterapia estándar. Adicionalmente, se
encontró que dentro del grupo de pacientes BR, y por consiguiente mejores tiempos de
supervivencia (González y cols. 2003), el subgrupo de hasta 60 años de edad tuvo mejor tiempo
de supervivencia que los BR mayores que 60 años. Estos resultados sugieren que, cuando se
emplee el esquema de tratamiento QVV, se obtendrá un efecto favorable para la población de
adultos jóvenes y de mediana edad.
Existe ya un número creciente de información en la literatura internacional (Malaguarnera y cols.
2010; Pawelec y cols. 2010), sobre los cambios que ocurren en el sistema inmune relacionados
con la edad. Se han observado afectaciones en el funcionamiento tanto de células B, como de las
células T. No es sorprendente que las vacunas de cáncer produzcan un efecto terapéutico
principalmente en los pacientes más jóvenes, pues además se ha descrito la existencia de
respuestas reducidas tanto a antígenos extraños como a autoantígenos, y consecuentemente
inmunoglobulinas menos protectoras, de bajos títulos y poca afinidad en individuos envejecidos
(Nicoletti y cols. 1993). Sin embargo, el hecho de haber encontrado una relación entre la edad y
el tiempo de supervivencia, aún dentro del grupo de BR, sugiere que la influencia de la edad no
puede ser atribuida a la capacidad del individuo de generar anticuerpos específicos, sino a la
capacidad funcional de estos o quizás al tiempo que necesita un sistema inmune ordenado de
manera diferente (a consecuencia de la edad) y tratado con quimioterapia para optimizar una
respuesta inmune contra un antígeno propio. Todas estas razones sustentan la necesidad de
evaluar estos elementos asociados a la edad y el funcionamiento del sistema inmune en ensayos
futuros, estratificados por grupos de edad y realizados en un mayor número de pacientes. Al
mismo tiempo, pone en perspectiva que se requiere de una optimización de los esquemas de
tratamiento basados en la inmunoterapia, en función de lograr mayores y mejores respuestas
específicas en los grupos de edades avanzadas, donde se encuentra la mayor incidencia de cáncer
en sentido general (Gravekamp 2007).
96
Discusión
Independientemente de los cambios en el sistema inmune relacionados con el envejecimiento,
existen informes recientes sobre el incremento de las anormalidades asociadas al funcionamiento
del sistema inmune en pacientes con cáncer avanzado (Chen y cols. 2009) extensamente tratados
con quimioterapia. En estas circunstancias, la integridad del sistema inmune se deteriora debido
a la disminución en los niveles de células T CD4 funcionales, tanto vírgenes como de memoria
-
central, y una expansión de poblaciones T CD28 específicas contra el CMV, que en su mayoría
se encuentran en un estado de diferenciación terminal y por lo tanto, no funcionan efectivamente
(Chen y cols. 2009). Adicionalmente, se sabe que cuando el sistema inmune se recupera de la
leucopenia inducida por la quimioterapia, en periferia ocurre una expansión preferencial de los
linfocitos específicos por antígenos previamente reconocidos por el sistema inmune (Mackall y
cols. 1994; Mackall y cols. 1997a; Mackall y cols. 1997b), como por ejemplo el CMV. Estos
hechos sustentan la idea de combinar la quimioterapia con la inmunoterapia, mediante la
vacunación previa a la quimioterapia para condicionar la expansión de una respuesta especifica
una vez finalizada la quimioterapia estándar.
En el ensayo VQV se introdujeron varios cambios simultáneos con respecto a los esquemas
usados anteriormente: aumento de dosis, diferentes sitios de inyección, frecuencia de
administración y vacunación previa a la quimioterapia. De modo que, no es posible atribuir la
potenciación de la respuesta inmune específica observada a ninguno de estos cambios en
particular. El hecho de lograr con el esquema de tratamiento VQV que la mayoría (80 %) de los
pacientes se convirtieran en BR en solo un mes, y que el 95 % alcanzara esta condición en
alrededor de tres meses de tratamiento, no se correspondió con una mejor supervivencia postquimioterapia, si se compara con el grupo de pacientes tratados con el esquema QVV. Este
resultado indica que ser BR es una condición necesaria pero no suficiente para lograr una mayor
supervivencia con este esquema de tratamiento (VQV). En línea con los resultados descritos
previamente, esto sugiere la necesidad de determinado tiempo y/o quizás de una condición
clínica pre-existente para lograr respuestas inmunológicas potencialmente más protectoras en
pacientes de CPCNP en estadios avanzados, tratados con los esquemas de tratamientos
actualmente utilizados. No obstante, sí se pudo corroborar que la magnitud de la respuesta
humoral específica por el EGF, tiene una marcada influencia en la supervivencia, en cualquiera
de los esquemas de tratamiento utilizados. Los pacientes SBR, mostraron tiempos de
97
Discusión
supervivencia significativamente superiores al resto de los pacientes tratados con el esquema
VQV, e incluso superiores a los de los BR del ensayo QVV.
También se demostró que los pacientes que tenían mayores concentraciones de EGF en el suero
antes de comenzar el tratamiento con el esquema VQV, se beneficiaron con una supervivencia
significativamente mayor que los de menor concentración de EGF. Desafortunadamente, como
fue un estudio piloto no se contaba con un grupo control concurrente, y no se pudo evaluar si la
concentración de EGF inicial solo tiene un valor predictivo de la respuesta a la vacunación o si
también tiene alguna relación con la evolución de los pacientes no vacunados.
Este hallazgo, dirige la atención hacia la importancia del estudio de la función y la relevancia de
los niveles de la molécula de EGF en los distintos momentos del curso de la enfermedad, y a su
relación con la efectividad del esquema de tratamiento aplicado. Hasta el momento no existen
informes en la literatura sobre los niveles de EGF en sueros de pacientes de CPCNP tratados con
quimioterapia. De hecho, el único informe sobre determinación de concentraciones de EGF en
suero de pacientes de CPCNP, fue descrito para pacientes no tratados en estadios IIIa, IIIb y IV,
y, contradictoriamente con nuestros datos y con los publicados para otras neoplasias como
carcinoma papilar de tiroides (Konturek y cols. 2005) y cáncer pancreático (Meggiato y cols.
1999), los niveles de EGF detectados fueron significativamente menores que los determinados en
una población sana usada como control (Lemos-González y cols. 2007).
La evaluación de la sobrexpresión de otros ligandos (anfirregulina y TGFα) del REGF en
CPCNP y su no relación con la progresión tumoral ha sido descrita desde hace más de 10 años
(Rusch y cols. 1993; Rusch y cols. 1997). Otros estudios más recientes sugieren que los niveles
de ambos ligandos en el suero de este tipo de pacientes pueden ser un predictor importante de la
resistencia a la terapia con gefitinib (Ishikawa y cols. 2005). La carencia de estudios similares
con la molécula de EGF, los altos niveles de este ligando en el suero pre-inmune de pacientes
incluidos en nuestro estudio y la relación de los niveles de EGF con la supervivencia de los
pacientes tratados, señalan la necesidad de realizar estudios más profundos sobre los niveles de
estos ligandos del REGF en el suero pre-inmune de pacientes de CPCNP vacunados con
CIMAvax-EGF, así como su correlación con la supervivencia de los mismos. Adicionalmente,
sería muy interesante medir los niveles de esta molécula en diferentes etapas del curso de la
enfermedad y/o tratamiento de nuestros pacientes de CPCNP versus población cubana sana. Este
98
Discusión
tipo de mediciones nos permitirán evaluar si este biomarcador tiene un valor diagnóstico o
pronóstico, o si tan solo posee un valor predictivo de la respuesta a la vacunación en un escenario
determinado.
En resumen, los resultados de esta tesis aportan elementos sobre el mecanismo de acción de la
vacuna CIMAvax-EGF, al identificar el efecto de la vacunación en los títulos de anticuerpos
específicos anti-EGF y en la reducción de los niveles de EGF circulantes; así como el efecto de
estos anticuerpos en la inhibición de la unión del ligando al receptor y en la inhibición de la
fosforilación del R EGF. Estos resultados también confirman la importancia de realizar sucesivas
inmunizaciones para lograr altos títulos de anticuerpos específicos que sean suficientes para
incrementar la supervivencia de los pacientes vacunados.
Aún quedan interrogantes abiertas para continuar ampliando el conocimiento sobre esta nueva
opción terapéutica. En general, se evidencia la necesidad de estudios posteriores con un mayor
número de pacientes, utilizando ambos esquemas de tratamientos u otras combinaciones
terapéuticas. El objetivo de estos estudios sería dilucidar cuáles son los cambios o combinaciones
clave para lograr una optimización de los esquemas de tratamiento y, en consecuencia, una
respuesta inmune efectiva que permita la protección del mayor número de pacientes posibles.
Otros esquemas terapéuticos basados en la vacunación antígeno-específica están siendo
evaluados en pacientes con CPCNP. Entre ellos, la vacuna L-BLP25, basada en el antígeno
tumoral mucina 1, y la vacuna MAGE-A3 (antígeno 3 asociado a melanoma), constituyen
inmunoterapias prometedoras para el tratamiento de esta patología, y se están evaluando
actualmente en ensayos clínicos fase III diseñados para documentar el beneficio clínico de estas
terapias con relación a las terapias ya establecidas. Para maximizar el efecto de estas estrategias
en pacientes con cáncer de pulmón, será crucial determinar la población de pacientes que pudiera
beneficiarse con cada una de estas nuevas terapias (Shepherd y cols. 2011) y la combinación
terapéutica necesaria para cada población.
La necesidad de optimizar los esquemas de tratamiento en el caso particular de los ancianos,
requiere atención especial si se considera que un gran número de pacientes con CPCNP está
representado por personas mayores de 60 años. En la mayoría de estos individuos, el sistema
inmune ha experimentado una estimulación antigénica crónica a lo largo de la vida y posee
características diferentes al de un individuo joven, lo cual dificulta la respuesta de esta población
99
Discusión
a nuevos retos antigénicos (García B 2006). Estos hechos, sumados a los efectos devastadores de
la quimioterapia sobre el sistema inmune (Chen y cols. 2009) o a la no posibilidad de su uso de
forma óptima en individuos envejecidos, sustentan la necesidad de estudios más minuciosos de
las características del sistema inmune y su funcionamiento en este grupo de pacientes, así como
del efecto de la quimioterapia sobre el sistema inmune de pacientes oncológicos avanzados en
los diferentes grupos de edades. De esta manera, se podrán diseñar ensayos apropiados para
dilucidar cuáles son los mejores esquemas de tratamiento para lograr una inmunoterapia efectiva
en pacientes oncológicos de edades avanzadas.
Por otra parte, el microambiente tumoral, con sus estrategias de inmunosupresión, puede
restringir la efectividad de las respuestas antitumorales (Drake y cols. 2006). Aún existen más
preguntas que respuestas sobre la interacción entre el sistema inmune y el tumor, así como sobre
las interacciones y la jerarquía de diferentes mecanismos tolerogénicos y/o supresores y su
impacto en la inmunoterapia de cáncer. Por lo que sería crítico determinar la eficiencia de
estrategias combinadas que involucren el bloqueo de diferentes señales inhibitorias (PD1/PDL1,TGFβ, IL-10,VEGF) junto con la quimioterapia convencional, la vacunación o la
transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos efectores (Rabinovich y cols. 2007). La
remoción de las señales inhibitorias en el microambiente tumoral, en combinación con nuestra
estrategia terapéutica, pudiera ser un escenario futuro para revertir la tolerancia inmunológica,
principalmente en el subgrupo de pacientes envejecidos y/o inmunosuprimidos que aún no logra
responder adecuadamente a la vacunación.
Otro de los aspectos importantes a verificar en ensayos futuros es el uso de los anticuerpos
naturales específicos por el EGF y las concentraciones de este factor de crecimiento en el suero
de pacientes vírgenes o no de tratamiento con la quimioterapia, como marcadores predictivos o
pronósticos de la evolución de los pacientes de CPCNP. La consolidación de evidencias en este
sentido sería muy útil para la identificación y selección del tipo de pacientes tributarios de los
esquemas de tratamientos propuestos en nuestros estudios.
Todas estas observaciones, sumadas a la validación del concepto de la castración inmunológica
del EGF y la baja toxicidad del tratamiento, sustentan el uso de la vacuna CIMAvax-EGF como
una alternativa terapéutica para el tratamiento de pacientes con CPCNP avanzado, así como la
evaluación de los esquemas de tratamiento utilizados en este estudio, en futuros ensayos clínicos
100
Discusión
donde se incluyan un mayor número de pacientes de CPCNP u otros tipos de tumores de origen
epitelial. La naturaleza crónica de la fase de mantenimiento en este tipo de régimen terapéutico,
pudiera contribuir al manejo futuro del cáncer de pulmón avanzado como una enfermedad
crónica y de esta forma mejorar la calidad de vida de los pacientes con tumores de origen
epitelial en estadios avanzados.
101
Conclusiones
6.
CONCLUSIONES
1. La vacuna CIMAvax-EGF administrada en combinación con la quimioterapia en dos
esquemas de tratamiento diferentes (QVV y VQV) es inmunogénica y reduce la
concentración de EGF sérico en pacientes con carcinoma de pulmón de células no
pequeñas.
2. La vacunación con CIMAvax-EGF induce altos títulos de anticuerpos neutralizantes,
capaces de impedir la activación del REGF mediada por el EGF, los que confieren
ventajas de supervivencia a los pacientes tratados.
3. El incremento en la supervivencia de los pacientes menores de 61 años, tratados con el
esquema QVV, se asocia con el aumento de las concentraciones de TGF en el suero
inmune, lo que sugiere que la neutralización del EGF puede desencadenar la secreción de
otros ligandos del REGF.
4. La capacidad neutralizante de los anticuerpos inducidos por la vacuna CIMAvax-EGF, se
asocia con la inmunodominancia del lazo B en la molécula de EGF y aumenta
considerablemente con el tiempo de tratamiento si se emplea el esquema VQV.
5. Con el esquema de tratamiento VQV, se incrementa el porcentaje de pacientes buenos
respondedores y se obtiene una notable reducción de las concentraciones de EGF con
menos tiempo de tratamiento, lo que le proporciona ventajas sobre el esquema QVV.
102
Recomendaciones
7.
RECOMENDACIONES
1. Extender el uso de ambos esquemas de vacunación (QVV y VQV) con CIMAvax-EGF
en pacientes con cáncer de pulmón avanzado y continuar evaluando, en nuevos ensayos
clínicos, variantes de optimización del esquema de inmunización con esta vacuna.
2. Profundizar en la relevancia de la secreción y expresión de otros ligandos del REGF,
como la anfiregulina y el TGFα como mecanismo de escape del tumor a la terapia con
CIMAvax-EGF en pacientes de cáncer.
3. Estudiar la evolución de la avidez de los anticuerpos anti-EGF generados durante la
vacunación y su relación con la actividad biológica de los mismos sobre la interacción del
EGF con su receptor.
4. Ampliar los datos sobre los títulos de anticuerpos naturales y la concentración de EGF
sérico e introducir nuevas mediciones tales como los marcadores de inmunosenescencia
para identificar predictores de la respuesta a la vacunación y la supervivencia.
103
Referencias Bibliográficas
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Anexos
9.
ANEXOS
Anexos
Anexo I. Esquemas de inmunización de ambos ensayos, Fase II (QVV) y Piloto V (VQV).
QVV
QT 1ra línea
(4-6 ciclos)
Vac
: 50µg
Vac:
50 µgEGF
FCE
11sitio
sitiodedeinyección
inyección
Cy
Vac
-3
0
Vac
7
Vac
Vac
Vac
14
28
56
inmunizaciones
mensuales
1 mes
Post QT
Ciclofosfamida (Cy) :200 mg/m2
VQV
optimizado
Vac:200µg
200 gEGF
FCE
Vac:
44sitios
sitiosdedeinyección
inyección
Cy
Vac
Vac
-3
0
14
Cy
32
QT 1ra línea
(4-6 ciclos)
1 mes
Post QT
Vac
inmunizaciones
mensuales
+ 3 días
Post CY
Anexos
Anexo II. Cronograma de evaluaciones clínicas en el ensayo Fase II (QVV).
Pruebas
Antecedentes
Diagnóstico
Anat. Patol.
Examen
Físico
Test de
embarazo
Hematología
Bioquímica
Sanguínea
Estudios de
orina
Biopsia
TAC
(Pulmón)
Rx de Tórax
Ultrasonido
Abdominal
Calidad de
vida
Día
0
Día
1
Día
4
Día
11
Día
18
Día
25
Día Mes
55
3
X
X
X
X
X
X
Mes
4
Mes
5
Mes
6
Mes
7
Mes
8
Mes
9
Mes
10
Mes
11
Mes
12
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Anexos
Anexo III. Cronograma de evaluaciones inmunológicas del ensayo QVV.
Prueba
Ciclofosfamida
CIMAvax
EGF
Respuesta
humoral
(Suero)
Día
0
Día
1
Día
4
Día
11
Día
18
Día
25
Día
55
Mes
3
Mes
4
Mes
5
Mes
6
Mes
7
Mes
8
Mes
9
Mes
10
Mes
11
Mes
12
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Anexos
Anexo IV. Cronograma de evaluaciones clínicas en el ensayo piloto V (VQV).
Prueba
Antecedentes
Diagnóstico
Anat. Patol.
Examen
Físico
Test de
embarazo
Día Día Día Día Día
0
1
4
18 32
Día
29
post
PQT
Día Mes Mes Mes Mes
Mes Mes
Mes 6
32
2
3
4
5
7
8
post
post post post post post
post post
PQT
PQT PQT PQT PQT PQT
PQT PQT
Mes Mes Mes
9
10
11
post post post
PQT PQT PQT
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Hematología
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Bioquímica
Sanguínea
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Estudios de
orina
Biopsia
PQT
TAC
(Pulmón)
Rx de Tórax
Ultrasonido
Abdominal
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Anexos
Anexo V. Cronograma de evaluaciones inmunológicas del ensayo VQV.
Prueba
Ciclofosfamida
CIMAvax-EGF
Respuesta
humoral (Suero)
Día Día Día Día Día
0
1
4
18 32
X
X
X
PQT: post-quimioterapia
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Anexos
Anexo VI. Regiones de la molécula de EGF evaluadas en el estudio de inmunodominancia de la
respuesta de anticuerpos anti-EGF.
N-terminal
Lazo A
Lazo B
Lazo C
C-C-teminal
C-terminal
hu-EGF
P 1-14
P 7-21
P 15-33
P 34-54
P 34-46
P 44-54
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CVVGYIGERCQYRDLKWWELR
CVVGYIGERCQYR
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AUTOBIBLIOGRAFÍA
Publicaciones de la autora relacionadas con el tema de la tesis.
1. García, B., y cols., Effective inhibition of the epidermal growth factor/epidermal growth
factor receptor binding by anti-epidermal growth factor antibodies is related to better
survival in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with the epidermal
growth factor cancer vaccine. Clin. Cancer. Res. 2008. 14(3): p. 840-6.
2. Neninger Vinageras, E., de la Torre A., Osorio Rodríguez M., Catalá Ferrer M., Bravo I.,
Mendoza del Pino M., Abreu Abreu D., Acosta Brooks S., Rives R., del Castillo Carrillo
C., González Dueñas M., Viada C., García Verdecia B., Crombet Ramos T., González
Marinello G, and Lage Dávila A. Phase II randomized controlled trial of an epidermal
growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2008.
26(9): p. 1452-8.
3. Neninger, E., García, B., y cols., Combining an EGF-based cancer vaccine with
chemotherapy in advanced nonsmall cell lung cancer. J. Immunother. 2009. 32(1): p.929.
Presentaciones en eventos científicos relacionados con el tema de la tesis.
1. ASCO Annual Meeting 2003 (USA)
2. ASCO Annual Meeting 2004 (USA)
3. ASCO Annual Meeting 2005 (USA)
4. International Workshop “Immunotherapy for the new century”. C. Habana, Cuba, Nov2004. Poster.
5. International Workshop “Targeting complexity“. C. Habana, Cuba, Nov-2006.
Presentación oral.
6. EORTC .Praga, República Checa, 2006. Poster.
7. EACR20. Lyon, Francia, 2007. Poster.
8. Taller Internacional de Inmunoterapia C. Habana, Cuba, Nov-2008. Presentación Oral.
9. 20 EORTC-NCI-AACR Simposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics,
Ginebra, Suiza 2008
10. I International Meeting of EGF Vaccine: CIMAvax-EGF®. Havana, CUBA, 2008.
Presentación Oral.
11. 2011 Scientific Colloquium of the Cancer Immunotherapy Consortium, titled “Schedule
and Dose for Combination Therapy”. Washington, USA Marzo 2011.
Otras publicaciones de la autora:
1. G. González, T. Crombet, F. Torres, M. Catala, L. Alfonso, M. Osorio, E. Neninger, B.
García, A. Mulet1, R. Pérez & A. Lage. Epidermal growth factor-based cancer vaccine
for non-small-cell lung cancer therapy. Ann. Oncol. 2003. 14(3): p. 461-6.
2. A Casacó, Y. Díaz, N. Ledón, N. Merino, O. Valdés, G. García, B. García, G. González,
and R. Pérez. Effect of an EGF-cancer vaccine on wound healing and inflammation
models. J. Surg. Res. 2004. 122(1): p. 130-4.
3. T. Crombet, E. Neninger, M. Osorio, M. Catala, A. Torre, I. Leonard, B. Garcia, G.
González, R. Pérez , A. Lage. Vaccination with epidermal growth factor (EGF) for non
small cell lung cancer (NSCLC) therapy: Preliminary results from a randomized phase II
clinical trial. Journal of Clinical Oncology, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings
(Post-Meeting Edition). Vol 22, No 14S (July 15 Supplement), 2004: 2514
4. E. Neninger, T. Crombet, M. Osorio, M. Catala, A. Torre, I. Leonard, B. García, P.
Marinello, G. González, A. Lage. Vaccination with EGF active immunotherapy improves
survival in advanced non small cell lung cancer (NSCLC) patients: interim analysis of a
randomized Phase II trial. Journal of Clinical Oncology, 2005 ASCO Annual Meeting
Proceedings. Vol 23, No. 16S, Part I of II (June 1 Supplement), 2005: 7210
5. T. Crombet, E. Neninger, M. Catalá, B. García, I. Leonard, L. Martínez, G. González,
R.Pérez Rodríguez, A. Lage. Treatment of NSCLC patients with an EGF-based cancer
vaccine: report of a Phase I trial. Cancer Biol. Ther. 2006. 5(2): p. 145-9.
6. García B, Lage.A., Inmunosenescencia: implicaciones para la inmunoterapia de cáncer
en los adultos mayores. Biotecnología Aplicada 2006. 23: p. 186-193.
7. Rodríguez G, Albisa A, Viña L, Cuevas A, García B, García AT, y cols. Manufacturing
process development for an epidermal growth factor based cancer vaccine. Bio-pharm.
Int. Vaccines Suppl. Octubre 2008.