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XXIII Reunión Científica Anual
Sociedad Argentina de Protozoología
22 al 24 de Octubre de 2009
Foro Cultural Universitario de la Universidad Nacional del Litoral
9 de julio 2150, Santa Fe
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COMITE ORGANIZADOR
Presidente:
Dr. Iván Marcipar
Miembros:
Bioq. M. Laura Bizai
Dra. Cristina Diez
Bioq. Diana Frabro
Dr. Sergio Guerrero
Bioq. Diego Mendicino
Bioq. Mirtha Streiger
Colaborador:
Dra. Silvina R. Villar
COMITE CIENTIFICO
Presidente:
Dra. Miriam Postan
Miembros:
Dra. Pilar Aoki
Dra. Jackeline Bua
Dra. Marta Victoria Cardinal
Dra. Estela Machado
Dra. Claudio Pereira
Dra. Ana Rosa Pérez
Dra. Patricia Petray
Dra. Silvia Revelli
Dra. Eva Acosta Rodriguez
Dra. Silvina Wilkowsky
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SOCIEDAD ARGENTINA DE PROTOZOOLOGIA
COMISION DIRECTIVA
Presidente:
Dra. Silvia Revelli
Vicepresidente:
Dr. Oscar Bottasso
Secretario:
Dr. Esteban Serra
Prosecretario:
Dra. Silvia Fernandez Villamil
Tesorero:
Dr. Antonio Uttaro
Protesorero:
Dra. María Laura Belaunzarán
Vocales Titulares:
Dr. Iván Marcipar
Dra. Ana Rosa Pérez
Vocales Suplentes:
Dra. Pamela Cribb
Bioq. Isabel Nocito
Órgano de Fiscalización: Dres. Estela Lammell y J. Cazzulo.
AUSPICIANTE
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL - UNL
PATROCINANTES
CONSEJO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS Y TECNICAS (CONICET)
AGENCIA NACIONAL DE PROMOCIÓN CIENTIFICA Y TECNOLOGICA
SECRETARÍA DE ESTADO DE CIENCIA, TECNOLOGIA E INNOVACION (SECTeI) DE
LA PROVINCIA DE SANTA FE
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CONMEMORACION DEL CENTENARIO
DEL DESCUBRIMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
La labor de Carlos Chagas. Más allá de lo secular
El análisis histológico de ambas biopsias cutáneas era categórico. Uno de los
preparados denotaba un predominio de histiocitos vacuolados con abundante cantidad de
bacilos ácido-alcohol resistentes en su interior, mientras que en la toma del segundo paciente
se advertía una reacción granulomatosa compuesta por células epitelioides, gigantes
multinucleadas y linfocitos. Por su parte, el clínico también coincidía en sus apreciaciones,
formas típicas de Lepra Lepromatosa y Tuberculoide.
La cotidianeidad de situaciones como las descriptas determina una suerte de
“presupuesto” y la consiguiente tendencia a pensar que el conocimiento necesario para efectuar
estas disquisiciones nos habría pertenecido desde siempre. Muy por el contrario, la
visualización que dos manifestaciones diametralmente diferentes corresponden a expresiones
clínico-patológicas de un mismo tipo de infección significó un fenomenal esfuerzo desde el
campo investigativo signados por aportes señeros de grandes maestros de la Medicina de todos
los tiempos.
Es claro que el recorrido de Carlos Chagas transita por esas esferas. A contrapelo de lo
que ocurre habitualmente en Medicina y atravesando diversas instancias del quehacer
científico no sólo identifica el patógeno sino que posteriormente describe la entidad nosológica
que ocasionaba. Un logro por partida doble reservado a unos muy pocos mortales dotados de
una cierta conjunción de fuerzas propicias: inteligencia, aquella intuición Kantiana y alguna
pizca de buenaventura, cual ofrenda de deidad olímpica. Pero por sobre todas las cosas, nos
imaginamos una férrea voluntad y capacidad de trabajo habida cuenta que este “Magno Carlo”
en definitiva tenía condición humana. Y como bien señalaba Picasso “mucho mejor si la
inspiración te toma trabajando”. Sin lugar a dudas, constituye el elemento propulsor más eficaz
que haya conocido el hombre. El hálito que nos incita a seguir andando aún cuando a prima
facie pareciera que los hechos no revisten relevancia.
Bueno sería que lo tuviéramos presente, particularmente por estas pampas y por los
siglos de los siglos,…….a propósito de la centuria!.
Dr. Oscar Bottasso.
Vicepresidente de la Sociedad Argentina de Protozoología.
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INDICE GENERAL
Página
PROGRAMA CIENTIFICO
S7
Cursos
C1
C2
Conferencia
Inagural
Mesas
Redondas
Tópicos críticos en inmunología celular
Taller: Diferentes enfoques y técnicas de tipificación de cepas de
T. cruzi
Current Status of Research in Acidocalcisomes
Dr. R Docampo
S 10
S 13
S 19
MR1
Clínica y tratamiento de las Parasitosis
S 20
MR2
Nuevos aportes al conocimiento de la patogénesis de la
Enfermedad de Chagas
S 22
MR3
Epidemiología y Vectores
S 24
MR4
Biología Molecular
S 27
MR5
Seminarios de Bioquímica
S 31
MR6
Inmunología de Enfermedades Parasitarias
S 34
CO1
Sesión 1- Biología Molecular
S 38
CO2
Sesión 2- Epidemiología y Vectores
S 41
CO3
Sesión 3 - Inmunología, Patogenia y Tratamiento
S 46
CO4
Sesión 4 - Bioquímica y Biología Celular
S 50
Biología Molecular
S 54
Epidemiología y Vectores
S 63
Inmunología
S 75
PyQ
Patogenia y Quimioterapia
S 86
BIO
Bioquímica
S 94
Comunicaciones
Orales
Posters
BM
EPyV
IN
BC
Indice de
Autores
Biología Celular
S 100
S 105
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PROGRAMA CIENTÍFICO
JUEVES 22 DE OCTUBRE DE 2009
HORARIO
SALON 1
SALON 2
Mesa Redonda # 1
CLÍNICA Y TRATAMIENTO DE LAS
PARASITOSIS
Comunicaciones Orales # 1
Coordinador: Dr. Oscar BOTTASSO
13:30-15:00 HS
BIOLOGÍA
MOLECULAR
MR1-1. Dr. Juan Beloscar
MR1-2. Dr. Oscar Pellizón
MR1-3. Dra. Ana Rosa Pérez
Mesa Redonda # 2
NUEVOS APORTES AL
CONOCIMIENTO DE LA
PATOGÉNESIS DE LA
ENFERMEDAD DE CHAGAS
15:30-17:00 HS
Coordinadora: Pilar AOKI
Comunicaciones Orales # 2
EPIDEMIOLOGÍA
Y VECTORES
MR2-1. Dra. Karina A. Gomez
MR2-2. Dra. Patricia Paglini
MR2-3. Dra. Claudia C. Motrán
Palabras de bienvenida de la Presidente de la Reunión
Dra. Miriam Postan
17:30-18:30 HS
CONFERENCIA CIENTÍFICA INAUGURAL
Dr. Roberto DOCAMPO
CURRENT STATUS OF RESEARCH IN ACIDOCALCISOMES
19:00-21:00 HS
21:30 HS
Posters (Pares)
Posters (Pares)
COCKTAIL de BIENVENIDA
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PROGRAMA CIENTÍFICO
VIERNES 23 DE OCTUBRE DE 2009
HORARIO
SALON 1
SALON 2
CURSO
TALLER
TÓPICOS CRÍTICOS EN INMUNOLOGÍA
CELULAR: DESDE LAS CÉLULAS DE LA
RESPUESTA INMEDIATA A LAS
EFECTORAS TARDÍAS
DIFERENTES ENFOQUES Y TÉCNICAS DE
TIPIFICACIÓN DE CEPAS DE
TRYPANOSOMA CRUZI
Coordinadora: Dra. Adriana GRUPPI
8:00-13:00 HS
Coordinador: Dr. Patricio DIOSQUE
C2-1. Dr. Aldo Solari
C1-1. Dra. Analia Trevani
C2-2. Dra. M. Virctoria Cardinal
C1-2. Dr. Juan M. Ilarregui
C2-3. Dr. Juan M. Burgos
C1-3. Dra. Daniela A. Bermejo
C2-4. Dr. Iván Marcipar
C1-4. Dra. Ana Rosa Pérez
C2-5. Dr. Martin S. Llewellyn
C2-7. Dr. Claudia P. Herrera Bernal
C2-6. Dr. Patricio Diosque
14:30-16:30 HS
17:00-18:00 HS
Mesa Redonda # 3
Mesa Redonda # 4
EPIDEMIOLOGÍA Y VECTORES
BIOLOGÍA MOLECULAR
Coordinador: Dra. M V CARDINAL
Coordinador: Dr. Claudio PEREIRA
MR3-1. Dra. Elizabeth Estallo
MR4-1. Dra. Alejandra Schoijet
MR3-2. Dr. Juan M. Gurevitz
MR4-2. Dra. Sebastián R. Najle
MR3-3. Dra. María G. Quintana
MR4-3. Dra. Alejandro Cassola
MR3-4. Dra. Soraya A. Acardi
MR4-4. Dra. Pamela Cribb
CONFERENCIA “100 AÑOS DEL DESCUBRIMIENTO DE LA
ENFERMEDAD DE CHAGAS
Dr. Juan Pablo ZABALA
“100 Años de la Enfermedad de Chagas: Trayectoria Científica y Política de un Problema Social”
18:30-20:30 HS
21:00 HS.
REUNION DE LA SAP
ENCUENTRO DE CAMARADERÍA
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PROGRAMA CIENTÍFICO
SABADO 24 DE OCTUBRE DE 2009
HORARIO
SALON 1
SALON 2
Mesa Redonda # 5
Mesa Redonda # 6
SEMINARIOS DE BIOQUÍMICA
INMUNOLOGÍA DE
ENFERMEDADES PARASITARIAS
Coordinador: Antonio UTTARO
9:00-11:00 HS
MR5-1. Dr. Alejandro Leroux
MR5-2. Dr. Diego G. Arias
MR5-3. Dr. Gaspar E. Cánepa
MR 5-4. Dr. Alejandro D. Nusblat
Coordinadora: Patricia PETRAY
MR6-1. Dr. Gerardo Mirkin
MR6-2. Dr. Susana Gea
MR6-3. Dra.Valentina Martín
MR6-4. Dra. Laura Cervi
CONFERENCIA CONMEMORATIVA
11:30-13:00 HS
Dra. STELLA MARIS GONZALEZ-CAPPA
"SOCIEDAD ARGENTINA DE PROTOZOOLOGÍA: historia y anécdotas sobre la
creación, el antes y el después".
Comunicaciones Orales # 3
Comunicaciones Orales # 4
14:00- 16:00 HS
INMUNOLOGÍA
PATOGENIA y TRATAMIENTO
BIOQUÍMICA
Y BIOLOGÍA CELULAR
16:30-18:30 HS
Posters (Impares)
Posters (Impares)
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CURSOS
C1. TÓPICOS CRÍTICOS EN INMUNOLOGÍA CELULAR: DESDE LAS CÉLULAS DE
LA RESPUESTA INMEDIATA A LAS EFECTORAS TARDÍAS.
Coordinadora: Dra Adriana Gruppi. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de
Córdoba. [email protected] / [email protected]
8:00-8:10 hs. Presentación Dra. Adriana Gruppi
8:10-9:00 hs. C1-1. Trampas extracelulares de neutrófilos (NETs): Una novedosa estrategia
del huésped para la defensa anti-infecciosa.
Trevani A. IIHEMA - Academia Nacional de Medicina y Depto. de Microbiología e Inmunología,
Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. CONICET.
[email protected]
Los neutrófilos constituyen uno de los tipos celulares más relevantes del sistema inmune innato,
contribuyendo activamente a la defensa del huésped frente a patógenos invasores. Son células
terminalmente diferenciadas, que una vez liberadas de la médula ósea tienen una vida media corta
en circulación. Los neutrófilos son masivamente reclutados a los focos de infección, donde su
capacidad de eliminar a los microorganismos se encuentra determinada por su eficiente capacidad
fagocítica y la posesión de un poderoso arsenal microbicida. Estudios realizados en los últimos
años demostraron que los neutrófilos pueden también eliminar microorganismos al capturarlos en
estructuras extracelulares que reciben el nombre de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs),
formadas por cromatina y proteínas granulares como elastasa, catepsinas y mieloperoxidasa. Las
NETs se forman por estimulación de neutrófilos con LPS, IL-8, C5a, PMA y por
microorganismos, factores que finalmente conducen a la disrupción de la membrana celular como
último paso de una nueva forma de muerte a la cual se denominó NETosis. La NETosis difiere de
la apoptosis y la necrosis en muy variados aspectos. Durante la formación de NETs el núcleo
pierde su forma, la eu- y hetero-cromatina se homogeinizan, y luego, la envoltura nuclear y las
membranas granulares se desintegran y el material nuclear toma contacto directo con los
componentes de los gránulos. Finalmente, la membrana celular se rompe y las NETs son liberadas
concomitantemente con la muerte celular.
La NETosis representa un mecanismo microbicida post-mortem mediado por neutrófilos. Diversos
patógenos como Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes y el hongo Candida albicans inducen la formación de NETs
y son atrapados por ellas. Las NETs degradan factores de virulencia y matan a bacterias Gram
positivas y negativas, posiblemente debido a que exponen a los patógenos a altas concentraciones
locales de proteínas anti-microbianas como la elastasa, la BPI y las histonas. También M
tuberculosis, un patógeno intracelular, es capaz de inducir la producción de NETs, aunque las
mismas son incapaces de matar a la bacteria. Estudios recientes reportaron la capacidad de
promastigotes de Leishmania amazonensis de inducir la producción de NETs y la capacidad de las
mismas de ejercer efectos leishmanicidas.
Las NETs son abundantes en microambientes inflamatorios in vivo, como se ha observado en la
Shigellosis experimental en conejos, en la apendicitis humana y en la mastitis en bovinos.
Aún cuando las NETs podrían cumplir un rol relevante en la defensa anti-infecciosa, la formación
de NETs podría también tener efectos perjudiciales para el huésped debido a la liberación ADN e
histonas que podrían conducir al desarrollo de respuestas autoinmunes disparadas contra el ADN
del huésped.
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El significado biológico de las NETs recién está comenzando a ser explorado. Estudios futuros
ayudarán a dilucidar el rol de las mismas en diversas condiciones inflamatorias y autoinmunes
donde los neutrófilos cumplen un rol relevante.
9:00-9:50 hs.
C1-2. Células dendríticas: papel en la inducción, modelado y regulación de la respuesta
inmune.
Ilarregui JM. Laboratorio de Inmunopatología. Instituto de Biología y Medicina Experimental
(IBYME-CONICET). [email protected]; [email protected]
Las células dendríticas (DCs), son células presentadoras de antígenos (CPA) profesionales que
cumplen una función crítica en la inducción y regulación de la respuesta inmune adaptativa, ya que
son las únicas células con la capacidad de estimular linfocitos T vírgenes e iniciar una respuesta
inmune primaria.
Constituyen una población heterogénea de células, cuya característica común es su capacidad de
captar, procesar y presentar antígenos a los linfocitos T, orientando luego el desarrollo de
respuestas inmunes efectoras. El perfil de la respuesta inmune generada dependerá del subtipo de
DC, los receptores estimulados, el microambiente circundante a la CPA, etc.
Las DCs también cumplen un papel crítico en la inducción y mantenimiento de tolerancia, tanto
central como periférica. En este sentido, la activación y/o diferenciación de células T regulatorias
inducido por DCs tolerogénicas es uno de los mecanismos utilizados en la inducción de tolerancia
periférica. Dichas DCs se originan como resultado de las distintas interacciones de las células con
su microambiente y pueden encontrarse en diferentes estadios de maduración y activación y son
capaces de inhibir la polarización de la respuesta inmune hacia perfiles inflamatorios, a la vez que
facilitan la proliferación de diferentes subtipos de células T regulatorias.
A través de estos mecanismos, las DCs logran promover una eficiente estimulación antigénica que
conducirá a la eliminación de organismos patógenos y tumores, o por el contrario permitirá
mantener la tolerancia periférica a los fines de evitar respuestas autoinmunes. Sin embargo, estos
mecanismos ocasionalmente fallan, generando diversas patologías. Por lo tanto, la posibilidad de
descifrar los mecanismos implicados en la generación de una respuesta antígeno-específica o en la
inducción de tolerancia inmunológica, permitiría diseñar nuevas estrategias terapéuticas, tendientes
a potenciar el sistema inmune frente a desafíos microbianos y cáncer o inhibir una respuesta no
deseada en procesos alérgicos y enfermedades autoinmunes.
10:00-10:20 hs. BREAK
10:20-11:10 hs.
C1-3. Subpoblaciones de linfocitos B: dinámica de la respuesta folicular y extrafolicular de
células esplénicas.
Bermejo DA. CIBICI – Facultad de Ciencias Químicas – Universidad Nacional de Córdoba.
CONICET. [email protected]; [email protected]
La producción de anticuerpos (Acs) neutralizantes de agentes infecciosos depende de linfocitos (Li)
B maduros los cuales han sido clasificados en convencionales (B2), CD5+ (B1) y LiB de zona
marginal (ZM). Estas subpoblaciones de LiB presentan diferentes fenotipos y localización
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topográfica sugiriendo que tienen diferencias funcionales. El comportamiento de los LiB no solo es
influenciado por Ags sino también por la interacción con LiT, células dendríticas y macrófagos.
Las poblaciones de LiB maduras presentes en bazo son los LiB2, LiB1 y los LiB de ZM. Estos
últimos tienen un umbral de activación mucho menor que los LiB2. De este modo, ellos responden
rápidamente a señales externas generando una primera ola de células plasmáticas (CP) y Acs que
actúan como una primera barrera de defensa contra patógenos. Cuando los LiB de ZM son
activados abandonan la ZM luego de unos pocos días. Subsecuentemente forman, en las regiones
extrafoliculares y a lo largo de los PALS, focos de CP secretantes, principalmente, de IgM de baja
afinidad. Se trata de una respuesta T-independiente. La mayoría de estas CP sobrevive unos pocos
días y mueren por apoptosis, posiblemente porque regulan negativamente la expresión de la
proteína Bcl-2. Por el contrario, cuando los LiB2 son activados vía BCR forman unas estructuras
dependientes de los LiT denominadas centros germinales (CG). Luego de la formación de los CG
se producen tanto CP como LiB de memoria. En el CG, los LiB sufren procesos de proliferación
repetidos, hipermutación somática y selección dependiente de Ag. Posteriormente los LiB
seleccionados positivamente, aquellos cuyas Igs de superficie presentan alta afinidad por el Ag, se
diferencian a célula de memoria o a plasmoblastos. Se demostró que la expresión de Acs de alta
afinidad per se favorece el paso a CP; mientras que señales aportadas por los LiT vía CD40-CD40L
favorecen un fenotipo de memoria. Por otro lado, IL-2 junto a IL-10, al igual que IL-5 e IL-6
favorecen la diferenciación a CP, mientras que IL-4 favorece el paso a célula de memoria. Estos
eventos de diferenciación son regulados por diversos factores de transcripción, de los cuales el
mejor caracterizado es Blimp-1 (B lymphocyte induced maturation protein-1) que participa en el
desarrollo de CP. Finalmente, después de la diferenciación las células de memoria se dirigen a ZM,
mientras que los plasmoblastos migran a médula ósea o lámina propia intestinal, en donde se
transforman en CP secretoras de Acs. Es posible que algunos LiB de ZM puedan entrar a los
folículos y formar CG.
Durante el desarrollo de la presentacion se presentaran ejemplos de la dinámica de la respuesta
folicular y extrafolicular de células esplénicas en infecciones producidas por distintos parásitos,
particularmente en la producida por el Trypanosoma cruzi.
11:10-12:00 hs.
C1-4. Células T reguladoras: ¿Cuál es su rol durante las enfermedades parasitarias?
Pérez AR – Instituto de Inmunología – Facultad de Ciencias Médicas – Universidad Nacional de
Rosario. CONICET. [email protected]; [email protected]
Las células T reguladoras (Tregs) son células supresoras que intervienen en el mantenimiento de la
homeostasis inmunológica y la auto-tolerancia. Además, serían un componente fundamental en la
modulación de la respuesta inmune efectora durante procesos infecciosos de diversa índole.
Las células Tregs se han caracterizado en base a su origen y fenotipo. Las “naturales” madurarían
en el timo y fenotípicamente serían CD4+CD25+FoxP3+. Las “inducibles” (Th3, Tr1 y
CD8+CD25+) se desarrollarían en la periferia a partir de células CD4+ convencionales. El reciente
descubrimiento de células CD4+ periféricas capaces de inducir la expresión de FoxP3+ hace menos
evidente la distinción entre naturales e inducibles. No obstante, un sinnúmero de experimentos in
vivo e in vitro indican que estas poblaciones ejercen su acción supresora por contacto célula-célula
o a través de la producción de IL-10 y TGF-β.
Si bien el conocimiento acerca del rol que cumplen las Tregs en las infecciones parasitarias aún es
escaso, no es sorprendente que puedan controlar diversos mecanismos efectores anti-parasitarios a
fin de evitar que sea la misma respuesta inmune la que dañe al huésped.
El tipo de relación que se establezca entre el huésped y el parásito dependerá del balance final
entre la respuesta supresora mediada por las Tregs y la respuesta efectora. En un primer escenario,
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si la supresión de la respuesta anti-parasitaria ejercida por las células Tregs es excesiva, podría
desencadenarse el crecimiento desmedido del parásito y eventualmente la muerte del huésped. En
el escenario opuesto, si la reacción efectora desplegada contra el parásito se halla poco contraregulada, se promoverá eficientemente su erradicación. No obstante, esto último podría conducir al
agravamiento del daño tisular causado por mecanismos inmunológicos y afectar asimismo la
supervivencia del huésped. Una situación intermedia, conveniente desde un punto de vista
evolutivo, consistiría en el desarrollo de una respuesta T reguladora balanceada, de manera tal que
permita limitar el crecimiento parasitario, y a la vez, evitar la patología tisular. En otras palabras,
esto aseguraría la supervivencia de ambos organismos y facilitaría la cronificación de la infección.
Los parásitos han desarrollado diversos mecanismos de evasión de la respuesta inmune a fin de
asegurar su supervivencia. Una de las estrategias de escape estaría orientada a disminuir la
intensidad de la respuesta antiparasitaria, ya sea aumentando la capacidad supresora de las Tregs, o
favoreciendo el reclutamiento y permanencia de éstas células en los sitios de infección.
Aún falta determinar aspectos claves acerca del rol de las células Tregs, como su participación en
el mantenimiento de la memoria inmunológica o la naturaleza de los antígenos parasitarios que
reconocerían. La adquisición de este conocimiento es uno de los desafíos mas importantes en este
campo para los próximos años, no sólo para determinar la importancia relativa que estas células
tienen en la protección y en la patología, sino debido a su potencial implicancia en la producción
de vacunas u otras estrategias terapéuticas que podrían desenvolverse para tratar las infecciones
parasitarias.
C2. TALLER: DIFERENTES ENFOQUES Y TECNICAS DE TIPIFICACION
DE CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI
Coordinador: Dr. Patricio Diosque. Unidad de Epidemiología Molecular, Instituto de Patología
Experimental, CONICET-Universidad Nacional de Salta, Argentina. ChagasEpinet Consortium.
8:00-8:40 hs.
C2-1. Epidemiología molecular de la enfermedad de Chagas en Chile usando minicirculos y
ensayos de hibridación.
Solari A. Programa de Biología Celular y Molecular, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad
de Medicina, Universidad de Chile. Casilla 70086, Santiago 7, Chile.
El conocimiento de los insectos vectores que transmiten T. cruzi, así como el estudio de los
genotipos de parásitos circulantes en un área endémica determinada, es relevante para entender la
epidemiología de la enfermedad de Chagas. Hemos escogido la metodología de análisis de
minicirculos por medio de PCR e hibridación contra un panel de sondas escogidas como son los
genotipos de T. cruzi más representativas en Chile (TcI, TcIIb, TcIId y TcIIe). Estos métodos
cautelan ser de alta sensibilidad en la detección del parásito y ser muy específicos para identificar
los genotipos infectantes aún en condiciones de infecciones mixtas. En el presente trabajo, se
muestran resultados de presencia de genotipos de T. cruzi en pacientes (57), reservorios silvestres
(117) y peridomésticos (70), y vectores silvestres del género Mepraia (227) así como Triatoma
infestans (120), de la zona central de Chile (Región Metropolitana y IV Región). Mientras en
humanos el genotipo más prevalente en sangre es TcI, después de TcIIb y TcIId (con un alto nivel
de infecciones mixtas cercano al 45%) con frecuencias de 0.70, 0.54 y 0.33 respectivamente. En T.
infestans de focos silvestres la presencia de TcI, TcIIb, TcIId aparecen con frecuencias cercanas a
13
0.95, 0.05 y 0.05, respectivamente. En el ciclo de transmisión silvestre donde Mepraia spinolai es
el único vector en esa zona endémica los genotipos TcI, TcIIb, TcIId y TcIIe circulan con
frecuencias de 0.60, 0.20, 0.15 y 0.10, respectivamente (con un alto nivel de infecciones mixtas
cercano al 50%). En 5 especies de reservorios silvestres (P. darwini, A. olivaceus, O. degus, T.
elegans y R. rattus), las frecuencias para TcI, Tcb, TcIId y TcIIe resultó con cifras de 0.41, 0.40,
0,25 y 0 .21, respectivamente (con un alto nivel de infecciones mixtas cercano al 41%).
En dos especies de reservorios peridomésticos (C. hircus) con 21 animales, los genotipos de T.
cruzi más prevalentes resultaron ser TcIId, TcIIb, TcI y TcIIe con frecuencias de 0.43, 0.33, 0.29 y
0.15, respectivamente. Mientras que en 51 O. cuniculus los más prevalentes resultaron ser TcIId,
TcI, TcIIe y TcIIb con frecuencias de 0.68, 0.41, 0.23 y 0.14, respectivamente. En ambos las
infecciones mixtas fueron sobre el 40% del total.
Estos datos permiten concluir que en Chile el genotipo TcI circula ampliamente en humanos e
insectos vectores de la zona central, sin embargo, los otros genotipos del linaje TcII también están
presentes en reservorios así como insectos del género Mepraia, los cuales representan los vectores
silvestres con más riesgo para transmitir T. cruzi al humano. Agradecimiento FONDECYT
1085154
8:40-9:20hs.
C2-2. Epidemiología molecular de los ciclos de transmisión de Trypanosoma cruzi en zonas
rurales del Chaco argentino.
Cardinal MV. Laboratorio de Eco-Epidemiología-FCEN-UBA, Argentina
Con el fin de establecer si los ciclos de transmisión doméstico y silvestre se solapan o si existen
independientemente en las áreas de estudio, el abordaje que proponemos consiste en la
combinación de estudios epidemiológicos de prevalencia y distribución de infección por
Trypanosoma cruzi en reservorios y vectores con la identificación de linajes parasitarios obtenida
mediante estrategias de PCR. En un estudio realizado entre el 2000-2007 en dos áreas rurales
vecinas de Santiago del Estero (Chaco semiárido) con diferente historia de transmisión y control
vectorial las prevalencias de infección por T. cruzi fueron del 1-23% para Triatoma infestans
domésticas y peridomésticas (N= 2.243), 5-12% para perros domésticos (N=697), 2-7% para gatos
(109), 5% para los humanos (N=612) y < 1% para mamíferos silvestres (N=586). El linaje II
predominó entre los 99 aislados caracterizados y el linaje I predominó entre los 6 aislados
obtenidos de mamíferos silvestres. T. cruzi IIe predominó en los hábitats domésticos; fue hallado
en 87% de los 54 aislados de T. infestans, en 82% de los 33 aislados de perros y en los 4 gatos
hallados infectados. Entre los mamíferos silvestres, las zarigüeyas (Didelphis albiventris) se
hallaron infectadas con linaje I y un zorrino (Conepatus chinga) con T. cruzi IIc. Los ciclos
domésticos y silvestres se solapaban en el área de estudio a fines de los 1980s, cuando ocurría
intensa transmisión doméstica, y en el presente aún se solapan marginalmente. La introducción de
T. cruzi desde los hábitats silvestres a los domésticos ocurriría muy raramente en el actual contexto
epidemiológico local. La distribución por vivienda de los linajes de T. cruzi mostró que las
vinchucas, perros y gatos de una determinada vivienda compartían el mismo linaje parasitario en la
mayoría de los casos. Basado en evidencia molecular, este resultado refuerza la importancia de los
perros y gatos como reservorios domésticos de T. cruzi.
Actualmente se halla en marcha un nuevo estudio de epidemiología molecular en el municipio de
Pampa del Indio, provincia del Chaco (Chaco húmedo). La prevalencia de infección por T. cruzi
fue del 25% para perros (N=480) y gatos (N=91) y del 20,4% en mamíferos silvestres (N=44); en
T. infestans disminuyó desde 22% (N=473) en el estudio de base pre-rociado a 3-8% (N=385)
luego de un rociado masivo con insecticidas piretroides. Hasta el momento hemos obtenido unos
53 aislados parasitarios de triatominos, 50 de perros y gatos, y 9 de mamíferos silvestres. Los
14
linajes de T. cruzi se identificaron en muestras cultivadas de cada animal infectado obteniendo
como resultado TCI para las zarigüeyas D. albiventris y TCIIc para los armadillos Dasypus
novemcinctus. Los resultados sugieren la existencia de transmisión activa de T. cruzi en la zona
previa al rociado masivo con insecticidas. A diferencia de lo hallado en el Chaco semiárido
santiagueño donde ningún armadillo fue hallado infectado y tampoco fue capturado D.
novemcinctus, en el área de Pampa del Indio, los armadillos D. novemcinctus resultaron uno de los
principales reservorios silvestres (junto con las zarigüeyas) presentando una elevada prevalencia de
infección (67%) y elevada infectividad al vector (84%).
9:20-10:00 hs.
C2-3. Tipificación molecular directa de T. cruzi en la infección de pacientes con
inmunosupresión
Burgos JM, Vigliano C, Diez M, Cura C, Duffy T, Bisio M, Begher S, Favaloro L, Levin MJ,
Favaloro R, Schijman AG.
Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, INGEBI-CONICET; ICyCC R.
Favaloro; Htal I. Pirovano.
La enfermedad de Chagas presenta distintas incidencias y tipos de manifestaciones clínicas a lo
largo de todo el continente. Estas diferencias podrían deberse, al menos en parte, al histotropismo
clonal manifestado por poblaciones de T. cruzi heterogéneas con comportamientos biológicos
diferentes. Actualmente, basándose en polimorfismos genómicos, se reconocen dos linajes
parasitarios principales, Tc I y Tc II (con cinco subgrupos, Tc IIa-d). Recientemente, además, se
han descrito cinco haplotipos de Tc I basados en el polimorfismo del espaciador intergénico del
miniexón (Tc Ia-d). En este contexto, la tipificación de los parásitos causantes de una infección
puede quedar sesgada por el tipo de muestra analizada, así como por el proceso de estudio si
requiere de una amplificación parasitaria.
En este trabajo presentamos la tipificación directa, a partir de diferentes muestras biológicas
(sangre, tejido cardíaco, epitelial, cerebral y LCR), de los parásitos involucrados en la infección
Chagásica de pacientes que cursan un estado de inmunosupresión por trasplante cardíaco o por
SIDA. Dicha tipificación se realizó mediante un algoritmo de clasificación de T. cruzi basado en la
amplificación por PCR de las secuencias genómicas: i) secuencia intergénica del miniexón; ii)
Dominio D7 de la secuencia ribosomal 24 Sα; iii) Fragmento A10 y iv) secuenciación del
espaciador intergénico del miniexón de Tc I.
En función de los tejidos analizados, hallamos 6 infecciones sanguíneas por Tc II, 5 por Tc I y 1
mixta Tc I + Tc II. En tejido cardíaco fueron tipificados parásitos Tc Id (3 casos) y Tc II (8 casos)
tanto en muestras de explantes como en biopsias endomiocárdicas (BEM). Las infecciones
epiteliales fueron caracterizadas como Tc I (2 casos) y Tc II (2 casos). Una muestra de tejido
cerebral presentó parásitos Tc II y una de LCR Tc Ie.
El estudio de diversos tejidos de un mismo paciente permitió la observación de 4 pacientes con
infecciones mixtas e histotropismo diferencial: i) Un paciente trasplantado cuya parasitemia fue
caracterizada como Tc I presentó parásitos Tc II b/d/e en el explante cardíaco, en la reactivación
cutánea y en la BEM; ii) Un paciente trasplantado presentó parásitos Tc Id en el explante cardíaco
pero Tc IId en la sangre y en una muestra de biopsia cutánea; iii) Un paciente con SIDA mostró
una infección sanguínea de Tc IId pero parásitos Tc IIb en la muestra de biopsia de la lesión
cerebral; iv) Un paciente con SIDA presentó una parasitemia mixta (Tc I + Tc II) con una
infección simple Tc Ie en LCR. Por otro lado, 6 pacientes presentaron igual linaje parasitario en
todos los tejidos tipificados: dos pacientes infectados con Tc Ia y 4 con Tc II (2 IId, 1 IIb/e y 1 IIe).
Estos hallazgos demuestran la existencia de infecciones naturales mixtas donde queda evidenciado
el histotropismo diferencial de las poblaciones parasitarias en la infección humana, y resaltan la
15
importancia de la tipificación de los parásitos en el sitio de la lesión para permitir su asociación
con las formas clínicas de la enfermedad de Chagas.
10:00-10:20 hs. BREAK
10:20-11:00 hs.
C2-4. La predominancia de secuencias mHVR de T. cruzi específicas de cepa y su utilidad
para tipificar sublinajes por PCR
Marcipar I, Diez C. Laboratorio de Tecnología Inmunológica, Facultad de Bioquímica y Cs
Biológicas. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe Argentina. [email protected]
Analizando 40 mHVRs de la cepa Cl Brener, hemos señalado la presencia de 1 secuencia
mayoritaria del sublinaje TcIIe. Por otro lado, Tellería y col (2006), han descrito 2 secuencias
mHVR predominantes en el sublinaje TcIId. Si bien identificamos la presencia de las 3 secuencias
en todas las cepas de todos los sublinajes evaluados mediante PCR, encontramos que se encuentran
al menos 103 veces más representadas en los linajes en los que fueron identificadas que en los
demás. Sobre esta base hemos propuesto una técnica de PCR semicuantitativa (MLS-PCR) para
identificar cepas de los sublinajes TcIId, TcIIe, o para descartar su presencia. Para esto realizamos
una primera amplificación de las regiones hipervariables de los minicírculos (mHVR) del parásito
a partir de ADN de la muestra con los primers S121 y S122 y luego sobre 0,3 pg de ADN de este
primer producto amplificado, una segunda PCR con los primers específicos para amplificar las 3
secuencias mencionadas. Hemos evaluado la técnica con un panel de cepas de referencia por un
lado y con muestras tipificadas previamente por hibridización con sondas de mHVR o por
caracterización del miniexón y del ADN ribosomal. Con las cepas de referencia hemos obtenido
correlación total entre los resultados MLS-PCR y la tipificación esperada. Al analizar muestras
biológicas, todas las muestras previamente tipificadas como TcIId por caracterización del
miniexón y del ADN ribosomal tuvieron resultados coincidentes con la metodología MLS-PCR.
Cuando se analizó la correlación de los resultados obtenidos entre la nueva técnica y la
hibridización, se obtuvo un 96.4 % para TcIId y sólo un 54.8% para TcIIe. Estos resultados
indicarían una baja sensibilidad de la técnica para la detección de TcIIe, aunque no deben
descartarse reacciones inespecíficas de la sonda. Luego se realizó mediante esta técnica la
tipificación de 31 muestras de pacientes provenientes de Bolivia y distintas regiones de la
Argentina, los cuales resultaron ser todos portadores de cepas TcIId salvo para un caso que
tampoco era TcIIe. La ventaja de la técnica propuesta, respecto a otras descriptas, es que no
requiere del aislamiento y cultivo de parásitos a partir de la muestra biológica, siendo esta etapa
limitante debido a que a menudo no permite obtener el material necesario para tipificar y que
también puede generar un sesgo en la genotipificación debido a la selectividad de las técnicas
utilizadas para el asilamiento. Por otro lado, esta técnica también podría permitir subclasificar los
genotipos TcIId. Actualmente estamos trabajando en identificar secuencias mHVR mayoritarias
correspondientes a otros linajes y sublinajes de T. cruzi para clasificarlos según este nuevo criterio.
16
11:00-11:40 hs.
C2-5. La micro-epidemiolgía de Trypanosoma cruzi I y IIc en las Américas de acuerdo con un
análisis de microsatélites
Llewellyn MS. (The London School of Hygiene and Tropical Medicine), The European Union
ChagasEpiNet Consortium.
La Enfermedad de Chagas es una de las enfermedades parasitarias más importantes de América
Latina. Trypanosoma cruzi, presenta una importante diversidad genética, (de acuerdo con un
origen antiguo en las Americas). Seis genotipos mayores han sido identificados – Tc I, IIa, IIb, IIc,
IId, y IIe. Sin embargo, esta clasificación es probablamente un reflejo inexacto de la diversidad
total del parásito. Con el propósito de identificar diferentes genotipos, dentro de los linajes
mayores, que puedan tener importancia desde un punto de vista epidemiológico, en el presente
trabajo se estudiaron 49 marcadores microsatellitales sobre un total de 135 cepas TcI y 53 TcIIc,
provenientes de diferentes puntos de la la distribución continental de T. cruzi. Nuestros resultados
muestran ciertas similitudes con respecto a la genética poblacional de los dos linajes estudiados en
ciclos de transmisión silvestre: 1) Alta diversidad genética (Allelic richness (Ar) – 2.23-2.83). 2)
Multiclonalidad. 3) Ausencia de especificidad de hospedador o vector (no se observa una coevolución estricta dentro de TcI o TcIIc). 4) Exceso de homocigosis en comparación con lo
esperado de acuerdo con la ley de Hardy-Weinberg. Además, detectamos una menor diversidad en
las cepas silvestres de TcI en los Estados Unidos y America Central (Ar - 1.53), lo cual sugiere una
expansión geográfica rápida y reciente en este región. Resultados similares se obtuvieron para
cepas domesticas de TcI. La mayoría de las cepas de humanos mostraron una significativa
reducción de diversidad genética (Ar – 1.407 -1.486). En las cepas provenientes de Venezuela los
aislados obtenidos de humanos presentaron genotipos muy diferentes de aquellos obtenidos de
ciclos silvestres, a pesar de provenir de las mismas áreas de estudio. En el presente trabajo se
discuten la importancia de nuestros resultados con respecto a la comprensión de la dinámica de
transmisión y la epidemiología en general de los dos linajes estudiados.
11:40-12:20 hs.
C2-6. Epidemiología molecular de Trypanosoma cruzi I basada en la región intergénica del
gen miniexón
Herrera Bernal C1, Guhl F1, Falla A1, Bargues MD2, Breniere F3, Tomasini N4, Diosque P.4
1
Centro de Investigación en Microbiología y Parasitología Tropical (CIMPAT), Universidad de
Los Andes.2Unidad de Biología Molecular de Parásitos. Universidad de Valencia. España.3Institut
de Recherche pour le Développement (IRD). Montpellier, France. 4 Unidad de Epidemiología
Molecular Instituto. Facultad de Ciencias de la Salud Universidad Nacional de Salta – CONICET.
Argentina.
La tripanosomiasis americana es una zoonosis muy compleja presente en Latinoamérica y
continúa representando una grave amenaza para la salud de los países de la región. Trypanosoma
cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas afecta 28 millones de personas en áreas
endémicas. En busca de establecer correlaciones entre las características biológicas,
epidemiológicas y clínicas entre los diferentes linajes de T. cruzi, se han utilizado herramientas
bioquímicas y moleculares que han permitido proponer diversas formas de agrupamiento.
Aislamientos de T. cruzi I que circulan en Colombia fueron clasificados en cuatro haplotipos
asociados a diferentes ciclos de transmisión. Se diseñaron cebadores específicos sobre la
secuencia de la región intergénica del gen miniexon, que permiten evidenciar tres de los cuatro
haplotipos propuestos (Ia, Ib y Id). Basados en las características propuestas para los haplotipos
colombianos, se analizaron secuencias de aislamientos de T. cruzi I, provenientes de diferentes
17
sitios geográficos de América Latina con el fin de corroborar la existencia de los haplotipos
propuestos en Colombia. Se analizaron 85 secuencias de la región espaciadora no transcripcional
del gen mini exon de T.cruzi, procedentes de Colombia, Mexico, Bolivia, Perú y Argentina,
aisladas a partir de diferentes orígenes: Hospederos mamíferos: 23 cepas humanas, 3 de perro, 3 de
roedor. Reservorios silvestres: 5 cepas de D. marsupiales colombianos y 1 boliviano, 3 cepas de D.
alviventris de la región del Chaco. Insectos vectores: 37 cepas de los principales vectores en
Colombia, Mexico, Bolivia y Argentina.Las secuencias fueron alineadas y editadas manualmente
en el software Mega 4.0 y alineadas por Clustal W, sometidas a análisis filogenético molecular,
utilizando el software MEGA versión 4.0.
Se realizó inferencia filogenética por Máxima parsimonia (MP) con bootstrap de 500 repeticiones,
el árbol fue graficado en el programa TreeView (Win32) v1.6.6.
De las 85 secuencias analizadas, 30 se agruparon en el haplotipo Ia, 26 en el haplotipo Ib, una
secuencia se clasificó como haplotipo Ic, 23 aislamientos en el haplotipo Id y 6 secuencias no
agruparon en ninguno de los haplotipos, estos aislamientos corresponden a secuencias de T. cruzi
provenientes de muestras humanas y de T. infestans de Bolivia y una cepa Cutia, procedente de
Brazil. Estos aislamientos fueron agrupados bajo el nombre de haplotipo Bolivia por su origen
geográfico de aislamiento.
Las agrupaciones se realizaron bajo los parámetros propuestos para la clasificación en cada uno de
los haplotipos Ia, Ib, Ic y Id, respecto a las diferencias encontradas en la región de microsatélites y
al ciclo epidemiológico del cual proceden.
12:20-13:00 hs.
C2-7. Secuenciación de fragmentos de genes metabólicos (MLST: Multilocus Sequence
Typing) como respuesta a la necesidad de un gold standard para la tipificación de T. cruzi.
Diosque P. Unidad de Epidemiología Molecular, Instituto de Patología Experimental, CONICETUniversidad Nacional de Salta, Argentina.ChagasEpinet Consortium.
El conocimiento de la diversidad genética y filogenética dentro del taxón T. cruzi resulta de interés
desde dos puntos de vista, relacionados entre sí. Por un lado, existe un interés médico (clínico y
epidemiológico); y por otro lado, desde un punto de vista biológico más básico, existe un interés
relacionado con el conocimiento de la historia evolutiva de los diferentes linajes del parásito, los
mecanismos genéticos que intervienen en la generación de la diversidad genética observada, y en
la ocurrencia o no de procesos de recombinación genética, entre otros.
La aplicación de diferentes métodos moleculares de tipificación de T. cruzi a partir de aislamientos
del parásito, así como también directamente a partir de muestras biológicas, se ha incrementado en
los últimos años. Los métodos utilizados actualmente están basados en el conocimiento de la
existencia de los principales linajes dentro de T. cruzi (TCI, TCIIa-e), y en la disponibilidad de
ciertos marcadores que permiten identificar a dichos linajes, con diferentes grados de
especificidad. Simultáneamente, estudios más detallados de la diversidad dentro de cada linaje han
demostrado una importante diversidad de genotipos (particularmente dentro de TCI).
La diversidad genética de T. cruzi, su amplio rango de distribución geográfica, y la diversidad de
formas clínicas de la Enfermedad de Chagas, requieren de un enfoque acorde a la información
genómica y herramientas de análisis actualmente disponibles. Idealmente, este enfoque debería
proporcionar el marco para ajustar otros marcadores a ser utilizados en estudios de asociación
entre genotipos infectantes y cuadros clínicos, propiedades biológicas de las cepas, hospedadores,
vectores y distribución geográfica; así como también debería permitir análisis genéticos, de
genética poblacional y filogenéticos.
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La secuenciación de fragmentos de diferentes genes metabólicos (MLST: Multilocus Sequence
Typing) demostró ser de gran utilidad en este sentido tanto en bacterias como en algunos
organismos eucariotas.
En este trabajo, se presentan los resultados de MLST, utilizando fragmentos de 10 genes, para un
panel de 25 cepas de referencia de T. cruzi, representativas de los linaje TCI, TCIIa-e; para un
conjunto de 29 clones y cepas de un área endémica de la provincia de Chaco, Argentina; y para dos
outgroups (T. c. marinkellei). Se discute la posibilidad de establecer un esquema de MLST para T.
cruzi basado en un panel restringido de fragmentos de genes que pueda utilizarse como gold
standard en una base de datos de acceso público.
Financiado por: Seventh Framework Programme, European Commission (223034); Institute de
Recherche pour le Développement (IRD), Francia; FONCyT; CIUNSa.
CONFERENCIA INAGURAL
Current Status of Research in Acidocalcisomes
Docampo R
Center for Tropical and Emerging Global Diseases, and Department of Cellular Biology,
University of Georgia, GA, USA
Email: [email protected]
Acidocalcisomes are acidic calcium- and phosphorus-storage organelles found in a diverse range
of organisms including trypanosomatids, in which they were first defined. (Docampo et al., Nat.
Rev. Microbiol. 3, 251-261, 2005). Acidocalcisomes resemble lysosome-related organelles (LRO)
from mammalian cells in many of their properties. For example, we found that platelet dense
granules, which are LROs, are very similar to acidocalcisomes (Ruiz et al., J. Biol. Chem. 279,
44250-44257, 2004). They share a similar size, acidic properties, and both contain pyrophosphate,
polyphosphate and calcium. Recent work that indicates that they also share the system for targeting
of their membrane proteins through adaptor protein complex-3 (AP-3) reinforces this concept.
Knock down of the α subunit of AP-3 in T. brucei led to a dramatic disappearance of
acidocalcisomes from both procyclic and bloodstream forms, as revealed by
immmunofluorescence and electron microscopy assays, and by the decrease in their total calcium,
pyrophosphate, and polyphosphate content, as well as defects in cytokinesis, growth, and
susceptibility to osmotic stress. Acidocalcisomes interact with other organelles in protozoan
parasites, like the contractile vacuole in T. cruzi. The contractile vacuole is an organelle whose
presence in T. cruzi has been neglected until recently (Rohloff and Docampo, Exp. Parasitol. 118,
17-24, 2008). Acidocalcisomes possess several proteins that are potential novel targets for
chemotherapy (Docampo and Moreno, Curr. Pharm. Design 14, 882-888, 2008). Proteomic
analysis of acidocalcisomes of T. cruzi and T. brucei and the contractile vacuole of T. cruzi,
identified a number of enzymes and transporters including acidocalcisome markers such as V-H+PPase, vacuolar calcium ATPase and aquaporin. A selected set of genes of identified proteins was
cloned and the proteins expressed with epitope tags to confirm their localization. We detected
amino acid transporters, cation transporters, and homologues of yeast vacuolar transporter
chaperones in acidocalcisomes, and subunits a and B of the V-H+-ATPase, SNARE2.1 and
SNARE2.2, AP180, and other proteins in the contractile vacuole. Studies with the vacuolar
transporter chaperones (VTC) in T. brucei confirmed their acidocalcisome localization, and RNAi
experiments revealed a role of these proteins (VTC1, Fang et al., Biochem. J. 407, 161-170; VTC4,
19
unpublished) in acidocalcisome biogenesis and cell growth. Interestingly these VTC proteins have
been shown recently to form a complex and have polyphosphate polymerase and translocase
activity (Hothorn et al. Science 324, 513-516, 2009). Another exciting finding has been the
detection of acidocalcisome-like organelles in eggs of different species (Motta et al., Insect
Biochem. Mol. Biol. 39, 198-206, 2009). This is also interesting because the novel second
messenger NAADP has been shown to release calcium from acidic stores. Subcellular fractions of
sea urchin eggs enriched in acidocalcisomes showed calcium release parallel to polyphosphate
hydrolysis suggesting that this store is the one sensitive to NAADP.
MESAS REDONDAS
MR1 - CLINICA Y TRATAMIENTO DE LAS PARASITOSIS
Coordinador: Dr. Oscar BOTTASSO – Instituto de Inmunología. Fac. de Cs. Médicas. UNR.
MR1-1. Migración aborigen y urbanización de la enfermedad de Chagas
Beloscar J1, Lioi S1, Pezzotto SM2.
1
Cátedra y Servicio de Cardiología - Sección Chagas, Hospital Centenario de Rosario, UNR,
Rosario, Argentina. 2Instituto de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, UNR, Rosario,
Argentina.
La migración desde zonas de alta endemicidad y la urbanización de la enfermedad de Chagas (EC)
es un fenómeno conocido, por el cual prácticamente la mitad de la población de infectados
chagásicos residen en zonas urbanas. Un caso especial lo constituyen las poblaciones consideradas
formas de migración no tradicionales como las aborígenes, las cuales al haber modificado
forzadamente sus estilos de vida, podrían haber creado eventuales condicionantes de progresión de
la enfermedad. Las migraciones de pueblos aborígenes, con sus modelos antropológicos, sociales y
culturales diferentes, trasladados a la zona urbana y confinada en asentamientos irregulares, con
posibilidades limitadas de desarrollo, plantean la posibilidad de influencias distintas en una
eventual progresión a la miocarditis crónica. Estas poblaciones mantienen en la región de adopción
características socioculturales de convivencia particular las que eventualmente podrían modificar
la epidemiología y los aspectos sanitarios y de control cardiovascular relacionados con la EC. En
consecuencia, la problemática de la EC no puede enfocarse exclusivamente desde el punto de vista
médico, y tampoco alcanza con la tríada ecológica epidemiológica agente-vector-huésped. Es
necesario también analizar el contexto antropológico social y cultural, incluido el hábitat
demográfico y el marco político económico en el que se desarrolla.
Los objetivos de nuestro estudio fueron determinar la prevalencia de EC en individuos de
ascendencia aborigen procedentes de regiones endémicas y emigrados a la zona de Rosario,
habitantes de asentamientos irregulares. Además se revisaron las características epidemiológicas y
clínicas de esa población, determinando estimadores bioquímicos de salud / enfermedad y su
correlación con la presencia de EC.
Las limitaciones de acceso a la consulta, los inconvenientes y obstáculos en la intermediación, la
falta de comprensión para aprovechar las posibilidades de prevención y las creencias culturales
contrapuestas fueron quizás los rasgos más sobresalientes de esta investigación.
20
MR1-2. Miocarditis chagásica crónica. Influencia del sistema nervioso simpático en la
génesis de muerte súbita cardíaca.
Pellizón O.
Cátedra y Servicio de Cardiología - Sección Chagas, Hospital Centenario de Rosario, UNR,
Rosario, Argentina. [email protected]
La muerte súbita cardíaca (MSC) (MCHC) es la principal causa de muerte en la miocarditis
chagásica crónica (60-70% de los casos). La misma sobreviene por la aparición de arritmias
ventriculares malignas denominadas taquicardia ventricular y fibrilación ventricular. El proceso de
inflamación-cicatrización que ocurre en esta miocardiopatía genera el sustrato para la aparición de
estas arritmias. Sobre este miocardio alterado existen influencias de diferentes tipos, siendo uno de
ellos el sistema nervioso autónomo simpático. El mismo se activa cuando se realiza un ejercicio o
por un estrés emocional. Significativamente muchos episodios de MSC se producen como primera
manifestación clínica de la enfermedad, en pacientes aparentemente sano, y ante situaciones de
esfuerzo (trabajo) o estrés emocional. Nuestro grupo evaluó a una serie de pacientes con MCHC a
quienes el ejercicio, la infusión de isoproterenol (droga estimulante del sistema nervioso
simpático) y el estrés mental inducían arritmias ventriculares complejas, las cuales son predictoras
de MSC. Posteriormente se le administró una droga anti-simpática (beta-bloqueantes) provocando
la desaparición de estas arritmias. Durante un largo seguimiento (> 2 años) no se produjeron MSC.
Por lo tanto postulamos que los betabloqueantes podrían ser eficaces para disminuir la MSC
mediada por la estimulación simpática o adrenérgica.
MR1-3. Disturbios inmunoendócrinos en la Enfermedad de Chagas Crónica
Pérez AR1, Silva-Barbosa SD2, Revelli S1, Beloscar J3, Savino W2, Bottasso O1.
1
Instituto de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, UNR, Rosario, Argentina; 2Laboratorio
de investigación sobre Timo, Fundación Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. 3 Cátedra y Servicio
de Cardiología - Sección Chagas, Hospital Centenario de Rosario, UNR, Rosario, Argentina.
[email protected]
La evolución de la Enfermedad de Chagas está íntimamente relacionada al establecimiento de un
proceso inflamatorio crónico. Una vez superada la fase aguda, alrededor del 25% de los pacientes
infectados desarrollan una miocardiopatía crónica con infiltrados inflamatorios difusos y fibrosis.
Si bien la etiología de este proceso es aún materia de debate, es posible que diversos mecanismos
de control de la respuesta inflamatoria se ven afectados en los pacientes que evolucionan hacia las
formas mas graves de la enfermedad.
La regulación cruzada que se establece entre el sistema inmune y el endócrino durante diversos
procesos infecciosos parecería ser crítica en la resolución o mantenimiento del proceso
inflamatorio. Este “cross-talk” entre ambos sistemas ha sido muy poco caracterizado durante la
Enfermedad de Chagas. Sin embargo, se podría sospechar que el establecimiento de un franco
proceso inflamatorio durante la fase crónica de la enfermedad podría afectar a distintas funciones
endócrinas, las que a su vez podrían indirectamente influenciar el proceso inflamatorio en el tejido
cardíaco. Algunas hormonas, como el cortisol (CT) o la dehidroepiandrosterona (DHEA), podrían
intervenir modificando el perfil de citocinas y la función de las células inmunocompetentes,
repercutiendo en el control del parásito y/o en el desarrollo de mecanismos autoinmunes.
En función de esto nos propusimos evaluar si el status inmuno-endócrino en pacientes chagásicos
se correlacionaba con el grado de las manifestaciones clínicas. Para ello se reclutaron individuos
con serología positiva para T. cruzi, que fueron clasificados como asintomáticos o casos
indeterminados (I), o sintomáticos con cardiopatía leve (L) o severa (S) de acuerdo a la historia
clínica, electrocardiograma y a la Rx de tórax. Asimismo se reclutaron individuos sanos de
21
similares características (Co). En todos los pacientes se evaluaron los niveles séricos de CT,
DHEA-sulfato (DHEA-s), somatotrofina (GH), somatomedina (IGF-1), prolactina (PRL) y
hormonas tiroideas. Asimismo se evaluaron diversas citocinas en plasma (TNF-α, IL-6, IFN-γ,
MCP-1/CCL2, IL-10 e IL-4) a fin de establecer el perfil inflamatorio.
Los individuos infectados mostraron claras alteraciones en el balance adrenal, ya que se registraron
cantidades disminuidas de DHEA-s a medida que se agravaba la patología cardíaca, sin cambios en
la producción de CT o ACTH. Este patrón hormonal resulta en una relación CT/DHEA-s
significativamente aumentada en el grupo S en comparación a los restantes grupos (Spearman rank
Test, p<0.02). Los niveles de GH y la relación GH/IGF-1 se hallaron marcadamente aumentado en
el grupo S respecto de los grupos I y L (U de Mann-Whitney, p<0.01 en ambos casos). El eje
tiroideo no mostró alteraciones significativas. El perfil inflamatorio de se incrementó con la
severidad cardíaca, ya que los niveles de TNF-α, IL-6, MCP-1/CCL2 (p<0.05 S vs Co), sin
diferencias en IL-10. TNF-α e IL-6 son capaces de influir sobre el eje hipotálamo-pituitarioadrenal (HPA), sin embargo sus niveles no se correlacionaron con ACTH, CT, DHEA-s o la
relación CT/DHEA-s, sugiriendo algún tipo de desregulación a este nivel.
Estos resultados muestran que la infección chagásica crónica impacta sobre algunos ejes
endócrinos, observándose cambios notables en la actividad del eje HPA y el eje GH/IGF-1. El
papel que estas alteraciones puedan tener el establecimiento y la exacerbación de la miocarditis
requiere aún de más investigación.
MR2 - NUEVOS APORTES AL CONOCIMIENTO DE LA PATOGENESIS
DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Coordinadora: Dra. Pilar AOKI. CIBICI Dpto. de Bioq. Clínica Fac. De Cs. Químicas, UNC.
MR2-1. Efecto de los anticuerpos dirigidos contra las Proteínas Ribosomales P de
Trypanosoma cruzi sobre las células cardiacas.
Gómez K.
Laboratorio de la Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas (LaBMECH), Instituto de
Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI), Buenos Aires.
[email protected]
La Cardiopatía chagásica crónica (CChC) es la consecuencia más severa de la infección originada
por el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi, la cual se caracteriza por ser esencialmente una
cardiomiopatía arritmogénica con cuadros clínicos severos que pueden conducir a la muerte súbita
del paciente.
A nivel inmunológico, se demostró que los pacientes con CChC presentan un alto título de
anticuerpos (Ac) dirigidos contra las proteínas ribosomales P del parásito (Ac anti-P), y
especialmente contra su región C-terminal. Este epitope presenta una alta homología de secuencia
con el segundo rulo extracelular de los receptores cardiacos β-adrenérgico (β-AR) y M2muscarínico (M2-R). Debido a ello, los Ac anti-P de pacientes con CChC, así como el anticuerpo
monoclonal murino dirigido contra el péptido R13 de la región C-terminal de la proteína TcP2β,
denominado 17.2 (AcM 17.2), se unen y activan a estos receptores. La interacción produce
aumento de los niveles de AMPc, segundo mensajero de β-AR, cambios en la frecuencia
cardiocitos neonatales de rata y alteraciones electrocardiográficas en ensayos de
inmunotransferencia. Estudios recientes han demostrado que el AcM 17.2 induce apoptosis de
22
células cardiacas de fenotipo adulto, HL-1, la cual es inhibida por el agregado del antagonista
propranolol, indicando que este efecto sería mediado por la interacción del AcM 17.2 con β-AR.
Por otro lado, el análisis la respuesta inmune desarrollada en pacientes con CChC muestra que
aquellos sueros con reactividad contra el péptido R13 y el receptor β-AR inducen apoptosis de las
células cardiacas HL-1. Este efecto es bloqueado por el agregado de propranolol o por
preincubación con el péptido R13, indicando que la inducción de apoptosis sería un proceso
mediado por el activación del receptor β-AR y por interacción de los mismos con el paratope del
Ac que reconoce la región C terminal de las proteínas P.
Los resultados sugieren que la estimulación de los receptores β-AR por los Ac anti-P inducen
efectos cardiotóxicos similares a los ya descriptos por la exposición crónica a sus agonistas
específicos.
Estos estudios se proponen contribuir a dilucidar el mecanismo de patogenia de la CChC, lo que
podría constituir la base del desarrollo de alternativas terapéuticas específicas que permita mejorar
la calidad de vida y expectativa de sobrevida de estos pacientes.
MR2-2. El sistema beta-adrenérgico y las mitocondrias están involucrados en la
fisiopatogenia de la miocardiopatía chagásica
Paglini P.
Cátedra de Física Biomédica, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba.
La miocardiopatía chagásica es la más frecuente y severa consecuencia clínica de la infección por
Trypanosoma cruzi; su fisiopatogenia sin embargo, aún no se comprende completamente. Diversos
factores influyen en la evolución de la infección hacia la miocardiopatía chagásica crónica,
algunos de los cuales pueden presentarse desde la etapa aguda. En el presente trabajo, estudiamos
las alteraciones producidas en el sistema β-adrenérgico y en las mitocondrias cardíacas como
consecuencia de la infección aguda con dos cepas diferentes de T. cruzi, para determinar su
participación en la génesis de la futura cardiopatía. Estudiamos, en corazones de ratones infectados
con T. cruzi, cepa Tulahuén (Tul, n=70) a los 30 días post-infección (dpi) y aislamiento SGO Z12
(Z12, n=70), a los 50 dpi los siguientes eslabones del sistema β-adrenérgico: adrenalina (A) y
noradrenalina (NA) en plasma (RF-HPLC); densidad y afinidad de receptores β-adrenérgicos (βAR) (binding con ligando radiactivo); niveles de AMPc (ELISA), presencia de anticuerpos anti-βAR (cromatografía de afinidad); y contractilidad cardíaca y respuesta a A y NA exógenas. Por otro
lado, se estudió a los 10 y 30 dpi la estructura (microscopía electrónica) y la actividad enzimática
(espectrofotometría) de las mitocondrias, determinando la Citrato Sintasa (CS) del ciclo de Krebs y
de los complejos (C) I-IV de la cadena respiratoria. Un grupo de ratones no infectados (NI, n=50)
fue tomado como control. A y NA disminuyeron con respecto a SI en ambos grupos infectados
(p<0,01); la afinidad de los β-AR disminuyó (p<0,05), mientras que su densidad aumentó sólo en
Z12 (p<0,01); los niveles de AMPc aumentaron en ambos grupos con respecto a SI (p<0,01); sin
embargo, la contractilidad aumentó (p<0,05) sólo en Tul, y la respuesta a A y NA se mantuvo sin
cambios en Tul y disminuyó en Z12 (p<0,05). En esta etapa, no se detectaron anticuerpos que
interactúen con los β-AR. A los 10 dpi el 60% de las mitocondrias en Tul y el 44% en Z12
presentaron alteraciones estructurales; a los 30 dpi sólo el 12% de las mitocondrias presentaron
características normales en Tul y el 29% en Z12 (p<0,05). La actividad de CS en Tul disminuyó a
los 10 dpi y aumentó a los 30 dpi; en Z12 ocurrió lo contrario (p<0,05); en la cadena respiratoria se
destaca la caída de la actividad de CIII en Tul y en Z12 (p<0,0001). Demostramos entonces que, la
presencia del T. cruzi afecta tanto al sistema β-adrenérgico cardíaco como a las mitocondrias, y
que dichas alteraciones comienzan en la etapa aguda y están involucradas la génesis de la
miocardiopatía.
23
MR2-3. La actividad de la enzima Indoleamina 2,3 dioxigenasa (IDO) es esencial para el
control de la infección experimental con Trypanosoma cruzi.
Motran CC.
Departamento de Bioquímica Clínica. CIBICI-CONICET. Facultad de Ciencias Quimicas. UNC.
Córdoba. ARGENTINA. [email protected]
Durante la infección con T. cruzi es necesario que el huésped establezca, con una cinética precisa,
en una primera etapa una respuesta inflamatoria seguida de la activación de los circuitos
regulatorios capaces de controlarla. IDO es una enzima intracelular que cataliza el paso inicial y
limitante del catabolismo del aminoácido esencial triptofano (Trp) a kinurenina (Kyn). Su
actividad es up-regulada por mediadores pro inflamatorios como IFN-γ y TNF, promoviendo en
células IDO + la inhibición del crecimiento de algunos patógenos por el consumo del Trp
intracelular. Además, IDO participa en la supresión de la respuesta de Li T y en la inducción de
células Treg. El objetivo de nuestro trabajo fue determinar la participación de la IDO en el control
de la infección experimental con T. cruzi. Para ello la expresión y actividad de IDO así como
también los efectos del tratamiento con 1-MT (inhibidor de IDO) sobre el curso de la infección
fueron evaluados en ratones BALB/C y B6. La infección con T cruzi incrementó la expresión y
actividad de IDO en células de bazo, tejido cardíaco y músculo esquelético. El bloqueo de IDO
disminuyó la resistencia a la infección ya que incrementó significativamente los niveles de
parasitemia y disminuyó la sobrevida respecto al grupo control. Además, el bloqueo de IDO se
asoció con un mayor número de parásitos, de infiltrados inflamatorios y de áreas de necrosis tisular
en corazón y músculo esquelético. Cuando se evaluó el efecto de IDO in vitro sobre la replicación
del parásito en macrófagos (Mo), se observo que la inhibición de IDO resultó en un significativo
incremento de la replicación intracelular que fue revertida con el agregado de los catabolitos del
Trp 3-HK, 3-HAA y PA pero no de Kyn mientras que el agregado de Trp restituyó solo
parcialmente la inhibición de la replicación promovida por IDO. Posteriormente se evaluó la
contribución de las enzimas IDO e iNOS en el control de la replicación intracelular. La activación
de Mo con INF-γ y LPS indujo una importante actividad de iNOS e IDO y un efectivo el control
de la replicación intracelular. La inhibición de la iNOS utilizando aminoguanidina (AG) aumentó
en 4 veces mientras que la inhibición de IDO aumentó en 25 veces la replicación intracelular
mostrando la inhibición de ambas enzimas el mismo efecto que la inhibición de IDO. Nuestros
resultados demuestran que la actividad de IDO, a través de la producción de los catabolitos del Trp
es crítica para el control de la replicación de T. cruzi en las etapas tempranas de la infección.
MR3 - EPIDEMIOLOGIA Y VECTORES
Coordinador: Dra. Marta Victoria CARDINAL. Laboratorio de Eco-Epidemiología, UBA.
MR3-1. Imágenes Satelitales y Sistemas de Información Geográfico como herramientas
alternativas para el control de Aedes aegypti
Estallo EL, Almirón WR.
Centro de Investigaciones Entomológicas de Córdoba. Facultad de Ciencias Exáctas, Físicas y
Naturales. UNC. e-mail: [email protected]
24
Argentina, al igual que el resto de América Latina, sigue enfrentándose a los problemas que
plantean las infecciones virales endemo-epidémicas emergentes y re-emergentes. Recientemente,
hemos sufrido en nuestro país un importante brote de dengue con más de 27.000 casos notificados,
constituyendo así el problema sanitario más importante de los últimos tiempos.
Las imágenes satelitales constituyen una herramienta que permiten una comprensión más integrada
del ambiente, ya que proveen datos útiles para el monitoreo de las condiciones ambientales y poder
determinar cuándo son favorables para el éxito reproductivo, desarrollo, dispersión y supervivencia
de vectores, cobran importancia principalmente para la prevención de enfermedades transmitidas
como es el caso del dengue.
Para la ciudad de Orán (Salta), en el noroeste argentino, se han desarrollado modelos predictivos
de la actividad de Aedes aegypti, mediante regresiones lineales múltiples basadas en el monitoreo
de las oviposturas y usando imágenes satelitales para caracterizar el ambiente a través del uso del
índice de vegetación (NDVI) y de la temperatura de superficie (LST).
Por otro lado, los Sistemas de Información Geográfico, conocidos como SIG/GIS, permiten
georeferenciar los sitios de muestreo, y a través de análisis espaciales de puntos identificar
regiones con distintos niveles de riesgo de acuerdo a la abundancia de Aedes aegypti. Esto ha sido
aplicado también en la ciudad de Orán para generar mapas de agrupamientos que permitirían
establecer prioridades en las acciones de control vectorial, al localizar de manera eficiente las áreas
de la ciudad con mayor actividad del vector.
De esta forma, los modelos predictivos permitirían estimar la actividad del vector de acuerdo a las
condiciones ambientales dadas, mientras que los SIG permitirían la localización de los puntos
calientes, optimizando los recursos al poder establecer zonas prioritarias para el manejo integrado
de los mismos.
MR3-2 Triatoma infestans en el Gran Chaco argentino: no siempre la misma historia
Gurevitz JM.
Laboratorio de Eco-Epidemiología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de
Buenos Aires
Los grandes avances en el control de Triatoma infestans, el principal vector del Trypanosoma cruzi
en el Cono Sur latinoamericano, han encontrado en la ecorregión del Gran Chaco, que comprende
parte del norte y centro de Argentina y parte de Bolivia y Paraguay, obstáculos hasta ahora
insalvables. Es en el Gran Chaco donde se conjugan el núcleo de la distribución de T. infestans con
una población rural, dispersa, de gran pobreza y las asociadas debilidades institucionales y del
sistema de salud, generando desafíos para el control en múltiples dimensiones. El control vectorial,
mediado casi exclusivamente por la aplicación de insecticidas piretroides de efecto residual, no ha
podido lograr la sostenibilidad y la efectividad necesarias para interrumpir la transmisión vectorial
en la región. A fines de 2007 se comenzó el proyecto Pampa del Indio, en el Dpto. General San
Martín, Pcia. del Chaco, en un área rural de unas 350 viviendas. Al inicio, 38% de ellas estaban
infestadas por T. infestans, principalmente en los domicilios (22%), cocinas y depósitos (13%) y
gallineros (13%); sólo en 1% de los corrales se halló T. infestans. Cuatro meses después del
rociado completo de los domicilios y peridomicilios con piretroides, 12% de las viviendas
albergaban T. infestans; 85% de los sitios infestados contenían colonias; 77% estaban también
infestados pre-rociado. Abundancias por captura manual y estructuras etarias similares a las de
pre-rociado, junto a ensayos preliminares de resistencia a piretroides (MI Piccollo,
CIPEIN/CITEFA) y experimentos de rociado a campo, muestran que varias colonias sobrevivieron
al rociado, incluso en sitios donde normalmente el insecticida debería ser altamente efectivo.
Probablemente esto se deba a cierto grado de resistencia en estas poblaciones de T. infestans. Al
igual que en lo visto en el resto del Gran Chaco, el rociado piretroide no resultó totalmente
25
efectivo. Pero las causas de ello difieren de las de otras zonas de la región porque la región misma
es heterogénea. ¿Cuán heterogénea? ¿Heterogénea en qué? ¿Qué heterogeneidad importa? Los
presentes resultados sirven de contrapunto con experiencias en otras zonas para comenzar a
esbozar algunas respuestas. Respuestas detalladas y mayor sostenibilidad y efectividad de las
estrategias de control vectorial requieren oportuna investigación en diversas zonas de la región en
estrecha relación con el control y con quienes ejecutan el control, además de adecuados sistemas
de monitoreo de las acciones realizadas y de sus resultados.
MR3-3 Patrones de distribución y abundancia de Phlebotominae a diferentes escalas espaciotemporales
Quintana MG1,3,4, Salomón OD2,3,4, Lizarralde de Grosso MS1,3.
1
Instituto Superior de Entomología, Universidad Nacional de Tucumán.
2
Centro Nacional de Diagnóstico e Investigación en Endemo-epidemias-ANLIS, Buenos Aires.
3
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas-CONICET
4
Red de Investigación de Leishmaniasis en Argentina-REDILA
e-mail: [email protected]
Los casos de leishmaniasis tegumentaria (LT) se incrementaron en el mundo en las últimas
décadas. En Argentina, la incidencia de ésta enfermedad re-emergente prácticamente se triplicó en
la actualidad. Las principales actividades propuestas como factores causales de esta re-emergencia
son la urbanización desordenada y la deforestación.
La LT es endémica en varias provincias del noroeste y noreste del país, donde Salta, registra más
del 50% de los casos. Orán, es la ciudad más importante en el área considerada hiperendémica. Por
está razón la investigación se llevó adelante en la región del NOA, con distintas escalas de trabajo:
1) Escala Microfocal - Se analizó la distribución de Phlebotominae en la interfase vegetación
primaria modificada-cultivo. Se colectaron en total 4673 Phlebotominae correspondientes a cinco
especies. La especie más abundante fue Lu. neivai con un 94%, especien incriminada como el
principal vector de LT en la región. Las trampas cercanas a las zonas modificadas presentaron las
mayores abundancias y las trampas con menor abundancia se localizaron en el vértice del área de
estudio. La abundancia estuvo principalmente asociada a la precipitación. En este análisis se pudo
observar que pequeñas modificaciones en el paisaje conducen a aumento en la abundancia de los
insectos vectores, y se refuerza la necesidad de recomendaciones sobre el riesgo de LT antes que
se realice cualquier tipo de intervención ambiental en un área endémica, como así también un
monitoreo y vigilancia de la dinámica de los Phlebotominae en el lugar de la intervención, tanto
antes, durante y después del proceso.
2) Escala Focal - Se realizó en la ciudad Orán y alrededores con el fin de evaluar la distribución
espacial de los riesgos teniendo en cuenta la abundancia de Phlebotominae. Se colectaron en total
7.787 flebótomos de cuatro especies. La especie más abundante fue Lu. neivai con un 98%.
Durante la temporada de transmisión (abril-mayo) se colectó un individuo en uno de cinco sitios
urbanos, mientras que, en una trampa ubicada en un peri-urbano, se capturaron 2985 Lu. neivai en
una noche. En la otra estación de actividad del vector (septiembre-octubre) se observó que
modificaciones a pequeña escala resultaron en cambios notables en la abundancia de Lu. neivai. En
el establecimiento de un nuevo barrio en la periferia de la ciudad, se capturaron 1073 Lu.
neivai/sitio en el borde de la vegetación, y sólo uno en un domicilio cercano. Esto implica que el
riesgo de contacto efectivo en un foco de LT urbana esta todavía asociado con modificaciones en
la vegetación peri-urbana y en el ecotono aún cuando los casos tienen residencia urbana.
3) Escala Regional - Se desarrolló un mapa de riesgo exploratorio con el fin de proponer
recomendaciones para la prevención de LT. Las trampas se colocaron en Parques Nacionales y
26
zonas de influencia de Jujuy y Salta. Se capturaron 12.079 flebótomos de seis especies. La especie
más abundante fue Lu. neivai con 85%.
El mapa se realizó a partir de la abundancia de Phlebotominae y variables climáticas, sin introducir
en el análisis los casos humanos por errores por incidencia asintomática y ambigüedad de datos.
Las variables que más contribuyeron fueron la precipitación estacional, temperatura estacional y la
elevación. La precisión se evaluó mediante el valor del área bajo la curva (AUC).
Esta aproximación provee un recurso potencial óptimo y nuevo para la prevención de la
enfermedad y poder así establecer las estrategias de acción mas adecuadas.
MR3-4 Caracterización por PCR-RFLP y secuenciación de especies causantes de
leishmaniasis cutanea (lc) y leishmaniasis visceral canina (lvc) en la provincia de Misiones
(Argentina).
Acardi SA1, Giuliani MG1, Monzani MC1, Collado MS1, Salomon OD2, Liotta DJ1.
1
Laboratorio de Biologia Molecular Aplicada, FCEQyN, Universidad Nacional de Misiones.
2
CeNDIE. Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán”
Buenos Aires. [email protected].
La Leishmaniasis es una zoonosis causada por parásitos del género Leishmania (Kinetoplastida:
Trypanosomatidae). Esta enfermedad se presenta bajo dos manifestaciones clínicas diferentes
conocidas como Leishmaniasis Cutánea (LC) y Leishmaniasis Visceral (LV), dependiendo de la
especie del parásito involucrada en la infección y la respuesta inmunológica del hospedador. En la
provincia de Misiones se encuentran las dos formas de la enfermedad, aunque separadas
geográficamente, ocurriendo LC en el norte de la provincia y LV en el sur. El objetivo del presente
trabajo es realizar la tipificación de la/s especie/s de Leishmania causantes de LC y de LVC
circulantes en la provincia. Se analizaron muestras clínicas humanas correspondientes a biopsias
de úlceras cutáneas de pacientes provenientes de hospitales de Puerto Iguazú y Puerto Esperanza
en 2005 y 2008. En todos los casos se requirió el consentimiento de las personas participantes. Se
incluyeron también muestras clínico-veterinarias que consistieron en aspirados de ganglio poplíteo
de canes de la ciudad de Posadas. La tipificación de Leishmania sp. se realizó por PCR-RFLP
según Marfurt et al (2003) con blanco en el gen mini-exón que se encuentra en repeticiones en
tándem de 100 a 200 copias, presentando regiones conservadas y otras con variabilidad de tamaño
y secuencia entre las diferentes especies. El ensayo de restricción se realizó con la enzima HaeIII.
El total de las diez biopsias de casos humanos analizadas resultaron positivas por PCR-RFLP para
la especie Leishmania braziliensis, tres de las cuales fueron confirmadas por secuenciación. En
tanto que las seis muestras pertenecientes a canes con clínica compatible con LVC resultaron ser
positivas para Leishmania complejo donovani, de las cuales dos se confirmaron por secuencia. En
vista de los resultados obtenidos el ensayo de PCR-RFLP con blanco en esta región genómica se
presenta como una alternativa valiosa para la tipificación de las especies causantes de
Leishmaniasis Cutánea y Leishmaniasis Visceral Canina presentes en la provincia.
MR4 – BIOLOGIA MOLECULAR
Coordinador: Dr. Claudio PEREIRA. Inst. de Inv. Médicas Alfredo Lanari (IDIM) Lab. De
Biología Molecular de T. cruzi (LBMTC) Buenos Aires.
27
MR4-1 Localización subcelular de la fosfodiesterasa TcrPDEC2 y su rol en osmorregulación
en Trypanosoma cruzi.
Schoijet A1, Docampo R2, Miranda K3, de Souza W3, Torres HN1, Flawiá MM1, Alonso GD1
1
INGEBI-CONICET, Buenos Aires, Argentina. 2University of Georgia, Athens, GA, United
Status. 3Universidad Federal de Río de Janeiro, Río de Janeiro, Brasil.
Trypanosoma cruzi posee un ciclo de vida complejo, durante el cual, se debe enfrentar a cambios
repentinos en su entorno. Un aspecto de particular relevancia es su habilidad para adaptarse a
cambios extremos en la osmolaridad que ocurren dentro del insecto vector y a medida que el
parásito se mueve hacia la célula hospedadora. El segundo mensajero AMPc posee una importante
función en la osmorregulación en T. cruzi. Se ha demostrado que luego de someter a epimastigotes
a un estrés hiposmótico, se produce una translocación de la aquaporina TcAQP desde los
acidocalcisomas hacia el complejo de la vacuola contráctil (CVC), y que dicho tráfico es
estimulado por análogos de AMPc e inhibidores de fosfodiesterasas (PDEs). Recientemente
hemos caracterizado una fosfodiesterasa específica para AMPc en T. cruzi, denominada
TcrPDEC2, la cual posee un dominio FYVE, el cual se encuentra involucrado en el
direccionamiento hacia membranas ricas en fosfatidilinositol 3-fosfato (PI 3-P). Siguiendo con esta
vía de señalización, también hemos clonado y caracterizado funcionalmente a TcVps34, la primer
fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) identificada en T. cruzi.
En el presente trabajo se describe un rol funcional de TcrPDEC2 en los procesos de
osmorregulación en T. cruzi. Mediante ensayos de estrés hiposmótico se determinó que parásitos
salvajes pre-incubados con inhibidores de TcrPDEC2 recuperan más rápidamente su volumen
original en comparación a aquellos parásitos sin tratar; mientras que parásitos transgénicos que
sobre-expresan TcrPDEC2 pre-incubados con estos inhibidores no mostraron diferencias en
comparación a los parásitos control. Además, coincidiendo con su rol en osmorregulación,
TcrPDEC2 mostró estar localizada en el espongioma de epimastigotes de T. cruzi, dentro del CVC.
Cabe destacar además, que en parásitos transgénicos que sobre-expresan TcVps34 esta PDE se
localiza no sólo en el CVC sino que también se distribuye en gránulos por todo el cuerpo del
parásito, lo cual indicaría una posible interacción regulatoria entre ambas proteínas produciendo
una deslocalización de TcrPDEC2 debido probablemente a un aumento en los niveles de PI 3-P
intracelulares. Por último y con el fin de estudiar en mayor profundidad la relevancia del dominio
FYVE de TcrPDEC2, demostramos que parásitos transgénicos carentes de dicho dominio no
poseen actividad fosfodiesterasa.
En conjunto, estos resultados muestran que TcrPDEC2 está involucrada en procesos
fundamentales para la supervivencia de este parásito como lo es la osmorregulación, así como
también postulan la importancia de su dominio FYVE para la funcionalidad de la enzima.
MR4-2 Interferencia con ARN por alimentación en el ciliado Tetrahymena thermophila
aplicada a la identificación de desaturasas de esteroles.
Najle SR1, Nusblat A2, Tomazic ML2, Nudel C2, Uttaro AC1.
1
Departamento de Microbiología. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBRCONICET). Suipacha 531. S2002LRK, Rosario. Argentina; 2 Cátedra de Biotecnología y
Microbiología Industrial, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín
956, 1113 Buenos Aires, Argentina.
Los ciliados del género Tetrahymena son protozoos de vida libre que habitan suelos, arroyos,
lagunas y estanques. Son células grandes, de 40 a 50 μm a lo largo de su eje antero-posterior, con
unas 1000 cilias ordenadas principalmente en filas longitudinales. La organización genómica de
28
los ciliados es inusual ya que presentan dualismo nuclear. Estos microorganismos constituyen un
excelente sistema biológico para el estudio de varios aspectos de la bioquímica de membranas. Las
membranas de T. thermophila contienen un único alcohol triterpenoide pentacíclico, el
tetrahymanol, que el microorganismo es capaz de sintetizar mediante la ciclación del escualeno
producido a través de la vía del ácido mevalónico. El tetrahymanol se localiza principalmente en
las membranas limitantes del organismo y su función parece ser similar a la de los esteroles en las
membranas de organismos superiores. A pesar de no poseer esteroles sintetizados endógenamente,
Tetrahymena tiene la capacidad de incorporar esteroles existentes en el medio y modificarlos
produciendo pro-vitaminas D. En el caso de los esteroles de la serie “colestan”, los mismos son
convertidos principalmente en 7, 22-bis dehidrocolesterol mediante una serie de desaturaciones en
las posiciones C5(6), C7(8) y C22(23). Esta capacidad de biotransformación de esteroles tiene un
claro interés biotecnológico ya que el 7-dehidrocolesterol es la provitamina D3, y la eventual
aplicación de esta actividad enzimática en la constitución de alimentos funcionales de origen
animal tendría el doble efecto de la reducción del contenido de colesterol con el concomitante
enriquecimiento en provitamina D3. A pesar del gran desarrollo de herramientas genéticas y de
biología molecular utilizables en T. thermophila existe una serie de restricciones prácticas para su
aplicación: 1) el genoma de este organismo es muy rico en A+T lo que torna muy trabajosa su
amplificación por PCR; 2) los codones UAA y UAG, que son codones de terminación en otros
organismos, codifican aquí Glutamina (Q) dificultando la expresión heteróloga de genes; 3) las
células deben encontrarse en conjugación para ser competentes para la electroporación. Las células
vegetativas pueden transformarse por bombardeo biolístico o, con mucha menor eficiencia, por
microinyección directa del macronúcleo. Debido a estas dificultades se decidió poner a prueba la
técnica de interferencia con ARN por alimentación con bacterias que sobre-expresan ARNs de
doble hebra. Esta técnica fue desarrollada para el nemátodo Caenorhabditis elegans, y
posteriormente fue aplicada con éxito en otros organismos incluyendo nemátodos parásitos e
incluso ciliados de otros géneros, pero nunca antes fue empleada sobre Tetrahymena. Esta sencilla
técnica pudo ser aplicada en Tetrahymena, permitiendo la identificación de una oxigenasa con
dominio Rieske [2Fe-2S] que participaría en la conversión de esteroles en derivados Δ7
insaturados, transformando el colesterol en provitamina D3.
MR4-3 Un motivo de reconocimiento de RNA como señal de localización
nucleocitoplasmática en tripanosomas
Cassola A, Frasch AC.
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-Instituto Tecnológico Chascomús, UNSAMCONICET, 1650 San Martín, Provincia de Buenos Aires, Argentina.
Las proteínas de unión a RNA (RBPs) y el metabolismo del RNA juegan un papel crítico en la
regulación post-transcripcional de la expresión genética en tripanosomas, dado que estos parásitos
protozoarios carecen de mecanismos que regulen la iniciación de la transcripción. Previamente en
nuestro laboratorio se ha identificado a TcUBP1, una RBP de Trypanosoma cruzi principalmente
citoplasmática y que posee un único Motivo de Reconocimiento de RNA (RRM). TcUBP1 cumple
roles en la estabilización y desestabilización de mRNA, y en la protección de transcriptos de la
degradación a través de su reclutamiento en gránulos citoplasmáticos. Ahora mostramos que
TcUBP1 tiene una dinámica nucleocitoplasmática, que le podría permitir unir transcriptos en el
núcleo y acompañarlos en su tráfico hacia el citoplasma. En condiciones de stress, TcUBP1 se
acumula en el núcleo, una propiedad que es dependiente de una activa transcripción y de la
interacción de esta RBP con RNA. La secuencia que determina la acumulación nuclear y la
exportación de TcUBP1 fue acotada al RRM de 92 aminoácidos, y mutaciones puntuales que
suprimen la capacidad de unir RNA eliminan la dinámica nucleocitoplasmática. TcUBP1 también
29
colocaliza con transcriptos en el núcleo, apoyando la unión a mRNA en ese compartimiento. La
distribución normal de TcUBP1 se afecta cuando se sobre-expresa la proteína, aumentando su
abundancia en el núcleo, y generando un aumento de la abundancia de transcriptos nucleares,
implicando a esta RBP en la exportación nuclear de mRNA. Proponemos que TcUBP1 podría ser
un enlace entre la exportación de mRNA con el recambio y la estabilización en gránulos a ambos
lados del poro nuclear, utilizando el RRM como una señal de de localización nuclear y
exportación.
MR4-4 Proteínas de la familia “High Mobility Group” en Trypanosoma cruzi: Estructura de
la cromatina y procesos nucleares.
Cribb P, Perozzi M, Villanova GV, Serra E.
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. FCByF. UNRosario. [email protected]
Las modificaciones en la estructura de la cromatina y su efecto sobre los distintos procesos
nucleares han adquirido gran protagonismo en los últimos años. En tripanosomátidos, la
posibilidad de un control transcripcional basado en mecanismos epigenéticos es de particular
importancia debido a la ausencia de promotores y reguladores transcripcionales clásicos.
Los genomas de Tri-Tryp contienen secuencias codificantes para metil-transferasas, acetiltyransferasas, desacetilasas y, factores con bromodominios, que podrían ser responsables de las
modificaciones postraduccionales observadas en las histonas, y de algún tipo de regulación
epigenética. Recientemente, algunas de las funciones de estas enzimas han sido caracterizadas en
T. brucei, y se han observado cambios en la estructura de la cromatina, durante el ciclo de vida de
T. cruzi y de T. brucei, asi como durante el ciclo celular de epimastigotes en cultivo.
En nuestro laboratorio se han identificado distintas proteínas de T. cruzi con posibles funciones
relacionadas con la estructura de la cromatina
TcBDF2 es una proteína nuclear con bromodominio, un dominio de unión a lisina acetilada
presente en complejos con actividad histona-acetil transferasa, factores de transcripción y/o
reguladores de la estructura de la cromatina. TcBDF2, se une a las histonas H2A y H4 acetiladas y
se acumula durante la irradiación con UV, lo que sugiere que podría formar parte de un complejo
remodelador de la cromatina y estar implicada en los procesos que median la reparación del daño
al ADN.
TcHMG-B pertenece a la familia de proteínas “High Mobility Group” (HMG), componentes
abundantes de la cromatina capaces de distorsionar, curvar o modificar la estructura del ADN en la
cromatina. Estas proteínas pueden presentar tanto funciones genómicas globales en el
establecimiento de dominios de cromatina activa e inactiva, como funciones de control específico
sobre un número limitado de genes. TcHMG-B y sus ortólogas de T. brucei y Leishmania, tienen
dos dominios “HMG box” al igual que las HMG-Bs de mamíferos. Las HMG-Bs de
tripanosomátidos carecen de la región acídica C-terminal típica de las HMG-Bs y, en cambio,
presentan una región N-terminal de unos 110 aminoácidos ausente en otros organismos. Ensayos
de “Western Blot” e inmunofluorescencia demostraron que la proteína se expresa en el núcleo de
epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes de T. cruzi. La sobreexpresión de TcHMG-B en
epimastigotes de T. cruzi utilizando el vector pTREX, produce parásitos con formas aberrantes que
presentarían dificultades durante la división celular ya que se observaron parásitos con más de un
flagelo y una relación anómala de núcleo/kinetoplasto. Si bien, los transfectantes se lograron
seleccionar, los cultivos de las cepas que sobreexpresan TcHMG-B, tienen una velocidad de
crecimiento menor que los controles y luego de algunas semanas mueren.
Por otra parte, TcHMG-B, al igual que otros componentes de la familia de HMGs, es capaz de
producir una curvatura en el ADN, sugiriendo que también en T. cruzi, esta proteína jugaría un rol
30
estructural, pudiendo modificar a la cromatina globalmente o de manera puntual y así afectar
procesos fundamentales como la transcripción, la replicación y la reparación del ADN.
MR5 – SEMINARIOS DE BIOQUIMICA
Coordinador: Dr. Antonio UTTARO. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario.
FCByF. UNR.
MR5-1 Caracterización funcional de enzimas vinculadas a la regeneración de NADPH en
tripanosomátidos
Leroux A, Nowicki C
Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA-IQUIFIB-CONICET, Buenos Aires, Argentina.
e-mail: [email protected]
Los tripanosomátidos (TriTryps) requieren una continua provisión de NADPH para asegurar tanto
los procesos de biosíntesis como la defensa frente el estrés oxidativo. Se cree que en la
regeneración de NADPH estarían involucradas varias deshidrogenasas tales como las enzimas del
ciclo de las pentosas, las enzimas málicas (EMs) y putativas isocitrato deshidrogenasas citosólicas
(IDHc), entre otras. Sólo las enzimas de la vía de las pentosas y las EMs de T. cruzi han sido
caracterizadas funcionalmente. Con el fin de poder establecer comparaciones entre las distintas
vías de regeneración de NADPH activas en los miembros de la familia de TriTryps, nos basamos
en la información disponible en los proyectos genoma de estos parásitos para probar la
funcionalidad de las putativas EMs de T. brucei y Leishmania. También, investigamos la presencia
de la putativa isoforma IDHc en TriTryps. Llamativamente en el genoma de Leishmania se detectó
sólo una copia génica y la secuencia de aminoácidos de la putativa IDH se distingue notoriamente
de las correspondientes a las IDHcs de tripanosomas. El putativo gen IDH de Leishmania
codificaría la isoforma mitocondrial. Para alcanzar los objetivos planteados, clonamos y
expresamos las distintas enzimas recombinantes en E. coli. Las EMs de T. brucei caracterizadas en
este trabajo presentaron igual distribución subcelular que sus contrapartes en T. cruzi, también sus
propiedades cinéticas resultaron semejantes a sus ortólogos en ese patógeno. T. cruzi posee una
EM mitocondrial y otra citosólica, siendo esta última marcadamente activada por aspartato
(Cannata y col. 1979). De nuestros resultados surge que la isoforma citosólica de T. brucei es 50
veces más sensible a la activación por AcCoA que por aspartato. En cambio, Leishmania posee
una EM de localización citosólica que no responde a la activación por aspartato ni por AcCoA y
carece de la contraparte mitocondrial. Mediante ensayos de Western-blot pudimos demostrar que
las EMs se expresan en los distintos estadios del ciclo de vida de tripanosomas. Por otra parte,
comprobamos que tripanosomas, pero no Leishmania sp., poseen IDHcs funcionales, siendo estas
isozimas específicas para el NADP. La caracterización cinética de la IDHc de T. cruzi mostró que
esta enzima posee Kms aparentes relativamente bajos para el isocitrato (54 μM) y similares a los
de las EMs para el NADP (56 μM). A pesar de que las IDHcs de T. cruzi y T. brucei poseen una
señal de internalización peroxisomal, estudios de inmunofluorescencia indirecta en procíclicos y
extracción con digitonina en epimastigotes confirmaron su localización exclusivamente citosólica.
Ensayos de Western-blots mostraron que las IDHcs también se expresan a lo largo de todo el ciclo
de vida de ambos tripanosomas. TriTryps cuentan con una variada batería de enzimas capaces de
regenerar NADPH. Sin embargo, nuestros resultados muestran que el patrón de expresión de EMs
y IDHcs no esta conservado entre estos parásitos, así como tampoco lo están las propiedades
31
bioquímicas de estas enzimas, lo cual pone una vez más en evidencia las diferencias metabólicas
entre estos protozoos patógenos. Dado que estos parásitos enfrentan distintas necesidades
metabólicas y condiciones particulares de estrés oxidativo a lo largo de sus ciclos de vida,
requieren de variadas fuentes de regeneración de NADPH. Es posible que las enzimas que
intervienen en estos procesos hayan surgido a partir de la adaptación evolutiva de estos parásitos a
los distintos entornos celulares en los cuales se desarrollan.
MR5-2 Metabolismo redox en Entamoeba histolytica. Caracterización del
sistema dependiente de tiorredoxina
Arias DG 1, 2, Iglesias AA2, Guerrero SA1
1
Laboratorios de Bioquímica Microbiana y Enzimología Molecular. 2Instituto de
Agrobiotecnología del Litoral (IAL; FBCB, UNL-CONICET). Paraje “El Pozo” CC 242. Santa Fe
S3000ZAA. Argentina.
El parásito intestinal Entamoeba histolytica es el agente causal de la amebiosis, una enfermedad de
importancia en salud pública en países en vías de desarrollo. Normalmente, el parásito vive y se
desarrolla en el intestino grueso bajo condiciones anaeróbicas o microaerofílicas. Sin embargo, E.
histolytica es capaz de atravesar la mucosa intestinal e infectar el hígado. Durante la fase
extraintestinal, E. histolytica es expuesto a un incremento en la presión de oxígeno y,
consecuentemente, a altas concentraciones de especies reactivas del oxígeno. Estudios previos han
demostrado que el parásito puede tolerar hasta un 5% de oxígeno gaseoso. Todas las formas de
vida han desarrollado sistemas enzimáticos eficientes para resistir el daño oxidativo. El sistema
tiorredoxina participa en la respuesta al estrés oxidativo, la regulación de la síntesis de ADN, la
transcripción génica, el crecimiento celular y la apoptosis. Este sistema ha sido caracterizado en
diferentes tipos de parásitos. En el caso de E. histolytica, se propuso que el balance redox
intracelular era mantenido principalmente por cisteína, una peroxirredoxina (Ehp29 o Eh2CysPrx)
y una proteína de 34 kDa (Ehp34) caracterizada como una NADPH:flavina oxidorreductasa. Se
pudo establecer además que E. histolytica posee insignificantes cantidades de glutatión y de que
carece de las enzimas asociadas a él, siendo la cisteína el tiol intracelular principal.
Presentamos en este trabajo evidencias de la presencia en E. histolytica del sistema TRX, formado
por una tiorredoxina reductasa de bajo peso molecular (EhTRXR) y cuatro isoformas de TRX
típicas (EhTRX6, EhTRX8, EhTRX41 y EhTRX111). Este sistema se ha caracterizado estructural,
termodinámica y cinéticamente [en la reducción de peróxidos dependiente de peroxirredoxina
(Eh2CysPrx), de disulfuros de bajo peso molecular (tales como cistína, glutatión disulfuro y
tripanotión disulfuro) y de S-nitrosotioles (tales como S-nitrosoglutatión y S-nitrosocisteína)]. Un
hecho interesante fue que la enzima EhTRXR presentó la facultad de emplear NADH como
sustrato reductor con afinidades comparables al NADPH. La gran versatilidad del sistema TRX de
E. histolytica podría deberse, en parte, a sus potenciales de reducción: de -292 mV para EhTRXR y
de -283 mV (valor promedio) para las EhTRX, lo que favorece la reducción de una amplia
variedad de sustratos. A nivel celular, el sistema TRX se localizó (mediante técnicas
inmunológicas) sobre la periferia de la membrana plasmática de trofozoitos de E. histolytica.
Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre las reacciones que, en E. histolytica, dirigen el
flujo de equivalentes de reducción. Este mecanismo metabólico sería crítico para la supervivencia
y virulencia del parásito, no solo por la participación en la detoxificación de hidroperóxidos, sino
también por el mantenimiento de las formas reducidas de otros compuestos. Este funcionamiento
versátil soporta la idea de que el sistema TRX juega un rol relevante en la defensa del parásito
contra las especies reactivas del oxígeno durante la fase extraintestinal de la infección. En adición,
estos resultados posibilitan hacer una correcta asignación estructura-función de los datos obtenidos
del proyecto genoma de este parásito.
32
MR5-3 Genómica funcional de permeasas de aminoácidos de Trypanosoma cruzi
Canepa GE, Carrillo C, Bouvier LA, Miranda MR, Cámara M de los M, Pereira CA. Laboratorio
de Biología Molecular de Trypanosoma cruzi (LBMTC), Instituto de Investigaciones Médicas
(IDIM, CONICET-UBA). Fundación Instituto Leloir.
El Trypanosoma cruzi presenta numerosas características metabólicas diferenciales respecto a sus
hospedadores insectos y mamíferos. Algunas de estas diferencias probablemente fueron
consecuencia de millones de años de adaptación al parasitismo en los cuales estos organismos
protozoarios reemplazaron rutas metabólicas de biosíntesis por sistemas de transporte de
metabolitos. En este trabajo se identificó por primera vez un transportador de aminoácidos de T.
cruzi. El gen denominado TcPAT545 perteneciente a la familia AAAP (Amino Acid/Auxin
Permeases) fue caracterizado funcionalmente y codifica para una permeasa de lisina. Hasta la
actualidad la única función conocida de este aminoácido en T. cruzi es la osmoregulación, pero no
se descarta que intervenga en otras rutas metabólicas. Mediante ensayos de complementación en S.
cerevisiae y sobreexpresión en T. cruzi se logró identificar y validar esta permeasa especifica para
el transporte de lisina. Se generó un modelo estable de epimastigotes transgénicos que poseen entre
10 y 40 veces la velocidad de transporte de lisina respecto a los controles. Estos resultados fueron
complementados con la caracterización del sistema endógeno de transporte de lisina en
epimastigotes. Teniendo en cuenta que estas moléculas se encuentran completamente ausentes en
mamíferos podrían ser consideradas como potenciales blancos contra el T. cruzi.
MR5-4 Identificación de genes del metabolismo de esteroles en el ciliado Tetrahymena
mediante análisis bioinformático y noqueo somático.
Nusblat AD1, Tomazic ML1, Najle SR2, Rinaldi MA1, Uttaro A2, Nudel CB1.
1
Cátedra de Biotecnología y Microbiología Industrial, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113 Buenos Aires, Argentina.
2
Departamento de Microbiología. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBRCONICET). Suipacha 531. S2002LRK, Rosario. Argentina.
Las enzimas que intervienen en el metabolismo de esteroles se encuentran ampliamente
distribuidas y presentan estructuras primarias altamente conservadas. Los intermediarios y
productos de estas vías modulan la fluidez de membranas y cumplen funciones metabólicas y de
señalización intra e intercelular en todos los organismos eucariotas.
No todos los organismos poseen las enzimas intervinientes de la vía completa de síntesis de
esteroles. Este es el caso de organismos invertebrados como nematodos e insectos y varios
protozoarios como los ciliados.
El requerimiento de esteroles entre los ciliados es irregular. Por ejemplo, Paramecium tetraurelia
requiere esteroles para su desarrollo vegetativo. En cambio Tetrahymena satisface este
requerimiento sintetizando hopanoides (símil esteroles encontrados en bacterias), principalmente
el tetrahymanol, con el que regula la fluidez y permeabilidad de las membranas, en conjunto con
los ácidos grasos. La capacidad de ciertos ciliados de sintetizar y usar hopanoides puede ser una
reliquia metabólica, remanente de los tiempos en que la atmósfera era anaerobia, ya que, a
diferencia de los esteroles, su síntesis no requiere oxigeno molecular.
Si bien Tetrahymena carece de la capacidad de sintetizar esteroles, cuando estos se agregan en el
medio de cultivo se interrumpe inmediatamente la síntesis de tetrahymanol y el esterol adicionado
es incorporado y, en ciertos casos, también modificado. Se han detectado cuatro tipos de
33
modificaciones posibles: la introducción de dobles enlaces en posiciones C5(6), C7(8) y C22(23) y
la remoción del grupo etilo del carbono 24.
Ninguna de las enzimas responsables de estas transformaciones han sido aisladas. A partir de una
caracterización preliminar de las actividades C7(8) y C22(23) esterol desaturasas, en fracciones
microsomales, se determinaron sus requerimientos de oxigeno, NAD(P)H y Cytb5. La búsqueda
informática de un consenso de esterol desaturasas Cytb5 dependientes reveló 8 genes putativos en
el genoma de Tetrahymena.
El análisis de las hipotéticas secuencias proteicas las agrupa dentro de la superfamilia de
hidroxilasas de ácidos grasos, que incluyen las C5 esterol desaturasas, C4 metil oxidasas y C4
esfingolipido hidroxilasas. Estas enzimas tienen motivos conservados de histidina y son proteínas
integrales de membrana.
Con el fin de identificar los genes responsables del metabolismo de esteroles en Tetrahymena
thermophila se procedió a generar mutantes mediante noqueo somático por precombinación
homóloga. Para ello se realizaron construcciones por overlapping PCR, consistentes en un gen
marcador seleccionable y regiones homologas flanqueantes de cada uno de los genes a noquear.
MR6 - INMUNOLOGIA DE ENFERMEDADES PARASITARIAS
Coordinadora: Dra. Patricia PETRAY. Servicio de Parasitología-Chagas. Hospital de Niños Dr.
Ricardo Gutiérrez.
MR6-1 Compartimentación de la respuesta inmune en la enfermedad de Chagas
Mirkin GA.
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
de Buenos Aires.
Introducción: La respuesta inmune en la infección por Trypanosoma cruzi presenta características
que comparte con otras enfermedades parasitarias tisulares: Aún en presencia de una respuesta
inmune efectora aparentemente efectiva, el parásito persiste en el hospedero. Para explicar este
fenómeno se han propuesto diversas hipótesis. El objeto de esta presentación es revisar e integrar
las hipótesis y modelos existentes, con el fin de abordar posibles explicaciones sobre la
persistencia de T. cruzi.
¿Dónde se aloja el parásito? Todos los estudios realizados desde el descubrimiento de T. cruzi,
demuestran que los distintos aislamientos de T. cruzi (tanto de humanos como de otros mamíferos)
tienen predilección por diversos tipos celulares in vivo. Por lo tanto, podemos definir aislamientos
predominantemente miotrópicos y macrofagotrópicos, o pantrópicos. Esto no excluye que
cualquiera de los aislamientos, independientemente de su tropismo predominante in vivo, sea capaz
de invadir otros tipos celulares in vitro. El tropismo parasitario condiciona, por lo tanto, la
respuesta inmune efectora que será efectiva para el control, no erradicación, del parásito. Es
necesario comprender que, si bien la eliminación de tripomastigotes es relevante para evitar la
diseminación parasitaria a órganos y tejidos aún no parasitados, la respuesta efectora frente a
antígenos expresados por amastigotes y su destrucción en células parasitadas, es crucial para
limitar la generación de aquel estadío.
Respuesta inmune periférica y local en la infección por T. cruzi: En modelos experimentales se
ha observado que los cambios en la frecuencia de linfocitos T citotóxicos y Th1 específicos en
34
periferia y tejidos parasitados, acompañan los cambios en la carga parasitaria. En humanos, estas
poblaciones celulares predominan en tejidos no linfoides, asociados a nidos de amastigotes. Si bien
estos resultados sugieren que los linfocitos T citotóxicos y Th1 son fundamentales para reducir la
carga parasitaria, también se infiere de ellos que existen mecanismos que limitan su actividad
efectora. Diversos modelos experimentales han demostrado que la actividad efectora de linfocitos
T está alterada en los tejidos parasitados en comparación con los de periferia. Este fenómeno
podría explicarse, al menos parcialmente, por la presencia de linfocitos T T. cruzi-específicos, que
secretan citoquinas moduladoras luego de ser reclutados desde los órganos linfoides secundarios.
Conclusión: La evaluación integrada de la respuesta inmune permite aclarar algunos de los
mecanismos que contribuyen a la persistencia parasitaria. En particular, el análisis de los
mecanismos efectores en los compartimentos linfoide y no linfoide ha contribuido a demostrar la
existencia de poblaciones de linfocitos T efectores con un repertorio funcional diferente. Algunas
de estas poblaciones reconocen y destruyen células parasitadas, en tanto otras modulan la respuesta
específica. Si bien este mecanismo contribuiría a modular la inflamación crónica, paradójicamente,
promovería la persistencia parasitaria. El conocimiento profundo de esta dualidad es fundamental
para elaborar estrategias para la cura parasitológica, particularmente en aquellos individuos en los
que el tratamiento farmacológico existente no resulta efectivo.
MR6-2 Rol de receptores tipo Toll y citoquinas en la respuesta inmune innata al estrés de la
infección por Trypanosoma cruzi.
Gea S.
CIBICI-CONICET. Dpto. Bioquímica Clínica. Facultad de Ciencias Químicas. UNC. e-mail:
[email protected]
La familia de receptores de inmunidad innata Toll like receptors (TLR) juega un rol central tanto
en la eliminación de patógenos como en el desarrollo de procesos patológicos. Las citoquinas son
mediadores solubles que regulan numerosos procesos celulares incluyendo la diferenciación y la
sobrevida y cumplen funciones reguladoras. Recientemente, en nuestro laboratorio se analizó
comparativamente la respuesta inmune y el daño tisular durante la infección aguda por T. cruzi en
ratones BALB/c y C57BL/6 (B6) que difieren en la susceptibilidad a esta infección. El hígado fue
uno de los órganos mas afectados con numerosos infiltrados, áreas necróticas y apoptosis celular,
siendo la cepa B6 la que presentó el mayor daño hepático. El nivel de transaminasas estuvo
incrementado en ambas cepas aunque fue mayor y mas sostenido en ratones B6. Si bien el número
de parásitos fue seis veces menor en la cepa B6 vs BALB/c en el pico de la parasitemia, la cepa B6
presentó mayor mortalidad, 80% vs 40%. Asociado a estos hallazgos se detectó un exacerbado
perfil de citoquinas pro-inflamatorias producidas por leucocitos intrahepáticos de B6.
Interesantemente, IL-10 y TGF-β sólo fueron encontradas en hígado de BALB/c y las células
F4/80+ y Gr1+ fueron las células inflamatorias predominantes en el hígado de ambas cepas. Para
profundizar en las bases moleculares de estos fenómenos, investigamos el compromiso de TLRs y
citoquinas en hígado. Se observó que la expresión de TLR2 y TLR4 estaba disminuida en B6 e
incrementada en BALB/c. Por el contrario, TLR9 estuvo incrementado en B6 y disminuido en
BALB/c al finalizar la fase aguda de la infección. Al realizar un estudio cinético de su expresión
en leucocitos hepáticos, se encontró que TLR2 y TLR4 no mostraban diferencias entre las cepas.
Sorprendentemente, en células parenquimales hepáticas se demostró una mayor inducción de
TLR2 y TLR4 sólo en BALB/c. Durante la búsqueda de los mecanismos que subyacen en la
patogénesis de esta infección, observamos elevados niveles de óxido nítrico y especies reactivas de
oxígeno asociados con elevada y persistente expresión de iNOS y gp91 y p47 phox de NADPH
oxidasa en hígado de ratones B6.
35
En conjunto, estos resultados proveen nueva evidencia para entender los mecanismos que
gobiernan durante la inmunidad innata en la cual la diferente regulación de TLRs y citoquinas
producidas por células inmunes y no-inmunes pueden conducir a la regeneración tisular y la
sobrevida de ratones BALB/c o a la injuria tisular y destino fatal observado en la cepa B6.
MR6-3 Evaluación de sistemas vacunales basados en proteínas recombinantes para la
prevención de la toxoplasmosis
Martin V.
CESyMA, Esc. Ciencia y Tecnología. UNSAM, Buenos Aires.
e-mail: [email protected]
La infección con Toxoplasma gondii, un protozoario intracelular obligado, tiene una gran
importancia médica y veterinaria a nivel mundial, ya que es una causa de enfermedades congénitas
y abortos en humanos y en animales domésticos. El tratamiento es dificultoso debido a los efectos
tóxicos de las drogas disponibles, con lo cual el desarrollo de nuevas drogas antitoxoplasma o de
una vacuna preventiva es una alternativa atractiva. Hasta el momento existe una única vacuna
comercial para uso en ovejas basada en taquizoitos atenuados de la cepa S48, por lo que su uso no
resulta adecuado para humanos. La mayor parte de los trabajos actuales se centraron en la
búsqueda de vacunas basadas en proteínas del parásito purificadas o recombinantes, y de ADN con
el fin de prevenir la infección toxoplásmica adquirida y/o congénita. La infección natural con T.
gondii genera en el hospedador una fuerte respuesta del tipo TH1, que resulta en una protección de
por vida contra una nueva infección
En particular en nuestro laboratorio se analizó el valor inmunoprotectivo de tres antígenos de
secreción de organelas especializadas en ensayos de vacunación contra la infección con T. gondii:
GRA4, un inhibidor de serin-proteasas TgPI-1 (ambos antígenos de los gránulos densos) y ROP2
(antígeno de las roptrias). La inmunización con formas recombinantes de estos antígenos
combinados con hidróxido de aluminio, adyuvante cuyo uso está permitido en humanos, generó
una respuesta inmune mixta capaz de conferir protección parcial frente a la infección con el
parásito: 32-45% (rGRA4), 25-47% (rROP2) y 38% (rTgPI-1) de reducción en la carga parasitaria
cerebral. Considerando la importancia de la función del adyuvante en la inducción de una
respuesta inmune adecuada, se evaluó el efecto inmunoprotectivo de estos antígenos cuando se los
combina con oligodeoxinucleótidos-CpG, adyuvante capaz de generar respuestas con fuerte perfil
Th1 y que ya se encuentra en ensayos clínicos de fase II. Como se esperaba, la combinación de los
antígenos con ODN-CpG generó una respuesta inmunológica con un perfil TH1 predominante en
ratones vacunados, los cuales mostraron una reducción significativa en el número de quistes
cerebrales: 63% (rROP2), 62% (rGRA4), 66% (rROP2+rGRA4) y 32% (rTgPI-1). Finalmente, con
el objetivo de optimizar estas estrategias de inmunización, se evaluó la capacidad de rTgPI-1
combinada con alum y/o ODN-CpG en un protocolo de “prime-boost”, en conferir protección a
ratones C57/BL6, altamente susceptibles frente a la infección toxoplásmica. Mientras que las
inmunizaciones por una única vía (intradérmica) de rTgPI-1+alum no resultaron en una reducción
significativa de la parasitemia (13%-22%), los ratones inmunizados siguiendo protocolos de
prime-boost (boost intranasal con rTgPI+ODN-CpG) generaron alta reducción de 49%-55%
comparado con el grupo control. Estos resultados indican que la combinación de distintos sistemas
vacunales que incluyen distintos antígenos y adyuvantes resulta una buena estrategia para ser
utilizada en el desarrollo de una vacuna contra la toxoplasmosis.
36
MR6-4 Regulación de la activación de células dendríticas por antígenos de Fasciola hepatica
y ligandos para receptores Toll: Potencial terapéutico en respuestas inmunoprotectoras o
anti-inflamatorias.
Cervi L, Falcón C, Carranza F.
CIBICI-CONICET. Dpto. de Bioquímica Clínica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad
Nacional de Córdoba.
Las células dendríticas (CD) cumplen una función crucial en el organismo, ya que participan en la
detección y endocitosis de patógenos en la periferia, luego migran hacia órganos linfáticos, en
donde realizan la presentación antígenica a linfocitos T naive. Este último evento es clave en la
modulación de la respuesta inmune adaptativa, ya que dependiendo del estado de maduración de
estas células, pueden dirigir la respuesta de linfocitos T, hacia un perfil Th1, Th2, Th17 o T
regulatorio.
Esta habilidad de las CD para modular el tipo de respuesta adaptativa, ha sido utilizada con fines
terapéuticos, tanto para potenciar respuestas efectoras contra determinados patógenos, o por el
contrario para inhibir respuestas inflamatorias excesivas en enfermedades autoinmunes. Datos de
nuestro laboratorio muestran que antígenos del parásito helminto Fasciola hepatica (AFh), no
inducen la maduración de las CD. Sin embargo la preincubación de estas células con los antígenos
del parásito, y posterior estímulo con un ligando para el receptor de tipo Toll (TLR4) como es
LPS, resulta en un alto grado de maduración de estas células. La inmunización de ratones BALB/c
con CD así tratadas indujo en los bazos de estos animales un perfil de respuesta tipo T helper 1.
Además, los animales inmunizados con estas células y posteriormente infectados con
metacercarias del parásito, mostraron menor daño hepático con respecto a los animales solo
infectados. Estos datos muestran que la manipulación del estado de activación de las CD, permite
direccionar el tipo de respuesta inmune adaptativa en los animales infectados, lo se correlacionó
con la prevención en el daño que ocurre en el hígado, órgano blanco en la infección.
Por otra parte el tratamiento simultáneo de CD con AFh y otro ligando para TLR como CpG-ODN
(ligando para TLR9), permite a estas células alcanzar un estado de maduración intermedio con alta
producción de IL-10 (citoquina anti-inflamatoria) y baja de citoquinas pro-inflamatorias (IL-12p70
y TNF). Estas células así tratadas se utilizaron para la inmunización de ratones DBA1/j,
susceptibles al desarrollo de artritis reumatoidea inducida por colágeno. Nuestros resultados
mostraron que la inmunización de estos animales con CD tratadas con AFh conjuntamente con
CpG-ODN, presentaron un menor índice de artritis, determinado por el grado de hinchazón en la
extremidades de estos animales. Estos datos nos muestran que el tratamiento ex vivo de CD con
AFh y CpG, confiere a estas células propiedades anti-inflamatorias in vivo, ya que fueron capaces,
una vez inyectadas, de disminuír el índice o score clínico de la enfermedad.
La manipulación de la maduración de CD con antígenos de F. hepatica en conjunto con ligandos
para receptores TLR, resulta una herramienta interesante para modificar la inmunidad innata y de
ese modo inducir respuestas anti-inflamatorias que permitan disminuír respuestas inmunes
exacerbadas. Por el contrario CD activadas con antígenos del parásito y ligandos TLR, podrían
también resultar potentes adyuvantes para inducir protección en contra de la infección con un
parásito endémico en nuestro país.
37
COMUNICACIONES ORALES
SESION CO1 - BIOLOGÍA MOLECULAR
CO1-1. Clonado y análisis bioinformático de los microRNAs de Echinococcus granulosus.
Cucher M, Rosenzvit M.
Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, UBA. [email protected].
Echinococcus granulosus es un parásito cestode de ciclo de vida indirecto que posee entre sus
hospedadores intermediarios animales ungulados y ocasionalmente al hombre. Presenta una
distribución geográfica cosmopolita y se lo puede agrupar en distintas cepas de acuerdo al
hospedador intermediario del cual se lo aisla. Estas cepas presentan diferencias entre sí, que
abarcan tanto aspectos biológicos como moleculares. Algunas presentan una menor especificidad
de hospedador intermediario que otras, lo cual genera el interrogante sobre la causa que les permite
sólo a estas cepas desarrollarse en un mayor número de hospedadores. Otra característica
sobresaliente de este parásito es que el estadío larval de protoescólex (PE) presenta la capacidad
dual de desarrollarse a quiste (metacestode) o adulto dependiendo de si se encuentra dentro del
hospedador intermediario o definitivo, respectivamente. Un enfoque que aún no ha sido abordado
en este parásito y que podría proveer información sobre los mecanismos involucrados en su
desarrollo y diferenciación, es el estudio de la regulación génica mediante microRNAs. Estos
RNAs no codificantes de 19-24 nucleótidos de longitud, regulan la expresión de sus genes blanco
mediante la degradación de los RNA mensajeros o inhibiendo su traducción. Actúan
principalmente sobre genes involucrados en desarrollo y diferenciación celular y han sido aislados
de numerosos organismos, no habiendo sido reportada aún la existencia de este mecanismo en
cestodes. Es por esto que decidimos estudiar el desarrollo de este parásito mediante el análisis de la
expresión de microRNAs. Para ello, se procedió a realizar una genoteca de RNAs pequeños
aislados a partir de PEs de quistes porcinos, se secuenciaron los fragmentos clonados y se realizó
el análisis bioinformático correspondiente. Como resultado, se identificaron secuencias homólogas
a microRNAs ya descriptos en otras especies y secuencias que presentan las características típicas
de esta clase de RNAs pequeños (longitud de microRNA maduro de 19-24 nucleótidos, longitud
del microRNA precursor de 60-70 nucleótidos y estructura secundaria de “hairpin”) que
representarían microRNAs novedosos. Estos resultados constituyen la base de futuros estudios de
regulación del desarrollo de manera comparativa entre cepas y/o estadíos de E. granulosus, y muy
probablemente su extrapolación a otros organismos.
CO1-2. Rol de la palmitoilación en la proteína HSP20 en Toxoplasma gondii.
De Napoli MG, Angel SO, Corvi MM.
INTECH. [email protected].
Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado y un patógeno humano de importancia.
Durante su ciclo de vida, T. gondii requiere lípidos para la síntesis de membrana para los nuevos
parásitos. Además, para que la invasión a la célula se produzca, hay ciertas proteínas que requieren
interactuar con sistemas de membranas, entre ellas proteínas que se dirigen al complejo de
membranas interno (IMC) y conforman el glideosoma (aparato locomotor de T. gondii). Un
38
posible mecanismo para que ello ocurra es la palmitoilación de estas proteínas, la cual les otorga la
suficiente hidrofobicidad como para que la interacción proteína/membrana ocurra. La proteína
HSP20 de T. gondii (TgHSP20) no presentar en su secuencia aminoacídica regiones
transmembranas, regiones hidrofóbicas, ni sufre de un proceso de maduración proteolítico en el
citoplasma. A pesar de ello, TgHSP20 se localiza en el IMC del parásito. Mediante experimentos
utilizando parásitos marcados metabólicamente con palmitato tritiado, demostramos que TgHSP20
se palmitoila “in vivo” y que la región N-terminal es la región aceptora del palmitato, coincidiendo
con el predictor de palmitoilación CSS-palm. Utilizando parásitos que expresan de manera estable
TgHSP20 truncada en sus primeros 30 aminoácidos (TgHSP20D30-Ty), se observó que esta
construcción presenta un alto grado de co-localización con TgHSP20 de secuencia completa.
Actualmente, se esta estudiando la importancia que presentan los residuos de cisteínas en
TgHSP20 utilizando distintas versiones mutantes de la proteína.
CO1-3. Avances en el estudio de las nucleósido difosfato quinasas de Trypanosoma cruzi.
Miranda M1, Cámara MM1, Canepa GE2, Bouvier LA2, Pereira CA2.
1
Laboratorio de Biología Molecular de Trypanosoma cruzi, Instituto de Investigaciones Médicas
(IDIM, CONICET-UBA). 2Laboratorio de Biología Molecular de Trypanosoma cruzi (LBMTC),
Instituto de Investigaciones Médicas (IDIM, CONICET-UBA). [email protected].
Las nucleósido difosfato quinasas son enzimas que catalizan la transferencia de fosfatos de alta
energía desde nucleósidos trifosfato a nucleósidos difosfato. TcNDPK1 y TcNDPK2 son dos
nucleósido difosfato quinasas del parásito Trypanosoma cruzi que fueron descriptas recientemente
por nuestro laboratorio. En el presente trabajo se reportan los avances obtenidos en el estudio de
dichas enzimas. Determinamos que TcNDPK1 (isoforma canónica) localiza en la vacuola
contráctil, que su sobre-expresión genera vacuolas de gran tamaño y que luego de un shock
hiposmótico transloca a numerosas vesículas. Estas observaciones podrían sugerir la participación
de TCNDPK1 en osmorregulación. Por su parte, TcNDPK2 (una variante con dominio N-terminal
DM10) localiza en el flagelo, en el citoesqueleto y en el citosol, presenta además un patrón de
extracción similar al de la tubulina, sugiriéndose que podría proveer el GTP necesario para la
polimerización de los microtúbulos. A su vez el dominio DM10 fue suficiente para dirigir a GFP
hacia esas estructuras. Por primera vez, en este trabajo, las nucleósido difosfato quinasas son
asociadas a las funciones mencionadas. El estudio de estas fosfotransferasas ubicadas en diferentes
organelas y estructuras subcelulares, permitirá esclarecer los fenómenos que ocurren en torno a la
distribución eficiente de energía en la célula.
CO1-4. Análisis ribonómico de la proteína TcRBP19 de Trypanosoma cruzi.
Pérez Díaz L1, Curgo M1, Probst C2, Krieger M2, Goldenberg S2, Dallagiovanna B2, Garat B1.
1
Facultad de Ciencias, UdelaROU, Uruguay. 2Instituto Carlos Chagas. [email protected].
Trypanosoma cruzi es el parásito causante de la enfermedad de Chagas que afecta a miles de
personas en América Latina. Su ciclo de vida transcurre entre dos huéspedes e involucra al menos
cuatro estadíos diferentes. Por lo tanto, debe existir un estricto control de la expresión génica que
permita la adaptación del parásito a los cambios abruptos a los que es sometido, siendo esto
esencial para la supervivencia del mismo La regulación de la expresión génica en tripanosomátidos
presenta desviaciones de los paradigmas de eucariotas superiores. Los genes se organizan en
policistrones, no existiendo promotores canónicos para la transcripción de genes de proteínas.
Dado que no se han reportado eventos de regulación a nivel de inicio de la transcripción para
39
proteínas, los principales mecanismos de regulación se dan a nivel postranscripcional. En este
aspecto, las proteínas de unión al ARN cobran aún más importancia jugando un rol principal en los
eventos de procesamiento, función y degradación del ARNm. Anteriormente, hemos caracterizado
una proteína de unión al ARN, TcRBP19 conteniendo un RRM en T. cruzi, que posee ortólogos
sólo en TriTryps, lo que sugiere una función única en estos parásitos. TcRBP19 es una proteína de
baja expresión detectada principalmente en el estadío amastigota con un patrón difuso en el
citoplasma. Parásitos epimastigotas sobreexpresando TcRBP19 no muestran alteraciones
fenotípicas pero tienen disminuida su capacidad de desarrollar metaciclogénesis. Además, se
observa una disminución en la tasa de infección en células VERO con estos parásitos
transfectantes. En este trabajo, nos hemos enfocado en la identificación de los ARNm asociados
con TcRBP19 mediante técnicas de GST pull down e hibridación en microarreglos de ADN. Los
ARN seleccionados, entre ellos, el ARNm de TcRBP19, no tienen una función común pero
comparten la presencia de regiones ricas en AU del tipo ARE y motivos de unión a la proteína
Pumilio en sus 3´UTR. Estos elementos han sido reportados como elementos desestabilizantes en
algunos genes para proteínas. La baja expresión que TcRBP19 y el hecho de que la misma es
diferencial en los estadíos, sumado a que el gen que la codifica posee en el 3’UTR los elementos
antemencionados y que además tiene al menos 3 sitios de poliadenilación alternativa, nos ha
conducido a plantearnos la caracterización de la funcionalidad de la región 3’ UTR de TcRBP19.
Para ello nos hemos planteado la búsqueda de potenciales elementos reguladores, y la
determinación de sus interacciones con factores en trans así como el análisis de construcciones
para estudiar el efecto sobre genes reporteros.
CO1-5. Estandarización de una técnica de PCR en materia fecal para diagnóstico de
nematodes intestinales sin requerimientos de kits comerciales.
Repetto S1, Alba Soto CD1, Chiodo P2, Cuello MS1, Basualdo J2, Tekiel VS3, González Cappa
SM1.
1
Departamento de Microbiología. Facultad de Medicina, UBA. 2Cátedra de Microbiología y
Parasitología, F. de Ciencias Medicas, UNLP. 3UNSAM. [email protected]
El objetivo fue poner a punto la extracción de ADN de nematodes de heces (H) y posterior PCR
sobre estas muestras para diagnosticar nematodiasis.Éstas se diagnostican por enriquecimiento de
H y microscopía. La sensibilidad puede ser baja y por ello las técnicas moleculares pueden ser
herramientas útiles.Los métodos comunicados usan kit comerciales de purificación de ADN por las
dificultades en su extracción debido a la estructura de la cutícula del parásito y por los inhibidores
en H que interfieren en la PCR. Para resolver esto se realizaron ensayos con nematodes y H,
empleando adultos frescos de Ascaris lumbricoides (A.l) y larvas frescas de Toxocara canis (T.c)
liberadas in vitro de huevos de hembras recuperadas de H de perro. Se purificó ADN de: a) 1g de
A.l ; b) 1g de A.l más 0,5g H humanas no parasitadas: c) 400 larvas de T.c. Luego de ensayar
varios protocolos, se describe el que resultó efectivo. Las muestras se incubaron a temperatura
ambiente en GTES (100 mM glicina, 0,05% SDS, 10mM Tris/HCL, pH8 y 1mM EDTA 0,5M) por
12h, se lisaron mecánicamente (N2 líquido y sonicación) e incubaron a 37 C otras 12h con buffer
de lisis (100mM EDTA, 100mM NaCl, 100mM Tris pH7,5 y 0,5% SDS, Proteinasa K 100µg/ml).
Se trataron dos veces con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) para extraer proteínas y el
ADN se precipitó con 2,5 vol etanol 100%. El sedimento se lavó con etanol 70% y su
concentración y pureza se verificaron por espectrofotometría. En las PCR de a), b) y c) se usaron
cebadores específicos. En una cuarta muestra se combinó ADN de T.c (c) más ADN de A.l con H
(b) y se amplificó con cebadores para T.c. Para la amplificación se usaron 5μl de ADN, más BSA
2,5μg, 2mM de Mg2, 0,5μM de cada cebador, 0,4μM de DNTPs y 0,01U/μl de Taq polimerasa en
un vol final de 20μl. El ciclado fue a 95C tres min, seguidos de 35 ciclos de 95C por cinco seg,
40
55C un min y 72C cuarenta y cinco seg y luego, 72C cinco min. Se ensayaron muestras paralelas
sin BSA. El rendimiento de ADN (μg/ml) fue: a)1,12, b)7,78 y c) 0,17. La relación 260/280 fue
1,7-1,8. En ausencia de BSA no se observó amplificación de ADN. Cuando se incluyó, se
identificaron en a)y b)una banda de 164 bp correspondientes a A.l (rRNA 18S) y en c) y d) una
banda de 364 bp correpondientes a T.c (rRNA 18S). Concluimos: el tratamiento de nematodes con
GTES y posterior lisis mecánica y química permite obtener ADN de calidad a partir de muestras
contaminadas con H y la inclusión del BSA en las PCR neutraliza inhibidores contaminantes
presentes en H. Esta metodología podría aplicarse para otras nematodiasis, como estrongiloidosis.
CO1-6. Determinación de subgrupos de Trypanosoma cruzi I circulantes en áreas rurales de
la Provincia de Chaco mediante secuenciación y análisis de la región intergénica del gen
mini-exón.
Tomasini N1, Lauthier JJ1, Monje Rumi MM1, Ragone PG1, Alberti D’Amato AM1, Herrera Bernal
C2, Falla A2, Llewellyn M3, Guhl F2, Diosque P1.
1
Unidad de Epidemiología Molecular - Instituto de Patología Experimental - Facultad de Cs de la
Salud - Univesidad Nacional de Salta. 2Centro de Investigaciones en Microbiología y Parasitología
Tropical (CIMPAT), Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia. 3London School of Hygiene
and Tropical Medicine, London, United Kingdom. [email protected]
Existen dos linajes mayores dentro T. cruzi (TCI y TCII). En el linaje TCII se ha demostrado una
clara estructuración en subgrupos (TCIIa, IIb, IIc, IId y IIe). Recientemente, distintos grupos de
investigación han intentado determinar posibles sub-linajes o haplotipos dentro de TCI utilizando
aislados de distintas regiones del continente, aunque muy pocos originarios de Argentina. Hasta la
fecha, las herramientas moleculares que han demostrado una posible estructuración interna de TCI
han sido la secuencia de la región intergénica del gen mini-exón y el análisis de microsatélites
(MMLT). La región intergénica de mini-exón posee múltiples copias en el genoma del parásito y
presenta variabilidad posiblemente informativa desde un punto de vista filogenético y/o
filogeográfico. En el presente trabajo se analizaron mediante PCR y secuenciación de esta región,
24 aislados provenientes de un área endémica de la Provincia de Chaco, Argentina. Se realizó el
análisis filogenético de las secuencias obtenidas, incluyendo secuencias disponibles en GenBank, y
los resultados fueron comparados con aquellos obtenidos por otros autores. Dos haplotipos aún no
descriptos fueron identificados entre los aislados de nuestra área de estudio y otros dos se
corresponden con grupos previamente caracterizados. La presencia de haplotipos similares a
aquellos encontrados en el norte de Sudamérica y en América del Norte, y de otros no descriptos
previamente, se discuten en el contexto de las tipificaciones multilocus previamente aplicadas a las
24 cepas estudiadas, utilizando diferentes métodos (MLST, MLEE, RAPD y MMLT). (Financiado
por: Institute de Recherche pour le Développement (IRD), Francia; Seventh Framework
Programme, European Commission; FONCyT; CIUNSa.)
SESION CO2 - EPIDEMIOLOGIA Y VECTORES
CO2-1. Equinos como reservorios de Babesia bovis y Babesia bigemina
Asenzo G1, Ruybal P1, Petrigh R1, Echaide I2, Farber M1, Florin-Christensen M1.
41
1
Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas – INTA.
Experimental de Rafaela – INTA. [email protected]
2
Estación
La babesiosis bovina, causada por protozoos intraeritrocíticos del género Babesia sp limita la
producción de ganado vacuno en vastas regiones tropicales y subtropicales del mundo. Las
especies presentes en Argentina son Babesia bovis y B. bigemina, quienes son transmitidas por la
garrapata Rhipicephalus microplus. Dado que esta garrapata también parasita equinos, y éstos a
menudo utilizan las mismas pasturas que los bovinos, se investigó la posible infección de caballos
con los mencionados protozoos. Se analizaron 41 muestras de ADN extraídas de sangre de
caballos de la provincia de Formosa, la cual es endémica para R. microplus, mediante Reverse
Line Blot Hybridization (RLB). Para ello a partir de cada muestra se amplificó mediante PCR semi
anidada un fragmento del gen ribosomal 18S y se analizó la hibridización de los amplicones con
sondas específicas para estos protozoos. Se observó detección positiva para B. bovis en 38
muestras (92,7 % ) y para B. bigemina en sólo un caso. Este estudio confirma datos previos de
nuestro grupo obtenidos por qPCR del gen del citocromo b e indica que los equinos pueden actuar
como reservorio de los mencionados hemoparásitos, un dato importante para la toma de medidas
de control de la babesiosis bovina. Este trabajo fue financiado por INTA, CONICET y la Comisión
Europea (INCO 003691).
CO2-2. Distribución de haplotipos de T. cruzi I en vectores, reservorios y humanos del
Continente Americano.
Cura C1, Mejía-Jaramillo AM2, Duffy T1, Burgos JM1, Diosque P3, Cardinal MV4, Kjos S5, Da
Silva A6, Russomando G7, Aznar C8, Levin MJ1, Cuba Cuba CA9, Gurtler R1, Triana-Chávez O2,
Schijman AG1.
1
Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas. INGEBI-CONICET, Bs. As.,
Argentina. 2Grupo Biología y Control de Enfermedades Infecciosas (BCEI), Univ. de Antioquia,
Medellin, Colombia. 3Unidad de Epidemiología Molecular, IPE, UNSA, Salta, Argentina.
4
Laboratorio de Eco-Epidemiología, FCEYN, UBA, Argentina. 5Department of Entomology,
CDC, Atlanta, USA. 6Division of Parasitic Diseases, CDC, Atlanta, USA. 7Departamento de
Biología Molecular, Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de
Asunción, Asunción, Paraguay. 8Laboratoire Hospitalier Cayenne, French Guiana. 9 Laboratorio de
Parasitologia Médica e Biologia de Vetores, Área de Patologia, Faculdade de Medicina,
Universidade de Brasilia, Brasilia DF, Brasil. [email protected]
Las poblaciones naturales de T. cruzi se clasifican en dos grupos: T. cruzi I, predominante en el
norte de Sur América, América Central y EE.UU, y T. cruzi II, en el cono sur de América Latina.
Existen 5 sublinajes de Tc II (a-e) pero aún no se ha encontrado una subdivisión clara dentro de Tc
I debido a su alta heterogeneidad. Herrera y col. (2007) han propuesto la existencia de 4 haplotipos
de Tc I en Colombia, identificados por SNPs e inserciones/deleciones en un motivo de
microsatélite de la región intergénica del gen del miniexón (EIMx) nombrados recientemente Tc I
a-d por Falla y col. (2009). En este trabajo planteamos caracterizar este polimorfismo en
poblaciones de Tc I halladas en heces de triatominos (Rhodnius sp, Pastrongylus sp y Triatoma
sp), reservorios silvestres y sangre y tejidos de pacientes provenientes de diversos países del
continente americano. Para esto se amplificó por PCR la EIMx de 88 muestras utilizando los
oligonucleótidos UTCC/Tc2 (475 pb) para los stocks provenientes de cultivo y se realizó una PCR
heminested con los oligonucleótidos TCC/Tc2 (350 pb) para las muestras clínicas. Los amplicones
fueron purificados, secuenciados y alineados mediante MEGA 4.0. Cinco muestras argentinas
resultaron Tc Ia; y 11, Tc Id. Si bien ambos se detectaron en sangre de pacientes con Cardiopatía
Chagásica crónica, los explantes cardíacos sólo presentaron Tc Id (4/4), aún en un caso con
42
determinación de Tc Ia en sangre. Cinco stocks de Brasil, 3 de Guyana Francesa y 5 de Paraguay
se clasificaron como Tc Id; 3 de Méjico, 10 de EE.UU. y 1 de Chile, como Tc Ia. Dentro de las 37
cepas colombianas, se encontraron 6 Tc Ia, 17 Tc Id y 14 Tc Ib. Es importante mencionar que 4
muestras argentinas y una de Bolivia presentaron un nuevo motivo de microsatélite, al que
llamamos Tc Ie (Cura, SAP 2008). Oligonucleótidos específicos diseñados para tipificación directa
por PCR están siendo actualmente evaluados en nuestro laboratorio. En conclusión, encontramos
una asociación de Tc Ia con el ciclo doméstico en Argentina y Colombia, y con triatominos
silvestres de EE.UU. y Méjico. Tc Ib sólo fue encontrado en los ciclos silvestre y peridoméstico de
Colombia. Tc Id se asoció mayormente con el ciclo silvestre (49%) pero también con el
histotropismo cardíaco en pacientes con Cardiopatía Chagásica de Argentina. Todas las muestras
Tc Ie pertenecen al ciclo doméstico de Argentina y Bolivia. Finalmente, Tc Ic no fue hallado en la
población estudiada.
CO2-3. Flebotominos (Diptera: psychodidae) en un área de transmisión de Leishmaniasis
Tegumentaria (LT) del Impenetrable chaqueño, Chaco, Argentina.
Rosa JR1, Szelag EA1, Quintana MG2, Brazil R3, Andrade Filho JD4, Salomón OD5.
1
Instituto de Medicina Regional. UNNE. 2Universidad Nacional de Tucumán. 3Laboratório de
Bioquímica e Fisiologia de Insetos, Instituto Oswaldo Cruz,-Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
4
Laboratório de Leishmanioses, Centro de Pesquisas René Rachou-Fiocruz, Belo Horizonte, MG,
Brasil. 4Centro Nacional de Diagnóstico e Investigación en Endemo-epidemias-ANLIS, Buenos
Aires. Argentina. [email protected]
En Argentina la Leishmanisis Tegumentaria (LT) es endémica en el norte del país, registrándose
brotes epidémicos cada vez más frecuentes y dispersos hasta 1400 casos/año. La provincia del
Chaco (24º28´S, 58º63´O) es endémica a la LT y los registros de flebotominos datan del 60’ sin
actualización. Por esta razón de octubre 2006 a setiembre 2007 en el municipio Misión Nueva
Pompeya (24º55’S,61º30’O) (región fitogeográfica Chaco Seco-Chaco Occidental) en los parajes
Fortín Arenales y Los Pozos con antecedentes de LT humana, se realizaron capturas mensuales
con trampas CDC (19:00-07:00hs) en el intradomicilio (interior), peridomicilio (corrales de
vacunos y caprinos) y extradomicilio (bosque < 150 mts. de la vivienda). Se capturaron 1702
flebotominos: Lutzomyia migonei (83,79%), L. complejo cortelezzi: total hembras L. cortelezzii y
L. sallesi (5,82%), L. sallesi (4,35% machos), L. cortelezzii (1,12% machos), L. peresi (3,34%), L.
quinquefer (1,17%), L. torresi (0,23%) y L. neivai (0,18%). La razón de sexo (H:M) en el total
para L. migonei fue de 0,3 y para el resto de las especies 1,8. La mayor abundancia fue en
primavera (n=849) con promedios de 24,2ºC (13°C-34ºC ) y 32mm de precipitación acumulada.
En otoño (n=491) 20,5ºC (0ºC -32ºC ) y 97mm, y en verano (n=362) 28,4ºC (19,7ºC -42ºC ) y
126,5mm. En invierno no se obtuvieron las capturas fueron [11,1ºC (7ºC - 18ºC )] y 0 mm . Los
picos de abundancia fueron en noviembre de 2006 (n=741), marzo de 2007 (n=416) y enero de
2007 (n=303) determinados por L. migonei. En cuanto a la heterogeneidad espacial la mayor
abundancia se registró en el extradomicilio (n=622) del paraje Arenales y en el intradomicilio
(n=97) en Los Pozos. Lutzomyia neivai fue la última especie en abundancia asociadas al
peridomicilio y bosque en el área seca luego de L. migonei, L. cortelezzii y L. peresi. Finalmente la
presencia de flebotominos en la mayor parte del año (primavera, verano y otoño) con predominio
de L. migonei y flebotominos del complejo cortelezzii asociados a ambientes peridomiciliarios y
domiciliarios incrementan el riesgo de transmisión de la leishmaniasis en la región del Chaco Seco,
incriminándolas como probables vectores. Financiación: Fundación Alberto J Roemmers.
Argentina.
43
CO2-4. Detección de IgG anti-T. cruzi específica por inmunoblotting en niños hijos de
madres con enfermedad de Chagas crónica
Fernández ER1, Olivera GC1, De Rissio AM1, Dopasso C1, Eliceo MT2, Leonardelli A2, Sylvestro
J2, Postan M1.
1
2
Instituto
Nacional
de
Parasitología.
Hospital
de
Niños
Pedro
Elizalde.
[email protected]
Se estima que la transmisión congénita de T. cruzi en la Ciudad de Buenos Aires ocurre en 1 a 4%
de los hijos de madres seropositivas para la enfermedad de Chagas crónica. En nuestro país está
indicado el diagnóstico serológico a todas las embarazadas y a los recién nacidos hijos de madre
seropositivas para Chagas, pero no es infrecuente que la infección sea diagnosticada años mas
tarde. El objetivo de este trabajo fue comparar la reactividad de IgG específica hacia T. cruzi por
inmunoblotting en niños hijos de madres seropositivas para Chagas residentes en la CABA con los
de la población general. Se tomaron muestras de suero al azar de 66 niños hijos de madres
seropositivas para T. cruzi derivadas al INP para diagnóstico de la infección por serología
convencional: 13 niños seropositivos [C+M+]; edad media ±DS=10,25± 1,71 y 53 niños
seronegativos [C-M+]; edad media ±DS=10,92± 1,95. Como población general se evaluó muestras
de suero de 63 niños seronegativos para T. cruzi [PG]; edad media ±DS=11,87 ± 1,36 que
concurrieron al Hospital Elizalde para atención médica por motivos no relacionados a enfermedad
de Chagas. Como antígeno en los inmunoblottings se utilizó epimastigotes de la cepa de T. cruzi
Brazil (1x106 epimastigotes/calle). Los sueros (1:50) se incubaron con el antígeno durante 16 Hs a
4ºC previo revelado de la membrana con α-1,4-chloronaphtol.
Los resultados mostraron IgG anti-T. cruzi en el 100% (13/13) de los niños C+M+. También se
detectó reactividad en 71% (38/53) de los niños C-M+ y en 11,09% (7/63) de los PG (P<0,0001,
Fisher exact test). El número de bandas reconocidas por el suero de los niños C+M+
(media±DS=15,3±2,84 bandas, n=13) fue significativamente mayor (p<0.001) que las reconocidas
por los niños C-M+ (media±DS=1,76±1,19 bandas, rango 1-5 bandas, n=38) y por los controles
(media±DS=1,29±0,76, rango 1-3 bandas, n=7), no detectándose diferencias significativas entre el
número de bandas reconocidas por los niños C-M+ y PG. Las bandas de 60, 66/67, 32/33, 40, 85 y
47 KDa fueron reconocidas en orden decreciente por más del 50% de los niños C+M+. En cambio,
las bandas detectadas por los niños C-M+ fueron la de 81, 77, 32/33, 40, 66/67, 49/50 y 88 KDa
(15,1 a 7,5%), mientras que las reconocidas por los seronegativos PG fueron las de 85, 20, 119, 60
y 13 KDa (4,8 a 1,6%). Estos resultados indican una mayor frecuencia de Ac anti-T. cruzi
específicos en niños seronegativos hijos de madres con Chagas que en la población general,
sugiriendo contacto con Ag del parásito durante el período prenatal o tempranamente en la niñez.
CO2-5. Producción de recursos educativos impresos y multimediales para la promoción
sociosanitaria y prevención de parasitosis intestinales en niños.
Caminos R1, Rivero MR2, Rópolo AS2, Touz MC2, Vidal ME1, Nores MJ3.
1
Departamento Informática-UNC. 2Instituto M y M Ferreira. 3Facultad de Cs Exactas, Físicas y
Naturales. [email protected]
En el presente trabajo nos proponemos el diseño y producción de materiales educativos en soporte
impreso y multimedial. El objetivo es brindar información sobre las principales parasitosis
intestinales infantiles y promover y fortalecer hábitos saludables, recurriendo a la participación de
los niños como multiplicadores de estos saberes. Se consideró necesario implementar estrategias
de información y programas educativos que tengan en cuenta factores socioculturales y
epidemiológicos que contribuyen al mantenimiento de las parasitosis en las comunidades en
riesgo. Con el fin de recuperar conocimientos, ideas previas, prácticas y actitudes acerca de las
44
parasitosis, se realizó una investigación cuali-cuantitativa mediante cuestionarios, análisis de
dibujos y entrevistas a informantes clave, en una comunidad vulnerable asociada al Centro
Integrador Comunitario-Salsipuedes. A partir de los resultados obtenidos, se definieron
destinatarios, niños con capacidad de lecto-comprensión (final del 1º y 2º ciclo EGB), se
seleccionaron contenidos y se plantearon estrategias para acercar el conocimiento científico de
manera atractiva y aprehensible por los niños. Se redactó e ilustró el cuento infantil Pequeños
Invasores, con un niño como protagonista, cuya propuesta estética incluyó dibujos infantiles y
personificación de los parásitos. La repercusión obtenida nos llevó a complementar el trabajo
utilizando tecnologías de la información y la comunicación (TICs), que posibilitan abordar el
problema considerando nuevos códigos de transmisión cultural basados en la imagen y la
circulación sencilla y económica de la información. Se elaboró material multimedia de carácter
lúdico e interactivo, a partir de la adaptación del cuento, utilización de técnicas de animación
tradicional en 2D (Animé Studio Pro5), animación con plastilina/stop motion (MonkeyJam) y
rodaje de secuencias con niños. Ambos materiales serán evaluados con grupos testigos para su
posterior edición final. El producto multimedia estará disponible en soporte DVD/CD y se prevé su
distribución gratuita en escuelas, especialmente del Programa Integral para la Igualdad Educativa
(PIIE), centros de salud, y por Internet. Este proyecto es financiado por: Secretaría de Extensión,
UNC (2008-2009) y FONCYT PICT (2004-2007).
CO2-6. Aporte desde un abordaje interdisciplinario en investigación, docencia y extensión,
para un mal que dura 100 años: Chagas.
Streiger ML1, Masi R2, Mainero MC2, del Barco ML1, Mendicino DA1, Fabbro DL1, Bizai ML1,
Arias ED1, Bertotti E2.
1
CIEN-FBCB-UNL 2Escuela de Servicio Social de Santa Fe. [email protected]
En el centenario del descubrimiento por el genio del médico brasilero Carlos Chagas de la
enfermedad que lleva su nombre, no podemos decir lamentablemente, “no hay mal que dure 100
años”. Su abordaje biológico y social, y la participación de la población son primordiales para la
prevención. El objetivo es mostrar los logros de la articulación entre investigación, extensión y
docencia con proyectos interdisciplinarios, integrando alumnos y volcando la experiencia en
cursos de pre y posgrado. Proyectos de investigación-acción: 1-En localidades con factores de
riesgo para Chagas: C.Dolores 1997; S.Martín Norte 2003 (ambas Dpto S.Justo); La Brava 2005,
(Dpto S.Javier); A.Gallardo 2007 (Dpto LaCapital); 2-Seguimiento clínico de chagásicos crónicos.
El equipo lo integran bioquímicos, médicos, trabajadores sociales, psicólogos sociales y
estudiantes. Para conocer el medio y motivar la prevención, en Escuelas y Centros de Salud se
trabajó con la comunidad y sus representantes. Se utilizaron estrategias didácticas en talleres con
niños y adultos, rescatando saberes previos y transfiriendo nuevos conocimientos. Se efectuó
serología para Chagas, previo consentimiento, y se realizaron electrocardiogramas. Los resultados
permiten describir la situación epidemiológica en cada localidad. Se informan en reuniones a la
comunidad y se transfieren a los alumnos de las asignaturas que dicta el CIEN. Los pasantes y
becarios participan en los proyectos. El encuentro interdisciplinario contribuyó a la apropiación de
nuevos saberes por la comunidad y tendió puentes entre conocimiento académico y popular. Las
tareas desarrolladas aumentaron el protagonismo institucional (Dispensario-Comuna-Escuela) y la
articulación con el Programa Provincial de Chagas. La formación profesional de los alumnos, se
enriqueció con la transferencia de nuestras experiencias en investigación y extensión en los cursos
de grado y pos grado. La participación de pasantes y becarios en proyectos de investigación y/o
extensión sobre la endemia chagásica, permitió el contacto en terreno con problemas sanitarios y
sociales propios de la región, con un rol protagónico y crítico, superando la pasividad en la
adquisición de conocimientos. Se logró: *Instrumentar a las comunidades con nuevas herramientas
45
y saberes. *Generar el compromiso de los futuros profesionales con una realidad socio-sanitaria
regional. *Articular la docencia, investigación y extensión con un problema de salud socialmente
relevante, desde la interdisciplina y con participación comunitaria.
SESION CO3 - INMUNOLOGIA – PATOGENIA Y TRATAMIENTO
CO3-1. Infección experimental con Trypanosoma cruzi en ratones Balb/c deficientes en IL-10
(IL-10 -/-): Consideraciones para una inmunoterapia contra la Enfermedad de Chagas.
Pino Martínez A, Solana ME, Poncini CV, Batalla EI, Gonzalez Cappa SM, Alba Soto CD.
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. Facultad de Medicina. UBA.
[email protected]
IL-10 es una citoquina con amplias propiedades antiinflamatorias como la inhibición de la
activación de células presentadoras y de su producción de citoquinas proinflamatorias e inhibición
de la respuesta Th1. Previamente, demostramos que la infección con T. cruzi interfiere en la
maduración/activación de células dendríticas (CD), en su capacidad estimulatoria de LT y las
induce a secretar IL-10 y TGF-beta. La neutralización in vitro de la IL-10 producida por CD
revierte este fenotipo. A su vez, establecimos que la transferencia adoptiva de CD obtenidas de
ratones deficientes en IL-10 (KO) previamente pulsadas con lisado de T. cruzi confería protección
contra el desafió letal con T. cruzi. El éxito de la inmunoterapia radicaría en la supresión de la IL10 produdida por las CD. En este trabajo, empleamos el modelo de infección experimental con T.
cruzi en ratones deficientes de IL-10 (KO) de origen Balb-c y controles (WT) para evaluar si la
ausencia global de producción de IL-10 se asocia a mayor resistencia a la infección.
Tempranamente (12dpi), la parasitemia de KO fue menor a la de WT pero esto se invirtió desde el
día 17 post infección (P <0.002) y durante el resto de la infección. La parasitemia permaneció
detectable por más tiempo en KO que en WT (62 vs 40 dpi). Los KO presentaron mayor perdida
de peso desde el inicio de la parasitemia hasta el día 30 y murieron con signos de caquexia que
estarían relacionados con la presencia de mayor actividad proinflamatoria. Los KO sobrevivientes
recuperaron el peso sobrepasando a los WT. No se observaron diferencias en la producción de IgG
total anti-T.cruzi entre grupos. Evaluamos la producción de IgG1 e IgG2a anti-T cruzi como
correlato del balance entre respuesta Th2 y Th1. No encontramos diferencias significativas en la
producción de IgG2a pero si un retraso en la producción de IgG1 en KO (63 dpi) con respecto a
WT (30 dpi) con diferencias significativas entre grupos a los 47 dpi (P<0.02). Estos resultados
demuestran que la ausencia global de IL-10 no es protectora. En nuestro modelo, la falta de IL-10
no induce una mayor respuesta Th1 pero retrasaría la aparición de la respuesta Th2. Además, la
ausencia de IL-10 parece colaborar en el control de la parasitemia a tiempos muy tempranos de la
infección. Esto indicaría que un bloqueo transitorio de la acción de la IL-10 en esta etapa
contribuiría a la inducción de una respuesta inmune más eficaz y preservaría el papel de esta
citoquina en el control del daño que se produce por la respuesta inmune durante etapas posteriores
de la infección.
46
CO3-2. rTgPI-1 combinada con aluminio y ODN-CpG en un protocolo de prime-boost
provee protección frente a la infección toxoplásmica a ratones C57BL/6.
Sánchez VR1, González Cobiello P2, Fenoy IM1, Frank F3, Goldman A1, Martin V1.
1
CESyMA, ECyT – UNSAM. 2CESyMA, ECyT - UNSAM; IDEHU, Inmunología, FFyB, UBACONICET; Dpto Micro, FMED. 3IDEHU, Inmunología, FFyB, UBA-CONICET; Dpto Micro,
FMED. [email protected]
T. gondii es un protozoario que infecta al hospedador mediante la ingestión oral de quistes tisulares
u ooquistes induciendo una fuerte respuesta inmune tipo Th1 y confiere inmunidad contra una reinfección. Los ODN-CpG sintéticos son capaces de promover respuestas Th1, necesarias para el
diseño de vacunas contra patógenos intracelulares. Previamente demostramos que una forma
recombinante del inhibidor de serin proteasas-1 (rTgPI-1) de T. gondii combinado con aluminio,
genera una respuesta inmune que resulta en protección contra la infección a ratones C3H/HeN. En
este trabajo, se evaluó la capacidad de rTgPI-1 combinado con hidróxido de aluminio y ODN-CpG
en un protocolo de “prime boost”, en conferir protección frente a la infección a ratones C57BL/6
altamente susceptibles. Para esto, ratones hembras fueron inmunizados con 2 dosis de rTgPI1+alum o sin adyuvante por vía intradérmica (id) mas 2 dosis de rTgPI-1+CpG por vía intranasal
(in) (G1 y G2) y se emplearon como grupos control, ratones inmunizados con 4 dosis de rTgPI1+alum id (G3), o rTgPI-1 id (G4) o rTgPI-1+CpG in (G5), o PBS (G6). Los ratones de los grupos
G1-4 mostraron altos niveles de anticuerpos específicos medidos por ELISA directo, presentando
G3 un perfil asociado a un tipo de respuesta Th2, G4 un perfil mixto Th1/Th2, y ambos protocolos
de prime-boost G1 y G2 mostraron un perfil asociado a una respuesta Th1. En los ratones
vacunados se observó una significativa respuesta celular frente a antígenos excretados-secretados
de T. gondii (ESA) medida por DTH. Catorce días luego del último refuerzo, los ratones se
desafiaron por vía oral con quistes de la cepa Me49 y se midió el nivel de protección conferido
mediante el conteo de quistes en cerebro. Las inmunizaciones por una única vía no resultaron en
una reducción significativa de la parasitemia: 13% (G3) y 22% (G5), mientras ambos protocolos
de prime-boost generaron una reducción significativa de 49% (G2) y 55% (G1) comparado con el
control G6. Estos resultados demuestran que la combinación de rTgPI-1 con dos tipos de
adyuvante en este protocolo de “prime-boost”, induce una respuesta inmune capaz de conferir
protección frente a la infección por T. gondii a ratones C57BL/6.
CO3-3. Calreticulina de Trypanosoma cruzi participa en la infectividad c1q-dependiente y es
susceptible de ser modulada por anticuerpos.
Ramírez G1, Valck C2, Sánchez G3, López N1, Maldonado I1, González A1, Weinberger K1,
Coddou F1, Duaso L1, Ferreira A1.
1
Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana, ICBM, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile. 2Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana, ICBM, Facultad de
Medicina, Universidad de Chile. 3Programa de Biología Molecular y Celular, ICBM, Facultad de
Medicina, Universidad de Chile. [email protected]
En Latinoamérica, la enfermedad de Chagas afecta alrededor de 18 millones de personas, con un
alto impacto en salud pública y económico. Su agente causal, Trypanosoma cruzi, despliega una
amplia variedad de estrategias para evadir el sistema inmune y expone una vasta gama de
antígenos para invadir las células de su hospedero. En nuestro laboratorio hemos clonado y
secuenciado una molécula de 45 kDa que identificamos como calreticulina de Trypanosoma cruzi
(TcCRT). Ésta es una proteína multifuncional, altamente conservada, presente desde plantas hasta
organismos superiores. Dentro de las funciones que se le han descrito en nuestro laboratorio están:
inhibir la ruta clásica del sistema del complemento, a través de su unión a C1, unirse a células
47
endoteliales interfiriendo en la multiplicación celular, migración y morfogénesis capilar,
finalmente, y motivo de este trabajo, promover infectividad a través de su unión a C1q. Varios
antecedentes bibliográficos, tanto nuestros como de otros laboratorios, avalan esta última función.
Primero, la presencia de C1q aumenta la infectividad de tripomastigotes in vitro. Segundo, TcCRT
y C1q colocalizan en la superficie de tripomastigotes, principalmente en la zona de emergencia
flagelar, donde se inicia el proceso de invasión de la célula hospedera. Tercero, al inducir
inmunidad humoral contra TcCRT en ratones, éstos presentan mayores parasitemias que el control,
ya que las inmunoglobulinas G anti-TcCRT aumentan el depósito de C1q sobre el complejo
TcCRT/IgG, promoviendo infectividad. Por esta razón, nos propusimos intervenir esta interacción
mediante el uso de fragmentos F(ab’)2 anti-rTcCRT, tanto in vitro como in vivo. Estos fragmentos
derivados de IgGs, al carecer de región Fc y ser modificados por el hombre, no pueden unir C1q,
bloqueando la unión TcCRT/C1q en la superficie del parásito. Para corroborar nuestra hipótesis
generamos IgGs y fragmentos F(ab’)2 anti-rTcCRT. Tanto C1q como IgGs completas antirTcCRT más C1q aumentan la infectividad de tripomastigotes de la cepa Dm28c, en células
fagocíticas no profesionales (VERO), una línea celular de macrófagos (RAW 264.7) e in vivo, en
el modelo murino. Por otro lado, fragmentos F(ab’)2 anti-rTcCRT disminuyen la infectividad del
parásito en macrófagos e in vivo, lo que se refleja en menor número de células infectadas, menores
parasitemias y mayor sobrevida de los ratones infectados. Financiamiento: Proyecto Bicentenario
de Anillos de Investigación ACT 29, Proyecto FONDECYT Regular 1095095, Beca de Apoyo de
Tesis Doctoral 24080095, todas del Gobierno de Chile.
CO3-4. Perfil de metaloproteasas circulantes en la infección experimental con cepas de
distintos linajes de Trypanosoma cruzi.
Musikant AD1, Rodríguez CE1, Higa RD2, Jawerbaum A2, Leguizamón MS1.
1
Depto de Microbiología - Facultad de Medicina – UBA. 2CEFYBO - CONICET – UBA.
[email protected]
Introducción: T. cruzi está constituido por dos grupos filogenéticos mayoritarios: T. cruzi I y T.
cruzi II. Su relación con patogenia no está esclarecida aún. Hemos comunicado que la
expresión/shedding de la trans-sialidasa (TS) en las cepas de T. cruzi II es significativamente
mayor que en T. cruzi I. TS es un factor de virulencia que induce entre otras alteraciones,
plaquetopenia y apoptosis de células del sistema inmune en la infección aguda. Las
metaloproteasas (MMPs) degradan componentes de la matriz extracelular, controlan la
remodelación tisular en procesos homeostáticos y patológicos y participan de la regulación de la
respuesta inflamatoria. El único reporte previo que las relaciona con la infección experimental por
T. cruzi describe un incremento de la actividad de MMP-2 y MMP-9 en infiltrado inflamatorio y
en células de la pared vascular cardíaca. Objetivo Analizar el perfil de MMPs circulantes en la
etapa aguda de la infección experimental con cepas T. cruzi I y T. cruzi II. Metodología y
resultados: Se infectaron ratones BALB/c machos (n=6 por grupo), con 5.104 parásitos de las
cepas (Hc, Ac y CA-1) y el clon (K-98) de T. cruzi I que inducen parasitemias tardías y sobrevida
entre 70-100%. La infección con T. cruzi II se realizó con 50 ó 500 parásitos de las cepas
Tulahuen, RA o VD y e1 clon Q501 que indujeron parasitemias precoces y mortalidad entre 90100%. El análisis de la actividad gelatinasa de las MMPs circulantes se realizó por zimografía de
muestras de sangre periférica extraída a distintos tiempos post infección y se cuantificó con el
software ImageJ. En todas las muestras de los ratones infectados con T. cruzi II se observó un
aumento significativo de proMMP-2 (p<0,01) y MMP-2 (p<0,02) respecto a los controles, Este
aumento no se indujo en ratones infectados con T. cruzi I. Las muestras de ratones infectados con
T. cruzi II mostraron un aumento de la actividad de proMMP-2 (p<0,02) y MMP-2 (p<0,03)
respecto a las de los ratones infectados con T. cruzi I. Los ensayos realizados con o-fenantrolina
48
(inhibidor de MMPs) mostraron una total inactivación. Ninguna de las cepas indujo aumento
significativo de MMP-9 respecto de los controles. Discusión: El aumento de proMMP-2 y MMP-2
circulantes solo en la infección con cepas T. cruzi II (letales) concuerda con el incremento en tejido
y alta mortalidad observado previamente. Estos resultados correlacionan con la inducción de la
actividad de proMMP-2 circulante mediada por TS activa, factor de virulencia de la etapa aguda
con mayor expresión en T. cruzi II.
CO3-5. Efecto inhibitorio del artesunato sobre el crecimiento de Typanosoma cruzi.
Olivera GC1, González MN1, Fernández ER1, Desmarchelier C2, Abril M2, Postan M1.
1
Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben". 2Fundación Mundo Sano.
[email protected]
Introducción: Las opciones terapéuticas actuales para la infección por T. cruzi producen efectos
adversos y la respuesta clínica es insatisfactoria, por lo que surge la necesidad de investigar nuevas
alternativas terapéuticas para la enfermedad de Chagas. La artemisinina (ART), compuesto aislado
de la Artemisia annua y sus derivados dihidroartemisinina (DHA) y artesunato (AS), constituyen
un grupo de compuestos utilizados para el tratamiento de malaria humana, en particular en la
infección producida por cepas de P. falciparum resistentes a multidrogas. En este trabajo
evaluamos el efecto del AS sobre el crecimiento de epimastigotes de T. cruzi de cultivos axénicos
y trypomastigotes derivados de cultivos celulares. Materiales y métodos: Se trataron 106
epimastigotes /ml de las cepas de T. cruzi Nicaragua (Nica) y Brazil (Br) con 17 (60μM), 25.4
(90μM) y 33.8 (120μM) microgramos AS en medio de cultivo LIT-10% SFB a 27ºC durante 72 hs,
utilizándose 30μg Benznidazol (BZ) como Standard y cultivos sin tratar como controles. Se
realizaron 3 ensayos para cada cepa, con triplicados para cada dosis en cada ensayo. Por otro lado,
se trataron 2x106/ml tripomastigotes provenientes de cultivos celulares VERO infectados con las
cepas Nica y Br resuspendidos en medio RPMI 1640-10% SFB con 17, 33.8 y 42.3 (150μM)
microgramos AS y 60μg BZ a 4ºC durante 24 hs. Al final de cada experimento se cuantificó el
número de parásitos en cámara de Neubauer. Resultados. Los resultados de los ensayos mostraron
que el número de epimastigotes en los cultivos tratados con AS y BZ fue significativamente menor
que en los cultivos no tratados (p<0.05), independientemente de la cepa de T. cruzi y de la dosis de
AS utilizada. El % de inhibición del crecimiento parasitario fue de 55.2±12.9%, 52.9±13.1% y
63.5±8.6% (IC50 21.1 ±26.2μg) y de 52.9±4.2%, 63.1±24.5% y 76.6±5.6% (IC50 17±2.9μg) para
las dosis de AS 17, 25.4 y 33.8μg, en las cepas Nica y Br respectivamente. El tratamiento de la
forma tripomastigote con AS produjo una reducción significativa del número de parásitos vivos
con respecto a los controles no tratados (p<0.05), independientemente de la cepa de T. cruzi y la
dosis de AS utilizada. La actividad citotóxica del AS para la cepa Nica fue 57%, 54,4% y 65%
para las dosis 17, 33.8 y 42.3μg respectivamente (IC50 de 16.8μg) mientras que para la cepa Br
fue de 40.4% 67.4%, y 71.9% respectivamente (IC50 21μg). Conclusión: Este trabajo demuestra la
capacidad inhibitoria del AS sobre el T. cruzi in vitro, indicando su potencial utilidad para el
tratamiento de la enfermedad de Chagas.
CO3-6. PSILOSTACHINA C aislada de ambrosia scabra es activa contra epimastigotes de
Trypanosoma cruzi e induce alteraciones ultraestructurales.
Barrera PA1, Sülsen V2, Coussio J2, Muschietti L2, Martino V2, Sosa M1.
1
Instituto de Histología y Embriología. 2Cátedra de Farmacognosia, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, IQUIMEFA (UBA-CONICET), Junín 956 (1113),
CABA, Argentina. [email protected]
49
La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana constituye uno de los problemas
sanitarios más relevantes en Latinoamérica. Las pocas drogas comercializadas en la actualidad
presentan una eficacia variable, ya que tienen efectos adversos tóxicos y requieren de largos
períodos de tratamiento. Los productos naturales han sido y son una fuente importante de
compuestos líderes en el desarrollo de nuevas drogas, especialmente en el campo de las
enfermedades infecciosas. En investigaciones previas hemos determinado la actividad tripanocida
in vitro e in vivo de dos lactonas sesquiterpénicas (STL) aisladas de la especie medicinal Ambrosia
tenuifolia (Asteraceae) (1). En este trabajo se describe la actividad tripanocida de Psilostachina C,
otra STL aislada de A. scabra, sobre epimastigotes cultivados de T. cruzi (Tulahuen). El efecto del
compuesto se evaluó sobre el crecimiento y la viabilidad de los parásitos y la integridad de los
mismos se estudió por microscopía de transmisión electrónica (TEM). La Psilosatchina C inhibió
el crecimiento de los parásitos a bajas concentraciones (>1 μg/ml), con un valor de IC50 de 2.5
μg/ml, siendo más efectiva que la droga de referencia benznidazol. El efecto fue irreversible, y los
agentes sulfurados como DTT o glutatión no pudieron revertir el efecto del compuesto. A dosis
subletales indujo algunas alteraciones ultraestructurales, como vacuolizaciones citoplasmáticas, y
en algunos casos se observaron parásitos con más de dos flagelos o con deformidades en el
kinetoplasto o en el núcleo. Concluimos que Psilostachina C es activo contra epimastigotes de T.
cruzi a bajas concentraciones y probablemente actúe por múltiples mecanismos. La búsqueda de
blancos moleculares para este compuesto así como la actividad contra formas infectivas de los
parásitos son los próximos objetivos que puedan dar una validación a este compuesto, o sus
derivados, como futura droga contra la enfermedad de Chagas. Agradecimientos. Esta
investigación fue financiada en parte por los proyectos PIP-CONICET (2010-2012) y UBACYT
B030 (UBA) Referencia 1. Sülsen V. et al. 2008. Trypanocidal and Leishmanicidal Activities of
Sesquiterpene Lactones from Ambrosia tenuifolia Sprengel (Asteraceae). Antimicrob. Agents
Chemother. 52(7):2415-2419.
SESION CO4 - BIOQUIMICA Y BIOLOGIA CELULAR
CO4-1. Caracterización de EgAT1: un transportador de glutamato en Echinococcus
granulosus.
Camicia F1, Cánepa G2, Prada L1, Pereira C2, Rosenzvit MC1.
1
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad
de Buenos Aires, Argentina. 2Laboratorio de Biología Molecular de Trypanosoma cruzi, Instituto
de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari (IDIM-UBA CONICET), Buenos Aires, Argentina.
[email protected]
La hidatidosis, causada por el parásito cestode Echinococcus granulosus (Eg), es una zoonosis que
afecta a la salud pública y la economía a nivel mundial. La hidatidosis constituye una seria
amenaza para la salud humana y la cirugía constituye la principal forma de tratamiento. Mediante
la técnica de captura de secuencia señal (Signal Sequence Trap) y el análisis bioinformático del
genoma de Echinococcus sp, hemos detectado la existencia de varias secuencias codificantes para
transportadores de aminoácidos. La secuencia más caracterizada es la de un ADN copia de 1627
pares de bases, denominado egat1, que contiene un marco de lectura abierto de 489 aminoácidos y
muestra una identidad aminoacídica del 30% con transportadores de aminoácidos neutros y
50
excitatorios pertenecientes a la familia de simportadores de dicarboxilatos/aminoácidos y cationes
(DAACS, TC Nº 2.A.23). Análisis adicionales de EgAT1 muestran la presencia de entre 9 y 10
dominios transmembrana, secuencias consenso de N-glicosilación y un perfil hidropático
altamente similar con miembros de la familia DAACS. En protoescólices, la hibridación in situ
muestra que el ARNm de egat1 se localizaría a lo largo del tegumento. La proteína EgAT1, que en
ensayos de Western blot mostró una masa molecular de 60 kD, se localizó en la región
subtegumentaria del metacestode, particularmente alrededor de las ventosas y el rostello de los
protoescólices y membrana germinal de las cápsulas prolígeras. La transfección de células COS7
con un plásmido recombinante codificante para EgAT1 resultó en la expresión de una proteína de
75 kDa en las membranas del sistema endomembranoso interno. Los ensayos funcionales,
realizados en células COS7 transfectadas e incubadas con aminoácidos radioactivos mostraron que
EgAT1 transporta glutamato pero no aspartato. Esta especificidad de transporte no ha sido
reportada para otros transportadores de glutamato pertenecientes a esta familia. Los resultados
obtenidos muestran que EgAT1 sería el primer transportador de la familia DAACS caracterizado
en platihelmintos. La caracterización de egat1 pone de manifiesto la importancia de los
transportadores de aminoácidos en la biología de los platihelmintos y abre el camino hacia la
caracterización de nuevos transportadores de aminoácidos, posibilitando una búsqueda más
racional de drogas y nuevas opciones de tratamiento contra la hidatidosis.
CO4-2. Biochemical characterization of the three enzymes involved in the two routes of
cysteine biosynthesis in Trypanosoma cruzi and Leishmania spp.
Marciano D, Santana M, Nowicki C.
Fac.de Farmacia y Bioquímica UBA. [email protected]
Cysteine plays key biological roles in all organisms; in trypanosomatids it is essential for the
biosynthesis of trypanothione, which is crucial in the defense against oxidative stress. In
Trypanosoma cruzi and Leishmania spp, but not in T. brucei, two pathways for de novo synthesis
of cysteine are expected to be operative, involving three enzymes: serine acetyltransferase (SAT),
cysteine synthase (CS) and cystathionine β synthase (CBS). Our results demonstrated the
functionality of L. major SAT (LmjF34.2850). Leishmanial SATs are highly conserved proteins
with unusually extended N-termini; presumably they are homotrimeric molecules and their
subunits exhibit the highest apparent molecular masses (45 kDa) among the members of SATs
family. L. major SAT appeared to be capable to specifically interact and be activated by
homologous CS. However, whether both proteins form a plausible bi-enzyme complex, with
similar roles as those described for plant and bacterial counterparts, remains unclear yet. As
reported for leishmanial parasites, our findings also show that T. cruzi exhibited a functional CS
(Tc00.1047053507165.50), which shares a high sequence similarity with plant homologues. Like
plant counterparts, T. cruzi and L. major CSs exhibited a notably high binding affinity for O-acetyl
serine (1µM and 8µM, respectively). T. cruzi and leishmanial CSs and CBSs are cytosolic
enzymes hence, the last steps of both cysteine biosynthetic routes occur in the same subcellular
compartment. CS produces cysteine using O-acetyl serine as carbon backbone, whereas CBS
might preferentially utilize serine as precursor for cysteine biosynthesis. This redundant capability
very likely reflects the vital role cysteine fulfills along the different nutritional and oxidative stress
conditions these parasites have to face during their life cycles. As predicted for Leishmania spp.,
also T. cruzi CS is notably more abundant in the mammalian stages than in the insect stage of this
pathogen. SAT and CS are absent in mammals, and the CBSs from both parasites notably differ
from the mammalian counterpart. The three enzymes might, therefore, represent potential
chemotherapeutic targets.
51
CO4-3. Phytomonas Jma: evidencias bioquímicas de enzimas involucradas en la biosíntesis de
poliaminas y el ciclo de la urea.
Marcora MS1, Carrillo C2, González ES3, Zadikian C1, Algranati ID3.
1
Fundación Instituto Leloir. 2Fundación Instituto Leloir; CONICET; Dto. Qca. Biológica-FCENUBA. 3Fundación Instituto Leloir; CONICET. [email protected]
Arginina, citrulina, agmatina y ornitina son moléculas relacionadas entre sí por reacciones
asociadas al metabolismo de poliaminas y al ciclo de la urea. Cada uno de ellas tiene distintos roles
metabólicos según los tipos celulares. La arginina, además de ser precursor en la síntesis de
proteínas, participa como metabolito intermediario en la síntesis de: a)- ornitina y urea, vía
arginasa; b)- citrulina, vía arginina deiminasa; c)- citrulina y NO, vía óxido nítrico sintasa (NOS);
d)- agmatina, vía arginina decarboxilasa (ADC). Agmatina, a su vez, puede ingresar a la
biosíntesis de poliaminas por conversión a putrescina vía agmatinasa. La ornitina, por su parte,
juega un rol fundamental como precursor de las poliaminas, dando putrescina vía ornitina
decarboxilasa (ODC), enzima sensible al inhibidor difluormetil ornitina (DFMO). También
participa como metabolito intermediario en el ciclo de la urea, ya sea como producto vía citrulina
hidrolasa, o como precursor de citrulina vía ornitina carbamoyltransferasa. En este trabajo
realizamos diversos ensayos bioquímicos para probar la presencia o ausencia de estas enzimas en
un protozoo parásito de plantas, la Phytomonas Jma. Tanto en ensayos in vitro como in vivo,
Phytomonas Jma 066 no presentó actividad de ADC ni formación de agmatina a partir del
precursor radioactivo arginina; sin embargo, se detectó síntesis de ornitina por actividad de
arginasa. Bajo las condiciones ensayadas in vivo, no se registró síntesis de citrulina a partir de
arginina, sugiriendo la ausencia de arginina deiminasa y/o de NOS. Por otro lado, tampoco se
detectó citrulina utilizando ornitina radioactiva como sustrato, sugiriendo también la ausencia de
ornitina carbamoyltransferasa. Tanto in vitro como in vivo, Phytomonas Jma presentó actividad de
ODC y formación de putrescina a partir del sustrato ornitina, siendo esta reacción inhibida por
DFMO. Finalmente, confirmamos la síntesis de espermidina, vía espermidina sintasa, a partir del
precursor putrescina.
CO4-4. Efecto de la autofagia en la infección de Trypanosoma cruzi sobre cardiomiocitos en
cultivo.
Romano P1, Millstone J2, Liu W2, Engman D3, Colombo MI1.
1
IHEM-CCT Mendoza-CONICET. 2Bioscience Center-SDSU. San Diego. USA.
3
Northwestern University Medical School. Chicago, USA. [email protected]
Trypanosoma cruzi, el agente causal de la Enfermedad de Chagas, usa diversas vías para invadir la
célula hospedadora y así poder multiplicarse y generar una infección persistente que se transforma
con el paso del tiempo, en una enfermedad crónica con deterioro de la función cardíaca y digestiva
principalmente. En nuestro laboratorio, hemos demostrado, que este parásito es capaz de utilizar
compartimentos de la vía autofágica para incrementar la infección celular. Realizando estudios in
vivo pudimos observar por microscopía confocal la acumulación de vesículas decoradas con la
proteína GFP-LC3 en los sitios de entrada de T. cruzi. Ensayos similares demostraron que estos
compartimientos también presentan marcadores lisosomales como Lamp-1 y DQ-BSA, indicando
su naturaleza autofagolisosomal (Romano et al, 2009). La participación de la vía autofágica sobre
la infección por T. cruzi fue posteriormente estudiada en células de mayor importancia en la
fisiopatología de la enfermedad de Chagas como los cardiomiocitos en cultivo de las líneas HL1 y
H9C2, y también frente a diferentes cepas de T. cruzi. En estos ensayos se pudo corroborar un
efecto similar al descripto previamente. Además, en estas células se observó que, aún en cortos
períodos de infección, la presencia del parásito, aumenta la formación de autofagosomas,
52
indicando que el mismo parásito es capaz de inducir la vía autofágica para favorecer su entrada.
Por otro lado, resultados preliminares de nuestro grupo indican que las curvas de parasitemia de
ratones “knock-out” heterocigotas para beclina-1, una proteína esencial en la formación de
autofagosomas, presentan valores reducidos respecto de los ratones “wild type” indicando que la
ausencia parcial de este gen altera la evolución de la infección murina. Concluimos que el efecto
de la autofagia sobre esta infección parasitaria es un fenómeno general que se puede verificar en
distintos tipos celulares y con diferentes cepas de T. cruzi y que parecería modificar el curso de la
infección en un organismo completo.
CO4-5. TcBDF3, leyendo el código de la tubulina?
Alonso V, Villanova GV, Trochine A, Cribb P, Serra E.
Lab. Parasitología Molecular, IBR-CONICET. [email protected]
TcBDF3 es una proteína de Trypanosoma cruzi que presenta un bromodominio en la región Nterminal y una región C-terminal rica en aminoácidos básicos y ácidos. El bromodominio es un
dominio eucariota conservado estructuralmente, presente en proteínas nucleares, como
acetiltransferasas, remodeladores de la cromatina o factores de transcripción, y capaz de reconocer
lisinas acetiladas. Se ha propuesto su función como dominio “lector” de esta modificación
postraduccional (MPT), principalmente en histonas, y como módulo de interacción proteínaproteína. Utilizando anticuerpos purificados obtenidos contra BDF3 recombinante, se verificó la
expresión la proteína en todos los estadios de vida de T. cruzi, por ensayos de Westen Blot (WB) e
inmunofluorescencia (IF). Llamativamente se observó por IF que la proteína cambia de
localización subcelular a lo largo del ciclo de vida del parásito, siendo citoplasmática en
epimastigotes y amastigotes, y flagelar en tripomastigotes y tripomastigotes metacíclicos. Este
cambio durante la diferenciación celular, fue estudiado con mayor detalle realizando ensayos de
metaciclogénesis in vitro e IF. La localización subcelular, fue verificada mediante WB sobre
extractos de parásitos permeabilizados selectivamente con digitonina, corroborándose la presencia
citoplasmática de la proteína en epimastigotes. Dados estos resultados, nos planteamos la
posibilidad de una asociación de TcBDF3 con la α-tubulina, ya que esta proteína se encuentra
acetilada en los microtúbulos de T. cruzi. Para esto realizamos IFs con anticuerpos a-TcBDF3 y aα-tubulina acetilada, observándo una co-localización parcial. También se realizaron estudios por
inmunoprecipitación (IP), así como IF y WB de citoesqueletos. En todos los casos los resultados
mostraron la interacción entre TcBDF3 y α-tubulina. Por otra parte, los ensayos de IP con aTcBDF3 y posterior tinción con plata, sugieren que la proteína estaría asociada además a otros
polipéptidos. Más estudios están siendo realizados. En este trabajo presentamos por primera vez
una proteína con bromodominio involucrada en procesos no nucleares. La presencia de TcBDF3
asociada a α-tubulina acetilada y su cambio de localización celular durante la diferenciación,
sugerirían a la acetilación como una posible señal para este proceso. Esto apoyaría la hipótesis de
un código de la tubulina para la regulación de eventos celulares, similar al de las histonas, con la
presencia de MPT y de proteínas capaces de reconocerlas.
CO4-6. Giardia Adaptor Protein 2 possesses a critical role during cyst wall formation.
Rivero R, Vranych C, Miras S, Ropolo A, Touz C.
Lab.de Microbiologia e Inmunologia. IMMF.CONICET. [email protected]
The differentiation of Giardia lamblia into the cyst form allows the parasite to survive in an
unfavorable environment, thereby increasing the likelihood of the infection of a new host. During
53
this process, cyst wall proteins (CWPs) are synthesized and transported into encystations-specific
secretory vesicles (ESVs) that migrate towards the periphery of the cell releasing their content to
form the rigid cyst wall. How this discharge occurred is still unclear or controversial. We found
that at the cell periphery, the ESV establishes contact the peripheral vesicles (PVs), acidic
organelles that correspond to an endosome-lysosome system, and observed that an exchange of
material might occur between both organelles. Previously, we showed that the heterotetrameric
clathrin-adaptor protein AP2 complex localizes in the PVs, cytoplasm, and plasma membrane in
growing trophozoites. However, during encystations, we observed that the PVs containing gAP2
enfold the ESVs. To better detail the participation of AP2 during this process, we analyzed the
localization of the medium subunit of gAP2 (gµ2) together with the ESVs formation and CWP1
release by IFA, confocal microscopy, and immunoelecto-microscopy of encysting trophozoites.
We found that during encystation gµ2 was decorating the ESVs membrane in patches with the
subsequently dispersal of ESV into small secretory vesicles containing CWP1 and gµ2 before
secretion. At the end of this stage, gµ2 was present at the plasma membrane remaining on the inner
side of it, just where the CWPs were released to form the filamentous cyst wall. Conversely,
formation of these small vesicles as well as the development of the cyst wall was inhibited when
gµ2 was knocked down. In this sense, quantitative analysis of cyst by FACS showed that the
silencing of gµ2 drastically reduced the number of cysts. Even though gµ2 expression does not
increase during encystation, our findings support the hypothesis where CWPs leave sorting PVs in
gµ2 compartments by segregation into discrete domains that can separate in small vesicles and
then fuse with the plasma membrane in an atypical exocytic event. Protein trafficking during
encystation needs to be explored in detail for a better understanding of the molecular bases
involved in surviving and dissemination of this important human parasite.
POSTERS
BIOLOGIA MOLECULAR (BM)
BM-1. Trypanosoma cruzi long chain solanesyl pyrophosphate synthase (tcspps): interstrain
variability, polymeric structure and recognition by chagasic sera.
Bontempi EJ1, Debenjak JA2, Pravia C2, Fusco O2, Perrone A2, Garavaglia P2, García G2, Cannata
JB3, Fichera L2, Bua J2, Maidana C2, Lauricella M2, Andersson B4, Rodríguez JB5.
1
Instituto Nacional de Parasitología “Dr. M. Fatala Chaben”. 2Instituto Nacional de Parasitología
“Dr. M. Fatala Chaben”, A.N.L.I.S, Ministerio de Salud, Buenos Aires, Argentina. 3Instituto de
Investigaciones Biotecnológicas IIB-INTECH, UNSAM-CONICET, Buenos Aires, Argentina.
4
Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden.
5
Departamento de Química Orgánica and UMYMFOR (CONICET-FCEyN), Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. [email protected]
The characterization of the TcSPPS [Ferella 2006] and the degree of inhibition of the enzyme by
new 2-alkylaminoethyl-1,1-bisphosphonic acids [Szajnman 2008] have already been published.
Although most of these compounds were more specific for T. cruzi Farnesyl Diphosphate
Synthase, compound 19 was four times more effective against TcSPPS (50% inhibition at 252
nanoM). Additionally, the inhibitor slowed down amastigotes growth at a 4.1 microM
54
concentration. In this work we studied some features of the enzyme in different strains, its
polymeric state and its recognition by chagasic sera. An interstrain study of the variability of
TcSPPS disclosed a new version of the gene, differing in nine nucleotides that translated into 3
amino acid changes. Based on the typification of the strains, it seems that an ancestor in lineage IIb
carried the old version, that was later transmitted to group IIe. The sensitivity to compound 19 was
tested with a parasite from every isoform group. The proliferation of Brener and Nicaragua
diminished by 50% (IC50) in the presence of similar concentrations of the inhibitor (270 and 209
microM, respectively). The polymeric structure of TcSPPS, studied by cross-linking and gel
filtration experiments, showed that the native protein mainly adopts a dimeric conformation, with a
minor subpopulation with a tetrameric conformation. Finally, with the aim of studying the host
immune response to this protein, we found that thirty chronic chagasic patients sera were unable to
recognize TcSPPS by ELISA, suggesting the protein is present in low amounts or is poorly
immunogenic in humans.
BM-2. Un motivo de reconocimiento de RNA media el transporte nucleocitoplasmático de
una proteína involucrada en exportación de mRNA en tripanosomas.
Cassola A.
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB-UNSAM). [email protected]
Las proteínas de unión a RNA (RBPs) y el metabolismo del RNA juegan un papel crítico en la
regulación post-transcripcional de la expresión genética en tripanosomas, dado que estos parásitos
protozoarios carecen de mecanismos que regulen la iniciación de la transcripción. Previamente en
nuestro laboratorio se ha identificado a TcUBP1, una RBP de Trypanosoma cruzi principalmente
citoplasmática y que posee un único Motivo de Reconocimiento de RNA (RRM). TcUBP1 cumple
roles en la estabilización y desestabilización de mRNA, y en la protección de transcriptos de la
degradación a través de su reclutamiento en gránulos citoplasmáticos. Ahora mostramos que
TcUBP1 tiene una dinámica nucleocitoplasmática, que le puede permitir unir transcriptos en el
núcleo y acompañarlos en su tráfico hacia el citoplasma. En condiciones de stress, TcUBP1 se
acumula en el núcleo, una propiedad que es dependiente de una activa transcripción y de la
interacción de esta RBP con RNA. La secuencia que determina la acumulación nuclear y la
exportación de TcUBP1 fue acotada al RRM de 92 aminoácidos, y mutaciones puntuales que
suprimen la capacidad de unir RNA en este RRM eliminan la dinámica nucleocitoplasmática.
TcUBP1 también colocaliza con transcriptos en el núcleo, apoyando la unión a mRNA en ese
compartimiento. La distribución normal de TcUBP1 se afecta cuando se sobre-expresa la proteína,
aumentando su abundancia en el núcleo, y generando un aumento de la abundancia de transcriptos
nucleares, implicando a esta RBP en la exportación nuclear de mRNA. Proponemos que TcUBP1
podría ser un enlace entre la exportación de mRNA con el recambio y la estabilización en gránulos
a ambos lados del poro nuclear, utilizando el RRM como una señal de de localización nuclear y
exportación.
BM-3. Desarrollo de ensayos multiplex de Luminex y PCR en Tiempo-Real para la
tipificación de Trypanosoma cruzi.
Duffy T1, Schijman AG1, da Silva AJ2.
1
Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas. INGEBI-CONICET, Bs. As.,
Argentina. 2Division of Parasitic Diseases, CDC, Atlanta, GA, USA. [email protected]
En este trabajo presentamos el desarrollo de nuevas estrategias de tipificación molecular utilizando
55
las metodologías Luminex y PCR en Tiempo-Real con sondas Taq-Man, que discriminan los
cuatro grupos principales de T.cruzi: Grupo 1, son los organismos denominados de Tc I; Grupo II,
incluye Tc IIb e hibridos Tc IId y IIe; Grupo III, incluye organismos Tc IIa y Grupo IV organismo
del grupo IIc. Ambos ensayos combinan la sensibilidad de la PCR con la especificidad de la
hibridización de sondas específicas para discriminar las mencionadas poblaciones parasitarias.
Sondas y primers complementarios a secuencias específicas de la región intergénica del mini-exón
de cada grupo, fueron diseñados a partir del alineamiento de 26 secuencias representativas de la
heterogeneidad genotípica de T. cruzi, disponibles en el Gene Bank. Los tractos con estructura
secundaria estable fueron descartados para el diseño de sondas. La amplificaciòn se realiza por
PCR Multiplex utilizando un primer forward común y primers reverse específicos de cada grupo.
Los amplicones obtenidos se distingen mediante sondas específicas por Luminex o PCR en
Tiempo-Real. El Luminex es una metodología novedosa que acopla microesferas con
concentraciones distintas de dos colorantes a sondas de ácidos nucleicos. Las microesferas son
reconocidas por dos detectores láser utilizando tecnología análoga a la citometría de flujo,
permitiendo discriminar entre 100 microesferas acopladas a sondas que pueden hibirizar
específicamente de forma simultánea a los amplicones producidos por la PCR. Hemos diseñado y
evaluado 10 sondas distintas para identificación de secuencias del mini-exon de los cuatro grupos
de T. cruzi, y una secuencia heteróloga clonada en plásmido como control interno del
procedimiento. Las sondas diseñadas para Luminex que mejor afinidad presentaron por el
amplicón especifico de cada grupo de T. cruzi, fueron modificadas para detectar dichos amplicones
por PCR en Tiempo-Real, utilizando sondas Taq-man. La especificidad de las sondas diseñadas
para cada tipo de ensayo fue confirmada utilizando ADN de cultivo de stocks de referencia para
cada grupo de T. cruzi. La sensibilidad fue evaluada en muestras de sangre reconstituida,
obteniéndose un límite de detección de 5 parásitos/mL para ambos ensayos. El objetivo final de
este enfoque es el análisis directo de muestras biológicas, que será puesto en marcha una vez se
optimicen las condiciones de mayor sensibilidad analítica y poder resolutivo de ambas
metodologías actualmente en evaluación.
BM-4. Expresión de una posible palmitoil-acil transferasa en Toxoplasma gondii.
Nieto Guil AF, Angel SO, Corvi MM.
Instituto de Investigaciones Tecnologicas de Chascomus. [email protected].
La palmitoilación de proteínas es la incorporación covalente de palmitato a la cadena lateral de
residuos de cisteínas. Esta modificación post-traduccional es de gran importancia para las células,
ya que tiene función moduladora en el direccionamiento de proteínas a membranas, localización de
ciertas proteínas a “lipid rafts” y actúa como reguladora de actividad enzimática. La transferencia
de palmitoil-CoA al sustrato proteico esta mediada por una enzima (palmitoil-acil transferasa;
PAT). Estas enzimas tienen la característica de tener un número par de dominios de
transmembrana y un motivo PAT consistente en cuatro aminoácidos que son fundamentales para
su actividad enzimática: DHHC. Hasta el momento se han detectado 23 posibles PATs en el
genoma humano con distinto grado de homología. En T. gondii hemos encontrado 15 proteínas que
contienen el motivo PAT (DHHC) en la base de datos toxodb. Al igual que ocurre con las PATs de
humanos (hPATS), estas posibles PATs de T. gondii (TgPATs) poseen varios dominios de
transmembrana y distinto grado de identidad entre si. Estas TgPATs contienen dos regiones
variables: uno hacia el extremo N-terminal y otro en el C-terminal (lo mismo se observa en
hPATs). En este trabajo se muestra la obtención de un anticuerpo específico para una de estas
TgPATs (TgPAT1, anotación en toxodb TGME49_093730). Este anticuerpo resulta ser altamente
específico ya que no muestra reacción cruzada con otras TgPATs ni con las PATs de las células
hospedadoras. Además, los ensayos de inmunofluorescencia muestran que TgPAT1 se localiza en
56
un sistema de membranas interno del parasito. Creemos que la obtención de este anticuerpo es de
importancia para poder determinar en un futuro los sustratos de TgPAT que se palmitoilan y
conocer mas en detalle el rol de la palmitoilación proteica en T. gondii.
BM-5. Peculiar abundance of poly-dinucleotides in Tritryps.
Smircich P1, Duhagon MA1, Forteza D1, Naya H2, Noreen W3, Garat B1.
1
Facultad de Ciancias. Universidad de la República. Uruguay. 2Institut Pasteur Montevideo.
Uruguay. 3Buffalo, Buffalo, NY USA. [email protected]
The protozoans Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major, the so called
Tritryps, are important worldwide human pathogens and constitute evolutionarily ancient
eukaryotes. Probably due to the early branching in eukaryotic evolution, they present unique
features. Indeed, signals for the different molecular processes remain mostly elusive. Repetitive
sequences though initially considered as selfish DNA, have been lately recognized as important
functional elements in cell biology. In particular, the pattern of dinucleotides occurrence has been
related to genome compartmentalization, gene evolution and level of gene expression. Here we
present the analysis of the occurrence, length and distribution of dinucleotide repeats in the whole
genomes of the Tritryps. We observed that most types of poly-dinucleotides are significantly more
abundant than what is expected by chance and that complementary dinucleotide repeats usually
displayed asymmetrical strand distribution, privileging TT and GT repeats in the coding strands. In
addition, we found that GT poly-dinucleotides are among the longest repeats in the three parasite
genomes. Finally, we showed that particular poly-dinucleotides are preferred at the vicinity of the
open reading frames. The striking bias in content, strand distribution, length and location of polydinucleotides suggest that these sequences have an active role in the kinetoplastid genomic
dynamics and might represent signals for molecular processes.
BM-6. Expresión de la histona canónica H2Ba de Toxoplasma gondii.
Bogado SS, Dalmasso MC, Angel SO.
Instituto tecnólogico chascomus. [email protected]
La familia de las histonas H2B de Toxoplasma gondii presenta dos linajes una canónica (TgH2Ba)
y una variante (TgH2Bv). H2Ba y H2Bv poseen un 68% de identidad entre ellas, observándose las
mayores diferencias en la región N-terminal. Recientemente, se observó que la región N-terminal
de la H2Bv de Plasmodium falciparum presenta un alto número de acetilaciones mientras que la
canónica no (Trelle et al., J Proteome Res 8:3439-3450). Un experimento de RT-PCR demostró
que h2bv se expresa en taquizoitos (estadio altamente replicativo) y en bradizoitos (estadio
arrestado en G0), mientras que h2ba solo se expresa en taquizoito, sugiriendo que su expresión está
asociada al ciclo celular. H2Ba se expresó en Escherichia coli como proteína recombinante
fusionada a un tag de histidina (rH2Ba), y se purificó mediante una columna de níquel.
Posteriormente se obtuvieron anticuerpos policlonales. Mediante ensayos de ELISA de
competencia con rH2Bv se demostró que este anticuerpo resulta ser altamente específico para
H2Ba. El anticuerpo anti-rH2Ba reaccionó con una banda esperada de 17-kDa en un ensayo de
Western blot con lisado de taquizoitos. Empleando el anticuerpo anti-rH2Ba descripto aquí, y un
suero policlonal anti-rH2Bv, descripto anteriormente, se están realizando experimentos de
composición de los nucleosomas y de localización genómica en ambos estadios.
57
BM-7. Avances en la caracterización y localización subcelular de las adenilato quinasas de
Trypanosoma cruzi.
Camara MM.
IDIM. [email protected].
Las enzimas responsables de mantener la homeostasis celular de ATP son las adenilato quinasas,
las cuales catalizan la interconversión de nucleótidos de adenosina. Las células eucariotas típicas
poseen tres isoformas de adenilato quinasa, la variante soluble y las que se encuentran en el
espacio intermembrana y en la membrana mitocondrial, sin embargo, en tripanosomátidos, se han
identificado por lo menos tres variantes adicionales. El metabolismo compartemantilizado de estos
organismos podría explicar la diversidad de isoformas donde cada variante tendría una localización
diferencial dentro de la célula. Por otra parte, los kinetoplástidos presentan ciclos de vida
complejos, con distintos estadios y características metabólicas particulares, por consiguiente el
gran número de isoformas podría ser explicado por la expresión diferencial de las mismas. En T.
brucei se han descripto variantes citosólicas, posibles mitocondriales y variantes glicosomales.
Dichas isoformas poseen homologas en T. cruzi, esperándose una localización similar. En este
trabajo estudiamos la localización y características de las adenilato quinasas de T. cruzi
denominadas TzAdk2/3/5/6. Se desarrollaron epimastigotes que expresan las diferentes isoformas
completas fusionadas a GFP con el objetivo de estudiar su localización subcelular. Paralelamente
se obtuvieron anticuerpos, para algunas de las isoformas, que permiten complementar los
resultados de localización. Para TzAdK3, la candidata glicosomal, se están realizando mutantes
que carecen de la posible señal PTS-1 así como también, se agrego dicha señal a GFP con el
objetivo de identificar los determinantes de su localización. En el caso de TzAdK5 se están
desarrollando también se obtuvieron mutantes, que carecen de las regiones de fosforilación, con el
objetivo de estudiar el efecto de dicha modificación post-traduccional. La identificación de los
factores capaces de regular la localización subcelular y expresión de este grupo de enzimas
permitirá comprender mejor el rol de cada isoforma en la red celular de transferencia de fosfatos
de alta energía.
BM-8. Localización flagelar de una adenilato quinasa de Trypanosoma cruzi.
Bouvier LA, Cámara MM, Miranda MR, Canepa GE, Pereira CA.
IDIM-Alfredo Lanari. [email protected].
Las adenilato quinasas son fosfotransferasas que catalizan la transferencia de fosfatos de alta
energía entre los nucleótidos de adenosina manteniendo la homeostasis intracelular de los mismos
y duplicando el potencial energético del ATP. Usualmente a estas enzimas se las encuentra
asociadas a estructuras subcelulares dedicadas tanto a la síntesis como al consumo de ATP. Entre
estas últimas podemos destacar a los flagelos, de cuya movilidad depende la supervivencia y
viabilidad de numerosos organismos tanto de vida libre como parásitos incluyendo a Trypanosoma
cruzi. Los flagelos eucariotas logran el movimiento mediante la acción altamente coordinada y
regulada de dineinas. Estos motores moleculares sufren una fuerte inhibición por el ADP formado
en la hidrólisis del ATP. La presencia de una adenilato quinasa en el flagelo no solo constituiría
una fuente de energía de rápida obtención permitiendo el consumo del segundo enlace de alta
energía del ATP, sino que además mantendrían baja la concentración del ADP inhibidor,
asegurando de esta manera la continuidad en el movimiento flagelar. En este trabajo, mediante la
expresión de proteínas de fusión en epimastigotes, determinamos la localización flagelar de la
isoforma de adenilato quinasa TzAdK4. Se produjeron anticuerpos policlonales los cuales, en
microscopias de fluorescencia, aportaron nuevos datos sobre la localización flagelar de TzAdK4.
Estos resultados fueron corroborados mediante el análisis por Western Blot de diferentes
58
extracciones sucesivas hasta llegar a flagelos crudos. Por último, se expresó en epimastigotes
proteínas que poseían la extensión N-terminal inusual que presenta esta variante (55 aa) fusionada
a GFP. Mediante este abordaje se pudo demostrar que este dominio N-terminal es el responsable
de la asociación de TzAdK4 al flagelo. Esto trabajo constituye la primera identificación de una
señal de localización flagelar en Trypanosoma cruzi.
BM-9. Tipificación por Secuenciación Multilocus de un panel de nuevos aislados de
Trypanosoma cruzi provenientes de la provincia de Chaco y evaluación de la posible
aplicación sobre muestras biológicas.
Lauthier JJ, Monje Rumi MM, Ragone PG, Alberti D’Amato AM, Tomasini N, Pérez Brandán C,
Uncos A, Diosque P.
Unidad de Epidemiología Molecular - Instituto de Patología Experimental – Facultad de Ciencias
de la Salud, Universidad Nacional de Salta. CONICET - Salta, Argentina.
[email protected]
La tipificación por secuenciación multilocus (MLST, Multilocus Sequence Typing), es una técnica
que permite identificar una gran variabilidad genética dentro y entre los linajes filogenéticos de
Trypanosoma cruzi (TC). En trabajos previos definimos un esquema de tipificación, al examinar
sobre un panel de clones representativos de la diversidad de TC en nuestra área de estudio en áreas
rurales de Chaco, un total de 10 fragmentos de genes metabólicos. Este esquema, se basa en el
análisis de 3 fragmentos de genes (rho-like GTP binding protein, Small GTP-binding protein Rab7,
y Glucosa-6-fosfato isomerasa). En el presente trabajo, se puso a prueba este esquema de
tipificación sobre un panel de 45 nuevos aislados obtenidos simultáneamente en las localidades de
Las Leonas (ciclo doméstico y peridoméstico) y El Palmar (ciclo silvestre), del departamento 12 de
Octubre, en la Provincia de Chaco. El algoritmo MLST utilizado permitió identificar los genotipos
circulantes, tanto en el ciclo doméstico/peridoméstico como en el ciclo silvestre, detectándose la
presencia de los linajes TCI, TCIIc, TCIId y TCIIe. Estos resultados se corresponden con aquellos
obtenidos mediante MLEE y RAPD para el mismo conjunto de aislados, aunque mediante MLST
se demostró una mayor variabilidad para TCI. Por otra parte, con el fin de evaluar la utilidad de
MLST como posible técnica diagnóstica, se realizaron ensayos sobre muestras biológicas
provenientes de ratones infectados artificialmente con diferentes genotipos de TC circulantes en la
misma zona de estudio. Los resultados preliminares obtenidos para un fragmento del gen GPI
fueron satisfactorios, sugiriendo que esta técnica podría ser empleada directamente sobre muestras
biológicas, aunque se necesitan más estudios para determinar la sensibilidad y especificidad de
estos ensayos. Financiado por: Institute de Recherche pour le Développement (IRD), Francia;
Seventh Framework Programme, European Commission; FONCyT; CIUNSa.
BM-10. Microsatélites de Trypanosoma cruzi aplicados a tipificación, estudio de la estructura
poblacional e implicancias epidemiológicas en un área endémica para la Enfermedad de
Chagas.
Alberti D Amato AM1, Barnabe C2, Lauthier JJ3, Monje Rumi MM3, Ragone PG3, Uncos A3,
Ramos F3, Segura MA3, Mora MC3, Basombrio MA3, Nasser JR4, Tibayrenc M2, Diosque P1.
1
Unidad de Epidemiología Molecular, Instituto de Patología Experimental, Facultad de Ciencias de
la Salud, Universidad Nacional de Salta–CONICET. 2Institut de Recherche pour le Développement
(IRD), Francia. 3Unidad de Epidemiología Molecular, Instituto de Patología Experimental,
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Salta–CONICET. 4Laboratorio de
59
Marcadores Moleculares, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Salta.
[email protected].
Actualmente, la diversidad genética de Trypanosoma cruzi (TC) como también su estructura
poblacional, son estudios de interés debido a las implicancias epidemiológicas que estos aspectos
tienen en la enfermedad de Chagas. En este contexto, diversos marcadores han sido utilizados. El
presente trabajo, aborda los aspectos antes mencionados a través del uso de un conjunto de loci de
microsatélites, aplicados a un set de cepas de TC provenientes de un área rural endémica para la
enfermedad de Chagas en la provincia de Chaco, Argentina. Los aislados fueron colectados en un
mismo año y paraje. Se obtuvieron aislados de 28 hospedadores (perros, Triatoma infestans y
Didelphis albiventris). Además, se obtuvieron clones mediante micromanipulación, a partir de 38
cepas, consideradas como representativas, luego de la determinación del DTU mediante MLEE.
Mediante la utilización de 10 loci microsatélites se analizaron un total de 149 cepas: 123 stocks
(cepas y clones) del área de estudio y 26 cepas de referencia. Los resultados revelan la presencia
de parásitos pertenecientes a los linajes I, IIc, IId y IIe. Dentro de los stocks de TCI se evidencian
2 subgrupos asociados a diferentes ambientes (selvático y peridomiciliario). Se discuten las
implicancias de los índices de variabilidad genética de estas sub-poblaciones, así como también las
implicancias epidemiológicas de los resultados. Financiado por: Institut de Recherche pour le
Développement (IRD), Francia; Seventh Framework Programme, European Commission;
FONCyT; CIUNSa.
BM-11. Construcción de vectores gateway para la deleción dirigida del gen Calreticulina en
Trypanosoma cruzi.
Sánchez Valdéz F, Pérez Brandán C, Zago MP, Basombrío MA.
Instituto de Patología Experimental-CONICET. Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad
Nacional de Salta. [email protected].
En Trypanosoma cruzi Calreticulina (CRT) es un gen de copia simple que codifica una proteína de
unión a calcio altamente conservada y multifuncional. Ensayos in vitro demostraron que la forma
de superficie de CRT une las porciones colágenas de la molécula de reconocimiento del sistema
del Complemento vertebrado C1q. Esta unión resulta en la inhibición de la formación de C3/C5
convertasas y el complejo de ataque a membrana. De esta forma CRT impide la activación de la
vía clásica del Complemento. Con el objeto de caracterizar la actividad de CRT in vivo nos
planteamos obtener clones de mutantes nulas para este gen, en la cepa virulenta Tulahuén y la cepa
atenuada TCC de Trypanosoma cruzi. La mutagénesis dirigida se realizará mediante
recombinación homóloga por transfección estable de epimastigotes con construcciones
desarrolladas utilizando el Sistema Multisite Gateway (MSGW). Con el fin de poder emplear una
única construcción para delecionar CRT en las diferentes cepas de T. cruzi planteadas, realizamos
el análisis de sus secuencias 5´ y 3´ UTR. El análisis de los datos a partir de la comparación de
secuencias con la publicada para la cepa CL Brenner reveló que las mismas poseen más de un 80%
de similitud. Esto hace posible no solo que las regiones empleadas para realizar las construcciones
destinadas al reemplazo génico puedan ser amplificadas de cualquier cepa sino que las
construcciones obtenidas muy probablemente puedan ser útiles para el intento de eliminar alelos
CRT en cualquier cepa de T. cruzi. Utilizando primers específicos para el sistema MSGW
amplificamos 645 y 1550 pb correspondientes a las regiones 5´ y 3´ UTR de CRT respectivamente.
Estos fragmentos se clonaron en vectores donantes del Sistema MSGW. Posteriormente se
recombinaron los vectores de entrada generados con un tercero conteniendo cassettes de
resistencia a Neomicina e Hygromicina. De esta forma se obtuvieron las construcciones finales con
las secuencias clonadas en el orden y orientación determinada: 5´UTR-Neomicina-3´UTR y
60
5´UTR-Hygromicina-3´UTR. Estas construcciones están disponibles para ser transfectadas en
epimastigotes de T. cruzi. Este trabajo es financiado por FONCYT
BM-12. Mapa de dominios WW y sus proteínas interactuantes en Trypanosoma cruzi como
modelo para la búsqueda de nuevas drogas anti-parasitarias en la Enfermedad de chagas.
Reinert M1, Westergaard G1, Vazquez M2.
1
LBGT, FBMC, UBA. 2LBGT, FBMC, UBA. [email protected].
Los dominios WW son módulos proteicos que median interacciones proteína-proteína
reconociendo motivos peptídicos ricos en prolina. Las proteínas con WW sirven de plataforma
para el ensamblado de redes multiproteicas, que transducen señales y funcionan en diversos
procesos metabólicos dentro de la célula. Estos dominios se pueden clasificar en 4 grupos en base
a su unión a ligandos ricos en prolinas: grupo I, reconocen motivos P(n)Y; grupo II motivos
P(n)LP, grupo III motivos P(n)R y grupo IV motivos p(S/T)P. Nuestro objetivo es hacer un mapa
completo de estas interacciones, permitiendo así caracterizar el patrón de ligandos ricos en
prolinas, que unen los distintos WW de T. cruzi. Un estudio más profundo de las interacciones que
se encuentren, nos permitirá analizar luego, el posible uso de éstas como targets para la búsqueda
de nuevas drogas anti-parasitarias. En primer lugar se rastreó la base de datos del genoma de
Trypanosoma cruzi para identificar las proteínas con WW, y todas sus posibles contrapartes con
motivos ricos en prolina. Encontramos 11 proteínas no redundantes conteniendo dominios WW,
que llevan a un total de 17 dominios. Algunas presentan dominios adicionales como ser de
ATPasa, de unión a citoesqueleto de actina o dedos de zinc. Es interesante destacar que la gran
mayoría de estas proteínas no tienen ortólogos en otros eucariotas. T. cruzi presenta 4 proteínas
con WW especificas que nisiquera tienen ortologos en T. brucei. Rastreos usando expresiones
regulares nos permitieron encontrar 24 proteínas que contienen motivos P(n)Y o P(n)LP, que
usamos como candidatos para evaluar la especificidad de los dominios WW I y II de
trypanosomatidos. En segundo lugar, para realizar la prueba de concepto del mapa de
interacciones, en una matriz de 25 celdas, se seleccionaron 5 proteínas WW y 5 proteínas con
motivos prolina. Con este fin, actualmente se está utilizando el sistema de doble híbrido en
levaduras, en combinación con la tecnología Gateway (Invitrogen). Además, seleccionamos dos
proteínas específicas de T. cruzi conteniendo dominios WW, a las que llamamos WW09 y WW12.
Las mismas están siendo empleadas como cebo para un screening por doble híbrido de levaduras,
de una biblioteca genómica de T. cruzi disponible en el laboratorio. La selección de las proteínas
se hizo en base al número de dominios presentes y a la variedad de grupo al que pertenecen los
mismos. Los resultados que arroje esta aproximación serán presentados en el congreso, en
conjunto con el mapa conceptual de interacciones.
BM-13. Cultivo celular primario de Echinococcus granulosus: formación de estructuras
compatibles con protoescólices.
Prada L1, Spiliotis M2, Cucher M1, Brehm K3, Rosenzvit M1.
1
Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, UBA, Argentina. 2Universidad de Berna,
Suiza. 3Universidad de Würzburg, Alemania. [email protected].
Echinococcus granulosus es un parásito cestode cuyo estadío larval es responsable de la
hidatidosis. Su ciclo de vida involucra dos tipos de hospedadores. En el hospedador definitivo,
perro u otros cánidos, se desarrolla el gusano adulto que genera oncosferas. Luego de liberarse al
medio, las oncosferas infectan al hospedador intermediario, animales ungulados y eventualmente
61
el hombre, formando el metacestode o quiste hidatídico. A partir de la capa germinal del quiste
hidatídico se generan vesículas prolígeras, las cuales a su vez, forman protoescólices que al ser
ingeridos por el hospedador definitivo desarrollan parásitos adultos. Si bien el estudio de los
parásitos helmintos ha avanzado en las últimas décadas, no se ha podido alcanzar el desarrollo
logrado en parásitos unicelulares debido a la complejidad de los ciclos de vida, difíciles de
reproducir en el laboratorio, y a la falta de modelos in vitro apropiados. Hasta el momento no
existen publicaciones sobre el cultivo celular primario de E. granulosus. Para E. multilocularis, en
cambio, ha sido reportado el establecimiento de cultivos celulares primarios a partir de células
provenientes del metacestode que, en condiciones reductoras y en co-cultivo con células del
hospedador, tienen la capacidad de agregarse y formar vesículas correspondientes al metacestode.
El objetivo de este trabajo es establecer un modelo de cultivo in vitro de células primarias de E.
granulosus para estudiar su capacidad de desarrollo. Para ello, se disgregaron con tripsina paredes
de quistes hidatídicos de origen porcino. Las células obtenidas se cultivaron en condiciones
reductoras (batocuproína), con el agregado de insulina humana, y en co-cultivo con distintas líneas
celulares: PK15 (células de riñón porcino), RH (células de hepatoma de rata), COS-7 (células de
riñón de mono) y HEK (células de riñón de embrión humano). En todos los casos se observó
viabilidad celular al menos hasta los dos meses de cultivo y formación de agregados celulares. En
el caso de células RH- , a los dos meses de cultivo, estos agregados mostraron una morfología y
movilidad compatible con protoescólices inmaduros, a diferencia de lo reportado en cultivos
primarios de E. multilocularis. La capacidad de movimiento sugiere la presencia de células
musculares y el desarrollo de un sistema nervioso. El modelo in vitro obtenido, es de utilidad para
el estudio de las distintas etapas de la formación de protoescólices así como también para el
análisis de los factores del hospedador y del parásito involucrados en el desarrollo y la
diferenciación celular.
BM-14. Caracterización de una proteína del tipo HMG-B de Trypanosoma cruzi.
Perozzi M, Cribb P, Villanova VG, Serra E.
Laboratorio de Parasitología Molecular-IBR-Conicet. [email protected]
Las proteínas “High Mobility Group” (HMG) son una superfamilia de proteínas nucleares capaces
de unirse al ADN e inducir cambios estructurales en la cromatina, afectando a distintos procesos
nucleares. Las proteínas HMG-B contienen uno o dos dominios “HMG Box”, que se unen al surco
menor del ADN con baja o nula especificidad de secuencia. Se ha descripto que las HMG-Bs
pueden “relajar” la estructura de los nucleosomas aumentando así la accesibilidad a distintos
complejos proteicos tales como remodeladores de la cromatina y factores de transcripción. En
Trypanosoma cruzi se ha identificado una proteína perteneciente a esta familia: TcHMG-B. Esta
proteína, tienen dos dominios “HMG box” tal como las HMG-Bs de mamíferos. Sin embargo, las
HMG-Bs de tripanosomátidos carecen de la región acídica C-terminal típica y, en cambio,
presentan una región N-terminal extra. En otros organismos, se han descripto numerosas
modificaciones post-traduccionales que modulan las funciones de las HMGs. Para evaluar posibles
modificaciones de TcHMG-B, se utilizo el programa “myhits”, identificándose regiones ricas en
Lisina, posibles sitios de fosforilación y uno de amidación. Este programa también identificó una
región de localización nuclear en el segundo dominio HMG-box. Por otra parte, esta proteína
también podría ser sumoilada (unión de SUMO:”small ubiquitin-related modifier”), según la
predicción del programa “sumosp” Ensayos de “Western Blot” nos permitieron verificar la
expresión de la proteína en epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes de T. cruzi. Los ensayos
de inmunofluorescencia confirmaron la presencia de TcHMG-B en el núcleo del parásito. Para
realizar estudios in vivo, se transfectaron epimastigotes de T.cruzi con el vector de expresión
pTREX-TcHMG-B. Este cultivo mostró un crecimiento lento comparado con el control
62
transfectado con el vector vacío y con la cepa salvaje. Al cabo de unas semanas, todos los parásitos
del cultivo transfectado con TcHMG-B murieron. Estos resultados, si bien son preliminares,
sugieren que esta proteína estaría implicada en importantes procesos celulares en T.cruzi. Con el
fin de estudiar las funciones de los diferentes dominios, se diseñaron oligonucleótidos para
expresar separadamente cada uno de ellos. Se clonaron en el vector pTREX y se transfectaron en
epimastigotes. Hasta el momento se ha observado que los parásitos que expresan la proteína
truncada sin el dominio N-terminal, (TcHMG-B-ΔN), tienen un crecimiento similar al control.
Más estudios están realizándose para concluir sobre la función de cada uno de los dominios
EPIDEMIOLOGIA Y VECTORES (EPyV)
EPyV-1. Enteroparásitos en Hospital Pediátrico Juan Pablo II de la ciudad de Corrientes.
Estudios preliminares.
Pasi L1, Sánchez Vallduví M2, Hidalgo M2, Rosa JR2.
1
Hospital Pediátrico. 2Cátedra Parasitología-Bioquímica-FaCENA-UNNE.
[email protected]
En algunos países, las parasitosis intestinales representan problemas para la salud pública,
generalmente subestimadas por ser asintomáticas y pueden contribuir a la morbilidad al asociarse a
la malnutrición. El objetivo del siguiente trabajo fue determinar la prevalencia de enteroparásitos
en niños que concurren por demanda espontánea e internados del hospital pediátrico. De julio de
2008 a junio de 2009 se efectuaron estudios coproparasitológicos en 732 niños de 0 a 14 años: 326
(44,6%) varones y 406 (55,4%) mujeres. Se realizaron colectas en fresco y seriadas (6
días/solución formol 10%) y escobillado perianal seriado en procura de huevos de Enterobius
vermicularis. Se procesaron por los métodos de Ritchie y centrifugación, respectivamente. Del
total analizado, se hallaron uno o más parásitos distribuidos en orden de frecuencia: Giardia
lamblia 20% (146), Blastocystis hominis 8% (58), Entamoeba coli 6,4% (48), Enterobius
vermicularis 3,2% (24), Uncinaria* 1,6% (12), Endolimax nana 1,5% (11), Ascaris lumbricoides
1,1% (8), Hymenolepis nana 1,1% (9), Strongyloides stercoralis 1% (7), poliparasitados 6,3% (47)
se consideraron aquellos con dos o más helmintos y protozoarios. Trichuris trichura se halló junto
a A. lumbricoides y G. lamblia. (*no se realizó cultivo parasitológico para identificación de
especie). No se observó Entamoeba histolytica. Estos resultados preliminares demuestran que la
contaminación del suelo y el agua, el deficiente sistema de eliminación de excretas y patrones de
higiene, son los factores de mayor influencia en la prevalencia de las enteroparasitosis a pesar de la
aplicación de programas de desparasitación masiva implementadas, al menos en la población
estudiada.
EPyV-2. Leishmaniosis cutánea: primer caso documentado en la ciudad de Santa Fe
Nardín ME, Mollerach A, Morano S, Ramos C, Nagel A, Mendosa MA, Méndez E de los A.
Hospital José María Cullen. [email protected]
El género Leishmania está constituido por diversas especies y subespecies de protozoos flagelados
cuyo ciclo biológico heteroxénico transcurre en el intestino de insectos flebótomos y en el tejido
del hospedero vertebrado. Los vectores del parásito son mosquitos del género Lutzomyia cuyo
hábitat son las zonas rurales, y las hembras hematófagas transmiten la infección. La lesión cutánea
63
se presenta inicialmente como una pápula en el sitio de entrada del parásito, hay reacción
inflamatoria con necrosis del epitelio y se produce una úlcera circular con bordes delimitados de
tinte violáceo no dolorosa y ganglios regionales inflamados. Cuando se retira la costra que la cubre
se observa exudado con polimorfonucleares e histiocitos conteniendo amastigotes. El diagnóstico
requiere la demostración del parásito en frotis de la lesión o biopsias de tejido. Caso clínico:
Paciente de sexo masculino, de 29 años de edad, oriundo de la ciudad de Santo Tomé, Santa Fe,
que había participado de entrenamiento militar en la provincia de Misiones. Presentaba lesiones
ulceradas costrosas en ambas muñecas. Concurre a nuestro laboratorio para examen bacteriológico,
micológico y parasitológico para investigación de Leishmania. Se tomó la muestra retirando la
costra y raspando los bordes de una de las lesiones, con bisturí estéril, se cultivó en medios
habituales para estudio bacteriológico y micológico que resultaron negativos. Para la investigación
de Leishmania se realizó un frotis y coloración de Giemsa, observandosé a 1000x amastigotes
tanto libres como en el interior de los macrófagos. Luego del diagnóstico de nuestro laboratorio el
paciente viajó a Bs As para su tratamiento. La importancia de este caso es alertar a los infectólogos
y microbiólogos de la emergencia de este patógeno que si bien es endémico de regiones cálidas, es
el primer caso en nuestro laboratorio y provino de un paciente que había viajado a zona tropical.
EPyV-3. Estudio sero-epidemiológico y clínico de Toxoplasma gondii en perros y gatos de
buenos aires.
Gómez NV1, Gury Dohmen F2, Ivanic J1.
1
Facultad de Ciencias Veterinarias. UBA. 2Instituto Pasteur de Buenos Aires. [email protected]
El objetivo de este relevamiento fue determinar la prevalencia serológica en ambas especies y sus
manifestaciones clínicas. Para ello fueron evaluados 200 gatos y 500 perros, pacientes del Hospital
Escuela de la FCV, UBA, por medio de Aglutinación directa, 2-Mercaptoetanol e
Inmunofluorescencia indirecta, específicas para Toxoplasma gondii. En dichas pruebas, el título
mínimo que se considera reactivo en los gatos es >1/256 y en los perros> 1/128. La
Inmunofluorescencia determina Ig G. Con la interpretación combinada de la Aglutinación directa y
la prueba de 2-Mercaptoetanol (2ME) se establece la IgM en forma indirecta. Si el titulo baja en
dos diluciones o más, respecto del obtenido en la Aglutinación directa se debe a la presencia de Ig
M. En los caninos se detectó una prevalencia de 40 %. Solo un 5% presentaban signos de la
enfermedad y el 90% eran menores a un año. También se halló la enfermedad en animales adultos,
pero tenían otras enfermedades de base, tales como neoplasias, Diabetes Mellitus, Distemper,
Hepatozoon, etc. Los signos hallados fueron: uveítis (Coeficiente de Goldmann Witmer) (9
perros); miositis (2 p); parálisis de nervios periféricos (6 p): signos neurológicos centrales (4 p)
enfermedad multisistémica (4 p). En los gatos la seroprevalencia resultó del 50%. La mayoría de
ellos tenían títulos elevados de IFI. El gato es muy buen formador de Ig G y ésta persiste con
niveles elevados por mucho tiempo. Solo 20 % de los gatos evaluados presentaron signos
compatibles con la enfermedad: neumonías intersticiales (6 gatos); hepatitis (2 g); signos
neurológicos centrales (4 g); signos neurológicos periféricos (2 g); Uveítis (Coeficiente de
Goldmann Witmer) (5 g); enfermedad multisistémica (1 g). Con respecto a la distribución etaria de
esta especie el 75% de los enfermos tenían menos de un año. El 70% de estos pacientes tuvo una
buena respuesta al tratamiento con Clindamicina y en el resto se detectaron enfermedades
inmunosupresoras (VIF o ViLeF), por ello la respuesta fue variada, dependiendo de lo avanzado de
la enfermedad de base. Con los resultados se pone en evidencia la elevada prevalencia para
Toxoplasma gondii en nuestro medio y además la baja la prevalencia de signos clínicos, tanto en
perros como en gatos, salvo en animales jóvenes o inmunosuprimidos. Finalmente se destaca la
importancia de la evaluación serológica como método valioso para el diagnóstico clínico, si se
64
examina el resultado de las pruebas a la par que se observa la presencia de signos compatibles con
la enfermedad y la respuesta al tratamiento, la cual es apreciable a los pocos días de instaurada.
EPyV-4. “Gene discovery” en el insecto vector Triatoma infestans.
Avila ML1, Stroppa MM2, Gerez de Burgos N2, Tekiel V1, Sánchez DO1.
1
Instituto
de
Investigaciones
Biotecnológicas
UNSAM
CONICET.
2
Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas, UNC.
[email protected]
El objetivo principal de nuestro proyecto es contribuir al descubrimiento de nuevos genes de T.
infestans con la idea de generar información que pueda ser de utilidad para desarrollar nuevas
estrategias de control de este vector, uno de los más importantes de la Enfermedad de Chagas en
Argentina. Para ello estamos generando ESTs [Expressed Sequence Tags, (secuencias parciales de
mRNAs)] a partir de distintos tejidos y estadíos del vector. Hasta el momento hemos construido 6
bibliotecas de ADNc diferentes y obtenido un total de 1738 ESTs. Las bibliotecas fueron
construidas a partir de ARNm extraído de (i) ninfas de 4to estadio; (ii) intestino y (iii) músculo de
insectos adultos. Tres de las bibliotecas se construyeron usando kits comerciales para favorecer el
clonado de ARNm completos o el incremento de transcriptos de baja abundancia. Dos se
construyeron usando la técnica de ORESTES que incrementa el clonado de la región central de los
transcriptos y la restante se construyó digiriendo el ADN copia con una enzima de alta frecuencia
y clonando en pGemT-easy. Las secuencias obtenidas fueron comparadas, usando el programa
BlastX, con la base de datos de proteínas “nr” del NCBI mediante la herramienta NetBlast. El
38,8% de las mismas presentaron similitud significativa (E value < 1e-10) con proteínas presentes
en la base de datos. El ensamble de este grupo de secuencias generó un total de 89 contigs y 92
singlets; 125 de las cuales (contigs + singlets) presentaron similitud significativa con proteínas de
otros organismos (no triatomíneos), representando nuevos genes para T. infestans. Por otra parte,
1094 secuencias (62,9%) no dieron similitud significativa, por lo que un porcentaje de las mismas
puede representar nuevos genes no descriptos hasta el presente. Recientemente hemos
implementado una estrategia alternativa a los ESTs para descubrir nuevos genes, que consiste en
generar GSSs [Genome Sequence Survey, (secuencias de ADN al azar)]. Para ello estamos
construyendo mini-bibliotecas de ADN genómico usando enzimas de restricción de corte
frecuente. Hasta el momento hemos secuenciado 63 clones. El 19% de los GSSs obtenidos
presentan similitud significativa con proteínas de otros organismos. Agradecemos al Biólogo Raúl
L. Stariolo del Centro de Referencia de Vectores de Córdoba, Argentina, por proveernos
ejemplares de T. infestans.
EPyV-5. Acciones educativas sobre Chagas en áreas no endémicas, alertan sobre probable
riesgo de transmisión vectorial no convencional.
Bizai ML1, Streiger M2, Mendicino D2, Fabbro D2, del Barco M1, Giraldez E2.
1
Centro de Investigaciones sobre Endemias Nacionales-Facultad de Bioquímica y Cs. Biológicas Univesidad Nacional del Litoral. 2CIEN-FBCB-UNL [email protected]
El Chagas afecta a millones de individuos de bajo nivel socio-económico de América. El patrón de
distribución de la endemia ha sido modificado por las migraciones a las grandes ciudades en
búsqueda de mejores condiciones de vida. A 15 km de Santa Fe capital, considerada de baja
endemicidad, se encuentran varias localidades con numerosa población inmigrante boliviana y del
norte del país y de la provincia, dedicados principalmente al cultivo de verduras en quintas. El
65
objetivo del trabajo es alertar sobre potencial vía de transmisión vectorial no convencional,
detectada mediante acciones de educación sobre Chagas en escuelas de éste área no endémica.
Nuestro grupo realiza actividades de investigación-extensión en comunas y centros de salud del
distrito Monte Vera, Dpto. La Capital, provincia de Santa Fe. Varias de las actividades se focalizan
en escuelas, empleando diferentes estrategias didácticas con docentes, alumnos y padres (talleres,
proyección de videos, representaciones teatrales, etc), para transmitir conceptos sobre la
enfermedad, el insecto vector y formas de prevención. A raíz de las propuestas educativas
realizadas, los niños llevan a la escuela insectos que encuentran, siendo generalmente predadores.
Un alumno de 6º grado de la Escuela Nº 36 “Mariano Moreno”, paraje Ascochinga (km18),
capturó en su domicilio un triatomino, lo identificamos como Triatoma platensis, que vive
asociado a las aves y es un transmisor silvestre de Trypanosoma cruzi. Se notificó al Programa
Provincial de Chagas y en forma conjunta, con participación de la Comuna, se visitó la vivienda
(Ruta Nº 2, Km 21, zona rural), donde se constató la presencia de Triatoma platensis, sin
infección, en nidos de Myopsita monacha (cotorras), y se encontraron rastros de heces de
vinchucas dentro del domicilio. Se tomaron muestras sanguíneas para diagnóstico de Chagas a los
integrantes de la familia, resultando seropositivo sólo el padre, quien presenta antecedentes
migratorios de área endémica. Estas acciones, con la participación de la población permitió
identificar un posible transmisor no convencional de la enfermedad de Chagas, Triatoma platensis.
Consideramos de importancia el hallazgo dado que un alto porcentaje de personas que habitan en
esta zona están infectados por T. cruzi, con lo cual se podría iniciar el ciclo vectorial. Si bien este
triatomino no tiene hábitos domiciliarios, en estas condiciones eco-epidemiológicas y por su
acercamiento paulatino al peridomicilio humano podría ser un potencial transmisor de la
enfermedad.
EPyV-6. Evaluación diagnóstica mediante la técnica de ELISA del recombinante TSSA-II de
Trypanosoma cruzi en sueros de perros infectados naturalmente.
Cimino R1, Ragone P2, Lauthier J2, Monje Rumi M2, Alberti D`Amato A1, Gil JF 3, López Quiroga
I1, Buscaglia C4, Diosque P 2, Nasser J1.
1
Cátedra de Química Biológica. 2Unidad de Epidemiología Molecular. Universidad Nacional de
Salta. 3Instituto de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, Orán. Universidad Nacional de
Salta. 4Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, Universidad Nacional de San Martin
(UNSAM). [email protected]
La proteína TSSA (Trypomastigote Small Surface Antigen) se encuentra en la superficie del
parásito y permite la discriminación de los dos linajes de T. cruzi, TcI (TSSA-I) y TcII (TSSA-II).
El antígeno recombinante TSSA-II fue evaluado mediante la técnica de ELISA (0.1µg/poc,
dilución de suero 1/500) usando 120 sueros de perros. Se formaron los siguientes grupos de sueros
(G), G1:15 sueros Controles Positivos (CP), correspondiente a perros infectados naturalmente, de
los cuales los aislados fueron caracterizados por MLEE como TcIIe (n=14) y TcIIc (n=1); G2: 75
sueros Controles Negativos (CN), correspondiente a perros de la misma área endémica del G1,
todos fueron negativos por xenodiagnóstico (Xe), serología y PCR; G3: 17 sueros CN
pertenecientes a perros de la ciudad de Salta, área no endémica, todos fueron negativos por
serología para T. cruzi; G4: 2 sueros de perros de los cuales los aislados fueron caracterizados por
MLEE como TcI; y G5: 11 sueros con serología positiva y Xe negativo, todos de la misma área
endémica. La sensibilidad calculada fue del 86.6% (13/15) con un IC (95%) 66.13-100 y la
especificidad del 100% (0/92) con un IC (95%) 99.33-100. El área ROC calculada fue de 0.97, EE
0.02; CI (95%) 0.925-1.02 Delong. La concordancia observada fue de 0.977, y el índice Kappa de
0.91, EE 0.059 con un IC (95%) 0.8-1.00. Del G4 fueron todos no reactivos. Del G5, el 54.54%
(6/11) fueron reactivos. De acuerdo al análisis ROC, la prueba tuvo una alta performance para el
66
diagnóstico en las condiciones que fue normatizado. La concordancia entre MLEE y el
recombinante TSSA-II fue muy bueno de acuerdo a la escala de Landis y Koch para la
interpretación del índice Kappa. La técnica de ELISA utilizando el antígeno recombinante TSSAII podría representar una herramienta importante para estudios epidemiológicos que involucren la
infección canina por T. cruzi. Ensayos de normatización de ELISA utilizando el antígeno
recombinante TSSA-I para examinar sueros de perros naturalmente infectados, y ratones con
infecciones experimentales están siendo realizados actualmente por nuestro grupo de trabajo.
Financiado por CIUNSa N° 1720, N° 1828, CONICET, PICTo N° 36714 y IRD.
EPyV-7. Herramientas de tipificación molecular de poblaciones naturales de T. cruzi en
muestras pertenecientes al ciclo doméstico en Argentina y al ciclo silvestre en Brasil.
Cura C1, Bisio M1, Burgos JM1, Bruses B2, Lejona S3, Riobo P, Anchart E3, Dip G3, Gurgel
Gonçalves R4, Monje Rumi MM5, Levin MJ1, Diosque P5, Cuba Cuba CA4, Lucero R2, Schijman
AG1.
1
Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas. INGEBI-CONICET, Bs. As.,
Argentina. 2Instituto de Medicina Regional. Universidad Nacional del Nordeste. Resistencia,
Chaco, Argentina. 3Área de Biología Molecular. CEMAR-Municipalidad de Rosario, Santa Fe,
Argentina. 4Laboratorio de Parasitologia Médica e Biologia de Vetores, Área de Patologia,
Faculdade de Medicina, Universidade de Brasilia, Brasilia DF, Brasil. 5Unidad de Epidemiología
Molecular, IPE, Universidad Nacional de Salta, Salta, Argentina. [email protected]
T. cruzi se agrupa en 2 linajes principales: T. cruzi I y T. cruzi II, Tc I presenta al menos 5
haplotipos Ia-e en base a un motivo de microsatélite en el espaciador intergénico del miniexón
(EIMx); y Tc II, 5 sublinajes IIa-e en base a diferentes marcadores isoenzimáticos y moleculares.
Tc IIb/d/e ha sido relacionado mayormente al ciclo doméstico de transmisión; Tc IIa/c, al ciclo
silvestre, y Tc I, a ambos. Estas poblaciones podrían jugar un rol importante en el tropismo tisular
y en la patogénesis de la enfermedad de Chagas. Este estudio aplicó estrategias de PCR para
tipificar poblaciones de T. cruzi directamente a partir de muestras biológicas. Se analizaron
muestras sanguíneas de pacientes provenientes de zona endémica (Chaco: poblaciones Pilagás,
Tobas y criollas; Formosa y Santiago del Estero) y residentes en zona no endémica (Ciudades de
Buenos Aires, Rosario, Concordia y Corrientes, incluyendo inmigrantes nacidos en Bolivia y
Paraguay) de la Argentina. Asimismo, se analizaron muestras de tejido intestinal, heces/orina de
triatómicos silvestres y cultivo de parásitos aislados de los insectos, fijados directamente en papel
de filtro (Rhodnius sp encontrados en palmeras de Brasil Central y de la región Amazónica,
Triatoma sp y Panstrongylus megistus). El linaje se determinó de acuerdo al algoritmo publicado
en Burgos y col, Int. J. Parasitol. 2007 (37(12):1319-27) y en el caso de Tc I por secuenciación del
EIMx (Cura y col, SAP 2008, 2009). De las 186 muestras clínicas que resultaron T. cruzi positivas
por PCR de kDNA, 65 % fueron Tc IIb/d/e y 1.1% Tc I. Dentro del grupo IIb/d/e se evidenció un
claro predominio del linaje IId (76 %), mientras que los genotipos IIb/e y posibles poblaciones
mixtas IId + IIb/e representaron un 3,3 %. Debido al bajo nivel de parasitemia en la fase crónica de
la infección, no fue posible tipificar 34 % de las muestras kDNA positivas. De las 76 muestras de
triatominos, 34 resultaron kDNA positivas. Se descartó la presencia de inhibidores de PCR por
amplificación de 5 fg de DNA de T. cruzi agregados al extracto de muestras kDNA negativas. Se
determinó el linaje de 3 muestras, obteniéndose Tc I, haplotipo Id y una población mixta Tc I + Tc
IIb/d/e. Estos resultados concuerdan con trabajos anteriores que encuentran a Tc IId como
población sanguínea prevalente en infección humana del cono sur, y a Tc I en el ciclo silvestre en
Brasil, y demuestran la utilidad de estas estrategias para detectar poblaciones mixtas, que suelen
estar enmascaradas al tipificar linajes en aislamientos de cultivo.
67
EPyV-8. Observaciones sobre la existencia de Blastocystis hominis en humanos entre los años
2000 Y 2009.
Gené CM, Rea MFJ, Borda CE.
Centro Nacional de Parasitología y Enfermedades Tropicales (Cenpetrop). Facultad de Medicina,
Universidad Nacional del Nordeste. [email protected]
Blastocystis hominis es un organismo cosmopolita encontrado en heces humanas y de animales
como mamíferos, aves, reptiles, anfibios y artrópodos. A pesar de haber sido descripto alrededor
de cien años atrás aún se discute su ubicación sistemática: inicialmente se lo incluyó entre los
hongos, después entre los protozoos Apicomplexa, luego en Sarcomastigophora y últimamente en
Chromalveolata, considerado por algunos Reino independiente. Asimismo muchos aspectos
relacionados con su morfología, biología y epidemiología son controversiales o desconocidos. No
existe uniformidad de criterios entre su hallazgo en las heces y su relación con la sintomatología
del paciente y se desconoce la influencia de factores asociados condicionantes de la infección. Por
esta razón el objetivo de este trabajo es presentar un estudio retrospectivo de la frecuencia de B.
hominis y su relación con la sintomatología, de pacientes de ambos sexos y todos los grupos
etarios asistidos en el Cenpetrop desde enero de 2006 hasta julio de 2009. Las heces preservadas
en formol al 5% y el mucus perianal, ambos en colecta seriada de 6 días, se analizaron con las
técnicas de Hoffmann, Pons y Janer y Ritchie y el método de la cinta engomada de Graham
respectivamente. Se registraron los síntomas que presentaba cada paciente al momento del examen
coproparasitológico. De 831 personas examinadas, 488 (59%) presentaron uno o más parásitos. B.
hominis fue el más frecuente, encontrado en 329 (67%) de los infectados. B. hominis se presentó
como único parásito en 176 (53%) pacientes (69 varones y 107 mujeres), en todos los grupos
etarios, desde una niña de un año hasta un varón de 91, pero con más preponderancia en la franja
de 20 a 49 años. El 17% manifestó prurito, dolor abdominal el 14%, diarrea el 14%, exantema el
6%, mareos el 6%, constipación el 5%, cefalea el 4%, vómitos el 4%. Con menos frecuencia se
manifestaron otros síntomas como epigastralgia, inapetencia, meteorismo y gastritis. No sintió
ningún malestar el 55%. La sintomatología relacionada con el protozoo coincide con los datos
publicados en las revisiones de Zierdt (1991), Stenzel & Boreham (1996) y Salinas & Vildozola
(2007). Se puede concluir, después de analizar una muestra significativa de personas que tenían B.
hominis, que continúa siendo necesario profundizar en aspectos tales como mecanismos de
transmisión, la real patogenia y la ecoepidemiología de este parásito.
EPyV-10. Colonización intradomiciliaria por T. patagonica en el Departamento San
Cristóbal en la provincia de Santa Fe.
Giraldez EL1, Lopez Ureta MP1, Nepote M2.
1
Fac. de Bioquimica y Cs. Biologicas UNL 2Programa Provincial de Chagas Ministerio de Salud
de la Provincia de Santa Fe. [email protected]
Dentro de las especies silvestres de triatominos, el Triatoma patagonica se encuentra
frecuentemente en el peridomicilio, ocupando una gran diversidad de hábitats. Debido a la
importancia de estas poblaciones peridomésticas como posibles transmisoras vectoriales de la Enf.
de Chagas, nos propusimos observar la distribución y colonización de esta especie en el ambiente
humano. Se relevaron viviendas rurales tipo rancho de varias localidades de la zona centro-oeste
del Dep. San Cristóbal de la Prov. de Sta Fe, mediante un trabajo conjunto entre la Fac.de Bioq. y
Cs Biol. U.N.L y el Prog. Pcial de Chagas, durante el mes de marzo de los años 2006 y 2009, con
la finalidad de detectar las especies de triatominos predominantes en domicilio y peridomicilio.Las
especies capturadas fueron analizadas según las claves taxonómicas de Lent, H. & P.
Wygodzinsky.1979; el estudio de infectividad para determinar la presencia de T. cruzi en las
68
mismas, se realizó por extracción del contenido intestinal y observación al microscopio óptico. Se
calcularon índices entomológicos según OPS (2003): Índice de Infestación (II), Índice de Densidad
(ID), Índice de Infección Natural (IIN) e Índice de Colonización (IC).En el año 2006, se relevaron
102 viviendas. Se halló que un 4.9 % estaban infestadas y que la especie predominante era T.
infestans en domicilio y peri. De los 50 ejemplares capturados 44 eran T. infestans y 6 T.
patagonica éstos solo en peridomicilio. El Prog Pcial de Chagas fumigó ambos hábitats. En marzo
del año 2009 y por vigilancia pasiva, los mismos pobladores denunciaron la presencia de
“vinchucas”; se realizó un nuevo relevamiento entomológico en 22 viviendas de la zona el cual
reveló un 40.90 % de infestividad con un notable aumento de triatominos. Se capturaron 189
insectos, de las cuales 127 fueron T. infestans, 61 T. patagonica y 1 T. platensis. Del total de T.
patagonica capturadas el 14.75 % se hallaron colonizando el domicilio, no compartiendo este
hábitat con T. infestans. Año 2006 para T. infestans: II = 3,92 %; ID=8.8; IC= 75%; IIN=65.9 %.
Para T. patagónica: II= 0,98%; ID= 1.2; IC=100 %; IIN=0%. En el año 2009: para T. infestans: II
= 18.18 %; ID=14.11; IC= 100% en el peridomicilio; para T. patagónica: II= 18.18%; ID= 6.77;
IC=100 % en dormitorio; en ambas especies: IIN=0 %. Concluimos que probablemente T.
patagonica está en proceso de adaptación al domicilio humano. Esto favorecería un potencial
riesgo de transmisión vectorial de la Enfermedad de Chagas, ya que el vector está presente y
colonizando la habitación humana aunque, hasta el momento, no se lo ha encontrado infectado.
EPyV-11. Desarrollo de un esquema de tipificación por secuenciación de locus múltiples
(mlst) en Babesia bovis.
Guillemi E, Ruybal P, Rodríguez Broggi MG, Delfino S, Príncipi D, Petrigh R, Nuñez P, Farber
M, Wilkowsky S.
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Cautelar. [email protected]
La babesiosis causada por el protozoario Babesia bovis es una enfermedad hemoparasitaria de los
bovinos que causa importantes pérdidas económicas a la ganadería. El empleo de metodologías de
tipificación molecular resulta esencial para comprender la epidemiología de este parásito. El
objetivo de este trabajo fue desarrollar un esquema de MLST para B. bovis. Se evaluaron
inicialmente 22 genes housekeeping; seleccionados del genoma anotado de B. bovis
(www.vetmed.wsu.edu/research_vmp/Babesia-bovis) y en base a su aplicación en esquemas
MLST para otros microorganismos eucariotas. Luego de amplificar y secuenciar un fragmento
promedio de 700 pb, de estos 22 genes se seleccionaron 7, elegidos por su mayor cantidad de sitios
polimórficos, su distribución en los cuatro cromosomas del parásito, ausencia de presión selectiva
y especificidad frente al ADN de bovino y de los hemoparásitos B. bigemina y Anaplasma
marginale, los cuales coinfectan frecuentemente el ganado de las regiones enzoóticas para B.bovis.
Los 7 genes seleccionados fueron: gsk (glycogen synthase kinase-3 alpha), dnaJ (DnaJ domain
containing protein), gpad (G-patch domain containing protein), pkid (protein kinase domain
containing protein), rcc (regulator of chromosome condensation domain containing protein), rip9
(ribosomal protein L9, N-terminal domain containing protein), y sbp4 (spherical body protein 4).
Para el análisis de las secuencias se desarrolló una pipeline bioinformática propia (MLST–
pipeline) y disponible en forma remota en http://190.103.0.207. Esta pipeline permite ingresar las
secuencias en forma de cromatogramas, realiza el armado de contigs, alineamiento de secuencias y
asigna los haplotipos correspondientes a cada gen. La combinación de haplotipos para cada gen
define el tipo de secuencia o sequence type. Se analizaron un total de 4 cepas de referencia (R1A,
M1A, S2P y M2P) y 3 casos clínicos de babesiosis aguda (35, 249 y 394) de la provincia de Salta.
Con las secuencias de los 7 genes concatenados se realizó un análisis filogenético utilizando el
programa MEGA versión 3.1 y se obtuvo un dendograma con el método Neighbor-joining. El
empleo de la técnica de MLST para Babesia bovis a mayor escala permitirá obtener información
69
acerca de las relaciones filogenéticas entre los distintos aislamientos de este parásito. Además, la
herramienta bioinformática desarrollada facilita el análisis a gran escala, reduciendo
significativamente el tiempo requerido para el procesado de los datos y minimizando los posibles
errores. Este proyecto fue financiado con fondos de la ANPCYT-PICT 1634 y de INTA.
EPyV-12. Toxocariasis: Seroepidemiology in the centro-litoral region of Argentina.
Martín UO1, Demonte M1, Machuca P1, Piedrabuena M1, Cordani F1, Widerhorn N2, Pepino S2.
1
CIEN - FBCB – UNL. 2Clínica de Pequeños Animales-FCV – UNL. [email protected]
The human Toxocariasis is a parasitic disease widely distribuited worldwide. The causative agents
are principally Toxocara canis and less frequently Toxocara cati . The disease is certainly the most
prevalent helminthiasis in industrialized countries. In humans, after infection with embrionated
eggs, the larvae follow a route of migration to muscle and nervous tissue, but the development of
the larva is interrupted and they do not reach the adult stage. It has been reported that the larvae
can persist viable in the tissues, for up to 10 years. The present study, show the prevalence of the
infection with Toxocara spp in different age population. 420 sera samples, selected at random, 332
were children with age ranging from 1 to 19 years: 2 population of children´s hospitals of state
capitals (Santa Fe y Paraná), that were considered as urban areas, another population of the
hospital of Rafaela City, considered suburban area, and a rural population, of 75 children in
Villaguay, Entre Rios. An adult population, composed of 2 samples of 44 sera, of blood donors of
regional blood bank of Santa Fe and Paraná, the mean age was 34-35 years. The sera were
analyzed with the ELISA test (enzyme-linked-inmunoabsorbent-assay) developed in the laboratory
with the excretory and secretory antigens from T. canis second-stage larval. The reaction was
standardized and controlled. The samples were analyzed in 2 referential laboratories of Argentina
and the results compared. The sera of blood donors were also studied with 2 commercial kits. The
prevalence in children of both capitals City was 28,80% (N=184). The prevalence in children of
Santa Fe 40,8% (N=93), in Paraná 18% (N=100), in Rafaela 26,15% (N=65) and in rural areas of
Villaguay 54,7% (N=75). In the blood donors the prevalence was 46,7%. The prevalence
according with age ranging , show the age of infection risk, important to propose public health
programs to prevent the infection.This result and others found in the region show that Toxocariasis
is an endemic disease, that affect principally children and should be considered a priority problem
in public health. An early and routine research in pediatric patients should be promoted, and also,
the use of sensitive and specific diagnostic tests. Is discussed, the use of commercial diagnostic
kits and the mechanism of transmission of the infection.
EPyV-13. Enteroparasitosis en diferentes comunidades escolares del distrito Alto Verde
(Santa Fe, Argentina).
Pawluk DB, Aró C, Olivera L, Zalazar F.
Laboratorio Práctica Profesional. [email protected]
El Distrito Alto Verde, a la vera de la Laguna Setúbal (Santa Fe), posee una población de escasos
recursos económicos que habita –en muchos casos- viviendas precarias, sobre calles de tierra, con
redes cloacales inexistentes y muchas de ellas con carencia de agua potable. Objetivo. Evaluar la
frecuencia de enteroparásitos, correlacionándola con datos epidemiológicos, en establecimientos
educativos de diferentes zonas del Distrito Alto Verde. Durante 2007-2008 se recolectaron
muestras de materia fecal e hisopado perianal, en alumnos de ambos sexos (Edad: 5-16 años) de
las escuelas “Victoriano Montes”, “Omar Rupp” y “Almafuerte”. Se realizaron 330 encuestas
70
epidemiológicas con información sobre el lugar de residencia, disponibilidad de agua corriente y
red cloacal, eliminación de excretas, presencia de sintomatología compatible con parasitosis,
hábitos de alimentación e higiene. Se efectuaron análisis coproparasitológicos (CPS) a 72 muestras
(exámenes directos, métodos de concentración y diferentes coloraciones). Resultados. Del total de
muestras analizadas se obtuvieron un 61% (44/72) de CPS positivos. Los principales protozoos
encontrados fueron: Blastocystis hominis (38%), Entamoeba coli (21%), Giardia lamblia (11 %) y
Endolimax nana 1,4%. No se observó presencia de coccídeos. Los mayores porcentajes de
helmintos fueron: Enterobius vermicularis (11%), Trichuris trichiura (3%), Hymenolepis nana
(3%) y Áscaris lumbricoides (1,4%). Sobre el total de muestras positivas, el 71% (31/44) presentó
una sola especie de parásito. En la escuela “Almafuerte” no se encontraron asociaciones
parasitarias mientras que en las muestras de las escuelas “Victoriano Montes” y “Omar Rupp”, el
25% (8/31) presentó dos especies de parásitos y el 9% (3/31) tres o más especies. Conclusiones. Al
evaluar los resultados obtenidos observamos un elevado porcentaje de individuos
monoparasitados, (58 %) en las escuelas “Victoriano Montes” y “Omar Rupp” y (59%) en la
escuela “Almafuerte. El hallazgo de Blastocystis hominis (38%) como principal agente parasitario
coincide con otros estudios realizados en la región. La presencia de asociaciones parasitarias en las
escuelas “Victoriano Montes” y “Omar Rupp”, a diferencia de la escuela “Almafuerte”, se
correlacionó con los datos de la encuesta epidemiológica y evidenciarse que la cercanía de
basurales, la presencia de criaderos de animales, la carencia de agua potable, reflejaban
condiciones sanitarias ambientales y socioeconómicas deficientes en diferentes zonas del Distrito
Alto Verde, favoreciendo la presencia de enteroparasitosis.
EPyV-14. Evaluación post-tratamiento de niños infectados por Trypanosoma cruzi en dos
áreas rurales endémicas para la Enfermedad de Chagas en la Provincia de Chaco.
Ragone PG1, Monje Rumi MM1, Alberti D Amato AM1, Lauthier JJ1, Tomasini N1, Uncos A1,
Cimino RO2, Gil JF2, Orellana V3, Juarez A5, Gonzalez M5, Meza C5, Zaca R3, Ramos F1, Segura
MA4, Naser JR2, Basombrío MA4, Diosque P1.
1
Unidad de Epidemiología Molecular, Instituto de Patología Experimental, Facultad de Ciencias de
la Salud, Universidad Nacional de Salta, CONICET. 2Cátedra de Química Biológica y Biología
Molecular, Facultad de Ciencias de Naturales, Universidad Nacional de Salta. 3Cátedra de
Microbiología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Salta. 4 Instituto de
Patología Experimental, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Salta,
CONICET. 5 Hospital Enrique V de Llamas, Charata, Chaco.
[email protected]
En los parajes rurales de Tres Estacas (TE) y Pampa Ávila (PA) en la Provincia de Chaco, se
realizó una evaluación post-tratamiento antichagásico con Benznidazol (5 y 2 años posttratamiento, respectivamente), de 23 niños de cada paraje; mediante pruebas serológicas (HAI y
ELISA, Wiener Lab) y PCR (primers 121 y 122). En ambos parajes, los resultados de PCR posttratamiento muestran una negativización del 90% (22/23) (en TE 10/23 fueron PCR positivos
pretratamiento y en PA 11/23 fueron PCR positivos pretratamiento). En los niños de TE, tratados
hace 5 años, se observó mediante ELISA, una seroconversión de 30,4% (7/23), mientras que en los
niños de PA tratados hace 2 años, la seroconversión fue de 8,7% (2/23). La comparación entre los
niveles promedios de Densidad Óptica pre- y post-tratamiento de los niños de TE mostraron un
significativo descenso de niveles de IgG (p<0,05). El 100% (7/7) de los niños de TE que
seronegativizaron mostraron tener PCR negativa pre- y post-tratamiento, mientras que el 50% (1/2)
de los niños de PA que seronegativizaron también fueron negativos por PCR. Mediante HAI, solo
se observó una seroconversión del 4% (1/23) en ambos parajes. Las muestras del 17% de los niños
seropositivos de TE, mostraron un descenso de 2 y 3 títulos de anticuerpos, mientras que en el 47%
71
de las muestras de niños seropositivos de PA se observó un descenso de entre 2 y 6 títulos de
anticuerpos. La baja seroconversión por ELISA de los niños tratados hace 2 años coincide con
trabajos previos, los cuales sugieren que la negativización serológica ocurre en un período de
tiempo prolongado, tal como se observa en los niños tratados hace 5 años. Si bien, con HAI solo se
evidencio una negativización del 4%, es importante destacar que en varios niños, se observó un
descenso de 2 o más títulos de anticuerpos; algunos autores proponen esta evidencia como
pronostico de cura. La negativización de la PCR en un elevado porcentaje de los niños, podría
representar una evidencia temprana del éxito terapéutico. Sin embargo, estos resultados deberían ir
acompañados de una negativización serológica. En nuestro estudio, hemos observado que la
seronegativización aparece significativamente asociada a niños cuya PCR fue negativa en la
muestra pretratamiento. Esto podría deberse a que niños con una baja carga parasitaria en sangre
(por debajo del límite de detección de la PCR) presenten una mejor respuesta terapéutica.
Financiado por: Institute de Recherche pour le Développement (IRD), Francia; Seventh
Framework Programme, European Commission; FONCyT; CIUNSa.
EPyV-15. Enteroparasitosis: Prevalencia y distribución según grupos etarios en el área
programática del Hospital Mira y López de la ciudad de Santa Fe.
Ramírez R1, Martorina AM1, Ulmari L1, Racca L2, Echenique C3.
1
Hosp. Mira y López. 2Área Estadística y Procesamiento de Datos. 3Área Parasitología.
[email protected]
En los países en desarrollo como Argentina, existe una fuerte asociación entre condiciones
sanitarias y de higiene y las infecciones parasitarias. Los pacientes que se atienden en el Hospital
Mira y López (Santa Fe) pertenecen a un nivel socioeconómico bajo, careciendo en su gran
mayoría de agua de red y cloacas, condiciones propicias para poseer una alta prevalencia de
parasitosis. Los objetivos de este trabajo fueron: determinar la prevalencia de enteroparasitosis
durante el período 2005-2008, establecer las frecuencias de los parásitos hallados y conocer la
distribución de los enteroparásitos en distintos grupos etarios. Durante el período 01/01/2005 a
31/12/2008 se analizaron las materias fecales de 19868 pacientes provenientes de distintos centros
asistenciales pertenecientes al área programática del hospital. Los pacientes fueron clasificados en
4 grupos etarios: Grupo I: menor a 1 año, Grupo II: 2 a 4 años, Grupo III: 5 a 14 años y Grupo IV:
mayores a 15 años. Los exámenes coproparasitológicos (frescos y seriados en formol al 10 %) se
procesaron por examen microscópico directo con y sin colorantes húmedo como lugol a 100 x y
400x, y exámenes macroscópicos por tamizado. La búsqueda de huevos de Enterobius
vermicularis a 5200 pacientes se realizó a través del test de Graham (período 2005-2006) y por
medio de hisopado anal seriado (2007-2008). Los parásitos encontrados fueron: Entamoeba
histolytica/dispar, Giardia lamblia, Blastocystis hominis, Entamoeba coli, Endolimax nana,
Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Strongyloides stercoralis. Las prevalencias de
enteroparasitosis no fueron las mismas en los años estudiados, p <0.0001: 61.09 % (2005), 58.07%
(2006), 47.38%(2007), 40.36% (2008). Los protozoarios más frecuentes en todos los años fueron
B. hominis y G. lamblia con 28.86% y 23.96% respectivamente y dentro de los helmintos A.
lumbricoides e H. nana, con 13.10% y 4,84% respectivamente. La prevalencia de E. vermicularis
(2005-2006) fue de 6,03%, aumentando a 16,14% en los años 2007-2008. Esta diferencia puede
atribuirse al cambio de metodología. B. hominis, E. coli y E. nana incrementaron su prevalencia
con la edad, mientras que G. lamblia y A. lumbricoides disminuyeron, siendo más frecuentes en los
Grupos I y II. Los otros parásitos no mostraron un patrón definido. E. vermicularis se presentó con
mayor frecuencia en el Grupo III. Se destaca la elevada prevalencia de enteroparasitosis de la
población estudiada, en la que se combinan variables humanas y medioambientales propicias para
el desarrollo y transmisión de las parasitosis.
72
EPyV-15. Lutzomyia longipalpis en la zona urbana de la ciudad de corrientes, Argentina.
Rea MJF, Mierez M, Borda CE, Mosqueda LA.
Centro Nacional de Parasitología y Enfermedades Tropicales (Cenpetrop), Facultad de Medicina,
UNNE, Santa Fé 1432, 3400 Corrientes. [email protected]
El control de la leishmaniasis continúa siendo un desafío para las entidades de salud. El
conocimiento de la fauna de flebótomos en las regiones de riesgo es necesario para un mejor
esclarecimiento epidemiológico sobre la transmisión, el comportamiento de esos dípteros y su
participación en el mantenimiento de la enfermedad, siendo estos factores de suma importancia
para las acciones de control en áreas endémicas. El ambiente característico para la presencia de la
Leishmaniasis Visceral (LV) definido por muchos autores, es aquel con bajo nivel socioeconómico, promiscuidad, elementos prevalentes en el medio rural y con tendencia a establecerse
en el área urbana. La gran adaptabilidad del principal vector Lutzomyia longipalpis y la presencia
del reservorio canino en áreas con diferentes características sociales están transformando a la LV
en una enfermedad que alcanza a personas de todas las edades, sexo y clase social. Antes de 1988,
la presencia de leishmaniasis y las especies transmisoras en la provincia de Corrientes eran
desconocidas. En base a trabajos realizados en el Cenpetrop, se sabe actualmente que en el 76 % o
sea 19 de los 25 departamentos, es endémica la leishmaniasis tegumentar americana (LTA) en sus
diferentes formas clínicas y los probables transmisores identificados dentro y en los alrededores de
las viviendas fueron: Lutzomyia neivai, Lu. quinquefer, Lu. migonei, Lu. shannnoni, Lu. cortelezzii,
Lu. pessoai. También demostramos que circulan dos especies del parásito: Leishmania braziliensis
y L. guyanensis conforme a las determinaciones en dos centros de referencia internacionales. En
esos estudios entomológicos no se capturaron Lu. longipalpis. Durante los últimos días del verano
del año 2009, fueron colectados con el capturador de Castro en el interior de una vivienda del área
céntrica de la ciudad de Corrientes 20 ejemplares de ambos sexos de Lu. longipalpis entre las
19:00 y 22:00 h y en horas de la mañana (11h). Leishmaniasis Visceral fue descripta en la
Argentina en las primeras décadas del siglo XX en las provincias del Salta y del Chaco. En la
actualidad se la considera una enfermedad emergente en la provincias de Misiones y Santiago del
Estero (con casos caninos y humanos y la existencia de Lu. longipalpis en la zona urbana de la
ciudad de Posadas) y en los países vecinos de Paraguay y sur del Brasil. El hallazgo de este
flebótomo, por primera vez, en un barrio céntrico de la ciudad de Corrientes justifica plenamente la
realización de una encuesta entomológica para conocer los índices de infección y la variación
estacional de esa especie de Lutzomyia.
EPyV-16. Características de la biología reproductiva de Triatoma patagonica Del Ponte 1929
(hemiptera: reduviidae) en hembras vírgenes y fecundadas, ayunadas y alimentadas.
Rodríguez C, Crocco L, Carrizo S.
Cátedra Introducción a la Biología, FCEFyN, UNC. [email protected]
La capacidad reproductiva de una especie es importante para regular su dinámica poblacional.
Considerando que en triatominos la alimentación y la cópula son factores que inciden sobre la
reproducción, el objetivo de este trabajo fue comparar aspectos relacionados a la postura de huevos
y longevidad en hembras de Triatoma patagonica vírgenes y fecundadas bajo condiciones de
ayuno y alimentación. Se trabajó con cuatro grupos de hembras recién mudadas con el mismo
estado nutricional: G1 vírgenes ayunadas, G2 vírgenes alimentadas, G3 fecundadas ayunadas y G4
fecundadas alimentadas. Los grupos 2 y 3 fueron alimentados cada 15 días sobre Columba livia
(paloma) con movimiento restringido. Las variables analizadas fueron: inicio de las posturas
(días), número de huevos puestos/hembra y longevidad (días). Se consideraron diferencias
significativas cuando p< 0,05. Se observó que las hembras de esta especie fueron capaces de poner
73
huevos sin haber recibido ningún alimento durante el estado adulto. En todos los grupos el
porcentaje de hembras que ovipuso fue mayor al 80%, excepto para el G1, donde sólo se registró
un 59%. Las hembras sin alimentar y fecundadas comenzaron significativamente antes a oviponer
(20,23± 8,20 días), mientras que las hembras sin alimentar pero vírgenes fueron las que mas
demoraron en iniciar la ovipostura (45,00± 10,00 días). El número de huevos puestos por hembra
no presentó diferencias significativas entre vírgenes y fecundadas, pero en todos los grupos las
hembras alimentadas pusieron significativamente mas huevos que las ayunadas (53,47± 10,12 y
14,39± 2,81 huevos por hembra alimentadas y ayunadas, respectivamente). La longevidad fue
significativamente mayor en las hembras alimentadas y entre éstas las vírgenes vivieron
significativamente mas días que las fecundadas (G2= 104,5± 45,25 días y G4= 88,92± 69,99 días).
Estos resultados sugieren que la alimentación incidiría sobre la producción de huevos y la
longevidad, mientras que la cópula sería el factor que estimula el inicio de las posturas.
EPyV-17. Lorenzo B: un caso para reflexionar sobre el diagnóstico de Enfermedad de
Chagas.
Streiger ML, Arias ED, Fabbro DL, del Barco ML, Mendicino DA, Amicone NA, Bizai ML.
Centro
de
Investigaciones
sobre
Endemias
Nacionales,
CIEN-FBCB,
UNL.
[email protected]
Para el diagnóstico de infección por T. cruzi relacionamos laboratorio, epidemiología y clínica,
aunque generalmente ésta no es ostensible. La serología convencional no siempre es concluyente,
algunas veces se presentan discordancias que no nos permiten rotular a las personas como
infectadas o no. Personas en seguimiento ingresan al CIEN a partir del laboratorio: por muestreos
de población, demanda espontánea o derivados. Relatamos el caso de una persona que acudió con
su familia enviados por cardiólogo. Provenían de Villa Minetti, NO de Santa Fe, del Dpto de
mayor endemicidad: 9 de Julio. Concurren por 1ª vez al CIEN en 1977. Se toma muestra para
diagnosticar Chagas a Lorenzo B, Sra y 5 hijos. El vivió en casa de barro y paja en zona rural,
conoce la vinchuca. Los primeros resultados fueron los de su Sra y una hija, ambas (+) para
Chagas por 3 reacciones distintas. Se los cita a control clínico, incluido el Sr Lorenzo, 37 años,
aunque aún no teníamos su serología. Se realizó electrocardiograma, Rx torax y xenodiagnóstico
Xd. ECG en el 1er control: HBAI. Rx tórax: cardiomegalia Grado 1. Serología: IFI= (-), HAI= (-),
AD2-ME=64. Durante 26 años se efectuaron periódicamente controles. Se repitió serología y se
aplicaron 4Xd entre 1977-1983. Nuestro título de corte es 32. En 13 años las serologías se
reiteraron (-), sólo la última, año 2003, dio AD-2ME=32, HAI=32, IFI=32, ELISA= (-) negativo!
Los 4Xd fueron (-), estandarizados con lecturas h/90 días. Año Serología Chagas Parasitemia AD
HAI IFI Xd 1977 64 - - - 1979 - - - - 1981 - - 8 - 82-83 - - - - 88-89 - - - 1990 32 - - 91-92 - - 1995 - - - 98-99 - - 16d 2003 32 32 32 Elisa (-) En 1979, a los 39 años, ECG: HBAI+BIRD,
continuó así con cardiomegalia Grado1 hasta 1992, FC 52lat/min y disnea. En 1995 ACV. En 1998
Parkinson. 1999 disnea de esfuerzo, ECG igual. Año 2003: HBAI, QS en V1, SVI. Fallece en
2004. En Lorenzo observamos clínica sugestiva de MCCh y fuertes antecedentes epidemiológicos,
pero persistentes Xd y S (-). Aunque es baja la sensibilidad del Xd en crónicos, la serología se
reiteró (-) durante años. Más allá de las implicancias inmunológicas: ¿Qué conducta seguir frente a
la discordancia entre laboratorio, epidemiología y clínica? La nuestra es no decirles a estas
personas que son chagásicos ni que no lo son, se les explica con claridad lo que suele ocurrir
coneventuales respuestas del organismo y se continúan los controles. Por prevención se indica no
dar sangre, tratar de hacer una vida normal, continuar el seguimiento y si es mujer controlar sus
hijos. Se aborda clínica y emocionalmente, para despejar incertidumbre.
74
INMUNOLOGIA (IN)
IN-1. Caracterización fenotípica de linfocitos CD4+LIR-1+ y CD8+LIR-1+ en pacientes
crónicamente infectados con Tryapanosoma cruzi.
Argüello RJ1, Albareda C1, Alvarez MG2, Armenti A2, Viotti R2, Tarleton R3, Laucella SA1.
1
INP Dr. Mario Fatala Chabén. 2H.I.G.A Eva Perón. 3CTEGD UGA, Athens, Georgia, USA.
[email protected]
Previamente hemos identificado diferentes poblaciones linfocitarias cuyas frecuencias se
encuentran alteradas (aumentadas o disminuídas) en los linfocitos T CD4+ y CD8+ totales de los
pacientes en los estadíos más severos de la enfermedad comparado con pacientes asintomáticos y
controles no infectados (Albareda et al. 2006 y Albareda, aceptado en publicación; Argüello,
manuscrito en preparación). Nuestro principal objetivo es la identificación de marcadores
inmunológicos en la población de linfocitos T totales asociados a la severidad de la enfermedad
para evaluarlos antes y luego del tratamiento en pacientes asintomáticos y que por lo tanto podrían
resultar de utilidad en la evaluación del impacto del tratamiento quimioterápico. Dado que la
frecuencia de las poblaciones de linfocitos CD8+LIR-1+ y CD4+LIR-1+ totales de sangre
periférica están aumentadas en pacientes en estadío severo y disminuyen luego del tratamiento
quimioterápico en los pacientes asintomáticos, investigamos su fenotipo para identificar las
subpoblaciones de células que los conforman. Las PBMC de pacientes asintomáticos crónicamente
infectados con T. cruzi no tratados fueron marcadas utilizando anticuerpos monoclonales unidos a
fluorocromos y luego analizadas por citometria de flujo. Encontramos dos subpoblaciones, una de
linfocitos T con el fenotipo CD3+CD8hi+LIR-1+CD56+CD16-CD45RA+/-CD27-CTLA-4-CD25Perforina+CD57-/+, y otra con el fenotipo CD3-CD8int+LIR-1+CD56+CD57-/+CD45RA+CD16CD27-CTLA-4-CD25- asociado con linfocitos NK CD8a+. La evaluación de estas subpoblaciones
podrían ser de utilidad para estudiar el impacto del tratamiento con benznidazol en pacientes
chagásicos crónicos y obtener una herramienta más específica y sensible para el seguimiento de los
pacientes luego del tratamiento quimioterápico.
IN-2. Distintos linajes de Trypanosoma cruzi inducen diferentes niveles de activación en NK.
Batalla E1, Poncini CV2, Mirkin GA1, Alba Soto CD1.
1
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. Fac. de Medicina, UBA.
2
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología Fac. de Medicina, UBA.
[email protected]
Las células NK están involucradas en protección contra T. cruzi mediante citotoxicidad y
producción de IFNgamma. Sin embargo recientemente se han vinculado a NK propiedades
reguladoras mediante la producción de IL-10 en etapas crónicas de la infección con parásitos
relacionados como Leishmania donovani. También se ha demostrado que, frente al estimulo
microbiano, las células dendríticas (CD) contactan NK promoviendo su activación, expansión,
producción de IFNgamma y actividad citotóxica. A su vez las NK pueden, mediante citoquinas y/o
contacto directo, madurar CD o ejercer citotoxicidad sobre CD inmaduras. Nosotros encontramos
alteraciones funcionales en las CD de bazo de ratones infectados con la cepa RA (alta virulencia)
pero no con K98 (baja virulencia) de T. cruzi, por lo que nos propusimos evaluar la funcionalidad
de las NK en nuestro modelo. Previamente describimos aumento en el porcentaje de NK en sangre
de ratones infectados con ambas cepas desde 2 dpi y observamos que éstas son productoras de IL10. Debido a esta característica y a reportes en la literatura de poblaciones de NK con propiedades
75
de presentación antigénica estudiamos si presentaban este fenotipo en nuestro modelo. Aquí
analizamos por citometría de flujo a los 18 hpi la expresión de CD11c y MHC-II en superficie de
NK (DX5+CD3-). Luego, estudiamos el estado de activación de las NK a este tiempo, midiendo el
marcador de activación temprano CD69, y empleando distintas dosis de LPS administrado por vía
id como control positivo de activación. Por otro lado analizamos el potencial citotóxico de las NK
evaluando la mobilización de gránulos citotóxicos a la superficie celular midiendo, post-estimulo,
el marcador CD107a (LAMP-1). Nuestros resultados señalan que para ambas cepas de T. cruzi, las
NK no presentan marcadores propios de CD. En cambio, el porcentaje de NK CD69+ aumentó en
ratones infectados con la cepa de mayor virulencia RA no así en ratones infectados con K98
(p<0,05 RA vs. K98 y controles negativos). Además, comprobamos aumento del porcentaje de
células NKCD107a+ con RA (p<0,05 RA vs. controles). Resumiendo, en nuestro modelo
experimental encontramos que ambas cepas inducen en NK niveles similares de producción de IL10 y no expresan marcadores de células presentadoras de antígeno. Sin embargo, las NK presentan
diferentes niveles de activación y citotoxicidad, proporcionales a la virulencia de la cepa de T.
cruzi en etapa aguda de la infección. Esto podría estar relacionado con la multiplicación
parasitaria, que es mayor en RA, o con diferencias en la expresión de factores de virulencia que
pudiesen activar NK.
IN-3. Transferencia pasiva a ratones de anticuerpos recombinantes dirigidos contra
proteínas P de Trypanosoma cruzi: efectos agudos sobre el corazón.
Benatar A, Simonetti L, Levin MJ.
Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas (LabMECh), INGEBI.
[email protected]
C5 es un anticuerpo recombinante (ScFv) derivado del anticuerpo monoclonal 17.2 dirigido contra
la región C-terminal de las proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi (R13). Tanto 17.2 como
C5 presentan reacción cruzada contra regiones del receptor β1-adrenérgico y son funcionalmente
activos estimulando al receptor como agonista parcial. Por transferencia pasiva se demostró que
C5 induce alteraciones en distintos parámetros cardíacos seguidos por electrocardiograma. Para
confirmar y profundizar estos hallazgos, se seleccionó una cohorte de 20 ratones, que fueron
inyectados con el ScFv C5 luego de anestesia con avertina y se les registró un electrocardiograma
cada cinco minutos, antes y después de la inyección de los ScFv. Se compararon los registros con
el electrocardiograma basal a tiempo 0 (tomado antes de la transferencia) y con ratones control. En
los ratones inyectados se observaron alteraciones electrocardiográficas semejantes a las que se
describen en modelos experimentales de la enfermedad de Chagas tales como ensanchamiento del
complejo QRS, arritmias, cambios en la longitud de la onda P, entre otras, llegándose a producir
muerte súbita en el 10% de los animales. Para dosar el anticuerpo se extrajo sangre de los ratones
cada 10 minutos. El dosaje se realiza por ELISA, para así evaluar características farmacocinéticas
de C5 como su vida media en sangre. Construcciones de C5 con GFP servirán para seguir su
distribución en diferentes tejidos. Los resultados obtenidos permiten postular que, al menos en
parte, las alteraciones cardíacas producidas durante la etapa crónica de la enfermedad de Chagas se
deben a la acción de anticuerpos circulantes con actividad agonista sobre el receptor β1adrenérgico. Todavía queda por identificar el o los tipos de célula cardíaca sobre los que actúa este
anticuerpo.
76
IN-4. Obtención y evaluación de productos de Excreción- Secreción (ES) de larvas de T. cati
de huevos provenientes de materia fecal felina.
Cardillo N1, Céspedes G2, Sosa S2, Santillan G2, Sommerfelt I1.
1
Facultad de Ciencias Veterinarias UBA. 2Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. ANLIS
“Carlos G Malbrán”. [email protected]
La Toxocariosis es una de las enfermedades parasitarias de mayor prevalencia en caninos y felinos
a nivel mundial. Las especies Toxocara canis y cati tienen potencial zoonótico, representando un
riesgo en Salud Publica. Existe poca evidencia del comportamiento biológico de T. cati y de la
respuesta inmunológica de los hospedadores, puesto que en las ultimas décadas, la mayoría de los
estudios han sido realizados sobre la especie T. canis. Los antígenos de excreción-secreción (ES)
liberados por las larvas juegan un papel muy importante en el diagnóstico de Toxocariosis humana.
El objetivo del presente estudio fue obtener y evaluar los productos de ES de larvas de T. cati
provenientes de huevos recuperados a partir de la materia fecal de gatos naturalmente infectados.
Las larvas libres se obtuvieron por ruptura mecánica de los huevos y se colocaron en medio de
cultivo para la producción de antígenos. El sobrenadante fue recolectado semanalmente, se
determinó una concentración proteica de 506,6 ug/ml por la técnica de Bradford. Los productos de
ES/L2 total se analizaron mediante la técnica de electroforesis SDS-PAGE y por Western Blot. Se
evaluó la respuesta al tratamiento de los mismos con y sin el agregado de B-Mercaptoetanol y en
diferentes diluciones (10 %, 5 %, 2 %, 0.1 %, 0.05 %, 0.03 %). La membrana fue tratada con una
dilución 1:100 de suero positivo a Toxocara spp. y una dilución del conjugado 1:6000. La corrida
se realizó en una Mini Protean III (Biorad) y el revelado se realizó con Diaminobencidina (DAB).
Se realizaron tres geles por prueba, destinándose uno para Western Blot y tinción de Coomassie, y
el otro para la tinción con plata. Las muestras tratadas con B-Mercaptoetanol mostraron mejor
definición de bandas que las no tratadas. En el Western Blot se observaron bandas de alrededor de
37 KDa, 50 KDa, una intermedia entre la de 50 y 93 KDa, de 93 y 115 KDa, coincidente con lo
observado en la tinción de plata. De acuerdo a los resultados obtenidos el antigeno ES de T. cati
demostró ser antigénico ya que por la técnica de Western blot se revelaron bandas de precipitación.
Serán necesarios futuros estudios para diferenciar T. canis y cati y poder establecer la frecuencia
de infección de ambas especies en el humano. Por otro lado, la posibilidad de obtener antígenos de
buena calidad y en alta concentración a partir de larvas de huevos obtenidos de materia fecal
animal, será una herramienta de utilidad en la producción de antigenos para el diagnóstico de
Toxocariasis humana.
IN-5. Estrategias inmunoterapéuticas para el control de la Enfermedad de Chagas.
Cerny N1, Cazorla S2, Gonzalez Cobiello P3, De Marzi M4, Malchiodi E2, Frank F2.
1
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. FMed-UBA. Argentina/ Instituto
de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU) Cátedra de Inmunología, FFyB, CONICET-UBA/
Ciencias Básicas, Universidad de Luján. 2Departamento de Microbiología, Parasitología e
Inmunología. FMed-UBA. Argentina/ Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU)
Cátedra de Inmunología, FFyB, CONICET-UBA. 3Departamento de Microbiología, Parasitología
e Inmunología. FMed-UBA. Argentina. 4Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU)
Cátedra de Inmunología, FFyB, CONICET-UBA/ Ciencias Básicas, Universidad de Luján.
[email protected]
Los agentes quimioterapéuticos empleados en el tratamiento de la enfermedad de Chagas poseen
limitada efectividad, alta toxicidad y graves efectos colaterales, haciendo indispensable el
desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Conociendo la capacidad inmuno-preventiva de
Cruzipaína (Cz), nos propusimos analizar su utilidad terapéutica en la infección adquirida.
77
Analizamos la administración del plásmido pcDNA 3.1+ conteniendo la secuencia codificante para
Cz ya sea por medio de la inyección intramuscular o a través del uso de un microorganismo
atenuado administrado por vía oral. El tratamiento temprano por inyección intramuscular del
plásmido disminuyó la parasitemia al ser coadministrado con el plásmido codificante para GMCSF, permitiendo a los animales una sobrevida del 100% (vs 0% control). Este grupo, que recibió
ambos plásmidos, presentó mayores títulos de IgG, con mayor relación IgG2a/IgG1. Se observó un
incremento en la respuesta celular de los animales inmunizados con pCz sólo o administrado
conjuntamente con pGM-CSF. Administrando los plásmidos a los 100 dpi, observamos este
incremento sólo en el grupo Cz+GM-CSF. El estudio histológico reveló que dicho grupo presentó
el mejor estado, como fuera avalado por la medición de la actividad sérica de las enzimas
marcadoras de injuria muscular. Buscando alternativas de tratamiento de menor costo y mayor
facilidad, estudiamos la utilidad de Salmonella para la administración de los plásmidos.
Observamos una reducción en la parasitemia de los ratones tratados con S.Cz sola o en forma
conjunta con S.GM-CSF. Sólo el grupo tratado con ambos plásmidos presentó mayor sobrevida
frente al desafío letal. Ante el desafío subletal este grupo presentó menor nivel de parásitos
circulantes, altos títulos de IgG específica con un notable predominio de IgG2a sobre IgG1, y un
incremento en la respuesta celular como se observara en los animales tratados con ADN desnudo.
El estímulo temprano previno el aumento de enzimas marcadoras de lesión tisular en los ratones
que recibieran S.Cz+S.GM-CSF, en los cuales no se observaron infiltrados inflamatorios. Los
efectos del tratamiento con Salmonella durante la fase aguda y crónica fueron similares. Nuestros
resultados indicarían que la inmunoterapia de la infección por T. cruzi con pCz (desnudo o
transportado por Salmonella) y coadministrado con pGM-CSF, puede prevenir la inflamación
tisular característica de la enfermedad, siendo efectivo tanto al ser administrado en etapas
tempranas como tardías de la infección.
IN-6. Modulación de la respuesta inflamatoria por gangliósidos durante la infección crónica
con Trypanosoma cruzi.
Cutrullis RA1, Poklépovich TJ1, Postan M2, Freilij HL1, Petray PB1.
1
Servicio de Parasitología y Chagas, Hospital de Niños Ricardo Gutiérrez, CABA. 2Instituto
Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala Chabén, CABA. [email protected]
Estudios previos de otros investigadores realizados entre los años 1991 y 1999 demostraron que el
tratamiento con gangliósidos durante la etapa aguda de infección experimental con T. cruzi
disminuyó la carga parasitaria de los ratones y aumentó su sobrevida. En pacientes crónicamente
infectados, se observó que la administración de gangliósidos redujo la incidencia de arritmias.
Nuestro objetivo fue investigar los beneficios de la terapia con gangliósidos durante la Enfermedad
de Chagas crónica explorando sus posibles efectos sobre el desarrollo de patología. Para ello,
ratones Balb/c (n=20) fueron infectados por vía ip con 20 tripomastigotes de la cepa Tulahuén de
T. cruzi. Al cabo de 120 dpi, un grupo de ratones recibió tratamiento diario con gangliósido (GM1;
5 mg/kg; im) durante 4 semanas. Como controles se emplearon animales infectados que no
recibieron tratamiento y animales no infectados, tratados con GM1. Un mes postratamiento se
determinó el título de anticuerpos (Acs) anti-T. cruzi por ELISA y en el miocardio se investigó la
presencia de infiltrados inflamatorios, fibrosis y expresión de las citoquinas proinflamatorias IFN
gamma y TNFα. Los resultados obtenidos demostraron que la terapia con GM1 no modificó los
niveles de Acs séricos anti-T. cruzi ni la intensidad de los infiltrados inflamatorios en el miocardio.
Sin embargo pudimos verificar una reducción significativa de los depósitos de colágeno (p=0,043)
y de la expresión de las citoquinas proinflamatorias (IFN gamma:p=0,0053; TNFα: p=0,042) en el
miocardio de los ratones infectados que recibieron tratamiento con GM1. Dado que en el
desarrollo de la Enfermedad de Chagas la inflamación juega un papel crucial, concluimos que la
78
administración de GM1 en la etapa crónica de infección podría tener un efecto benéfico sobre el
hospedador infectado al modular la respuesta inflamatoria y atenuar el daño miocárdico.
Agradecimiento: Laboratorio TRB Pharma.
IN-7. Optimización de un ELISA competitivo basado en un anticuerpo monoclonal contra
MSA2-C de Babesia bovis.
Dominguez M1, Echaide I2, de Echaide ST2, Wilkowsky S1, Zábal O1, Florín-Christensen M1.
1
CICVyA, INTA Cautelar. 2EEA-Rafaela, Argentina. [email protected]
La babesiosis bovina causada por el hemoparásito Apicomplexa Babesia bovis, provoca
importantes pérdidas económicas a la ganadería bovina de las regiones tropicales y subtropicales
del mundo. En Argentina la zona endémica se sitúa al norte del paralelo 30°S. El análisis anual de
sueros de terneros nacidos en regiones donde habita la garrapata vector Rhipicephalus microplus
permite establecer el grado de estabilidad enzoótica de la babesiosis de cada rodeo. La detección
de rodeos en inestabilidad con riesgo de epizootia, permite establecer medidas de control como el
uso de vacunas. El antígeno MSA2-c, localizado en la superficie de merozoitos de B. bovis, es una
proteína inmunodominante conservada entre aislamientos de diferentes regiones geográficas, por
ende candidato útil para desarrollar pruebas para diagnóstico. Con ese fin se generó un anticuerpo
monoclonal contra MSA2-c de la cepa R1A, denominado MAb H9P2C2. En un ensayo piloto de
ELISA competitivo, se observó que el mismo competía por el correspondiente epitope de la
proteína MSA2-c, con sueros provenientes de bovinos experimental y naturalmente infectados
(Domínguez M. et al, ANYAS 2004). En este trabajo, se optimizaron las concentraciones de la
proteína adsorbida a la placa, la concentración de MAb y se estableció la dilución óptima de los
sueros a analizar. Estandarizada la prueba, se evaluaron sueros de bovinos positivos (n=209) y
negativos (n=129), definidos mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Los datos
fueron sometidos al análisis de ROC para determinar el punto de corte, el cual expresado como
porcentaje de inhibición fue de 12,8%. La sensibilidad del método resultó de 86,6 % y la
especificidad de 95,3 %. Estos resultados indican que el cELISA desarrollado sería una prueba
eficaz para la detección de anticuerpos contra B. bovis en Argentina. En etapas posteriores, se
evaluará la eficiencia de este ensayo en un mayor número de muestras de bovinos de zonas libres y
de bovinos de otros países afectados por la babesiosis. Este trabajo fue financiado por INTA,
CONICET, ANPCyT (PICT 2002-00054), la Comisión Europea (INCO 0003691 y TCP INTAAsoc.Coop. EEA Rafaela 426100.
IN-8. Generación de inmunidad protectiva frente a T. gondii empleando un microorganismo
atenuado como sistema de delivery de pGRA4.
Gonzalez Cobiello PL1, Cerny N2, Sanchez V3, Goldman A3, Malchiodi E2, Martin V3, Frank FM2.
1
IDEHU, Inmunología, FFyB, UBA-CONICET; Dpto Micro, FMED, CESyMA, ECyT-UNSAM,
Buenos Aires. 2IDEHU, Inmunología, FFyB, UBA-CONICET; Dpto Micro, FMED. 3CESyMA,
ECyT-UNSAM, Buenos Aires. [email protected]
GRA4 es una proteína de los gránulos densos que desencadena respuesta a nivel sistémico y de
mucosas tras la infección murina experimental. En la búsqueda de herramientas que lleven al
desarrollo de una vacuna preventiva, evaluamos la utilidad de Salmonella entérica atenuada (S)
como sistema de delivery de pGRA4. De esta forma empleamos la vía habitual de infección, oral,
para la inmunización. Como estrategias para intentar mejorar la respuesta evaluamos la
coadministración con el gen de GM-CSF o un refuerzo con GRA4 adyuvada por sales de
79
Aluminio. Para esto, ratones hembras C3H/HeN fueron inmunizados con 4 dosis de S.pGRA4 sola
(G1) o acompañada de S.pGM-CSF (G2), o bien 2 dosis de S.pGRA4 + 2 dosis de GRA4+Alum
(G3). Solo los ratones del G3 presentaron altos títulos sistémicos de IgG específicos, sin embargo
los 3 grupos mostraron una importante respuesta de DTH sin diferencias entre sí. Quince días
después de la última inmunización, los ratones se desafiaron por vía oral con quistes de la cepa
Me49 midiéndose la protección conferida mediante recuento de quistes cerebrales. La respuesta
obtenida fue capaz de reducir significativamente la carga parasitaria (entre 44 y 56%) en los
grupos inmunizados y prevenir el aumento sérico de LDH, enzima marcadora de daño tisular. Tras
la infección, los títulos de IgG específicos se vieron incrementados hasta 13 veces en el G3 y 8
veces en el G1, respecto al control sin inmunizar, mientras que el G2 presentó sólo un incremento
de 2 veces. Estos resultados demuestran que la inmunización por vía oral empleando Salmonella
como sistema de delivery del gen de GRA4 genera protección frente al desafío, sin necesidad de
adyuvantes agregados. Trabajos previos demostraron que la respuesta generada por administración
pGRA4 desnudo, es mejorada por el agregado del pGM-CSF. En este trabajo, al emplear
Salmonella como sistema de delivery del plásmido, la respuesta no ofrece mayor protección al ser
coadministrada con una citoquina o tras el boost con proteína.
IN-9. Optimización de un ensayo de inmunoaglutinación para diagnosticar infección por
Trypanosoma cruzi.
Gonzalez VDG1, Garcia VS1, Vega JR1, Marcipar I2, Gugliotta LM1.
1
INTEC (CONICET-UNL). 2Laboratorio de Tecnología Inmunológica, FBCB, UNL.
[email protected]
Los látex de inmunodiagnóstico se han utilizado exitosamente para la detección de embarazo,
artritis reumatoidea, toxoplasmosis, malaria, brucelosis, leptospirosis, entre otras. La detección de
la aglutinación se puede realizar visualmente o mediante métodos instrumentales, como
turbidimetría, nefelometría, y dispersión de luz dinámica. Los reactivos de inmunoaglutinación
presentan la ventaja de ser rápidos, simples y de bajo costo, resultando además posible su
automatización. El desarrollo de un reactivo de diagnóstico basado en la aglutinación de látex se
puede dividir en cuatro etapas en las cuales hemos trabajado: I) la síntesis controlada de las
partículas de látex; II) la caracterización de los látex producidos, que comprende la determinación
de tamaños medios de partículas y su distribución, así como también su caracterización superficial;
III) la sensibilización de las partículas de látex con las proteínas antigénicas de interés; y IV) la
prueba de los complejos látex-proteínas en ensayos de inmunoaglutinación. Se muestran aquí los
resultados obtenidos en la etapa de aplicación de los complejos látex-proteína en ensayos de
inmunoaglutinación para diagnosticar la Enfermedad de Chagas. En primer lugar, los ensayos se
realizaron empleando látex carboxilados sensibilizados con diferentes proteínas antigénicas del
T.cruzi (homogenato del parásito y dos proteínas recombinantes: Ag36 y CP1) y bajo diferentes
condiciones de reacción (buffer de alta y baja fuerza iónica, y con agregado de agentes bloqueantes
y/o emulsificantes). El seguimiento de la reacción se realizó por espectrofotometría. Se observó
que los látex sensibilizados con CP1 mostraron mayor sensibilidad para la detección de
anticuerpos anti-T.cruzi a baja fuerza iónica, tanto en presencia de un agente bloqueante como de
un emulsificante. Posteriormente se procedió a la evaluación del reactivo, comparativamente con
las reacciones serológicas clásicas. Para ello se estudiaron sueros clasificados por ELISA y HAI.
Sobre 50 sueros positivos para las dos reacciones serológicas, 48 fueron positivos para la reacción
de aglutinación del látex (96%) y 2 negativos (4%). Sobre 50 sueros negativos para las dos
reacciones serológicas, 16 fueron positivos (32%) y 34 negativos (68%). Los ensayos muestran la
necesidad de aumentar la sensibilidad de la aglutinación con los sueros reactivos, y la influencia
80
negativa de la viscosidad de las muestras no reactivas, por lo que se continúa trabajando de manera
de determinar las condiciones de reacción para optimizar el ensayo.
IN-10. Marcadores serólogicos para el diagnóstico y pronóstico de la Enfermedad de Chagas.
Longhi SA, Gómez KA, Brandariz SB, Lafon SO, Levin MJ.
Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas. INGEBI-CONICET.
[email protected]
El diagnóstico de la enfermedad de Chagas se basa fundamentalmente en el examen clínico y en
los estudios serológicos, puesto que durante el período crónico se observa una baja parasitemia. El
objetivo del presente trabajo fue determinar si un conjunto de anticuerpos de pacientes con Chagas
crónico pueden ser marcadores específicos de diagnóstico así como también marcadores de
progresión hacia formas clínica más severas como la cardiopatía chagásica crónica (CChC). Se
analizó por ELISA el perfil serológico de 114 individuos no chagásicos y de 228 pacientes con
enfermedad de Chagas clasificados como: cardiópatas severos, cardiópatas leves, digestivos y
asintomáticos. El estudio de la respuesta inmune se realizó contra diferentes péptidos sintéticos
derivados de antígenos recombinantes como JL18 y JL19 (derivado del recombinante JL9 de T.
cruzi con homología con la MAP1B de mamíferos), R13, P013 y P0β (derivados de las proteínas
ribosomales P de T. cruzi), H11 (derivado de las proteínas ribosomales P humanas), TcHSP70
(derivado de la “heat shock protein 70” de T. cruzi), la proteína JL7 (proteína flagelar asociada al
citoesqueleto) y homogenato de T. cruzi. Los resultados indicaron que los mejores marcadores de
infección fueron el homogenato de T. cruzi y la proteína JL7. Esta dupla antigénica se comporta
como un excelente reactivo diagnóstico debido a su especificidad y sensibilidad. Así, la
determinación de líneas de corte (método de ROC) o criterio de positividad más exigentes para los
niveles de estos anticuerpos (anti-T. cruzi>4,35 y anti-JL7>5,82) permitieron diferenciar a los
grupos asintomáticos de los cardiópatas severos, pronosticando con un 70% de certeza la
pertenencia a su correspondiente grupo. Si simultáneamente, además de estos niveles anti-T. cruzi
y anti-JL7, se considera una línea de corte para el antígeno JL19>1,0, la probabilidad aumenta a un
82,4% en aquellos sueros provenientes de pacientes con CChC severa. Por último, si se consideran
además valores de anti-P013>2,42, se observó que 9 sueros cardiópatas severos versus un suero de
paciente indeterminado cumplieron con estas características, aumentando la certeza a 90%. Éstos
resultados sugieren que existiría una relación entre la evolución hacia la CChC y la fuerte
respuesta antiparasitaria contra determinantes antigénicos del parásito, entre ellos los epitopes
correspondientes a la región C-terminal de las proteínas ribosomales P de T. cruzi.
IN-11. Clonado y expresión de la proteína de Trypanosoma cruzi tc52 y sus dominios en E.
coli y células de mamífero.
Matos MN, Cazorla SI, Ramirez CV, Malchiodi EL.
Cátedra de Inmunología-IDEHU, CONICET-UBA, Facultad de Farmacia y Bioquímica y
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. [email protected]
La proteína de T. cruzi Tc52 con función glutatión transferasa, posee además propiedades
inmunomoduladoras actuando sobre diferentes células del sistema inmune. Tc52 modula la
expresión de citoquinas por células dendríticas y macrófagos e inhibe la proliferación de linfocitos
T por mitógenos. Por estas características es un interesante candidato para el diseño de vacunas y
para el estudio de sus propiedades inmunomoduladoras. Tc52 está constituida por dos dominios, el
amino terminal de 26 kDa que es el sitio activo, y el carboxilo terminal de 25 kDa, de función
81
desconocida. El alineamiento de secuencias de bases de ambos dominios reveló que poseen un
26% de identidad y un 28% de similitud. Para disponer de la proteína recombinante clonamos a
Tc52 y sus dos dominios en vectores de expresión procariota y eucariota. Se realizaron PCRs
utilizando como templado el ADN genómico extraído de epimastigotes de la cepa RA de T. cruzi.
Los productos de PCR de 1377, 717 y 708 pb, correspondientes a la proteína completa, dominio Ny C-terminal, respectivamente, fueron digeridos con enzimas de restricción y ligados al plásmido
pET23a. Para la clonación en vectores de expresión eucariota, los productos de PCR digeridos con
enzimas de restricción, fueron ligados al plásmido pcDNA3.1. Se seleccionaron los clones por su
resistencia a ampicilina y se evaluó la presencia de los insertos por digestión enzimática y PCR.
Los clones fueron secuenciados obteniéndose mas de 99% de identidad respecto a la secuencia
AF117240 (cepa Y de T. cruzi). Las construcciones en pET23a se usaron para transformar células
E. coli BL21. Las células fueron crecidas hasta DO600nm = 0.8, induciéndose la expresión con 1
mM IPTG durante 4 h. Las proteínas fueron purificadas en condiciones desnaturalizantes por
cromatografía de afinidad utilizando columnas de Ni-NTA y replegadas posteriormente por diálisis
contra PBS. Las proteínas recombinantes fueron reconocidas por Western blot utilizando
anticuerpos anti-His. Por inmunización con adyuvante de Freund se obtuvo suero de ratones
específicos contra Tc52 y contra cada uno de los dominios. Estas construcciones nos permitirán: 1evaluar la respuesta inmune obtenida frente a Tc52 y sus dominios; 2- realizar ensayos de
inmunoprotección con las proteínas y los ADN correspondientes; 3- analizar la función
inmunomoduladora de la Tc52, discriminando la importancia de cada dominio en dicha función; y
4- realizar estudios estructurales.
IN-12. Efecto de las células mesenquimales sobre la infección de macrófagos peritoneales por
Trypanosoma cruzi.
Mirkin GA.
Depto. de Microbiología, Parasitología e Inmunología - Facultad de Medicina - Universidad de
Buenos Aires. [email protected]
El transplante de células estromales mesenquimales (CEM) singeneicas y alogeneicas se ha
propuesto como alternativa terapéutica para la reconstitución tisular en diversas enfermedades
crónicas degenerativas y se realiza actualmente en situaciones de transplante de médula ósea
refractario. La capacidad inmunosupresora de estas células, representa un riesgo de reactivación de
infecciones crónicas, como la causada por el protozoario tisular Trypanosoma cruzi. En este
contexto investigamos el efecto que tienen las CEM sobre la infección de macrófagos, una de las
principales células blanco de este agente etiológico. Con este fin infectamos cultivos de
macrófagos peritoneales (MAC) de ratones C57BL/6, co-cultivos MAC-CEM y cultivos de MAC
en presencia de medio condicionado por CEM (mcCEM) con tripomastigotes sanguíneos de T.
cruzi (cepa RA). A las 72 hs evaluamos cuantitativamente, mediante microscopía de fluorescencia,
el porcentaje de MAC infectados y el número de parásitos por MAC. Observamos aumento del
porcentaje de MAC infectados en presencia de CEM pero no de mcCEM ( MAC-CEM (N=15) vs
MAC (N=20), 22,2±11,79 vs 4,38±2,11, p <0,0001; MAC-mcCEM (N=15) vs MAC (N=20),
5,71±2,42 vs 4,38±2,11, p=0,092 (NS); ANOVA – Prueba post hoc de Dunnet, α=0,05). En ningún
caso observamos aumento del número de amastigotes por MAC. Tal como esperábamos, dado el
carácter pantrópico de la cepa de T. cruzi empleada, las CEM fueron infectadas por T. cruzi. Los
resultados sugieren que las CEM secretan factor(es) que modulan la respuesta efectora de los
MAC infectados, pero que no modifican el tiempo de duplicación parasitaria. Estamos realizando
estudios en los sobrenadantes de cultivos de MAC para evaluar si las CEM inducen la activación
alternativa de los MAC, lo que contribuiría al establecimiento de la infección por T. cruzi en estas
células.
82
IN-13. Proteínas de T. cruzi asociadas a mimetismo molecular: relación con la cardiopatía
chagásica y la terapia tripanocida.
Olivera LV, Bizai ML, Stafuza MC, Denner S, Arias E, Streiger ML, Del Barco M, Mendicino D,
Diez C, Marcipar I, Fabbro DL.
CIEN-FBCB-UNL [email protected]
Las proteínas P2β y B13 del T. cruzi presentan reactividad cruzada con componentes cardiacos
humanos, por lo que podrían estar involucradas en la fisiopatogenia de la enfermedad de Chagas.
Mediante un estudio de cohorte retrospectivo en infectados chagásicos crónicos, tratados y no
tratados con drogas tripanocidas, se evaluó: a) el valor pronostico de los Ac anti P2β y anti B13 y
b) efecto del tratamiento antiparasitario específico sobre la respuesta inmune a esas proteínas. Se
realizo ELISA, utilizando como antígeno las proteínas P2β y B13 de T. cruzi, a sueros
correspondientes a 87 pacientes para P2β y 72 de estos para B13. Se procesaron al menos 3
muestras por paciente obtenidas de los diferentes chequeos realizados durante 15 años de
seguimiento promedio. Los pacientes se agruparon en: A) tratados asintomáticos; B) no tratados
asintomáticos y C) no tratados con miocardiopatía chagásica. Análisis estadísticos: ANOVA, test
de Student, Wilcoxon, Mann-Whitney según correspondiera. Al comparar los niveles de Ac entre
los diferentes grupos al inicio del seguimiento, P2β tuvo una mayor respuesta en los pacientes no
tratados asintomáticos (B), mientras B13 no presentó diferencias entre A, B y C. Las respuestas
finales para ambas proteínas fueron significativamente menores en los pacientes tratados respecto
a los infectados de los otros grupos. Al evaluar la evolución serológica durante el seguimiento de
los pacientes con cardiopatía (C), no se observaron cambios en el comportamiento de la respuesta
inmune a P2β y B13, siendo incluso menor que la observada en los pacientes asintomáticos no
tratados. En cambio, en el grupo A (tratados) se observó una disminución significativa en la
respuesta a ambas proteínas. En esta experiencia no se hallo correlación entre la evolución clínica
y la respuesta inmunológica a P2β y B13 en los infectados chagásicos no tratados (B y C), lo que
conduciría a descartar la relación causa efecto del mimetismo molecular en el daño cardiaco.
Mientras, en los pacientes tratados (A) se modificó significativamente el nivel de respuesta anti
P2β y anti B13, sugiriendo una disminución en la carga parasitaria por efecto del tratamiento.
IN-14. Modulación de la expresión de CD40 en células mononucleares de sangre periférica de
pacientes infectados con Trypanosoma cruzi
Moreno Ayala M1, Cutrullis RA1, Schapachnik E2, Sánchez R3, Ángel A4, Agüero RN5, Corral
RS1, Altcheh JM1, Petray PB1.
1
Servicio de Parasitologia y Chagas, Hospital de Niños Ricardo Gutiérrez, CABA. 2Sección
Enfermedad de Chagas, División Cardiología, Hospital Argerich, CABA. 3Sección Cardiología,
Hospital Ramos Mejía, CABA. 4Servicio de Cardiología, Hospital Militar Central, CABA.
5
Servicio de Cardiología, Sanatorio Franchín, CABA. [email protected]
El CD40 es un mediador clave de la respuesta inmune, asociándose también a procesos
patogénicos en enfermedades inflamatorias crónicas y autoinmunes. Se expresa en una variedad de
células incluyendo las presentadoras de antígenos, linfocitos B y T activados. Su interacción con el
ligando específico CD40L favorece la expresión de quimioquinas, citoquinas proinflamatorias y
moléculas de adhesión. Nuestro objetivo fue evaluar la expresión de CD40 en células
mononucleares de sangre periférica (MNSP) de pacientes pediátricos y adultos cursando distintos
estadíos de la infección con T. cruzi. Se incluyeron: pacientes pediátricos en fase indeterminada
temprana de infección (PPChI; n=9); pacientes adultos en fase indeterminada (PAChI, n=6);
pacientes con Enfermedad de Chagas leve (con trastornos del sistema de conducción, PAChL,
n=5) y pacientes con miocardiopatía chagásica severa (PAChS, n=7). Como controles se
83
incluyeron niños (n=9) y adultos no infectados (n=17), y un grupo de individuos con
miocardiopatía dilatada idiopática (MDI, n=5). De cada paciente se obtuvieron MNSP y se
determinó por RT-PCR la expresión de ARNm para CD40. Tanto en los PPChI como en los niños
seronegativos para T. cruzi, no se verificó expresión de CD40 en las MNSP. Al analizar los niveles
de expresión del receptor en adultos, detectamos un aumento significativo (p <0,05) en los PAChL
respecto de los sujetos seronegativos y de PAChS. El incremento relativo fue 3,2 ± 0,2 y 6,9 ± 0,4
respectivamente. Sólo en un paciente del grupo PAChS se detectó expresión de CD40. El análisis
estadístico reveló que en este grupo la expresión del CD40 fue semejante a la del control no
infectado pero difiere significativamente de la hallada en los pacientes con MDI, quienes sin
excepción presentaron niveles incrementados de ARNm para CD40 equivalentes a los hallados en
el grupo PAChL. Nuestros resultados revelan que la infección por T. cruzi es capaz de inducir una
modulación de la expresión del CD40 en MNSP, que se evidencia a lo largo de la evolución de la
Enfermedad de Chagas. Particularmente, frente a la reducida inducción en pacientes en fase
indeterminada, se observa un aumento de la expresión del marcador en coincidencia con la
aparición de alteraciones funcionales cardíacas, mientras que una posterior disminución sugeriría
la progresión hacia una fase crónica con compromiso miocárdico severo. Es interesante el hallazgo
de una modulación diferencial del CD40 en los pacientes con miocardiopatía chagásica crónica
con respecto a los individuos que padecen disfunción cardíaca por otra etiología.
IN-15. Knockout of the dhfr-ts gene in Trypanosoma cruzi generates attenuated parasites that
induce specific CD8+ T cells in infected mice and confer long term protection against a
virulent challenge.
Pérez Brandán C1, Padilla AM2, Xu D2, Cardozo R1, Tarleton R2, Basombrío MA1.
1
Instituto de Patología Experimental- CONICET- Universidad Nacional de Salta.
2
Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, USA.
[email protected]
It has been shown that the naturally attenuated TCC strain of Trypanosoma cruzi, confers partial
protection against a virulent challenge. However, the factors involved in the attenuation of this
strain are still unknown and persistence of these parasites in immunocompetent mice has been
observed. We generated monoallelic mutant parasites for the dihydrofolate reductase-thymidylate
synthase gene (dhfr-ts) in the TCC strain based on the rationale that these mutant parasites would
became auxotrophic for thymidine and would not persist in the infected host. We have previously
reported the impairment in growth of dhfr-ts-/+ epimastigotes and the induction of a lower number
of specific CD8+ T cell response in C57BL/6 infected mice when compared with TCC wild type
infected ones, as demonstrated by staining with MHC class I tetramers containing the T. cruzi
specific peptide TSKB20. Here we report the results of immunization/challenge assays performed
in Balb/c and C57BL/6 mice. In two independent short term assays we observed no remarkable
differences in the protective effect of wild type versus mutant parasites measured by parasitemia.
Skeletal muscle samples were collected to assess histological damage after challenge of vaccinated
and non vaccinated animals. We then carried out a long term immunization assay where mice
where challenge 370 days after immunization. At 300 days post vaccination, CD8+ T cells specific
for T. cruzi expressed the CD127 memory marker, suggesting the presence of memory T cells in
these infected mice. We then challenged these mice in the footpad with fluorescent parasites and
measured fluorescence intensity at the site of infection for 13 days. The results indicate that, a year
after the immunization, these animals are able to control the challenging parasite load at the site of
infection. This study suggests that it is possible to generate genetically attenuated T. cruzi parasites
that generate CD8+ memory cells and confer protection against further infections with T. cruzi.
Supported by FONCYT grant to MAB and NIH grant to RLT.
84
IN-16. Clonado y expresión de la proteína de Trypanosoma cruzi Tc24 en bacterias y células
eucariotas.
Ramirez CV, Cazorla SI, Matos MN, Malchiodi EL.
Cátedra de Inmunología-IDEHU, CONICET-UBA, Facultad de Farmacia y Bioquímica y
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad
de Buenos Aires. [email protected]
Tc24 es una proteína ligadora de Ca++, que se asocia a los rafts lipidícos de la membrana flagelar
de Trypanosoma cruzi mediante una doble acilación en su extremo N-terminal. Aunque se sabe
que funciona como sensor de Ca++ intracelular, se desconoce por qué mecanismos lo hace. Así
como también se desconoce cuál es el rol del profundo cambio conformacional que sufre esta
proteína cuando se encuentra en presencia de este catión. Por otro parte, se ha determinado que es
un antígeno de excreción-secreción con una potente actividad mitogénica. Para producirla en
forma recombinante hemos clonado el gen en un vector de expresión procariota. Para ello, se
amplificó la secuencia por PCR a partir de DNA genómico de epimastigotes de la cepa RA, y el
fragmento resultante se digirió con enzimas de restricción que direccionaron la ligación en el
plásmido pET23a+. Las construcciones resultantes se secuenciaron comprobándose un 99% de
identidad con las secuencias previamente reportadas. Con el plásmido resultante se transformaron
células competentes E. coli BL21, que se cultivaron en medio LB a 37ºC con agitación hasta un
valor de DO600 igual a 0.7. La expresión de la proteína se indujo con el agregado de 1 mM de
IPTG durante 4 h. Por Western Blot frente a suero de ratones infectados con T. cruzi y con un
anticuerpo monoclonal anti-His se puso de manifiesto la expresión de la proteína recombinante en
forma soluble. La proteína Tc24 fue purificada por cromatografía de afinidad usando resinas NiNTA en condiciones nativas con un rendimiento de 7.5 mg/ml. Por inmunización con adyuvante
de Freund se obtuvo suero de ratones anti-Tc24. Por otra parte, el gen de Tc24 se ligó al vector
pCDNA3.1+ de expresión en células eucariotas. Con esta construcción se transfectaron células
COS-7 y se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para evaluar la eficiencia de
transfección y la expresión de la proteína. Por Western blot del sobrenadante de las células
tranfectadas se comprobó que la proteína recombinante es secretada al medio de cultivo. De esta
manera se obtuvieron las construcciones plasmídicas, que serán utilizadas para evaluar el papel de
la Tc24 en la modulación de la respuesta inmune frente a la infección por T. cruzi, y su rol como
herramienta en el proceso de infección.
IN-17. Caracterización de tres anticuerpos recombinantes humanos anti-Trypanosoma cruzi.
Simonetti L1, Niborski LL1, Cauerhff A2, Levin MJ1.
1
LaBMECh - INGEBI – CONICET. 2Fundación Leloir - LaBMECh – INGEBI.
[email protected]
Se han clonado y seleccionado por rastreo de bibliotecas combinatoriales de anticuerpos (Ac)
humanos construidas a partir de médula osea y sangre periférica de pacientes con Cardiomiopatía
Crónica de Chagas (CCCh), dos Ac reactivos contra el parásito T. cruzi. Así mismo, también se
construyeron otros dos Ac a partir de dos cadenas variables pesadas (VH) y una variable liviana
(VL) aisladas de células plasmáticas presentes en un infiltrado inflamatorio de cortes histológicos
de corazón de un paciente con CCCh. Los cuatro Acs se expresaron en bacterias como
recombinantes de cadena simple (scFv), y sus reactividades fueron ensayadas. Los scFv
provenientes de bibliotecas de anticuerpos, A2R1 (VH3-73) y 6B6 (VH3-30), mostraron un fuerte
reconocimiento por proteínas intracelulares del parásito en inmunofluorescencia indirecta. En
ensayos de Western Blott contra lisados de T. cruzi ambos reconocen un patrón de bandas
85
característico. Además reconocen a otros kinetoplástidos, como T. brucei y C. fasciculata y no
reaccionan contra lisados celulares de mamífero y/o bacteria. Los scFv aislados del corazón, DP10
(VH1-69/JH4-5 –VL1-40/JL2-3) y DP75 (VH1-2/JH6), reconocen una proteína de
aproximadamente 20 kDa en WB contra lisado de T. cruzi, no siendo aún establecido si se trata de
la misma proteína para ambos. Para todos los anticuerpos se estudió el uso de la cadena variable
pesada, el largo y la composición de la tercera región determinante de la complementariedad
(CD3) y el grado de mutaciones somáticas que presentan las regiones variables de los Acs anti-T.
cruzi. Observándose que los Ac presentan signos claros de maduración frente al antígeno. Los
resultados obtenidos en el presente trabajo amplían los conocimientos sobre la complejidad de la
respuesta inmunitaria anti-T. cruzi en pacientes con CCCh.
PATOGENIA Y QUIMIOTERAPIA (PyQ)
PyQ-1. Association between tamoxifen-induced apoptosis and acidic glycosphingolipid levels
in Trypanosoma cruzi.
Acosta DM1, Soprano LL1, Ferrero MR1, Garavaglia P1, Esteva MI1, Couto AS2, Duschak VG1.
1
Departamento de Investigación, Inst. Nac. de Parasitología ‘Dr Mario Fatala Chaben’, ANLISMalbrán, Ministerio de Salud, Bs As, Argentina. 2CIHIDECAR, Departamento de Química
Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Bs As ,
Argentina. [email protected]
Chagas’ disease, caused by the kinetoplastid protozoan Trypanosoma cruzi is one of the major
health problems in Latin America. Acidic glycosphingolipids (AGSLs) are active participants in
adhesion processes in many cellular systems and appear to be involved in the regulation of cell
proliferation, differentiation, host interaction and other developmental cellular events. On the other
hand, the drug tamoxifen, (Z)-1-(4-(2-(diimethylamino)ethoxyl-phenyl)-1,2-diphenyl-1-butane, is
a non steroidal anti-oestrogen widely used for the treatment and prevention of breast cancer. In
addition to its activity as antioestrogen receptor modulator, the modulation of caspases, calmodulin
and kinases by tamoxifen has been also reported, involved in mechanisms responsible for inducing
apoptosis. In addition, this drug is a potent inhibitor of lipid peroxidation induced by Fe(III)ascorbate in ox-brain phospholipid liposomes and interferes in glycosphingolipid metabolism,
retarding it by inhibition of ceramide glycosylation in human cancer cells. Herein, the activity of
tamoxifen was assessed in vivo against axenically cultured epimastigotes and in vitro on blood
trypomastigotes finding a dose-dependant epimastigote growth inhibition reaching up to complete
inhibition of proliferation at 50 µM and a 90% lysis percentage with 10 µM in blood
trypomastigote forms. Electron microscopy analysis of tamoxifen treated parasites (10-50 µM)
showed characteristic apoptotic signs at the two concentrations tested but a significant increase of
apoptotic cells percentage was observed at 50 µM. On the other hand, purification of the AGSLs
was achieved and acidic components were characterized. TLC analysis of tamoxifen-treated (1050 µM) and control parasites showed increased levels of AGSLs at growing concentrations of
tamoxifen in comparison with those synthesized by equal number of control parasites. Moreover,
UV-MALDI-TOF mass spectrometry analysis of this fraction allowed the determination of a
sulfatide and a ganglioside structure suggesting a possible association between the increase in the
biosynthesis of AGSLs and tamoxifen-induced apoptosis. Furthermore, tamoxifen treatment
showed a significant trypanocidal activity on blood trypomastigotes in different strains under the
conditions tested. Supported by CONICET-ANPCYT-UBA,.INP-ANLIS-Malbrán.
86
PyQ-2. Compromiso del sistema β-adrenérgico cardíaco, la estructura y función
mitocondrial y la estructura histológica del corazón y del músculo esquelético en la infección
crónica por T. cruzi.
Bazán C1, Fauro R1, Báez A2, Lo Presti S3, Micucci L1, Strauss M1, Triquell MF4, Pons P5,
Rivarola W1, Paglini P1.
1
Cátedra de Física Biomédica. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba.
2
Cátedra de Física Biomédica. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba. y
IICSHUM. Universidad Nacional de La Rioja. 3Cátedra de Física Biomédica. Facultad de Ciencias
Médicas. Universidad Nacional de Córdoba. y IICSHUM. Universidad Nacional de La Rioja.
4
Cátedra de Biología Celular, Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Médicas.
Universidad Nacional de Córdoba. 5Cátedra de Biología Celular y Microscopía Electrónica.
Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba. [email protected]
La miocardiopatía chagásica crónica es una entidad altamente compleja cuya fisiopatogenia aún no
es claramente comprendida. Es por ello, que en el presente trabajo abordamos el estudio del
sistema β-adrenérgico cardíaco de transducción de señales, la participación de las mitocondrias y
las alteraciones histopatológicas en corazón y músculo esquelético (ME) de ratones (n=200)
infectados con T. cruzi cepa Tulahuen (50 tripomastigotes/ratón), en la etapa crónica de la
infección (365 días post infección). Del sistema β-adrenérgico, determinamos: adrenalina (A) y
noradrenalina (NA) en plasma (por RF-HPLC); densidad, afinidad y funcionalidad de receptores βadrenérgicos (β-AR) (por “binding” con ligando radiactivo); niveles de AMPc (por ELISA),
presencia de anticuerpos anti-β-AR (por cromatografía de afinidad) y contractilidad cardíaca. Se
estudió la estructura mitocondrial (por microscopía electrónica) y la actividad de la citrato sintasa
(CS) y de los complejos de la cadena respiratoria (CII-CIV, por espectrofotometría) de las
mitocondrias cardíacas y de ME. Para la histopatología, cortes de corazón y de ME de 5 μm fueron
coloreados con HE, tricrómico de gomori o anticuerpo fluorescente anti-T. cruzi. Un grupo de
ratones no infectados (NI, n=50) fue tomado como control. A y NA disminuyeron con respecto a
NI (p<0,05); la afinidad de los β-AR disminuyó (p<0,05), pero su densidad permaneció sin
cambios con respecto a NI; el AMPc se mantuvo dentro de los niveles de NI; la fuerza de
contracción basal aumentó (p<0,05), pero la respuesta a A y NA exógenas disminuyó (p<0,05),
debido a la presencia de anticuerpos que bloquearon los β-AR. Las mitocondrias cardíacas
presentaron disrupción de membrana, dilatación de crestas y aumento de matriz, mientras que las
del ME, mostraron cambio de forma y dilatación de crestas. La actividad (μM de proteína/min.mg
proteína) de CS aumentó (0,36 ± 0,07), la de CII (4,1 x 10-10 ± 2,8 x 10-11) y CIII (0,04 ± 0,01)
disminuyó y la de CIV (1,03 ± 0,11) aumentó con respecto a NI (p<0,05). Los cortes de músculo
cardíaco y esquelético presentaron focos de necrosis aislados, infiltrados inflamatorios, fibrosis y
nidos de amastigotes. El ME presentó además desorganización de la estructura tisular. Estos
resultados demuestran que tanto el sistema β-adrenérgico, la estructura y función mitocondrial,
como la estructura histológica de corazón y ME se encuentran comprometidos en la infección
crónica por T. cruzi, alteraciones que seguramente contribuyen a la génesis de la cardiopatía y a las
características de la fase crónica de la infección.
PyQ-3. Distribución de linajes de Trypanosoma cruzi en pacientes con coinfección HIV (Virus
de la inmunodeficiencia humana) –Chagas.
Bisio MMC1, Burgos JM1, Altcheh J2, Cura C1, Giganti SO3, Lattner J4, Begher S5, Scapellato PG6,
Levin MJ1, Schreck R3, Freilij H2, Schijman AG1.
1
LaBMECh - INGEBI – CONICET. 2Lab. Parasitología Chagas - Htal Gutierrez. 3Htal Eva Peron.
4
Htal Fernandez. 5Htal Pirovano. 6Htal Santojanni. [email protected]
87
T. cruzi ha sido clasificado en seis linajes filogenéticos: T. cruzi I, IIa, IIb, IIc, IId y IIe, que
pueden jugar un rol en el tropismo tisular y patogénesis de la enfermedad de Chagas. Si bien se
conoce que existe una interacción bidireccional entre la infeccion con HIV y T. cruzi, el impacto
en la diversidad genética de T. cruzi es un campo poco explorado en parasitología. En este trabajo
caracterizamos los linajes de poblaciones parasitarias naturales halladas en pacientes coinfectados
por T. cruzi y HIV. Se analizaron muestras de sangre y/o lesiones de 25 pacientes residentes en
Argentina: 8 pediátricos y sus 7 madres coinfectadas, 3 adultos con Chagas indeterminado y HIV y
7 con encefalitis chagásica por SIDA. El diagnóstico molecular y seguimiento de tratamiento
etiológico se realizó por PCR hacia secuencias del minicírculo y/o satélite. Los linajes de T. cruzi
fueron identificados por PCRs dirigidas a secuencias de genes de miniexón y ARN ribosomal 24s.
La diversidad infra-linaje fue caracterizada por polimorfismo de restricción de regiones variables
del minicírculo. La mayoría de las poblaciones parasitarias sanguíneas fueron T. cruzi IId, con
perfiles de minicírculos particulares de cada paciente, excepto en pares madre-niño infectados, en
que resultaron idénticas. Se hallaron poblaciones mixtas con T. cruzi I-IId. En pacientes con
reactivación se encontró tropismo diferencial de T. cruzi IIb y I en lesiones. En los pacientes que
fueron tratados con benznidazol se observó la negativización de la PCR. Se destaca el caso de una
mujer que por presentar un cuadro grave de Chagas cerebral en la semana 32 de embarazo fue
tratada con benznidazol revirtiendo el cuadro clínico y que dio a luz una niña no infectada. Al mes
postratamiento la mujer presentó mejora en las imágenes del SNC y negativizó la serología
persistiendo negativa 1 año más tarde. Actualmente se encuentra en seguimiento. La elevada
proporción de muestras en que se pudo determinar el linaje por PCR es indicativa de parasitemias
más elevadas que en población chagásica sin HIV. Esta exacerbación estaría también implicada en
la alta tasa de transmisión vertical. La prevalencia de linaje IId en muestras de sangre periférica
concuerda con lo hallado en población chagásica en la región. La asociación de linajes infrecuentes
en casos con encefalitis sugiere tropismo diferencial y mayor prevalencia de infecciones mixtas.
PyQ-4. Primeros tratamientos controlados de la Enfermedad de Chagas en la provincia de
Corrientes.
Borda CE, Rea MJF, Mosqueda LA.
Centro Nacional de Parasitología y Enfermedades Tropicales (Cenpetrop), Fac. Medicina, UNNE,
Santa Fé 1432, Corrientes, [email protected]
Desde el año 1973 se trabaja en el Cenpetrop en diversos aspectos de la endemia chagásica, y
desde el 2003 se realiza el tratamiento con controles. De un total de 211 personas examinadas
serológica y parasitológicamente resultaron chagásicos el 55,45%, o sea 117 y de éstos, fue posible
tratar a 48 enfermos. Se adoptó como criterio de inclusión que el test de inmunofluorescencia
indirecta resultarse reactivo (1/60) y positivo el xenodiagnóstico (XD). El antígeno para el TIF fue
una mezcla de seis cepas del complejo Trypanosoma cruzi aislados por el Cenpetrop y para el XD
40 ninfas del 3er. estadio de Triatoma infestans o Panstrongylus megistus examinados a los 30, 60
y 90 días. Se puso en práctica un protocolo que incluía el consentimiento informado de los
pacientes y se contó con la colaboración de servicios especializados (Servicio de Cardiología del
Hospital Escuela “José F. de San martín, Instituto de Cardiología “J. F. Cabral” de la ciudad de
Corrientes). Totalizaron 48, de éstos, 20 eran mujeres y 28 hombres. Las edades estaban
comprendidas entre 8 meses y 70 años. Las formas clínicas incluían un caso congénito, uno agudo
y los 46 restantes eran indeterminados y crónicos. Previamente se les realizó un examen clínico
(radiografía, electrocardiograma, radiografías de tórax, postero-anterior y perfil de contraste,
hemograma y recuento de plaquetas). Los pacientes presentaban las alteraciones cardíacas propias
de la afección chagásica. Este último examen se repetía a los 20 días de iniciado el tratamiento. La
dosis fue de comprimidos de 5mg/kg/día de benznidazol Radanil ® durante 30 días. Los controles
88
se realizaron durante cuatro años, los clínicos y XD se repitieron cada dos meses después del
tratamiento y el TIF a partir de los seis meses. Cuatro pacientes (8,8%) interrumpieron el
tratamiento por reacciones cutáneas adversas. Regresaron para los controles 40 pacientes y de
éstos se curaron cuatro (Xenodiagnóstico y TIF negativos), el de la fase aguda, el congénito, un
crónico con aneurisma ventricular y uno de forma indeterminada. Los otros 36 pacientes se
realizaron entre 1 y 12 XD postratamiento con resultado negativo en todos los casos. Estos
pacientes permanecieron estables clínicamente. Se puede concluir que el tratamiento controlado de
la enfermedad de Chagas realizado por primera vez en la provincia de Corrientes, tuvo buenos
resultados, exceptuando a los que tuvieron reacciones adversas. Los resultados sugieren que el
tratamiento impidió o retardó la evolución natural de la enfermedad de Chagas.
PyQ-5. Evaluation of three DNA binders as leishmanicidal and trypanocidal drugs.
Ferraz JD1, Rocha SC1, Stik Lange IE1, Stolić I2, Glavaš-Obrovac L3, Bajić M2, Silber AM1.
1
Dept. de Parasitologia – Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo, São Paulo
– Brazil. 2Dept. of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Veterinary Medicine – University of
Zagreb, Zagreb. 3Dept. of Medical Chemistry and Biochemistry, School of Medicine – J. J.
Strossmayer University of Osijek, Osijek – Croatia. [email protected]
African trypanosomiasis and leishmaniasis are infectious diseases caused by trypanosomatid of the
genus Trypanosoma and Leishmania respectively. The former is geographically distributed around
the tropical and subtropical belt of the planet, while the latter affects more specifically the
subsaharian Africa. Taken together these diseases affect some 12 million people, with a population
at risk of about 400 million people. Chemotherapies for the treatment of these diseases are
generally unsatisfactory due to the high toxicity of drugs in use and the emergence of resistance. In
this sense is urgent to validate new targets, and to obtain and evaluate new drugs against them. In
the present work we evaluate the trypanocidal and leishmanicidal activity of three novel
bisbenzimidazoles (named here compounds 4 to 6), characterized by 3,4-ethylenedioxy-extension
of thiophene core, which are able to interact within ds-DNA grooves as dimmers or even
oligomers and agglomerate along ds-RNA. These DNA binders were previously evaluated against
Trypanosoma cruzi showing one of them a promising parasiticidal activity (IC50= 4.3 x 10-6 M).
αThe obtainment of IC50 values ranging from 0.30 to 10.82 for L. amazonensis and from 0.37 to
1.56 x 10-6 M for T. brucei prompt these drugs as interesting leading compounds for
chemotherapy against these infections. Funding: CNPq, FAPESP (Brazil) and Ministry of Science,
Education and Sports (Republic of Croatia)
PyQ-6. Expresión de las integrinas CD18 y CD29 en células de médula ósea de ratón C57/BL
con infección crónica por T. cruzi (Tulahuén2).
Fuchs AG, Echeverría C, Ruiz AM, Riarte A.
INP Fatala Chaben, ANLIS Malbrán. [email protected]
La miocardiopatía chagásica crónica consiste en necrosis de miocardiocitos y amplias zonas de
fibrosis intersticial. Actualmente, se propone como tratamiento para las cardiopatías resistentes al
tratamiento farmacológico el autotransplante de células de médula ósea (MO) por vía
intracoronaria. El mecanismo de acción estas células que genera mejoría clínica en los pacientes,
se desconocen. Un aspecto inicial a investigar es el estudio de las características de las integrinas,
involucradas en la adhesión y en la migración celular, de células de MO de un portador de
infección crónica. Hemos analizado por citometría de flujo (FACS) las expresión de las integrinas
89
β1 (CD29) y α2 (CD18) de células incubaron en baño de hielo y se de MO de ratones C57/Bl
infectados por vía ip. con 50 tul2 durante 6 a 10 meses. Los controles fueron células de ratones
C57/Bl inyectados con solución salina simultáneamente. Se analizó la respuesta en la expresión de
estas integrinas en MO al PMA. Las células de MO se extrajeron de los huesos largos de los
miembros inferiores en presencia de EDTA y CaCl2. Se marcaron con anti rata Ha2/5 (α1) o anti
ratón C71/16 (α 2)- biotina y luego con Avidina-FITC (BD Pharmigen). Después de 3 lavados con
0,5% BSA-PBS y fijadas con 0,5-1% formaldehido-BSA-PBS se analizaron por FACS Scalibur
(Becton Dickinson). Se estudió además la respuesta a 100ng/ml PMA después de la incubación
durante dos horas. Los resultados mostraron en 6 muestras de MO que la expresión de CD18 no
aumenta en forma significativa con la presencia de infección, y el PMA (n=4) produce en los
controles y en los inferctados un discreto aumento de CD18. Respecto de CD29 (n=7) la infección
crónica tampoco produce una diferencia significativa respecto a la expresión, pero el PMA
produce un aumento variable de la expresión del CD29 (n=4) en las células normales y una
disminución variable de esta integrina en las provenientes de los animales infectados: 57% en
normales y 41% de CD29 en infectados (p≤ 0,01) por el test U de Mann Whitney. Conclusión: Las
células de MO de ratón C57/Bl infectado crónicamente con tul2 responden en forma diferente,
respecto de la expresión de CD29 a la presencia de PMA.
PyQ-7. La estimulación con G-CSF no modifica la evolución de la miocarditis crónica de
ratones infectados con Trypanosoma cruzi.
González MN, Migchelsen SJ, Postan M.
INP "Dr. Mario F. Chaben". [email protected]
Aproximadamente 20-30% de las personas infectadas con T. cruzi desarrollan alteraciones
cardiacas y/o digestivas progresivas e irreversibles en la etapa crónica de la enfermedad de Chagas.
El corazón aumenta de tamaño, con degeneración y necrosis de fibras musculares cardiacas,
infiltrados inflamatorios y fibrosis intersticial de variable intensidad, siendo actualmente el
trasplante cardíaco el único recurso para los pacientes con insuficiencia cardiaca terminal. En el
infarto miocárdico se ha demostrado que el G-CSF ejerce un efecto reparador sobre el tejido
dañado, induciendo hipertrofia de los miocitos cardíacos y reducción de la fibrosis cicatrizal. El GCSF es una glicoproteína que induce movilización y colonización de las células progenitoras de la
medula ósea en tejidos lesionados, diferenciación de neutrófilos y producción de IL-10. En este
trabajo se estudió el efecto de la administración de G-CSF sobre la evolución de las lesiones
cardiacas producidas por la infección por T. cruzi. Materiales y métodos: Se administró G-CSF
(10μg/Kg/dia) vía ip durante 20 días a ratones C3H/He 12 meses pi con el clon de T. cruzi Sylvio
X10/4 (106 tripomastigotes/ratón), los cuales fueron sacrificados al finalizar el tratamiento. Se
evaluaron los niveles de IL-10 séricos por ELISA, la evolución de las lesiones cardiacas por
histopatología, la expresión de GATA-4 y de G-CSFR por Western blot. Resultados: Los
resultados mostraron un aumento significativo en la producción de IL-10 en los ratones tratados
con G-CSF respecto de los no tratados, independientemente de si estaban o no infectados por
T.cruzi. El tratamiento con G-CSF no modificó significativamente la intensidad de la respuesta
inflamatoria cardiaca ni la densidad parasitaria en los animales infectados. Tampoco se detectaron
cambios significativos en el tamaño de los miocitos cardiacos de los animales tratados con G-CSF
(grupos infectado y control). El tamaño de los miocitos cardíacos en las áreas inflamadas de los
animales infectados fue significativamente menor que en las no inflamadas (P<0,001), como fue
descrito en el modelo de infección de rata. El G-CSF indujo en los ratones infectados una marcada
disminución de la expresión del factor de trascripción GATA-4 respecto de los no tratados y los
controles, no modificando la expresión del receptor G-CSFR. Conclusión: En conjunto estos datos
sugieren que la administración de G-CSF a ratones crónicamente infectados con T. cruzi como
90
único tratamiento no altera la evolución de la miocarditis crónica, en contraposición a lo descrito
en infarto de miocardio.
PyQ-8. Estudio experimental en ratones infectados con la cepa Nicaragua de Trypanosoma
cruzi y tratados con benznidazol (bz) y alopurinol. (alo).
Grosso NL1, Bua J1, Marotta H2, Frate L1, Fichera LE1.
1
INP. 2INP y CAECIS UAI. [email protected]
Estudiamos la respuesta al tratamiento con bz y alo en ratones C3H/He infectados con un aisado de
T. cruzi Nicaragua perteneciente al linage I que ha sido recientemente caracterizado en nuestro
laboratorio. El objetivo es estudiar su susceptibilidad con la menor dosis de bz o en combinación
de bz con alo. Las drogas fueron suministradas a ratones infectados via intraperitoneal con 103
tripomastigotes de Nicaragua con 30 dosis 2dpi de 100, 75 o 50 mg/kg/día de bz por vía oral. Otros
3 grupos recibieron además, 20 mg/kg/día de alo, vía oral, durante los 30 días siguientes. Se
estudió la parasitemia y se analizó la patología de diversos órganos a los 6 meses y al año pi.
Sobrevivieron todos los ratones en todos los tratamientos. Los órganos analizados a los 6 meses pi
muestran pocos nidos de amastigotes en los tejidos musculares cardíaco y esquelético. No
observamos diferencias significativas entre los tratamientos ensayados, solo se encontró una
significativa disminución de la inflamación en el corazón de los tratados con 75 bz y alo. En
conclusión; con la menor dosis de bz sobreviven todos los ratones y se disminuye la carga
parasitaria. El análisis de los corazones y músculo esquelético examinados a los 6 meses muestra
una disminución de los nidos de amastigotes comparados con los ratones no tratados. Estos
resultados son aún preliminares para establecer relaciones entre la virulencia de este aislado con
las parasitemias, la susceptibilidad a las drogas actualmente en uso y la cronicidad de la infección
en este modelo experimental.
PyQ-9. Descripción de un caso de hepatozoonosis en un perro. A propósito de sus
manifestaciones oculares.
Ivanic J, Gomez N, Duchene A, del Prado A.
Fac. de Cs. Veterinarias UBA. [email protected]
RESEÑA. Un canino, macho, entero, mestizo, de 8 años, es llevado a consulta por presentar
secreción mucopurulenta y malestar en ojo izquierdo. Los propietarios notaron cambios de color y
aumento de tamaño. Había sido encontrado en la calle en la zona sur del Gran Buenos Aires donde
había permanecido durante 4 meses. EXAMEN CLÍNICO. El examen clínico mostró
linfoadenopatía generalizada, mucosas pálidas, temperatura de 39 °C, menor peso y estado general
regular, al mismo tiempo se encontraron garrapatas en orejas y entre los dedos de los miembros. El
examen del ojo derecho fue normal, mientras que en el ojo izquierdo las alteraciones fueron:
aumento del globo ocular, hiperemia conjuntival y epiescleral, ausencia de respuesta a la amenaza,
presión intraocular superior a 25 mmHg y edema corneal que no permitió la oftalmoscopía
compatibles con uveítis y glaucoma secundario. Se indicó: hemograma y bioquímica, serología de
toxoplasmosis, brucelosis y neosporosis, junto con ecografía de abdomen y ocular. En el
hemograma las alteraciones fueron anemia normocítica arregenerativa y en el frotis sanguíneo
aparecieron en los leucocitos gamontes alargados de 10 μm de largo rodeados por una cápsula fina
teñida de azul con el Metanol – Giemsa compatibles con hepatozoon sp.; los resultados de la
bioquímica y la serología fueron normales. El resultado de la ecografía ocular fue aumento de
ecogenicidad de la cámara vítrea, con engrosamiento del cuerpo ciliar compatibles con proceso
91
inflamatorio, el estudio del abdomen mostró hepatomegalia y esplenomegalia. Se enucleó el ojo
izquierdo, para histopatología. El resultado fue un proceso inflamatorio con células plasmáticas y
macrófagos afectando el cuerpo ciliar compatible con uveítis inmunomediada. Se trató con
Toltrazuril a 10 mg/kg por día durante 4 días. El control de las garrapatas se realizó con Fipronil
spot – on. A los 45 días del tratamiento, los signos clínicos remitieron. DISCUSIÓN. En el
diagnóstico diferencial de las uveítis infecciosas deben considerarse aquellas causas más comunes
como la toxoplasmosis, brucelosis y neosporosis aunque descubrir la etiología puede ser difícil.
Ante un animal callejero, con mal estado general y con garrapatas la hepatozoonosis debe
considerarse en el diagnóstico diferencial, siendo la observación directa en frotis de sangre una
forma para el diagnóstico. Los hallazgos en la histopatología ocular fueron compatibles con el
parásito, debido a la respuesta inmunomediada que el mismo desencadena a nivel ocular,
considerando que se trataba de una infección crónica, con una estimulación antigénica persistente.
PyQ-10. Relación entre variables clínicas y polimorfismos de genes de factores participantes
en la evolución de la cardiomiopatía chagásica y no chagásica.
Lassen O.
Catedra de Medicina Interna III, Hospital Córdoba. Fac. Cs. Médicas. UNC.
[email protected]
Se analizó el polimorfismo 138-EX1-INS/DEL-A del gen de Endotelina-1 (ET-1) y el
polimorfismo H323H (T/C) del gen del receptor A de endotelina (ETA), moléculas participantes
en la evolución de la fisiopatogenia de la cardiomiopatía chagásica, en ADN de pacientes, para
determinar si existe asociación entre variables clínicas con frecuencia de polimorfismos de un solo
nucleótido (SNPs). Se clasificó a la población, según las características clínicas en Grupo Control,
(59) sin alteraciones cardiovasculares ni enfermedad de Chagas, Grupo Chagásicos (47) con
serología positiva para Enfermedad de Chagas y alteraciones cardiovasculares; y Grupo No
Chagásicos (91) serológicamente negativos para Chagas, con alteraciones cardiovasculares. El
análisis de los SNPs se realizo por PCR-RFLP. Al comparar las frecuencias alélicas y genotípicas
entre las poblaciones, se observó que la frecuencia genotípica 4A4A del polimorfismo138-EX1INS/DEL-A de ET-1 en pacientes chagásicos (p<0.05) era significativa. A continuación se analizó
la distribución de frecuencias genotípicas y alélicas de los polimorfismos estudiados, según las
variables clínicas de riesgo cardiaco entre las poblaciones. Observamos, para el polimorfismo del
gen ET-1, una correlación positiva entre Grupo Chagásicos y el genotipo 4A/4A. En este grupo de
pacientes se observó valores plasmáticos cercanos a los normales para TG, HDL, LDH, CPK, y
GOT-GPT. El Grupo No Chagásicos solo presentó valores normales para las variables LDH, CPK
asociadas al genotipo 4A /4A. El análisis de correlación, mostró una asociación significativa entre
los marcadores bioquímicos de daño cardíaco y el genotipo 4A/4A. Se podría especular, que los
individuos portadores del genotipo 4A/4A sobrellevaría los daños cardiológicos en forma más
atenuada. Para el polimorfismo ETA, se observó en el Grupo Chagásicos una relación significativa
entre la frecuencia del alelo T y el grado de compromiso cardiovascular. Los individuos con
enfermedad de Chagas sin cardiomegalia presentaron el alelo T en un 80%. Una asociación
significativa en el Grupo No Chagásicos, pero en el sentido opuesto al anterior, se observó entre la
presencia del alelo T y el grado de compromiso cardiovascular. Por lo que a diferencia de ET-1, al
presente no se ha podido establecer una relación entre estos genotipos de ETA y su participación
en la fisiopatogenia de las enfermedades cardiovasculares.
92
PyQ-11. Relevance of sulfated oligosaccharides of cruzipain in the immunopathogenesis of
Chagas disease.
Soprano LL1, Acosta DM1, Ferrero MR1, García GA1, Esteva MI1, Couto AS2, Duschak VG1.
1
INP Dr Mario Fatala Chaben, ANLIS-Malbrán, Ministerio de Salud de la Nación.
2
CIHIDECAR-Dpto.Q.Org., FCEN, UBA, Argentina. [email protected]
Trypanosoma cruzi contains a major cysteine proteinase, cruzipain (Cz). This lysosomal enzyme
bears an unusual C-terminal domain (C-T) that contains a number of post-translational
modifications and is responsible for most antibodies in natural and experimental infections. UVMALDI-TOF MS analysis, allowed us to identify the presence of sulfated high-mannose type
oligosaccharides in the C-T as a new striking feature of this molecule. In order to evaluate the
involvement of sulfated moieties in the crossreactivity between cardiac proteins and cruzipain,
BALB/c mice were immunized with purified Cz and C-T prior and after desulfation treatment. The
humoral immune response to sulfates on Cz or C-T was mainly IgG2b. This reactivity was
abolished when desulfated antigens were used as immunogens showing that sulfates are absolutely
required for eliciting IgG2b response to Cz. A significant reduction of C-T-specific delayed-type
hypersensitivity reaction in C-T-immunized mice was observed when desulfated C-T was
challenged, suggesting the involvement of sulfate groups in the generation of memory T-cell
responses. Moreover, immunization with C-T elicited ultrastructural abnormalities in heart tissue.
Surprisingly, pathological alterations were not observed in hearts from sulfate depleted-C-Timmunized mice and a lower labeling was observed by immunoelectron microscopy using myosinadsorbed specific policlonal anti-Cz serum. Furthermore, when BALB/c mice immunized with C-T
and desulfated C-T were challenged with trypomastigotes, immunopathological enhanced
responses were observed in cardiac and muscle mice tissues previously immunized with C-T. Our
results highlight the relevance of sulfated groups as main components of this molecule and suggest
it plays a role in the immunopatogenesis of Chagas disease. Ongoing assays using specific antisulfate antibodies will help to elucidate the involvement of sulfates in the antigenicity and
crossreactivity of this unique glycoprotein. Supported by CONICET-ANPCYT-UBA,.INPANLIS-Malbrán
PyQ-12. Expresión de CD40 en el miocardio de ratones infectados con Trypanosoma cruzi.
Moreno Ayala M1, Cutrullis RA1, González MN2, Corral RS1, Petray PB1.
1
Servicio de Parasitologia y Chagas, Hospital de Niños Ricardo Gutiérrez, CABA. 2Instituto
Nacional de Parasitología Dr Carlos Fatala Chabén, CABA. [email protected]
La interacción CD40-CD40L es clave en la regulación de muchos procesos de activación del
sistema inmune. La estimulación del CD40 tanto en células inmunes como no inmunes activa la
secreción de citoquinas proinflamatorias y moléculas de adhesión que jugarían un papel crítico en
la patogénesis de enfermedades inflamatorias agudas (miocarditis viral), crónicas y autoinmunes.
En la infección aguda por T.cruzi la interacción de este par receptor-ligando fue asociada con una
respuesta protectiva mediada por IL12 e IFN gamma pero se desconoce su posible participación en
el desarrollo de patología cardíaca. Nuestro objetivo fue explorar la expresión de CD40 en el
miocardio de ratones infectados con cepas de T. cruzi de diferentes características biológicas. Para
ello empleamos dos modelos experimentales: (I) Ratones Balb/c infectados con la cepa RA (50
parásitos/ratón) y (II) Ratones C3H/He infectados con el clon Sylvio-X10/14(106 parásitos /ratón).
A distintos tiempos pi (7 a 360 dpi), se extrajo el corazón y se analizó la expresión de CD40 por
inmunohistoquímica. Nuestros resultados revelaron por primera vez, en ambos modelos
experimentales, que la expresión de este receptor es inducida marcadamente en el miocardio desde
una fase temprana de infección y continúa presente durante toda la etapa aguda y crónica. En los
93
controles normales sólo se observó una expresión mínima constitutiva. La expresión de CD40 en
los ratones infectados fue verificada no sólo en células del infiltrado inflamatorio, sino también en
los miocardiocitos y en células endoteliales. Concluimos que la estimulación del CD40 a nivel de
tejido cardíaco y de endotelio vascular durante la infección por T. cruzi podría desencadenar la
síntesis de mediadores inflamatorios que contribuirían a favorecer y perpetuar el daño del
miocardio.
BIOQUIMICA (BIO)
BIO-1. Trypanosoma cruzi posee actividad lisofosfolipasa a in vivo.
Belaunzarán ML, Giménez G, Bott E, Lammel EM, Durante de Isola EL.
Departamento de Microbiología - Facultad de Medicina – UBA. [email protected]
Previamente determinamos en amastigotes (AMA) y tripomastigotes (TRP) de T. cruzi actividad
Fosfolipasa A1 (PLA1), asociada a membrana/secretada y significativamente mayor que en
epimastigotes (EPI) (Belaunzarán y col. 2007). La acumulación de ácidos grasos libres (AGL) y
lisofosfolípidos (LPL) durante la autólisis parasitaria, sugiere además la existencia de actividad
LisoPLA1 (LPLA) asociada a PLA1 (Wainszelbaum y col. 2001). Numerosas evidencias
relacionan PLA1 de tripanosomátidos con patogénesis. En T. brucei induciría daño celular per se o
por generación de AGL y LPC desde PL parasitarios o del huésped (Tizard y col. 1978) y
participaría en el mecanismo para evitar la toxicidad de LPL y AGL (Bowes y col. 1993). En T.
cruzi, se observó en nidos de AMA en degeneración una marcada respuesta inflamatoria,
sugiriendo que los productos de hidrólisis de fosfolípidos (PL) parasitarios son responsables de
este efecto (Tafuri, 1979). Se demostró además el efecto tóxico de AGL y LPL liberados de TRP
sobre cultivos celulares (Asahi y col. 1986). En el presente trabajo se determinó la actividad LPLA
in vivo en los diferentes estadíos de T. cruzi y el destino de los lípidos generados por dicha
actividad. Se incubaron 107 parásitos/ml + 0.2 μCi/ml de 2-[14C] oleoil-LPC 0, 15, 30 y 60 min y
los lípidos de los parásitos/sobrenadantes (SB) se extrajeron y separaron por TLC. AMA y TRP
incorporaron e hidrolizaron parcialmente la LPC a AGL, confirmando la actividad LPLA in vivo.
La presencia de LPC y AGL en los SB, sugiere que dicha actividad en AMA/TRP está asociada a
membrana/secretada. Se observó además biosíntesis de novo de fosfatidilcolina (PC). Los EPI
incorporaron e hidrolizaron completamente la LPC con generación de AGL y biosíntesis de PC,
diacilglicerol (DG), fosfatidiletanolamina (PE) y triacilglicerol (TG). En contraste con AMA/TRP,
en los SB de EPI no se detectaron lípidos marcados. Se incubaron luego AMA/TRP (107/ml) con 1
μCi/ml [14C] oleato 0, 15, 30 y 60 min y procesaron como se describió. Ambos incorporaron AO
en PC, PE y TG, al igual que EPI (Wainzelbaum y col. 2003), requiriendo al menos 30 min para
metabolizarlo. En los SB sólo se observó el AO no incorporado. Estos resultados confirman la
existencia en T. cruzi de actividad LPLA in vivo, la cual protegería al parásito de la toxicidad de
LPL generados por la PLA1, favoreciendo su sobrevida. Ambas actividades enzimáticas,
involucradas en el metabolismo de los PL/LPL, constituirían además un potencial blanco
quimioterapéutico. Financiado por UBA/FONCYT.
94
BIO-2. Identificación y caracterización de la enzima hemo A sintasa de Trypanosoma cruzi.
Buchensky C, Cricco JA.
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR) CONICET-UNR. Área Biofísica.
FCByF UNR. [email protected]
El grupo hemo A es un cofactor esencial del complejo multiproteico citocromo c oxidasa de
células eucariotas y también de algunos organismos procariotas. En eucariotas, su biosíntesis tiene
lugar en la mitocondria, donde el hemo B es modificado y convertido en hemo A mediante la
acción de dos enzimas, la hemo O sintasa (HOS, Cox10p) y la hemo A sintasa (HAS, Cox15p);
productos de los genes nucleares cox10 y cox15, respectivamente. La primera reacción, catalizada
por Cox10p, involucra la farnesilación del grupo vinilo del anillo pirrólico A generando hemo O.
Luego, Cox15p participa en la oxidación a aldehido del metilo sustituyente del anillo D del hemo
O, generando así hemo A. Trypanosoma cruzi carece de la ruta biosintética de hemo, lo mismo
ocurre en otros tripanosomátidos y diversos parásitos. Estos organismos incorporan el grupo hemo
desde el medio extracelular, que posteriormente es distribuido e incorporado en hemoproteínas.
Entre ellas, se encuentran proteínas mitocondriales que están involucradas en el metabolismo
energético. Estudios previos realizados en epimastigotes de T. cruzi, han demostrado que la
principal oxidasa terminal es del tipo aa3 (contienen hemo A como cofactor). Si bien la via de
incorporación y distribución de hemo hacia la mitocondria no ha sido elucidada en este organismo,
en el laboratorio hemos identificado las enzimas responsables para la biosíntesis de hemo A.
Utilizando como semilla de búsqueda la secuencia proteica de la enzima Cox15p de levadura,
hemos identificado un marco abierto de lectura, en el genoma de T. cruzi, que muestra homología
con esta secuencia. La misma fue amplificada y clonada en vectores de expresión para S.
cerevisiae como proteína de fusión con una cola de histidina C-terminal. La expresión de la
proteína de T. cruzi (TcCox15p) en células de levaduras knock out para COX15 (ScΔcox15) fue
capaz de revertir la deficiencia respiratoria originada por la deleción, permitiendo su crecimiento
en medios con fuentes de carbono no fermentables, y restaurar los niveles mitocondriales de hemo
A. Resultados similares se obtienen al expresar la proteína de S. cerevisiae (ScCox15p) en las
células knock out correspondientes. En conjunto con resultados previos en donde se identificó una
proteína de T. cruzi con actividad hemo O sintasa, se puede inferir que en este parásito, existe una
ruta conservada para la biosíntesis de hemo A catalizada por las enzimas TcCox10p y TcCox15p.
BIO-3. Caracterización del transporte de Hemo en Trypanosoma cruzi.
Cricco J1, Pral EMF2, Silber AM2, Barisón MJ3.
1
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR) CONICET-UNR. Área Biofísica,
FCByF, UNR, Argentina. 2Departamento de Parasitología, Instituto de Ciências Biomédicas,
Uiversidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil. 3Instituto de Biología Molecular y Celular de
Rosario (IBR) CONICET-UNR. [email protected]
El grupo hemo cumple un rol fundamental en muchos procesos celulares, es sintetizado a través de
una ruta de múltiples pasos e involucra intermediarios definidos que están altamente conservados a
través de la evolución. Trypanosoma cruzi, así como otros tripanosomátidos presenta un ciclo de
vida complejo y requiere, entre otros, hemo como cofactor esencial. Estudios bioquímicos han
mostrado que T. cruzi, carece de una ruta de síntesis para este cofactor, además de observó que
están ausentes las enzimas de la vía clásica de biosíntesis de hemo en su secuencia genómica.
Estos parásitos, adquieren hemo del entorno extracelular que posteriormente incorporan en
hemoproteínas, muchas de estas son ortólogas a las de otros organismos eucariotas e intervienen en
rutas metabólicas esenciales. En nuestro laboratorio fue utilizado el análogo fluorescente de hemo
Zn(II) mesoporfirina IX (ZnMP), para estudiar y caracterizar el proceso de transporte e
95
incorporación de hemo en epimastigotes de T. cruzi. Este compuesto es estable y ha sido utilizado
previamente para estudiar el tráfico de hemo por microscopía de fluorescencia en diferentes
organismos. Como primera aproximación hacia la caracterización bioquímica de su transporte,
desarrollamos una metodología que permite seguir la incorporación del análogo ZnMP midiendo la
intensidad de fluorescencia relativa (IF) del mismo en extractos celulares totales. Esta estrategia de
trazado no radioactivo permite cuantificar y comparar la incorporación de ZnMP como indicador
de la incorporación de hemo. Los resultados obtenidos muestran que la incorporación de ZnMP en
función del tiempo sigue una cinética de saturación, y la constante de afinidad observada para este
proceso fue menor a 50 uM. Se estudió la actividad específica de transporte ZnMP en función de
cambios de pH y de temperatura del medio, como así también los efectos que producen sobre este
proceso la variación de concentraciones de iones metálicos monovalentes como Na+ y K+.
Finalmente, se evaluó el efecto del ionóforo de protones (FCCP), de inhibidores de la cadena
respiratoria mitocondrial (rotenona + antinicina) y de oligomicina, inhibidor de la ATPasa
mitocondrial. Los resultados obtenidos avalan la propuesta de que el transporte de hemo en
epimastigotes de T. cruzi es activo y es mediado por un transportador proteico específico. La
elucidación del sistema de transporte e incorporación de hemo, como la identificación y
caracterización de las proteínas involucradas, permitiran avanzar hacia el conocimiento de vias
esenciales en el metabolismo de este organismo.
BIO-4. In vivo effects of sodium chlorate on cruzipain sulfation in Trypanosoma cruzi .
Ferrero M1, Soprano LI1, Acosta DM1, García GA1, Couto AS2, Duschak VG1.
1
I.N.P . 2Dto. Quim. Org. Fcen U.B.A. [email protected]
Trypanosoma cruzi, the parasitic protozoan that causes Chagas disease, contains a major cysteine
proteinase, cruzipain. This lysosomal enzyme bears an unusual C-terminal extension that contains
a number of post-translational modifications. We have reported the presence of sulfated structures
in the C-T domain of this glycoprotein, constituting the first report on the presence of a sulfated
glycoprotein in Tripanosomatids. Sulfotransferases (STs) catalize the transfer reaction of the
sulfate group from the ubiquitous donor 3´phosphoadenosine 5`phosphosulfate (PAPS) to an
acceptor group of numerous substrates. Sulfation reaction is widely observed from bacteria to
humans and plays a key role in various biological processes such as cell communication, growth
and development as well as defence. Chlorate is known to be an in vitro inhibitor of ATP–
sulfurylase, the first enzyme in the biosynthesis of PAPS which is the ubiquitous co-substrate for
sulfation. It has has been used to abolish protein sulfation on tyrosine as well as on carbohydrate
residues in intact cells. In this work, we have examined the in vivo effect of chlorate on cruzipain
sulfation in epimastigote forms of T. cruzi. Epimastigotes were treated with growing
concentrations of sodium chlorate (10-80 mM) during 24, 48 and 96 h. The results, showed a
significant decrease in the immunerecognition of specific antisulfate antibodies, obtained from
mice immunized with Cz followed by absorption with desulfated cruzipain. It is worth stressing
that there are no putative genes for canonic sulfotransferases identified up to now in the T. cruzi
genome. This fact suggests that significant differences in sequences between T. cruzi and
mammalian sulfotransferases exist. Therefore, it might be feasible to take advantage of these
differences to determine whether these enzymes as valid targets for chemotherapeutic drug design.
Supported by CONICET-ANPCYT-UBA, INP-ANLIS-Malbrán
96
BIO-5. Probable participación de una aldo-ceto reductasa de Trypanosoma cruzi (tcakr) en el
mecanismo de acción de ο–naftoquinonas con actividad tripanocida.
Garavaglia PA1, Cannata JB2, Galleano M3, García GA1.
1
Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chaben”-ANLIS “Carlos G. Malbrán”.
2
IIB-UNSAM CEFYBO Facultad de Medicina-UBA. 3Facultad de Farmacia y Bioquímica-UBA.
[email protected]
Trypanosoma cruzi, el agente etiológico de la Enfermedad de Chagas, posee una limitada
capacidad para eliminar especies reactivas del oxígeno. Estos radicales libres pueden formarse por
varios mecanismos incluyendo el metabolismo de drogas. Se postula que ciertas drogas
tripanocidas como nitroheterociclos y naftoquinonas, entre ellas la β-lapachona, son reducidas por
reductasas del parásito formando radicales aniones de la droga, que bajo condiciones aeróbicas
derivan en la formación de metabolitos tóxicos del oxígeno. Recientemente, hemos identificado y
caracterizado una reductasa NADPH-dependiente citosólica perteneciente a la superfamilia de las
aldo-ceto reductasas (AKRs), denominada TcAKR. La enzima recombinante (recTcAKR)
presenta, además de actividad de AKR con los sustratos comunes para esta superfamilia, 4-NBA y
2-DHA, actividad de quinona-óxido reductasa (QOR) con afinidad solo por las o-naftoquinonas,
en especial por 1,2-naftoquinona (1,2NQ), 9,10-fenantrenquinona (9,10PQ) y β-lapachona. A
partir de la reducción de 9,10PQ y 1,2NQ utilizando la recTcAKR, en presencia de citocromo C
acetilado, se comprobó la formación de anión superóxido (0.211 y 20.71 µmoles de
superóxido/min/ml de enzima, respectivamente) en una relación 2:1 con el consumo de NADPH.
Alternativamente, a partir de la reducción de 9,10PQ y β-lapachona por la recTcAKR, en presencia
del atrapante DMPO se identificaron espectros de resonancia de electro spin (EPR), compatibles
con el aducto radical hidroxilo-DMPO, confirmando la generación de radicales libres. Por otro
lado, se evaluó el efecto in vivo de dichas o-naftoquinonas sobre epimastigotes de T. cruzi,
pudiendo determinar que 9,10PQ posee una toxicidad similar a la β-lapachona con un valor de
IC50 de 5.75 µM, mientras que para 1,2NQ se determinó un IC50 de 62 µM, muy alejado de las
concentraciones fisiológicas. Nuestros resultados sugieren que el efecto parasiticida de la 9,10-PQ
y la β-lapachona estaría dado por la reducción de dichas drogas por la TcAKR con la concomitante
producción de radicales libres en el citosol del parásito. A fin de confirmar esta hipótesis, en
futuros estudios se evaluara la susceptibilidad a dichas drogas de epimastigotes transfectados que
sobreexpresan dicha enzima.
BIO-6. TcPI3K: A class I PI-3 kinase in Trypanosoma cruzi.
Gimenez, AM1, Schoijet AC2, Torres HN2, Flawiá MM2, Alonso GD2, Machado EE1.
1
Departamento de Biología Molecular, FCEFQyN, Universidad Nacional de Río Cuarto.
2
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI – CONICET).
[email protected]
Phosphatidylinositol kinases play a central role in different processes such as membrane
trafficking, autophagy and cell signaling. Previously, we found that Trypanosoma cruzi
epimastigotes possesses a PI3K activity which is a component in the signaling pathways activated
by hyperosmotic stress. However, we did not identify the class of PI3K involved in this response.
The aim of this work was to define if class I PI3K is functional in this parasite, through cloning
and expressing a putative T. cruzi class I PI3K (TcPI3K) in BL 21 E. coli cells. Primer sequences
were designed from the identified sequence (Tc00.1047053510167.10) and PCR product was
sequenced and compared with the original sequence found at GeneDB. We used pET22 b(+)
expression vector and protein induction with IPTG was performed at 25ºC to obtain enough
soluble protein for its purification. Southern and Northern blot analysis showed that TcPI3K is a
97
single copy gene and its mRNA is expressed in epimastigote forms. Moreover, recombinant
TcPI3K recovered from soluble fraction was assayed in order to determinate kinase activity,
confirming a functional PI3K. This is the first report of class I PI3K existence in trypanosomas.
BIO-7. Aumento de los contenidos de poliaminas en epimastigotes de Trypanosoma cruzi
sometidos a estrés osmótico.
Hernández S, Fresia RB, Schwarcz M.
Universidad Abierta Interamericana. [email protected]
Las poliaminas putrescina, espermidina y espermina son policationes ubicuos con acciones
pleiotrópicas que incluyen regulación de la expresión de los genes, proliferación y diferenciación
celular y la modulación de los sistemas de señales. Las poliaminas pueden ser inducidas por
diferentes señales de estrés como un mecanismo citoprotector. El Trypanosoma cruzi, agente
causal de la Enfermedad de Chagas, está sujeto durante su ciclo de vida a amplias variaciones en la
osmolaridad del medio, y necesita adaptarse a estas condiciones. El objetivo de este trabajo es
estudiar si las poliaminas tienen un rol fisiológico en la protección del estrés osmótico en la forma
epimastigote del parásito. Como agente hiperosmótico se utilizó manitol a concentraciones
farmacológicas (100 a 700 mOsm). Se determinó la acción del manitol sólo o en presencia de las
drogas antitripanocidas Nirfutimox y Benznidazol, y se evaluó su efecto sobre los niveles
endógenos de poliaminas del parásito. Se observó que el manitol produjo una reducción dosis
dependiente en la proliferación de los epimastigotes acompañada de alteraciones morfológicas y
disminución de la motilidad. El efecto antiproliferativo del manitol fue sinérgico con el de las
drogas: el agregado de manitol 400 mOsm junto con concentraciones IC50 de Nifurtimox o
Benznidazol aumentó el porcentaje de inhibición del crecimiento a 90 y 75% respectivamente.
Tanto el manitol como el Benznidazol aumentaron los niveles endógenos de poliaminas, Manitol
400 mOsm o Benznidazol 30 μM produjeron un aumento de 1,5 veces en la espermidina y 2 veces
en la espermina, mientras que el agregado conjunto las elevó en 3 y 4 veces respectivamente. El
agregado conjunto de manitol y espermidina o espermina al medio de cultivo carente de
poliaminas no protegió a los parásitos de la acción osmótica del manitol. Sin embargo la
preincubación con cada una de las poliaminas (0,5 o 1 mM) 24 horas antes del agregado del
manitol redujo el daño osmótico. Estos resultados indican que las poliaminas podrían estar
involucradas en los mecanismos protectores del estrés osmótico en T. cruzi y sugieren un potencial
rol terapéutico para el manitol o los inhibidores de la síntesis de poliaminas como coadyuvantes de
las drogas actualmente utilizadas en el tratamiento de la Enfermedad de Chagas para disminuir los
efectos adversos de las mismas
BIO-8. Sobre la regulación redox de la actividad de la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa en
Entamoeba histolytica.
Martinez LI, Guerrero SA, Iglesias AA.
Lab.Enzimología Molecular.Lab. de Bioquímica Microbiana.FBCB.UNL. IAL (UNL-CONICET)
[email protected]
Amebiosis es una infección intestinal causada por el patógeno humano Entamoeba histolytica. La
enfermedad causada por este agente es la tercera causa de muerte en el mundo (100.000 muertes
anuales). E. histolytica presenta gliconconjugados anclados a la superficie celular, los cuales
estarían involucrados en las interacciones entre el parásito y el huésped. La ruta biosintética para
estos glicoconjugados aún no ha sido completamente elucidada. En este tipo de organismos la
98
producción de oligo y polisacáridos estructurales ocurre vía UDPGlc, siendo la enzima UDPGlc
pirofosforilasa (EC 2.7.7.9; UDPGlcPPase) responsable de su síntesis. Aquí reportamos el clonado
molecular del gen que codifica para la UDPGlcPPasa de E. histolytica. Se utilizó el sistema E. coli
BL21(DE3)/pRSETB para la expresión y purificación de la proteína recombinante
(EhUDPGlcPPasa). La enzima purificada se caracterizó cinéticamente en ambos sentidos de
reacción. Oxidantes como diamida, peróxido de hidrógeno y nitroprusiato de sodio inactivan a la
enzima. El proceso se revierte completamente con agentes reductores como cisteína, DTT y TRXs.
Con la ayuda de un modelo computacional de la enzima se identificaron determinados residuos de
cisteína y metionina críticos para la regulación redox. En base a esos datos se produjeron las
mutantes C108S, C378S, C108/378S, M106S y M106C, cuya caracterización alude un mecanismo
para la regulación de la enzima. Se sugiere que la EhUDPGlcPPasa es una enzima regulada por un
mecanismo de modificación postraduccional de tipo redox que modula sus niveles de actividad.
Este mecanismo podría afectar críticamente al metabolismo de carbohidratos en este organismo.
Trabajo subsidiado por: CAI+D 2006, PICT´07 668 y PICTO’05 15-36129.
BIO-9. Trypanosoma cruzi: el poro de transición de la permeabilidad mitocondrial podría
estar involucrado en la muerte celular programada del parásito.
Perrone A, Bustos PL, Fuchs AG, Postan M, Bua J.
Instituto Nacional de Parasitología. [email protected]
Las Ciclofilinas (CyPs) son enzimas involucradas en el plegamiento proteico y blanco de la droga
inmunosupresora Ciclosporina A (CsA). La CyPD es una ciclofilina mitocondrial, involucrada en
la apertura del poro de permeabilidad mitocondrial (mPTP) en mamíferos. Previamente hemos
descripto la familia de genes de las ciclofilinas en el Trypanosoma cruzi y algunas de sus
isoformas fueron aisladas por cromatografía de afinidad por CsA. T. cruzi tiene una ciclofilina
homóloga a la CyPD de 21 kDa, TcCyP21, que se expresa en el parásito. (SAP, Rosario, Argentina
2008). Intentamos establecer si la TcCyp21 podría estar involucrada en la apertura del mPTP. El
Análisis bioinformático de los componentes del poro de mPTP tales como la adenina-nucleotido
translocasa, el canal aniónico dependiente de voltaje, la hexoquinasa, entre otras, fueron
encontradas en el genoma del T. cruzi. El objetivo del trabajo fue estudiar el rol de la ciclofilina
TcCyP21 en la muerte celular del parásito. Se indujo un stress oxidativo en epimastigotes del clon
CL Brener con 5 mM H2O2, Hemos observado algunos hechos relacionados con la apoptosis
como la degradación del ADN celular, un clivaje de la proteína PARP-like y la traslocación del
citocromo c al citosol. Estas señales apoptóticas pudieron ser inhibidas por pre-tratamiento de los
parásitos con CsA sugiriendo que una ciclofilina del T. cruzi podría estar involucrada en el mPTP.
La proteína recombinante TcCyP21 incrementó la actividad enzimática de la Hexoquinasa
mitocondrial, mientras que las pre-incubaciones con Ciclosporina A, o anticuerpos policlonales
anti-TcCyP21 o contra un péptido sintético de la TcCyP21 redujeron drásticamente dicha actividad
enzimática. Dado que estos inhibidores afectan la actividad enzimática Peptidil Prolil cis-trans
isomerasa (PPIasa) de la ciclofilina TcCyP21, es posible que esta proteína interactúe con la
hexoquinasa mitocondrial modificando la velocidad inicial de esta enzima. Este hecho ya fue
descripto para el poro de mPTP de mamífero en el cual la actividad enzimática de la CyPD
estabiliza la unión de la Hexoquinasa a la mitocondria, indicando una interacción entre ambas
proteínas. Esta es la primera vez que un poro de permeabilidad mitocondrial se describe para un
protozoo parásito y alienta posteriores estudios sobre las proteínas que componen este poro,
involucrado en eventos de muerte celular del parásito. Este proyecto recibió apoyo del Grant
D43TW007888 del Fogarty International Center, NIH, USA y el INP, ANLIS Malbrán y CAECIS,
Universidad Abierta Interamericana de Argentina.
99
BIO-10. Clonado y caracterización funcional de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa
(PEPCK) de Leishmania major.
Sosa M, Nowicki C.
Fac.de Farmacia y Bioquímica UBA. [email protected]
Hay evidencias experimentales que muestran que Leishmania puede sintetizar de-novo glucosa.
Este proceso gluconeogénico no es idéntico al de los mamíferos. Por ejemplo, estos parásitos
carecerían de piruvato carboxilasa, enzima mitocondrial que en los tejidos gluconeogénicos
produce el oxalacetato que se deriva a la síntesis de novo de glucosa. Sin embargo, se observó que
amastigotes y promastigotes de L. mexicana cultivados en medios pobres de glucosa pueden
utilizar tanto aspartato como alanina para sintetizar de novo carbohidratos. Este proceso tendría
relevancia fisiológica ya que la inactivación de la fructosa 1, 6 bisfosfatasa disminuye la virulencia
de amastigotes de Leishmania. En coherencia con la posible relevancia biológica del proceso
gluconeogénico en estos parásitos, la actividad de PEPCK es aproximadamente 10 veces más alta
en los extractos crudos de amastigotes que en los obtenidos a partir promastigotes. Las
aminotrasnferasas o la malato deshidrogenasa presentes en el citosol de amastigotes podrían
producir el oxalacetato necesario para que la PEPCK pueda formar fosfoenolpiruvato y este se
utilice como precursor en la síntesis de glucosa. Con el propósito de conocer las propiedades
bioquímicas de la putativa PEPCK de Leishmania decidimos clonar y caracterizar esta enzima. El
putativo gen de la PEPCK de L. major se amplificó por PCR en base a secuencia nucleotídicas
identificadas en las bases de datos. El fragmento de ADN se clonó en pET28 y se le agregó una
secuencia codificante para 6xHis al extremo 5´. La enzima recombinante se expresó en cultivos de
E. coli y se purificó por cromatografía de afinidad a metales. Se obtuvo un rendimiento de aprox. 3
mg por litro de cultivo y la PEPCK purificada presentó una actividad específica de
aproximadamente 30 U.mg-1 tanto cuando se midió el consumo de fosfoenolpiruvato como el de
oxalacetato. Estos valores son muy similares a los informados para su homologo de mamíferos. Se
sabe que las PEPCKs de tripanosomátidos utilizan ADP, en cambio la PEPCK de mamíferos
pertenece al grupo de las que utilizan GDP. Las diferencias estructurales entre ambos tipos de
enzimas permitirían considerar a la PEPCK como un potencial blanco terapéutico en caso de que
ésta resultara esencial para la sobrevida/infectividad de parásitos de Leishmania.
BIOLOGIA CELULAR (BC)
BC-1. Echinococcus granulosus, modelo in vitro a partir de un cultivo monocelular.
Leonardelli A, Perrone A, Echeverría C, Manzini A, Campos K, Fuchs AG.
CAECIS, Universidad Abierta Interamericana. [email protected]
En la reunión del año pasado hemos presentado la obtención y la caracterización de un cultivo
primario continuo de protoescólices (PE) de E. granulosus (SAP 2008). En esta etapa hemos
continuado con la caracterización de las células, que aún son mantenidas en el laboratorio en forma
continua, soportando la congelación en nitrógeno líquido y su posterior descongelación. En este
periodo hemos estudiado el comportamiento de estas células en medio axénico bifásico utilizando
como soporte la agarosa para investigar si las mismas son capaces de formar estructuras similares a
las observadas en los hospedadores secundarios de la hidiatidosis. Células sembradas sobre o
dentro de agarosa al 2% en 5mM fosfato/Hepes, pH 7,1, con el agregado de 3x10-4 de hemina y 0,5
ppm de Cl2Zn y medio de crecimiento en su fase líquida, favorece la formación de estructuras
100
circulares u ovaladas constituidas por membranas celulares, como ha sido demostrado por las
técnicas histológicas de PAS y H-E, se observan a partir de las 24h de sembrado y se mantienen
por 7 días. El tratamiento de estas estructuras con 10µM de Benznidazol reduce la viabilidad
celular, pero no la formación de membranas, aunque estas se presentan acelulares (INPI P090102320). La expresión del AgB se ha estudiado por imnunohistoquímica, utilizando el
anticuerpo policlonal obtenido en conejo, gentilmente aportado por la Dra Mara Rosenzvit, una
concentración 1/8x10-6 y como segundo anticuerpo un anti conejo marcado con fluoresceína 1/100,
el ioduro de propideo se ha utilizado para la visualización de los núcleos celulares. Entre el 3050% de estas células y sobre todo las agrupadas en membranas expresan este antígeno. Estas
investigaciones confirman 1-El origen parasitario de estas células; 2-Su utilidad en la pruebas de
nuevas drogas antiparasitarias.
BC-2. Incremento de la citotoxicidad al daño oxidativo del DNA en Trypanosoma cruzi
mediante la inhibición de la vía BER
Sepúlveda Contreras S1, Fernández Castro C1, Valenzuela Pérez L1, Barría Loaiza C1, Kemmerling
Weiss U2, Galanti Garrone N1, Cabrera Vallejos G1.
1
Programa de Biología Celular y Molecular, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de
Medicina, Universidad de Chile. 2Programa de Anatomía y Biología del Desarrollo, Instituto de
Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. [email protected]
Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, es un protozoo hemoflagelado que
se presenta en tres formas celulares: epimastigote, amastigote y tripomastigote, estas dos últimas
presentes en hospederos mamíferos. Este parásito sobrevive al daño del DNA por especies
reactivas (ROS/RNS) generadas por células del hospedero mamífero. Proponemos que, como se ha
observado en otros eucariontes, T. cruzi sobrevive al daño oxidativo del DNA por activación del
mecanismo de escisión de bases (vía BER), proceso altamente conservado en el que las
endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (APEs) juegan un rol fundamental. Consecuente con
nuestra propuesta, se observó que la citotoxicidad de epimastigotes y tripomastigotes sometidos a
diferentes concentraciones de H2O2 aumenta significativamente cuando se tratan simultáneamente
con metoxiamina (inhibidor de endonucleasas AP de la vía BER). Se concluye que esta vía juega
un rol en la resistencia al daño oxidativo en T. cruzi. Para estudiar la participación de la proteína
homóloga de APE1 humana en T. cruzi (TcAP) en este proceso de resistencia, se clonó y expresó
la región carboxilo terminal de esta enzima en E. coli. Con la proteína obtenida se preparó un
anticuerpo específico, que fue utilizado para estimar la expresión de TcAP en epimastigotes de T.
cruzi sometidos a H2O2. Se concluyó que la expresión de TcAP aumenta en respuesta a estrés
oxidativo en epimastigotes de T. cruzi. Para evaluar la posible participación de otras APEs en las
distintas formas celulares del parásito se identificó en el genoma de T. cruzi secuencias homólogas
a APEs en otros organismos. Se encontró en T. cruzi la secuencia de las proteínas TcAP2,
homóloga de Apn2 de Schizosaccaromyces pombe y APE2 humana, y NL1Tc, endonucleasa
retrotransposónica de la familia AP. Se clonaron y expresaron ambas proteínas completas y
posteriormente se generaron anticuerpos específicos para cada una de ellas. Estos anticuerpos
serán utilizados para evaluar la expresión de estas APE en las distintas formas celulares de T. cruzi
en condiciones normales y de estrés oxidativo.
101
BC-3. Definición de una señal de localización nuclear para proteínas en Trypanosoma cruzi.
Westergaard G1, Reinert M1, Vazquez M2.
1
LBGT, FBMC, UBA. 2LBGT, FBMC, UBA [email protected]
Las señales de localización nuclear en los tripanosomátidos han sido poco exploradas. Sin
embargo, resultarian de gran importancia para el mejoramiento de las herramientas geneticas
disponibles, como por ejemplo vectores de transfeccion inducibles que necesitan ubicar la proteína
heterologa inducible en el nucleo. Como modelo de estudio se eligió a la proteína p14 por 2
razones fundamentales: 1) se sabe que tiene funcion en el nucleo, 2) es una proteina pequeña. En
efecto, la proteína p14 interacciona con el factor de splicing SF3b155 y ambas son reclutadas al
punto de ramificación de la reaccion de splicing en el nucleo. Por otro lado, es una proteina de bajo
peso molecular muy conservada en la evolución que se caracteriza por tener un unico dominio
RRM. La proteína de T. cruzi, en particular, consta de 117aa. En el extremo c-terminal Tcp14
presenta una extension de hélice-alpha que también está presente en otras p14. En esa extension,
entre los aminoácidos 91 a 96 aparece una señal básica (RRKRRR) que podria funcionar como una
putativa señal de localización nuclear. Mediante el sistema de detecciones rapidas con fusiones a
GFP que diseñamos en el laboratorio, exploramos una serie de Tcp14 mutantes para definir con
exactitud las señales involucradas en su localizacion nuclear. De esta forma, pudimos determinar
que Tcp14 no depende de su union a SF3b155 para ingresar al nucleo, sino que posee su propia
señalizacion. Los avances de este trabajo seran presentados en detalle.
BC-4. Caracterización de aislados de Trypanosoma cruzi provenientes de pacientes con
cardiopatía chagásica en la provincia de Salta.
Monje Rumi MM1, Lauthier JJ1, Ragone PG1, Alberti D’Amato AM1, Tomasini N1, Uncos A1,
Ramos F1, Lacunza D2, Nuñez Burgos F2, Lescano L2, Aramburu E2, Ruíz O2, Correa Salazar C2,
Merubia O2, Nieva E2, Sanchez J2, López M3, Vidal MI3, Costello G3, Ledesma E3, Aguilera S4,
Llaya J5, Arias L5, Saldaño V2, Basombrio MA6, Diosque P1.
1
Unidad de Epidemiología Molecular Instituto de Patología Experimental Facultad de Ciencias de
la Salud Universidad Nacional de Salta. 2Hospital San Bernardo Servicio de Cardiología Salta
Argentina. 3Hospital San Bernardo Laboratorio Central Salta Argentina. 4Hospital San Bernardo
Servicio de Radiología Salta Argentina. 5Hospital San Bernardo Servicio de Cirugía Salta
Argentina. 6Instituto de Patología Experimental Facultad de Ciencias de la Salud Universidad
Nacional de Salta. [email protected]
El conocimiento de la diversidad genética de T. cruzi en Argentina se ha incrementado en los
últimos años, sin embargo hasta el momento no se conoce en detalle la distribución geográfica de
los diferentes linajes del parásito, ni las prevalencias de los linajes del parásito en las diferentes
áreas endémicas. Este estudio se enmarca dentro de un proyecto que busca abordar aspectos de
interés para la epidemiología de la Enfermedad de Chagas. Por un lado, el estudio de las
prevalencias de los diferentes linajes en diferentes áreas de estudios, y por otro lado, el estudio de
la posible influencia de las cepas infectantes sobre las manifestaciones clínicas de la enfermedad,
mediante un estudio de caso y controles. En la primera etapa de este trabajo, se obtuvieron 59
muestras de sangre de pacientes con cardiopatía chagásica de la provincia de Salta. Los pacientes
fueron sometidos a un examen físico: electrocardiograma, radiografía de tórax, ecocardiograma y
examenes gastroenterológicos (esófago-gastro-duodenal y colon por enema con doble contraste).
Las muestras fueron estudiadas mediante hemocultivo (utilizando un método de lavado y
concentración), estudios serológicos y, PCR diagnóstica (primers 121-122). El 44% de las
muestras fueron positivas por PCR (26/59). Se sembraron hemocultivos a partir de muestras de 32
pacientes, de los cuales 7 fueron positivos (21,8%). Los aislados obtenidos fueron caracterizados
102
por MLEE, RAPD y MLST. Los resultados demostraron la presencia de los linajes TCI (1/7),
TCIIb (4/7); TCIId (2/7). Los linajes identificados podrían no representar la totalidad de los clones
circulantes en sangre, debido a que durante el proceso de cultivo puede ocurrir selección de clones,
así como también es posible que los parásitos obtenidos en las muestras no sean representativos de
la diversidad total de clones infectantes. Sin embargo, estos resultados son informativos, tanto para
conocer los linajes involucrados en infecciones de pacientes residentes en la cuidad de Salta, como
para conocer los linajes presentes en pacientes cardiópatas. Estos aislados serán utilizados como
controles en futuros ensayos de hibridización con sondas de mHVR sobre muestras de sangre de
pacientes infectados cardiópatas y no-cardiópatas, en el estudio de casos y controles (Financiado
por: Institute de Recherche pour le Développement (IRD), Francia; Seventh Framework
Programme, European Commission; FONCyT; CIUNSa).
BC-5. Generation and characterization of monoclonal antibodies specific to Giardia lamblia
lysosome-like organelles.
Feliziani C, Merino C, Touz M, Ropolo A.
Instituto de Investigaciones Médicas Mercedes y Martín Ferreyra. INIMEC-CONICET.
[email protected]
Giardia lamblia is an early-diverging eukaryote that lacks a typical endosomal/lysosomal system.
Instead, it possesses peripheral vacuoles (PVs) that function as both endosomes and lysosomes and
are located underneath the plasma membrane of the trophozoites. In this work, we developed
monoclonal antibodies (mAbs) directed against purified PVs, to provide a unique set of tools for
understanding the assembly and function of these particular organelles. PVs purified by cellfractionation were used as immunogen to subcutaneously immunize BALB/c mice. The mice
producing PV positive pAb were further euthanized and the spleen cells fused to the NSO
myeloma cell line. Antibody-secreting hybridomas were screened with indirect
immunofluorescence and dot-blotting using non-encysting trophozoites. Monoclonal antibodies
against PVs, endoplasmic reticulum, ventral disc, and variant-specific surface proteins, were
obtained. The development of mAbs against proteins from other organelles can be explained by
their presence in the same PV-purified fractions. Also, there might be proteins that are sorted to the
PVs at certain point in time for processing or degradation. Immunoblotting after cloning showed
that each anti-PV mAb was able to recognize one particular protein. Further analysis utilizing
proteomic strategies will allow us to characterize each protein in the context of their role in
lysosome trafficking and function. Our studies, utilizing monoclonal antibodies directed against
the PVs, might allow understanding the distinctive function of these unique organelles and whether
G. lamblia has many of the endomembrane protein transport elements and sorting functions of
higher cells. Giardia appears as a great system to study not only the evolution of the secretory
pathway in eukaryotes but also “why” and “how” an organism may have lost some essential
subcellular organelles when becoming a parasite, while maintaining the minimal machinery
necessary for fundamental cellular functions.
BC-6. Análisis, clonado y expresión de nuevos candidatos vacunales de Trypanosoma cruzi.
Ziliani M, Sánchez DO, Tekiel V.
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB-UNSAM), CONICET. [email protected].
Previamente, empleando una biblioteca de expresión de cDNA de tripomastigotes de Trypanosoma
cruzi, realizamos ensayos de inmunización genética en ratones e identificamos 22 fragmentos de
103
genes que -en conjunto- conferían protección frente a la infección. Nuestro objetivo actual es reevaluar a estos nuevos candidatos vacunales para determinar cuál es el menor número (y en qué
combinación) que brinda la mayor protección empleando un modelo murino de infección con T.
cruzi. Como es bien sabido que las vacunas a DNA (con las que realizamos la identificación de los
22 candidatos originales) no son buenas inductoras de una respuesta inmune tipo B, es que
utilizaremos en nuestros próximos ensayos la metodología de inmunización "prime" (DNA) and
"boost" (proteína) para obtener una adecuada estimulación de las respuestas T y B. En esta primera
etapa, realizamos la expresión de 14 clones que fueron seleccionados en base a diferentes criterios:
i) presencia de epitopes T y B (identificados in silico, NetMHC 3.0 Server, Antigenic Emboss)
para maximizar la inducción de ambos tipos de respuesta (9 clones); ii) clones que codifican para
proteínas ya conocidas (prot. lisosomal/endosomal de membrana p67, prot. de la familia TcYasp,
prot. de superficie asociada a mucinas, prot. de la familia de las trans-sialidasas, etc.) (5 clones);
iii) clones que codifican para péptidos con dominios transmembrana (4 clones) y iv) presencia de
péptidos con alto índice de antigenicidad (2 clones). Sólo cinco de los péptidos pudieron ser
expresados a partir de su secuencia original, probablemente debido a que el grupo de clones
protectivos codifica para péptidos de bajo PM (4,2 - 21 kDa), lo cual hace muy difícil su expresión
y purificación en sistemas bacterianos. Por este motivo, los 9 clones restantes se re-clonaron,
incluyendo un mayor número de epitopes T, como fragmentos más grandes. Las proteínas se
expresaron utilizando los vectores pQE o pGEX, los cuales agregan una cola de poli-His o GST,
respectivamente, en el N-terminal de la proteína de interés permitiendo así su posterior
purificación. En resumen, en este trabajo hemos realizado el re-clonado y expresión de nuevos
candidatos vacunales de T. cruzi que serán utilizados en próximos ensayos de inmunización y
desafío.
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