Download Citometría de flujo al alcance de las inmunodeficiencias primarias

IV simposio Internacional de
Regreso a la U….
Perspectivas diagnósticas y pronosticas del
laboratorio en la práctica clínica
Taller pruebas diagnósticas en
Inmunodeficiencias primarias
Dra. María Claudia Ortega
Dr. Carlos E Olmos O.
Dr. Jairo Muñoz .
Ma. Consuelo Romero S
Citometría de flujo al alcance de las
inmunodeficiencias primarias-IDP
Ma.Consuelo Romero S, PhD-Jairo Muñoz, MSc
Zulma Maldonado, Bcl-Clara M. Manosalva Bcl
Unidad de IDP-Instituto de Referencia Andino
Taller pruebas diagnósticas en
Inmunodeficiencias primarias
Inmunodefiencias
Citometría de Flujo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Inmunodeficiencias
• Grupo heterogéneo de patologías que como
resultado de anormalidades en el sistema inmune
producen un incremento en la susceptibilidad a
infecciones, cáncer y autoinmunidad
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Análisis básicos de tamizaje en IDP
Linfocitos
B
Linfocitos
T
PMN
NK
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Citometría de Flujo-definición:
• Medición simultánea de múltiples
características físicas de una sola célula en
suspensión a una alta velocidad.
• Principio de las mediciones célula por célula
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Citometría de flujo-características
• Una columna de líquido
transporta en su seno a
las células a analizar
haciéndolas
pasar
alineadas por delante
de una fuente de
iluminación
monocromática
(generalmente un láser)
Ma. Consuelo Romero S, PhD
• Una serie de detectores
registran la luz dispersada
por las células y su
emisión de fluorescencia
(luz emitida con distinta
longitud de onda.
• Esa
fluorescencia
es
recolectada
y
transformada en valores
digitales almacenados en
un computador.
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Citometría de flujo-características
• Mediante el marcaje de las células con
moléculas fluorescentes se pueden conocer
propiedades de las mismas: expresión
antigénica, fenotipificación, viabilidad,
función, capacidad efectora etc.
Ma. Consuelo Romero S, PhD
PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS
El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o
FSC)
La complejidad interna o granularidad relativa
(Side Scatter o SSC)
Intensidades relativas de emisión de fluorescencia
( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)
Citometría de Flujo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Parámetros evaluados
FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA
- S relaciona con la superficie y área celular.
- Se detecta en el eje de incidencia del laser:
SIDE SCATER – LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA
-Se relaciona con la complejidad interna de la célula y su granularidad
-Se detecta en un ángulo de 90 grados con el haz del laser.
Fuente de Luz
Incidente: Láser de
Argón a 488 nm
Detector de dispersión de luz frontal
α Tamaño celular-FSC
FSC (Forward Scatter)
Detector de dispersión de luz en ángulo recto
α Complejidad celular-SSC
SSC (Side Scatter)
Citometría de Flujo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
www.biol.unlp.edu.ar/inmunologia/citometria.ppt
Que podemos medir?
• Partículas o células en suspensión desde 0.2
hasta 50 µm
• Células a partir de tejidos sólidos: disgregación
y suspensión
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Características de una célula medidas
en el citómetro de flujo:
Tamaño y granularidad
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Glóbulo rojo: 6 um
Linfocito:8 um
Polimorfonuclear neutrófilo= 12 um
Monocito =14 um
http://www.google.com.co/imgres?q=tamaño+de+las+células+de+la+sangre&um=1&hl=es&lr=&sa=N&biw=1152&bih=753&tbm=isch&tbnid=4ioBwyZSCRvN
oM:&imgrefurl=http://www.proyectosalonhogar.com/cuerpohumano/Cuerpo_humano_circulatorio2.htm&docid=KzJC7DOOkdhJM&w=374&h=241&ei=zBKR
Tun9OM2
Ma. Consuelo Romero S, PhD
MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS
FLUORESCENTES
•Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra
antígenos de la superficie de las células, o proteínas intraceluares
marcadas con colorantes fluorescentes.
•Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo
fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la
superficie.
•Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar
autofluorescencia.
•Control positivo: células normales, células de líneas celulares,
comerciales
Citometría de Flujo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
www.biol.unlp.edu.ar/inmunologia/citometria.ppt
FLUOROCROMO
Sustancia que se emplea para marcar
anticuerpos u otras moléculas, por su
propiedad de emitir luz de una determinada
longitud de onda, cuando se le estimula con un
láser o con luz ultravioleta.
Los fluorocromos pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad
que tienen algunos de unirse a determinadas moléculas u orgánulos tales
como los colorantes de ácidos nucleicos: ioduro de propidio, bisbencimidas,
etc.
Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras
moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico
a estructuras concretas de la célula. http://fotonica.cnb.uam.es
http://www.medicoscubanos.com/diccionario_medico.aspx?q=fluorocromo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Citometría multicolor
• COMO DISEÑAR UN PANEL DE FLUOROCROMOS:
– Selección de fluorocromos por brillo según la expresión
antigénica y/o cantidad celular. (Valores Publicados)
– Minimizar el sobrelapamiento entre flourocromos.
– Usar los fluorocromos tandem ( varios fluoruocromos)
considerando sus limitaciones.
– Conocer muy bien la configuración del equipo que se esta
utilizando, y manejar un muy buen control de Calidad.
Luz incidente
Luz transmitida
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Fluorocromos utilizados
FL1
FL2
FL4
FL3
Citometría de Flujo
Índice de coloración
del fuorocromo y
como se acopla a la
molécula
Luz Fluorescente
emitida
de menor energía y
mayor longitud de
onda
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Citometría Análoga vs Digital
Análoga
• Se dificulta almacenar, comparar y calcular, recuperar información
• Menos canales de resolución
• No se puede modificar datos después de la adquisición
Digital
•
•
•
•
Más rápida, mas exacta
Más canales de resolución
Datos originales
Se puede compensar datos después de haber realizado la adquisición de
estos
• El proceso de compensación permite corregir el sobrelapamiento
Ma. Consuelo Romero S, PhD
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis355.pdf
Intensidad de fluorescencia y sitios de unión
FITC
FITC
FITC
Número
de
eventos
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Intensidad de fluorescencia FITC
Nivel de expresión antigénica en una célula.
La expresión antigénica puede variar debido alMa.
nivel
de activación celular
Consuelo Romero S, PhD
y diferencias funcionales.
•En linfocitos CD4 activados disminuye la intensidad de expresión del
correceptor CD4.
•En linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del correceptor CD8
•Activación TCR modulación de CD3
•La apoptosis reduce la expresión de determinados antígenos de linaje
Estudio de la heterogeneidad celular
CD4
CD8
NK
LB
Mono Neu
CD45
CD19,CD20
CD19 CD14 CD15
CD2
CD3
CD56,CD16
CD56
CD4
CD45RA
CD45RO
CD8
CD45RA CD45RO
http://www.alfredoprieto.tk
CD45RA
anti-CD3-FITC
Linfocito T CD4
anti-IL-17 RT
IL-17
anti-CD4-APC
anti-CD45-PerCP
anti-CD3-FITC
anti-CD8-PE
Linfocito T CD8
anti-CD45-PerCP
anti-CD3-FITC
Linfocito T
CD3/CD8/CD4/CD45
anti-CD4-APC
anti-CD45-PerCP
anti-CD8-PE
Muestra con EDTA almacenada a temperatura 20-25 oC se
puede procesar en las siguientes 48 horas
Cytometry, 1993;14:685-9
Cytometry, 1996;26:16-21
CDC.MMVR, 2003;52(No.RR-02):1-13.1
anti-CD20-FITC
Linfocito B
anti-CD19-PE
anti-CD45-PerCP
anti-CD56-FITC
anti-CD16-PE
NK
anti-CD45-PerCP
LT/LB/NK
Población celular
Tipo de antígeno
Expresión de moléculas
por célula
Linfocito T
TCR
100.000
CD3
124.000
CD4
100.000
CD8
90.000
CD45
> 200.000
Población celular
Tipo de antígeno
Expresión de moléculas
por célula
Linfocito B
CD19
18.000
CD20
109.000
NK
CD56
10.000
Monocito
CD14
110.000
CD32
21.000
ANALISIS DE DATOS
Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:
1) Histograma
Eventos
medidos
FLUORESCENCIA
HISTOGRAMA
Citometría de Flujo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:
2) Dot-plot
Citometría de Flujo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Análisis de datos
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
Elijo un gate:
Ej. linfocitos
CD3- CD4 en sangre total
CD3 – CD4 en gate de linfocitos
Cuantificación del número de linfocitos T CD4
CD4 T cells
CD 8
T Cells
Representación de la información
J Immunol 1983;131:212
Expresión de Resultados
de células T maduras CD4/CD3 o CD8/CD3
• Datos porcentuales
• Datos absolutos: Partículas de cuantificación con
fluorescencia conocida células/µ
µL
• Datos estadísticos
Quadrant Statistics
File: Normal01.05
Sample ID:
Tube: CD3/CD8
Acquisition Date: 15-Jun-95
Gated Events: 2383
X Parameter: FL1-H CD3 (Log)
Quad Location: 17, 17
Log Data Units: Linear Values
Patient ID:
Panel: IMK-Lymphocyte
Gate: G1
Total Events: 6000
Y Parameter: FL2-H CD8 (Log)
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL
126
5.29
2.10
4.51
4.12 324.82
171.35
UR
508
21.32
8.47 268.00
249.17 2472.09
1624.51
LL
420
17.62
7.00
3.92
3.50
3.13
2.53
LR
1329
55.77
22.15 306.66
289.43
1.50
1.28
Citometría de Flujo
Ma. Consuelo Romero S, PhD
¿De que nos informan los estudios
inmunfenotípicos?
-Caracterización fenotípica: CD3, CD56, CD19
- Diferenciación celular: CD95, CD45RA, CD45RO
- Co estimulación: CD28, ICOS, CTLA-4
- Recirculación: CD62L, CLA, α4β7
- Activación celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71
• Establecer rangos propios ?
• Parámetros que pueden afectar: género, edad del
paciente, características clínicas del paciente, raza,
estado de actividad física, hora del día.
Subclase
n
Media
Rango al 95 %
LT CD 4 %
164
45
33-58
LT CD 8 %
164
24
13-39
LT totales CD3 %
164
72
56-86
LT CD4 células/µL
164
941
404-1612
LT CD 8 células/µL
164
511
220-1129
LT totales
células/µL
164
1513
723-2737
Ma. Consuelo Romero S, PhD
National Committee for clinical laborattory Stabdars, 1992.NCCLS
• Inmunofenotipificación de linfocitos apartir de
sangre periférica en niños:
• Maduración y expansión del sistema inmune
en los primeros años, la cual puede variar
• Objetivos: Establecer valores de referencia
relativos y absolutos en diferentes etapas de
la población pediátrica.
Marleke, W. et Al .J Pediatr 1997;130:388-93
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Métodos: Sangre total con EDTA lisada,
citometría a 2 colores
Total
n= 429
Neonatos (sangre de cordón
umbilical)
20
Niños sanos
358
Adultos
51
1 semana a 2 meses
n=13
2 a 5 meses
n=46
5 a 9 meses
n=105
9 a 15 meses
n=70
15 a 24 meses
n=33
2 a 5 años
n=33
5 a 10 años
n=35
10 a 16 años
n=23
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Fenotipos
Linfocitos B
CD19
Linfocitos T
CD3
Linfocitos T CD4
CD3+/CD4+
Linfocitos T CD8
CD3+/CD8+
Linfocitos T activados
CD3+/HLA DR+
Células NK
CD3-/CD16+,CD56+
•Seleccionaron el gate de linfocitos por tamaño y
granularidad y se confirmó su pureza con marcadores CD14
y CD45 = el gate contenía por lo menos 95% de linfocitos
•Valor relativo = expresado en porcentaje
•Valor absoluto= tomando el valor de leucocitos
•Estadística percentiles 5 y 95, mediana y distribución ??
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Valor relativo de subpoblaciones de
linfocitos en sangre
Marleke, W. et Al .J Pediatr 1997;130:388-93
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Valor absoluto de subpoblaciones de
linfocitos en sangre
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Mediana del valor absoluto de subpoblaciones
de linfocitos en neonatos, niños y adultos
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Valor absoluto de LT y subpoblaciones CD4
y CD8
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Mediana del valor absoluto de células NK
en neonatos, niños y adultos por edad
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Conclusiones
• Los cambios en el valor absoluto de subpoblaciones
de linfocitos no siempre son consistentes con los
cambios en porcentaje.
• El porcentaje de LT CD3 permanece estable en un 64
al 72% desde los 2 años hasta el adulto lo cual no
sucede con el valor absoluto, la mediana disminuye
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Conclusiones
• El incremento en el porcentaje de células NK
hasta de dos veces durante la niñez no es
causada por un aumento por si de estas
células, sino por la disminución en el número
de LT y LB.
• Valores confiables en cada grupo de edades:
dirigidos a estudios de inmunodeficiencias.
• Infección y medicamentos: periodo estable
Ma. Consuelo Romero S, PhD
Conclusiones
• El informe de los resultados se debe
categorizar por grupos de edades.
• Es suficiente la evaluación de un solo
marcador de linaje linfoide para LT,LB y NK??
• La muestra con EDTA es estable por 2 días a To
ambiente.
Ma. Consuelo Romero S, PhD