Download Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología

UNIVERSIDAD DE GRANADA
LIBRO DE PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
3 E INMUNOLOGÍA
La realización y presentación de este cuaderno de prácticas es
obligatoria.
El alumno debe responder a las preguntas que figuran al final de cada práctica
y entregar las hojas (1 hoja de la primera práctica y 2 de la segunda) al
profesor de prácticas correspondiente.
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA Nº 1
IDENTIFICACIÓN DE ÓRGANOS
LINFOIDES Y EXTRACCIÓN DE
LINFOCITOS
ENSAYO DE FAGOCITOSIS DE
MACRÓFAGOS PERITONEALES
OBJETIVOS PRINCIPALES



Identificación de los órganos linfoides primarios y secundarios en ratón.
Obtención de linfocitos procedentes de bazo de ratón.
Estudio de la función principal del macrófago en la repuesta inmunitaria innata y
adaptativa:
- como célula presentadora de antígeno
- como célula fagocítica.
OBJETIVOS SECUNDARIOS:


Utilización de la cámara de Neubauer y microscopio para el contaje de
linfocitos.
Diferenciar linfocitos vivos y muertos mediante el uso de azul tripán.
INTRODUCCIÓN
ÓRGANOS LINFOIDES (Fig. 1):
La presente práctica nos va a permitir identificar los órganos linfoides primarios
o centrales y los órganos linfoides secundarios o periféricos de ratón. Dentro de los
órganos linfoides primarios nos encontramos con el TIMO y la MÉDULA OSEA, los
órganos secundarios o periféricos son el BAZO, los GANGLIOS LINFÁTICOS y el
TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A MUCOSAS, como las placas de Peyer
(agregados de tejido linfoide que no forman órganos encapsulados propiamente dichos).
MÉDULA ÓSEA: Lugar donde se generan las células sanguíneas circulantes del adulto,
y donde tiene lugar de maduración de los linfocitos B.
TIMO: Órgano bilobulado situado en la parte superior de la cavidad torácica. Aparece
completamente desarrollado en el tercer mes de gestación. Aquí se produce la
diferenciación de los timocitos hasta linfocitos T maduros y funcionales que saldrán a
los tejidos linfoides periféricos.
BAZO: El bazo es el principal órgano donde se producen las respuestas inmunitarias
frente a los antígenos transportados en la sangre. Se sitúa detrás del estómago y cerca
del diafragma.
TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A MUCOSAS: Las superficies mucosas de los
tractos respiratorio y gastrointestinal, al igual que la piel, están colonizados por
linfocitos y células accesorias que permiten al organismo responder de forma óptima a
los antígenos inhalados e ingeridos.
GANGLIOS LINFÁTICOS: Son redondeados, presentan un área de células B
(folículos linfoides primarios y secundarios) y un área de linfocitos T. Entre ellos se
encuentran los ganglios cervicales, inguinales y axilares.
FIGURA 1. ÓRGANOS LINFOIDES HUMANOS
FIGURA 2. ORGANOS LINFOIDES EN EL RATÓN
ÓRGANOS PRIMARIOS
GENERADORES O
CENTRALES
ÓRGANOS
SECUNDARIOS O
PERIFÉRICOS
ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN (Fig. 2):
Al abrir el ratón intentaremos encontrar los ganglios linfáticos inguinales, los
cuales se observarán como pequeños puntos blancos (o durezas) en las uniones de los
vasos sanguíneos. A continuación, cortando el peritoneo podemos observar en la parte
derecha del ratón y detrás del estómago el bazo que es de color rojizo debido a la gran
cantidad de hematíes que contiene, de forma alargada, es fácilmente distinguible (no
confundirlo con el hígado). Desenrollando el intestino del ratón, distinguiremos las
placas de Peyer que se podrán observar como unos pequeños gránulos sobre el intestino
delgado.
A continuación, rompiendo el esternón, observaremos en la parte superior del
corazón un órgano de color blanco bilobulado que no hay que confundir con los
pulmones. Este órgano es el timo. En ocasiones los dos lóbulos se encuentran muy
juntos por lo que da el aspecto de presentar un único lóbulo. A la hora de romper el
esternón hemos de tener cuidado para no romper el corazón y evitar de esta forma que
se produzca una hemorragia que nos impediría distinguir el timo y los pulmones con
facilidad. Los pulmones, situados al lado del corazón, se verán colapsados debido a que
presentan presión negativa, presentan color rosáceo.
CÉLULAS FAGOCÍTICAS: MACRÓFAGOS
El sistema inmunitario innato reconoce un grupo de patrones moleculares
altamente conservados comunes a numerosos patógenos. Los fagocitos poseen
receptores de superficie que han sido seleccionados evolutivamente para reconocer estas
estructuras antigénicas altamente conservadas, por lo que los individuos de cada especie
nacen con la capacidad innata de reconocer y fagocitar numerosos microorganismos, sin
previa exposición. Los fagocitos se clasifican en mononucleares y polimorfonucleares.
Los mononucleares se localizan en sangre en forma de monocitos, pasando a
los órganos y tejidos al cabo de tres o cuatro días, desde que abandonaron la médula
ósea. En esta maduración dan lugar a los macrófagos, que formaran la red o sistema
mononuclear o fagocítico, localizado en los lugares donde los microorganismos pueden
acceder al huésped: tejido conectivo subepitelial (piel, mucosas), vasos sanguíneos de
sinusoides del hígado y el bazo (sangre), y en los órganos linfoides. Constituyen la
primera línea de defensa frente a las infecciones. En determinados órganos y tejidos
adquieren morfología y funciones especializadas, recibiendo nombres específicos. En el
hígado son las células de Kupffer, en el sistema nervioso central son las células de la
microglia, en riñón son las células mesangiales, en el hueso son los osteoclastos, en las
articulaciones son las células A sinoviales y en las vías pulmonares son los macrófagos
alveolares.
Los receptores de los macrófagos reconocen estructuras bioquímicas muy
diferentes pero especificas de un grupo de patógenos y que generalmente forman parte
de moléculas que son esenciales para la supervivencia o patogenicidad del
microorganismo.
Los receptores de los macrófagos son de dos tipos: endocíticos y de
señalización.
Receptores endocíticos: el reconocimiento de un antígeno a través de los mismos
supone la internalización de este y la fusión con lisosomas que permiten la destrucción
del patógeno. Entre ellos se encuentra el receptor CD14 para el lipopolisacárido
bacteriano (LPS), que está anclado a la membrana plasmática a través de una cola de
glicofosfatidilinositol; los receptores “scavenger” o depuradores (SR); y la familia de
receptores lectinas tipo C (CLR). El reconocimiento a través de estos receptores puede
ser directo o mediado por complejos multiméricos, como es el caso del reconocimiento
del LPS mediante el complejo formado por las moléculas solubles LBP (proteína de
unión a LPS) y MD2 y la molécula de membrana CD14.
Otros receptores endocíticos reconocen moléculas propias que rodean al
patógeno, como son los FcR o los receptores del complemento (CR1, CR3 y CR4). El
proceso realizado a través de estos receptores se denomina opsonización. A través de
sus receptores para las moléculas como la fosfaditil serina identifican células dañadas,
envejecidas o en apoptosis, y así limpian al organismo de las células no útiles.
Receptores de señalización: a través de estos receptores se activan gran cantidad
de genes del sistema inmunitario que ponen en funcionamiento la respuesta inmunitaria:
desarrollo de la respuesta inflamatoria y activación de linfocitos. Incluyen los receptores
tipo Toll o receptores TLR; la familia de receptores tipo NOD (dominios de
oligomerización de unión a nucleótidos) o receptores NLR; y los receptores tipo RIG-1
(gen I inducible por ácido retinoico) o receptores RLR. Estos receptores están
implicados en la activación celular en respuesta a diferentes motivos microbianos
(PAMPs) tales como proteínas, glicanos, lipoproteínas o ácidos nucleicos. Pueden
encontrarse en la superficie celular o a nivel intracelular
La principal función de los macrófagos es la fagocitosis. Una vez internalizado
el antígeno en una vesícula de fagocitosis, ésta se fusiona al lisosoma dando lugar al
fagolisosoma, donde actúan distintas especies reactivas del oxígeno permitiendo una
explosión respiratoria que destruirá al patógeno, degradándolo a péptidos menores que
son expresados en la superficie celular del macrófago unidos a las moléculas de clase II
(MHC II), a través de las cuales se activarán los linfocitos T CD4+ colaboradores. Por
eso los macrófagos funcionan como células presentadoras de antígeno. Algunas
citoquinas producidas por los linfocitos T activados participan en la activación de los
linfocitos B. A su vez, los linfocitos B activados producen y liberan anticuerpos
específicos frente a antígenos que pueden adherirse a los propios antígenos de los
microorganismos o de células infectadas por virus y así facilitan la fagocitosis por parte
de los macrófagos (opsonización). La actividad fagocítica de los macrófagos puede ser
incrementad por INF-γ, producido por células Th1, induciendo una mayor producción
de agentes oxidantes y potenciando la formación de fagolisosomas.
Los macrófagos además de fagocitar microorganismos y células infectadas o
muertas, participan en otros fenómenos fisiológicos como:


Hemostasia: el macrófago produce una serie de substancias que participan en la
coagulación como son: proteína C, trombomodulina, factor tisular, factor VII,
factor XIII y el inhibidor del activador del plasminógeno.
Inflamación.
Por tanto, los macrófagos participan en primer lugar como uno de los componentes
de la inmunidad innata a través de su actividad fagocítica y de su participación en el
proceso inflamatorio y al mismo tiempo activan los mecanismos de la inmunidad
adaptativa como células presentadoras de antígenos (MHC II).
MATERIAL Y REACTIVOS
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Ratones.
Papel de filtro.
Pipetas Pasteur de plástico.
Tubos de ensayo.
Material quirúrgico: pinzas, tijeras, guantes.
Agujas y jeringas.
Contenedores punzantes.
Alcohol de 96º
Botes de 100 ml.
Placas de Petri.
Micropipetas.
Cámaras Chamber Slides
PBS (tampón fosfatos).
Medio RPMI.
Azul tripán.
Cámara de Neubauer.
Cubreobjetos.
Agua destilada.
Incubador de CO2.
Bolas de látex.
Cubetas de tinción
Fijador, soluciones de tinción hematoxilina/eosina
Solución de montaje.
Microscopios.
Cámaras Chamber Slides
Slides
PROTOCOLO
EXTRACCIÓN DE MACRÓFAGOS PERITONEALES
1º) Sacrificar el ratón (previamente anestesiado) mediante dislocación cervical. Para ello
situamos una mano sobre la nuca y con la otra tiramos del rabo hacia atrás, presionando
la nuca hacia abajo.
2º) Colocar el ratón de espaldas sobre el papel de filtro.
3º) Hacer un pequeño corte en la piel del ratón con la tijera a la altura del abdomen.
4º) Retirar la piel con los dedos.
5º) Distinguir los ganglios linfáticos inguinales y si es posible los axilares.
6º) Introducir aproximadamente 6 ml de medio de cultivo (RPMI) con jeringa y aguja
en el peritoneo del ratón; a continuación, dar un pequeño masaje en el abdomen.
7º) Tras el masaje (un par de mins), con la misma jeringa y aguja se extrae el medio de
cultivo, que contendrá la población celular del peritoneo y se deposita en un tubo de
ensayo.
8º) Se enrasa con PBS hasta 10 ml y se pone a centrifugar aprox. A 1500-1600 rpm
durante 15 mins.
DISECCIÓN DEL RATÓN
9º) Abrir el peritoneo y localizar:
- El bazo, extraerlo y depositarlo en una Placa de Petri con aprox. 6 ó 7 ml de
PBS.
- Extraer el intestino desenrollándolo, y extendiéndolo para localizar las
placas de Peyer.
10º) A continuación, abrimos el tórax, y localizamos el timo, situado sobre el corazón,
es un órgano bilobulado, grisáceo y bastante desarrollado debido a la juventud del ratón.
En este punto se termina la disección (se desecha el ratón).
- El bazo sigue cubierto de PBS y se puede empezar a disgregar.
- A la vez, se continúa con el tubo de ensayo (células del peritoneo) que está
en la centrífuga.
PREPARACIÓN DE LA PRIMERA INCUBACIÓN DE LOS MACRÓFAGOS
11º) Del tubo de ensayo, se desecha el sobrenadante y nos quedamos con el pellet
(sedimento en la parte inferior del tubo). Éste sedimento se resuspende y se añaden 1.7
ml de RPMI.
12º) En la cámara Chamber Slides, poner 200 μl en cada pocillo y taparla.
13º) Poner la cámara a incubar en la estufa de 37ºC y 5% de CO2 durante aprox. 30-40
mints.
OBTENCIÓN DE CÉLULAS DEL BAZO
14º) Tras la disgregación se recoge con Pipeta Pasteur de plástico el sobrenadante y se
coloca en un tubo de ensayo, se enrasa a 10 ml.
15º) Centrifugar 15 mints. A 1500 rpm.
16º) Retirar el sobrenadante y quedarse con el pellet o sedimento celular.
17º) Resuspender el sedimento y añadir 1 ml de PBS.
18º) Hacer una tinción con Azul de Tripán al 1/10 (suspensión celular/azul tripán).
19º) Preparar la CÁMARA DE NEUBAUER con un cubre-objetos y colocar 10 l de la
mezcla (suspensión celular/azul tripán). (Ver último apartado: “Contaje en Cámara de
Neubauer”).
20º) Contar los linfocitos al microscopio.
- Localizar la cuadrícula (cámara de Neubauer) y los linfocitos con el objetivo
10x.
- Pasar al objetivo 40x para el contaje.
21º) Aplicar la fórmula de la cámara para saber qué cantidad de linfocitos viables hemos
obtenido
PREPARACIÓN DE LA SEGUNDA INCUBACIÓN DE LOS MACRÓFAGOS
22º) Sacar del incubador la cámara Slides y lavar los pocillos con PBS y Pipeta Pasteur,
3 veces, evitando tocar el fondo del pocillo.
23º) Añadir 200 μl por pocillo de medio RPMI.
24º) De una solución de partículas de látex al 1% en PBS, poner en cada pocillo 20 μl.
25º) Incubar durante 30 mints. a 37º C.
26º) Retirar las celdillas de la placa y lavar el exceso de bolitas de látex con PBS.
TINCIÓN DE LA PREPARACIÓN
27º) Con cestilla y cubeta:
- Fijar las células con metanol (inmersión 5 veces)
- Teñir con eosina (inmersión 5 veces)
- Teñir con azul de metileno (inmersión 5 veces)
28º) Lavar con agua destilada y esperar que se seque la preparación.
29º) Observar al microscopio (óptica 40x) como los macrófagos fagocitan.
Macrófagos teñidos con hematoxilina/eosina.
CONTAJE EN CÁMARA DE NEUBAUER
El contaje de células en cámaras con cuadrículas se utiliza con bastante
frecuencia en inmunología experimental, y también en algunas determinaciones clínicas
(ej. tipaje HLA serológico). Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad
de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas células que son viables. Para
determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la
relativamente simple cámara de contaje celular, de la que existen numerosas variantes
entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de
contaje celular. El contaje con cámaras nos proporciona un método para contar células
efectivo y de bajo coste. Existen distintos tipos de cámaras que fundamentalmente
varían en el tipo de cuadrícula y el volumen que admiten.
La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de cristal en forma de
porta, cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje
longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hayan sobreelevadas 0´1 mm con
respecto a la central, y en esta última hay grabado un retículo cuadrangular. La banda
central puede estar, a su vez, subdividida en dos semibandas idénticas y separadas por
un surco paralelo al eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas
hay grabado un retículo idéntico.
Estos retículos constan de 4 cuadrantes o cuadros grandes idénticos, situados en los
cuatro vértices, que a su vez están divididos en 16 cuadritos iguales y que se utilizan
para el contaje de los linfocitos. Además existe un cuadrante central con mayor nº de
divisiones que se utiliza para el recuento de eritrocitos.
Como la longitud de cada uno de los lados de los cuadrantes es de 1 mm, y la
altura del espacio comprendido entre la superficie de la cámara y el cubre es de 0´1mm,
el volumen del área del cuadrante será:
1mm x 1mm x 0.1 mm = 0.1mm3 = 0.1l = 10-4 ml
Lectura y cálculo de la concentración celular:
Para contar los linfocitos viables se coloca un cubreobjetos sobre la zona de la
cámara que tiene la cuadrícula y colocamos 10 l de la mezcla de azul tripán y la
suspensión celular entre el cubre y la cámara de Neubauer, situando la punta de la pipeta
de tal forma que toque el borde superior del cubreobjetos dejándola penetrar por
capilaridad.
El contaje de la muestra se realiza como se observa en la Fig.3. En ella se ve un
cuadrante a gran aumento (40x). Contamos las células que hay en todo el cuadrante, es
decir, en los 16 cuadritos del cuadrante. ¿Qué hacemos con las células que quedan en
los bordes que delimitan el cuadrante? las que caen a lo largo de las líneas de los bordes
superior y derecho se consideran que están dentro del cuadrante y se cuentan, mientras
que las células de los bordes inferiores e izquierdo se excluyen. Las células teñidas de
azul son células muertas y por tanto no las contamos.
Se cuentan los linfocitos presentes en los 4 cuadrantes idénticos del retículo
(contando las células presentes en los 16 cuadritos de cada cuadrante), y se divide por 4
la cifra obtenida en el recuento, para calcular el número de linfocitos que hay en un solo
cuadrado grande.
El valor obtenido será el número de células en 10-4 ml (volumen del área del
cuadrante). Este valor se multiplica por la dilución realizada con azul tripán (1:10 en
nuestro caso) y por 104 para conocer el nº final de células por ml de nuestra
suspensión.
Nº de células contadas
Nº de células vivas / ml =
x 10 x 104
4
En definitiva, para el cálculo puede emplearse la siguiente fórmula:
RL= L/4 x D x 104
Donde,
RL= Recuento de linfocitos (número de linfocitos por ml de la suspensión celular).
L = Linfocitos contados en los 4 cuadrados grandes.
D= Factor de dilución.
Fig 3: Tinción con azul tripán (1/10)
Bibliografía utilizada:
Manual de prácticas de Inmunología. AUTOR/ES: Campos, A. / Muñoz, C. / Rubio, G.
NOMBRE:
GRUPO:
PREGUNTAS:
1. Si procesamos el timo de un ratón y estudiamos los linfocitos existentes en
él, ¿de qué tipo serían, T o B? ¿Y los del bazo? ¿Y en las placas de Peyer?
2. ¿Qué cantidad total de linfocitos deberíamos encontrar en el bazo de un
ratón sano?
3. ¿Para qué utilizamos el colorante azul tripán en el contaje de linfocitos?
4. El factor de dilución en el contaje de linfocitos es 10. ¿Por qué? Explicar
brevemente.
5. ¿Por qué se deja la población de células del peritoneo durante 30-40 mints
en el incubador antes de añadir las bolitas de látex?
6. El reconocimiento de las partículas de látex por los macrófagos ¿es
específico o inespecífico?
Si recubrimos las partículas de látex con IgG ¿cómo es el reconocimiento?
¿a través de qué receptor se produce?
7. Explica el proceso de fagocitosis: qué ocurre a nivel intracelular tras la
captación e internalización de la partícula fagocitada.
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA Nº 2
IDENTIFICACIÓN DE ANTÍGENOS
EN CÉLULAS EN SUSPENSIÓN
CITOMETRÍA DE FLUJO
OBJETIVOS GENERALES DE LA PRÁCTICA:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Los alumnos aprenderán el funcionamiento del citómetro de flujo y sus
aplicaciones
Aprenderán la información que nos da el citómetro sobre las distintas poblaciones
celulares, fundamentalmente aplicado a poblaciones sanguíneas.
Verán como se pueden identificar distintas moléculas en la superficie de una célula;
y como de esta forma se pueden diferenciar células que bajo microscopia rutinaria
es muy difícil o imposible.
Aprenderán una de las utilidades más importantes de los anticuerpos monoclonales,
y como con ellos se pueden identificar esas moléculas de la superficie de la célula.
Para la visualización de esta reacción antígeno-anticuerpo se realizará la técnica de
directa o indirecta.
Realizarán determinación de las principales subpoblaciones linfocitarias.
Se les explicará, con ejemplos, su aplicación al estudio de inmunodeficiencias (ej.
SIDA) y al estudio de las leucemias.
CITOMETRIA DE FLUJO
La Citometría de flujo consiste en el análisis rápido de células en suspensión
dentro de un sistema de flujo laminar, sobre el que incide un haz de luz que proporciona
información acerca de sus características físico-químicas.
En 1969 se aplicó el láser como fuente luminosa y quedaron establecidas las
bases de la citometría de flujo moderna.
Elementos de un citómetro
Un citómetro de flujo se compone de tres sistemas instrumentales:
1 - Sistema de inyección
2 - Sistema óptico
3 - Sistema informático
1. Sistema de inyección y manejo de la muestra:
Consiste en un mecanismo hidráulico presurizado compuesto por jeringas o
bombas de inyección, conductos y electroválvulas. Este sistema tiene como misión
recoger la muestra, y a través de una corriente de solución salina, conducirla hasta
el canal de flujo, comúnmente formado por un elemento de cuarzo en su centro.
De este modo, al quedar sometida la muestra a una presión envolvente por el
tampón, se induce su flujo hacia el canal capilar de contaje en forma de elementos
alineados sobre los que incidirá la luz del sistema óptico.
La inyección se realiza habitualmente por un sistema volumétrico compuesto
de bomba y jeringa, capaz de inyectar un volumen exacto de la suspensión celular,
y el sistema consta de un contador volumétrico para el recuento de las unidades
celulares que fluyen por el capilar.
2. Sistema óptico:
Según el carácter del haz luminoso, se distinguen dos tipos de citómetro de flujo:
•
•
De lámpara de mercurio
Multiparamétricos o de luz láser, que han ido sustituyendo a los
anteriores, por sus propiedades de intensidad, estabilidad y
monocromaticidad.
Existen diferentes tipos de láser, el más frecuentemente utilizado es el de ión
argón, que emite a una longitud de onda de 488 nm, también se utiliza de kripton.
Otros elementos de importancia dentro del sistema óptico son las lentes
colectoras, los filtros ópticos, los espejos dicroicos y los fotodetectores.
1. Unidad informática
En general consta de:
-
Diversos amplificadores de señal.
Un transformador analógico-digital, para convertir los pulsos electrónicos en
información digital.
Un ordenador de gran capacidad que almacena y analiza los datos,
proporcionando estudios estadísticos y representación gráfica de los mismos.
Funcionamiento de un citómetro
Tras la introducción del tubo de ensayo con la muestra problema, en la toma de
muestra del citómetro, ésta es succionada por la jeringa conectada a una bomba
hidráulica y mediante canalizaciones, es conducida hasta la cámara de contaje, donde es
envuelta por un fluido salino que rodea a las células alineándolas en su centro hasta ser
atravesadas por el haz de luz.
En ausencia de fluorocromos unidos a los elementos celulares, la incidencia
del láser sobre ellos proporciona dos tipos de señales ópticas en función del ángulo de
recolección de la luz dispersada que realizan dos fotodetectores diferentes.
Los ángulos de medida utilizados son:
Configuración frontal entre 1° y 20°
- Forward scatter (FSC)
- Nos da información del tamaño de la célula.
Configuración lateral a 90°
- Side scatter (SSC)
- Nos da información de la granularidad y rugosidad celular.
Mediante el análisis de la información proporcionada por la configuración
frontal y lateral de los elementos que fluyen por el citómetro, es posible agruparlos en
distintas clases por tamaño y granularidad, de forma que el instrumento discrimina entre
ellas y es capaz de mostrarlas en diferentes zonas, a mayor FSC más grandes, a mayor
SSC más granulares y complejas. Con lo cual podemos seleccionar la población que
deseamos estudiar (en ventanas).
Por otro lado cuando van marcadas con un fluorocromo, la señal producida
como consecuencia de la excitación del fluorocromo nos permitirá conocer el porcentaje
de células reconocido por el anticuerpo empleado.
El análisis estadístico de las poblaciones celulares (la total por un lado y la
seleccionada en las ventanas por otro) proporciona el canal medio de fluorescencia
(Mode Channel) en el que se distribuyen FSC y SSC, su desviación típica y el
coeficiente de variación.
Fluorescencia
La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas (llamada fluorocromos)
que, al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada,
emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación.
Las moléculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de
onda y convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en luz de
menor energía (longitud de onda más larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de
emisión y excitación característico; si se utilizan dos con el mismo espectro de
excitación, pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos características al
mismo tiempo (fluorescencia de dos colores o a veces de tres).
La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de anticuerpos
que reconocen antígenos de la superficie de células y tejidos. Para ello se emplean
anticuerpos preparados frente a la proteína que se desea detectar, marcados con los
fluorocromos. Se aprecia si hubo unión del anticuerpo con el antígeno por la
fluorescencia emitida, antes se observaba bajo microscopio de luz ultravioleta, hoy en
día se hace con el citómetro de flujo.
Existen dos procedimientos:
• Inmunofluorescencia directa
• Inmunofluorescencia indirecta
En la inmunofluorescencia directa se marcan directamente los anticuerpos
necesarios para cada una de las proteínas a investigar. Tiene el inconveniente de que
hay que marcar con fluorocromos cada uno de los anticuerpos necesarios. Se utiliza
fundamentalmente en clínica donde normalmente se utilizan siempre los mismos
anticuerpos, ya que hay establecida una rutina, y las casas comerciales los venden ya
preparados.
En la inmunofluorescencia indirecta no se marca directamente el anticuerpo
específico de la proteína a estudiar, sino que se utiliza secundariamente una
antiinmunoglobulina marcada con fluorocromo, que reconocerá al anticuerpo
específico. Normalmente es el procedimiento a utilizar en investigación, donde se
utilizan muchos y diferentes anticuerpos cada vez, y no interesa marcar cada uno.
El fluorocromo más frecuentemente utilizado en citometría de flujo es el
isotiocianato de fluoresceína (FITC) con una absorción máxima a los 495 nm y emisión
a 520 nm (emite luz color verde).
El segundo fluorocromo más utilizado es la ficoeritrina (PE) con una excitación
máxima a los 495 nm y emisión a 576 nm (emite luz color naranja) y es especialmente
útil en estudios de doble fluorescencia.
Por último destacaremos los conjugados covalentes de ficoeritrina y cianinas,
entre ellos la cianoficoeritrina.
Los fluorocromos pueden ligarse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar
la capacidad de estos últimos para unirse a sus correspondientes antígenos. Por ello, los
fluorocromos vinculados a anticuerpos específicos constituyen un medio útil de
visualizar los lugares donde ocurre la reacción antígeno-anticuerpo.
El modo de unión a los anticuerpos depende del tipo de fluorocromo; así, por
ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína se liga mediante enlace covalente con los
grupos amino y carboxilo de las proteínas a pH alcalino.
Aplicaciones de la citometría de flujo
La posibilidad de estudiar células de forma individualizada y multiparamétrica
hace de la citometría de flujo una herramienta de gran utilidad en citología,
inmunología, hematología y anatomía patológica, tanto a nivel clínico como en
investigación.
El desarrollo progresivo de las técnicas y su simplificación ha traído como
consecuencia un auge de la citometría en los últimos años y su incorporación al
laboratorio de forma rutinaria. Las aplicaciones más frecuentes son:
1. Análisis fenotípico de células sanguíneas
2. Identificación de antígenos intracelulares
3. Cuantificación de DNA y ciclo celular
4. Determinación de la viabilidad celular
5. Evaluación de la activación celular
6. Análisis de reticulocitos
7. Detección de autoanticuerpos en suero
8. Cuantificación del potencial de membrana
9. Medida del calcio intracelular
10. Determinación del pH intracelular
APLICACIÓN DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO AL ESTUDIO DE
SUBPOBLACIONES LEUCOCITARIAS e INMUNOFENOTIPO DE
LEUCEMIAS
1. Determinación de cuantitativa de subpoblaciones linfocitarias T CD4, T CD8, B
y NK.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
-
Calcular las principales poblaciones linfocitarias en porcentaje usando
SimulSet, FacsDiva u otra aplicación informática.
Cálculo del número absoluto de las principales poblaciones linfocitarias a
partir de datos del hemograma: fórmula y recuento leucocitario
Cálculo del número absoluto de las principales poblaciones linfocitarias
mediante análisis multiparamétrico (Aplicación informática FacsCanto)
Interpretación de linfocitosis absoluta y relativa.
Desviación a la izquierda: leucocitosis con y sin neutrofilia
Alteraciones de los leucocitos en la infecciones bacterianas y virales
Se utilizarán para ello anticuerpos monoclonales murinos que reconocen
moléculas en la superficie de subpoblaciones de células T, mediante una técnica de
inmunofluorescencia directa. El anticuerpo anti-CD3 reconoce una molécula de la
superficie celular que forma parte del complejo del receptor de células T. Los
anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 reconocen moléculas de la superficie de una
subpoblación de células T que modulan la respuesta inmune: linfocitos T helper y
citotóxicos respectivamente. El anticuerpo anti-CD19 reconoce una molécula de la
superficie de las células B y el anti-CD16 una molécula presente en las células NK y
neutrófilos.
El Síndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se caracteriza por una
reducción severa de linfocitos T helper (CD3+CD4+) y una inversión del cociente
CD4/CD8. Por lo tanto, es una patología en la que la determinación de las
subpoblaciones linfocitarias es de gran utilidad en el seguimiento de la enfermedad.
También se aplica al estudio de otras enfermedades infecciosas, inmunodeficiencias y
en el seguimiento de enfermos trasplantados que reciben tratamiento inmunosupresor.
Población
Linfocitos T
Linfocitos B
Células NK
Marcador
CD3
CD4
CD8
CD19
CD16
Significado
T totales
T helper totales
T citotóxicos
B totales
NK totales
Rango (%)
55-84
31-60
13-41
6-25
5-27
Método: Se utilizarán para ello anticuerpos monoclonales murinos que
reconocen moléculas en la superficie de subpoblaciones de leucocitos, mediante una
técnica de inmunofluorescencia directa o indirecta. Los anticuerpos a utilizar se
encuentran en la tabla siguiente:
Reactivos
-
Se utilizarán los anticuerpos mencionados, sin conjugar o conjugados en función del
número de grupos, tiempo disponible para la práctica y licenciatura:
Anticuerpos mononoclonales que reconocen de forma específica a los
antígenos de superficie mencionados, no marcados o marcados
directamente con fluorocromos (FITC/PE):
• CD45FITC/CD14PE
• CD3FITC/CD19PE
• CD4FITC/CD19PE
• CD3FITC/CD16PE-CD56PE
-
FICT conjugate; anti-mouse Ig, conjugado con fluoresceína (sólo en técnicas
indirectas)
PBS
Reactivo de lisis
-
Muestras
-
3 ml de sangre periférica en tubo vacutainer con EDTA como anticoagulante sobre
la que se ha realizado previamente el hemograma. .
Las muestras de sangre no deben ser refrigeradas.
Para asegurar la exactitud en el contaje de células blancas, deberá realizarse la
técnica dentro de las 6 horas siguientes a la recogida de las muestras.
Procedimiento
-
Rotular un tubo de citometría de flujo por cada uno de los anticuerpos a analizar,
además de un tubo extra para un control negativo.
Poner 100 μl de sangre, bien mezclada, en el fondo del tubo.
Añadir 50 μl del anticuerpo correspondiente en cada tubo sobre la muestra de sangre
Mezclar, agitando suavemente, e incubar durante 30 minutos a 4°C (preferible pero
no necesario).
Lavar con PBS, y centrifugar (5 min., a 1500 r.p.m.), repetir 2 veces.
Añadir 20 μl de fluoresceina por tubo, agitar e incubar 20 min.
Lavar con PBS, y centrifugar (5 min., a 1500 r.p.m.), repetir 2 veces.
Una vez que nos hemos quedado con el botón celular: añadir 2 ml de reactivo de
lisado a cada uno de los tubos. Se utiliza para eliminar las células rojas, que son
lisadas debido a una acumulación de cloruro amónico en el interior de la célula y
esta acumulación aumenta la presión osmótica rompiendo la membrana del hematíe.
Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
-
Las muestras estarán listas para ser analizadas por citometría de flujo, análisis que
deberá ser realizado antes de una hora.
2. Aplicación del inmunofenotipo en el diagnóstico de los síndromes
linfoproliferativos y leucemias agudas.
OBJETIVO DE APRENDIZAJE:
-
Paneles de estudio para el estudio de las leucemias
Estudios de clonalidad mediante citometría de flujo
Aplicaciones de la citometría para el estudio de la enfermedad mínima
residual.
Método: Aprendizaje mediante la aplicación informática, FacsDiva. Interpretación de
ejemplos del archivo histórico: Se verán ejemplos en el citómetro de estudios realizados
en el hospital a enfermos con SIDA y leucemias.
NOMBRE:
GRUPO:
PREGUNTAS A RESOLVER
La imagen corresponde a un análisis de subpoblaciones linfocitarias mediante
citometría de flujo. Comente los porcentajes de linfocitos, indicando si existe
alguna anomalía.
64%
CD8PE
1%
23%
12%
100
101
102
103
104
CD4 FITC
2. La imagen corresponde a una ventana del citómetro de flujo, explica la
información que nos esta dando esta ventana.
SSC
1.
R1
0
200
400
FSC
600
800
1000
NOMBRE:
GRUPO:
CALCULO DE SUBPOBLACIONES CD4 Y CD8 A PARTIR DEL HEMOGRAMA:
1) Leucocitos totales WBC:
-- cel/μl
A) Interpretación: leucocitosis, leucopenia
2) Fórmula sanguínea:
%
cel/μl
NEUTRÓFILOS
LINFOCITOS
MONOCITOS
EOSINOFILOS
BASOFILOS
LUC
LUC (alarma de blastos)
B) Interpretación:
eosinofília, alarma de blastos:
neutrofilia,
neutropenia,
infocitosis
linfopenia,
3) Linfocitos /μl
% de CD4
→
-- CD4/μl
% de CD8
→
-- CD8/μl
Ratio CD4/CD8
C) Interpretación: Inversión CD4/CD8 con linfocitosis T CD8; inversión
CD4/CD8 con linfopenia CD4:
TABLA DE VALORES DE NORMALIDAD DE LAS SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS
Subpoblaciones linfocitarias
2-3 meses 4-11
meses
1-2 años 2-5 años 7-17 años Adultos
Linf.totales µL
(cels/µL )
%
Cels T CD 3
(cels/µL)
%
Cels T CD 4
(cels/µL )
%
Cels T CD 8
(cels/µL )
%
Cociente
CD:4/CD:8
Cels B
(CD19 o CD20)
%
Células NK
(CD56/CD16+/CD3
%
5680
2920-8840
66(55-78)
5990
3610-8840
64(45-79)
5160
2180-8270
59(44-72)
4060
2400-5810
50(38-64)
2400
2100
2000-2700* 1600-2400*
40(36-43) 32(28-39)
4030
2070-6540
72(60-87)
4270
2280-6450
71(57-84)
3330
1460-5440
66(53-81)
3040
1610-4230
72(62-80)
1800
1600
1400-2000* 960-2600*
70(66-76) 73(61-84)
2830
1460-5110
52(41-64)
2950
1690-4600
49(36-61)
2070
1020-3600
43(31-54)
1800
900-2860
43(35-51)
800
700-1100*
37(33-41)
940
540-1660*
46(32-60)
1410
650-2450
25(16-35)
1450
720-2490
24(16-34)
1320
570-2230
25(16-38)
1180
630-1910
30(22-38)
800
600-900*
30(27-35)
520
270-930*
27(13-40)
2.18
1.32-3.47
2.09
1.20-3.48
1.55
0.95-2.95
1.44
1.05-2.07
1.3
1.1-1.4
1.7
0.9-4.5
900
500-1500
23(19-31)
900
500-1500
23(19-31)
900
500-1500
23(19-31)
900
700-1300
24(21-28)
400
300-500*
16(12-22)
246
122-632
13(10-31)
60 ± 40
12.7 ± 4.6
80 ± 40
12.7 ± 4.6
120 ± 90
12.9 ± 4.6
360 ± 170
14.4 ± 5.2
410 ± 190
15.2 ± 4.2
400 ± 150
15.2 ± 4.2
Conley, Stiehm.Immunologic Disorders: General considerations. En: Immunologic Disorders in
Infants and Childrens.4ªedición.Philadelphia: WB Saunders; 1996. JAMA, 267; 1484-1488
· Mediana; Los intervalos de confianza corresponden a los percentiles 5 y 95. Excepto donde
aparece un * que corresponden a los percentiles 25 y 75.
¨ El % de linfocitos corresponde al total de leucocitos
El % de los CD3, CD4, CD8 y células B corresponden al total de linfocitos