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Generación y caracterización de un panel de anticuerpos
monoclonales específicos frente a IgE canina mediante el uso
de antígenos recombinantes
García-Gallo Pinto, M.1; Llorente Gómez, M.1; Martín López, L.1; Kremer Barón, L.1, Mas Fontao, A.2,
Álvarez Álvarez, J.2
Protein Tools Unit & Departamento de Inmunología y Oncología, CNB-CSIC, Cantoblanco – Madrid
Tlf. 915854570; [email protected]; 2ALERGOVET S.L.; C/ Luis Cabrera 92- 28002 – Madrid.
Tlf. 914134472; [email protected]
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Objetivo
El diseño de un tratamiento eficaz de la alergia en perros implica la determinación individual de aquellos
alergenos relacionados con la enfermedad. Esto se puede realizar mediante la detección de inmunoglobulina
E (IgE) específica en suero, utilizando técnicas in vitro. Uno de los problemas más importantes en el estudio
del sistema inmune canino es la falta de anticuerpos bien caracterizados frente a componentes específicos del mismo. Así, existen pocos trabajos de investigación dirigidos al desarrollo de reactivos específicos,
sensibles y eficaces para la detección de IgE canina, molécula que representa aproximadamente el 0,003%
[1] de las inmunoglobulinas circulantes. Debido a la gran dificultad para conseguir inmunógenos a partir
de preparaciones de IgE libres de IgG, inmunoglobulina mayoritaria, muchos de los reactivos disponibles
muestran reactividad cruzada con IgG, produciendo falsos positivos y, por tanto, un diagnóstico equivocado.
Para solventar esta limitación, en este trabajo se planteó el desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales
(mAb) frente a IgE canina, empleando en su generación un antígeno recombinante absolutamente libre de
IgG, combinando esto con una exhaustiva caracterización molecular de los anticuerpos generados.
Materiales y métodos
Para la generación de mAb se empleó como antígeno una molécula de IgE canina recombinante (rIgE) producida
en Alergovet S.L., que comprende los dominios CH2-CH3-CH4 de la región constante de la cadena pesada de IgE
canina [2]. Como inmunógeno se utilizó rIgE conjugada a la hemocianina de moluscos (KLH), emulsionada con
adyuvante de Freund, e inyectada subcutáneamente a ratones de la cepa BALB/c. La selección de ratones inmunizados se realizó mediante titulación de anticuerpos anti-rIgE en suero, empleando un ELISA de captura de anticuerpos
por rIgE unida a la placa del ensayo. Para generar hibridomas productores de mAb específicos de rIgE, se extrajeron linfocitos de bazo del ratón seleccionado como mejor respondedor, que se fusionaron con células de mieloma
murino. Se estudió la presencia de anticuerpos específicos en ensayos de ELISA frente a rIgE y a albúmina bovina
como control negativo. Los hibridomas que presentaron la mejor relación señal frente al fondo fueron sometidos a
dos rondas sucesivas de clonación por dilución límite. La selección de los hibridomas se hizo mediante el análisis de
sobrenadantes celulares en dos tipos de ELISA de captura de anticuerpo: directo frente a rIgE e indirecto frente a diferentes alergenos. En este último ensayo, se determinó la cantidad de IgE presente en los sueros de perros alérgicos
y en sueros de perros sanos (control negativo). Durante la selección de clones se estudió la interacción de los mAb
con IgG e IgM de perro, eligiéndose los clones productores de mAb específicos. También se analizó la capacidad de
unión simultánea de los diferentes mAbs a rIgE mediante ELISA de competición.
Resultados
El estudio de los sueros de todos los ratones inmunizados demostró un buen nivel de anticuerpos frente a rIgE, empleándose para la realización de la fusión celular el ratón con el título de anticuerpos más alto. Se analizaron los sobrenadantes de más de 3.000 hibridomas y los positivos en dicho ensayo fueron estudiados en un ELISA indirecto de
determinación de IgE específica en sueros de perros, empleando como antígeno diferentes alergenos. Se obtuvieron 20
pocillos positivos, que contenían mAb específicos para rIgE con capacidad de reconocer IgE nativa. Los hibridomas
de cuatro de estos pocillos se clonaron mediante dilución límite. Todos los mAb presentaron alta especificidad para el
reconocimiento de IgE específica y ninguno ellos reaccionó frente a IgG o IgM purificadas de perro. Además, mediante
ensayos de competición se determinó los mAb interaccionan con epítopos diferentes dentro de la molécula de rIgE.
Conclusiones
Alergovet en colaboración con el CNB-CSIC, ha desarrollado un panel de anticuerpos monoclonales específicos frente a IgE canina, empleando un antígeno recombinante. Ningún mAb interacciona con IgG o IgM
canina, evitando falsos positivos. Además, todos los mAbs son capaces de detectar IgE específica en sueros de
perros alérgicos al ensayar los alergenos más frecuentemente implicados en las alergias caninas. Por último,
se ha demostrado que los mAb interaccionan con epítopos diferentes de la molécula de IgE, lo que permite
su empleo en una mezcla oligoclonal, una novedosa herramienta molecular para la determinación de IgE
específica en perro, que incrementa la sensibilidad de la técnica manteniendo su especificidad.
Bibliografía
[1] Tizard, IR. (2009) “Los anticuerpos:receptores solubles de antígeno” en Tizard, IR. “Introducción a la Inmunología
Veterinaria” pp. 170-180, Barcelona, Ed. Elsevier
[2] Alvarez J. and Zalve V. (2010) Vet Dermatol 21(5): 536
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Tipo: ORAL