Download Leer libro en PDF - Instituto Tomás Pascual Sanz

Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
Aplicación de
la Biotecnología
en la Ciencia Veterinaria
© Fundación Tomás Pascual y Pilar Gómez-Cuétara
INSTITUTO TOMÁS PASCUAL SANZ
Dirección postal y correspondencia: Paseo de la Castellana, 178, 3.º Derecha. Madrid 28046
Domicilio fiscal: c/ Orense, 70. Madrid 28020
Tel.: 91 703 04 97. Fax: 91 350 92 18
www.institutotomaspascual.es • [email protected]
© Real Academia de Ciencias Veterinarias
Maestro Ripoll 8 - Madrid 28006
Tel.: 91 561 77 99. Fax: 91 562 82 47
racveracve.es • www.racve.es
Coordinación editorial:
Alberto Alcocer, 13, 1.º D. 28036 Madrid
Tel.: 91 353 33 70. Fax: 91 353 33 73
www.imc-sa.es • [email protected]
Ni el propietario del copyright, ni el coordinador editorial, ni los patrocinadores, ni las
entidades que avalan esta obra, pueden ser considerados legalmente responsables de
la aparición de información inexacta, errónea o difamatoria, siendo los autores los responsables de la misma.
Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrónico o mecánico, incluyendo
las fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperación de almacenaje de información, sin permiso escrito del titular del copyright.
ISBN: 978-84-7867-202-8
Aplicaciones de la Biotecnología
en la Ciencia Veterinaria
Coordinador
D. Alfonso Perote Alejandre
Director de Proyectos del Instituto Tomás Pascual Sanz para la nutrición y la salud.
Autores
Dra. Cristina Acín Tresaco
Licenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Profesora Asociada de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza.
Dr. José Antonio Aínsa Claver
Profesor Titular de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Zaragoza.
Grupo de Genética de Micobacterias, CIBA, Universidad de Zaragoza.
CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).
Dr. Juan José Badiola Díez
Catedrático de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza.
Director del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Presidente del Consejo General de Colegios Veterinarios de España.
Dr. Carlos Barreiro Méndez
Investigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.
Responsable del Servicio de Proteómica.
Dra. Rosa Bolea Bailo
Licenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Profesora Titular de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza.
Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Hicham Filali
Licenciado en Biotecnología por la Facultad de Ciencias y Técnicas
de la Universidad Abdelmalek Essaadi de Tánger.
Becario del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dr. Carlos García Estrada
Investigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.
Responsable del Área de Biofarmacia y Biomedicina.
Dra. M.ª Carmen Garza García
Licenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dr. Jesús Gonzalo Asensio
Doctor en Bioquímica y Biología Molecular y Celular.
Investigador Programa Juan de la Cierva. Servicio de Microbiología
Hospital Universitario Miguel Servet,
IIS Aragón. Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina,
Universidad de Zaragoza. CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).
Carlos Alfonso Hedman Altamirano
Licenciado en Veterinaria por la Universidade Estadual Do Ceará (Brasil).
Becario del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Rodrigo Salomón Hernández Aco
Licenciado en Veterinaria por la Facultad de Veterinaria
de la Universidad Autónoma de Tlaxcala (México).
Becario del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
William Jirón Toruño
Profesor Titular de Anatomía Patológica de la Escuela
de Medicina Veterinaria de la UNAN-León (Nicaragua).
Profesor invitado del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
M.ª Belén Marín González
Licenciada en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Contratada del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dr. Carlos Martín Montañés
Catedrático de Microbiología de Universidad de Zaragoza.
Director Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina,
Universidad de Zaragoza.
CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).
Servicio de Microbiologia Hospital Universitario Miguel Servet, IIS Aragón
Dra. Eva Monleón Moscardó
Licenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Profesora Titular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza.
Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dra. Marta Monzón Garcés
Licenciada y Doctora en Ciencias Biológicas por la Universidad de Navarra.
Contratada Doctora Investigadora de la Universidad de Zaragoza.
Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dr. Bernardino Moreno Burgos
Licenciado y Doctor en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Investigador del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Profesor Asociado de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza.
Dra. Isabel Otal Gil
Profesora Titular de Microbiología, Facultad de Ciencias de la Salud y del Deporte,
Universidad de Zaragoza. Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina,
Universidad de Zaragoza. CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).
José Luis Pitarch Moré
Licenciado en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Becario del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dr. Martí Pumarola i Batlle
Licenciado en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza y
Doctor en Veterinaria por la Universidad Autónoma de Barcelona.
Dr. Elías F. Rodríguez Ferri
Catedrático de Sanidad Animal (Microbiología e Inmunología).
Universidad de León. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.
Dr. Antonio Rodríguez García
Investigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.
Servicio de Genómica, Transcriptómica y Análisis de Ácidos Nucleicos.
Dr. José Luis Rodríguez-Marín Roy
Teniente Coronel Veterinario Servicio de Bromatología
y Seguridad Alimentaria del Centro Militar de Veterinaria.
Jefatura de Apoyo Veterinario. Inspección General de Sanidad de la Defensa. MINISDEF.
Dra. Sofía Samper Blasco
Investigadora Senior del Instituto de investigación Sanitaria de Aragón.
Laboratorio de Investigación Molecular, Hospital Universitario Miguel Servet. IIS Aragón.
Grupo de Genética de Micobacterias, CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).
Dra. Rocío Sarasa Orcastegui
Licenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.
Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dra. M.ª Antonia Vargas Vargas
Licenciada en Medicina por la Universidad de Sevilla y Doctora en Veterinaria
por la Universidad de Zaragoza. Profesora Titular de la Universidad de Zaragoza.
Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías
y Enfermedades Transmisibles Emergentes.
Dr. Alberto Zamora Benito
Comandante Veterinario. Servicio de Bromatología
y Seguridad Alimentaria del Centro Militar de Veterinaria.
Jefatura de Apoyo Veterinario. Inspección General de Sanidad de la Defensa. MINISDEF.
Dr. José Luis Vega Pla
Teniente Coronel Veterinario. Director del Laboratorio de Investigación Aplicada.
Organismo Autónomo Cría Caballar de las Fuerzas Armadas. Ministerio de Defensa.
Dr. Ricardo Vicente Ullán
Investigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.
Responsable del Área de Energía y Medio Ambiente.
Índice
9
Prólogo
Ricardo Martí Fluxá
11
Prólogo
Dr. Elías F. Rodríguez Ferri
17
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa
a los métodos clásicos de detección y cuantificación
de microorganismos: aplicación al diagnóstico preventivo
en équidos
Dr. José Luis Vega Pla
35
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis
microbiológico de alimentos
Dr. José Luis Rodríguez-Marín Roy y Dr. Alberto Zamora Benito
57
Bases moleculares de la producción de antibióticos
beta-lactámicos
Dr. Carlos García Estrada
105
El glioma canino como modelo animal natural de los gliomas
humanos: estudio de las células madre cancerosas para
la determinación de nuevas dianas diagnósticas y terapéuticas
Dr. Martí Pumarola i Batlle
117
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
Dr. Jesús Gonzalo Asensio, Dra. Sofía Samper Blasco, Dr. José Antonio
Aínsa, Dra. Isabel Otal Gil y Dr. Carlos Martín Montañés
135
Las enfermedades priónicas, un antes y un después
para la seguridad de los alimentos
Dra. Marta Monzón, Dra. Cristina Acín, Dra. Rosa Bolea,
Dra. Eva Monleón, Dra. M.ª Antonia Vargas, Dr. Bernardino Moreno,
M.ª Belén Marín, Rodrigo Salomón Hernández,
José Luis Pitarch, Carlos Alfonso Hedman, William Jirón,
Hicham Filali, Dr. Rocío Sarasa, Dr. M.ª Carmen Garza
y Dr. Juan José Badiola
179
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
Dr. Ricardo Vicente Ullán
209
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso
de inmunosupresores. Nuevos retos de la biología molecular
Dr. Carlos Barreiro Méndez
237
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
Dr. Antonio Rodríguez García
253
Sanidad animal y biotecnología
Dr. Elías F. Rodríguez Ferri
Prólogo
Estimado lector,
En nuestro país, para la consecución de los objetivos y prioridades en investigación, desarrollo e innovación tecnológica a medio plazo, se establece un instrumento de programación y agenda en el sistema español de Ciencia,
Tecnología y Empresa que se denomina Plan Nacional de Investigación
Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (Plan Nacional de I+D+i).
En su epígrafe 8 se establecen las acciones estratégicas y los programas relacionados, y reconociendo la Biotecnología como su segunda acción estratégica.
El objetivo de ésta es “potenciar la participación española en el desarrollo de
una Bioeconomía basada en el conocimiento que mejore la competitividad de
nuestras empresas en los sectores de la salud, agroalimentarios, industriales y
que protejan y mejoren el medio ambiente”.
Según se explica en el citado documento “La Biotecnología es uno de los factores clave de la revolución de la economía basada en el conocimiento… La
investigación en este campo es una actividad muy importante para el éxito de
cualquier estrategia que se proponga mejorar la salud de los ciudadanos, la
mejora de la producción agraria, la alimentación, las tecnologías de producción, la generación de energía, el desarrollo sostenible y la conservación y mejora del medio ambiente.”
A su vez, el Plan Nacional de I+D+i establece las líneas de actuación en la estrategia de biotecnología:
“Línea 1. Biotecnología para la salud.
Línea 2. Biotecnología agraria y alimentaria.
Línea 3. Biotecnología industrial.
Línea 4. Bioenergía y desarrollo de biocombustibles.
Línea 5. Biotecnología ambiental.
Línea 6. Biología de sistemas, Biología sintética y Nanobiotecnología.”
Como seguramente usted ya ha deducido, toda esta introducción me ha servido para evidenciar la oportunidad e interés del libro que tiene entre sus
manos. Durante todo el año 2011 y 2012 celebramos, junto con la Real
Academia de Ciencias Veterinarias de España, un ciclo de conferencias titulado “Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria”, en la que se
trataron muchas de las líneas y sublíneas recogidas en el Plan Nacional de
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
10
Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (Plan Nacional de
I+D+i) comentado anteriormente.
Los autores, todos ellos de reconocido prestigio en investigación en sus diferentes campos, trataron en profundidad temas de la máxima actualidad en
Biotecnología tales como las nuevas metodologías de la genética molecular y
la genómica, su aplicación en la detección de enfermedades en animales de
producción, las aplicaciones de los microarrays y micromatrices, los nuevos
retos en ingeniería genética en el trasplante de órganos mediante inmunosupresores, la Biotecnología y bases moleculares de la producción de antibióticos, la utilización de modelos animales para comprender el mecanismo de
las células madre cancerígenas, las nuevas técnicas de análisis microbiológico
de alimentos, los avances en la comprensión de las enfermedades priónicas y
los retos en la erradicación de enfermedades reemergentes como la tuberculosis; posteriormente, los mismos autores recogieron estas conferencias y las
ampliaron en los documentos que han dado lugar a esta publicación digital.
Nuestro Instituto se caracteriza por ser un firme defensor de la divulgación científica para el público en general y también para aquellos que, siendo más especializados, reclaman la información de una forma rigurosa, veraz e independiente. Por ello, dedicamos una parte importante de nuestros esfuerzos a la
organización de ciclos de conferencias, cursos y seminarios relacionados con los
avances en la ciencia en la mayoría de los campos de la salud, con especial énfasis en las nuevas tecnologías; fruto de este ambicioso objetivo es este libro.
Es obligación para mí dedicar unas palabras de agradecimiento a todos los autores por el esfuerzo que supuso la preparación de todo este material y de sus
conferencias, sin ellos no habría sido posible esta obra. También quiero agradecer la aportación del Dr. Elías Rodríguez Ferri, Presidente de la Academia de
Ciencias Veterinarias de Castilla y León y Académico de Número de la Real
Academia de Ciencias Veterinarias de España, cuyo empeño, ayuda y desinteresado trabajo ha empujado de forma importante esta obra. El prólogo de esta
obra es suyo, así como un extenso capítulo en el que re recorre detalladamente
la importancia de la Biotecnología en nuestra sociedad a través de la Ciencia
Veterinaria, que es su vocación profesional.
Y por último, un sentido y póstumo reconocimiento a una magnífica persona,
gran profesor y amigo, el profesor Carlos Luis de Cuenca y Esteban, Presidente
de la Real Academia de Ciencias Veterinarias de España, principal impulsor de
esta iniciativa junto con nuestro Instituto, que falleció durante la celebración
del citado ciclo y al que deseamos dedicar esta obra. Descanse en paz.
Gracias.
Ricardo Martí Fluxá
Presidente Instituto Tomás Pascual Sanz
Prólogo
Representa para mí un gran honor y una oportunidad única, que agradezco,
tanto al Instituto Tomás Pascual Sanz, Fundación Tomás Pascual y Pilar GómezCuétara, como a la Real Academia de Ciencias Veterinarias de España, de presentar esta recopilación de textos recogidos con motivo de las Jornadas que
sobre la “Aplicación de la Biotecnología a las Ciencias Veterinarias”, patrocinadas por ambas instituciones, se celebraron a lo largo de 2011 en distintas
capitales de España (Córdoba, Valencia, Santander, Zaragoza, Lugo y León),
en las que intervinieron destacados especialistas de la universidad, centros tecnológicos y de investigación, y empresas.
Primero de todo es justo reconocer que fue el entusiasmo y buen hacer de
nuestro querido amigo y respetado Presidente de la RACVE, D. Carlos Luis de
Cuenca y Esteban a cuya memoria dedicamos este libro, el iniciador y gestor
principal de la idea, con la colaboración de D. Alfonso Perote, por parte de la
Fundación Tomás Pascual, en el marco del convenio de colaboración que mantenían ambas instituciones. El Dr. Cuenca, tuvo la gentileza de encargarme la organización de varias de las Jornadas que configuraron el periplo de la ‘Aplicación
de la Biotecnología a las Ciencias Veterinarias’ y a ello me dediqué con entrega,
coincidiendo con él, desde el primer momento, sobre la importancia e interés
del tema, que ya había sido con anterioridad objeto de manifestaciones por mi
parte, y que coincidía, a propuesta del Rector de la Universidad de León, con el
encargo de dirigir los destinos del Instituto de Biotecnología de León, INBIOTEC.
En cualquier caso, por mi especialidad (Microbiología e Inmunología, parte de
la Sanidad Animal), nada podía resultar más atractivo.
Las Ciencias Veterinarias, la Veterinaria, es una profesión milenaria cuya aparición coincide con el comienzo de la domesticación animal. Su progreso, en la
antigüedad, estuvo ligado principalmente a los équidos, cuyo papel fundamental
en los ejércitos, el transporte y las labores agrícolas exigía disponer de animales
en buenas condiciones de uso, lo que impuso la necesidad de desarrollar métodos y técnicas dirigidas a su cuidado y a combatir o mitigar sus dolencias. En
la etapa más reciente, los antiguos albéitares cedieron el testigo a los modernos
veterinarios, surgidos de las primeras Escuelas de Veterinaria, con el encargo
principal de organizar y coordinar la lucha contra las grandes enfermedades de
los animales, como la peste bovina. Los veterinarios fueron de los primeros profesionales que abrazaron con convicción en las postrimerías del siglo XIX las
nuevas doctrinas de Pasteur y Koch, que abrieron el camino a la teoría microbiana de las enfermedades infecciosas y a la aplicación de recursos de interés
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
12
diagnóstico y preventivo-curativo (desarrollo de vacunas y sueros) para su lucha
y control. No en vano fueron animales los modelos en los que se apoyaron los
primeros descubrimientos, como en los casos del carbunco bacteridiano, el cólera aviar, el mal rojo porcino, la rabia y otros muchos. Durante el siglo XX se produjeron grandes y revolucionarios descubrimientos científicos, y las profesiones
se abrieron a campos nuevos. La Medicina Veterinaria tradicional, por ejemplo,
amplió sus horizontes a la Producción Animal, incluyendo la nutrición, la mejora,
la identificación, la etología, etc., y a la Higiene, Inspección y Tecnología de los
Alimentos, buscando cualidades que mejorasen sus propiedades, abaratasen su
costo de producción, estableciesen nuevos procedimientos de conservación y
asegurasen su inocuidad; en la Medicina Veterinaria tradicional, también el amplio campo de las enfermedades producidas por agentes patógenos de todas
las naturalezas (bacterias, hongos, protozoos, virus, helmintos o priones), que
en los últimos años, y como consecuencia de alarmas de gran trascendencia,
han configurado muchas novedades de interés.
Los años 40 y 50 fueron especialmente fértiles en descubrimientos científicos.
Avery, MacLeod y McCarty demostraron en 1944 que el ADN era el material genético, y Watson y Crick, en 1953, establecieron su estructura en doble hélice.
A ello se sumó en 1960 el descubrimiento de la polimerasa, la enzima que define el sitio de inicio de la síntesis del ácido desoxirribonucleico. A partir de aquí,
los acontecimientos se han sucedido de forma vertiginosa, hasta llegar a la secuenciación del genoma de la primera bacteria en 1997 y del genoma humano
en 2001. El descubrimiento de la renaturalización o hibridación del ADN en 1961
después de su desnaturalización por calentamiento marcó el comienzo de todas
las técnicas de hibridación. La utilización de enzimas capaces de cortar el ADN
en secuencias específicas (palindrómicas) permitió obtener y estudiar fragmentos,
lo que, unido al descubrimiento de otras enzimas (ADN ligasa) capaces de unir
fragmentos separados, condujo a estudios de recombinación in vitro y dio origen
a la tecnología del ADN recombinante, es decir, a la Ingeniería Genética o, lo
que es lo mismo, a la Biotecnología Moderna. Decimos Biotecnología Moderna
porque el término ya había sido utilizado en 1919 para describir procesos de obtención de productos a partir de distinto tipo de materias primas, con el concurso de organismos vivos. Su desarrollo se produjo cuando se incorporaron técnicas que permitieron la selección y extracción de fragmentos del ADN de un
microorganismo introduciéndolos después en otro, haciendo que este expresara
y produjera moléculas ajenas. La Ingeniería Genética hizo de la Biotecnología
una ciencia principal, permitiendo una nueva revolución biológica. En esencia,
la Biotecnología supone la aplicación de métodos y técnicas derivadas de la investigación en biología molecular y celular, microbiología, parasitología, inmunología, bioquímica, epidemiología, bioinformática y otras disciplinas afines, utilizadas donde quiera que se utilicen microorganismos (bacterias, virus, hongos,
protozoos, etc.) o células (vegetales o animales).
Prólogo
13
El desarrollo más espectacular de la Biotecnología se produjo en el campo de
la fabricación de medicamentos y vacunas, y en la obtención de cultivos y animales modificados genéticamente con el propósito de producir alimentos, pero
en la actualidad su campo de trabajo se ha diversificado mucho más. Desde
la síntesis biotecnológica de insulina por recombinación genética en Escherichia
coli, en 1978, ha tenido lugar una carrera de vértigo para obtener nuevos productos que hoy incluyen hormonas, proteínas de interés, antibióticos, antitumorales, antiparasitarios, anticuerpos monoclonales y un sinfín de moléculas
más. Se ha generado, así, una pujante industria que representa ya un sector
estratégico para muchos países y que, por su bajo coste, supone también una
oportunidad para los países en desarrollo.
Las Ciencias Veterinarias se ocupan de cuanto tiene que ver directa o indirectamente con los animales y sus relaciones útiles para el hombre. De este modo,
la columna vertebral de las Ciencias Veterinarias es médica (Medicina
Veterinaria), incluyendo las patologías producidas por agentes infecciosos (y
agentes de zoonosis) y no infecciosos, igual que las de naturaleza espontánea,
como consecuencia del envejecimiento, traumatismos, exposición a agentes
físicos o químicos o el medio ambiente, pero los otros capítulos se ocupan de
los animales sanos, vistos desde la óptica de su utilidad como productores de
alimentos o útiles por una larga lista de motivos diferentes (animales de compañía, de ocio, de trabajo, de experimentación, salvajes, etc.), consagrados
por el deseable bienestar y la mayor rentabilidad de sus producciones, su mejora genética dirigida a las opciones que en cada caso correspondan, incluyendo también la industria derivada del ocio para el hombre, y finalmente, el
capítulo que se refiere a los alimentos para el hombre y los animales, desde la
tecnología de su producción y conservación a su higiene y seguridad, para el
consumo humano o animal, respectivamente.
Cualquiera que sea la óptica con la que se decida analizar las Ciencias
Veterinarias, se puede afirmar, sin temor a equivocarse, que está detrás la
Biotecnología o que esta puede colaborar a su desarrollo con ventaja, y ello
independientemente del campo objeto de análisis. En el plano médico, la
Biotecnología proporciona recursos que facilitan el conocimiento de las causas
de enfermedad y sus consecuencias, las interacciones entre los agentes de enfermedad y la respuesta orgánica (innata y adquirida), permite conocer en profundidad los caracteres de los agentes patógenos que intervienen en la génesis de las enfermedades, la base genética de los factores de virulencia y las
complicadas reacciones que configuran la respuesta inmune. La Biotecnología
permite el desarrollo de herramientas e instrumentos útiles para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención (fármacos antimicrobianos, antiparasitarios o antitumorales, pongamos por caso, vacunas más precisas, más seguras
y más eficientes), incluyendo el desarrollo, hoy todavía a nivel experimental,
de estrategias que representarán alternativas en los próximos años para el con-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
14
trol de todo tipo de enfermedades. No se puede entender la vigilancia epidemiológica, la Epidemiología en el más vasto de los sentidos, aplicada a cualquier actividad, sin recurrir a la Biotecnología. La OIE se ha referido, en relación con la Biotecnología, al desarrollo de estudios cuantitativos de genética
de poblaciones para la investigación de marcadores de caracteres de interés
sanitario, a los estudios de genómica funcional para las interacciones patógeno-hospedador, al desarrollo de herramientas para el diagnóstico y control
de las enfermedades de los animales y al apoyo integral en las Ciencias
Veterinarias.
En Producción Animal tampoco puede entenderse la mejora de las especies domésticas y útiles sin la integración de la Biotecnología, mejorando los caracteres
que más convienen, generando incluso procedimientos de selección basados en
características de resistencia natural a las enfermedades o permitiendo conocer
los mejores métodos de manejo que faciliten la expresión del caudal genético
para lograr éxitos en cualquier campo. La Biotecnología, aquí, modifica genéticamente cultivos vegetales productores de alimentos, especialmente con destino a los animales, pero también al hombre, como sucede en el caso del maíz
resistente a diferentes plagas, cuya primera variedad comercial se obtuvo ya en
1996, o el de otras materias primas, cuya lista aumenta continuamente. Todavía
más, la Biotecnología es una pieza inexcusable en la recuperación de especies
en peligro de extinción, en este caso animales, pero también vegetales, mediante
la creación de bancos de germoplasma, una garantía para la creciente pérdida
de biodiversidad que la civilización trae consigo.
De todos son conocidos los éxitos logrados por la Biotecnología en materia de
reproducción, iniciados en 1997 con la clonación de la famosa oveja Dolly (a
partir de una célula única, procedente de una oveja adulta), aunque muchos
de los resultados en esta y otras especies no han dejado satisfechos a todos,
pero ahí están, sin embargo, los resultados de la transgénesis relativos a la hormona del crecimiento que han permitido obtener animales con mayor crecimiento, mayor producción cárnica, como es el caso de cerdos que no solo
crecen más y más rápido, sino que incorporan a sus tejidos menos grasa. En
el caso de los peces, se han obtenido truchas y salmones en los que se ha reducido el periodo de crecimiento necesario para la comercialización, con mayores tamaños y pesos. De igual modo, la Biotecnología es clave para el desarrollo de modelos animales con modificaciones genéticas dirigidas, que
permiten su uso en experimentos destinados a la Medicina (Humana y Animal),
y en cualquier caso, la Ciencia de los Animales de Experimentación ha contribuido a lo largo de los años, y lo sigue haciendo, al desarrollo de la Biología y
la Medicina.
Y otro tanto sucede en el campo de los alimentos para consumo humano o
animal, en el que la Biotecnología contribuye al desarrollo de herramientas
Prólogo
15
que permiten la vigilancia de su seguridad e inocuidad y, en último término,
también su control. La industria alimentaria fía de la Biotecnología, antes de
forma empírica y ahora con base científica conocida, más segura y eficaz,
que aporta a los alimentos el valor añadido de su procesado, transformación y conservación, poniendo al alcance del consumidor gamas de productos
de mayor calidad, más seguros, diversos y apetecibles, y todo ello mediante
la intervención de agentes microbianos seleccionados de forma natural o
transformados por intervención humana para orientar tal o cual actividad
deseable. Apurando la esencia de la industria alimentaria, podría afirmarse
que ha sido (y sigue siendo) desde su origen, consecuencia de la
Biotecnología, aunque cuando ni tan siquiera se sospechara la intervención
microbiana, como sucede en el caso del pan, las bebidas alcohólicas, los derivados lácteos, etc. ¿Cómo podría hoy entenderse, en fin, la industria alimentaria sin el concurso de iniciadores, de sensores biológicos, probióticos,
prebióticos e innumerables productos más, cuyo origen o aplicación es biotecnológico? Y esto solamente considerando los aspectos que se refieren a
modificaciones buscadas, a los que si se suma la infinidad de recursos originados igualmente a partir de la Biotecnología para garantizar su inocuidad
o vigilar puntos o etapas de riesgo, configura un todo que de ningún modo
puede prescindir de ella.
En el campo de la Salud Pública y la Sanidad Animal, a las que ya nos hemos
referido, todo es de aplicación o aplicable, particularmente respecto del estudio de la patogénesis, diagnóstico, prevención y tratamiento. Dicho queda.
En la actualidad, las perspectivas no pueden ser más alentadoras. El sector de
las bioempresas, en España (sociedad ASEBIO), por ejemplo, supera ya las mil
empresas, y en casi la mitad la biotecnología es actividad principal o exclusiva,
con una cifra de negocio que supera los 50.000 millones de euros, contribuyendo de forma transversal en sectores muy diversos, identificados por lo que
hoy conocemos como Biotecnología Roja, Blanca, Gris, Verde o Azul; distintas
orientaciones para un núcleo común de inmejorables expectativas.
En España, la Biotecnología es considerada por el Plan Nacional de
Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica, una prioridad estratégica, “uno de los factores clave de la revolución de la economía basada
en el conocimiento… cuyo avance potencia nuevas disciplinas científicas,
aporta respuestas y genera aplicaciones socioeconómicas múltiples... la investigación en este campo es una actividad muy importante para el éxito de cualquier estrategia que se proponga mejorar la salud de los ciudadanos, la mejora de la producción agraria, la alimentación, las tecnologías de la
producción… podemos afirmar que la Biotecnología no es una ciencia per se,
sino que aglutina varias disciplinas, como agricultura, biología, bioquímica, genética, ingeniería, medicina, microbiología, veterinaria, etc.”.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
16
Poco más se puede añadir para justificar el acierto de las Jornadas sobre la
“Aplicación de la Biotecnología a las Ciencias Veterinarias”. La respuesta obtenida en las intervenciones realizadas por los especialistas que participaron
en las mismas, de forma especial en aquellos lugares en los que coincidían
centros relacionados con la formación veterinaria, pone de manifiesto la inquietud de las nuevas generaciones por estos campos tan atractivos.
Vaya desde aquí nuestra felicitación a los organizadores, el agradecimiento a
los participantes y el deseo de que acontecimientos como estos puedan seguir marcando la pauta en el futuro de las Ciencias Veterinarias.
Dr. Elías F. Rodríguez Ferri
Presidente de la Academia de Ciencias
Veterinarias de Castilla y León
Amplificación de ADN a tiempo real,
una alternativa a los métodos
clásicos de detección y cuantificación
de microorganismos: aplicación
al diagnóstico preventivo en équidos
Dr. José Luis Vega Pla
Introducción
Las pruebas de diagnóstico basadas en las
tecnologías de amplificación de ácidos
nucleicos están adquiriendo cada vez más
importancia e interés en los laboratorios
de Microbiología clínica desde hace algunos años. La aplicación de este tipo de
tecnología, combinada con métodos eficientes de extracción y de preparación de
las muestras, puede proporcionar ventajas
muy importantes sobre los métodos tradicionales en términos de sensibilidad,
simplicidad y rapidez. La aceptación de
este tipo de pruebas ha estado también
condicionada al desarrollo de kits comerciales que faciliten las labores de diagnóstico (David et al., 2010).
Sin embargo, la implantación masiva de
esta tecnología no es tan rápida como a
los microbiólogos les gustaría. Se están
publicando numerosos trabajos científicos
proponiendo protocolos cada vez más precisos y sofisticados, pero validar una técnica para que se pueda confiar plenamente en su sensibilidad y especificidad es
una tarea muy complicada. Uno de los
casos más relevantes que ha dado un impulso a la investigación y desarrollo de
nuevas pruebas fue la propuesta oficial de
un protocolo de detección de micoplasmas en la producción de vacunas de
origen vírico en EE.UU., aunque dicha propuesta parecía estar condicionada al fracaso de los métodos tradicionales: “in
some cases, culture-based procedures
cannot be used due to an inability to completely neutralize vaccine viruses, thus necessitating the use of PCR-based assays to
test for mycoplasma in these products”
(Center for Biologics Evaluation and
Research, 2010). En 2007, la Farmacopea
Europea aceptó este tipo de pruebas
como una alternativa a los métodos tradicionales de detección de Micoplasma spp.
después de una validación del método.
Durante los últimos 25 años se han desarrollado muchas metodologías para el análisis de los ácidos nucleicos con fines diagnósticos, siendo la reacción en cadena de
la polimerasa o PCR (Polimerase Chain
Reaction) la más empleada. El proceso incluye tres pasos fundamentales: la extracción, la amplificación y la detección. El
paso de la extracción del ADN, que servirá
como diana y molde para el desarrollo de
la PCR, es crítico, habiéndose diseñado
multitud de protocolos, kits comerciales y
diversos aparatos que facilitan la productividad de los laboratorios. El paso de am-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
18
plificación persigue generar multitud de
copias fieles a la original, para lo que se
usan diversos reactivos y tampones cuya
selección y proporciones influyen directamente en esta fidelidad y rendimiento de
la reacción. Finalmente, hay un paso de
detección del producto amplificado que
con ayuda de patrones y controles debe
ser capaz de tipificarlo e identificarlo
inequívocamente, se emplean sistemas
de electroforesis, inmunológicos o se detecta el producto directamente mediante
el empleo de sustancias fluorescente
(http:// www.bioqtforum.com/295).
La PCR fue desarrollada por Kary Mullis en
los años 80 y muy rápidamente llegó a ser
una de las técnicas más ampliamente
usadas por varias razones de peso: era rápida, económica y simple, aportando el potencial de amplificar copias de ADN procedentes de pequeñas cantidades de material
biológico de muy diverso origen e incluso
de baja calidad. El nombre de la técnica
proviene de la enzima polimerasa de ADN
empleada durante la reacción para producir miles o millones de copias de ADN in
vitro. Cada una de las copias tiene la propiedad de servir de molde para el siguiente
ciclo de amplificación, de aquí su nombre
de reacción en cadena. Así, la secuencia
diana original se copia en el primer ciclo,
se multiplica por dos en el siguiente ciclo y
así sucesivamente para generar millones de
copias después de 30 o 40 ciclos (figura 1).
Los requerimientos de la PCR son básicamente cuatro: ADN molde procedente de
la muestra; una enzima polimerasa de
ADN, siendo la más común la procedente
de una bacteria denominada Thermus
aquaticus, que tiene la propiedad de soportar las fuertes variaciones de temperatura de la reacción sin deteriorarse excesi-
vamente; cebadores, que son una pareja
de oligonucleótidos que delimitan la secuencia a amplificar, y los dideoxinucleótidos, que son los que después de pasar del
estado trifosfato al monofosfato darán
lugar a la secuencia complementaria del
ADN diana. Se requiere también un instrumento capaz de calentar y enfriar la reacción en cada ciclo de una manera precisa
y un medio adecuado para que la reacción
se lleve a cabo.
Figura 1. Esquema del proceso de amplificación
mediante PCR (http://www.nanodic.com).
La PCR convencional requiere que, para detectar el producto amplificado, el tubo de
la reacción sea abierto para someterlo a diferentes tipos de pruebas, fundamentalmente electroforesis; esta circunstancia le
confiere una gran desventaja, pues los pequeños fragmentos de ADN producidos
son susceptibles de formar aerosoles mediante las técnicas de pipeteo y manipulación y contaminar el ambiente, reactivos e
incluso muestras. Higuchi y col. (1993) publicaron las características de la primera PCR
cuantitativa a tiempo real (qPCR), que permite el análisis de los productos amplificados a medida que transcurre la reacción,
lo cual representó un salto tecnológico importante; esto se consigue incorporando
una serie de fluorocromos que se activan
con el producto amplificado y son suscep-
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
19
nomina RT-PCR. En algún momento también se le ha denominado a la PCR en
tiempo real RT-PCR (Real Time PCR), por
esa razón es necesario denominar las dos
reacciones de forma diferente, qPCR para
la PCR en tiempo real y RT-PCR para retrotranscripción de ARN seguido de una PCR.
De esta manera, cuando se emplea una
qPCR posteriormente a una retrotranscripción de ARN en ADN se puede referir
como RT-qPCR para evitar equivocaciones.
tibles de ser detectados por el propio instrumento donde se desarrolla la reacción;
también se pueden incorporar oligonucleótidos marcados que se hibridan con la
secuencia amplificada, añadiendo un grado
más de especificidad a la reacción. Además,
mediante el uso de muestras de referencia,
la qPCR permite inferir la cantidad de partida de dicho ADN (figura 2).
Las polimerasas termoestables de ADN requieren ADN como materia, sin embargo,
en ocasiones es necesario detectar la presencia de algún virus cuyo genoma esté
constituido por ARN, y también es muy interesante poder acceder a secuencias de
ARN ribosomal altamente conservadas
entre especies de microorganismos. En
estos casos se recurre a un primer paso, denominado retrotranscripción o transcripción inversa, durante el cual el ARN de la
muestra es transcrito a ADN. A la retrotranscripción seguida de una PCR se le de-
La técnica de la PCR en tiempo
real o PCR cuantitativa (qPCR)
La qPCR pone de manifiesto la cantidad
de ADN presente en cada ciclo de amplificación mediante el uso se flouróforos.
Durante la amplificación, la rapidez con
que la señal fluorescente alcanza el nivel
umbral (Threshold level) se correlaciona
con la cantidad inicial de ADN molde, per-
45
40
Fase Meseta
Fluorescencia
35
30
25
Fase
Exponencial óptima
20
15
Fase
Exponencial
inicial
Fase Lineal
10
5
0
Figura 2.
0
5
10
15
20
Ciclo
25
30
35
40
45
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
20
mitiendo de esta manera poder cuantificarlo. El número de ciclos necesarios para
que la señal fluorescente alcance el nivel
umbral se conoce como Threshold cycle
(Ct) o ciclo de cuantificación (Cq), y es el
parámetro en el cual se fundamenta la
cuantificación. A mayor Cq, menor será
la cantidad de ADN molde o diana inicial.
En los últimos años el número de casas
comerciales que ofrecen instrumentos y
reactivos para qPCR, sumado a la inmensa
cantidad de trabajos científicos publicados, ponen en evidencia la importancia
de esta tecnología.
Por lo tanto, el incremento de la señal de
fluorescencia es proporcional a la cantidad
de ADN doble hebra presente en el tubo
de reacción y la misma se mide al final de
la fase de extensión de la PCR (figura 3).
Su principal desventaja es la inespecificidad, ya que se une independientemente
de la secuencia del ADN, pudiendo generar resultados falsos positivos al detectar ADN espurios, como son, por
ejemplo, los dímeros de cebadores de la
reacción. Una forma de asegurar en estos
casos la especificidad de la detección es
analizando las curvas de disociación.
Una de las ventajas fundamentales de la
qPCR en relación a la PCR tradicional de
punto final es que en la primera las mediciones se realizan en la etapa exponencial de la reacción donde, en teoría, por
cada ciclo de amplificación se acumula el
doble de producto respecto al ciclo anterior, asumiendo una eficiencia del 100%.
Por el contrario, en la PCR de punto final
la detección del producto de amplificación se realiza en la fase de meseta de la
reacción, donde la misma ya se detuvo;
por lo tanto, las medidas realizadas en
esta fase no ofrecen resultados fiables en
cuanto a la cantidad inicial de ADN molde
de la muestra. Otras ventajas de la qPCR
son la rapidez en la obtención de resultados, el amplio rango dinámico de cuantificación, la seguridad al evitar la manipulación del producto amplificado.
Por otra parte, están los sistemas de identificación basados en oligonucleótidos fluorescentes. Básicamente se encuentran marcados con dos flourocromos (reporter y
quencher) que interfieren entre sí mientras
están próximos, de forma que mediante hidrólisis o hibridación se separan o se juntan
ambos y uno de ellos emite luz a una determinada longitud de onda detectable con el
instrumento adecuado (figura 4). Hay varios
sistemas basados en sondas fluorescentes,
los más conocidos son: TaqMan® probes,
Molecular Beacons®, Hybridization probes,
Locked Nucleic Acid (LNA) probes, LightUp
probes, etc. En cada caso, múltiples colorantes fluorescentes (p. ej.: Fluorescein,
6-FAM, JOE, VIC, Cal Fluor, etc.) pueden ser
utilizados con una variedad de inhibidores
(p. ej.: TAMRA, DABCYL, BHQ, etc.).
Dentro de los flouróforos, el más utilizado
es el SYBR Green I®, que tiene la propiedad de unirse al ADN doble hebra de
manera inespecífica, emitiendo hasta
1.000 veces más fluorescencia cuando se
encuentra unido al ADN que cuando está
libre en solución (absorbe luz de 480 nm
de longitud de onda y emite a 520 nm).
Es importante, cuando se diseña el sistema de amplificación a utilizar, tener en
cuenta las ventajas y desventajas que presentan las diferentes opciones descritas.
Utilizando sistemas basados en sondas
fluorescentes, se suma la posibilidad de
llevar a cabo reacciones multiplex, que
tanta relevancia tienen a nivel diagnóstico
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
21
Figura 3. Sistema de detección mediante el uso
de fluorocromos intercalantes
(http://classic.the-scientist.com).
Figura 4. Sistema de detección mediante hidrólisis de
sondas específicas (http://classic.the-scientist.com).
por su rapidez y economía. Sin embargo,
es una técnica más cara y menos sensible,
aunque en la mayoría de los casos es la
de elección por su alta especificidad.
minan el número de ciclo en el cual la fluorescencia alcanza el valor umbral (Cq). Este
valor de Cq es inversamente proporcional
a la cantidad inicial de la secuencia específica del ADN a cuantificar, en la muestra
original. A partir del mismo, el software realiza los cálculos de cuantificación.
Hay una amplia variedad de equipos adecuados para qPCR, que consisten en un
termociclador para realizar la reacción y
una parte óptica. La química elegida y el
equipo están íntimamente relacionados.
Hay tres formas básicas en que los instrumentos pueden aportar la energía de excitación para los fluoróforos: mediante
lámparas, diodos o láser, combinados con
distintos tipos de fotodetectores para
medir la fluorescencia emitida (figura 5).
Además es imprescindible el empleo de un
ordenador que posea un software apropiado para la recolección y análisis de los
datos generados. Las curvas de amplificación generadas por dicho software deter-
Un tipo de cuantificación es la absoluta,
que se utiliza para cuantificar muestras
desconocidas por interpolación a partir de
Figura 5. Sistema de excitación y detección en un
termociclador (www.quigen.com).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
22
una curva estándar, generada a partir de
diluciones en serie de una muestra de
concentración conocida del ADN blanco.
La cuantificación relativa es utilizada para
analizar cambios en la expresión de un
gen en una muestra dada en relación a
otra muestra de referencia, por ejemplo,
en respuesta a un tratamiento. Esas
muestras de referencia contienen genes
invariables (genes de referencia o housekeeping), los cuales normalmente no sufren cambios bajo las condiciones experimentales, sirviendo por lo tanto como
estándares internos.
Las aplicaciones más importantes de esta
tecnología, además de incluir las de la
PCR convencional, son, entre otras, los estudios de la expresión génica (RT-qPCR),
detección y cuantificación de microorganismos, identificación de mutaciones o
polimorfismos de base simple (SNP), etc.
Áreas como la Microbiología, Genética y
Farmacogenética, Oncología y Trasplante
se han visto beneficiadas por la implementación de la qPCR. Otros campos de
aplicación de esta tecnología de gran potencial son: Agricultura, Veterinaria,
Alimentos y Medicina Forense.
En definitiva, cualquier necesidad de medición rápida y precisa de pequeñas cantidades de ácidos nucleicos representa un
futuro potencial para innovaciones basadas en qPCR.
Guía MIQE para publicaciones
científicas con ensayos qPCR
La popularidad que ha ido adquiriendo la
qPCR se ha traducido en la aparición de
numerosas publicaciones científicas donde
se describen diversos protocolos, reactivos,
metodologías de análisis estadístico y
donde se presentan los resultados con diferentes formatos. Esta importante falta de
consenso sobre cómo desarrollar de la
mejor manera un experimento basado en
qPCR ha tenido como consecuencia la publicación de trabajos con graves deficiencias de diseño y escasa información técnica
que hacen poco reproducibles los experimentos y poco creíbles los resultados en
numerosas ocasiones (Bustin et al., 2009).
Algunas de estas deficiencias tienen que
ver con las muestras y su preparación; en
ocasiones no se tiene en cuenta el tipo de
almacenamiento (crítico para estudios de
ARN mensajero), o el protocolo de extracción no es el adecuado, proporcionando
un rendimiento muy bajo de la cantidad de
ácidos nucleicos obtenidos. Otro tipo de
deficiencia es una selección de los cebadores y sondas inadecuada que hace que
la técnica sea poco robusta. Finalmente, se
emplean a menudo tratamientos estadísticos inadecuados que arrojan resultados
poco creíbles. El problema se exacerba por
la escasa información proporcionada en
muchas publicaciones, que impiden al
lector evaluar de forma crítica la calidad de
los resultados presentados o la repetición
de los experimentos.
En este sentido Bustin y col. (2009) elaboraron una guía para autores, revisores y
editores, con especificaciones acerca de la
mínima información que debería ser proporcionada en una publicación con experimentos basados en qPCR para asegurar
su relevancia, precisión, correcta interpretación y repetibilidad; a esta guía se la denomina MIQE por las siglas en inglés de
Minimum Information for Publication of
Quantitative Real-Time PCR Experiments.
Sin embargo la supuesta “mínima” infor-
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
23
mación es tan exhaustiva que la aplicación
de la guía MIQE se hace tan compleja que
Bustin y col. (2010) publicaron una serie de
recomendaciones para aplicarla, incluyendo una lista de chequeo útil para editores, revisores y autores (tabla 1).
Tabla 1. Relación de aspectos que deben revisarse para publicar una técnica qPCR de
nuevo diseño según las recomendaciones de Bustin y col. (2009).
Sample/Template
Source
Method of preservation
Storage time (if appropriate)
Handling
Extraction method
RNA: DNA-free
Concentration
RNA: integrity
Inhibition-free
Details
If cancer, was biopsy screened
for adjacent normal tissue?
Liquid N2/RNAlater/formalin
If using samples > 6 months old
fresh/frozen/formalin
TriZol/columns
Intron-spanning primers/no RT control
Nanodrop/ribogreen/microfluidics
Microfluidics/3':5' assay
Method of testing
Assay optimisation/validation
Accession number
Amplicon details
Primer sequence
Probe sequence*
In silico
empirical
Priming conditions
PCR efficiency
Linear dynamic range
Limits of detection
Intra-assay variation
RefSeq XX_1234567
exon location, amplicon size
even if previously published
identify LNA or other substitutions
BLAST/Primer-BLAST/m-fold
primer concentration/annealing temperature
oligo-dT/random/combination/target-specific
dilution curve
spanning unknown targets
LOD detection/accurte quantification
copy numbers not Cq
RT/PCR
Protocols
Reagents
Duplicate RT
NTC
NAC
Positive control
detailed description, concentrations, volumes
supplier, Lot number
ΔCq
Cq & melt curves
ΔCq beginning:end of qPCR
inter-run calibrators
Data analysis
PSpecialist software
Statistical justification
Transparent, validated normalisation
e.g., QBAsePlus
e.g., biological replicates
e.g., GeNorm summary
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
24
Diseño e implantación de la
qPCR en los laboratorios de
Microbiología
Las técnicas de análisis de ácidos nucleicos
y en concreto la qPCR se han extendido y
se ha incrementado su uso en muchos laboratorios; sin embargo, su implantación
en laboratorios de Microbiología está
siendo relativamente lenta. Los principales
obstáculos se han descrito recientemente
(Denoya, 2009):
• Universalidad: frecuentemente se necesita disponer de la capacidad para detectar todos los posibles microorganismos
que se encuentran contaminando una
muestra. Se plantean una serie de cuestiones acerca de si los cebadores empleados son lo suficientemente universales o
si se puede aplicar la qPCR en forma múltiple.
• Límite de detección: aún no está claro
si la qPCR puede proporcionar mayoritariamente una probabilidad superior de
detectar unidades formadoras de colonia a la alcanzada con los métodos de
cultivo tradicionales.
• Microorganismos viables no cultivables y
muertos: se plantea la duda sobre si hay
suficientes protocolos de qPCR para discriminar metabólicamente entre células
durmientes, viables y muertas, lo que
puede influir en un diagnóstico preciso.
• ADN de fondo: el ADN extraído junto al
ARN puede dar lugar a falsos positivos
en lo que se refiere a las técnicas de RTPCR.
• Contaminaciones cruzadas: la PCR es
muy sensible a contaminaciones cruzadas y sobre todo a contaminaciones
de producto amplificada que pueden
dar falsos positivos y, en algunos casos
falsos negativos, por la inhibición de la
amplificación de la muestra en favor de
otras secuencias.
¿Cuáles son entonces los criterios elementales que se deben aplicar para confiar en
un ensayo determinado? La selección
adecuada de muestras, la instrumentación calibrada y la metodología pertinente
para lograr el fin perseguido son elementos de importancia crítica en la validación de pruebas. La continuidad de los
experimentos queda asegurada cuando
se escogen las muestras y los reactivos, se
preparan de forma adecuada, divididas en
alícuotas y almacenadas para su uso en
cada experimento. Eso reduce al mínimo
el número de variables, ayuda a prevenir
fallos una vez iniciado el proceso de validación. Este enfoque reduce la variabilidad y proporciona los datos necesarios
para establecer controles adecuados a fin
de asegurarse de que cada aplicación de
la prueba es válida.
La puesta a punto de un protocolo de
qPCR incorpora un escenario no contemplado en los criterios de validación clásicos. Se trata de usar las herramientas y
algoritmos de comparación de secuencias
que permiten conocer si un fragmento de
ADN concreto se encuentra representado
en otras partes del genoma del individuo
o en cualquier otro espécimen previamente secuenciado. Hay diferentes bases
de datos públicas y privadas que se están
alimentando continuamente con secuencias de microorganismos, muchos de ellos
implicados en las enfermedades descritas,
como GenBank NCBI (National Center for
Biotechnology Information), EMBL
(European Molecular Biology Laboratory),
RDP (Ribosomal Database Project), RIDOM
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
25
(Ribosomal Differentiation of Medical
Microorganisms), MicroSeq (Applied
Biosystems) y SmartGene IDNS (Integrated
Database Network System). Este marco de
comparación permite escoger las secuencias dianas más convenientes. A la vez
que se publican trabajos con propuestas
de protocolos de diagnóstico, se pueden
tomar las secuencias propuestas para amplificar y compararlas con nuevas que van
apareciendo en las bases de datos. De
esta manera se observa si mutaciones
puntuales pueden afectar a la especificidad o sensibilidad de la técnica propuesta.
El diseño de una qPCR que ofrezca garantías de especificidad, sensibilidad, robustez y repetibilidad pasa por el empleo
de modernas herramientas basadas en la
secuenciación del ADN, manejo de bases
de datos y programas informáticos que
incorporen sofisticados algoritmos para
calcular posibles acoplamientos y reordenamientos de los oligonucleótidos que se
emplean en la qPCR.
Una de las regiones diana más empleadas
en bacteriología es la responsable de la codificación del ARN ribosómico (Rodicio y
Mendoza, 2004). Los tipos de ARN ribosómico se han venido denominando tradicionalmente según su coeficiente de sedimentación, medido en svedbergs (S). De esta
manera, en organismos procariotas existen
tres ARN ribosómicos distintos (5S, 16S y
23S) y en organismos eucariotas cuatro
(5S, 5'8S, 18S y 28S). Los genes para el
ARN ribosomal están entre los más estables e inmutables genes conocidos. Hay
mutaciones viables, pero no frecuentemente. En particular, los genes de la
unidad pequeña del ARN (16S en procariontes o 18S en eucariontes) se usan ex-
tensivamente para comparar organismos
vivos, tan diversos como bacterias, hongos
y eucariotas. Cada región codificante de
ARN ribosómico incluye genes para los
ARNr 23S, 16S y 5S, separados por regiones espaciadoras o intergénicas.
El análisis de la secuencia de los ARNr 16S
de distintos grupos filogenéticos reveló un
hecho adicional de gran importancia práctica: la presencia de una o más secuencias
características que se denominan oligonucleótidos firma. Se trata de secuencias
específicas cortas que aparecen en la
mayor parte de los miembros de un determinado grupo filogenético, y raramente están presentes en otros grupos,
incluidos los más próximos. Por ello, los
oligonucleótidos firma pueden utilizarse
para ubicar a cada bacteria dentro de su
propio grupo.
Aunque existen otras regiones alternativas
al ARNr 16S, hasta el momento ninguna
ha conseguido desplazarle, siendo muy
útiles como cronómetros moleculares. De
hecho, esta macromolécula presenta una
serie de características, en base a las
cuales fue considerada por Woese como
cronómetro molecular definitivo (Rodicio
y Mendoza, 2004):
• Se trata de una molécula muy antigua,
presente en todas las bacterias actuales.
Constituye, por tanto, una diana universal para su identificación.
• Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy
prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios.
• Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta como para aportar
información acerca de todos los proca-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
26
riotas y, junto con las variaciones en los
ARNr 18S, a lo largo de toda la escala
evolutiva. Los ARNr contienen, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no solo los organismos más alejados, sino también los más próximos.
• El tamaño relativamente largo de los
ARNr 16S (1.500 nt) minimiza las fluctuaciones estadísticas.
• La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una base para el
alineamiento preciso.
• Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr 16S, existen bases de
datos amplias, en continuo crecimiento.
Si no existe ningún trabajo publicado se
lleva a cabo la búsqueda de secuencias
del microorganismo de interés en las
bases de datos y se elige una región que
identifique inequívocamente a dicho microorganismo. En ocasiones se recurre a
las zonas intergénicas del ADNr que no se
expresan y que acumulan mayor variabilidad, lo que permite separar especies más
fácilmente.
Una vez que se dispone de una secuencia
diana es necesario definir el tamaño del
fragmento a amplificar que se encuentra
acotado por los cebadores directo y reverso; además hay que seleccionar la secuencia donde se va a hibridar la sonda o
sondas marcadas con fluorocromos, las
cuales confirman que el fragmento amplificado es el adecuado. El diseño de los
tres o, en su caso, cuatro oligonucleótidos
es determinante para el éxito de la qPCR.
Existen diversas aplicaciones para realizar
el diseño con una cierta garantía de éxito,
como:
GeneFisher 2 (http://bibiserv.techfak.unibielefeld.de).
AlleleID (http://www.premierbiosoft.com).
Beacon Designer (http://www.premierbiosoft.com).
Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl).
FastPCR (http://primerdigital.com).
PrimerExpress (http://www.appliedbiosystems.com).
Es importante comprobar que la secuencia definitiva no hibrida con otras similares, por lo que se recurre de nuevo a
los programas de alineamiento y búsqueda como GenBank NCBI, EMBL, RDP
o RIDOM. A continuación es necesario encargar la síntesis de los cebadores y
sondas y comenzar con un proceso básico
de validación del ensayo.
Validación de ensayos para la
Organización Mundial
de Sanidad Animal (OIE)
La necesidad de combatir las enfermedades de los animales a nivel mundial
constituyó el motivo por el cual se creó la
Oficina Internacional de Epizootias (OIE)
gracias a un acuerdo internacional firmado el 25 de enero de 1924. En mayo
de 2003, la OIE se convirtió en la
Organización Mundial de Sanidad Animal,
pero conserva su acrónimo histórico OIE.
El Comité Internacional de la OIE asignó
a la Comisión de Estándares Biológicos de
la organización la tarea de elaborar el
Manual de animales terrestres. El propósito de este manual es facilitar el comercio
internacional de animales y productos animales, así como contribuir a la mejora de
los servicios de salud animal en todo el
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
27
mundo. El manual fija los estándares del
laboratorio para todas las enfermedades
de las listas A y B de la OIE, así como para
otras varias enfermedades de importancia
global. Sin embargo, el complejo proceso
de validación de nuevos ensayos ralentiza
enormemente la incorporación de nuevas
tecnologías con la velocidad que los
tiempos requieren.
En la práctica se están incorporando tecnologías como la qPCR para complementar y, en muchas ocasiones, acelerar
los procesos de discriminación de enfermedades, tanto las denominadas como
de declaración obligatoria como otros
procesos patógenos.
El problema más importante que ralentiza la incorporación de este tipo de técnicas es el complejo sistema de validación del ensayo. En la gráfica 1 se puede
observar un flujograma con el proceso
que se debería seguir para validar una
técnica para su empleo como herramienta de diagnóstico.
Adecuación del ensayo a la necesidad
Reactivos y controles
Desarrollo
del ensayo
Requisitos
esenciales
Ensayo candidato
vs. oficial
Diseño y
protocolos
Características
analíticas
Sensibilidad
Especificidad
Reproducibilidad inicial
Repetitividad
Límite de detección
Características
diagnósticas
Animales de referencia
Animales
experimentales
Laboratorios
participantes
Reproducibilidad
Panel de muestras
Muestras
de referencia
Implementación
Normas
de interpretación
Reconocimiento
provisional
Validación
del ensayo
Optimización y
estandarización
(OIE Terrestrial Manual/2010)
Reconocimiento oficial por la OIE
Gráfica 1. Flujograma con el proceso de validación según la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) 2010.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
28
A continuación se comentan algunos de
los puntos críticos del proceso de validación:
• Comparación y armonización de los ensayos: normalmente, se elaboran nuevos
ensayos para mejorar las técnicas en
vigor. Para demostrar que un nuevo ensayo supone una mejora de una técnica
ya existente, debe existir alguna forma
de comparación que demuestre esa mejora. La comparación puede estar relacionada con las características de realización
analítica y/o diagnóstica. También puede
estar relacionada con características de
tipo operativo, como el coste, la robustez, el tiempo para la obtención de
resultados, el rendimiento, etc. Si el
nuevo ensayo se va a integrar en un régimen de diagnóstico que incluye otros
métodos de prueba, debería establecerse
la razón de ser de su utilización, la interpretación de los datos y la toma de decisiones.
• Optimización y estandarización de los
reactivos: la elección y caracterización
de los reactivos debe abordarse de
forma cuidadosa o de lo contrario podrán peligrar las condiciones de realización de la prueba. Cuando un reactivo,
como una muestra de control, está a
punto de agotarse, resulta necesario
preparar y probar repetidamente otro
de repuesto antes de que se acabe. La
nueva muestra de control se incluye en
sucesivas realizaciones del ensayo antes
del agotamiento del control original
para establecer su relación proporcional
con el que se está acabando.
• Estudios de viabilidad y selección de
muestras: se necesitan muestras para
los experimentos a fin de determinar si
la prueba propuesta es viable. Las muestras deberían representar tanto a animales que se consideran infectados
como a aquellos no infectados dentro
de la población que finalmente va a ser
objeto de la prueba una vez que esta se
haya validado. Por otra parte, las muestras deben haber dado los resultados esperados en uno o más ensayos clásicos
además de aquel en el que se está validando. Con preferencia, las muestras
deben proceder de animales individuales, aunque también pueden derivar
de la acumulación de muestras de varios animales. Estas muestras pueden
utilizarse en experimentos para determinar si la prueba es capaz de distinguir
diferentes cantidades del componente
analizado y para optimizar las concentraciones de reactivos y perfeccionar el
protocolo.
• Selección del método para lograr resultados normalizados: la normalización
ajusta los resultados directos de la prueba
para todas las muestras con relación a los
valores de los controles incluidos en cada
desarrollo del ensayo. El procedimiento
de normalización requiere un algoritmo
sofisticado, que usa varios controles ajustados a valores esperables, para obtener
una curva estándar desde la que puede
extrapolarse el valor de la muestra. Este
método también permite la exclusión de
un valor control que puede caer fuera de
los límites de confianza esperados. Sea
cual sea el método usado para la normalización de los datos, es esencial incluir
controles adicionales para cada reactivo
que pueda introducir variabilidad y que
pueda limitar por tanto los intentos de
lograr un ensayo validado. Los valores
normalizados para tales controles tienen
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
29
que caer dentro de límites predeterminados (dentro de un múltiplo apropiado
de la desviación estándar de la media de
muchas reacciones de cada control). Los
límites escogidos deberían reflejar una
tasa tolerable de rechazo de ensayo y un
riesgo aceptable de que algunas muestras de prueba puedan estar mal clasificadas.
• Reproducibilidad: la evidencia preliminar
de reproducibilidad (concordancia entre
los duplicados dentro de un mismo ensayo y entre distintas realizaciones de la
prueba) resulta necesaria para garantizar el posterior desarrollo del ensayo a
validar. Esto se lleva a cabo evaluando
los resultados de, como mínimo, tres de
las cuatro muestras internas que representan la actividad dentro del rango lineal del ensayo. Se ensayan cuatro copias de esas muestras en al menos
cuatro realizaciones del ensayo para determinar la variación (entre ensayos)
dentro de una misma realización. La variación entre diferentes realizaciones del
mismo ensayo se analiza utilizando las
mismas muestras en un mínimo de 20
realizaciones (en total), por dos o más
operarios, preferiblemente en fechas diferentes. Todas las realizaciones deben
llevarse a cabo de forma independiente.
• Determinación de la especificidad y sensibilidad analíticas: la especificidad analítica es el grado en que el ensayo no
muestra reacción cruzada con otras secuencias de ADN. La sensibilidad analítica de un ensayo puede evaluarse mediante la cuantificación de la cantidad
más pequeña de ADN que es detectable
en la muestra.
• Sensibilidad y especificidad diagnóstica:
los valores de sensibilidad y especificidad diagnóstica constituyen los parámetros más importantes que se establecen durante la validación de un
ensayo. Dichos valores deben establecerse tras el ensayo y se optimizarán y
estandarizarán los reactivos; la alteración de los protocolos o los reactivos
puede requerir una revisión de las características de realización. Constituyen
la base para el cálculo de otros parámetros a partir de los cuales se realizan deducciones sobre los resultados. Por consiguiente, es muy importante que las
estimaciones sobre la sensibilidad y la
especificidad diagnóstica sean tan
exactas como sea posible. En teoría,
estos valores derivan del ensayo de una
serie de muestras procedentes de animales de referencia cuya historia es conocida, así como su estado de infección/enfermedad, y que son además
animales representativos de la región o
país donde se pretende usar la prueba,
pero tal cosa no siempre es posible.
Debe elegirse un diseño de prueba que
permita estimar las características de
realización diagnóstica. No obstante, se
trata de un proceso complicado por
causa de limitaciones de tipo logístico y
financiero. Los resultados de las pruebas
tienen primero que reducirse a la categoría de positivo o negativo. Esto implica considerar un punto de corte (umbral o límite de decisión) en la escala
continua de resultados de la prueba.
Para establecer la sensibilidad y la especificidad diagnóstica, tanto el número
como el origen de los animales de referencia y los métodos utilizados para determinar la sensibilidad y especificidad
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
30
analíticas son aspectos clave cuando se
intenta una validación adecuada del ensayo para su uso con la población de
animales a la que va dirigida.
• Pseudomonas aeruginosa (Cattoir et al.,
2010).
En definitiva, son muy pocos los ensayos validados con técnicas qPCR por
la dificultad de validación de los mismos
y por las frustrantes experiencias previas con las técnicas de PCR por la falta
de rigor en la estandarización.
• Rodococcus equi (Rodríguez-Lázaro et al.,
2006).
Aplicación de las técnicas
de análisis de ácidos nucleicos
en el diagnóstico
de enfermedades equinas
La OIE, por las circunstancias anteriormente descritas, tan solo ha validado algunas técnicas para diagnóstico vírico en
la versión on-line de su último Manual de
Enfermedades Terrestres de 2010 referentes a caballos (OIE, 2010):
• Virus de la arteritis vírica equina.
• Virus de la fiebre del Nilo Occidental.
• Virus de la peste equina.
• Virus de la anemia infecciosa equina.
• Virus de la gripe equina.
Sin embargo, se han publicado técnicas
de qPCR sin validar para detectar la presencia de otros microorganismos de interés equino que pueden ser útiles para
análisis de discriminación y estudios epidemiológicos. A continuación se citan algunos ejemplos:
• Taylorella equigenitalis (Wakeley et al.,
2006).
• Babesia caballi (Bhoora et al., 2010).
• Theileria equi (Kim et al., 2008).
• Klebsiella pneumoniae (Kurupati et al.,
2004).
En el Reglamento (UE) n.º 176/2010 de la
Comisión Europea, de 2 de marzo de
2010, por el que se modifica el anexo D
de la Directiva 92/65/CEE del Consejo en
lo que respecta a los centros de recogida
y almacenamiento de esperma, los
equipos de recogida y producción de embriones y las condiciones aplicables a los
animales donantes de las especies equina,
ovina y caprina y a la manipulación de esperma, óvulos y embriones de dichas especies, se indica en el punto 1.5 del capítulo II que cada semental deberá ser
sometido a las pruebas siguientes, realizadas y certificadas en un laboratorio reconocido por la autoridad competente,
con arreglo al programa que se establece
en el punto 1.6:
a) Prueba de inmunodifusión en gel de
agar (prueba de Coggins) o ELISA para
la detección de la anemia infecciosa
equina, con resultado negativo.
b) Prueba de aislamiento del virus de la
arteritis vírica equina con resultado negativo, realizada en una parte alícuota
de todo el esperma del caballo semental donante, salvo que se obtenga
un resultado negativo con una dilución
de suero de 1:4 en una prueba de neutralización sérica para la detección de
dicha enfermedad.
c) Una prueba para la detección de la
metritis contagiosa equina, realizada
en dos ocasiones con muestras to-
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
31
madas del caballo semental donante
con un intervalo de 7 días, mediante
aislamiento de Taylorella equigenitalis
en el líquido preeyaculatorio o en una
muestra de esperma y en hisopos genitales tomados, como mínimo, del
prepucio, la uretra y la fosa uretral,
con resultados negativos en todos los
casos.
En ningún caso se cita el empleo de técnicas moleculares para el diagnóstico de
estas enfermedades cuando tanto para la
detección de T. asinigenitalis como para
el virus de la arteritis vírica equina hay técnicas descritas que pueden ayudar a confirmar los aislamientos de ambos microorganismos (Mankoc et al., 2007;
Wakeley et al., 2006). A continuación se
citan algunos de estos ejemplos:
Metritis equina contagiosa
La metritis equina contagiosa consiste en
una inflamación del endometrio de las yeguas causada por Taylorella equigenitalis,
y que normalmente origina una infertilidad temporal. Se trata de una infección
no sistémica, cuyos efectos se encuentran
restringidos al tracto reproductivo de la
yegua. La identificación del agente se realiza a partir de frotis, que deben transportarse al laboratorio con precaución para
evitar pérdida de viabilidad. Los frotis
deben sumergirse en medio de transporte
Amies con carbón y transportarse al laboratorio de pruebas, preferiblemente con
la temperatura controlada, para su resiembra dentro de las 48 horas siguientes
a la recogida. El crecimiento de T. equigenitalis puede llevar al menos 72 horas, y
puede extenderse hasta 14 días, aunque,
normalmente, no le lleva más de 6 días a
37 ºC en medio enriquecido con sangre
caliente y en una atmósfera del 5-10% de
CO2. Es aconsejable realizar una incubación de al menos 7 días antes de certificar
que los cultivos son negativos para T.
equigenitalis. La naturaleza compleja de
T. equigenitalis dificulta su aislamiento, y
se han empleado pruebas realizadas en
manadas de sementales para detectar el
estado de portador como una ayuda valiosa al examen de los cultivos.
Recientemente, otra especie de Taylorella,
T. asinigenitalis, se ha aislado a partir de
machos de burro y caballos sementales de
los EE.UU. y caballos sementales de
Europa. Se ha descrito que esta bacteria no
produce ninguna enfermedad natural; habita en el tracto genital de los machos de
burro, y puede transmitirse a otros burros
y caballos durante la cópula. Puede adquirirse un sistema de aglutinación con bolas
de látex para la identificación antigénica de
T. equigenitalis, y se basa en el empleo de
anticuerpos policlonales. Este método se
utiliza ampliamente por los laboratorios de
análisis rutinario para la confirmación de la
identidad de las colonias que crecen en el
medio selectivo, y que dan una reacción
bioquímica consistente con T. equigenitalis.
Debería recalcarse que esta prueba no distinguirá necesariamente a las cepas de
T. equigenitalis de las de T. asinigenitalis.
Durante el comienzo de la temporada de
cría, se toman frotis de los sementales, incluyendo a aquellos que se encuentren en
su primera temporada, en dos ocasiones
separadas por no menos de 7 días. Las yeguas se clasifican de acuerdo con el grado
de riesgo que presentan, y la frecuencia
del muestreo se ajusta de manera apropiada.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
32
Este tipo de análisis es tedioso y exige la
repetición de los análisis por la frecuencia
de los falsos negativos que se presentan
dada la dificultad de crecer en el laboratorio. La incorporación de técnicas más
ágiles se impone como medida preventiva
para el mantenimiento de la explotación
controlada frente a esta enfermedad.
Wakeley y col. (2006) proponen una técnica de qPCR que tiene la ventaja de discriminar entre T. equigenitalis y T. asinigenitalis. Este aspecto es importante, pues
un aislamiento de Taylorella spp. conllevaría la declaración del estado de portador del animal y la toma de medidas
preventivas para evitar la difusión de la
bacteria cuando es posible que se trate de
T. asinigenitalis que no produce metritis.
El frotis destinado a ser analizado mediante qPCR puede ser congelado inmediatamente para detener el crecimiento
bacteriano y, una vez en el laboratorio, el
análisis se lleva a cabo en apenas 2 horas.
Esencialmente se trata de amplificar un
fragmento de 112 pares de bases de la región del ADN que codifica para la subunidad 16S de ARN ribosómico. La secuencia
del fragmento amplificado presenta diferencias según se trate de T. equigenitalis
o T. asinigenitalis.
T. equigenitalis
GGTTTGTGTTAATACCATGGACTGCT
T. asinigenitalis
GTTTTAGGATAATACCCTAGGATGCT
Se añaden a la reacción dos sondas marcadas con fluorocromos diferentes, una
con la secuencia de T. equigenitalis y la
otra con la secuencia de T. asinigenitalis.
Según se trate de una bacteria u otra se
hibridará una de las dos sondas. La sonda,
una vez hibridada, se hidroliza por acción
de la polimerasa y comienza a emitir luz
de una determinada longitud de onda.
Según el color de la luz emitida se puede
saber si la secuencia diana es de T. equigenitalis o de T. asinigenitalis. Mediante
filtros se puede observar qué ocurre en la
reacción con cada tipo de sonda.
Arteritis vírica equina
Según el Manual de Enfermedades
Terrestres (2008): “La arteritis vírica equina
(AVE) es una enfermedad vírica y contagiosa de los équidos causada por el virus de
la arteritis equina (EAV), un virus con ARN
clasificado en la familia Arteriviridae. La mayoría de las infecciones adquiridas naturalmente con el EAV son subclínicas. Cuando
aparecen, los síntomas clínicos de la AVE
varían en extensión y gravedad”.
Se debe tratar de aislar el virus del semen
de los sementales seropositivos con anticuerpos contra el EAV que no tengan antecedentes de vacunación contra AVE. El
aislamiento del EAV debe realizarse con
preferencia en una porción del eyaculado
completo. El problema del aislamiento es
que en ocasiones el efecto citotóxico del
semen sobre las células de la monocapa
provoca su destrucción, siendo imposible
lograr un cultivo del virus aceptable que
permita su identificación. Se han ido proponiendo diferentes técnicas de qPCR
(Mankoc et al., 2007), aunque permanecen las dudas sobre las regiones mejor
conservadas del genoma para evitar que
mutaciones puntuales puedan dar lugar
a falsos negativos (Zhang et al., 2007).
Conclusiones
• La PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)
es una técnica rápida, sensible, especí-
Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…
33
fica, robusta y de fácil implantación que
la hace idónea para su aplicación en diferentes aspectos de la Microbiología.
• La qPCR tiene una aplicación fundamental en el diagnóstico preventivo de
enfermedades de declaración obligatoria
en los caballos porque permite la detección temprana de focos epidemiológicos.
• La proliferación de trabajos científicos
exige cautela y prudencia, siendo necesaria una validación de las técnicas
antes de su aplicación masiva.
Bibliografía recomendada
Bhoora R, et al. Development and evaluation of
real-time PCR assays for the quantitative detection of Babesia caballi and Theileria equi infections in horses from South Africa. Veterinary
Parasitology 2010; 168(3-4):201-11.
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE
guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.
Clinical Chemistry 2009; 55(4):611-22.
Cattoir V, et al. Rapid detection of Pseudomonas
aeruginosa from positive blood cultures by
quantitative PCR. Annals of Clinical Microbiology
and Antimicrobials 2010; 9(1):21.
Center for Biologics Evaluation and Research,
Guidance for Industry: Characterization and
Qualification of Cell Substrates and Other
Biological Starting Materials Used in the
Production of Viral Vaccines for the Prevention
and Treatment of Infectious Diseases 2010.
Available at: http://www.fda.gov/Biologics
BloodVaccines/GuidanceComplianceRegulator
yInformation/Guidances/Vaccines/default.htm
[Accedido Mayo 24, 2011].
David SAW, et al. Evaluation of Mycoplasma
inactivation during production of biologics:
egg-based viral vaccines as a model. Applied
and Environmental Microbiology 2010;
76(9):2.718-28.
Denoya CD. Microbiology –Nucleic Acid
Amplification– Based Rapid Microbiological
Methods: Are These Technologies Ready for
Deployment in the Pharmaceutical Industry?
American pharmaceutical review 2009;
12(4):12.
Higuchi R, et al. Kinetic PCR Analysis: Realtime Monitoring of DNA Amplification
Reactions. Nat Biotech 1993; 11(9):1.026-30.
Kim C, et al. Diagnostic real-time PCR assay
for the quantitative detection of Theileria equi
from equine blood samples. Veterinary
Parasitology 2008; 151(2-4):158-63.
Kurupati P, et al. Rapid detection of Klebsiella
pneumoniae from blood culture bottles by
real-time PCR. Journal of Clinical Microbiology
2004; 42(3):1.337-40.
Mankoc S, et al. Comparison of different molecular methods for assessment of equine arteritis virus (EAV) infection: a novel one-step MGB
real-time RT-PCR assay, PCR-ELISA and classical
RT-PCR for detection of highly diverse sequences of Slovenian EAV variants. Journal of
Virological Methods 2007; 146(1-2):341-54.
OIE 2010. Access online: OIE-World Organisation for Animal Health. Manual of Diagnostic
Tests and Vaccinesfor Terrestrial Animals 2010.
Available at: http://www.oie. int/en/international-standard-setting/terrestrial-manual/accessonline/ [Accedido Mayo 24, 2011].
Rodicio M, Del R & Mendoza, M del C.
[Identification of bacteria through 16S rRNA
sequencing: principles, methods and applications in clinical microbiology]. Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica 2004;
22(4):238-45.
Rodríguez-Lázaro D, et al. Internally controlled
real-time PCR method for quantitative speciesspecific detection and vapA genotyping of
Rhodococcus equi. Applied and Environmental
Microbiology 2006; 72(6):4.256-63.
Wakeley PR, et al. Development of a real time
PCR for the detection of Taylorella equigenitalis directly from genital swabs and discrimination from Taylorella asinigenitalis. Veterinary
Microbiology 2006; 118(3-4):247-54.
Zhang J, et al. Genetic variation and phylogenetic analysis of 22 French isolates of equine
arteritis virus. Archives of Virology 2007;
152(11):1.977-94.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 35
Ecología microbiana y nuevas tecnologías
de análisis microbiológico de alimentos
Dr. José Luis Rodríguez-Marín Roy y Dr. Alberto Zamora Benito
Introducción
La higiene alimentaria es labor básica de
la profesión veterinaria; además, no sería
descabellado considerarla como labor exclusiva de los veterinarios. Esta afirmación
tan categórica viene apoyada por diferentes argumentos de índole legal, profesional e histórica.
La legislación, en diferentes preceptos,
atribuye a los veterinarios la exclusividad
en la higiene de los alimentos de origen
animal, tal es el caso de la Ley General de
Sanidad (1) y de la Ley de Profesiones
Sanitarias (2); así mismo, parece lógico
deducir que los profesionales conocedores de la patología animal sean los que
dictaminen sobre los productos alimenticios procedentes de los animales de
abasto y de los derivados de las producciones animales de diferente índole.
Históricamente no hace falta remontarse
más que al siglo XIX para encontrar las
primeras referencias a la inspección veterinaria de los alimentos. Los veterinarios municipales fueron incorporados a
la inspección de víveres un lejano 10 de
marzo de 1840 (3) por acuerdo del
Excmo. Ayuntamiento de la Villa y Corte
de Madrid, sancionado más tarde por
Reglamento Municipal aprobado el 14
de diciembre de 1842, que decía: “El
Ayuntamiento le expide el presente título
para que sea reconocido, respetado y
obedecido como inspector, quedando
autorizado para reconocer los mataderos
y las reses que existan en ellos, tanto
vivas como después de muertas; las
carnes, los pescados, caza, leche, fruta
y, en una palabra, todo lo que sirva de
alimento para el hombre y pueda comprometer su salud, por hallarse malsano
o poco sazonado, como igualmente
todo sitio que, por su situación topográfica o por el poco aseo que en él haya,
sea foco de infección”.
Años más tarde, otras ciudades, como
Barcelona, Valencia, Oviedo, Granada y
Navarra, copiaron este modelo de inspección veterinaria.
Posteriormente le han seguido numerosas
disposiciones, entre las que destaca el
Real Decreto de 22 de diciembre de 1908,
que, según Martín-Martínez Conde (3), es
una verdadera obra maestra de la higiene
de los alimentos.
Las herramientas técnicas con las que los
veterinarios han desarrollado su labor de
higiene alimentaria han evolucionado
desde la simple inspección de visu y el microscopio monocular con luz natural amplificada por lupa hasta las modernas técnicas de análisis inmunoenzimático o la
cromatografía líquida de alta resolución.
Por otra parte, el autocontrol en materia
de inocuidad microbiológica de los alimentos es un concepto básico que se ha
desarrollado desde hace pocos años
como pilar fundamental del control de las
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 36
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
36
enfermedades de transmisión alimentaria.
Este autocontrol se ha plasmado en los
sistemas de calidad alimentaria denominados APPCC (acertada traducción del
HACCP inglés).
A nuestro entender el APPCC se ha revelado como una magnífica herramienta
para evitar la transmisión de las enfermedades alimentarias, pero su correcta im-
Ciencia veterinaria
Conocimientos de anatomía,
fisiología y patología animal
Ecología microbiana
Conocimientos de carga
microbiana de los productos
alimenticios en las diferentes
fases de la cadena alimentaria
plantación está condicionada por una
serie de disciplinas, de las cuales la decisiva es la Ecología Microbiana de los
Alimentos, es decir, el conocimiento en
profundidad de las bacterias, virus y parásitos presentes de una forma inevitable
en los productos alimenticios durante las
diferentes fases de la cadena alimentaria
(figura 1).
Bromatología descriptiva
Conocimientos de calidad,
propiedades nutritivas y
composición de los alimentos
Tecnología alimentaria
Conocimientos de los
procesos de transformación
de los alimentos y su
repercusión sobre estos
Determinación
de peligros
Evaluación y
gestión de
los riesgos
Legislación alimentaria
Conocimientos de la normativa
alimentaria vinculante
ANÁLISIS DE PELIGROS
Y PUNTOS DE CONTROL CRÍTICO
APPCC
Análisis de alimentos
Realización de ensayos acreditados por
técnicas rápidas de tipo microbiológico
y de tipo físico-químico
Monitorización
de puntos
de control críticos
Verificación del sistema APPCC
y comprobación de la calidad
sanitaria del producto
alimentario final
Figura 1.
ALIMENTOS
SANITARIAMENTE
APTOS PARA EL
CONSUMO
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 37
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
37
Esta “presencia inevitable” es consecuencia de:
• El medio en el que se desarrollan y
crecen los animales y plantas que darán
lugar a determinados productos alimenticios; tal es el caso de los tubérculos y
la presencia de microorganismos esporulados de origen telúrico.
• Las fases de producción y transformación primaria a las que son sometidos
estos productos; como ejemplo claro es
la presencia de enterobacteriáceas en
las canales de animales de abasto después de su faenado en mataderos.
• Las diferentes operaciones que se realizan durante las fases de la cadena alimentaria, sobre todo en el picado o troceado de determinados alimentos
animales.
Además, los diferentes tipos de alimentos, la complejidad de la industria
alimentaria y las necesidades del mercado están obligando a las industrias a
contratar expertos sanitarios que sean
especialistas en higiene alimentaria, ecología microbiana y análisis de alimentos,
todo ello por diferentes sectores del mercado alimentario.
Figura 2. Instalaciones del Servicio de Bromatología del Centro Militar de Veterinaria de la Defensa (fotografías
de los autores).
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 38
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
38
La comprobación de la viabilidad de los sistemas APPCC se debe realizar por medio
de análisis de alimentos que nos ofrezcan
resultados fiables en el menor tiempo posible y, por supuesto, económico.
Así pues, la conjunción de conocimientos
de Ecología Microbiana que nos permita
determinar los riesgos a los que nos enfrentamos, junto con la aplicación de un
sistema APPCC, que nos ayude a eliminar
o minimizar esos peligros por medio de
un adecuado control de los riesgos, y con
la inestimable ayuda de unos ensayos microbiológicos baratos, fiables y rápidos,
que nos ayuden a monitorizar el plan
APPCC y a comprobar la inocuidad del
producto alimenticio final, será el sistema
higiénico-sanitario ideal para el control de
las enfermedades de transmisión alimentaria.
Figura 3. Sistema TEMPO® (bioMérieux) basado en el número más probable (NMP) para análisis microbiológico
de los alimentos utilizado en el Servicio de Bromatología y Seguridad Alimentaria del CEMILVET (fotografía de los
autores).
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 39
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
39
Ecología Microbiana
Generalidades
Se puede definir la Ecología Microbiana
como la ciencia que estudia el componente microbiológico de los alimentos,
tanto animales como vegetales, en las diferentes fases de la cadena alimentaria,
así como el entorno de los alimentos y su
influencia sobre estos y, por lo tanto,
sobre la citada microbiota (4).
Además, en los diferentes procesos de
manipulación de estos alimentos se influye cuantitativa y cualitativamente en la
microbiota que sobrevive a aquellos y en
la que se desarrollará en los subsiguientes
procesos de manipulación y almacenamiento.
Existen dos campos de interés de entre los
diversos aspectos que abarca la
Microbiología Alimentaria:
• Sanitario: relacionado con la protección
del consumidor frente a enfermedades
transmitidas por los alimentos.
• Comercial: dirigido hacia la prevención
de las alteraciones de los alimentos a
través de los microorganismos.
En líneas generales, el origen y las propiedades bioquímicas son diferentes en
los microorganismos de interés sanitario
respecto a los microorganismos responsables de la alteración comercial de los
alimentos; esto motivaría tres situaciones:
• Los alimentos que presentan una carga
microbiana de patógenos o de sus toxinas suficientes como para provocar
sintomatología clínica tras su ingesta no
suelen ocasionar una modificación evidente en sus caracteres organolépticos.
• Las medidas de control que se muestran
eficaces frente al crecimiento de patógenos no tienen por qué serlo necesariamente frente al crecimiento de alterantes. Un ejemplo claro de esto es la
leche pasteurizada.
• Las medidas tendentes a reducir o inhibir el crecimiento de alterantes no sanean el alimento, es decir, no lo hacen
inocuo en todos los casos, por dos motivos:
– Ciertos patógenos existentes siguen
conservando su poder infectivo.
– Ciertos patógenos requieren dosis infectivas muy pequeñas.
En vista de que la contaminación resulta
muy difícil de evitar, las medidas prácticas
en la industria alimentaria tienden a inhibir o reducir la multiplicación de los microorganismos contaminantes.
Inicialmente se puede decir que la industria cuenta con suficientes conocimientos
científicos y tecnológicos como para producir alimentos de buena calidad microbiológica, aunque el problema de su aplicación se halla condicionado al factor
humano.
El aseguramiento de la calidad microbiológica de los alimentos se basa en el control de la multiplicación de los microorganismos en el nicho ecológico,
constituido por el sustrato que este proporciona y por el tipo de ambiente en el
que se conserva.
Así pues, el tipo de alimento, junto con
una serie de factores externos al propio
alimento, determinarán el tipo de microbiota presente en cada fase de la cadena
alimentaria (figura 4).
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 40
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
40
Ecología microbiana de los alimentos
La rama de la Microbiología Alimentaria que estudia las relaciones
entre las poblaciones microbianas presentes en el alimento y los
diferentes factores tanto relativos como ajenos a este, recibe el
nombre de Ecología Microbiana de los Alimentos
Microbiótica
de carnes
Microbiótica
de pescados
Microbiótica
de huevos
Microbiótica de
leche y derivados
Microbiótica de
alimentos vegetales
Microbiótica de
otros alimentos
}
Factores intrínsecos:
• Actividad de agua aw
• pH (acidez)
• Nutrientes
• Potencial de óxido-reducción
Factores intrínsecos:
• Temperatura
Tratamientos tecnológicos:
• Calor
• Cambios en la composición
química de los alimentos
Factores implícitos:
• Sinergismo
• Antagonismo
IDENTIFICACIÓN DE PELIGROS
GESTIÓN DE RIESGOS
APPCC
Figura 4.
Los factores que influyen en la selección
de la microbiota inicial y que son la causa
de la multiplicación de solo una parte de
ella (resistencia a la colonización del alimento) pueden ser (5):
1. Factores intrínsecos: propiedades físicoquímicas y biológicas.
2. Tratamientos tecnológicos.
3. Factores extrínsecos: condiciones ambientales.
4. Factores implícitos: antagonismo/sinergismo.
Factores que afectan a la microbiota
presente en el alimento (substrato)
Factores intrínsecos: propiedades
físico-químicas y biológicas
Actividad de agua (aw)
Agua de la que disponen los microorganismos para crecer; es inversa a la presión
osmótica del alimento.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 41
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
41
• aw = 0,98-1, casi todos los microorganismos se desarrollan.
• aw < 0,95, se mantienen cocos y lactobacilos.
que permite que los alimentos enlatados
de carácter ácido no requieran de un tratamiento térmico tan intenso como aquellos de menor acidez.
• aw < 0,87, proliferan únicamente
mohos (p.ej.: el almíbar).
Su efecto inhibidor depende:
Los microorganismos patógenos crecen
con unos valores de aw < 0,86.
• Otros factores limitantes: nutrientes, aw,
temperatura...
Figura 5. Cecina, ejemplo de alimento conservado por
desecación y con baja aw (Mercado de Oviedo, fotografía de los autores).
Figura 6. Alimentos conservados a pH bajo (Mercado
de Valencia, fotografía de los autores).
pH (acidez)
Los pH alcalinos también dificultan el crecimiento de ciertos microorganismos; de
forma que un pH de 9 (clara de huevo recién puesto) constituye uno de los mecanismos de protección del huevo frente a
la invasión por microorganismos.
La mayoría de los alimentos, como la
carne, la fruta y el pescado en su estado
natural, son ligeramente ácidos, a excepción de la clara de huevo, que tiene un pH
alcalino.
Todos los microorganismos se desarrollan
bien con rangos de pH comprendidos
entre 5 y 8, pero casi ningún patógeno se
desarrolla con un pH de 4,5.
Las bacterias sensibles a la acidez, como
los bacilos gramnegativos, no pueden
multiplicarse en alimentos de pH ácido,
tales como las frutas o los encurtidos. De
igual modo, Clostridium botulinum no
prolifera a valores de pH < 4,5 (6), hecho
• Del tipo de ácido: láctico o cítrico.
Potencial de óxido-reducción
El potencial redox indica las relaciones de
oxígeno de los microorganismos vivos y
puede ser utilizado para especificar el ambiente en el que un microorganismo es
capaz de generar energía y sintetizar
nuevas células sin recurrir al oxígeno molecular.
• Microorganismos anaerobios: valores
redox negativos (+ 300 mV).
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 42
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
42
• Microorganismos aerobios: valores
redox positivos (– 420 mV).
Nutrientes
• Glúcidos: la degradación de alimentos
ricos en almidón (patata, grano) requiere de microorganismos con una capacidad de subsistencia a partir de un
suministro mínimo de nitrógeno y sales,
así como un equipo enzimático amilasa
eficaz frente a almidón no degradado.
De igual forma, la asociación alterante
de la celulosa, presente en los alimentos
de origen vegetal, es muy restringida
por la rareza de la presencia de enzimas
celulolíticas en los microorganismos.
El efecto selectivo de otros glúcidos de
peso molecular más pequeño que el almidón o la celulosa también se da,
aunque en menor medida. Así, en los productos lácteos predominan las especies
lactosa positivas de Enterobacteriaceae,
en contraste con la mayoría de los alimentos en los que son aventajadas por
las cepas lactosa negativas.
• Lípidos: la presencia de grasas en los alimentos estimula el predominio de microorganismos lipolíticos en los mismos.
Estos microorganismos producen lipasas
que hidrolizan las grasas dando lugar a
la aparición de metabolitos, como los
ácidos grasos, que a su vez sufren cambios, originando, entre otros, cetonas.
En conjunto, estos cambios metabólicos
detectables organolépticamente se han
englobado en lo que se denomina rancidez microbiana (7).
• Proteínas y péptidos: en general, las
proteínas complejas no son frecuentemente atacadas por los microorganismos, por lo que no constituyen una
fuente universal de nitrógeno. Sin embargo, existen bacterias productoras
de colagenasa que desempeñan un
papel importante en la alteración de la
carne.
Estas especies proteolíticas pueden desdoblar las moléculas nitrogenadas de
mayor tamaño presentes en los alimentos, posibilitando la proliferación de
otras especies no proteolíticas, que utilizan el nitrógeno de los compuestos de
degradación originados por el ataque a
las proteínas.
• Vitaminas: muchos microorganismos no
pueden crecer si no cuentan con un
aporte adecuado de vitaminas del complejo B, incluso en medios óptimos en
cuanto a otros requerimientos.
Parece significativo que las frutas, pobres en vitaminas del grupo B, sean atacadas por mohos y levaduras, capaces
de sintetizarlas por sí mismos.
Por el contrario, los alimentos de origen
animal, ricos en vitaminas del grupo B,
son atacados por bacterias.
• Otros nutrientes: constituyentes naturales antimicrobianos: aceites esenciales
en productos de origen vegetal o lisozima y la conalbúmina en el huevo.
Tratamientos tecnológicos
Temperatura: calor
Constituye el procedimiento más importante utilizado por la moderna tecnología
y el más eficaz en lo que se refiere a la
inocuidad para el consumidor de los alimentos así tratados.
En general, las células calentadas muestran una mayor sensibilidad a las condiciones externas desfavorables, sensibilidad
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 43
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
43
que aumenta cuanto más drástico es el
tratamiento. Este hecho implica que los
factores antimicrobianos que tienen solo
un pequeño efecto sobre las células limitan e incluso inhiben completamente
la multiplicación de las mismas, si previamente han sufrido un tratamiento térmico
subletal.
caución por la falsa creencia de su inalterabilidad, son aun potencialmente mayores que los vinculados a los alimentos
crudos, conservados a temperaturas de
refrigeración.
Tras un tratamiento de pasteurización
(72 ºC/20 s), solo se encuentran en los alimentos tratados bacterias esporuladas de
la familia Bacillaceae. Cuando aumenta la
intensidad del tratamiento, incluso se
inactivan los esporos de los microorganismos pertenecientes a la mencionada
familia, sobreviviendo únicamente los más
termorresistentes.
• Modificación en la aw: puede reducirse,
bien por eliminación de agua (desecación y deshidratación) o bien por aumento de la concentración de solutos
(salazones y mermeladas).
Pero estas consideraciones son válidas en
los casos en que los alimentos estén protegidos de una contaminación posterior
al tratamiento térmico, circunstancia que
no siempre se da (8).
La contaminación posterior al tratamiento
de enlatados pocas veces se presenta,
siendo más frecuente en los productos
envasados en películas flexibles y apareciendo de forma regular en alimentos y
platos cocinados que no se protegen mecánicamente de la contaminación.
Los riesgos que supone la contaminación de estos últimos, que no se mantienen o manipulan con la debida pre-
Tipo
Cambios en la composición química de los
alimentos
• Modificación del pH: por adición directa
de un ácido (ácido acético en pescado
en escabeche) o por una fermentación
láctica (yogur).
• Adición de conservadores químicos:
ácido cítrico en mermeladas.
Factores extrínsecos
Temperatura de conservación
Los diversos microorganismos que son
responsables de la alteración de los alimentos pueden crecer a temperaturas
comprendidas entre –10 y 80 ºC. Cada
uno de ellos tiene unas temperaturas
“cardinales” de crecimiento: mínima, óptima y máxima, en función de las cuales
pueden clasificarse:
Temperatura
Temperatura
Temperatura
mínima (en ºC)
óptima (en ºC)
máxima (en ºC)
Psicrófilos
–15
10-15
18-20
Psicrótrofos
–5
20-30
35-40
Mesófilos
5-10
30-37
~45
Termófilos
25-42
50-80
60-85
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 44
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
44
Las temperaturas de conservación resultan determinantes en la bioquímica del
proceso alterativo.
En carne refrigerada predominan procesos proteolíticos por desarrollo de microbiota psicrófila y psicrótrofa, reduciéndose la acidez del medio.
En carnes a temperaturas superiores son
mayoritarios los microorganismos esporulados y los de la familia Lactobacillaceae,
produciendo al principio ácidos a partir de
los glúcidos disponibles.
Los alimentos congelados se conservan
por debajo de los –15 ºC, cesando toda
multiplicación microbiana como resultado
no solo de la temperatura, sino también
de la disponibilidad de agua (aw = 0,84
para una temperatura de –20 ºC).
Además, a esta temperatura se inicia incluso una lenta inactivación de los microorganismos no esporulados, aunque esta
inactivación carece de repercusiones prácticas.
Factores implícitos
Sinergismo
• Cambios en el pH: reducción de ácido
acético por el género Bacillus.
• Cambios en la aw: el crecimiento de aerobios esporulados en pan de una a w
cerca del límite de desarrollo de
Clostridium botulinum eleva el contenido en agua, aumentando la posibilidad de multiplicación del primero.
• Deterioro de las estructuras biológicas:
proliferación de un moho determinante
de podredumbre en una fruta intacta y
posterior penetración de levaduras a
través de la estructura dañada.
Antagonismos
Los mecanismos son muy similares a los
explicados para el sinergismo:
• Competición en la utilización de nutrientes: Micrococcus spp. frente a
Staphylococcus spp.
• Cambios de pH: Leuconostoc spp.
frente a Lactobacillus spp.
• Formación de sustancias antimicrobianas: CO2, H2O2, etanol, ácidos fórmico, láctico y propiónico, y bacteriocinas.
La relación sinérgica se establece a través
de diferentes mecanismos:
Las relaciones de antagonismo son de gran
importancia en el campo de la Salud
Pública. Estos fenómenos contribuyen en
parte a la incidencia relativamente baja de
intoxicaciones por toxina estafilocócica,
dada la alta sensibilidad de este microbio a
la competencia por otros microorganismos,
como Pseudomonas spp., Lactobacillus
spp., Bacillus spp. y Micrococcus spp., entre
otros (9).
• Disponibilidad de nutrientes: producción de vitamina B por levaduras que
posibilita el crecimiento de bacterias lácticas.
Del mismo modo, la baja frecuencia registrada de casos de gastroenteritis por
Bacillus cereus y por Clostridium perfringens puede ser debida a la inhibición na-
Los fenómenos de sinergismo entre
grupos de microorganismos son frecuentes: un microorganismo produce un
cambio en el sustrato que favorece el crecimiento de otro microorganismo o grupo
de microorganismos.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 45
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
45
tural de estas bacterias por la microbiota
saprófita que se desarrolla al mismo
tiempo.
Los alimentos como sustrato
de la microbiota. Presencia
de determinados microorganismos
característicos en la producción
primaria (2) (resumen en la tabla 1)
Carnes
La carne es un substrato alimenticio ideal
para el crecimiento de diversos microorganismos.
La cría intensiva del ganado incrementa
en gran medida la difusión de los microorganismos de animal a animal, y en el
matadero y durante el procesado, de
canal a canal.
La persistencia de Salmonella spp. en la
carne cruda de los animales de abasto
varía, dependiendo de la especie animal
y del método de cría.
Los pollos y otras aves son los más frecuentemente contaminados por este microbio
y una gran proporción de las canales de
venta al por menor pueden estarlo.
Microorganismos como Salmonella enteritidis fago tipo 4 pueden contaminar a los
huevos mientras se forman en el oviducto.
Campylobacter spp. suele contaminar las
canales de pollo, sobre todo en el producto fresco. La incidencia de estos microorganismos en los puntos de venta de
la carne de animales de abasto es menor,
aunque los despojos suelen estar más
contaminados.
Los pollos albergan con frecuencia Listeria
monocytogenes y Yersinia enterocolitica,
habiéndose señalado también la presencia
de Aeromonas spp. en la carne cruda de
animales de abasto. La carne de cerdo contaminada puede ser una fuente esporádica
importante de infecciones por Yersinia spp.
Las temperaturas de refrigeración pueden
no ser lo suficientemente bajas como para
frenar el crecimiento de estas bacterias (10).
La presencia de Escherichia coli y
Clostridium perfringens puede esperarse
en las canales, pero su número es bajo
cuando se obtienen con buenas prácticas
de higiene.
En algunos países, la carne de vacuno picada, en particular las hamburguesas insuficientemente calentadas, pueden ser
fuente importante de infecciones por
Escherichia coli verocitotoxigénico.
La mayoría de las bacterias alterantes son
aerobias y crecen en la superficie de la
carne, pudiendo distribuirse irregularmente
a consecuencia del picado o la trituración.
En el caso de las carnes cocinadas, el tratamiento culinario destruye las formas vegetativas de las bacterias, pero las esporas
como las de Clostridium perfringens
pueden sobrevivir y germinar si los alimentos no se refrigeran inmediatamente
después.
Todo proceso de cocinado extrae el oxígeno de los tejidos y da lugar a un ambiente que favorece el crecimiento de las
bacterias anaerobias.
En embutidos crudos curados su elaboración se desarrolla en cinco etapas: picado
y amasado, fermentación, secado y maduración. Durante la etapa fermentativa
acontece una multiplicación de las bacterias lácticas de la carne que se acompaña
de una disminución de la microbiota
gramnegativa.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 46
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
46
Huevos
Es un alimento que se caracteriza por
transmitir Salmonella enteritidis debido
tanto a la contaminación interna (microorganismos acantonados en los oviductos
de las gallinas que producen la contaminación interna del huevo) como a la contaminación externa (cáscara sucia y con
excrementos de las aves).
Figura 7. Carne de bovino (Mercado de Oviedo, fotografía de los autores).
Se han señalado brotes de intoxicación estafilocócica por estos productos. La multiplicación de Staphylococcus aureus
puede limitarse manteniendo la carne en
refrigeración durante la fermentación inicial, dado que la acidificación rápida inicial favorece su crecimiento.
Los derivados cárnicos tratados térmicamente, como el jamón cocido, presentados en lonchas envasadas al vacío, de
un pH > 6 y una aw > 0,95, se alteran con
el tiempo aun cuando se conserven refrigerados, principalmente por la proliferación de micrococos, bacterias acidolácticas, Brochotrix thermosphacta (11) y
estreptococos de los grupos N y D. Estos
últimos son bastante resistentes y poco
puede hacerse para eliminarlos por completo; el resto se puede reducir en gran
medida realizando las operaciones de cortado y envasado en las mejores condiciones higiénicas.
La importancia de la transmisión de la salmonelosis por productos alimenticios en
cuya composición interviene el huevo es
tal que se ha prohibido la elaboración de
salsas frías caseras (mayonesa) para su utilización en restaurantes y bares por una
disposición legal de carácter nacional (12).
Solo se permite la utilización de mayonesas producidas, envasadas y pasteurizadas por empresas autorizadas.
Productos lácteos
Dado que la mayoría de los productos lácteos que consumimos están tratados térmicamente, la transmisión de enfermedades de origen alimentario por estos
resulta muy rara.
A pesar de todo se sigue consumiendo
lecha fresca y cruda (sin tratamiento culinario) que puede transmitir los siguientes
microorganismos: S. aureus, B. cereus, Y.
enterocolitica, L. monocytogenes, Brucella
spp.
Pescados y mariscos
Salvo que se capturen en aguas contaminadas, los pescados frescos raramente
son fuente de microorganismos patógenos para la salud humana. Los microorganismos de interés en Salud Pública
que se asocian al pescado son Salmonella
spp., Staphylococcus spp., Escherichia
coli, Vibrio parahemolyticus, Clostridium
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 47
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
47
perfringens, Clostridium botulinum E y
Enterovirus (13), que se encuentran fundamentalmente en el de origen marino, y
Clostridium botulinum, implicado en
brotes de botulismo debidos al consumo
de pescado crudo escabechado.
La biota del pescado es fundamentalmente psicrótrofa y en el de origen marino también es halofílica. Las contaminaciones más importantes se deben a que
el pescado, pero sobre todo el marisco, se
cría y recoge en aguas contaminadas.
En el pescado son importantes las toxiinfeciones alimentarias producidas por
Vibrio parahaemolyticus.
En los mariscos, Salmonella spp., Escherichia
coli, Vibrio parahaemolyticus, virus y mitilotoxinas.
Alimentos vegetales
En cuanto a la transmisión de enfermedades alimentarias, los productos alimenticios más significativos son los “vegetales terrestres”, es decir, los productos vegetales
que crecen a ras del suelo. La contaminación microbiana en estos casos puede ser
por microorganismos de origen telúrico o
por microorganismos procedentes de aguas
no tratadas, como las aguas residuales.
Alimentos desecados
Se producen pocas toxiinfeciones, pero los
microorganismos implicados suelen ser:
• Clostridium spp.
Figura 8. Pescado y marisco (Mercado de Santander,
fotografías de los autores).
• Bacillus spp.
Tabla 1. Principales fuentes de los microorganismos responsables de las
toxiinfecciones alimentarias.
Agente
Salmonella spp.
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus
Bacills spp.
Escherichia coli
Vibrio parahaemoliticus
Yersinia enterocolitica
Campylobacter jejuni
Listeria monocytogenes
Virus
Fuente alimenticia
Carne, leche fresca y huevos.
Carne, alimentos desecados, especias.
Comidas preparadas en frío, productos lácteos.
Cereales, alimentos desecados, productos lácteos,
carne, productos cárnicos, especias, frutas, verduras
y tubérculos.
Alimentos crudos.
Pescado y marisco crudo y cocinado.
Carne cruda, leche, productos lácteos y vegetales.
Carne cruda, leche fresca o sometida a un tratamiento
térmico inadecuado, agua no tratada.
Carne, productos lácteos, vegetales y mariscos.
Mariscos crudos, alimentos no cocinados (ensaladas)
preparados por manipuladores infectados.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 48
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
48
Comidas rápidas (platos preparados y
precocinados)
considerable, sobre todo para la industria alimentaria.
Son platos con una compleja ecología microbiana debido a los diferentes componentes que tienen y a la laboriosidad en
su preparación, que implica una excesiva
manipulación. Se suelen aislar los siguientes microorganismos:
• Ahorrar coste financiero: debido a la inmovilización de partidas de alimentos
mientras se están analizando.
• Clostridium spp.
• Bacillus spp.
• Y. enterocolitica: en platos con carne.
• L. monocytogenes: en platos con carne.
Métodos rápidos de análisis
microbiológico de los
alimentos
Leotta (14) define como “método rápido”
a cualquier método destinado a la detección, el recuento, la caracterización y la
subtipificación de microorganismos (patógenos y del deterioro) mediante el cual
se obtienen resultados de manera sencilla,
fiable y en menor tiempo que con los métodos convencionales.
La instauración de métodos rápidos de análisis microbiológicos en laboratorios se
debe, sin lugar a dudas, a la economía de
tiempo; en nuestro laboratorio, donde la
prontitud en la respuesta es esencial debido
a la operatividad que deben tener las diferentes unidades de las Fuerzas Armadas, ha
dado un resultado inmejorable.
Además, estos métodos tienen otras ventajas que ha determinado perfectamente
Machanie (15):
• Liberar rápidamente para el consumo
lotes de alimentos intervenidos sanitaria
o comercialmente: esta es una ventaja
• Ahorrar trabajo manual: es un factor
muy importante frente a la Microbiología
tradicional de alimentos; un solo analista
puede procesar, en nuestro laboratorio,
hasta 80 ensayos diarios. Todo esto
frente a los 60 ensayos semanales de la
Microbiología tradicional, sin contar la
preparación de medios de cultivo, que
implicaría invertir un tiempo de 3 días y
la preparación del material utilizado (autoclaves, material de vidrio, tubos, campanas de Durham, matraces de diverso
tipo y tamaño, etc.), y, por supuesto, el
lavado de este material y su correspondiente esterilización, así como la gestión
de residuos biosanitarios, que es mucho
más voluminosa (tabla 2).
• Racionalizar el recurso humano: el personal técnico que antes se ocupaba de
labores propias de análisis microbiológico tradicional de los alimentos puede
dedicarse a otras labores técnicas en el
laboratorio, y lo que es más importante,
ampliar la cartera de servicios del laboratorio con la implantación de nuevas
técnicas.
• Usar equipos semi o totalmente automáticos, con la facilidad que implica a
la hora de manejarlos por medio del
software adecuado.
• Facilitar la ejecución de los ensayos: la
importancia radica en la simplicidad en
la ejecución.
• Analizar cantidades importantes de alimentos.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 49
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
49
Tabla 2. Comparación de los tiempos de análisis microbiológico entre técnicas de
Microbiología automatizada y tradicional.
Microorganismos Microbiología
tradicional
Microbiología
automatizada
Sistema Tempo®/VIDAS®
Distribución
de tiempo según
el resultado:
Microbiología tradicional
Aerobios mesófilos
totales
Mohos y levaduras
72 horas
40 horas
5 días
Enterobacteriaceas
4 días
48 horas, incluido
2 horas en revitalización
24 horas
Coliformes
5 días
24 horas
E. coli
5 días
24 horas
S. aureus
4 días
24 horas
Salmonella spp.
6 días
Listeria spp.
3 días
48 horas (24 horas
de revitalización)
48 horas
• Contribuir a realizar ensayos microbiológicos en momentos de crisis: como en
casos de toxiinfecciones alimentarias, en
las que se necesita un resultado rápido
para poder tratar adecuadamente a las
personas afectadas y localizar el alimento responsable del brote.
• Ahorrar espacio en almacenes.
• Facilitar la eliminación de residuos biológicos por su menor volumen, lo que
implica un menor coste.
• Aumentar la velocidad de los análisis o
su respuesta.
• Disponer de kits sensibles, precisos, con
buen límite de detección: en la actualidad, en nuestro laboratorio se han
acreditado por la Entidad Nacional de
Acreditación (ENAC) ensayos realizados
con Tempo®.
Si – 48 horas
Si + 4 días
Si – 3 días
Si + 5 días
Si – 2-3 días
Sí + 5 días
Si – 2 días
Si + 4 días
Si – 3 días
Si + 6 días
Si – 2 días
Si + 3 días
• Ahorrar espacio de los propios instrumentos y aparatos de análisis por miniaturización.
No obstante, cabe señalar una serie de
desventajas, como son:
• En algunos casos se consideran de
screening, ya que se deben confirmar
los resultados positivos de microbios patógenos por Microbiología tradicional.
• Algunos métodos necesitan enriquecer el analito que se busca antes
de detectarlo: esto no es en sí una
desventaja y solo en las analíticas para
determinación de patógenos por enzimoinmunoensayo (método VIDAS ®,
bioMérieux) se invierte un tiempo considerable.
• Usualmente, costes algo más elevados
que los métodos tradicionales: esto no
es del todo exacto, ya que existen mé-
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 50
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
50
todos más baratos, sobre todo en el
caso de utilización del método del NMP
por Microbiología tradicional. No obstante, sería necesario realizar de un
coste por ensayo realizado.
• El horario del laboratorio podría modificarse según el método: este sí es uno
de los inconvenientes importantes, ya
que en muchos casos se amplían los
horarios del personal técnico de laboratorio.
• No siempre son flexibles; es decir, el kit
no permite más de un tipo de uso.
• No siempre hay disponibilidad regular
de los kits en el mercado: este aspecto,
junto con la exclusividad de las casas comerciales respecto al método de ensayo, ha hecho que tengamos que disponer de alternativas que se puedan
usar rápidamente, manteniendo en
nuestro caso los ensayos microbiológicos por método clásicos.
• Algunos métodos también detectan los
microorganismos muertos.
Técnicas de análisis rápido
en Microbiología de los alimentos
Con relación a los diferentes métodos de
Microbiología rápida, el estudio realizado
por la Dra. Martín de Santos (16) es el
más completo, si bien existen otras clasificaciones más generales, pero siempre
basadas en la clasificación por fundamentos técnicos de análisis.
A continuación enumeramos los que estamos utilizando dentro de nuestro ámbito de trabajo, como laboratorio de referencia en seguridad alimentaria del
Ministerio de Defensa.
Recuentos de células viables
• Sistema Iso-Grid (QA laboratories Ltd.,
San Diego, Calif., EE.UU.): está aceptado por la Association of Official
Analytical Chemists International
(AOAC International) para la enumeración de bacterias, mohos y levaduras en
muchos tipos de alimentos.
Este sistema lo estamos utilizando para
análisis microbiológico de aguas de consumo humano y se encuentra acreditado por ENAC, con unas ventajas considerables en tiempo de trabajo,
simplicidad a la hora de realizarlo, pero
con periodos de incubación muy parecidos a los empleados en Microbiología
tradicional.
• Sistema Petrifilm (3M Co., St. Paul, Minn.,
EE.UU.): utiliza medios de cultivo deshidratados sobre películas plásticas de tamaño y grosor similares al de una tarjeta.
Figura 9. Utilización del Sistema Iso-Grid en el Servicio de Bromatología y Seguridad Alimentaria (fotografía de los
autores).
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 51
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
51
Existen equipos para la lectura automatizada de los resultados (lector de placas
3M Petrifilm, 3M®). Este método es muy
utilizado en la monitorización de los protocolos de limpieza y desinfección (L + D),
como parte de los prerrequisitos de los
sistemas de APPCC. Se han realizado estudios comparativos del uso de los medios tradicionales y del sistema Petrifilm
para Staphylococcus spp., no hallando diferencias significativas (p > 0,05) entre los
recuentos medios, realizados en leche
cruda y queso fresco contaminados con
cepas de Staphylococcus spp. coagulasa
positivos (19), para los sistemas de ensayo
comparados.
Sistemas miniaturizados y kits de
diagnóstico
• Los sistemas miniaturizados surgen a
partir del concepto de placa microtituladora (96 pocillos, formato 8 x 12); es un
sistema muy utilizado para la identificación de microorganismos hasta el nivel
de especie.
• Para la automatización del método del
NMP se han desarrollado tarjetas de
material plástico que contienen tres
grupos de 16 pocillos, con un loga-
Figura 10.Sistema API (bioMérieux Hazelwood, Mo,
EE.UU.). Galerías que permiten la identificación de
más de 800 especies de bacterias y levaduras como
Salmonella spp. (fotografía de los autores).
ritmo de diferencia en volumen para
cada grupo de pocillos, y medios de
cultivo con indicadores fluorescentes
(Tempo®, bioMérieux, Hazelwood, Mo,
EE.UU.).
Es un sistema que nuestro laboratorio
ha acreditado por ENAC y que está
dando unos magníficos resultados en
cuanto a la rapidez de respuesta en análisis de alimentos que consumen los militares españoles en operaciones en el
extranjero.
Las ventajas frente a la Microbiología tradicional se han definido en la tabla 2.
Figura 11. Sistema Tempo®: determinación de indicadores microbiológicos de calidad y de sanidad.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 52
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
52
Equipos de medida de la biomasa microbiana
• Bioluminiscencia o medida del ATP: se
está utilizando este tipo de equipos
para monitorización de limpieza y desinfección en servicios de restauración
colectiva del Ejército de Tierra.
• Turbidimetría: la turbidimetría o nefelometría es una técnica utilizada para
evaluar el crecimiento de un cultivo
microbiano. Se basa en la propiedad
de las partículas de pequeño tamaño
de refractar la luz incidente. Dentro de
ciertos límites, existe una relación
entre la cantidad de luz que atraviesa
una suspensión celular y el número de
microorganismos presentes en ella. Es
importante destacar que en el año
2004 se leyó una tesis doctoral realizada en nuestro Servicio de Bromatología y Seguridad Alimentaria cuya
fase experimental se basó en esta
técnica.
Técnicas inmunológicas
Sistema VIDAS ® (bioMérieux, Hazelwood, Mo, EE.UU.), que permite
completar la reacción de ELISA entre 45
minutos y 2 horas dependiendo del microorganismo diana o toxina que se pretenda detectar. Puesto que la técnica incorpora un sistema de detección
fluorescente recibe el nombre de ELFA
(Elisa Linked Fluorescent Assay). En
nuestro laboratorio está dando unos
magníficos resultados. En la tabla 1 se
comparan los tiempos de análisis entre
esta técnica y las equivalentes de
Microbiología tradicional.
Figura 12. Equipo MINIVIDAS® del Servicio de
Bromatología y Seguridad alimentaria del CEMILVET
(fotografía de los autores).
Técnicas de Biología Molecular
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) en tiempo real: se trata de una
técnica basada en la amplificación del
ADN de los microorganismos diana, con
el fin de disponer de una cantidad suficiente que permita su detección. Es una
técnica específica, sensible y rápida.
Los procedimientos de análisis de ADN
mediante PCR constan de tres etapas: purificación del ADN, amplificación de las secuencias específicas y detección de los
productos de amplificación.
En la PCR a tiempo real se emplean dos
tipos de sistemas de detección por fluorescencia: agentes intercalantes y sondas
específicas marcadas con fluorocromos.
Los agentes intercalantes son fluorocromos que aumentan notablemente la
emisión de fluorescencia cuando se unen
a una molécula de ADN de doble hélice.
El más empleado es el SYBR® Green I. La
fluorescencia emitida se incrementa de
modo proporcional al ADN que se forma
en cada ciclo de PCR. Este sistema tiene
la ventaja de ser más barato que las
sondas específicas; sin embargo, tiene
como inconveniente su baja especificidad,
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 53
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
53
puesto que se unen de manera indistinta
a productos que se pueden generar inespecíficamente o a dímeros de los propios
oligocebadores de la reacción.
Las sondas de hibridación específicas se
marcan con dos tipos de fluorocromos: un
donador y un aceptor. El proceso se basa
en la transferencia de energía fluorescente
mediante resonancia (FRET) entre las dos
moléculas. Las más utilizadas son las sondas
de hidrólisis, también conocidas como
sondas TaqMan®. Gracias a la alta especificidad de los cebadores y las sondas
TaqMan® es posible distinguir el patógeno
de estudio entre las especies filogenéticamente más relacionadas en el alimento, por
lo que su uso es el más extendido en la
cuantificación de bacterias (17).
Las sondas TaqMan® son oligocebadores
marcados con un fluorocromo donador en
el extremo 5´ que emite fluorescencia al ser
excitado y un aceptor o apantallador en el
extremo 3´ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador. La ADN polimerasa
se desplaza sobre la cadena de ADN, sintetizando la hebra complementaria a partir
de un fragmento de ADN que sirve de
molde. Como consecuencia de la actividad
5´-3´ exonucleasa de la polimerasa, se produce la hidrólisis de la sonda, la separación
física de los dos fluoróforos y un aumento
en el rendimiento cuántico que permite la
cuantificación del producto acumulado en
cada ciclo.
En la PCR en tiempo real se cuantifica
ciclo a ciclo el producto de la reacción,
para lo que se requieren sistemas de detección sensibles que permitan mostrar la
acumulación de productos en la fase exponencial de la reacción (momento en el
que existe una buena correlación entre
concentración de producto amplificado y
concentración inicial de moléculas diana).
El parámetro que se emplea en la cuantificación es el ciclo umbral (Ct), definido
como el número de ciclos necesarios
para generar una señal estadísticamente
significativa por encima de la señal de
ruido. La cuantificación se basa en que
cuanto mayor sea la concentración de
secuencia diana, antes se alcanzará el Ct.
Cuando la eficiencia es constante, el
ciclo umbral es inversamente proporcional al logaritmo de la cantidad inicial
de moléculas (18).
Los valores Ct obtenidos con cantidades
conocidas de la secuencia diana se usan
para establecer una recta de calibrado,
que permite calcular la concentración inicial de secuencia diana en la muestra problema.
Las principales ventajas de la PCR en
tiempo real son:
• Minimiza el riesgo de contaminación,
puesto que la amplificación y la detección se realizan en el mismo tubo.
• Intervalo amplio de concentraciones de
ensayo.
• Alta capacidad de procesamiento.
• Tiempos de análisis cortos.
Respecto a estos dos últimos sistemas descritos (VIDAS® y PCR), se han realizado
evaluaciones a partir de muestras contaminadas naturalmente con S. aureus coagulasa positivo (20), empleando los métodos cuantitativos clásicos de agar
Baird-Parker, agar plasma de conejo y el
sistema Petrifilm. Las colonias de morfología típica aisladas se estudiaron por el
sistema VIDAS® y la PCR-rt; estos últimos
presentaron mejor rendimiento para la
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 54
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
54
identificación de toxina del Staphylococcus
aureus en comparación con los medios
tradicionales descritos anteriormente, incluyendo una mayor frecuencia de toxinapositivos en colonias aisladas y mejores índices de correlación entre los recuentos
típicos y los ya mencionados toxina-positivos. Entre todos los medios de cultivo
evaluados, no hubo diferencia significativa
(p > 0,05).
Figura 13. Equipo PCR-rt del Servicio de Bromatología
y Seguridad Alimentaria del CEMILVET (fotografía de
los autores).
ECOLOGÍA MICROBIANA
DE LOS ALIMENTOS
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
DE LOS ALIMENTOS
Sistemas de análisis rápido
y automatizado
• Identificación de peligros
• Gestión de riesgos
• Establecimiento de PCC
• Monitorización de APPCC
• Verificación de PCC
• Establecimiento de PCC
APPCC
ALIMENTOS SANITARIAMENTE
SEGUROS Y, POR LO TANTO, AUSENCIA
DE ENFERMEDADES DE TRANSMISIÓN
ALIMENTARIA
Figura 14.
Bibliografía
1. Jefatura del Estado. Ley General de Sanidad.
Boletín Oficial del Estado 29-04-1986;
102:15.207-24.
3. Martín-Martínez Conde J. Guía del Inspector
Veterinario Titular. Biblioteca veterinaria
AEDOS, Editorial AEDOS. 1975.
2. Jefatura del Estado. Ley 44/2003, de 21 de
noviembre, de ordenación de las profesiones
sanitarias. Boletín Oficial del Estado 22-112003; 280:41.442-58.
4. International Comission on Microbiological
Specifications for Foods (ISMSF). Ecología
Microbiana de los Alimentos 2. Productos
Alimenticios. Editorial Acribia. 1982; vol. II.
2 Valencia 26 MAYO.qxd
14/12/12
11:06
Página 55
Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos
55
5. International Comission on Microbiological
Specifications for Foods (ISMSF). Ecología
Microbiana de los Alimentos 1. Factores que
afectan a la supervivencia de los microorganismos de los alimentos. Editorial Acribia.
1980; vol. I.
6. Sobel J. Botulism. Clin Infect Dis 2006;
41(8):1.167-73.
7. Haas MJ. Lipolytic Microorganism. En:
Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 4.ª
Ed. American Public Health Association.
2001; 175-81.
8. Te Giffel MC, Beumer RR, Bonestroo MH,
Rombouts FM. Incidence and characterization of Bacillus cereus in two dairy processing plants. Nederlands melk en
Zuiveltijdschrift 1996; 50(4):479-92.
9. Paulin S, Horn B, Hudson JA. Factors influencing staphylococcal enterotoxin production
in Dairy Products. MPI Technical – chose one
Paper No: 2012/07. Ministry for Primary
Industries. Nueva Zelanda. 2012.
10. Maragkoudakisa PA, Mountzourisb KC,
Psyrrasa D, y col. Functional properties of
novel protective lactic acid bacteria and
application in raw chicken meat against
Listeria monocytogenes and Salmonella
enteritidis. Int J Food Microbiol 2009;
130(3):219-26.
11. Pennacchia C, Ercolini D, Villani F.
Development of a Real-Time PCR assay for
the specific detection of Brochothrix thermosphacta in fresh and spoiled raw meat.
Int J Food Microbiol 2009; 134(3):230-6.
12. Parlamento Español. Real Decreto
1254/1991, de 2 de agosto, por el que se
dictan normas para la preparación y conservación de la mayonesa de elaboración
propia y otros alimentos de consumo inmediato en los que figure el huevo como ingrediente. Boletín Oficial del Estado 03-081991; (185):25.741-2.
13. Yagoub SO. Isolation of Enterobacteriaceae
and Pseudomonas spp. from raw fish sold
in fish market in Khartoum state. J Bacterial
2009; 1(7):85-8.
14. Leotta GA. Métodos rápidos: una herramienta útil y práctica para el análisis microbiológico de los alimentos. Revista Argentina
de Microbiología 2009; (41):63-63.
15. Machanie S. Métodos alternativos, precisos
y rápidos para el control microbiológico de
alimentos. Empaque Alimentación 2005;
Año XI(1):64-71.
16. Martín de Santos R. Métodos rápidos y automatizados aplicados al análisis microbiológico de alimentos. En: Monografías de la
Real Academia Nacional de Farmacia.
Monografía XXXI: Aspectos Higiénicos de
los Alimentos Microbiológicamente Seguros.
Real Academia de Farmacia. 2010.
17. Costa J. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real. Enferm Infecc
Microbiol Clin 2004 ; 22:299-305.
18. Zamora A, Mediavilla CI, Rodríguez-Marín
JL, Sarmiento P, López LA. Investigación de
Organismos Modificados Genéticamente
(OMG,s) en alimentos suministrados a las
FAS. Med Mil (Esp) 2005; 61(4):334-7.
19. Viçosa GN , Moraes PM , Yamazi AK , Nero
LA . Enumeration of coagulase and thermonuclease-positive Staphylococcus spp. in raw
milk and fresh soft cheese: an evaluation of
Baird-Parker agar, Rabbit Plasma Fibrinogen
agar and the Petrifilm Staph Express count
system. Food Microbiol 2010 Jun;
27(4):447-52.
20. Zhang C, Zhang D , Yang J , Zhou J , Hu
Q, R Ling , Dong M. Comparative evaluation of the association among enumeration methods and production of enterotoxins in food-derived Staphylococcus
aureus. J AOAC Int 2012 Jan-Feb;
95(1):105-10.
Bases moleculares de la producción de
antibióticos beta-lactámicos
Dr. Carlos García Estrada
Resumen
Con cientos de millones de prescripciones
anuales, los antibióticos beta-lactámicos
son unos de los medicamentos más frecuentemente empleados en la Medicina
Humana y Veterinaria a nivel mundial. La
síntesis de penicilina se lleva a cabo por
un número limitado de hongos ascomicetos de los géneros Aspergillus y
Penicillium. Dentro de este último género
se incluye al productor industrial de penicilina, Penicillium chrysogenum. La penicilina no fue descubierta mediante sofisticados sistemas de selección y análisis de
compuestos, sino por un científico que al
volver de vacaciones se dio cuenta del
poder antibacteriano que ejercía un
hongo (poco después se sabría que era
Penicillium notatum) que por casualidad
había contaminado una placa de Petri
sembrada con Staphylococcus aureus.
Recientemente, se han cumplido 80 años
desde que Alexander Fleming hizo este
descubrimiento, logrando así uno de los
hitos más importantes que han marcado
la historia reciente de la medicina.
La tremenda colaboración existente entre
universidades y laboratorios de Inglaterra
y Estados Unidos durante la Segunda
Guerra Mundial dio lugar a ensayos clínicos de gran escala con la penicilina para
tratar a los heridos en batalla. El interés
de las empresas farmacéuticas por el producto llevó a la búsqueda de cepas del
hongo productor que tuviesen mayores
rendimientos en la producción de antibiótico. Tras el aislamiento de P. chrysogenum NRRL 1951 a partir de un melón
en un mercado local de Peoria (IL, EE.UU.)
hace casi siete décadas, los programas industriales de mutagénesis clásica y selección han dado lugar al desarrollo de cepas
industriales con una productividad aumentada en al menos tres órdenes de
magnitud respecto al aislado inicial. Estas
cepas industriales han sufrido numerosos
cambios durante este largo proceso. Únicamente unos pocos de estos cambios se
habían caracterizado hasta la llegada de
la era de las “ómicas“ estos últimos años.
Tras la publicación del genoma de P. chrysogenum en el año 2008, se aportó información relevante acerca de los aspectos
reguladores y del desarrollo que controlan
los procesos moleculares que se encuentran detrás de la síntesis del fármaco milagroso del siglo XX, la penicilina. Además,
estudios más recientes de proteómica y
metabolómica han proporcionado la clave
para comprender los mecanismos moleculares subyacentes del proceso de mejora de cepas. Estos estudios han revelado
que el incremento en la producción por
parte de las cepas industriales de P. chrysogenum es consecuencia de un cuidadoso reequilibrio entre diversas rutas metabólicas, mostrando así la versatilidad de
este hongo filamentoso para la producción de antibiótico.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
58
Introducción a los antibióticos
beta-lactámicos
El descubrimiento de los antibióticos fue
uno de los avances más trascendentales
en la historia de la medicina, puesto que
con ellos se ha podido hacer frente a las
enfermedades infecciosas que han causado la muerte de millones de seres humanos a lo largo de la historia de la humanidad, consiguiendo estos reducir
drásticamente el índice de mortalidad.
Los antibióticos (palabra de origen griego
que significa anti: contra y bios: vida; es
decir, inhibidores de la vida de otros seres
vivos) pueden definirse como sustancias
químicas orgánicas de bajo peso molecular producidas por microorganismos
que son capaces de inhibir selectivamente, a bajas concentraciones, el crecimiento de otros microorganismos
(Waksman, 1947). Estos compuestos son
mayoritariamente sintetizados una vez
que la densidad del cultivo del microorganismo productor llega a su valor máximo,
a su vez coincidiendo con una velocidad
específica de crecimiento baja. Por este
motivo y en función de que son compuestos no indispensables para la viabilidad del microorganismo productor, los
antibióticos son considerados como metabolitos secundarios. La función biológica de estos compuestos en los microorganismos productores se atribuye
generalmente a que confieren una ventaja ecológica cuando dichos microorganismos deben competir con otros por los
nutrientes del medio ambiente (Martín y
Demain, 1980).
Clasificación y estructura química de
los antibióticos beta-lactámicos
Los antibióticos beta-lactámicos se incluyen dentro de los antibióticos de tipo
peptídico. Se pueden clasificar según su
estructura química en cinco grupos
(tabla 1) (O´Sullivan y Sykes, 1986;
Aharonowitz y col., 1992). La característica estructural común a todos ellos es
un anillo beta-lactámico de cuatro
miembros, formado por la condensación
no ribosómica de tres aminoácidos:
L-valina, L-cisteína y ácido L-α-aminoadípico. Exceptuando las monolactamas,
que solo presentan el anillo beta-lactámico, estos compuestos están formados
por un sistema bicíclico, siendo la estructura de este segundo anillo la que
permite su clasificación.
Tabla 1. Clasificación de los antibióticos beta-lactámicos según su estructura química.
Estructura química
H
N
R
S
O
Penicilinas
CH3
N
O
CH3
Antibióticos
Penam COOH
H
N
R
O
O
Cefalosporinas
R
S
N
CH2R
COOH
Ceph-3-em
Cefamicinas
Cefabacinas
Microorganismos productores
Hongos
Bacterias
Gram+
Gram–
P. chysogenum
P. notatum
A. Nidulans
A. chysogenum
P. persinicus
Flavobacterium sp.
S. clavuligerus
L. lactamgenus
N. lactamdurans
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
59
Tabla 1. Clasificación de los antibióticos beta-lactámicos según su estructura química
(continuación).
Estructura química
O
N
O
Antibióticos
Ácido
clavulánico
R
H
HR
Microorganismos productores
Hongos
Bacterias
Gram+
Gram–
S. clavuligerus
Clavam
N
O
Tienamicinas
Ácidos olivánicos
Epitienamicinas
Nocardicinas
R
H
H COOH
R
Carbapenem
H
N R
R
O
SO3H
H
N
E. carotovora
Serratia sp.
N. uniformis
Subsp.
Tsuyamanensis
N
O
R
S. clavuligerus
S. olivaceus
OH
O
Monobactamas
N
O
H
COOH
E. radiobacter
P. acidophila
Monolactam
En el caso de las penicilinas, el núcleo central es el 6-APA, formado por el anillo betalactámico asociado a un segundo anillo tiazolidínico. Sin embargo, las cefalosporinas
y las cefamicinas contienen como núcleo
central el ácido 7-aminocefalosporánico,
formado por el anillo beta-lactámico unido
a un anillo dihidrotiazínico (figura 1).
Anillo dihidrotiazínico
Anillo tiazolidínico
H
N
R
H
N
R
S
S
O
O
O
N
O
N
COOH
COOH
Anillo ß-lactámico
Penicilinas
Figura 1. Estructura química general de penicilinas y cefalosporinas.
R
Anillo ß-lactámico
Cefalosporinas
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
60
Los antibióticos beta-lactámicos poseen
cadenas laterales (la R indica las diferentes
cadenas laterales), que confieren un carácter hidrofílico o hidrofóbico; así, algunas penicilinas son de carácter hidrofóbico al presentar una cadena lateral de
ácido fenilacético (penicilina G o bencilpenicilina) o ácido fenoxiacético (penicilina V), mientras que otras presentan una
cadena lateral hidrofílica de ácido L-αaminoadípico (isopenicilina N).
Las penicilinas con una cadena lateral hidrofóbica son exclusivamente sintetizadas
por hongos filamentosos, como es el caso
de especies del género Penicillium (P. chrysogenum, P. nalgiovense y P. griseofulvum). Sin embargo, la producción de
antibióticos beta-lactámicos de tipo hidrofílico tiene lugar en hongos filamentosos,
como Acremonium chrysogenum, y en
muchos actinomicetos, como especies del
género Streptomyces sp., además de algunas especies bacterianas gramnegativas
(Aharonowitz y col., 1992).
Algunas de las penicilinas son producidas
de forma natural por los microorganismos
que las sintetizan. A partir de las producidas naturalmente pueden sintetizarse
químicamente otras penicilinas de mayor
interés farmacéutico que se denominan
penicilinas semisintéticas (ver más adelante).
Mecanismo de acción de los
antibióticos beta-lactámicos
Los antibióticos beta-lactámicos son
agentes bactericidas que bloquean la última etapa en la síntesis de la pared celular: el entrecruzamiento de las distintas
cadenas del peptidoglicano, que es un
componente indispensable de la pared ce-
lular bacteriana que consta de cadenas de
polisacáridos lineales que están entrecruzadas con péptidos cortos.
La penicilina inhibe las enzimas DDtranspeptidasa y DD-carboxipeptidasa,
proteínas llamadas “PBP“ (penicillin binding proteins) o de unión a penicilina,
responsables de dicho entrecruzamiento,
llegando al centro activo de estas porque
se confunden con el sustrato normal de
las enzimas, el compuesto acil-D-alaninaD-alanina, mimetizándolo en la reacción
de entrecruzamiento. Estas penicilinil-enzimas ya no reaccionan más y, por lo
tanto, quedan inhibidas de forma irreversible. Esto provoca que la pared celular se vuelva osmóticamente sensible,
con la consiguiente autolisis de la bacteria (Giesbrecht y col., 1991; Frère y
col., 1993). Además, estos antibióticos
desencadenan la activación de hidrolasas
de la pared celular y de autolisinas, lo
que conduce a la lisis celular (Kong et al.,
2010).
La actividad de estos antibióticos es
mucho mayor frente a bacterias grampositivas que frente a gramnegativas. La explicación a esta diferencia en la actividad
se encuentra en el diferente porcentaje de
peptidoglicano en la composición de la
pared celular de ambos grupos. Mientras
que el peptidoglicano es el componente
mayoritario de la pared celular de las bacterias grampositivas, constituye solo una
fina capa en la pared celular de las bacterias gramnegativas. En todo caso, el espectro de actuación se ha ido ampliando
a lo largo de los años con la incorporación
de nuevas moléculas que poseen una
mayor actividad frente a los microorganismos Gram negativos.
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
61
Farmacocinética de las penicilinas
Las penicilinas naturales son antibióticos
tiempo-dependientes. La dosis de penicilina que se administra es de 10.000 a
20.000 UI/kg. Con esto se obtiene una
concentración del antibiótico en el plasma
de 2 μg/ml. Tras la administración parenteral intramuscular o subcutánea, las penicilinas se absorben rápidamente, se distribuyen a casi todo el organismo y alcanzan
niveles muy altos en pulmones, riñones,
útero, ubre e hígado. No atraviesan la barrera placentaria, ni el peritoneo ni la
pleura. Tras su aplicación intrauterina, se
absorbe al torrente sanguíneo y difunde a
la glándula mamaria.
La penicilina G sódica y la penicilina G potásica son las de más rápida absorción, alcanzan niveles terapéuticos en 15-30 minutos y su vida media se prolonga hasta 60
minutos después de su aplicación. La penicilina G procaínica alcanza niveles terapéuticos a las 4 horas y tiene una vida
media de 24 horas. La penicilina G benzatínica es una combinación de la bencilpenicilina con benzatina, para que se absorba
lentamente desde el punto de inyección.
Es una opción cuando se requiere de tratamientos prolongados. Alcanza su máxima absorción a las 24 horas, con niveles
séricos que permanecen hasta 48 horas
después de la inyección.
Las penicilinas se eliminan sin ser biotransformadas, no son metabolizadas o solo
mínimamente metabolizadas y son excretadas en un 80% por los riñones y en un
20% por otras vías, que incluyen el hígado y la glándula mamaria.
Las penicilinas son inestables ante la temperatura y la luz solar, son higroscópicas,
se hidrolizan rápidamente, se oxidan fá-
cilmente y son sensibles a las variaciones
de pH.
Penicilina: descubrimiento y
caracterización
Aunque el año que se suele tomar como
punto de partida de la historia de los antibióticos es el del descubrimiento de la
penicilina (1928), ya en el siglo XIX algunos
investigadores, como Cornil y Babés
(1885), llevaron a cabo experimentos con
microorganismos vivos sobre antagonismo microbiano, sugiriendo que existiría
un agente inhibidor de naturaleza química producido por uno de los microorganismos que interferiría en el crecimiento del otro, denominando a este
fenómeno con el nombre de antibiosis.
Algo más tarde, otros investigadores,
como Ernest Duchesne y Andre Gratia,
también observaron el efecto de antibiosis
ejercido entre hongos y bacterias.
En septiembre de 1928, Alexander
Fleming, profesor de bacteriología del St.
Mary´s Hospital de Londres, estaba intentando aislar la bacteria Staphylococcus
aureus. Para este propósito desarrolló la
bacteria en placas de cultivo y cuando observó estas después de un periodo corto
vacacional, apreció la contaminación de
alguna de ellas con un hongo. Las placas
contaminadas deberían haber sido descartadas; sin embargo, Fleming se dio
cuenta de la ausencia de crecimiento de
bacterias alrededor de las colonias del
hongo que contaminó accidentalmente
los cultivos bacterianos.
Fleming aisló el hongo y lo identificó,
viendo que se trataba del género
Penicillium; por su morfología concluyó
que era Penicillium rubrum y denominó al
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
62
compuesto capaz de inhibir el crecimiento
de las bacterias “penicilina“. Trató
además de concentrar y purificar el antibiótico, pero encontró que la penicilina se
destruía fácilmente y todos los intentos y
propósitos fracasaron. El hallazgo de
Fleming fue publicado el 10 de mayo de
1929 en el British Journal of Experimental
Pathology (Fleming, 1929). El artículo describe una extensa serie de experimentos
donde se establece claramente el potencial de la penicilina como agente terapéutico. El artículo de Fleming describiendo
la penicilina no causó mucho interés al
principio, y el descubrimiento quedó reducido a una mera observación, manteniéndose desconocido fuera del círculo
científico. Solo unas pocas publicaciones
referentes a la penicilina aparecieron en
los siguientes 10 años, siendo la más importante la que identificó correctamente
el hongo aislado por Fleming como
Penicillium notatum en lugar de P. rubrum
(Clutterbuck y col., 1932).
Un segundo capítulo en la historia de la
penicilina comenzó en el año 1938,
cuando el médico patólogo australiano
Howard Walter Florey y el bioquímico de
origen alemán Ernst Boris Chain, junto
con el británico Norman Heatley, iniciaron
una investigación detallada de las propiedades terapéuticas de la penicilina. Florey
se ocupó de los aspectos biológicos y farmacológicos, Chain se ocupó de las propiedades químicas y bioquímicas y Heatley
se ocupó de la producción, de cómo cultivar la mayor cantidad posible del microorganismo para que produjese gran cantidad del principio activo y, finalmente, de
separarlo del caldo de cultivo y purificarlo.
Fruto de este trabajo se consiguió aislar el
antibiótico con una pureza aceptable me-
diante las nuevas técnicas cromatográficas en columna. En agosto de 1940 se
describieron métodos para la producción
de la penicilina y la utilización con éxito
del antibiótico para curar infecciones en
ratones (Chain y col., 1940). El éxito de
estos experimentos iniciales permitió
tomar la decisión de llevar a cabo el
primer ensayo clínico en humanos.
La importancia médica de la penicilina,
gracias a los buenos resultados obtenidos,
fue comprendida de inmediato. Debido al
conflicto de la Segunda Guerra Mundial,
Florey y Heatley fueron a los Estados
Unidos y convencieron al Departamento
de Agricultura Americano (USDA) y a varias compañías farmacéuticas (Charles
Pfizer & Co., E.R. Squibb & Sons, y Merck
& Co., entre otras) para que produjesen
penicilina. La mejora del proceso y su producción a escala industrial fue llevada a
cabo en los Estados Unidos en el Northern
Regional Research Laboratory (NRRL) de
Peoria, Illinois. En agosto de 1941,
Abraham y colaboradores (1941) describieron en detalle las condiciones ideales
para la producción de penicilina en
grandes cantidades. El descubrimiento de
la penicilina y el desarrollo de un método
de producción masiva supuso la concesión del Premio Nobel de Medicina y
Fisiología en el año 1945 a los científicos
Sir Alexander Fleming, Ernst Boris Chain
y Sir Howard Walter Florey.
Las innovaciones más relevantes en la producción de penicilina a gran escala fueron
el aislamiento y selección de nuevas cepas
y la optimización del proceso de fermentación, sustituyendo el cultivo en superficie por cultivos sumergidos (Moyer y
Coghill, 1946a, b), la utilización de líquido
de maceración de maíz como fuente de
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
63
nitrógeno y la adición de precursores de
la cadena lateral, tales como el ácido fenilacético (Moyer y Coghill, 1947). El incremento de la producción también fue
posible gracias al desarrollo de la tecnología del proceso industrial, introduciendo
mejoras como la ingeniería de aireación y
el sistema de mezclado en fermentadores.
Paralelamente a las investigaciones destinadas a producir penicilina a gran escala,
se llevaron a cabo estudios que permitieron determinar la estructura química de
la penicilina (Clarke y col., 1949).
El ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) fue
detectado en fermentaciones en el año
1957 y aislado en forma pura 1 año más
tarde (Batchelor y col., 1959). Este hallazgo fue el punto de partida para el desarrollo de las penicilinas semisintéticas
mediante la incorporación de diferentes
cadenas laterales al núcleo de 6-APA por
un proceso químico (ver apartado más
adelante).
Mejora de cepas productoras
de penicilina
La cepa original de Penicillium aislada por
Fleming y que fue designada como P. notatum NRRL-1249 producía alrededor de
2-3 μg/ml de penicilina. En la búsqueda
por conseguir cepas con un incremento
en los títulos de penicilina se enviaron
muestras de tierra de todas partes del
mundo (recogidas durante la Segunda
Guerra Mundial) al Northern Regional
Research Laboratory (NRRL) de Peoria,
Illinois, donde fueron analizadas, consiguiéndose cepas que incrementaban la
producción de penicilina en cultivos sumergidos.
Sin embargo, la mejor cepa aislada fue
hallada en Peoria a partir de un melón enmohecido obtenido en el mercado local.
Esta cepa fue designada como P. chrysogenum NRRL-1951, la cual presentaba
mayor capacidad de producción (0,25 mM;
60 μg/ml) que la cepa de Fleming y era
más adecuada para cultivos sumergidos
(Raper, 1946). A partir de la cepa P. chrysogenum NRRL-1951 y por mutagénesis
al azar utilizando mutágenos tanto físicos
(luz UV, rayos X) como químicos (nitrosoguanidina), se fueron obteniendo sucesivas cepas que se seleccionaron según su
mayor producción. Tras varios pasos de
mutación se consiguió aislar la cepa Wis
Q-176 con un título de hasta 1.000 μg/ml
de penicilina. Esta cepa fue adoptada por
la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fue la original de la conocida línea
Wisconsin en los distintos programas de
mejora de cepas (Backus y Stauffer,
1955).
Dichos programas han conseguido aumentar la productividad más de 1.000
veces (Lein, 1986; Elander, 2003). No solo
ha sido importante el aumento del rendimiento en el desarrollo de las cepas, sino
que también han sido optimizados otros
factores que tienen un efecto muy importante sobre la recuperación del producto,
como, por ejemplo, la eliminación de pigmentos que se purificaban junto con la
penicilina.
Aparte de la Universidad de Wisconsin, algunas compañías farmacéuticas desarrollaron sus propios programas industriales
de mejora de cepas con el fin de obtener
cepas de alta producción de penicilina. Sin
embargo, se disponen de pocos datos
acerca de dichos programas. Por ejemplo,
Panlabs Inc. (Taiwán) comenzó el programa
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
64
Biosíntesis de penicilina
con las cepas P1 y P2, ambas derivadas de
la cepa Wis Q-176 (Lein, 1986); la empresa
holandesa DSM, con sede en Delft, desarrolló la cepa DS04825 a partir de la
Wisconsin 54-1255 (Gouka y col., 1991);
Wyeth Lab (West Chester Pa, EE.UU.) desarrolló las cepas M (obtenidas a partir de
la cepa Wisconsin 51-20 strain, uno de los
ancestros de Wisconsin 54-1255), y
Antibióticos S.A. (León, España) produjo
las cepas AS-P-78, AS-P-99 y E1 a partir de
la familia de cepas Wisconsin (Fierro y col.,
1995). Los mutantes superproductores que
se emplean actualmente por la industria
pueden alcanzar títulos de más de 50
mg/ml (83.300 u.i./ml) en fermentaciones
industriales (Peñalva y col., 1998).
La ruta de biosíntesis de penicilina ha sido
estudiada en detalle a nivel molecular y
bioquímico (Martín y col., 2010). En la figura 2 se muestra un esquema de la ruta
biosintética de penicilina con las actividades enzimáticas implicadas en cada una
de las tres etapas.
El primer paso consiste en la formación del
tripéptido ACV: δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina por condensación no ribosómica de los tres aminoácidos que lo conforman (ácido L-α-aminoadípico, L-cisteína
y L-valina), llevada a cabo por la enzima
ACV sintetasa (ACVS). El segundo paso de
la vía biosintética es la ciclación oxidativa
del tripéptido ACV para dar lugar al com-
L-α-aminoadípico
H2N L
H
L-cisteína
H2N
COOH
COOH
L-valina
H2N
SH
COOH
δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina
pcbAB (acvA)
ACV sintetasa
H2N
H
N
H COOH
(LLD-ACV)
COOH
O
O
SH
NH
COOH
Isopenicilina N sintasa
pcbC (acvA)
H 2N L
H
COOH
Isopenicillin N
H
N
O
O
S
N
COOH
PAA-CoA
L-α-aminoadípico
Bencilpenicilina
H
N
O
O
penDE (aatA)
Isopenicilina N
aciltransferasa
S
N
COOH
HS-CoA
Figura 2. Ruta biosintética de penicilina en P. chrysogenum.
L-α-aminoadípico
H2N
PAA-CoA
S
O
6-APA
N
COOH
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
65
puesto isopenicilina N (IPN), ya con una
débil actividad antibiótica. La enzima responsable de la ciclación es la isopenicilina
N sintasa (IPNS), también denominada ciclasa. El paso final de la biosíntesis de penicilinas consiste en la sustitución de la cadena lateral de L-α-aminoadípico por un
ácido orgánico activado mediante coenzima A (CoA), que en el caso de la bencilpenicilina es el ácido fenilacético. Este último paso es llevado a cabo por la enzima
acil-CoA: isopenicilina N aciltransferasa
(IAT).
Genes y proteínas biosintéticos
El gen pcbAB y la ACVS
El gen que codifica la enzima ACVS fue
denominado pcbAB porque se suponía
que eran dos los genes implicados en la
biosíntesis de L-α-aminoadipil-L-cisteinil
(AC) en primer lugar y ACV a continuación (Martín y col., 1990). Algunas evidencias genéticas posteriores demostraron la existencia de un único gen que
codifica una única enzima que contiene
todas las actividades necesarias para la
biosíntesis de ACV. Estudios transcripcionales revelaron la existencia de un ARN
mensajero de aproximadamente 11,5 kb,
tamaño que fue confirmado al secuenciarse el gen y comprobarse la existencia
de un ORF (Open Readin Frame) de
11.376 pb, que codifica una proteína de
3.792 aminoácidos con un peso molecular deducido de 426 kDa. Este gen ha
sido clonado en P. chrysogenum (Díez y
col., 1990; Smith y col., 1990). El ORF de
este gen no está interrumpido por ningún
intrón y en su secuencia se observa la presencia de tres regiones repetidas o módulos. Cada uno de estos módulos pre-
senta una gran similitud a dominios de
péptido sintetasas de Bacillus brevis,
además de regiones de unión a 4´-fosfopanteteína similares a las de policétido y
ácido graso sintetasas (Martín, 2000a).
La ACVS es una enzima multimérica con
un peso molecular de 426 kDa. Los módulos que la conforman presentan las diferentes actividades catalíticas necesarias
para realizar la síntesis del tripéptido ACV:
reconocimiento y activación de los tres
aminoácidos precursores (L-valina, L-cisteína y L-α-aminoadípico), formación de
los enlaces peptídicos, isomerización de
la L-valina a D-valina y tioesterificación
para liberar el tripéptido formado. Esta
enzima ha sido purificada a partir de P.
chrysogenum (Theilgaard y col., 1997).
El gen pcbC y la IPNS
El gen que codifica la IPNS se denomina
pcbC, tiene un tamaño de 1 kb, su secuencia no se encuentra interrumpida por
ningún intrón y se clonó a partir de P.
chrysogenum en la década de 1980 (Carr
y col., 1986; Barredo y col., 1989a).
La enzima codificada por este gen (IPNS)
tiene una masa molecular de 48 kDa. Para
llevar a cabo la reacción de ciclación del
tripéptido ACV que origina el anillo betalactámico, esta enzima requiere Fe+2 y
oxígeno molecular como cofactores y ascorbato como donador de electrones. La
ciclasa ha sido purificada a partir de P.
chrysogenum (Ramos y col., 1985; Carr y
col., 1986).
El gen penDE y la IAT
El último paso en la biosíntesis de bencilpenicilina está catalizado por la enzima aciltransferasa. En este paso se produce el intercambio de la cadena lateral de
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
66
L-α-aminoadípico de la isopenicilina N por
un ácido activado en forma de acil-CoA. Se
ha propuesto un proceso de dos pasos enzimáticos (Queener y Neuss, 1982). En
primer lugar, una actividad amidohidrolasa
elimina la cadena lateral de L-α-aminoadipato de la isopenicilina N generando 6APA, y a continuación, una actividad acilCoA: 6-APA-aciltransferasa incorpora la
nueva cadena lateral activada. Estas dos actividades enzimáticas residen en una proteína heterodimérica (Tobin y col., 1990,
1993; Álvarez y col., 1993) denominada
IAT. La forma activa de la enzima IAT resulta
del procesamiento del precursor monomérico de 40 kDa a un heterodímero que contiene dos subunidades: una de 11 kDa (subunidad α correspondiente a la región
amino terminal) y otra 29 kDa (subunidad
β correspondiente a la región carboxilo terminal).
En P. chrysogenum, se ha conseguido purificar la subunidad de 29 kDa de la IAT
(Álvarez y col., 1987), mientras que en
Aspergillus nidulans (otro hongo productor de penicilina) se han purificado las
dos subunidades (Whiteman y col., 1990).
Ambas subunidades están codificadas por
un único gen denominado penDE (Tobin
y col., 1990, 1993). Dicho gen ha sido
clonado en P. chrysogenum (Barredo y
col., 1989b; Tobin y col., 1990) y en A. nidulans (Montenegro y col., 1990; Tobin y
col., 1990).
En contraste con los otros genes de la biosíntesis de penicilina, el gen penDE contiene tres intrones en similares posiciones
en ambos organismos (Barredo y col.,
1989b; Tobin y col., 1990; FernándezCañón y Peñalva, 1995). La presencia de
intrones indica un posible origen fúngico
(Aharonowitz y col., 1992), aunque este
aún no está claro, ya que no se conocen
análogos cercanos en organismos eucariotas o procariotas. Algunas características de este gen indican que derivó de
una fusión de un gen eucariota con otro
procariota (Martín y col., 1994).
En A. nidulans se ha descubierto el gen
aatB, un gen homólogo al gen aatA (que
codifica la IAT), con una estructura similar
y un modelo de expresión génica igual al
gen aatA, lo que sugiere un origen a partir
de un gen ancestral común. La proteína
codificada por este gen posee actividad
aciltransferasa e interviene en la biosíntesis
de penicilina en A. nidulans. En otras especies de hongos productores de penicilina
los genes homólogos al aatA forman parte
de la agrupación de genes de biosíntesis
de penicilina, mientras que los genes homólogos al aatB también están presentes
en hongos no productores (Spröte y col.,
2008). El análisis del genoma de P. chrysogenum reveló la presencia de un gen
(Pc13g09140) denominado gen ial debido
a que codifica una proteína de gran similitud (IAL por IAT-like) a la IAT. Al contrario
que el producto del gen aatB de A. nidulans, la IAL no tiene actividad relacionada
con la biosíntesis de penicilina. Estos resultados sugieren que los genes ial y penDE
de P. chrysogenum podrían no haberse formado a partir de un mismo gen ancestral
por duplicación génica. Por lo tanto, estos
genes podrían no tener una función similar,
sino distintas funciones dentro del organismo (García-Estrada y col., 2009).
Organización génica de los genes
biosintéticos en los microorganismos
productores de penicilinas
En bacterias y en hongos los genes implicados en la biosíntesis de antibióticos
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
67
beta-lactámicos tienden a localizarse en
agrupaciones génicas denominadas clusters (Martín y Liras, 1989a; Martín, 1992).
En los hongos productores de penicilinas
A. nidulans y P. chrysogenum, los tres
genes de la ruta biosintética de penici-
lina se encuentran agrupados en un
cluster localizado en el cromosoma I, en
el caso de P. chrysogenum (Fierro y col.,
1993), y en el cromosoma VI, en el caso
de A. nidulans (Montenegro y col., 1990)
(figura 3).
pcbAB
pcbC
penDE
ipnA
aatA
P. chrysogenum (cromosoma I)
acvA
A. nidulans (cromosoma VI)
Figura 3. Agrupación de los genes de biosíntesis de penicilina en los hongos productores P. chrysogenum y A. nidulans.
Los genes pcbAB y pcbC se transcriben en
orientación divergente, existiendo entre
ellos una región intergénica común que
funciona como un promotor bidireccional.
La expresión de estos genes que están situados en una región del genoma que
contiene dos promotores divergentes ha
sido asociada con la reorganización de la
estructura de la cromatina, que permite
la interacción facilitada de las regiones
promotoras con la ARN polimerasa II y
con factores transcripcionales (García y
col., 2004; Ishida y col., 2006; Shwab y
col., 2007). El gen penDE, situado aguas
abajo del gen pcbC, se transcribe a partir
de su propio promotor.
Regulación de la biosíntesis de
penicilina
La penicilina es, posiblemente, el metabolito secundario más estudiado y su biosín-
tesis la más investigada y conocida, debido en parte a que actualmente la penicilina sigue siendo uno de los antibióticos
más importantes en términos de uso terapéutico y de volumen de producción
anual.
La producción de penicilina tiene lugar,
preferentemente, en condiciones de desequilibrio de nutrientes y a velocidades de
crecimiento bajas. El desequilibrio nutricional se refiere sobre todo a la limitación
en las fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo. Además de estos factores, aminoácidos como la lisina ejercen un marcado
efecto en la producción de penicilina en algunos microorganismos. Diversos componentes del medio de cultivo, como, por
ejemplo, el líquido de maceración de maíz
y determinadas características del medio
de cultivo, como pueden ser el pH y el oxí-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
68
geno disuelto, juegan un papel importante
en el proceso de regulación.
La producción de penicilina es un proceso
relativamente ineficiente, ya que solo un
20% de la fuente de carbono consumida
durante la fermentación termina incorporándose a la molécula de penicilina,
aunque los análisis de flujos metabólicos
en las cepas de alta producción estiman
un rendimiento teórico de la conversión
hasta valores del 50% (Jørgensen y col.,
1995). La mejora en la producción y en el
porcentaje de rendimiento de las cepas
que actualmente se emplean se ha conseguido, en mayor medida, mediante la
utilización de técnicas clásicas de mutación y selección.
La introducción de la tecnología del ADN
recombinante ha llevado a la clonación y
caracterización de los genes estructurales
de la ruta biosintética de penicilina y hace
posible la investigación sobre su regulación
a nivel molecular. Debido a que la expresión de los genes de biosíntesis de penicilina está sujeta a sofisticados controles,
bien sea por factores nutricionales y/o factores reguladores, los conocimientos sobre
los circuitos reguladores y la sobreexpresión de los posibles genes reguladores
pueden llevar a incrementos importantes
sobre la producción y el rendimiento en la
biosíntesis de la penicilina.
Reguladores transcripcionales
La biosíntesis de penicilina está afectada
por diversos factores nutricionales, como
la regulación catabólica por fuente de carbono, nitrógeno y fósforo (Martín y col.,
1999), y complejos procesos reguladores
(Chang y col., 1990; Aharonowitz y col.,
1992; Feng y col., 1994; Martín, 2000b;
Brakhage y col., 2004).
Diversos factores transcripcionales han
sido identificados en diversos hongos filamentosos. Algunos de estos factores
transcripcionales se unen a la región promotora de los genes pcbAB y pcbC y a la
región corriente arriba del gen penDE en
A. nidulans (Brakhage, 1998) y P. chrysogenum (Martín, 2000b).
Estos factores transcripcionales actúan
como elementos reguladores de la expresión de los genes de biosíntesis de penicilina (Chu y col., 1995; Feng y col., 1995;
Kosalková y col., 2000, 2007, 2009). Sin
embargo, no se ha encontrado ningún gen
regulador específico en la región amplificada que contenga los tres genes biosintéticos (Fierro y col., 2006; Van den Berg y
col., 2007), lo cual indica que la biosíntesis
de penicilina debe ser controlada directamente por “reguladores globales“ más
que por un regulador específico.
Regulación por pH externo.
Regulador PacC
La producción de penicilina en A. nidulans está regulada mediante el pH ambiental o externo, siendo mayor en los
cultivos incubados con valores de pH alcalinos. Este efecto se observa también en
P. chrysogenum (Chu y col., 1997;
Gutiérrez y col., 1999). Existen diferencias
en el comportamiento de estos dos
hongos, ya que mientras en A. nidulans
un valor de pH alcalino contrarresta la represión catabólica ejercida por el azúcar
sacarosa sobre el gen pcbAB cuando se
utiliza esta como fuente de carbono
(Espeso y col., 1993), en P. chrysogenum
un valor de pH alcalino, aunque estimula
la transcripción de los genes pcbAB, pcbC
y penDE, no elimina la fuerte represión
catabólica por glucosa que se ejerce sobre
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
69
los dos primeros genes de la ruta de biosíntesis de penicilina (Gutiérrez y col.,
1999).
En A. nidulans, el efecto regulador por pH
externo está mediado a través del factor
transcripcional PacC. Esta proteína es sintetizada como producto primario de la
traducción, siendo inactiva en la regulación de los genes estructurales debido a
las interacciones intramoleculares entre
las regiones carboxilo y amino terminal
(Arst y col., 1994; Tilburn y col., 1995). A
pH ambiental alcalino la proteína PacC
cambia su conformación y aproximadamente un 60% de la proteína inactiva (de
la región carboxilo-terminal) es eliminada
mediante proteolisis, dando lugar a una
proteína funcional que contiene tres dominios de unión al ADN en forma de
dedos de zinc que activa la transcripción
de genes que se expresan bajo un pH alcalino y reprime la transcripción de los
genes que se expresan a pH ácido (Tilburn
y col., 1995). Suárez y Peñalva (1996) han
determinado los sitios de unión in vitro de
la proteína PacC de P. chrysogenum en la
región intergénica pcbAB y pcbC. Dicha
región intergénica contiene siete sitios de
unión PacC mediante la secuencia consenso 5´-GCCARG-3´.
Regulación catabólica por fuente de
carbono. Regulador CreA
La regulación por la fuente de carbono es
un mecanismo general conocido en bacterias y hongos que impide la síntesis y/o
la actividad de enzimas necesarias para la
asimilación de las diversas fuentes de carbono cuando esté presente una fuente de
carbono fácilmente utilizada, como puede
ser la glucosa. Desde el punto de vista fisiológico, este tipo de regulación es be-
neficioso para el microorganismo, ya que
se utiliza la fuente de carbono más energética y no se desperdicia energía en la
síntesis de otros sistemas catabólicos para
fuentes de carbono alternativas. Los
genes sujetos a represión por fuente de
carbono pueden dividirse en tres grupos:
los que codifican enzimas implicadas en
el metabolismo de fuentes de carbono
menos favorables, los que codifican enzimas implicadas en la gluconeogénesis y
en el ciclo del glioxilato, y los relacionados
con el metabolismo secundario. El mejor
ejemplo del último grupo es la regulación
por fuente de carbono de la producción
del antibiótico penicilina.
El término represión por fuente de carbono (o, más específicamente, represión
por glucosa) se refiere a un efecto represor que ejerce la glucosa sobre la expresión de algunos genes. La glucosa es
una de las fuentes de carbono con las que
se produce un mayor crecimiento de micelio, pero ejerce un efecto represor sobre
la producción de penicilina. En A. nidulans se ha observado el mismo fenómeno
de represión catabólica en la biosíntesis
de penicilina mediada por la fuente de
carbono que en P. chrysogenum.
La mejor caracterización del fenómeno de
la regulación catabólica por la fuente de
carbono en hongos se consiguió en S. cerevisiae. La regulación por glucosa en levaduras puede tener lugar mediante la activación o represión a nivel transcripcional
o postranscripcional. En levaduras, el represor MIG1, codificado por el gen Mig1,
es el efector responsable de la represión
de los genes regulados por glucosa. La
proteína MIG1 contiene dominios de
unión de tipo dedos de zinc y se une a
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
70
cajas GC, motivo presente en muchos
genes reprimidos por glucosa.
El gen homólogo al Mig1 en A. nidulans
se denomina creA. El factor regulador o
proteína CreA contiene dos dedos de zinc
del tipo Cys2-His2 y una región rica en
alaninas indicativa de una proteína represora de unión al ADN. La proteína CreA
se une a determinadas regiones del ADN
con el propósito de modular la expresión
génica. Se ha conseguido definir la secuencia de unión consenso para CreA: 5´SYGGRG-3´ (S = C o G; Y = C o T; R = A
o G) que coincide en gran medida con la
de Mig1: 5´-GCGGRG-3´. Se ha demostrado que la represión por la fuente de
carbono del metabolismo primario es mediada por la proteína reguladora CreA. Sin
embargo, la deleción de un fragmento de
29 pb protegido por el factor regulador
CreA no alteró la represión catabólica en
A. nidulans, lo que indica que la represión
catabólica por la fuente de carbono del
gen que codifica la ACV sintetasa (acvA)
es independiente del represor transcripcional CreA.
Estos resultados sugieren que en la biosíntesis de penicilina en A. nidulans está
involucrado otro mecanismo de regulación independiente del gen creA. Sin embargo, en P. chrysogenum, una mutación
dirigida a los sitios de unión del factor regulador CreA, indica que este tiene un
papel importante en la regulación por glucosa en la biosíntesis de penicilina.
La biosíntesis de penicilina en P. chrysogenum está fuertemente regulada por glucosa, sacarosa y, en un nivel más bajo, por
otros azúcares, como la maltosa, la fructosa y la galactosa. Esta regulación no aparece cuando se utiliza como fuente de car-
bono la lactosa, por este motivo inicialmente la producción industrial de penicilina en P. chrysogenum fue llevada a cabo
utilizando como fuente de carbono lactosa, ya que se comporta de forma contraria a la glucosa, siendo menor el crecimiento en biomasa del microorganismo,
pero no poseyendo un efecto represor
sobre la producción de penicilina. La lactosa no ejerce efecto represor debido, probablemente, a una lenta hidrólisis de este
azúcar como resultado de la muy baja actividad β-galactosidasa en este hongo.
La glucosa en altas concentraciones reprime la formación del tripéptido ACV (reprimiendo la enzima ACVS) y la represión
no es reversible por la adición del ácido
α-aminoadípico, cisteína o valina, y también reprime la ciclasa (IPNS), pero no
tiene efecto sobre la isopenicilina N aciltransferasa (IAT) (Revilla y col., 1986).
También la biosíntesis de penicilina es reprimida por 2-desoxiglucosa. Este análogo
de glucosa es fosforilado a 2-desoxiglucosa-6-fosfato, pero parece que no es
metabolizado en la ruta glucolítica.
Martín y colaboradores (1999) demostraron que los niveles de ARN mensajero
de los genes pcbAB, pcbC y penDE están
drásticamente reducidos en presencia de
glucosa. Además, los cultivos crecidos con
glucosa como fuente de carbono muestran
niveles reducidos del ácido α-aminoadípico, efecto aparentemente causado por
estimular la biosíntesis del aminoácido lisina y estimular a su vez el crecimiento del
microorganismo (Revilla y col., 1984). En el
año 1988 se aisló un mutante de P. chrysogenum (Barredo y col., 1988) desregulado en la represión ejercida por la glucosa
sobre la biosíntesis de penicilina. Este mutante es incapaz de fosforilar la D-glucosa,
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
71
lo que sugirió que podría carecer de la actividad glucoquinásica. En relación con esta
hipótesis, se demostró que la hexoquinasa
II de S. cerevisiae posee un importante
papel en la represión catabólica ejercida
por la glucosa en levaduras (Entian y
Fröhlich, 1984; Gancedo, 1998). Este
hecho en hongos filamentosos no está del
todo aclarado (Ruijter y Visser, 1997) dado
que una deficiencia en la hexoquinasa provoca una disminución de la tasa de captación de glucosa, con lo que su efecto sobre
la biosíntesis de penicilina podría explicarse
en términos de una reducción de captación
del compuesto represor.
Todas las evidencias disponibles sugieren
que la regulación catabólica por fuente de
carbono en la biosíntesis de penicilina es
ejercida por una proteína reguladora, el
factor transcripcional CreA, que regula la
producción de penicilina mediante dos
mecanismos: uno indirecto, controlando
el metabolismo general del hongo, y otro
directo, regulando la expresión del gen
pcbAB uniéndose a las cajas CreA. La mutación de las cajas CreA presentes en la región intergénica pcbAB-pcbC disminuye la
tasa de represión de, al menos, el primer
gen de la ruta biosintética de penicilina.
Actualmente, el problema de la represión
por glucosa ha sido parcialmente superado usando como fuente de carbono glucosa, pero en dosis no represoras. De este
modo, la producción de penicilina es favorecida bajo condiciones subóptimas
para el crecimiento del microorganismo
(Demain y col., 1998).
Regulación por la fuente de
nitrógeno. Regulador NRE
La represión por la fuente de nitrógeno
en hongos es un ejemplo de un meca-
nismo regulador global necesario para la
coordinación de la expresión de los genes
que aseguren un aporte de fuente de nitrógeno necesario para el crecimiento en
respuesta a cambios medioambientales.
El ión amonio y la glutamina o el glutamato son las fuentes de nitrógeno preferiblemente usadas por los hongos.
En ausencia de fuentes de nitrógeno favorables se inicia una síntesis de novo de
permeasas y enzimas catabólicas, cuya expresión es altamente controlada por el circuito regulador, que permiten el uso de
las fuentes de nitrógeno secundarias,
como pueden ser nitratos, purinas, proteínas y amidas (Marzluf, 1993; Caddick
y col., 1994).
En el hongo Neurospora crassa la regulación por la fuente de nitrógeno es llevada
a cabo por el producto del gen nit-2 (Fu
y Marzluf, 1990) y en A. nidulans por el
producto del gen areA (Kudla y col.,
1990). Ambos genes codifican los factores reguladores que contienen un dedo
de zinc tipo Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys.
En P. chrysogenum la regulación por la
fuente de nitrógeno es mediada por el
producto del gen nre, homólogo a los
genes nit-2 y areA (Hass y col., 1995). Los
factores transcripcionales de los genes reguladores reconocen una secuencia consenso GATA en el ADN (Marzluf, 1997).
En el hongo P. chrysogenum hay seis secuencias o cajas GATA en el promotor bidireccional pcbAB-pcbC, aunque se ha
descrito que el producto del gen nre, el
factor regulador NRE, únicamente interactúa fuertemente con solo dos de ellas
(Haas y Marzluf, 1995). Cabe pensar, por
lo tanto, que la regulación de la biosíntesis de penicilina esté mediada por la
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
72
misma proteína reguladora NRE que participa en el circuito regulador de la fuente
de nitrógeno.
Regulador transcripcional PENR1
De los circuitos reguladores conocidos, algunos de ellos han sido encontrados mediante el análisis de mutantes (creA, pacC)
o mediante análisis bioquímicos o fisiológicos (nre). El análisis delecional de la región intergénica entre los genes pcbAB y
pcbC en A. nidulans ha revelado la presencia de otro factor transcripcional denominado PENR1 (PENicillin Regulator 1)
que se une específicamente a la secuencia
que contiene la caja 5´-CCAAT-3´.
La deleción de la región que contiene la
secuencia 5´-CCAAT-3´ de la región intergénica pcbAB-pcbC o el cambio de cuatro
pares de bases, provoca el incremento de
hasta 8 veces, la expresión del gen pcbAB
y una reducción simultánea del 30% del
nivel normal de la expresión del gen pcbC.
Estos datos indican que la proteína PENR1
está involucrada en la expresión de los
genes de la biosíntesis de penicilina en A.
nidulans y que la secuencia de la unión
del PENR1 manifiesta un efecto opuesto
en la expresión de los genes pcbAB y
pcbC.
Las cajas CCAAT están presentes en los
promotores de aproximadamente el 30%
de los genes de eucariotas y son sitios de
unión de diferentes factores transcripcionales. Los complejos de unión a la secuencia 5´-CCAAT-3´ se denominan HAP,
AnCF, CBF o NF-Y. Son requeridos para la
activación de un amplio grupo de genes
y fueron caracterizados inicialmente en S.
cerevisiae y posteriormente en A. nidulans
(Papagiannopoulos y col., 1996). Este
complejo, en S. cerevisiae, está formado
por cuatro subunidades, HAP2, HAP,
HAP5 (formando un complejo heterotrimérico esencial para la unión al ADN) y
HAP4, que es una proteína ácida que
actúa como el dominio de activación
transcripcional.
El complejo HAP también se identificó en
A. nidulans (denominado PENR1) (Bergh
y col., 1996; Litzka y col., 1998; Steidl y
col., 1999). La deleción o mutagénesis de
los sitios de unión de la proteína PENR1
(409 pb corriente arriba del codón de iniciación del gen pcbAB) incrementó hasta
un valor de 8 veces la expresión del gen
acvA, mientras la expresión del gen ipnA
fue reducida hasta un 30% del valor
normal (Bergh y col., 1996). En resumen,
la caja CCAAT I media un efecto positivo
en la expresión del gen acvA y un efecto
negativo sobre el gen ipnA.
Otra caja CCAAT II, que es reconocida por
el complejo proteico PENR1, está localizada 250 pb aguas arriba del inicio de la
transcripción del gen penDE. La sustitución de la secuencia 5´-CCAAT-3´ por 5´GATCC-3´ resulta en una reducción de la
expresión de este gen (Litzka y col.,
1996).
En P. chrysogenum, el complejo HAP está
formado por los factores transcripcionales
HAPB (fuerte similitud a la proteína HAPB
de A. nidulans), HAPC (fuerte similitud a
la proteína HAPC que se une a la secuencia 5´-CCAAT-3´ de Aspergillus
oryzae) y HAPE (fuerte similitud a la proteína HAPE de A. oryzae).
La contribución real del complejo PENR1
al control de la expresión de los genes de
biosíntesis de penicilina no está muy clara.
La deleción del complejo PENR1 debería
permitir niveles de transcripción más altos
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
73
del gen pcbAB e incrementar la producción de penicilina en A. nidulans, donde
es conocido que la expresión del gen
pcbAB es limitante en la producción de
penicilina.
Regulador transcripcional PTA1
En P. chrysogenum, la expresión de los
dos primeros genes de la ruta biosintética
de penicilina, pcbAB y pcbC, se deben expresar de forma coordinada, ya que
ambos muestran un modelo regulatorio y
de expresión similar. El análisis de la secuencia de ADN de la región intergénica
de estos dos genes revela la presencia de
múltiples secuencias reguladoras que actúan en cis y que son objetivo de diversos
reguladores transcripcionales como se ha
visto hasta ahora. Así, un total de siete secuencias consenso para PacC, seis para
CreA, seis para NRE y seis cajas CCAT son
distribuidas a lo largo de la región del promotor bidireccional.
Estudios realizados sobre la región intergénica muestran que al menos hay cuatro
regiones que parecen ser importantes en
la regulación de la expresión del promotor
del gen pcbAB. Cuando se deleciona la
región más distal del promotor pcbAB
(posición 933 a -789 en referencia al
punto de inicio de la transcripción), el resultado es un incremento de la expresión
del gen pcbAB en un medio donde se ha
utilizado como fuente de carbono lactosa.
Además, hay otras tres regiones importantes en la regulación del promotor, denominadas cajas A, B y C, que producen
un bajo nivel de expresión cuando son delecionadas, tanto si se utiliza como fuente
de carbono glucosa o lactosa.
Dos de estas regiones contienen secuencias que actúan en cis (cajas A y B).
Ambas cajas contienen la mayoría de los
motivos de unión al ADN de las diferentes
proteínas que actúan como factores reguladores de la expresión génica (Martín y
col., 1999). En la caja A aparece una secuencia heptamérica (TTAGTAA), que es
el sitio de unión de una proteína reguladora denominada PTA1 (penicillin transcriptional activator 1). La deleción de la
secuencia heptamérica provoca una drástica reducción de la expresión del gen
pcbAB, por lo que este factor regulador
es requerido para un alto nivel de expresión del gen pcbAB (Kosalková y col.,
2000). La secuencia 5´-TTAGTAA-3´ se parece a la secuencia del factor regulador
BAS2 (PHO2) requerido para la expresión
de diversos genes en levaduras (TiceBaldwin y col., 1989).
Regulador transcripcional penRFX
Recientemente, se ha identificado un
nuevo factor transcripcional en el hongo
A. chrysogemun (CCPR1) y que muestra
gran homología con la familia de factores
reguladores animales RFX (Gajiwala y
Burley, 2000).
En A. chrysogenum, la proteína CPCR1 se
une a una secuencia palindrómica imperfecta en la región promotora de los genes
pcbAB-pcbC. La localización del sitio de
unión de la proteína es aproximadamente
350 pb corriente arriba del lugar de inicio
de la transcripción del gen pcbC, lo que
sugiere que el factor de transcripción
CPCR1 está involucrado en la regulación
de la ruta biosintética de cefalosporina C.
El gen homólogo del cpcR1 de A. chrysogenum se ha identificado en P. chrysogenum (penRFX), el cual presenta una homología del 60% con el gen cpcR1. Hasta
el momento, muy poco se sabe del po-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
74
sible papel regulador de penRFX en la biosíntesis de penicilina en P. chrysogenum,
pero los resultados de nuestro laboratorio
indican que está implicado en el control
transcripcional de los genes biosintéticos
y de la biosíntesis de este antibiótico
(Domínguez-Santos y col., 2012).
Regulador global laeA
En P. chrysogenum se ha identificado el
gen que codifica un regulador global del
metabolismo secundario denominado
laeA. Este gen codifica una proteína nuclear (PcLaeA) con un dominio metiltransferasa. El gen laeA está presente como
copia única en el genoma de cepas de
baja y alta producción de penicilina y no
está localizado en la región amplificada
de 56,8 kb donde se encuentra el cluster
de genes de biosíntesis de penicilina en
las cepas de alta producción de este antibiótico, lo que significa que no ha ocurrido amplificación génica en el proceso
de selección de las cepas de alta producción (Kosalková y col., 2009).
Estudios realizados de sobreexpresión de
este gen dieron como resultado un incremento de un 25% en la producción de
penicilina, lo que indica que la proteína
PcLaeA actúa como un regulador de la expresión del cluster de genes de biosíntesis
de penicilina. Estudios realizados en mutantes donde se había interrumpido el
gen dieron como resultado un descenso
drástico de la producción de penicilina,
una baja pigmentación y esporulación.
Estos resultados evidencian que el gen
laeA codifica un regulador global transcripcional que afecta a la esporulación,
pigmentación y biosíntesis de penicilina
en P. chrysogenum (Kosalková y col.,
2009).
Complejo regulador Velvet
Velvet (VeA) es otro regulador global del
metabolismo secundario que ha sido caracterizado en A. nidulans y más reciente
en P. chrysogenum (Hoff y col., 2010).
VeA forma parte de un complejo de alto
peso molecular que contiene al menos 10
proteínas diferentes, entre las que se encuentra también LaeA. Ambos factores
juegan un papel fundamental en la biosíntesis de penicilina y en diferentes procesos de desarrollo (Hoff y col., 2010).
Regulación por aminoácidos
La penicilina es sintetizada a partir de tres
aminoácidos precursores, L-cisteína, L-valina y L-α-aminoadípico, por lo que estos
compuestos tienen un papel importante en
su regulación. Altas concentraciones de lisina reducen la producción de penicilina
(Demain, 1957; Luengo y col., 1979). En P.
chrysogenum, las rutas biosintéticas de la
penicilina y de la lisina tienen varias etapas
en común. El punto de ramificación de las
dos rutas es el ácido α-aminoadípico. En la
biosíntesis del aminoácido lisina este ácido
es convertido en α-aminoadipato-δ-semialdehído mediante la enzima α-aminoadipato reductasa, mientras que en la ruta de
la biosíntesis de la penicilina, el ácido α-aminodípico es condensado junto con L-valina
y L-cisteína dando lugar al tripéptido ACV.
La L-lisina ejerce la inhibición de la biosíntesis de penicilina en varios pasos.
Masurekar y Demain describieron en 1974
que la primera enzima de la ruta biosintética de la lisina en P. chrysogenum, la homocitrato sintasa, era inhibida por el aminoácido lisina. Resultados similares fueron
descritos por otros investigadores (Friedrich
y Demain, 1978; Luengo y col., 1979).
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
75
La lisina también inhibe la actividad de la
α-aminoadipato reductasa y se ha observado que esta inhibición se producía en
mayor o menor intensidad según la cepa
estudiada. El hecho de que algunas enzimas de la biosíntesis de lisina sean inhibidas mediante el proceso de retroalimentación ejercido por la L-lisina ocasiona una
reducción del flujo del ácido α-aminoadípico disponible para la producción de penicilina (Brakhage, 1998). El α-aminoadípico tiene un papel importante en la
biosíntesis de penicilina, puesto que la
adición de α-aminoadipato externo
(Friedrich y Demain, 1978) o la inducción
de condiciones que incrementen el flujo
intracelular de α-aminoadípico (Hönliger
y Kubicek, 1989) aumentan la tasa de
ACV y de biosíntesis de penicilina. Las
cepas de alta producción de penicilina de
P. chrysogenum presentan altos niveles de
flujo intracelular de α-aminoadípico
(Jaklitsch y col., 1986). Mediante la disrupción génica del gen lys2, que codifica
para la enzima α-aminoadipato reductasa, Casqueiro y colaboradores (1999)
consiguieron aumentar el flujo de α-aminoadípico disponible para la biosíntesis de
penicilina.
Regulación por la adición de líquido
de maceración del maíz
El líquido de maceración del maíz (corn
steep liquor o CSL) es un subproducto de
la manufactura del almidón de maíz y
viene siendo empleado como ingrediente
de los medios de cultivo microbiológico
desde hace muchos años. El CSL es el líquido resultante del proceso de molienda
húmeda del maíz para la fabricación del
almidón y del gluten. El agua empleada
en sucesivas operaciones a lo largo de la
manufactura del almidón va arrastrando
compuestos solubles contenidos en un
principio en el grano y que han de separarse de los productos finales: almidón,
gluten, germen y fibra.
La adición de CSL al medio de producción de P. chrysogenum estimula la producción de penicilina (Ligget y Koffer,
1948). Una explicación de las propiedades básicas del CSL podría ser que en
su composición hay un alto contenido en
aminoácidos, polipéptidos, minerales y
ácido láctico que favorecen la biosíntesis
de penicilina. Las búsquedas de los compuestos simples, que son parte de esta
mezcla tan compleja y que son responsables del efecto positivo que provoca su
adición en el medio de fermentación,
han sido infructuosas (Demain y Elander,
1999), debido en parte al fenómeno de
la variabilidad en los CSL de diferente
origen y debido a las enormes oscilaciones del porcentaje en la composición
de este dependiendo de la intensidad de
la fermentación que tiene lugar en la
fabricación del CSL. Según Ligget y
Koffer (1948), la fracción proteica del
CSL tiene el importante papel de servir
como fuente de nitrógeno al organismo
P. chrysogenum. Los aminoácidos presentes no parecen tener proporciones
constantes, dependiendo del tipo de
maíz del que proceden y del grado de
solubilidad proteica que hayan sufrido.
Regulación mediada por oxígeno
Para la producción de penicilina, conseguir una buena aireación del micelio con
oxígeno es una de las condiciones imprescindibles. Diversas enzimas, como la ciclasa (IPNS), requieren oxígeno para su
actividad. Sin embargo, el análisis trans-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
76
cripcional descrito por Renno y colaboradores (1992) demostró que la expresión
de los genes pcbAB y pcbC en P. chrysogenum puede ser también inducida,
como la respuesta al estrés, por la reducción de los niveles de oxígeno.
Regulación mediada por la fuente de
fósforo
El efecto represor de la glucosa sobre la
biosíntesis de penicilina depende de la
concentración del fosfato inorgánico en
el medio de fermentación. En el medio
complejo de fermentación con la fuente
de fósforo limitada, el efecto represor es
del 13% cuando la fuente de carbono
(glucosa) es añadida en el tiempo de inoculación, mientras que se incrementa
hasta un 59% cuando el medio es suplementado a la vez con glucosa y con fosfato inorgánico a una concentración de
100 mM. La adición de fosfato inorgánico
a una concentración de 100 mM no tiene
efecto sobre la producción de penicilina
en medios con la concentración de glucosa limitada o con lactosa como fuente
de carbono (Martín y col., 1999).
Compartimentalización de la
biosíntesis de penicilina
Las diferentes reacciones bioquímicas involucradas en la biosíntesis de penicilina
ocurren entre el citosol y los peroxisomas
(microcuerpos) (Martín y col., 2010), lo
que significa que los sustratos y las enzimas de biosíntesis están separadas físicamente.
Localización de la ACVS
Como ya se ha indicado en apartados anteriores, el primer paso en la ruta de biosíntesis de penicilina consiste en la forma-
ción del tripéptido ACV por condensación
no ribosómica de los tres aminoácidos
que lo conforman (ácido L-α-aminoadípico, L-cisteína y L-valina), llevada a cabo
por la enzima ACVS. Estudios iniciales localizaron esta enzima asociada a estructuras membranosas del aparato de Golgi
(Kurylowicz y col., 1987). Posteriormente,
mediante experimentos de fraccionamiento celular, se localizó la enzima ACVS
en el interior de vacuolas o vinculada a la
membrana de estas (Müller y col., 1991;
Lendenfeld y col., 1993).
La purificación de la ACVS mostró que
esta enzima era soluble (aunque altamente inestable) en ausencia de detergentes y que, además, su actividad no
parecía depender de la presencia de detergentes o de lípidos (Van Liempt y col.,
1989; Baldwin y col., 1990, 1991;
Theilgaard y col., 1997). Un posterior
análisis de la secuencia de aminoácidos
de la ACVS mostró que era una proteína
hidrofóbica, pero que no contenía ninguna región transmembrana (Lendelfeld
y col., 1993) ni ninguna señal de localización (targeting) reconocible a retículo
endoplásmico o vacuolas (Van de Kamp
y col., 1999). Todos estos hechos hicieron replantearse de nuevo la localización de esta proteína y se realizaron más
experimentos empleando las técnicas
tradicionales de fraccionamiento, las
cuales no mostraron ningún resultado
claro dada la inestabilidad de la ACVS y
su sensibilidad a la degradación proteolítica. La mejora de los protocolos de lisis
celular, unida al uso de la técnica de inmunocitoquímica asociada a la microscopía electrónica, permitieron la localización subcelular de la proteína ACVS en
el citosol (Van der Lende y col., 2002a).
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
77
En A. nidulans se ha conseguido además
mostrar la localización de la ACVS en el
citosol fusionándola a una proteína
verde fluorescente (Vousden y Turner,
2001; Evers y col., 2004). Esta localización citosólica es más acorde con las propiedades bioquímicas de la ACVS, como
un pH neutro (el pH de las vacuolas es
ácido), requerimiento de cofactores y
sensibilidad a proteasas (la vacuola tiene
gran actividad proteolítica).
Localización de la IPNS
La segunda etapa de la biosíntesis de penicilina consiste en la ciclación oxidativa
de LLD-ACV a IPN, catalizada por una proteína de 38 kDa denominada ciclasa
(IPNS). Los resultados de los experimentos
de fraccionamiento mostraron claramente
que la IPNS era una enzima soluble y citosólica (Kurzatkowski y col., 1991;
Müller y col., 1991). Esta localización está
de acuerdo con la ausencia de regiones
transmembrana y de señales de localización específicas en la secuencia aminoacídica deducida (Ramón y col., 1987;
Barredo y col., 1989a), y también con
todas las características bioquímicas y estructurales conocidas de la misma (Martín
y Liras, 1989b; Roach y col., 1995, 1997).
Esta enzima ha sido localizada también en
el citosol utilizando técnicas de microscopía electrónica (Müller y col., 1991; Van
der Lende y col., 2002a). La presencia de
la IPNS en el citosol implica que puede utilizar directamente como sustrato el LLDACV producido por la ACVS. Se ha planteado que estas dos enzimas, ACVS e
IPNS, podrían estar organizadas formando
un metabolón o gran complejo, pero esto
es algo de lo que no se tiene ninguna evidencia experimental.
Localización de la IAT
El tercer y último paso de la síntesis de
penicilinas es el intercambio, catalizado
por la IAT, de la cadena lateral L-α-aminoadípica de la IPN por el grupo fenilacetilo o fenoxiacetilo activado con coenzima A, dando como resultado la
formación de bencilpenicilina o fenoxipenicilina, respectivamente. Estudios
bioinformáticos muestran que una de las
dos subunidades que forman la IAT (la
subunidad β de 29 kDa), una vez realizado el procesamiento autocatalítico de
la preproteína de 40 kDa (Aplin y col.,
1993a, b), posee en el extremo carboxilo
terminal una señal PTS1 que permite su
localización en la matriz peroxisomal. Por
tanto, el sustrato de esta enzima, la IPN,
tiene que entrar en el peroxisoma para
poder ser convertida en bencilpenicilina
o fenoxipenicilina.
El uso de técnicas inmunocitoquímicas
asociadas a la microscopía electrónica ha
permitido confirmar la localización de la
IAT en el interior de los peroxisomas
(Müller y col., 1991, 1992, 1995; GarcíaEstrada y col., 2008a). Se ha demostrado
que el transporte de la enzima IAT al interior del peroxisoma no depende del estado de procesamiento de la enzima, ya
que un mutante no procesable de la IAT
(variante IATC103S) se transporta activamente al interior del peroxisoma aunque
no sea activo (García-Estrada y col.,
2008a). Finalmente, la localización de la
IAT y dos ligasas (encargadas de la activación de la cadena lateral) en el interior de
los peroxisomas ha sido confirmada por
aislamiento físico de estos orgánulos e
identificación de las proteínas perixomales
mediante espectrometría de masas (Kiel y
col., 2009).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
78
Otras enzimas implicadas en la
biosíntesis de penicilina
Además de las tres proteínas de la ruta
biosintética de penicilina, existen algunas
enzimas implicadas en el metabolismo primario que son necesarias para la formación de penicilina. Tres de las más importantes son la fosfopanteteinil transferasa
(PPTasa), la fenilacetil-CoA ligasa (PCL) y
la disulfuro reductasa.
La ACVS es sintetizada como una apoproteína inactiva, cuya activación se logra
mediante la adición de 4´-fosfopanteteína
gracias a la acción catalizada por la
PPTasa. Esta clase de enzimas son las responsables de la modificación postraduccional de enzimas implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos, policétidos y
péptidos no ribosómicos. Por lo tanto, la
enzima PPTasa es necesaria para la biosíntesis de penicilina tanto en A. nidulans
(Lambalot y col., 1996; KeszenmanPereyra y col., 2003; Márquez-Fernández
y col., 2007) como en P. chrysogenum
(García-Estrada y col., 2008b). Además de
activar a la enzima ACVS, la PPTasa activa
también en el citosol a la enzima α-aminoadipato reductasa, que convierte el
α-aminoadipato en α-aminoadipato semialdehído en la ruta biosintética de la lisina en hongos (Casqueiro y col., 1998;
Ehmann y col., 1999; Guo y col., 2001).
Para que se lleve a cabo la reacción de
sustitución catalizada por la IAT, los ácidos
fenilacético o fenoxiacético que van a actuar como precursores de la cadena lateral tienen que estar activados en sus correspondientes tioésteres. Teóricamente,
esta activación la puede realizar una enzima de actividad acil-CoA sintetasa (ACS)
o de actividad PCL. En 1997, se identificó
una enzima PCL que contenía una señal
PTS1 (SKI) de localización en peroxisomas
(Gledhill y col., 1997). Años más tarde, se
consiguió clonar el gen phl que codificaba
esta enzima PCL, comprobándose su actividad y su implicación de forma directa
en la ruta biosintética de penicilina
(Lamas-Maceiras y col., 2006). También se
encontró que no era la única enzima que
presentaba esta actividad en el microorganismo, ya que aunque su inactivación
suponía una notable reducción, no bloqueaba completamente la biosíntesis de
penicilina (Lamas-Maceiras y col., 2006).
De hecho, también se ha clonado en
P. chrysogenum un segundo gen implicado en la activación del ácido fenilacético, el gen phlB, el cual codifica una proteína que posee actividad PCL y una señal
de localización peroxisomal en su extremo
carboxilo terminal (Wang y col., 2007).
Sin embargo, recientes estudios de
Koetsier y colaboradores (2009, 2010)
han puesto en evidencia que este gen
(también denominado aclA) no interviene
en la activación del ácido fenilacético y,
por tanto, en la biosíntesis de penicilina,
tratándose de un gen que codifica una
acil-CoA ligasa de amplio espectro que
activa ácido adípico. Un estudio aún más
reciente ha identificado un tercer gen
(phlC) en P. chrysogenum, que codifica
una proteína que también tiene una señal
de tipo PTS2 y estaría involucrada en la
activación de ácido fenilacético (Yu et al.,
2011). La localización subcelular en peroxisomas de la PCL es ventajosa, ya que es
la misma localización que posee la IAT.
Además, puesto que los ácidos fenilacético y fenoxiacético muy probablemente
difunden a través de la membrana peroxisomal, su activación proporciona un mé-
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
79
todo muy útil para acumularlos en este
microcuerpo en concentraciones más
altas que en el citosol sin ejercer efectos
tóxicos.
Una vez que el tripéptido ACV se sintetiza
en la célula, tiende a oxidarse y formar el
dímero bis-ACV debido a las condiciones
de aireación que existen en el medio de
cultivo. Este dímero no puede ser utilizado
como intermediario de la ruta biosintética, puesto que la IPNS solo admite como
sustrato la ACV monomérica. Más aún, el
bis-ACV inhibe la actividad de la ACVS
(Theilgaard y col., 1997). La reincorporación del bis-ACV a la biosíntesis de penicilina es posible por la acción de un sistema tiorredoxina disulfuro reductasa
(TrxAB) dependiente de NADPH. Este sistema está presente en el citosol y ha sido
caracterizado en P. chrysogenum a nivel
genético y proteico (Cohen y col., 1994).
Importancia de la
compartimentalización
de la biosíntesis de penicilina
La organización subcelular de la biosíntesis de penicilina en diferentes compartimentos permite la regulación y la optimización de los procesos implicados. El
elevado rendimiento de la producción de
penicilina en las cepas industriales supone
un elevado gasto de precursores y cofactores tales como CoA, ATP y NADPH
(Hersbach y col., 1984; Nielsen, 1995). La
compartimentalización facilita la canalización de los cofactores necesarios y de los
precursores procedentes del metabolismo
primario (aminoácidos) hacia la ruta metabólica específica de la biosíntesis de penicilina, en lo que se conoce como control del flujo metabólico por una barrera
física.
La razón exacta de por qué el último paso
de la ruta biosintética de penicilina se realiza en el interior del peroxisoma no está
clara. Lo que sí se conoce es que este
hecho proporciona una serie de condiciones favorables que pueden explicar que
ocurra de este modo. Por ejemplo, crea un
entorno específico para las enzimas que
actúan en él. El pH de los microcuerpos de
P. chrysogenum se ha investigado con experimentos de fluorescencia y se ha concluido que es ligeramente alcalino (pH 7,07,5) (Van der Lende y col., 2002b), lo cual
está en concordancia con el pH óptimo
(pH 8,2) de la enzima biosintética IAT y
también de la PCL (Álvarez y col., 1993;
Lamas-Maceiras y col., 2006).
Otras posibles ventajas de la compartimentalización de algunas etapas enzimáticas
pueden ser las altas concentraciones de
proteínas y sustratos que se encuentran en
los peroxisomas y que favorecen las reacciones que catalizan estas enzimas, la prevención de la pérdida de intermediarios de
estas rutas por derivación de los mismos a
rutas laterales no deseadas y la regulación
de la ruta biosintética.
La importancia de los peroxisomas en la
biosíntesis de penicilina fue evidente
cuando se demostró que la IAT estaba localizada en este orgánulo (Müller y col.,
1991). Tratando de delimitar las implicaciones de esta localización, se realizaron
unos experimentos en los que, tras la eliminación de la señal de localización a peroxisomas, se observaba que la IAT permanecía en el citosol, interrumpiéndose en
estas condiciones la producción de penicilina, pese a que la enzima se expresaba in
vivo y se mostraba activa in vitro (Müller y
col., 1992). La explicación más factible a
estos resultados es que la activación del
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
80
precursor por la PCL tiene lugar en el interior peroxisomal y, por tanto, al estar la IAT
en el citosol, estos precursores activados se
encuentran fuera de su alcance. Otra explicación que se planteó en su momento
fue que la IAT no era capaz de desarrollar
su actividad catalítica en el citosol. La obtención de un mutante de A. nidulans que
carece de peroxisomas funcionales y que
mantiene la producción de penicilina con
las enzimas del peroxisoma localizadas en
el citosol (De Lucas y col., 1997) hace que
esta posibilidad sea menos probable.
Además, estos resultados sugieren que los
peroxisomas no son esenciales para la
producción de la penicilina per se, pero
que existe una correlación positiva entre
el rendimiento de la producción de penicilina y el número de peroxisomas. La
razón de esta correlación no se conoce,
pero podría deberse a un incremento en
la cantidad de enzimas de la ruta biosintética (Evers y col., 2004).
Una evidencia clara de la importancia de
estos microcuerpos en la biosíntesis de penicilina ha sido subrayada a través de la alteración del número y forma de estos orgánulos como resultado de la sobreexpresión
de la proteína Pc-Pex11p (una peroxina que
está involucrada en la abundancia de peroxisomas). La sobreexpresión de esta proteína se traduce en un incremento en la
biosíntesis de penicilina. Este efecto positivo viene a estar relacionado con un aumento en el transporte de penicilina y/o de
los precursores a través de los peroxisomas
(Kiel y col., 2005), lo cual evidencia que el
transporte a través de membrana en los orgánulos es muy importante.
Además de los peroxisomas, orgánulos
como la mitocondria y las vacuolas son im-
portantes en la biosíntesis de penicilina. Las
mitocondrias son esenciales para la biosíntesis del aminoácido precursor α-aminoadípico, ya que las enzimas responsables de
su biosíntesis, como la homocitrato sintasa
y la homoisocitrato deshidrogenasa, se localizan en la matriz mitocondrial (Kubicek
et al., 1990; Jaklitsch y Kubicek, 1990). La
vacuola fúngica está implicada en una amplia variedad de procesos celulares
(Klionsky y col., 1990), entre los que se encuentran el control activo de la concentración en el citosol de muchos y muy diferentes componentes. La mayor parte de los
aminoácidos libres básicos y neutros, y una
parte sustancial de los aminoácidos ácidos,
están localizados en las vacuolas (Klionsky
y col., 1990; Kubicek-Pranz y Kubicek,
1991). Estudios acerca de los niveles de
aminoácidos utilizados en la biosíntesis de
penicilina en el citosol indicaron que existía
una transferencia elevada desde las vacuolas (Jaklitsch y col., 1986; Hönlinger y
Kubicek, 1989; Kubicek y col., 1990;
Lendenfeld y col., 1993). Además, el ácido
L-α-aminoadípico y la L-cisteína son tóxicos
a concentraciones moderadas, siendo por
tanto sus niveles citosólicos cuidadosamente regulados a través de su almacenamiento en la vacuola (Klionsky y col., 1990;
Kubicek-Pranz y Kubicek, 1991). El transporte a través de la membrana de la vacuola tanto al interior como al exterior implica un sistema de antiporte de tipo
H+-aminoácido, el cual está presente en la
membrana vacuolar fúngica (Klionsky y
col., 1990; Harvey y Nelson, 1992).
Procesos de transporte
La compartimentalización de la ruta de
biosíntesis de penilicina implica el transporte de enzimas, precursores, interme-
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
81
diarios y del producto final a través de los
orgánulos celulares, además de crearse
distintas condiciones medioambientales
específicas para cada etapa de biosíntesis.
Transporte de precursores:
aminoácidos y ácido fenilacético
Los hongos filamentosos pueden sintetizar cualquier aminoácido, pero también
son capaces de incorporarlos del medio
de cultivo al interior celular para usarlos
como fuente de nitrógeno y de carbono
o como unidades estructurales para la síntesis de proteínas y péptidos (Horak,
1986), estando implicadas en este proceso permeasas activas de aminoácidos.
La mayoría de las permeasas fúngicas de
aminoácidos muestran similitudes muy
significativas en la secuencia y forman una
única familia conocida como AAP (permeasas de aminoácidos) (Andre, 1995), la
cual pertenece a la superfamilia de proteínas APC (aminoácidos/poliaminas/organocationes) (Jack y col., 2000). Las permeasas tienen una estructura común con
12 posibles segmentos α-hélice transmembrana y regiones hidrofílicas en los
extremos carboxilo y amino terminal localizadas en el citoplasma (Horak y Wolf,
1997; Regenberg y col., 1999). La incorporación de aminoácidos transcurre a
través de un transporte secundario, mediante un gradiente electroquímico de
protones como fuerza conductora que
permite dicha incorporación contra el gradiente de concentración (Andre, 1995;
Jack y col., 2000).
En P. chrysogenum se han clonado y caracterizado tres permeasas de aminoácidos (Trip y col., 2002) y se han determinado y clasificado otras actividades en
base a ensayos de competición y trans-
porte. Se han publicado hasta el momento
nueve sistemas de transportadores de aminoácidos: sistema I para la L-metionina
(Benko y col., 1967), sistema II para la Lcisteína (Skye y Segel, 1970), sistema III
para todos los aminoácidos (Benko y col.,
1969; Hunter y Segel, 1971), sistema IV
para aminoácidos ácidos, sistema V para
la L-prolina, sistema VI para L-lisina y L-arginina, sistema VII para L-arginina, sistema
VIII para L-lisina y sistema IX para L-cisteína
(Hunter y Segel, 1971).
La incorporación del aminoácido α-aminoadípico podría ser realizada mediante
ambos sistemas, el sistema de transporte
de aminoácidos ácidos (Hunter y Segel,
1971) y un sistema de transporte de aminoácidos general (Horak, 1986). Estudios
más recientes muestran que la permeasa
general de aminoácidos es la principal
ruta para la incorporación a la célula de
este aminoácido (Evers y col., 2004).
Los ácidos fenilacético y fenoxiacético son
ácidos débiles que entran rápidamente en
las células de P. chrysogenum mediante
difusión pasiva y se distribuyen a lo largo
de la membrana de acuerdo con el gradiente transmembrana de pH (Eriksen y
col., 1995; Hillenga y col., 1995). Este
hecho actualmente aceptado fue durante
un tiempo objeto de discusión, pues otros
autores habían postulado un transporte
activo para la adquisición del ácido fenilacético desde el medio de cultivo
(Fernández-Cañón y col., 1989a, b;
Martínez-Blanco y col., 1989). Las principales diferencias en estos estudios se encontraban en las concentraciones empleadas de ácido fenilacético y en el tipo de
cepas (de bajo y alto rendimiento). Un
análisis pormenorizado de estas variables
condujo de nuevo a la misma conclusión,
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
82
que durante la biosíntesis de penicilinas
se consumen grandes concentraciones de
ácidos fenilacético o fenoxiacético, los
cuales entran en la célula utilizando como
ruta predominante la difusión pasiva
(Eriksen y col., 1998).
Por otro lado, este tipo de transporte supone que, a concentraciones muy elevadas de ácido fenilacético en el medio,
se produciría una difusión masiva de este
ácido hacia el interior celular, lo que conduciría a un colapso del gradiente electroquímico (Henriksen, 1996). Esto podría
explicar en parte el efecto tóxico de estas
moléculas cuando están presentes en elevadas concentraciones o en un medio de
pH bajo (Barrios-González y col., 1993;
Henriksen, 1996).
Transporte de intermediarios
El hongo P. chrysogenum secreta al medio
de cultivo los tres intermediarios de la ruta
biosintética de penicilina, además del producto final de la misma, la bencilpenicilina, cuando se utiliza ácido fenilacético
como precursor de la cadena lateral. Se
han encontrado en dichos caldos tanto el
tripéptido ACV (López-Nieto y col., 1985),
como la IPN y el 6-APA (Demain, 1983).
En todos estos casos no está claro si la secreción de intermediarios se debe a un sobreflujo de la ruta biosintética en las cepas
de alta producción o si es un proceso natural con un significado ecológico.
La cantidad de cada uno de los intermediarios que se secretan al medio durante
las fermentaciones es diferente. Mientras
que el ACV se va acumulando en el caldo
de cultivo llegando a ser una tercera parte
de la concentración intracelular, las concentraciones de IPN extracelulares permanecen bajas y más o menos constantes
durante toda la fermentación (Jørgensen
y col., 1995).
Aunque no hay evidencia experimental de
ello, se ha propuesto que el ACV podría
ser transportado fuera de la célula por el
sistema de exportación del glutatión
(GSH) (Meister y Anderson, 1983;
Schwartz y col., 1988; Del Carmen
Mateos y Sánchez, 1990), el cual se parecería al sistema glutatión S-conjugado
(GSX) dependiente de ATP que se ha localizado en la membrana plasmática de
eucariotas superiores (Deeley y Cole,
1997; Rea y col., 1998). Una vez que el
tripéptido ACV es transportado al exterior
celular, no es importado de nuevo hacia
el interior, ni en forma dimérica, ni monomérica (García-Estrada y col., 2007).
La IPN es el siguiente intermediario de la
ruta biosintética de penicilina y, al igual
que el tripéptido ACV, se sintetiza en el
citosol y también se secreta parcialmente
al caldo de cultivo. Mediante estudios de
transporte realizados utilizando una cepa
mutante que carece del cluster de genes
de biosíntesis de penicilina (P. chrysogenum npe10 pygG–), transformada con
un plásmido que contiene el gen penDE,
se ha observado que la IPN atraviesa con
dificultad la membrana plasmática. No
ocurre lo mismo con el paso a través de
la membrana peroxisomal desde el citosol, ya que en este caso probablemente
este sea muy efectivo (García-Estrada y
col., 2007).
El 6-APA es el último intermediario de la
ruta biosintética de penicilina antes de
formarse bencilpenicilina cuando se
añade ácido fenilacético como precursor
de la cadena lateral. El 6-APA es un compuesto más hidrofóbico que los ante-
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
83
riores, ya que posee un grupo carboxilo
menos. Esto, unido a su menor tamaño,
hace más factible su transporte por difusión pasiva a través de las membranas. En
estudios realizados de conversión de 6APA en bencilpenicilina utilizando el
mismo microorganismo mutante que en
el caso de la IPN, se ha podido apreciar
que el 6-APA es transportado al interior
celular mediante un transporte por difusión que depende de la concentración extracelular (García-Estrada y col., 2007).
Hasta el momento, no se ha identificado
ningún transportador que pueda estar implicado en el transporte de los compuestos intermediarios de la ruta al exterior celular.
ficiales y electroquímicos, que probablemente son suficientes para inhibir drásticamente la difusión pasiva de penicilinas
(Hillenga y col., 1994). En segundo lugar,
la difusión pasiva no puede explicar una
distribución de penicilinas con concentraciones más altas fuera que dentro de la
célula (Van de Kamp y col., 1999).
Las penicilinas aromáticas producidas por P.
chrysogenum son compuestos anfipáticos,
moderadamente hidrofóbicos y cargados
negativamente al pH normal del citosol
(Kirschbaum, 1986). Estas características
hacen posible su secreción al exterior celular por difusión a través de las membranas
peroxisomal y plasmática. Aparte de estas
indicaciones, no se conoce mucho más
acerca del mecanismo por el que los antibióticos beta-lactámicos son secretados al
medio por las células de los hongos productores (Martín y col., 2010).
Tampoco se puede excluir una tercera
opción, situada entre la difusión pasiva
y el transporte activo, que es el transporte vesicular (Luengo y col., 1986;
Kurylowicz y col., 1987; Müller, 1991;
Martín y col., 2010). Este tipo de transporte está implicado, por ejemplo, en la
síntesis de la pared celular, en la secreción de feromonas, en la liberación de
neurotransmisores y en el transporte y
secreción de ácidos biliares en los organismos eucariotas. El hecho de que la
penicilina sea sintetizada en el interior de
microcuerpos, otorga posibilidades a
este tipo de transporte mediado por vesículas, de modo que la bencilpenicilina,
además, sea transportada desde el peroxisoma hasta la membrana citoplasmática sin encontrarse libre por el citosol.
Aunque, por otro lado, el flujo de bencilpenicilina a través del citosol podría
servir para explicar en parte la formación
de 6-APA, atribuyéndola a una actividad
acilasa citosólica (Nielsen, 1995).
Existen varias razones que apuntan a un
sistema de transporte activo, primario o
secundario, como el más probable para la
secreción de penicilinas a través de la
membrana plasmática. En primer lugar,
factores físicos relacionados con las características de la membrana plasmática,
como el apretado empaquetamiento de
su capa lipídica debido al alto contenido
en ergosterol y diferentes factores super-
Con respecto al transporte activo, hasta
el momento no se ha identificado ningún
transportador de penicilina en P. chrysogenum. La búsqueda de transportadores
ha tenido algún resultado en A. nidulans,
donde se ha encontrado un transportador
de tipo ABC codificado por el gen atrD,
que está implicado, de algún modo, en la
secreción de penicilina (Andrade y col.,
2000).
Transporte de penicilina
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
84
Transporte a través de la membrana
peroxisomal
Los peroxisomas se han estudiado en varios hongos filamentosos como A. nidulans (Valenciano y col., 1996; 1998; De
Lucas y col., 1997), A. niger (Van Dijken
y Veenhuis, 1980; Schilling y Lerch,
1995) o N. crassa (Wanner y Theimer,
1982; Kionka y Kunau, 1985; Thieringer
y Kunau, 1991a, b; De Zoysa y
Connerton, 1994). El microcuerpo de P.
chrysogenum es un compartimento pequeño de membrana sencilla con un diámetro de 200-800 nm, por lo que es de
esperar que el flujo a través de este orgánulo sea alto.
Aunque se han aislado microcuerpos de
P. chrysogenum, la contaminación con
otros orgánulos ha impedido su completa
caracterización (Müller y col., 1995). Los
peroxisomas están implicados en diferentes rutas metabólicas que varían
según los distintos organismos. En
hongos, el único lugar en el que se lleva
a cabo la β-oxidación de ácidos grasos es
en los peroxisomas. Además, estos orgánulos están implicados en otras funciones
como la biosíntesis de penicilina y el desarrollo sexual.
Durante mucho tiempo se pensó que los
peroxisomas eran permeables a moléculas pequeñas debido a la presencia de
porinas en sus membranas. Pero estudios
posteriores realizados in vivo mostraron
que estas membranas constituían una
barrera efectiva, siendo impermeable a
los protones (lo que permite la existencia
de diferente pH entre la matriz peroxisomal y el citosol) y a otros pequeños solutos, como NADPH, acetil-CoA y ácidos
grasos activados, para los cuales eran ne-
cesarios transportadores especializados
(Singh y col., 1992; Tabak y col., 1995;
Van Roermund y col., 1995; Hettema y
col., 1996). De todos modos, debido al
bajo contenido en esterol de la membrana peroxisomal, se ha sugerido que
es más permeable que la membrana
plasmática (Sulter y col., 1993; Zinser y
Daum, 1995).
No existen datos disponibles de la permeabilidad de la membrana peroxisomal
para el ácido fenilacético, ácido fenoxiacético, CoA y ATP, sustratos de la PCL, o
para el fenilacetil-CoA, fenoxiacetil-CoA
e IPN, sustratos de la IAT, ni tampoco para
los productos de la reacción catalizada
por la IAT, la bencilpenicilina y el ácido
L-α-aminoadípico.
En vista de las propiedades de permeabilidad de los ácidos fenilacético y fenoxiacético (Hillenga y col., 1995), es probable
que tanto el ácido fenilacético como el
ácido fenoxiacético difundan libremente
a través de la membrana del microcuerpo.
Del mismo modo, tomando como base
las propiedades hidrofílicas y de peso molecular de la IPN y del ácido L-α-aminoadípico, es de esperar que se necesiten
transportadores específicos para estos
compuestos.
En cuanto a las penicilinas hidrofóbicas
formadas, podrían liberarse del microcuerpo tanto por difusión como por transporte activo. Pero esto hasta el momento
son suposiciones, ya que no existe ninguna evidencia experimental de la implicación de transportadores activos en el
transporte de IPN, ácido fenilacético,
ácido L-α-aminoadípico o penicilinas hidrofóbicas a través de la membrana peroxisomal.
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
85
Implicaciones biotecnológicas
en la producción de penicilinas
y otros antibióticos beta-lactámicos
derivados
Junto con los programas industriales de
mejora de cepas, la caracterización de los
genes y proteínas implicados en la ruta biosintética de antibióticos beta-lactámicos ha
permitido el desarrollo de diferentes estrategias a través de la ingeniería genética
para modificar P. chrysogenum con el fin
de obtener penicilinas semisintéticas y
otros antibióticos beta-lactámicos, tales
como cefalosporinas semisintéticas.
Penicilinas semisintéticas
Es bien conocido que si se añade al medio
de cultivo un precursor de la cadena lateral se producirá de forma mayoritaria un
tipo de penicilina. Las penicilinas así obtenidas se denominan biosintéticas siendo
las más importantes la bencilpenicilina o
penicilina G (cuando se añade como precursor de la cadena lateral el ácido fenilacético) y la penicilina V (cuando se
añade como precursor de la cadena lateral el ácido fenoxiacético). Esta es la estrategia que se sigue para la producción
de penicilinas semisintéticas, cuyo proceso
de obtención se describe a continuación.
Las penicilinas biosintéticas obtenidas mediante procesos fermentativos se purifican
mediante cristalización tras añadir acetato
potásico. Estas penicilinas no solo constituyen los precursores de las penicilinas semisintéticas, sino también de cefalosporinas, ya que tras la desacilación química
o enzimática de la cadena lateral se obtiene el núcleo de 6-APA, que es la base
para la síntesis de estos compuestos.
La producción clásica de penicilinas semisintéticas comenzó en los años 70 y con-
sistía en una desacilación química de la
penicilina G obtenida mediante fermentación. Este proceso requería compuestos
y solventes peligrosos, por lo que estuvo
en uso hasta finales de los 80, cuando se
sustituyó por la hidrólisis enzimática de la
penicilina G o de la penicilina V. Para ello,
se utilizan las enzimas penicilina G acilasa
y penicilina V acilasa, ambas de gran eficiencia y que se obtienen como enzimas
recombinantes a partir de Escherichia coli
(en el caso de la penicilina G acilasa) o
Fusarium oxysporum (en el caso de la penicilina V acilasa) (Arroyo y col., 2003).
Aunque la penicilina V muestra una
mayor estabilidad en soluciones acuosas
a bajo pH durante la extracción a partir
de caldos fermentados, la penicilina G es
la molécula de elección en la producción
de 6-APA (un 85% del 6-APA producido
mundialmente se obtiene a partir de penicilina G).
Tras la obtención del núcleo de 6-APA, se
le adicionan químicamente diferentes cadenas laterales, dando lugar a las penicilinas semisintéticas, las cuales se agrupan
en cinco categorías: penicilinas antistafilocócicas (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina), aminopenicilinas
(ampicilina, amoxicilina), carboxipenicilinas
(carbenicilina, ticarcilina), ureidopenicilinas
(piperacilina y mezlocilina) y penicilinas resistentes a beta-lactamasas (combinación
de las anteriores con inhibidores de la enzima beta-lactamasa; por ejemplo, amoxicilina-ácido clavulánico, ampicilina-sulbactam) (Oshiro, 1999).
Modificación de P. chrysogenum para
producir cefalosporinas semisintéticas
Las cefalosporinas derivadas de la penicilina se basan principalmente en el nú-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
86
cleo del ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA), el cual se origina
tras la expansión química del anillo de la
bencilpenicilina (dando lugar al compuesto fenilacetil-7-ADCA) seguida de
una desacilación enzimática que elimina
la cadena lateral aromática (Barber y col.,
2004) (figura 4). La expansión del anillo
es un proceso complejo y contaminante,
por lo que la producción de 7-ADCA a
través de otros procesos, tales como la
modificación genética de P. chrysogenum (que no produce cefalosporinas
de modo natural), es conveniente.
Expansión química
Expansión vía adipyl 6-APA
(Crawford y col., 1995)
ACV
ACV
Isopenicilina N
Isopenicilina N
Ácido
fenilacético
Ácido
adípico
La gran capacidad que tiene P. chrysogenum para producir antibióticos, junto
con el alto coste que tienen las fermentaciones realizadas con A. chrysogenum (el
hongo productor de cefalosporinas), han
promovido la producción de antibióticos
derivados del anillo cefalosporánico en
P. chrysogenum. Este hongo filamentoso
ha sido modificado genéticamente, de
modo que sea capaz de expresar diferentes combinaciones de genes biosintéticos de cefalosporinas provenientes de
diversos microorganismos productores de
cefalosporinas y cefamicinas.
Expansión vía penicillin N
(Cantwell y col., 1990,
Beckman y col., 1993)
ACV
Isopenicilina N
S. clavuligerus
cefD (epimerasa)
Penicilina N
S. clavuligerus
cefE (expandasa)
S. clavuligerus
cefE (expandasa)
Expansión química
del anillo
Fenilacetil 7-ADCA
ACV
Isopenicilina N
Ácido
adípico
Adipil 6-APA
Adipil 6-APA
Bencilpenicilina
Carbamilación
(Harris y col., 2009)
Adipil 7-ADCA
Glutaril
acilasa
Penicilina
acilasa
DAOC
H2N
O
S
N
CH3
COOH
7-ADCA
A. chrysogenum
cefEF (hidr-exp)
Adipil 7-ADCA
A. chrysogenum
cefEF (hidr-exp)
Adipil 7-AHCA
A. clavuligerus
cmcH (carbamoiltr)
ad7-ACCCA
Figura 4. Estrategias para la producción de cefalosporinas semisintéticas usando P. chrysogenum.
Mediante la introducción del gen cefE
(expandasa) de Streptomyces clavuligerus o del gen cefEF (expandasa/hidroxilasa) de A. chrysogenum en P. chrysogenum, el microorganismo modificado
resultante fue capaz de expandir el anillo
tiazolidínico de la penicilina para formar
un anillo dihidrotiazínico de seis miembros. La adición en exceso de ácido adípico como precursor de la cadena lateral
dio como resultado la producción de
adipil-6-APA, que fácilmente se expandió
a adipil-7-ADCA (figura 4). Esta estrategia también condujo a la producción
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
87
de ácido adipil 7-aminocefalosporánico
(adipil-7-ACA) cuando se introdujo el
gen que codifica la acetiltransferasa
(cefG) de A. chrysogenum.
De modo similar, la introducción de los
genes cefEF de A. chrysogenum y cmcH
(carbamoil transferasa) de S. clavuligerus
en P. chrysogenum dio como resultado la
producción del ácido adipil-7-amino-3carbamoiloximetil-3-cefem-4-carboxílico
(ad7-ACCCA), que es un precursor de cefalosporinas muy interesante desde el
punto de vista de la estabilidad (Harris y
col., 2009) (figura 4).
Bases moleculares de la
mejora de la producción de
penicilina en P. chrysogenum
Como consecuencia de los programas industriales de mejora de cepas, se introdujeron numerosas modificaciones responsables de los títulos de penicilina tan
impresionantes producidos por P. chrysogenum. Algunas de estas modificaciones
se han caracterizado en detalle, y se relacionan a continuación.
El fenómeno de amplificación de la
agrupación de genes biosintéticos
Como se ha mencionado anteriormente,
los genes pcbAB, pcbC y penDE se encuentran agrupados en un único cluster
(figura 3) localizado en una región génica
que está presente a modo de única copia
en el genoma de las cepas de P. chrysogenum NRRL 1951 y Wisconsin 54-1255.
Sin embargo, en cepas de alta producción, esta región, cuyo tamaño varía entre
56,8 kb y 106,5 kb (dependiendo de la
cepa), sufre un fenómeno de amplificación en tándem, dando lugar a varias co-
pias de la agrupación de genes biosintéticos (Fierro y col., 1995; Newbert y col.,
1997). De este modo, la cepa AS-P-78
tiene 5-6 copias del cluster, la cepa E1
tiene 12-14 copias y la cepa DS0485 tiene
5-6 copias (Fierro y col., 1995; Van den
Berg y col., 2007). El mecanismo que lleva
a la amplificación no es del todo conocido, pero se ha sugerido que los hexanucleótidos conservados que se encuentran
localizados en los bordes de la región amplificada pueden actuar de “sitios calientes“ para la recombinación (Fierro y
col., 1995).
Cabe señalar que además de los tres
genes biosintéticos, la región amplificada
también contiene otros genes (Fierro y
col., 2006; Van den Berg y col., 2007).
Puesto que estos genes adicionales también sufren el fenómeno de amplificación,
cabría esperar que pudiesen jugar un
papel en la biosíntesis, regulación o secreción de penicilina. Sin embargo, estos
genes son esenciales para este propósito,
ya que, como se comprobó posteriormente, la mera presencia de los tres
genes biosintéticos fue suficiente para restaurar la producción de antibiótico en un
mutante que carecía de la región completa (García-Estrada y col., 2007; Van
den Berg y col., 2007).
No se han encontrado reguladores específicos de la biosíntesis de penicilina en dicha
región, lo que indica que tal regulación
corre a cargo de reguladores globales del
metabolismo secundario, tales como LaeA
o el complejo Velvet. Tampoco se encuentran presentes dentro de la región amplificada otros genes que codifican enzimas
que contribuyen a la ruta biosintética de
penicilina, como es el caso del gen ppt,
que codifica la enzima PPTasa encargada
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
88
de activar postraduccionalmente la ACVS
(García-Estrada y col., 2008b), o del gen
phl, que codifica la fenilacetil-CoA ligasa
encargada de activar la cadena lateral aromática de la bencilpenicilina (LamasMaceiras y col., 2006). Curiosamente, la
amplificación de los genes laeA, ppt o phl
mediante ingeniería genética tiene como
consecuencia el aumento de los títulos de
penicilina (Lamas-Maceiras y col., 2006;
García-Estrada y col., 2008b; Kosalková y
col., 2009).
Aunque las cepas de alta producción
tienen varias copias de la región amplificada, se ha visto que no existe una correlación directa entre la producción de penicilina y el número de copias de los
genes biosintéticos (ni tampoco con los
niveles de transcritos o proteínas) (Smith
y col., 1989; Newbert y col., 1997; Nijland
y col., 2010; Smidák y col., 2010), lo que
indica que existen otras modificaciones
que también juegan un papel importante
en el incremento de la producción de antibiótico.
Disminución del catabolismo
del ácido fenilacético
Otra de las modificaciones que ha sido caracterizada en detalle está relacionada
con el catabolismo del ácido fenilacético
(el precursor de la cadena lateral de la
bencilpenicilina).
El ácido fenilacético es un ácido débil tóxico para las células en función de su concentración y del pH del cultivo. Este compuesto puede metabolizarse en P.
chrysogenum al menos a través de dos
rutas metabólicas: incorporación a la molécula de bencilpenicilina o catabolismo a
través de la ruta del homogentisato
(Fernández-Cañón y Peñalva, 1995;
Mingot y col., 1999; Arias-Barrau y col.,
2004; Ferrer-Sevillano y Fernández-Cañón,
2007).
La primera etapa de la ruta del homogentisato consiste en la 2-hidroxilación del
ácido fenilacético y la formación de 2-hidroxifenilacetato, el cual, en sucesivas
etapas, se cataboliza a fumarato y acetoacetato. Esta 2-hidroxilación está catalizada
por un citocromo P450 monooxigenasa
microsomal denominada fenilacetato 2-hidroxilasa (EC: 1.14.13), la cual está codificada por el gen pahA. La secuenciación del
gen pahA a partir de varias cepas de P.
chrysogenum reveló que mientras que la
cepa silvestre (NRRL 1951) contiene una C
en la posición 598 del gen, la cepa 49-133
(y también su descendiente, Wisconsin 54
1255) sufrieron una mutación en esa posición, reemplazando la C por una T. Esta
mutación en el gen da lugar a una modificación en la proteína (L181F), la cual es responsable de la reducción en la actividad
enzimática. Por tanto, el catabolismo del
ácido fenilacético está disminuido en la
cepa Wisconsin 54-1255 y presumiblemente, en las cepas derivadas de esta, lo
que tiene como consecuencia un mayor
acúmulo de este compuesto y una mayor
producción de bencilpenicilina (RodríguezSaiz y col., 2001).
La importancia de la fenilacetato 2-hidroxilasa en la producción de penicilina se
hizo más patente al comparar el gen
pahA de P. notatum (el aislado original de
Fleming) con el de P. chrysogenum NRRL
1951 (la cepa silvestre aislada de un
melón en Peoria, IL). Esta última muestra
una mutación en el gen (C1357T), lo cual
se traduce en una modificación de la proteína (A394V). Esta modificación también
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
89
está presente en la cepa Wisconsin 541255 (y probablemente en sus cepas descendientes), lo que conduce a una disminución de la activad fenilacetato
2-hidroxilasa con la consiguiente reducción en la oxidación de ácido fenilacético
y la mayor producción de penicilina,
hecho que justifica la selección histórica
de P. chrysogenum como productor industrial de penicilina (Rodríguez-Saiz y
col., 2005). Por tanto, la acumulación
consecutiva de mutaciones puntuales en
la fenilacetato 2-hidroxilasa es otro de los
motivos por los que P. chrysogenum es
tan buen productor de penicilina.
Modificaciones de la expresióngénica:
Genómica y Transcriptómica
Las modificaciones detalladas anteriormente fueron descubiertas y caracterizadas a lo largo de los años y no suponían
más que la punta del iceberg. Muchas
otras modificaciones se mantuvieron
ocultas hasta la llegada de la era de las
“ómicas“.
Los microcuerpos son orgánulos involucrados en la última etapa de la ruta biosintética de penicilina (sustitución de la cadena lateral a través de la IAT) y en la
activación de dicha cadena lateral mediante la enzima PCL. Se ha visto que
existe una relación directa entre la abundancia de microcuerpos (peroxisomas) y
el incremento en los títulos de penicilina
(Kiel y col., 2005). De hecho, se ha comprobado que el número de microcuerpos
se encuentra aumentado en las cepas de
alta producción de penicilina (Van den
Berg y col., 2008).
La publicación de la secuencia completa
del genoma de P. chrysogenum Wisconsin
54-1255 (Van den Berg y col., 2008) supuso el trampolín definitivo para que se
desarrollasen varios estudios encaminados
a descifrar los secretos que se encuentran
detrás de la producción de penicilina. Una
de las modificaciones que se encontraron
fue la introducción de una repetición de
14 pb en un gen homólogo a una cefalosporina esterasa cuando se modificó la
cepa Q-176 para dar lugar a la cepa
Wisconsin 54-1255 (alterando el marco
de lectura), lo que sugiere una reducción
en la degradación no deseada de betalactamas. Otro ejemplo lo constituye la introducción de una mutación en un transportador de tipo ABC cuando se modificó
la cepa Q-176 para dar lugar a la cepa
Wisconsin 54-1255, lo que sugiere una
modificación en las capacidades de transporte (Van den Berg, 2010).
El hecho de que la ruta de biosíntesis de
penicilina esté compartimentalizada
entre el citosol y los microcuerpos ha
sido crucial para la productividad, y parece que P. chrysogenum ha perdido su
capacidad de sintetizar penicilinas en el
citosol (Müller y col., 1992), ya que los
peroxisomas son esenciales para una eficiente biosíntesis de penicilina (Meijer y
col., 2010).
Los datos proporcionados por los estudios
de transcriptómica indican que la expresión
de los genes implicados en la biosíntesis de
aminoácidos precursores de la penicilina
(cisteína, valina y ácido α-aminoadípico)
está aumentada en las cepas de alta producción. Varios genes que codifican proteínas de microcuerpos siguen la misma tendencia (Van den Berg y col., 2008).
Curiosamente, también se observó que la
Aumento en el número de
microcuerpos (peroxisomas)
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
90
transcripción de los genes biosintéticos
pcbAB, pcbC y penDE se incrementa únicamente entre 2 y 4 veces en las cepas de alta
producción (Van den Berg y col., 2008), lo
que sugiere que otras modificaciones en
otras rutas metabólicas han contribuido
tanto como el fenómeno de amplificación
génica anteriormente mencionado a la producción de penicilina.
Aunque los datos provenientes de la
Genómica y Transcriptómica han proporcionado una visión global de algunos de
los mecanismos que han contribuido al incremento de la producción de antibiótico,
la integración de otras “ómicas“ era aún
necesaria para aumentar el conocimiento
de las bases moleculares responsables del
incremento de la producción.
Modificaciones globales del
metabolismo: Proteómica
y Metabolómica
La reciente aplicación de las técnicas de
Proteómica y la optimización de la electroforesis bidimensional para P. chrysogenum permitió realizar un análisis comparativo detallado entre la cepa silvestre
NRRL 1951, la cepa de baja producción
Wisconsin 54-1255 y la cepa de alta producción AS-P-78 (Jami y col., 2010) con
el fin de analizar las modificaciones acontecidas en el metabolismo durante el programa industrial de mejora de cepas.
Una visión global de las proteínas expresadas diferencialmente en estas tres cepas
reveló que la representatividad de algunas
rutas y funciones se había ampliado durante el proceso de mejora, mientras que
para otros casos estas habían disminuido.
Se observó que en la cepa silvestre predominan las proteínas implicadas en la viru-
lencia y la degradación de la pared celular
de plantas para la obtención de nutrientes
(esta cepa fue aislada de un melón y, por
tanto, es capaz de infectar y crecer sobre
frutas). Un ejemplo lo constituye la glucosa oxidasa. La escasa representación de
esta enzima asociada con la infectividad
de plantas en las cepas de alta producción
no es sorprendente, ya que los cultivos líquidos sumergidos han sustituido al crecimiento natural sobre frutas.
Probablemente, la pérdida más notable
que se produjo durante la selección de
estas cepas fue la que implica a algunas
rutas del metabolismo secundario, lo cual
potenció la biosíntesis de antibióticos
beta-lactámicos. Algunas de las proteínas
cuya síntesis estaba aumentada en la cepa
silvestre llevó a plantear que una de las razones de la escasa cantidad de penicilina
producida por la cepa silvestre podría ser
el uso de los precursores y la energía para
la biosíntesis de otros metabolitos secundarios, tales como los terpenoides (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa), porfirinas (coproporfirinógeno oxidasa) o
pigmentos como violaxantina (zeaxantina
epoxidasa) y la melanina (scytalone deshidratasa), lo cual desviaría los flujos metabólicos lejos de la ruta de biosíntesis de
penicilina. Los pigmentos constituyen uno
de los mejores ejemplos de metabolitos
secundarios que se perdieron durante la
manipulación de la cepa silvestre para obtener la cepa Wisconsin 54-1255, como
es el caso del pigmento amarillo. Como
se mencionó anteriormente, durante los
tratamientos mutagénicos desde la cepa
Q-176 a la cepa BL3-D10 (precursores de
la cepa Wisconsin 54-1255), se seleccionaron cepas sin pigmentación. Durante la
selección de la cepa de alta producción
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
91
AS-P-78, otras rutas del metabolismo secundario parecen haber sido bloqueadas,
como sugiere la ausencia en la cepa ASP-78 de una supuesta isoflavona reductasa, la cual participa en la última parte
de la ruta biosintética de medicarpina.
Las proteínas implicadas en la biosíntesis
o degradación de los aminoácidos precursores están representadas en las tres
cepas de modo distinto. En la cepa silvestre NRRL 1951, el aumento de los niveles de la metilmalonato semialdehído
deshidrogenasa podría ser otra de las razones de la baja biosíntesis de penicilina
por parte de esta cepa. Esta enzima está
implicada en la “vía distal“ del catabolismo de la valina (Goodwin y col., 1989;
Zhang y col., 1996), conduciendo al agotamiento de las reservas de valina. La biosíntesis de cisteína parece ser una de las
principales mejoras que se produjeron durante el proceso de selección. El flujo de
producción de penicilina está fuertemente
influenciado por la disponibilidad de cisteína para la formación de ACV (Nasution
y col., 2008). La cisteína sintasa (encargada de la biosíntesis de cisteína a partir
de serina) está más representada en la
cepa Wisconsin 54-1255 que en la cepa
silvestre. Esta mejora se conserva en la
cepa AS-P-78 que, además, mostró mayor
contenido de la enzima cistationina beta
sintasa, una enzima implicada en la biosíntesis de cisteína a partir de metionina
por transulfuración. Esto indica que en la
cepa AS-P-78 se han mejorado las dos
vías de biosíntesis de cisteína.
En la cepa Wisconsin 54-1255 son predominantes las proteínas encargadas de la
obtención de energía a partir de carbohidratos. Estas proteínas pertenecen en su
mayoría al ciclo de los ácidos tricarboxí-
licos, aunque también hay enzimas de la
glicolisis y de la ruta de la fosforilación oxidativa. Es probable que durante el proceso de mejora de cepas, los mecanismos
de obtención de energía fuesen beneficiosos para satisfacer la creciente demanda para la biosíntesis de penicilina.
Un hallazgo interesante es que la cepa
Wisconsin 54-1255 produce mayores cantidades, en comparación con la cepa de
alta producción AS-P-78, de una proteína
que podría estar relacionada con la modificación o degradación de penicilina.
Esta enzima es similar a una 1,4-butanodiol diacrilato esterasa BDA1 (implicada
en la conversión de 1,4-butanodiol diacrilato en 4-hidroxibutil acrilato) y contiene
un dominio que está conservado en la
clase C de beta-lactamasas y otras proteínas de unión a penicilina. Esta proteína
muestra similitud con una supuesta transesterasa (LovD) de Aspergillus clavatus
(85% de homología, 72% de identidad)
y una beta-lactamasa de Paracoccidioides
brasiliensis (48% de homología, 32% de
identidad). La transesterasa LovD añade
2-metilbutirato a monacolina J para
formar lovastatina. Por lo tanto, la proteína 1,4-butanodiol diacrilato esterasa
podría unirse al núcleo de la penicilina
contribuyendo a su modificación o degradación. La disminución de los niveles de
esta proteína en la cepa AS-P-78 en comparación con las cepas silvestre y
Wisconsin 54-1255 podría ser uno de los
mecanismos que han contribuido al aumento de los títulos de la penicilina en
esta cepa industrial.
Otra modificación que podría haber servido de base para el aumento de los títulos de penicilina en la cepa AS-P-78 es
la sobreproducción de enzimas de la ruta
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
92
de las pentosas fosfato. Las enzimas de la
fase no oxidativa de esta ruta, como la ribosa-5-fosfato isomerasa o la transcetolasa, son predominantes en la cepa de
alta producción. Además, algunas enzimas que intervienen en la síntesis de
novo de pirofosfato de tiamina se encuentran más representadas en la cepa de
alta producción. El pirofosfato de tiamina
es un grupo prostético presente en numerosas enzimas. Una de estas enzimas es la
transcetolasa (Shreve y col., 1983), que
conecta la ruta de las pentosas fosfato
con la glicolisis mediante la introducción
del exceso de azúcares fosfato en las principales rutas metabólicas de carbohidratos. Es probable que se originen altas
concentraciones de ribulosa-5-fosfato
(junto con poder reductor en forma de
NADPH) en la cepa de alta producción a
través de la fase oxidativa de la ruta de las
pentosas fosfato, por lo que el exceso de
este azúcar fosfato sería convertido por la
ribosa-5-fosfato isomerasa en ribulosa-5fosfato (precursora de nucleótidos y
ácidos nucleicos) y por la transcetolasa en
precursores para la glicolisis. El aumento
en los niveles de NADPH se ha correlacionado positivamente con la producción de
antibióticos beta-lactámicos (Jørgensen y
col., 1995; Henriksen y col., 1996; Van
Gulik y col., 2000). Se sabe que la producción de penicilina en las cepas de alta producción implica un gran suministro de
NADPH (Kleijn y col., 2007) (la biosíntesis
de un mol de penicilina requiere 8,10
moles de NADPH). Además, se ha descrito
que la producción de penicilina está fuertemente influenciada por el nivel de ATP
y la concentración de cisteína. Ya que el
NADPH es necesario para la biosíntesis de
este aminoácido, existe una relación po-
sitiva entre los niveles de cisteína y
NADPH y la producción de penicilina
(Nasution y col., 2008). El NADPH también es necesario para reducir el glutatión
oxidado que se deriva de las tasas de aireación intensa durante el estrés oxidativo
(Díez y col., 1998). Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que
varias proteínas implicadas en la respuesta
al estrés oxidativo (glutatión S-transferasa,
citocromo P450 monooxigenasa, quinona
oxidorreductasa de NADPH, etc.) están
más representadas en la cepa AS-P-78.
Algunas diferencias observadas en la cepa
AS-P-78 se corresponden con los datos
proporcionados por la respuesta transcripcional de una cepa de P. chrysogenum
modificada para producir ad7-ACCCA.
Esto puede ser debido a que la cepa de
P. chrysogenum utilizada en este estudio
era una cepa superproductora de penicilina. Esta respuesta incluía una regulación
positiva de la transcripción de una supuesta aflatoxina B1 aldehído reductasa,
dos glutatión S-transferasas, una citocromo P450 monooxigenasa y una quinona oxidorreductasa de NADPH (Harris
y col., 2009). Estos resultados apuntan a
que la respuesta al estrés oxidativo constituye un mecanismo de adaptación a la
superproducción de penicilina.
Es curioso que otra proteína que está más
representada en la cepa Wisconsin 541255 comparado con la cepa silvestre y
también en la cepa AS-P-78 en comparación con la cepa Wisconsin 54-1255, haya
sido identificada como una enoilrreductasa
LovC (Pc20g05830). También se ha descrito que existe una regulación positiva del
gen que codifica la enoilrreductasa LovC
como una de las respuestas transcripcionales de la cepa de P. chrysogenum que
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
93
produce ad7-ACCCA (Harris y col., 2009).
Dicha proteína participa en la biosíntesis
del precursor de lovastatina, dihidromonacolina L. Queda por establecer si esta proteína está verdaderamente implicada en la
biosíntesis de lovastatina o si es una proteína indirectamente relacionada con la
biosíntesis de penicilina.
Conclusiones
La era de las “ómicas“ ha permitido a los
científicos, 80 años después del descubrimiento de Fleming del hongo productor de
penicilina, empezar a comprender las bases
moleculares del incremento de la producción de antibiótico como consecuencia de
seis décadas de mejora clásica de cepas.
Los avances en la Microbiología, Bioquímica, Genética y Biología Molecular han
contribuido al conocimiento de los genes
y enzimas estructurales, auxiliares y reguladores, junto con la caracterización de los
compartimentos subcelulares involucrados
en la biosíntesis de antibióticos beta-lactámicos. Los datos proporcionados por la
Genómica, Transcriptómica, Proteómica y
Metabolómica han revelado las modificaciones principales del metabolismo primario y secundario que han ocurrido durante los programas de mejora de cepas,
dando lugar al cuidadoso reequilibrio entre
procesos celulares y metabólicos responsables de los impresionantes títulos de penicilina alcanzados por las cepas industriales
actuales. Estos hallazgos servirán de ayuda
a la comunidad científica perteneciente
tanto a la industria farmacéutica como al
ámbito académico, no solo para continuar
la explotación de la exitosa sinergia existente entre P. chrysogenum y la producción
de antibióticos beta-lactámicos, sino también para explorar la producción de otros
compuestos usando este hongo, que ha
demostrado ser tan versátil como factoría
celular.
Agradecimientos
Los avances en el conocimiento de la producción de antibióticos beta-lactámicos han
sido fruto del trabajo llevado a cabo por varios grupos de investigación, siendo uno de
los más importantes el formado por el profesor Juan Francisco Martín y su equipo de
investigadores de la Universidad de León
y del Instituto de Biotecnología de León
(INBIOTEC). Gran parte de los trabajos han
sido financiados a través de distintos organismos, entre los que destacan la Unión
Europea (Proyectos Eurofung QLRT-199900729 y Eurofungbase), Ministerio de
Industria (Proyecto PROFIT: FIT-0100002007-74), Ministerio de Ciencia y
Tecnología, Programa Torres Quevedo
(PTQ04-3-0411 y PTQ05-02-02553), Junta
de Castilla y León (Proyecto LE13/04),
Agencia de Inversiones y Servicios de
Castilla y León (Proyecto Genérico de
Desarrollo Tecnológico 2008) y DSM
Antiinfectives.
Bibliografía recomendada
Abraham EP, Chain E, Fletcher CM, Gardner
AD, Heatley NG, Jennings MA, Florey HW.
Further observations on penicillin. Lancet,
1941; II:177-89.
Aharonowitz Y, Cohen Gm Martín JF. Penicillin
and cephalosporin biosynthetic genes: structure, organization, regulation, and evolution.
Annu Rev Microbiol 1992; 46:461-95.
Álvarez E, Cantoral JM, Barredo JL, Díez B,
Martín JF. Purification to homogeneity and characterization of the acyl-CoA: 6-APA acyltransferase of Penicillium chrysogenum. Antimicrob.
Agents Chemother 1987; 31:1.675-82.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
94
Álvarez E, Meesschaert B, Montenegro E,
Gutiérrez S, Díez B, Barredo JL, Martín JF. The
isopenicillin N acyltransferase of Penicillium
chrysogenum has isopenicillin N amidohydrolase, 6-aminopenicillanic acid acyltransferase
and penicillin amidase activities, all of which
are encoded by the single penDE gene. Eur J
Biochem 1993; 215:323-32.
Andrade AC, Van Nistelrooy JG, Peery, RB,
Skatrud PL, De Waard MA. The role of ABC
transporters from Aspergillus nidulans in protection against cytotoxic agents and in antibiotic production. Mol Gen Genet 2000;
263:966-97.
Andre B. An overview of membrane transport
proteins in Saccharomyces cerevisiae. Yeast
1995; 11:1.575-611.
Aplin RT, Baldwin JE, Cole SC, Sutherland JD,
Tobin MB. On the production of α, β-heterodimeric acyl-coenzyme A: isopenicillin N-acyltransferase of Penicillium chrysogenum. Studies
using a recombinant source. FEBS. Lett 1993a;
319:166-70.
Aplin RT, Baldwin JE, Roach PL, Robinson CV,
Schofield CJ. Investigations into the post-translational modification and mechanism of isopenicillin N:acyl-CoA acyltransferase using electrospray mass spectrometry. Biochem J 1993b;
294:357-63.
Arias-Barrau E, Olivera ER, Luengo JM,
Fernández C, Galán B, García JL, Díaz E,
Miñambres B. The homogentisate pathway: a
central catabolic pathway involved in the degradation of L-phenylalanine, L-tyrosine, and 3hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida.
J Bacteriol 2004; 186:5.062-77.
Arroyo M, De la Mata I, Acebal C, Castillón
MP. Biotechnological applications of penicillin
acylases: State-of-the-art. Appl Microbiol
Biotechnol 2003; 60:507-14.
Arst HN Jr, Bignell E, Tilburn J. Two new
genes involved in signalling ambient pH in
Aspergillus nidulans. Mol Gen Genet 1994;
245:787-90.
Backus MP, Stauffer JF. The production and selection of a family of strains in Penicillium chrysogenum. Mycologia 1955; 47:429-63.
Baldwin JE, Bird JW, Field RA, O´Callaghan NM,
Schofield CJ. Isolation and partial characterization of ACV synthetase from Cephalosporium
acremonium and Streptomyces clavuligerus. J
Antibiot 1990; 43:1.055-7.
Baldwin JE, Bird JW, Field RA, O´Callaghan NM,
Schofield CJ, Willis AC. Isolation y partial characterisation of ACV synthetase from
Cephalosporium acremonium and Streptomyces
clavuligerus: evidence for the presence of phosphopantothenate in ACV synthetase. J Antibiot
1991; 44:241-8.
Barber MS, Giesecke U, Reichert A, Minas W.
Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv Biochem Eng
Biotechnol 2004; 88:179-215.
Barredo JL, Álvarez E, Cantoral JM, Díez B,
Martín JF. Glucokinase-deficient mutant of
Penicillium chrysogenum is derepressed in glucose catabolite regulation of both betagalactosidase and penicillin biosynthesis. Antimicrob
Agents Chemother 1988; 32:1.061-7.
Barredo JL, Cantoral JM, Álvarez E, Díez B,
Martín JF. Cloning, sequence analysis and
transcriptional study of the isopenicillin N synthase of Penicillium chrysogenum AS-P-78. Mol
Gen Genet 1989a; 216:91-8.
Barredo JL, Van Solingen P, Díez B, Álvarez E,
Cantoral JM, Kattevilder A, Smaal EB, Groenen
MAM, Veenstra AE, Martín JF. Cloning and
characterization of the acyl coenzyme A: 6
aminopenicilanic acid acyltransferase gene of
Penicillium chrysogenum. Gene 1989b;
83:291-300.
Barrios-González J, Montenegro E, Martín JF.
Penicillin production by mutants resistant to
phenylacetic acid. J Ferment Bioeng 1993; 76;
455-8.
Batchelor FR, Doyle PD, Nayler JHC, Rolinson
GN. Synthesis of penicillin: 6-amino-penicillanic acid in penicillin fermentations. Nature
1959; 183:257-8.
Benko PV, Word TC, Segel IH. Specificity and
regulation of methionine transport in filamentous fungi. Arch Biochem Biophys 1967;
122:783-804.
Benko PV, Wood TC, Segel IH. Multiplicity and
regulation of amino acid transport in Penicillium
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
95
chrysogenum. Arch Biochem Biophys 1969;
129:498-508.
Penicillium chrysogenum. Appl Microbiol
Biotechnol 1997; 47:250-4.
Bergh KT, Litzka O, Brakhage AA. Identification of a major cis-acting DNA element controlling the bidirectionally transcribed penicillin biosynthesis genes acvA (pcbAB) and ipnA
(pcbC) of Aspergillus nidulans. J Bacteriol
1996; 178:3.908-16.
Clarke HT, Johnson JR, Robinson R. The chemistry of penicillin. Ed Robinson R Princenton
University Press, 1949.
Brakhage AA. Molecular regulation of α- lactam
biosynthesis in filamentous fungi. Microbiol Mol
Biol Rev 1998; 62:547-85.
Brakhage AA, Spröte P, Al-Abdallah Q, Gehrke
A, Plattner H, Tüncher A. Regulation of penicillin biosynthesis in filamentous fungi. Adv
Biochem Eng Biotechnol 2004; 88:45-90.
Caddick MX, Peters D, Platt A. Nitrogen regulation in fungi. Antonie Van Leeuwenhoek
1994; 65:169-77.
Carr LG, Skatrud PL, Scheetz ME, Queener SW,
Ingolia TD. Cloning and expression of the isopenicillin N synthetase gene from Penicillium
chrysogenum. Gene 1986; 48:257-66.
Casqueiro J, Gutiérrez S, Bañuelos O, Fierro F,
Velasco J, Martín JF. Characterization of the
lys2 gene of Penicillium chrysogenum encoding alpha-aminoadipic acid reductase. Mol
Gen Genet 1998; 259:549-56.
Casqueiro J, Gutiérrez S, Bañuelos O,
Hijarrubia MJ, Martín JF. Gene targeting in
Penicillium chrysogenum: disruption of the
lys2 gene leads to penicillin overproduction. J
Bacteriol 1999; 181:1.181-8.
Chain E, Florey HW, Gardner AD. Penicillin as
a chemotherapeutic agent. Lancet 1994;
II:226-8.
Chang LT, McGrory EL, Elander RP. Penicillin
production by glucose-derepressed mutants of
Penicillium chrysogenum. J Ind Microbiol
1990; 6:165-9.
Chu YW, Renno D, Saunders G. Detection of
a protein which binds specifically to the upstream region of the pcbAB gene in
Penicillium chrysogenum. Curr Genet 1995;
28:184-9.
Chu YW, Renno D, Saunders G. Extracellular
pH affects regulation of the pcbAB gene in
Clutterbuck PW, Lovel LR, Raistrick H. Studies
in the biochemistry of the microorganisms.
XXVI. The formation from glucose by members of the Penicillium chrysogenum species
of a pigment, an alkali soluble protein and penicillin. The antibacterial substance of Fleming.
Biochem J 1932; 26:1.907-18.
Cohen G, Argaman A, Schreiber R, Mislovati
M, Aharonowitz Y. The thioredoxin system of
Penicillium chrysogenum and its possible role
in penicillin biosynthesis. J Bacteriol 1994;
176:973-84.
Cornil AV, Babés V. Un antagoniste microbien
nouveau. J Conn Med Prat (Paris) 1885;
7:321-3.
De Lucas JR, Valenciano S, Domínguez AI,
Turner G, Laborda F. Characterization of
oleate-nonutilizing mutants of Aspergillus nidulans isolated by the 3-amino-1,2,4-triazole
positive selection method. Arch Microbiol
1997; 168:504-51.
De Zoysa PA, Connerton IF. The function and
specificity of the C-terminal tripeptide glyoxysomal targeting signal in Neurospora crassa.
Curr Genet 1994; 26:430-7.
Del Carmen Mateos R, Sánchez S. Transport
of neutral amino acids and penicillin formation
in Penicillium chrysogenum. J Gen Genet
1990; 254:417-26.
Deeley RG, Cole SPC. Function, evolution and
structure of multidrug resistance protein
(MRP). Semin Cancer Biol 1997; 8:193-204.
Demain AL. Inhibition of penicillin formation by
lysine. Arch Biochem Biophys 1957; 67:244-6.
Demain AL. Biosynthesis of ‚-lactam antibiotics. En: Antibiotics containing the ‚-lactam
structure. Eds. Demain AL y Solomon NA.
Springer. Berlin Heidelberg. New York. 1983;
189-228.
Demain AL, Elander RP. The beta-lactam antibiotics: past, present, and future. Antonie Van
Leeuwenhoek 1999; 75:5-19.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
96
Demain AL, Martín JF, Elander RP. Penicillin biochemistry and genetics. En: Penicillin. A paradigm for biotechnology. Ed. Mateles RI.
Candida Corporation, Chicago 1998; 93-114.
Evers ME, Trip H, Van den Berg MA, Bovenberg
RA, Driessen AJ. Compartmentalization and
transport in β-lactam antibiotics biosynthesis.
Adv Biochem Eng Biotechnol 2004; 88:111-35.
Díez B, Gutiérrez S, Barredo JL, Van Solingen
P, Van deer Voort LHM, Martín JF. The cluster
of penicillin biosynthetic genes. Identification
and characterization of the pcbAB gene encoding the α-aminoadipyl-cysteinylvaline synthetase and linkage to the pcbC and penDE
genes. J Biol Chem 1990; 265:16.358-65.
Feng B, Friedlin E, Marzluf GA. A reporter
gene analysis of penicillin biosynthesis gene
expression in Penicillium chrysogenum and its
regulation by nitrogen and glucose catabolite
repression. Appl Environ Microbiol 1994;
60:4.432-9.
Díez B, Schleissner C, Moreno MA, Rodríguez
M, Collados A, Barredo JL. The manganese superoxide dismutase from the penicillin producer Penicillium chrysogenum. Curr Genet
1998; 33:87-394.
Domínguez Santos R, Martín JF, Kosalková K,
Prieto C, Ullán RV, García Estrada C. The regulatory factor PcRFX1 controls the expression of
the three genes of β-lactam biosynthesis in
Penicillium chrysogenum. Fungal Genet Biol
2012; 49:866-81.
Ehmann DE, Gehring AM, Walsh CT. Lysine
biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: mechanism of alpha-aminoadipate reductase
(Lys2) involves posttranslational phosphopantetheinylation by Lys5. Biochemistry 1999;
38:6.171-7.
Elander RP. Industrial production of β-lactam
antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol 2003;
61:385-92.
Entian KD, Fröhlich KU. Saccharomyces cerevisiae mutants provide evidence of hexokinase PII
as a bifunctional enzyme with catalytic and regulatory domains for triggering carbon catabolite repression. J Bacteriol 1994; 158:29-35.
Eriksen SH, Jensen B, Schneider I, Kaasgaard
S, Olsen J. Uptake of phenoxyacetic acid by
Penicillium chrysogenum. Appl Microbiol
Biotechnol 1995; 42:945-50.
Eriksen SH, Soderblom TB, Jensen B, Olsen J.
Uptake of phenylacetic acid by two strains of
Penicillium chrysogenum. Biotechnol Bioeng
1998; 60:310-6.
Espeso EA, Tilburn J, Arst HN Jr, Peñalva MA.
pH regulation is a major determinant in expression of a fungal penicillin biosynthetic
gene. EMBO J 1993; 12:3.947-56.
Feng B, Friedlin E, Marzluf GA. Nuclear DNAbinding proteins which recognize the intergenic control region of penicillin biosynthetic
genes. Curr Genet 1995; 27:351-8.
Fernández-Cañón
JM,
Peñalva
MA.
Overexpression of two penicillin structural
genes in Aspergillus nidulans. Mol Gen Genet
1995; 246:110-8.
Fernández-Cañón JM, Reglero A, MartínezBlanco H, Ferrero MA, Luengo JM. Phenylacetic
acid transport system in Penicillium chrysogenum Wis 54-1.255: molecular specificity of its
induction. Tokio: J Antibiot, 1989a; 42:1.410-5.
Fernández-Cañón JM, Reglero A, MartínezBlanco H, Luengo JM. Uptake of phenylacetic
acid by Penicillium chrysogenum Wis 54-1255:
a critical regulatory point in benzylpenicillin
biosynthesis. Tokio: J Antibiot, 1989b;
42:1.398-409.
Ferrer-Sevillano F, Fernández-Cañón JM. Novel
phacB-encoded cytochrome P450 monooxygenase from Aspergillus nidulans with 3-hydroxyphenylacetate 6-hydroxylase and 3,4-dihydroxyphenylacetate 6-hydroxylase activities. Eukaryotic
Cell 2007; 6; 514-20.
Fierro F, Gutiérrez S, Díez B, Martín JF.
Resolution of four large chromosomes in penicillin-producing filamentous fungi: the penicillin gene cluster is located on chromosome II
(9.6 Mb) in Penicillium notatum and chromosome I (10.4 Mb) in Penicillium chrysogenum.
Mol Gen Genet 1993; 241:573-8.
Fierro F, Barredo JL, Díez B, Gutiérrez S,
Fernández FJ, Martín JF. The penicillin gene
cluster is amplified in tandem repeats linked
by conserved hexanucleotide sequences. Proc
Natl Acad Sci USA 1995; 92:6.200-4.
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
97
Fierro F, García-Estrada C, Castillo NI,
Rodríguez R, Velasco-Conde T, Martín JF.
Transcriptional and bioinformatic analysis of
the 56.8 Kb DNA region amplified in tandem
repeats containing the penicillin gene cluster
in Penicillium chrysogenum. Fungal Genet Biol
2006; 43:618-29.
Fleming A. On the antibacterial action of a
Penicillium with special reference to their use
in the isolation of B. influenzae. Brit J Exp
Pathol 1929; 10:226-36.
Frère JM, Nguyen-Distéche M, Coyette J, Joris
B. Mode of action: interaction with the penicillin binding proteins. En: The Chemistry of
β-lactams. London, United Kingdom: Ed. Page
MI. Blackie Academic and Professional, 1993;
148-97.
Friedrich CG, Demain AL. Uptake and metabolism of alpha-aminoadipic acid by
Penicillium chrysogenum Wis 54-1255. Arch
Microbiol 1978; 119:43-7.
Fu YH, Marzluf GA. Site-directed mutagenesis
of the 'zinc finger' DNA-binding domain of the
nitrogen-regulatory protein NIT2 of
Neurospora. Mol Microbiol 1990; 4:1.847-52.
Gajiwala KS, Chen H, Cornille F, Roques BP, Reith
W, Mach B, Burley SK. Structure of the wingedhelix protein hRFX1 reveals a new mode of DNA
binding. Nature 2000; 403:916-21.
Gancedo JM. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev 1998; 62:334-61.
García J, González R, Gómez D, Schazzochio
C. Cromatin rearrangements in the prnD-prnB
bidirectional promoter: dependence on transcription factors. Ekaryotic Cell 2004; 3:14456.
García-Estrada C, Vaca I, Lamas-Maceiras M,
Martín JF. In vivo transport of the intermediates
of the penicillin biosynthetic pathway in tailored strains of Penicillium chrysogenum. Appl
Microbiol Biotechnol 2007; 76:169-82.
García-Estrada C, Vaca I, Fierro F, Sjollema K,
Veenhuis M, Martín JF. The unprocessed preprotein form IATC103S of the isopenicillin N
acyltransferase is transported inside peroxisomes and regulates its self-processing. Fungal
Genet Biol 2008a; 45:1.043-52.
García-Estrada C, Ullán RV, Velasco-Conde T,
Godio RP, Teijeira F, Vaca I, Feltrer R, Kosalková
K, Mauriz E, Martín JF. Post-translational
enzyme modification by the phosphopantethenyl transferase is required for lysine and penicillin biosynthesis but not for roquefortine or
fatty acid formation in Penicillium chrysogenum. Biochem J 2008b; 415:317-24.
García-Estrada C, Vaca I, Ullán RV, Van den
Berg MA, Bovenberg RA, Martín JF. Molecular
characterization of a fungal gene paralogue
of the penicillin penDE gene of Penicillium
chrysogenum. BMC Microbiology 2009;
9:104.
Giesbrecht P, Franz M, Krüeger D, Labischinski
H, Wecke J. Bacteriolysis of Staphylococci is
only a side-effect of penicillin induced death.
En: 50 years of penicillin application, history
and trends. Eds. Kleinkauf H, Von Döhren H.
PUBLIC Ltd., Czech Republic, 1991; 353-63.
Gledhill L, Greaves PA, Griffin JP. PhenilacetylCoA ligase from Penicillium chrysogenum.
Patent IPN WO97/02349, Smithkline Beecham
UK 1997.
Goodwin GW, Rougraff PM, Davis EJ, Harris
RA. Purification and characterization of
methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase
from rat liver. Identity to malonate-semialdehyde dehydrogenase. J Biol Chem 1989;
264:14.965-71.
Gouka RJ, Van Hartingsveldt W, Bovenberg
RAL, Van den Hondel, CAMJJ, Van Gorcom
RFM. Cloning of a nitrate–nitrite reductase
gene cluster of Penicillium chrysogenum and
use of the niaD gene as a homologous marker.
J Biotechnol 1991; 20:189-200.
Guo S, Evans SA, Wilkes MB, Bhattacharjee JK.
Novel posttranslational activation of the LYS2encoded alpha-aminoadipate reductase for
biosynthesis of lysine and site-directed mutational analysis of conserved amino acid residues in the activation domain of Candida albicans. J Bacteriol 2001; 183:7.120-5.
Gutiérrez S, Marcos AT, Casqueiro J, Kosalková
K, Fernández F, Velasco JY, Martín JF. Transcription of the pcbAB, pcbC and penDE genes
of Penicillium chrysogenum AS-P-78 is repressed by glucose and the repression is not
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
98
reversed by alkaline pHs. Microbiology 1999;
145:317-24.
Haas H, Marzluf GA. NRE, the major nitrogen
regulatory protein of Penicillium chrysogenum,
binds specifically to elements in the intergenic
promoter regions of nitrate assimilation and
penicillin biosynthetic gene clusters. Curr
Genet 1995; 28:177-83.
Haas H, Bauer B, Redl B, Stöffle G, Marzluf
GA. Molecular cloning and analysis of nre, the
major nitrogen regulatory gene of Penicillium
chrysogenum. Curr Genet 1995; 27:150-8.
Harris DM, Westerlaken I, Schipper D, Van der
Krogt ZA, Gombert AK, Sutherland J,
Raamsdonk LM, Van den Berg MA, Bovenberg
RA, Pronk JT, Daran JM. Engineering of
Penicillium chrysogenum for fermentative production of a novel carbamoylated cephem antibiotic precursor. Metab Eng 2009; 11:125-37.
Harvey WR, Nelson N. Physiology of VATPases.
J Exp Biol 1992; 172:1-17.
Henriksen CM. Metabolic characterization of
Penicillium chrysogenum. PhD Thesis. Technical
University of Denmark, Lyngby 1996.
Henriksen CM, Christensen LH, Nielsen J,
Villadsen J. Growth energetics and metabolic
fluxes in continuous cultures of Penicillium
chrysogenum. J Biotechnol 1996; 45:149-64.
Hersbach GJM, Van der Beek CP, Van Dijck
PWM. The penicillins: properties, biosynthesis,
and fermentation. En: Biotechnology of
Industrial Antibiotics. New York: Ed. Vandamme
EJ. Marcel Dekker, 1984; 45-140.
Hettema EH, Van Roermund CW, Distel B, Van
den Berg M, Vilela C, Rodrigues-Pousada C,
Wanders RJ, Tabak HF. The ABC transporter
proteins Pat1 and Pat2 are required for import
of long-chain fatty acids into peroxisomes of
Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 1996;
15:3.813-22.
Hillenga DJ, Versantvoor HJ, Driessen AJ,
Konings WN. Structural and functional properties of plasma membranes from the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. Eur J
Biochem 1994; 224:581-7.
Hillenga DJ, Versantvoort H, Van der Molen S,
Driessen A, Konings WN. Penicillium chryso-
genum takes up the penicillin G precursor
phenylacetic acid by passive diffusion. Appl
Environ Microbiol 1995; 61:2.589-95.
Hoff B, Kamerewerd J, Sigl C, Mitterbauer R,
Zadra I, Kürnsteiner H, Kück U. Two components of a velvet-like complex control hyphal
morphogenesis, conidiophore development,
and penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Eukaryotic Cell 2010; 9:1.236-50.
Hönlinger C, Kubicek CP. Metabolism and
compartmentation of α-aminoadipic acid in
penicillin-producing strains of Penicillium chrysogenum. Biochim Biophys Acta 1989;
993:204-11.
Horak J. Amino acid transport in eukaryotic
microorganisms. Biochim Biophys Acta 1986;
864:223-56.
Horak J, Wolf DH. Catabolite inactivation of
the galactose transporter in the yeast
Saccharomyces cerevisiae: ubiquitination, endocytosis, and degradation in the vacuole. J
Bacteriol 1997; 179:1.541-9.
Hunter DR, Segel IH. Acidic and basic amino acid
transport systems of Penicillium chrysogenum.
Arch Biochem Biophys 1971; 144:168-83.
Ishida C, Aranda C, Valenzuela L, Riego L,
Deluna A, Recillas-Targa F, Filetici P, LópezRevilla R, González A. The UGA3-GLT1 intergenic region constitutes a promoter whose bidirectional nature is determined by chromatin
organization in Saccharomyces cerevisiae. Mol
Microbiol 2006; 259:1.790-806.
Jack DL, Paulsen IT, Saier MH. The aminoacid/
polyamine/organocation (APC) superfamily of
transports specific for aminoacids, polyamines
and organocations. Microbiology 2000;
146:1.797-814.
Jaklitsch WM, Kubicek CP. Homocitrate synthase
from Penicillium chrysogenum. Localization, purification of the cytosolic isoenzyme, and sensitivity to lysine. Biochem J 1990; 269:247-53.
Jaklitsch WM, Hampel W, Rohr M, Kubicek CP,
Gamerith G. α-aminoadipate pool of
Penicillium chrysogenum. Can J Microbiol
1986; 32:473-80.
Jami MS, Barreiro C, García-Estrada C, Martín
JF. Proteome analysis of the penicillin producer
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
99
Penicillium chrysogenum: Characterization of
protein changes during the industrial strain improvement. Mol Cell Proteomics 2010;
9:1.182-98.
broad-substrate-specificity acyl-coenzyme A ligase involved in activation of adipic acid, a sidechain precursor for cephem antibiotics. Fungal
Genet Biol 2010; 47:33-42.
Jørgensen H, Nielsen J, Villadsen J, Møllgaard
H. Metabolic flux distributions in Penicillium
chrysogenum during fed-batch cultivations.
Biotechnol Bioeng 1995; 46:117-31.
Kong KF, Schneper L, Mathee K. Beta-lactam
antibiotics: From antibiosis to resistance and
bacteriology. Acta Pathologica, Microbiologica
et Immunologica Scandinavica 2010; 118:1-36.
Keszenman-Pereyra D, Lawrence S, Twfieg ME,
Price J, Turner G. The npgA/ cfwA gene encodes a putative 4'-phosphopantetheinyl
transferase which is essential for penicillin
biosynthesis in Aspergillus nidulans. Curr
Genet 2003; 43:186-90.
Kosalková K, Marcos AT, Fierro F, HernandoRico V, Gutiérrez S, Martín JF. A novel heptameric sequence (TTAGTAA) is the binding site
for a protein required for high level expression
of pcbAB, the first gene of the penicillin
biosynthesis in Penicillium chrysogenum. J Biol
Chem 2000; 275:2.423-30.
Kiel JA, Van der Klei IJ, Van den Berg MA,
Bovenberg RA, Veenhuis M. Overproduction of
a single protein, Pc-Pex11p, results in 2-fold enhanced penicillin production by Penicillium chrysogenum. Fungal Genet Biol 2005; 42:154-64.
Kiel JA, Van den Berg MA, Fusetti F, Poolman
B, Bovenberg RAL, Veenhuis M, Van der Klei
IJ. Matching the proteome to the genome: the
microbody of penicillinproducing Penicillium
chrysogenum cells. Funct Integr Genomics
2009; 9:167-84.
Kionka C, Kunau WH. Inducible ‚-oxidation
pathway in Neurospora crassa. J Bacteriol
1985; 161:153-7.
Kirschbaum J. Penicillin G potassium. En:
Analytical profiles of drugs substances. Ed.
Florey K. Academic Press, New York. 1986;
15:427-509.
Kleijn RJ, Liu F, Van Winden WA, Van Gulik
WM, Ras C, Heijnen JJ. Cytosolic NADPH metabolism in penicillin-G producing and nonproducing chemostat cultures of Penicillium
chrysogenum. Metab Eng 2007; 9:112-23.
Klionsky DJ, Herman PK, Emr SD. The fungal
vacuole: composition, function, and biogenesis. Microbiol Rev 1990; 54:266-92.
Koetsier MJ, Jekel PA, Van den Berg MA,
Bovenberg RA, Janssen DB. Characterization
of a phenylacetate-CoA ligase from Penicillium
chrysogenum. Biochem J 2009; 417:467-76.
Koetsier MJ, Gombert AK, Fekken S, Bovenberg
RA, Van den Berg MA, Kiel JA, Jekel PA, Janssen
DB, Pronk JT, Van der Klei IJ, Daran JM. The
Penicillium chrysogenum aclA gene encodes a
Kosalková K, Rodríguez-Sáiz M, Barredo JL,
Martín JF. Binding of the PTA1 transcriptional
activator to the divergent promoter region of
the first two genes of the penicillin pathway
in different Penicillium species. Curr Genet
2007; 52:229-37.
Kosalková K, García-Estrada C, Ullán RV, Godio
RP, Feltrer R, Teijeira F, Mauriz E, Martín JF. The
global regulator LaeA controls penicillin
biosynthesis, pigmentation and sporulation,
but not roquefortine C synthesis in Penicillium
chrysogenum. Biochimie 2009; 91:214-25.
Kubicek-Pranz EM, Kubicek CP. Production
and biosynthesis of amino acids by fungi. En:
Handbook of Applied Mycology. Fungal
Biotechnology. Eds. Arora DK, Elander RP,
Mukerji KG. Marcel Dekker, Inc New York.
1991; 4:313-56.
Kubicek CP, Hönlinger CH, Jaklitsch WM,
Affenzeller K, Mach R, Gerngross TU, Ying L.
Regulation of lysine biosynthesis in the fungus
Penicillium chrysogenum. En: Amino Acids:
Chemistry, Biology and Medicine. Eds. Lubec
G, Rozenthal GA. Leiden, The Netherlands:
ESCOM, Science Publishers B.V., 1990.
Kudla B, Caddick MX, Langdon T, MartínezRossi NM, Bennett CF, Sibley S, Davies RW,
Arst HN Jr. The regulatory gene areA mediating nitrogen metabolite repression in
Aspergillus nidulans. Mutations affecting specificity of gene activation alter a loop residue
of a putative zinc finger. EMBO J 1990;
9:1.355-64.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
100
Kurylowicz W, Kurzatkowski W, Kurzatkowski
J. Biosynthesis of benzylpenicillin by Penicillium
chrysogenum and its Golgi apparatus. Arch
Immunol Ther Exp (Warsz) 1987; 35:699-724.
Kurzatkowski W, Palissa H, Van Liempt H, Von
Döhren H, Kleinklauf H, Wolf WP, Kurylowicz
W. Localization of isopenicillin N synthase in
Penicillium chrysogenum PQ-96. Appl Microbiol
Biotechno. 1991; 35:517-20.
Lamas-Maceiras M, Vaca I, Rodríguez E,
Casqueiro J, Martín JF. Amplification and disruption of the phenylacetyl-CoA ligase gene
of Penicillium chrysogenum encoding an arylcapping enzyme that supplies phenylacetic
acid to the isopenicillin Nacyltransferase.
Biochem J 2006; 395:147-55.
Lambalot RH, Gehring AM, Flugel RS, Zuber P,
LaCelle M, Marahiel MA, Reid R, Khosla C,
Walsh CT. A new enzyme superfamily the
phosphopantetheinyl transferases. Chem Biol
1996; 3:923-36.
Lein J. The Panlabs penicillin strain improvement program. En: Overproduction of microbial metabolites. Eds. Vanek Z. y Hostalek Z.
Butterworths, Boston. 1986; 105-39.
Luengo JM, Revilla G, Villanueva JR, Martín JF.
Lysine regulation of penicillin biosynthesis in
low-producing and industrial strains of
Penicillium chrysogenum. J Gen Microbiol
1979; 115:207-11.
Luengo JM, Domínguez JM, Cantoral JM,
Martín JF. Formation of bulges associated with
penicillin production in high producing strains
of Penicillium chrysogenum. Curr Microbiol
1986; 13:203-7.
Márquez-Fernández O, Trigos A, RamosBalderas JL, Viniegra-González G, Deising HB,
Aguirre J. Phosphopantetheinyl transferase
CfwA/NpgA is required for Aspergillus nidulans secondary metabolism and asexual development. Eukaryotic Cell 2007; 6:710-20.
Martín JF. Clusters of genes for the biosynthesis of antibiotics: regulatory genes and overproduction of pharmaceuticals. J Ind Microbiol
1992; 9:73-90.
Martín JF. α-Aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetases in β-lactam producing organisms.
From Abraham’s discoveries to novel concepts
of non-ribosomal peptide synthesis. J Antibiot
2000a; 53:1.008-21.
Lendenfeld T, Ghali D, Wolschek M, KubicekPranz EM, Kubicek CP. Subcellular compartmentation of penicillin biosynthesis in Penicillium
chrysogenum. The amino acid precursors are derived from the vacuole. J Biol Chem 1993;
268:665-71.
Martín JF. Molecular control of expression of penicillin biosynthesis genes in fungi: regulatory
proteins interact with a bidirectional promoter
region. J Bacteriol 2000b; 182:2.355-62.
Liggett RW, Koffler H. Corn steep liquor in microbiology. Bacteriol Rev 1948; 12:297-311.
Martín JF, Liras P. Organization and expression
of genes involved in the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites. Annu
Rev Microbiol 1989a; 43:173-206.
Litzka O, Then Bergh K, Brakhage AA. The
Aspergillus nidulans penicillin-biosynthesis
gene aat (penDE) is controlled by a CCAATcontaining DNA element. Eur J Biochem 1996;
238:675-82.
Litzka O, Papagiannopolous P, Davis MA, Hynes
MJ, Brakhage AA. The penicillin regulator
PENR1 of Aspergillus nidulans is a HAP-like
transcriptional complex. Eur J Biochem 1998;
251:758-67.
López-Nieto MJ, Ramos FR, Luengo JM, Martín
JF. Characterization of the biosynthesis in vivo of
α-aminoadipyl-cysteinylvaline in Penicillium chrysogenum. Appl Microbiol Biotechnol 1985;
22:343-51.
Martín JF, Demain AL. Control of antibiotic
biosynthesis. Microbiol Rev 1980; 44:230-51.
Martín JF, Liras P. Enzymes involved in penicillin, cephalosporin and cephamycin biosynthesis. Adv Biochem Eng/Biotechnol 1989b;
39:153-87.
Martín JF, Ingolia TD, Queener SW. Molecular
genetics of penicillin and cephalosporin antibiotic biosynthesis. In Molecular Industrial
Mycology: Systems and Applications for
Filamentous Fungi. New York (USA): Eds.,
Leongs SA, Berka RM, Marcel Dekker, 1990;
149-96.
Martín JF, Gutiérrez S, Fernández FJ, Velasco J,
Fierro F, Marcos AT, Kosalkova K. Expression of
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
101
genes and processing of enzymes for the
biosynthesis of penicillins and cephalosporins.
Antonie van Leeuwenhoek 1994; 65:227-43.
Moyer AJ, Coghill RD. Penicillin VIII. Production
of penicillin in surface cultures. J Bacteriol
1946a; 51:57-78.
Martín JF, Casqueiro J, Kosalková K, Marcos
AT, Gutiérrez S. Penicillin and cephalosporin
biosynthesis: mechanism of carbon catabolite
regulation of penicillin production. Antonie
Van Leeuwenhoek 1999; 75:21-31.
Moyer AJ, Coghill RD. Penicillin IX. The laboratory scale production of penicillin in submerged
cultures by Penicillium notatum Westling (NRRL
832). J Bacteriol 1946b; 51:79-93.
Martín JF, Ullán RV, García-Estrada C.
Regulation and compartmentalization of betalactam biosynthesis. Microbial Biotechnol
2010; 3:285-99.
Martínez-Blanco H, Reglero A, Ferrero MA,
Fernández-Cañón JM, Luengo JM. Repression
of phenylacetic acid transport system in
Penicillium chrysogenum Wis 54-1255 by free
amino acids and ammonium salts. Tokio: J
Antibiot, 1989; 42:1.416-23.
Marzluf GA. Regulation of sulfur and nitrogen
metabolism in filamentous fungi. Annu Rev
Microbiol 1993; 47:31-55.
Marzluf GA. Genetic regulation of nitrogen
metabolism in the fungi. Microbiol. Mol Biol
Rev 1997; 61:17-32.
Masurekar PS, Demain AL. Insensitivity of homocitrate synthase in extracts of Penicillium
chyrosogenum to feedback inhibition by lysine. Appl Microbiol 1974; 28:265-70.
Meijer WH, Gidijala L, Fekken S, Kiel JA, Van den
Berg MA, Lascaris R, Bovenberg RA, Van der Klei
IJ. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.
Appl Environ Microbiol 2010; 76:5.702-9.
Meister A, Anderson ME. Glutathione. Annu
Rev Biochem 1983; 52:711-60.
Mingot JM, Peñalva MA, Fernández-Cañón
JM. Disruption of phacA, an Aspergillus nidulans gene encoding a novel cytochrome P450
monooxygenase catalyzing phenylacetate
2-hydroxylation, results in penicillin overproduction. J Biol Chem 1990; 274:14.545-50.
Montenegro E, Barredo JL, Gutiérrez S, Díez B,
Álvarez E, Martín JF. Cloning, characterization
of the acyl-CoA: 6 amino penicillanic acid acyltransferase gene of Aspergillus nidulans and
linkage to the isopenicillin N synthase gene.
Mol Gen Genet 1990; 221:322-30.
Moyer AJ, Coghill RD. Penicillin X. The effect
of phenylacetic acid on penicillin production.
J Bacteriol 1947; 53:329-41.
Müller WH, Van der Krift TP, Krouwer AJ,
Wösten HA, Van der Voort LH, Smaal EB,
Verkleij AJ. Localization of the pathway of the
penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. EMBO J 1991; 10:489-95.
Müller WH, Bovenberg RA, Groothuis MH,
Kattevilder F, Smaal EB, Van der Voort LH,
Verkleij AJ. Involvement of microbodies in penicillin biosynthesis. Biochim. Biophys. Acta
1992; 1.116:210-3.
Müller WH, Essers J, Humbel BM, Verkleij AJ.
Enrichment of Penicillium chrysogenum microbodies by isopycnic centrifugation in nycodenz as visualized with immunoelectron
microscopy. Biochim Biophys Acta 1995;
1.245:215-20.
Nasution U, Van Gulik, WM, Ras C, Proell A,
Heijnen JJ. A metabolome study of the steadystate relation between central metabolism,
amino acid biosynthesis and penicillin production in Penicillium chrysogenum. Metab Eng
2008; 10:10-23.
Newbert RW, Barton B, Greaves P. Harper J,
Turner G. Analysis of a commercially improved
Penicillium chrysogenum strain series: involvement of recombinogenic regions in amplification and deletion of the penicillin biosynthesis
gene cluster. J Ind Microbiol Biotechnol 1997;
19:18-27.
Nielsen J. Physiological engineering aspects of
Penicillium chrysogenum. PhD. Polyteknisk
Forlag, Lyngby, Denmark. 1995.
Nijland JG, Ebbendorf B, Woszczynska M, Boer
R, Bovenberg RA, Driessen AJ. Nonlinear
biosynthetic gene cluster dose effect on penicillin production by Penicillium chrysogenum.
Appl Environ Microbiol 2010; 76:7.109-15.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
102
Oshiro BT. The semisynthetic penicillins. Primary
Care Update for OB/GYNS 1999; 6:56-60.
O´Sullivan J, Sykes RB. ‚-Lactam antibiotics. En:
Biotechnology, a comprehensive treatise in 8
volumes, vol 4. Eds. Pape H. y Rehm H-J. VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany.
1986; 247-81.
Papagiannopoulos P, Andrianopoulos A, Sharp
JA, Davis MA, Hynes MJ. The hapC gene of
Aspergillus nidulans is involved in the expression of CCAAT-containing promoters. Mol Gen
Genet 1996; 251:412-21.
Revilla G, López-Nieto MJ, Luengo JM, Martín
JF. Carbon catabolite repression of penicillin
biosynthesis by Penicillium chrysogenum.
Tokio: J Antibiot, 1984; 37:781-9.
Revilla G, Ramos FR, López-Nieto MJ, Álvarez
E, Martín JF. Glucosa represses formation of
delta-(L-alpha-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine and isopenicillin N synthase but not penicillin acyltransferase in Penicillium chrysogenum. J Bacteriol 1986; 168:947-52.
Peñalva MA, Rowlands RT, Turner G. The optimization of penicillin biosynthesis in fungi.
Trends Biotechnol 1998; 16:483-9.
Roach PL, Clifton IJ, Fülöp V. Harlos K, Barton
GJ, Hajdu J, Andersson I, Schofield CJ, Baldwin
JE. Crystal structure of isopenicillin N synthase
is the first from a new structural family of
enzymes. Nature 1995; 375:700-4.
Queener SF, Neuss N. The biosynthesis of βlactam antibiotics. En: The chemistry and biology of β-lactam antibiotics. Eds. Morin R. B.
y Morgan N. London: Academic Press, 1982;
1-81.
Roach PL, Clifton IJ, Hensgens CMH, Shibata
N, Schofield CJ, Hajdu J, Baldwin JE. Structure
of isopenicillin N synthase complexed with
substrate and the mechanism of penicillin formation. Nature 1997; 387:827-30.
Ramón D, Carramolino L, Patiño C, Sánchez F,
Peñalva MA. Cloning and characterization of
the isopenicillin N synthetase gene mediating
the formation of the β-lactam ring in
Aspergillus nidulans. Gene 1987; 57:171-81.
Rodríguez-Saiz M, Barredo JL, Moreno MA,
Fernández-Cañón JM, Peñalva MA, Díez B.
Reduced Function of a PhenylacetateOxidizing Cytochrome P450 Caused strong
Genetic Improvement in Early Phylogeny of
Penicillin-Producing Strains. J Bacteriol 2001;
183:5.465-71.
Ramos FR, López-Nieto MJ, Martín JF.
Isopenicillin N synthetase of Penicillium chrysogenum, an enzyme that converts δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine to isopenicillin
N. Antimicrob Agents Chemother 1985;
27:380-7.
Raper KB. The development of improved penicillin-producing molds. Ann NY Acad Sci
1946; 58:41-56.
Rea PA, Li S, Lu YP, Drozdowicz YM, Martinoia
E. From vacuolar GS-X pumps to multispecific
ABC transporters. Annu Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol 1998; 49:727-60.
Regenberg B, Düring-Olsen L, Kielland-Brandt
MC, Holmberg S. Substrate specificity and
gene expression of the amino-acid permeases
in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet 1999;
36:317-28.
Renno DV. Saunders G, Bull AT, Holt G.
Transcript analysis of penicillin genes from
Penicillium chrysogenum. Curr Genet 1992;
21:49-54.
Rodríguez-Saiz M, Díez B, Barredo JL. Why did
the Fleming strain fail in penicillin industry?
Fungal Genet Biol 2005; 42:464-70.
Ruijter GJ, Visser J. Carbon repression in
Aspergilli. FEMS Microbiol. Lett 1997;
151:103-14.
Schilling B, Lerch K. Cloning, sequencing and
heterologous expression of the monoamine
oxidase gene from Aspergillus niger. Mol Gen
Genet 1995; 247:430-8.
Schwartz R, Lucas MT, Escalante L, Vázquez G,
Sánchez, S. Glutathione formation in Penicillium
chrysogenum: stimulatory effect of ammonium.
J Gen Microbiol 1988; 134:1.117-21.
Shreve DS, Holloway MP, Haggerty JC 3rd,
Sable HZ. The catalytic mechanism of transketolase. Thiamin pyrophosphate-derived transition states for transketolase and pyruvate
dehydrogenase are not identical. J Biol Chem
1983; 258:1.2405-8.
Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos
103
Shwab EK, Bok JW, Tribus M, Galehr J,
Graessle S, Keller NP. Histone deacetylase activity regulates chemical diversity in Aspergillus.
Eukaryotic Cell 2007; 6:1.656-64.
Singh I, Lazo O, Dhaunsi GS, Contreras M.
Transport of fatty acids into human and rat peroxisomes. Differential transport of palmitic
and lignoceric acids and its implication to
Xadrenoleukodystrophy. J Biol Chem 1992;
267:13.306-13.
Skye GE, Segel IH. Independent regulation of
cysteine and cystine transport in Penicillium
chrysogenum. Arch Biochem Biophys 1970;
138:306-18.
Smidák R, Jopcík M, Kralovicová M,
Gajdosíková J, Kormanec J, Timko J, Turna J.
Core promoters of the penicillin biosynthesis
genes and quantitative RT-PCR analysis of
these genes in high and low production strain
of Penicillium chrysogenum. Praha: Folia
Microbiol, 2010; 55:126-32.
Smith DJ, Bull JH, Edwards J, Turner G.
Amplification of the isopenicillin N synthetase
gene in a strain of Penicillium chrysogenum
producing high levels of penicillin. Mol Gen
Genet 1989; 216:492-7.
Smith DJ, Burnham MK. Edwards J, Earl AJ,
Turner G. Cloning and heterologous expression of the penicillin biosynthetic gene cluster
from Penicillum chrysogenum. Biotechnology
(NY). 1990; 8:39-41.
Spröte P, Hynes MJ, Hortschansky P, Shelest E,
Scharf DH, Wolke SM, Brakhage AA.
Identification of the novel penicillin biosynthesis gene aatB of Aspergillus nidulans and its
putative evolutionary relationship to this
fungal secondary metabolism gene cluster.
Mol Microbiol 2008; 70:445-61.
Steidl S, Papagiannopoulos P, Litzka O,
Andrianopoulos A, Davis MA, Brakhage AA,
Hynes MJ. AnCF, the CCAAT binding complex
of Aspergillus nidulans, contains products of the
hapB, hapC, and hapE genes and is required for
activation by the pathway-specific regulatory
gene amdR. Mol Cell Biol 1999; 19:99-106.
Suárez T, Peñalva MA. Characterization of a
Penicillium chrysogenum gene encoding a
PacC transcription factor and its binding sites
in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the
penicillin biosynthetic cluster. Mol Microbiol
1996; 20:529-40.
Sulter GJ, Harder W, Veenhuis M. Structural
and functional aspects of peroxisomal membranes in yeasts. FEMS Microbiol Rev 1993;
11:285-97.
Tabak HF, Elgersma Y, Hettema E, Franse MM,
Voorn-Brouwer T, Distel B. Transport of proteins and metabolites across the impermeable
membrane of peroxisomes. Cold.Spring. Harb.
Symp. Quant Biol 1995; 60:649-55.
Theilgaard HBA, Kristiansen KN, Enriksen CM,
Nielsen J. Purification and characterization of
δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase from Penicillium chrysogenum.
Biochem J 1997; 327:185-91.
Thieringer R, Kunau WH. The β-oxidation
system in catalase-free microbodies of the filamentous fungus Neurospora crassa. Purification
of a multifunctional protein possessing 2-enoylCoA hydratase, L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, and 3-hydroxyacyl-CoA epimerase activities. J Biol Chem 1991a; 266:13.110-7.
Thieringer R, Kunau WH. ‚-oxidation system of
the filamentous fungus Neurospora crassa.
Structural characterization of the trifunctional
protein. J Biol Chem 1991b; 266:13.118- 23.
Tice-Baldwin K, Fink GR, Arndt KT. BAS1 has
a Myb motif and activates HIS4 transcription
only in combination with BAS2. Science 1989;
246:931-5.
Tilburn J, Sarkar S, Widdick DA, Espeso EA,
Orejas M, Mungroo J, Peñalva MA, Arst HN Jr.
The Aspergillus PacC zinc finger transcription
factor mediates regulation of both acid- and
alkaline-expressed genes by ambient pH.
EMBO J 1995; 14:779-90.
Tobin MB, Fleming MD, Skatrud PL, Miller JR.
Molecular characterization of the acylcoenzyme A:isopenicillin N acyltransferase gene
(penDE) from Penicillium chrysogenum and
Aspergillus nidulans and activity of recombinant enzyme in Escherichia coli. J Bacteriol
1990: 172:5.908-14.
Trip H, Evers ME, Konings WN, Driessen AJ.
Cloning and characterization of an aromatic
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
104
amino acid and leucine permease of
Penicillium chrysogenum. Biochim Biophys
Acta 2002; 1.565:73-80.
the identification of metabolic bottlenecks in
the biosynthesis of penicillin-G. Biotechnol
Bioeng 2000; 68:602-18.
Valenciano S, De Lucas JR, Pedregosa A,
Monistrol IF, Laborda F. Induction of β-oxidation enzymes and microbody proliferation in
Aspergillus nidulans. Arch Microbiol 1996;
166:336-41.
Van Liempt H, Von Döhren H, Kleinkauf H.
δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystenyl-Dvaline synthetase from Aspergillus nidulans. The first
enzyme in penicillin biosynthesis is a multifunctional peptide synyhetase. J Biol Chem 1989;
264:3.680-4.
Valenciano S, De Lucas JR, Van der Klei I,
Veenhuis M, Laborda F. Characterization of
Aspergillus nidulans peroxisomes by immunoelectron microscopy. Arch Microbiol 1998;
170:370-6.
Van de Kamp M, Driessen AJ, Konings WN.
Compartmentalization and transport in
β- lactam antibiotic biosynthesis by filamentous fungi. Antonie Van Leeuwenhoek, 1999;
75:41-78.
Van den Berg MA. Functional characterization
of penicillin production strains, Fungal Biol Rev
2010; 24:73-8.
van den Berg, M.A., Westerlaken, I., Leeflang,
C., Kerkman, R. y Bovenberg, R.A. (2007).
Functional characterization of the penicillin
biosynthetic gene cluster of Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255. Fungal. Genet.
Biol. 44; 830-844.
Van den Berg MA, Albang R, Albermann K, et
al. Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum.
Nature Biotechnol 2008; 26:1.161-8.
Van der Lende TR, Van de Kamp M, Berg M,
et al. δ-(L-α- aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine
synthetase, that mediates the first committed
step in penicillin biosynthesis, is a cytosolic
enzyme. Fungal Genet Biol 2002a; 37: 49-55.
Van der Lende TR, Breeuwer P, Abee T,
Konings WN, Driessen AJ. Assessment of the
microbody luminal pH in the filamentous
fungus Penicillium chrysogenum. Biochim
Biophys Acta 2002b; 1.589:104-11.
Van Dijken JP, Veenhuis M. Cytochemical localization of glucosa oxidase in peroxisomes of
Aspergillus niger. Eur J Appl Microbiol 1980;
9:275-83.
Van Gulik WM, De Laat WT, Vinke JL, Heijnen
JJ. Application of metabolic flux analysis for
Van Roermund CW, Elgersma Y, Singh N,
Wanders RJ, Tabak HF. The membrane of peroxisomes in Saccharomyces cerevisiae is impermeable to NAD(H) and acetyl-CoA under
in vivo conditions. EMBO J 1995; 14:3.480- 6.
Vousden W, Turner G. Fungal Genetics
Conference. Fungal Genet Newsletter 2001;
48:160.
Waksman SA. What is an antibiotic or an antibiotic substance? Micology 1947; 39:565-9.
Wang FQ, Liu J, Dai M, Ren ZH, Su CY, He JG.
Molecular cloning and functional identification
of a novel phenylacetyl-CoA ligase gene from
Penicillium chrysogenum. Biochem Biophys
Res Commun 2007; 360:453-8.
Wanner G, Theimer RR. Two types of microbodies in Neurospora crassa. Ann NY Acad Sci
1982; 286:269-84.
Whiteman PA, Abraham EP, Baldwin JE,
Fleming MD, Schofield CJ, Sutherland JD,
Willis AC. Acyl coenzyme A: 6-aminopenicillanic acid acyltransferase from Penicillium
chrysogenum and Aspergillus nidulans. FEBS
Lett 1990; 262:342–4.
Yu ZL, Liu J, Wang FQ, Dai M, Zhao BH, He JG,
Zhang H. Cloning and characterization of a
novel CoA-ligase gene from Penicillium chrysogenum. Praha: Folia Microbiol, 2011;
56:246-52.
Zhang YX, Tang L, Hutchinson CR. Cloning
and characterization of a gene (msdA) encoding methylmalonic acid semialdehyde dehydrogenase from Streptomyces coelicolor. J
Bacteriol 1996; 178:490-5.
Zinser E, Daum G. Isolation and biochemical
characterization of organelles from the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Yeast 1995; 11:493536.
El glioma canino como modelo animal
natural de los gliomas humanos:
estudio de las células madre cancerosas
para la determinación de nuevas dianas
diagnósticas y terapéuticas
Dr. Martí Pumarola i Batlle
La finalidad de este proyecto es confirmar
la utilidad del perro como modelo animal
para el diagnóstico, pronóstico y terapia
de los tumores gliales humanos. La especie canina es un modelo animal natural,
con una incidencia de gliomas espontáneos similar, y en algunos casos incluso
superior, a la de la especie humana.
Además, el perro comparte con la especie
humana su medio natural, está sometido
a los mismos factores ambientales, dietéticos e incluso tóxicos. La profundización
en el estudio de los gliomas caninos, mediante el estudio de las células madre tumorales, su identificación, estudio in vitro
de sus propiedades biológicas (división,
diferenciación, invasividad, etc.), así como
su comportamiento in vivo (inoculación
en ratones inmunodeficientes para reproducir el tumor canino original), permitirá
identificar nuevas dianas diagnósticas, de
pronóstico y terapéuticas que podrán ensayarse en la especie canina y aplicarse,
posteriormente, a la especie humana.
Antecedentes y estado actual
de los conocimientos
Las células madre (stem cells) se definen
como aquellas que tienen la capacidad de
perpetuarse mediante autorrenovación y
de generar células maduras de un tipo
particular de tejido mediante su diferenciación (1). Estas células han sido bien estudiadas y caracterizadas durante el desarrollo embrionario, son las llamadas
células madre embrionarias (embryonic
stem cells); se caracterizan por ser pluripotentes, es decir, pueden diferenciarse
en células de linajes diferentes pertenecientes a las tres hojas embrionarias. En
los últimos años se han identificado células madre en tejidos y órganos de animales adultos. Estas células madre
adultas, en algunos órganos, son las encargadas de la sustitución y de la restauración de la funcionalidad celular. Su potencial de proliferación y diferenciación es
mucho menor que el de las embrionarias
o fetales. Se localizan en nichos, formados
por células especializadas y células madre
adultas. Son multipotentes, dan células
del tejido al que pertenecen, a no ser que
se reduzca su transdiferenciación.
En el tejido nervioso adulto se han identificado zonas neurogénicas, donde residen células madre neurales (neural stem
cells) (2), localizadas en nichos (3), localizadas tanto en el encéfalo como en la
médula espinal. Además, se ha compro-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
106
bado su capacidad multipotencial, generando in vitro tanto en neuronas como en
células gliales (2, 4).
Células madre tumorales
El potencial de proliferación indefinido que
determina la formación y el crecimiento de
un tumor, así como la similitud de los mecanismos que regulan la autorrenovación
de las células madre normales con el de las
células cancerosas, ha llevado a la hipótesis
de que una parte de la población tumoral
podría originarse directamente de células
madre adultas y con ello se ha establecido
la hipótesis de las células madre tumorales
(en adelante las llamaremos CSC, abreviatura de cancer stem cells) (1, 5, 6). Según
esta nueva hipótesis, no todas las células
de un tumor tienen las mismas habilidades
de proliferar y de mantener el crecimiento
del tumor. Únicamente las llamadas CSC
tienen la particularidad de proliferar y de
autorrenovarse (7). Estas células, debido a
su longevidad, son dianas para la acumulación de mutaciones genéticas, las cuales
alterarían la regulación de su ciclo de renovación y podrían, así, cambiar su destino.
Esta hipótesis justificaría el modelo jerárquico descrito en los tumores (8) por el que
únicamente un grupo de células dentro del
tumor tiene una capacidad de proliferación
significativa y la habilidad de generar
nuevos tumores similares al primario. Esta
nueva hipótesis se añade a la llamada hipótesis tumorigénica tradicional por la cual
los tumores se originan a partir de la desdiferenciación de células maduras en respuesta a alteraciones genéticas. En este
caso, todas las células tienen un potencial
tumorigénico parecido que se activa sincrónicamente y con una frecuencia baja
(hipótesis estocástica clásica) (8).
Esta nueva hipótesis se ha visto refrendada por diferentes grupos, especialmente en tumores malignos o de alto
grado (5, 9), aunque también se ha demostrado en tumores benignos (6). Los
tumores nerviosos también cumplen
dicha hipótesis (7, 10-15) especialmente
los gliomas (8, 15).
Para confirmar esta hipótesis en los tumores nerviosos se requieren como mínimo diferentes estudios (15-17):
• Marcadores de superficie celular e intracelulares: su número es muy grande y su
eficacia muchas veces cuestionada (ver
apartado siguiente: Identificación y estudio de las CSC en el tejido nervioso).
• In vitro:
– Ensayo de neuroesferas: se usa para definir la identidad de las células madre
neurales. A partir de células individuales
obtenidas de la disociación de células
del tejido germinal, se exponen a factores de crecimiento en un sistema de
cultivo no adhesivo. Su expansión
clonal forma esferas que contienen
NSC mezcladas con células más diferenciadas de líneas específicas. Su caracterización evalúa la multipotencialidad de las neuroesferas. Su capacidad
de autorrenovación se evalúa aislando
células de la neuroesfera primaria y generando nuevas neuroesferas.
– Disociación de las neuroesferas y generación en medios de cultivo selectivos, de líneas celulares diferenciadas
(neuronales, βIII tubulina+; astrocitarias, GFAP+...).
• In vivo:
– Para evaluar la capacidad tumorigénica totipotente, se inoculan células
El glioma canino como modelo animal natural de los gliomas humanos: estudio de…
107
de las neuroesferas subcutáneamente
en ratones inmunodeficientes, con lo
que se puede seguir fácilmente la generación y desarrollo del tumor y su
caracterización histológica.
– Implantación en encéfalo de ratones
inmunodeficientes de células de las
neuroesferas disociadas. Deberá generarse un tumor fenotípicamente similar al que generó las neuroesferas
al desarrollarse en un microentorno
propio de estas células, confirmando
con ello su capacidad tumorigénica
específica.
Identificación y estudio de las CSC en
el tejido nervioso
A mediados de los años 60 del siglo pasado se empezaron a publicar los primeros estudios que demostraban la existencia de zonas neurogénicas en el
encéfalo adulto: el bulbo olfatorio, el hipocampo y zonas del neocórtex del encéfalo de rata y de gato adultos (18, 19).
Dichos hallazgos se fueron confirmando
en encéfalos de roedores (20, 21) y en
otras especies, como en las aves (22). Sin
embargo, estudios posteriores en mono
adulto rechazaron o limitaron dicha hipótesis (23). A partir de los años 90, gracias
a la utilización de nueva metodología, se
reemprendieron los estudios previos y se
confirmaron los hallazgos de neurogénesis en encéfalo adulto en las diferentes
especies animales descritas (24, 25).
Finalmente, se confirmó dicha hipótesis
en la especie humana, demostrándose
neurogénesis en el gyrus dentatus del hipocampo adulto (26). Con posterioridad,
se han publicado muchos trabajos que
confirman la neurogénesis en el encéfalo
adulto, ampliando el número de zonas
neurogénicas a la zona subventricular, estriado, bulbo olfatorio, córtex piriforme,
amígdala, hipotálamo, substantia nigra,
N. del vago, médula espinal, etc. (2).
Como hemos mencionado en el apartado
anterior, las mejoras introducidas en las técnicas de estudio aplicadas al tejido nervioso
(3H-thymidine, BrdU, retrovirus,14C, etc.)
son las que han permitido demostrar y
confirmar la presencia de células madre activas en el encéfalo adulto (2). Ello ha permitido no solo localizarlas sino determinar
las características de la neurogénesis en el
adulto, evaluando su funcionalidad y los
factores que regulan su mantenimiento, su
proliferación, la elección de su destino, su
migración y orientación, así como su integración en circuitos neuronales preestablecidos mediante su integración sináptica (4).
Una atención especial está mereciendo el
nicho, o microambiente, que rodea a las
células madre y que regula su supervivencia
y proliferación en el encéfalo adulto (3).
Para el estudio e identificación de las células madre en el tejido nervioso adulto,
tanto normal como tumoral, se han
usado diferentes técnicas y marcadores
celulares (5, 8, 0). La nestina, un filamento
intermedio de clase IV, ha sido considerada durante mucho tiempo como una
proteína específica del citoesqueleto de
las células madre y de los neuroblastos,
tanto en el embrión como en el adulto
(27, 28). Sin embargo, se ha visto que no
es tan exclusiva de dicha población celular, ya que se ha demostrado su presencia en células no nerviosas, como endotelios, músculo estriado y cardiaco, piel
y anejos cutáneos, hígado, páncreas,
riñón, adrenal y testículo (27, 29).
Además, cuando el tejido nervioso se altera debido a lesiones traumáticas, exci-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
108
totóxicas o isquémicas, inflamación o epilepsia, se reexpresa en astrocitos activados
(27, 30). Lo mismo ocurre en muchos tumores nerviosos, como neurocitomas y
neuroblastomas, gliomas, en especial glioblastomas, astrocitomas y ependimomas,
meduloblastomas y schwannomas (27), lo
cual indicaría el grado de desdiferenciación de sus células (8). En la actualidad se
considera un marcador de células madre
siempre que se acompaña de otros marcadores que así lo confirmen y se utiliza
en la mayoría de estudios que se están
publicando sobre tumores nerviosos, en
especial, los que estudian tumores de
grado alto o poco diferenciados (31).
Otro marcador ampliamente utilizado es
CD133 (prominina-1), una glicoproteína
transmembrana típica de células madre
neuroepiteliales de ratón y humanas,
aunque no exclusivo de las mismas, ya que
las células madre hematopoyéticas también
lo expresan (7, 8). Su función no es del todo
conocida; se le relaciona con la polarización, migración e interacción entre las células y la matriz extracelular. Se ha visto
cómo células CD133+ aisladas de tumores
nerviosos muestran propiedades de células
madre y pueden iniciar y dirigir la progresión del tumor in vivo (5, 7, 8, 32). Además,
estas células CD133+ poseen resistencia a
drogas y toxinas, activando su capacidad de
reparación del ADN y su resistencia a la
apoptosis, la irradiación y la quimioterapia
(8). También se relacionan dichas células
con la sobreexpresión del receptor de la
quemoquina de superficie celular CXCR4,
el cual regula la dirección de la migración
celular y, con ello, la actividad invasiva tumoral (8). También se han utilizado en tumores nerviosos para identificar el nicho en
el que se encuentran las células madre (12).
Ante la variabilidad de resultados obtenidos se ha recurrido a la combinación de
nestina y CD133 para asegurar una
mayor fiabilidad en la identificación de células madre neurales (5, 8, 32), especialmente para el estudio de tumores nerviosos (13-15).
La activación de vías de señalización que
normalmente regulan las células progenitoras puede tener un papel importante en
la formación de tumores (3, 4, 33); un exceso de dichas vías puede provocar la
transformación fenotípica de dichas células. Así, se ha utilizado la familia de receptores transmembrana Notch –1, 2, 3
y 4–, esenciales para el mantenimiento de
les células madre neurales, promoviendo
su autorrenovación e inhibiendo la diferenciación neuronal o glial (8). En el
mismo sentido se utilizan otros factores
(5, 11, 34), como: BMI-1, esencial para la
autorenovación de les células madre neurales; Sonic Hedgehog, relacionado con
gliomas; las BMP, que regulan la homeostasis en diferentes órganos y tejidos controlando la diferenciación, proliferación y
la apoptosis; PTEN, Hox, Wnt, etc.
Los factores de crecimiento también han
resultado de interés en el estudio de las
células madre neurales y su transformación. PDGF (platelet derived growht
factor) y sus receptores, identificados en
el encéfalo adulto, en neuronas y astrocitos, especialmente en la zona subventricular, muestran activación durante la gliomagénesis, en especial en glioblastomas
(8, 10). EGF (epidermal growth factor) estimula la proliferación y la diferenciación
de las células madre neurales; cuando su
nivel es alto se convierten en células
gliales altamente invasivas típica de los
gliomas; muchos astrocitomas expresan
El glioma canino como modelo animal natural de los gliomas humanos: estudio de…
109
EGF (10). TGF y sus receptores también se
han asociado a la generación de gliomas
(35, 36) en especial de glioblastomas (37).
Está surgiendo una nueva línea de investigación con el análisis de la nucleostemina, un gen presente en las células
madre que codifica para una proteína del
nucléolo celular y que, aparentemente,
tiene un papel crítico para la autorrenovación de estas células (38). Esta proteína,
expresada especialmente en precursores
neuroepiteliales durante la embriogénesis,
desaparece cuando la célula empieza su
diferenciación, volviéndose a expresar en
tumores nerviosos (39).
CSC y tumores nerviosos caninos
Existe una abundante bibliografía que describe la incidencia de tumores espontáneos
en el sistema nervioso central de animales,
siendo el perro la especie animal con
mayor número de referencias (40, 41). Los
tumores intracraneales se presentan con
una incidencia anual superior en la especie
canina que en la humana (14,5 por cada
100.000 perros, comparados con los 4-5
por 100.000 en humanos) (17).
En el perro, el glioblastoma intracraneal
se presenta con mayor incidencia en razas
braquiocefálicas, en particular Bóxer
(30%) y Boston Terrier; no se ha descrito
predilección por sexo y su incidencia aumenta a partir de los 6 años (40). Las localizaciones más frecuentes son cerebro y
diencéfalo. Las técnicas de imagen aplicadas a su diagnóstico, como la tomografía axial computarizada (TAC) y la resonancia magnética nuclear (RMN),
permiten detectar características tumorales similares a las descritas en la especie
humana (17).
El estudio de la hipótesis de las CSC en
tumores de animales domésticos es muy
incipiente. En la literatura solo aparecen
publicados dos trabajos realizados en tumores de piel y mama caninos y felinos
(42, 43), uno en un osteosarcoma canino
(44) y otro en carcinomas hepáticos caninos (45). En estos estudios, sus autores
se limitan a demostrar la presencia de las
CSC mediante ensayo de mamoesferas o
sarcoesferas y a tipificar las poblaciones
celulares diferenciadas a partir de dichos
cultivos primarios.
Hasta el momento, existe un único estudio llevado a cabo a partir de un glioblastoma canino (17) en el que, además
de demostrar la presencia de CSC in vitro,
mediante ensayo de neuroesferas y su diferenciación en células pertenecientes a
distintas poblaciones neurales, reproducen in vivo el tumor canino original inoculándolo, intracerebralmente, en ratones
inmunodeficientes.
CSC, tumores nerviosos humanos y
modelos animales
En la especie humana, los tumores nerviosos constituyen menos del 2% de las
neoplasias malignas, pero son el segundo tumor más frecuente en niños,
después de las leucemias (46). De entre
los tumores intracraneales, un 60% son
de origen neuroepitelial, un 28% meníngeo y un 7,5% derivado de los nervios craneales. La mortalidad en pacientes con tumores encefálicos es muy
alta, dependiendo del tipo y grado del
tumor; los pacientes con tumores de
grado IV, como es el caso del glioblastoma, tienen una supervivencia menor a
los 2 años desde el momento de su diagnóstico. El Glioblastoma es el tumor en-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
110
cefálico más frecuente (un 12-15% de
las neoplasias intracraneales y un 5060% de los tumores astrocíticos) con
una incidencia de dos-cuatro nuevos
casos por cada 100.00 personas/año. La
ratio mortalidad/incidencia de los tumores nerviosos en la especie humana
refleja la efectividad del diagnóstico y de
las medidas terapéuticas (46).
Los modelos animales utilizados hasta el
momento para el estudio de la hipótesis
de la CSC en tumores nerviosos se limitan
a (46, 47):
• Tumores creados mediante métodos que
no se focalizan en un gen específico:
– Desde los años 70 se utilizan inyecciones intravenosas repetidas de compuestos, como la methylnitrosourea
(MNU) y la N-ethyl-N-nitrosourea
(ENU), provocando gliomas en ratas
inmunocompetentes.
– Inyección de células de glioma de rata
en hospedadores singénicos como la
línea C6 de glioma, el modelo Fisher,
la línea CNS-1 y sobre todo, la línea
GL261.
– Inyección de células de glioma humano implantadas en ratones atímicos.
• Tumores creados por una mutación génica dirigida y conocida que también
está presente en tumores humanos,
como, por ejemplo, p53, INK4a/ARF,
PTEN, EGF-R, PDGF, etc.
También se están utilizando ratones en los
que se provoca el tumor nervioso utilizando vectores virales (lentivirus) (48).
Finalmente, se utilizan ratones modificados genéticamente (knockout condicionales, usando promotores como GFAP,
S-100, nestina…), los cuales presentan
una incidencia alta de tumores nerviosos
espontáneos (49).
La fiabilidad de los resultados obtenidos
al extrapolarlos a los tumores nerviosos
de la especie humana se han puesto en
cuestión (47) debido, principalmente, a
las deficiencias inmunológicas existentes
en los modelos murinos descritos: muy
baja expresión de antígenos de superficie
e inmunosupresión local y sistémica asociada.
Las ventajas de utilizar un modelo animal
como es el perro, más cercano a la especie humana, resultan cada vez más evidentes y son defendidas por un mayor
número de grupos de investigadores.
Destacamos entre ellas (50-52):
• Los estudios longitudinales son similares, debido a la vida más larga del
perro respecto del ratón.
• El perro comparte características bioquímicas y fisiológicas con los humanos: la
presentación de la enfermedad y la respuesta clínica del perro son más semejantes a la de la especie humana.
• Más de la mitad de las enfermedades
hereditarias del perro tienen equivalente
en el hombre (cardiomiopatía, distrofia
muscular, cáncer de próstata, etc.) incluso las multifactoriales (diabetes, epilepsia, cáncer, asma).
• Se ha secuenciado el genoma canino, lo
que permite su estudio.
• El perro ha sido fundamental como instrumento para el estudio y desarrollo
del trasplante de médula ósea y de los
protocolos de terapia génica, cardiovascular y ortopédica.
El glioma canino como modelo animal natural de los gliomas humanos: estudio de…
111
• En los trasplantes, la cinética de las células madre en el perro es biológicamente comparable a la humana en relación a necesidades hematopoyéticas y
respuesta a citoquinas.
• Posibilidad de clonación terapéutica de
células caninas.
• Existen líneas celulares embrionarias caninas obtenidas a partir de blastocistos
o de embriones de 13-14 días.
• La reprogramación de células somáticas
caninas hacia un fenotipo pluripotencial
da como resultado células equivalentes
a les células madre.
Estado actual de grupos que
trabajan con materias afines
al proyecto
En Medicina Humana, en los últimos años
han proliferado enormemente los grupos
que se dedican al estudio de las CSC en diferentes tipos de tumores, incluidos los nerviosos. Dentro de este último grupo destacamos los grupos liderados por el Dr. O.
Brüstler (Institute of Reconstructive
Neurobiology, Life and Brain Center,
Universidad de Bonn, Alemania), el Dr.
Schiffer (Departamento de Neurociencia de
la Universidad de Turín, Italia), la Dra.
Cattaneo (Centre for Stem Cell Research,
Universidad de Milán, Italia), el Dr. Pollard
(Wellcome Trust Centre for Stem Cell
Research, Universidad de Cambridge, Reino
Unido), Dr. Frisen (Department of Cell and
Molecular Biology, Medical Nobel Institute,
Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia). En
nuestro país son ya numerosos los grupos
que desarrollan tanto investigación básica
(Facultad de Medicina, Universidad de
Barcelona, IDIBAPS; Insituto de Oncología
del Hospital Vall d’Hebron, Barcelona;
Centro Nacional de Investigaciones
Oncológicas –CNIO–, Madrid; Instituto de
Investigación Biomédica –INIBIC–, A
Coruña, etc.) como aplicada (Instituto de
Biología Molecular y Celular del Cáncer,
CSIC/Universidad de Salamanca; Hospital
Universitario Dr. Negrín, Las Palmas de Gran
Canaria, etc.) aplicada a la Neurooncología.
En Medicina Veterinaria, tal como hemos
citado en la sección anterior, existen aún
pocos grupos que se dediquen al estudio
de las CSC en tumores espontáneos animales. Citamos a continuación, los cuatro
grupos que han publicado resultados al
respecto:
• Department of Medical Sciences,
University of Wisconsin, Madison, WI,
EUA, en colaboración con la Royal (Dick)
School of Veterinary Studies, de la
Universidad de Edimburgo, Reino Unido
(43, 44).
• Facultad de Medicina Veterinaria de la
Universidad de Milán, Italia, en colaboración con el Max Planck Institute,
Muenster, Alemania (42).
• Departments of Veterinary Pathobiology
and Small Animal Medicine and Surgery,
College of Veterinary Medicine, Texas
A&M University, College station, TX,
EUA (17).
• Departamentos de Patología y Cirugía,
Facultad de Medicina Veterinaria y de
Ciencia Animal, Universidad de Sao
Paulo, Brasil (45).
En el Estado español no existe aún ningún
grupo que haya publicado ningún trabajo
en este ámbito en animales de compañía
(perro o gato).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
112
Experiencia de nuestro grupo
en el estudio de las CSC en
tumores gliales caninos
Nuestro Grupo de Neuropatología Veterinaria (GNPV) tiene amplia experiencia en
el estudio y diagnóstico de las enfermedades neuropatológicas en animales tanto
domésticos como salvajes y de laboratorio.
Queremos destacar las siguientes.
• Estudios clínico-patológicos en medicina
de animales de compañía, general y de
especialidad (Neurología, Medicina
Interna, Dermatología, Imagen, Exóticos, Équidos), realizados por convenios
con empresas o dirigidos a proyectos de
investigación integrados y multidisciplinares.
• Enfermedades infecciosas: participación
en programas de vigilancia de enfermedades emergentes en nuestro país:
lengua azul en rumiantes domésticos y
salvajes, enfermedades víricas (flavivirus)
vehiculadas por artrópodos (West Nile
en équidos). Desarrollando técnicas de
evaluación clínica y de diagnóstico histopatológico.
• Neurooncología: colaboración con el Dr.
Kaspar Matiasek, neuropatólogo de la
Facultad de Veterinaria de la
Universidad de Múnich, Alemania, en
su proyecto de estudio epigenético de
tumores caninos en colaboración con el
banco de tejidos (colección de tumores,
estudios de expresión génica, etc.).
• Neurodegeneración: líneas abiertas en
el estudio de las enfermedades neurodegenerativas animales (enfermedad de
neurona motora, mielopatías degenerativas, leucodistrofias) en colaboración
con grupos de investigación de medi-
cina humana. Creación de una nueva
línea de estudio del envejecimiento del
tejido nervioso animal en colaboración
con otros grupos (Parc Zoològic de
Barcelona, Dr. Isidro Ferrer-Bellvitge),
evaluando la utilidad de primates y
perro como modelos para el estudio del
envejecimiento humano.
• Enfermedades priónicas en animales
(Laboratorio PRIOCAT): estudio de la patogenia de la neurodegeneración usando
modelos animales modificados genéticamente complementados con material de
campo (casos autóctonos) en colaboración con el BTAC. Estudios de expresión
génica en ovejas afectadas de scrapie en
colaboración con el grupo que dirige el
Dr. Juan Badiola, de la Universidad de
Zaragoza. Evaluación de nuevas técnicas
que mejoren los niveles de detección de
la proteína priónica para detectar casos
clásicos y atípicos, tanto en ovino como
en bovino. Estudio de priones en especies no sensibles con el grupo del Dr.
Joaquín Castilla, CIC-bioGUNE, Derio,
Bilbao.
• Animales modificados genéticamente:
desde la Unidad de Patología Murina del
CBATEG: servicio de fenotipado de ratones transgénicos (mouse clinic). Estudio
de la patogenia de enfermedades metabólicas (diabetes, Sanfilippo).
• Banc de Teixits Animals de Catalunya
(BTAC): único biobanco con tejidos
animales existente en nuestro país.
Participación en estudios clínicos y
proyectos de investigación de grupos
de investigación externos aportando
muestras del banco. Disminución del
uso de animales para experimentación.
El glioma canino como modelo animal natural de los gliomas humanos: estudio de…
113
Desde hace aproximadamente año y
medio, hemos iniciado en nuestro grupo
el estudio de las células madre del tejido
nervioso, especialmente en el encéfalo de
animales adultos.
El primer paso ha sido poner a punto técnicas que nos permitieran identificar células
madre adultas en encéfalos animales en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Para ello, gracias a nuestra experiencia
en estudios inmunohistoquímicos, pusimos
a punto diferentes marcadores de las
mismas. El primero de ellos fue nestina. A
partir de encéfalos de diferentes especies
animales, perro y ratón, identificamos células nestina+ en diferentes localizaciones
encefálicas: zona subventricular y gyrus
dentatus. A pesar de que los resultados obtenidos coincidían con los publicados por
otros autores, ponían en cuestión la especificidad de este marcador, ya que en algunas zonas resultaban también positivas
células maduras con morfología neuronal
o glial (astrocitos).
Con el anticuerpo contra Olig2, marcador
de precursores gliales de la línea oligodendrocítica, no tuvimos problemas, ya que
obtuvimos un marcaje específico y claro
tanto en perro joven como en viejo.
A continuación pusimos a punto CD133.
En este caso, la puesta a punto la hicimos
en riñón de perro, obteniendo positividad
en los epitelios de los túbulos contorneados. En los tumores gliales, la positividad se correspondía con los vasos y con
células aisladas.
Una vez puestos a punto los nuevos marcadores, aplicaremos todos ellos al estudio de los distintos tumores gliales caninos. Estos resultados preliminares han
sido presentados en dos congresos:
• Como una comunicación oral titulada
“Caracterización y clasificación de neoplasias de células gliales en perro, estudio histológico e inmunohistoquímico“, presentada en la XXI Reunión de
la Sociedad Española de Anatomía
Patológica Veterinaria (SEAPV), celebrada del 24 al 26 de junio de 2009 en
Lugo.
• Parte de una comunicación oral titulada
“Cancer stem cells in canine gliomas: preliminary results in a study of 17 cases”,
presentada en el 22nd Symposium
European Society of Veterinary Neurology-European College of Veterinary
Neurology (ESVN-ECVN), celebrado del
24 al 26 de septiembre de 2009, en
Boloña (Italia).
En paralelo a esta puesta a punto de técnicas de laboratorio, hemos organizado la
recolección de tumores gliales caninos.
Para ello, contamos con la colaboración
imprescindible del SNN-FHCV-UAB, dirigido
por la Dra. Sònia Añor y con su equipo de
residentes. El primer paso ha sido la formación del grupo clínico para la detección de
perros afectados de gliomas intracebrebrales inoperables o intratables; a estos
animales únicamente se les puede recomendar una eutanasia humanitaria. Una
dificultad adicional ha sido conseguir donaciones de cadáveres por parte de los propietarios de dichos perros. Para ello se instaló un póster en la consulta de Neurología
del hospital informando a los propietarios
del proyecto y animándoles a colaborar en
el mismo, donando el cadáver de sus perros una vez eutanasiados.
Inmediatamente después de practicada la
eutanasia se procedió a la necropsia y extracción del encéfalo (post mórtem máximo
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
114
de 30 minutos). Se extrajeron muestras de
tejido tumoral, de tejido nervioso adyacente
al tumor y de tejido nervioso alejado del
tumor (hemisferio contralateral). Las muestras en fresco fueron sumergidas en medio
de cultivo. Se tomaron muestras en congelación para posteriores estudios inmunoquímicos. El resto del encéfalo fue sumergido
en solución de formol tamponado. Una vez
fijado, fue tallado e incluido en parafina de
forma rutinaria.
A partir de las muestras en fresco se procedió al cultivo de células madre cancerosas en flotación. El tejido disociado permitió el crecimiento y expansión de
células madre formando glioesferas mantenidas en un estadio indiferenciado. El
cultivo de células madre en medios de diferenciación permitió la obtención de diversos fenotipos neurales, tanto gliales
(GFAP y Olig2) como neuronales (Tuj1).
A estos tumores se les están aplicando las
técnicas de inmunohistoquímica usando
los marcadores descritos para detectar
CSC, así como otros marcadores convencionales para tipificar las diferentes poblaciones celulares.
Parte de estos últimos resultados han sido
presentados en forma de póster titulado
“Hipótesis de las células madre cancerosas
(cancer stem cells) en tumores gliales caninos: resultados preliminares“, en la XXII
Reunión de la Sociedad Española de
Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV),
celebrada del 16 al 18 de junio de 2010 en
Valencia.
Bibliografía
1. Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman
IL. Stem cells, cancer, and cancer stem cells.
Nature 2001 Nov 1; 414(6.859):105-11.
2. Gould E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nat Rev Neurosci 2007
Jun; 8(6):481-8.
3. Conover JC, Notti RQ. The neural stem
cell niche. Cell Tissue Res 2008 Jan;
331(1):211-24.
4. Duan X, Kang E, Liu CY, Ming GL, Song H.
Development of neural stem cell in the
adult brain. Curr Opin Neurobiol 2008
Feb; 18(1):108-15.
5. Ailles LE, Weissman IL. Cancer stem cells
in solid tumors. Curr Opin Biotechnol
2007 Oct; 18(5):460-6.
6. Xu Q, Yuan X, Tunici P, Liu G, Fan X, Xu M,
et al. Isolation of tumour stem-like cells
from benign tumours. Br J Cancer 2009
Jul 21; 101(2):303-11.
7. Singh SK, Clarke ID, Hide T, Dirks PB. Cancer
stem cells in nervous system tumors.
Oncogene 2004 Sep 20; 23(43):7.267-73.
8. Dell'Albani P. Stem cell markers in gliomas.
Neurochem Res 2008 Dec; 33(12):2.407-15.
9. Hadjipanayis CG, Van Meir EG. Tumor initiating cells in malignant gliomas: biology
and implications for therapy. J Mol Med
2009 Apr; 87(4):363-74.
10. Jackson EL, Álvarez-Buylla A. Characterization of adult neural stem cells and their
relation to brain tumors. Cells Tissues
Organs 2008; 188(1-2):212-24.
11. Yadirgi G, Marino S. Adult neural stem
cells and their role in brain pathology. J
Pathol 2009 Jan; 217(2):242-53.
12. Christensen K, Schroder HD, Kristensen
BW. CD133 identifies perivascular niches
in grade II-IV astrocytomas. J Neurooncol
2008 Nov; 90(2):157-70.
13. Zhang M, Song T, Yang L, Chen R, Wu L,
Yang Z, et al. Nestin and CD133: valuable
stem cell-specific markers for determining
clinical outcome of glioma patients. J Exp
Clin Cancer Res 2008 Dec 24; 27:85.
14. Thon N, Damianoff K, Hegermann J, Grau
S, Krebs B, Schnell O, et al. Presence of pluripotent CD133+ cells correlates with malignancy of gliomas. Mol Cell Neurosci 2010
Jan; 43(1):51-9.
El glioma canino como modelo animal natural de los gliomas humanos: estudio de…
115
15. Das S, Srikanth M, Kessler JA. Cancer stem
cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol
2008 Aug; 4(8):427-35.
al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med 1998 Nov;
4(11):1.313-7.
16. Wan F, Zhang S, Xie R, Gao B, Campos B,
Herold-Mende C, et al. The utility and limitations of neurosphere assay, CD133
immunophenotyping and side population
assay in glioma stem cell research. Brain
Pathol 2010 Sep; 20(5):877-89.
27. Gilyarov AV. Nestin in central nervous
system cells. Neurosci Behav Physiol 2008
Feb; 38(2):165-9.
17. Stoica G, Lungu G, Martini-Stoica H,
Waghela S, Levine J, Smith R 3rd.
Identification of cancer stem cells in dog
glioblastoma. Vet Pathol 2009 May;
46(3):391-406.
18. Altman J, Das GD. Post-natal origin of microneurones in the rat brain. Nature 1965
Aug 28; 207(5.000):953-6.
19. Altman J, Das GD. Autoradiographic and
histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J Comp
Neurol 1965 Jun; 124(3):319-35.
20. Kaplan MS, Bell DH. Mitotic neuroblasts in
the 9-day-old and 11-month-old rodent
hippocampus. J Neurosci 1984 Jun;
4(6):1.429-41.
21. Kaplan MS, Hinds JW. Neurogenesis in the
adult rat: electron microscopic analysis of
light radioautographs. Science 1977 Sep
9; 197 (4.308):1.092-4.
22. Goldman SA, Nottebohm F. Neuronal production, migration, and differentiation in
a vocal control nucleus of the adult female
canary brain. Proc Natl Acad Sci USA 1983
Apr; 80(8):2.390-4.
23. Rakic P. Limits of neurogenesis in primates.
Science 1985 Mar 1; 227(4.690):1.054-6.
24. Gould E, Reeves AJ, Graziano MS, Gross
CG. Neurogenesis in the neocortex of
adult primates. Science 1999 Oct 15; 286
(5.439):548-52.
25. Cameron HA, Woolley CS, McEwen BS,
Gould E. Differentiation of newly born
neurons and glia in the dentate gyrus of
the adult rat. Neuroscience 1993 Sep;
56(2):337-44.
26. Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork-Eriksson T,
Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA, et
28. Ernst C, Christie BR. Nestin-expressing cells
and their relationship to mitotically active
cells in the subventricular zones of the
adult rat. Eur J Neurosci 2005 Dec;
22(12):3.059-66.
29. Wiese C, Rolletschek A, Kania G,
Blyszczuk P, Tarasov KV, Tarasova Y, et al.
Nestin expression –a property of multi-lineage progenitor cells? Cell Mol Life Sci
2004 Oct; 61(19-20):2.510-22.
30. Ernst C, Christie BR. Temporally specific
proliferation events are induced in the hippocampus following acute focal injury. J
Neurosci Res 2006 Feb 15; 83(3):349-61.
31. Schiffer D, Manazza A, Tamagno I.
Nestin expression in neuroepithelial tumors. Neurosci Lett 2006 May 29;
400(1-2):80-5.
32. Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, Squire JA,
Bayani J, Hide T, et al. Identification of
human brain tumour initiating cells.
Nature 2004 Nov 18; 432(7.015):396-401.
33. Seoane J. NO Signals from the Cancer
Stem Cell Niche. Cell Stem Cell 2010 Feb
5; 6(2):97-8.
34. Zheng H, Ying H, Yan H, Kimmelman AC,
Hiller DJ, Chen AJ, et al. p53 and Pten
control neural and glioma stem/progenitor
cell renewal and differentiation. Nature
2008 Oct 23; 455(7.216):1.129-33.
35. Seoane J. TGFbeta and cancer initiating
cells. Cell Cycle 2009 Dec; 8(23):3.787-8.
36. Anido J, Sáez-Borderias A, González-Junca
A, Rodon L, Folch G, Carmona MA, et al.
TGF-beta Receptor Inhibitors Target the
CD44 (high)/Id1(high) Glioma-Initiating Cell
Population in Human Glioblastoma. Cancer
Cell 2010 Dec 14; 18(6):655-68.
37. Penuelas S, Anido J, Prieto-Sánchez RM,
Folch G, Barba I, Cuartas I, et al. TGF-beta
increases glioma-initiating cell self-renewal
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
116
through the induction of LIF in human
glioblastoma. Cancer Cell 2009 Apr 7;
15(4):315-27.
38. Bernardi R, Pandolfi PP. The nucleolus: at
the stem of immortality. Nat Med 2003
Jan; 9(1):24-5.
39. Malakootian M, Mowla SJ, Saberi H, Asadi
MH, Atlasi Y, Shafaroudi AM. Differential
expression of nucleostemin, a stem cell
marker, and its variants in different types
of brain tumors. Mol Carcinog 2010 Sep;
49(9):818-25.
40. Summers BA, Cummings JF, De Lahunta
A. Tumor of the central nervous system.
In: Veterinary Neuropathology, pp. 351395. 1st ed. St. Louis, MO: Mosby; 1995.
41. Stoica G, Kim HT, Hall DG, Coates JR.
Morphology, immunohistochemistry, and
genetic alterations in dog astrocytomas.
Vet Pathol 2004 Jan; 41(1):10-9.
42. Cocola C, Anastasi P, Astigiano S, Piscitelli E,
Pelucchi P, Vilardo L, et al. Isolation of canine
mammary cells with stem cell properties and
tumour-initiating potential. Reprod Domest
Anim 2009 Jul; 44(Suppl. 2):214-7.
43. Penzo C, Ross M, Muirhead R, Else R, Argyle
DJ. Effect of recombinant feline interferonomega alone and in combination with chemotherapeutic agents on putative tumourinitiating cells and daughter cells derived
from canine and feline mammary tumours.
Vet Comp Oncol 2009 Dec; 7(4):222-9.
44. Wilson H, Huelsmeyer M, Chun R, Young
KM, Friedrichs K, Argyle DJ. Isolation and
characterisation of cancer stem cells from
canine osteosarcoma. Vet J 2008 Jan;
175(1):69-75.
45. Cogliati B, Aloia TP, Bosch RV, Alves VA,
Hernández-Blázquez FJ, Dagli ML. Identifi-
cation of hepatic stem/progenitor cells in canine hepatocellular and cholangiocellular
carcinoma. Vet Comp Oncol 2010 Jun;
8(2):112-21.
46. DN Louis, G Reifenberger, DJ Brat, DW
Ellison. Tumours: introduction and neuroepithelial tumours. In: S Love, DN Louis, DW
Ellison, editor. Greenfield's Neuropathology.
8th ed. London: Hodder Arnold, 2008;
1.821-2.000.
47. Sughrue ME, Yang I, Kane AJ, Rutkowski
MJ, Fang S, James CD, et al. Immunological
considerations of modern animal models of
malignant primary brain tumors. J Transl
Med 2009 Oct 8; 7:84.
48. Marumoto T, Tashiro A, FriedmannMorvinski D, Scadeng M, Soda Y, Gage
FH, et al. Development of a novel mouse
glioma model using lentiviral vectors. Nat
Med 2009 Jan; 15(1):110-6.
49. Lindberg N, Kastemar M, Olofsson T, Smits
A, Uhrbom L. Oligodendrocyte progenitor
cells can act as cell of origin for experimental glioma. Oncogene 2009 Jun 11;
28(23):2.266-75.
50. Schneider MR, Wolf E, Braun J, Kolb HJ,
Adler H. Canine embryo-derived stem cells
and models for human diseases. Hum Mol
Genet 2008 Apr 15; 17(R1):R42-7.
51. Vaags AK, Rosic-Kablar S, Gartley CJ,
Zheng YZ, Chesney A, Villagómez DA, et
al. Derivation and characterization of canine embryonic stem cell lines with in vitro
and in vivo differentiation potential. Stem
Cells 2009 Feb; 7(2):329-40.
52. Pang LY, Argyle DJ. Using naturally occurring tumours in dogs and cats to study telomerase and cancer stem cell biology.
Biochim Biophys Acta 2009 Apr;
1.792(4):380-91.
Los retos de la erradicación de la
tuberculosis en el siglo XXI
Dr. Jesús Gonzalo Asensio, Dra. Sofía Samper Blasco,
Dr. José Antonio Aínsa Claver, Dra. Isabel Otal Gil y Dr. Carlos Martín Montañés
En la actualidad, las tres enfermedades infecciosas que causan mayor número de
muertes en el mundo son las llamadas enfermedades de la pobreza, que incluyen
la tuberculosis, el sida y la malaria.
La tuberculosis es una enfermedad tan
antigua como la humanidad. Se han descrito manifestaciones de tuberculosis en
momias egipcias con más de 3.000 años
de antigüedad, así como en momias precolombinas. La tuberculosis causó una
gran mortalidad en las ciudades europeas
durante los siglos XVIII y XIX, siendo en el
siglo XIX la principal causa de mortalidad
de la juventud europea.
Tras el descubrimiento por Robert Koch
del bacilo causante de la tuberculosis y su
descripción pública el 24 de marzo de
1882, las medidas de higiene y prevención se fundamentaron en la detección de
casos y en el aislamiento de los enfermos
que eran tratados en los sanatorios antituberculosos. En los años sucesivos, la
“lucha organizada contra la tuberculosis”
unida a la mejora de las condiciones de
vida permitió disminuir drásticamente el
número de muertos en los países industrializados.
En los años 20, Albert Calmette y Camille
Guérin, tras 13 años de cultivos sucesivos
del bacilo de la tuberculosis en el laboratorio, logran que pierda su virulencia y desarrollan la vacuna denominada BCG (ba-
cilo de Calmette y Guérin). Esta vacuna ha
mostrado su eficacia contra las formas más
graves de tuberculosis, como son las localizaciones meníngea y diseminada. Conjuntamente a la utilización de la vacuna BCG,
en la segunda mitad del siglo XX se descubrieron fármacos eficaces contra esta enfermedad. Administrados de forma conjunta y durante prolongados periodos de
tiempo, constituyen un arsenal terapéutico
eficaz para el tratamiento de la tuberculosis.
Situación actual de la
tuberculosis en el mundo
El conocimiento de la historia natural de
la enfermedad, la mejora de los métodos
de diagnóstico y la existencia de un tratamiento eficaz llevaron a considerar en los
países industrializados que la enfermedad
se encontraba bajo control. Sin embargo,
en los años 90, saltó la alarma en dichos
países industrializados. El número de
casos experimentó un aumento, registrándose un número de enfermos superior al
esperado y se detectaron formas epidémicas de tuberculosis resistentes a los fármacos convencionales en hospitales de
estos países; la tuberculosis se convertía
de nuevo en una enfermedad incurable.
En 1993, la Organización Mundial de la
Salud declaró la tuberculosis como una
emergencia global, estimando que, anualmente, el número de nuevos casos supe-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
118
raría los 10 millones y causaría 2 millones
de muertos.
Desde los años 60, en que se iniciaron los
primeros tratamientos, se han descrito
cepas resistentes a los distintos antituberculosos. Sirva de ejemplo que, en abril de
1991, el 33% de las cepas aisladas en
Nueva York eran resistentes al menos a un
antibiótico. El mal cumplimiento del tratamiento está considerado el principal factor
asociado con la aparición de resistencias.
Actualmente, los países en vías de desarrollo, especialmente África subsahariana,
amplias zonas de Asia y algunas naciones
latinoamericanas, son los que presentan un
mayor número de casos de tuberculosis resistente a los principales antituberculostáticos. También supone un grave problema
en algunos países de la antigua Unión
Soviética, donde se han detectado epidemias de tuberculosis multirresistente, considerándose el control de estas epidemias
una prioridad (OMS, 2004). Con el fin de
describir este problema global, la OMS, en
1994, implementó un programa de vigilancia de resistencias que de manera rutinaria recoge datos y analiza las resistencias
detectadas en los distintos países. Como
dato alarmante, el último informe de
2012, que incluye datos de 80 países y
ocho territorios, recoge el mayor índice de
tasas de multirresistencia desde su inicio
(Zignol, 2012).
La estrategia del bacilo
de la tuberculosis
Comparado con otras bacterias, el bacilo
de la tuberculosis se multiplica muy lentamente (24 horas). Crece dentro de las células del hospedador que infecta; en la tuberculosis humana, su único hábitat es el
ser humano, transmitiéndose entre personas por vía respiratoria. Tras ser infectadas por el bacilo, entre un 5 y un 10%
de las personas infectadas desarrollan la
enfermedad, ya que la susceptibilidad a la
enfermedad es multifactorial. Entre las
múltiples causas que se asocian con desarrollar una tuberculosis se encuentran factores genéticos, pero también factores ambientales que pueden disminuir las
defensas del individuo, como una mala alimentación asociada a la pobreza o enfermedades que afectan al sistema inmunológico, como el sida.
Estudios moleculares recientes muestran
que la estrategia de crecimiento lento del
bacilo de la tuberculosis es muy eficaz y
que, en comparación con otros microbios,
su adaptación al ser humano es relativamente reciente, existiendo una gran similitud entre todos los aislamientos del bacilo de la tuberculosis, que serían
descendientes de un antecesor común
(Mostowy, 2005). La hipótesis es que el
bacilo infectó a los primeros humanos,
aproximadamente hace 15.000 o 20.000
años, cuando el ser humano comenzó a
vivir en sociedad en comunidades agrícolas y ganaderas (Brosch, 2002, 2007).
Epidemiología molecular
de la tuberculosis: siguiendo
el rastro del bacilo
de la tuberculosis
Los estudios moleculares permiten diferenciar una cepa del bacilo de la tuberculosis que ha producido la enfermedad en
un determinado paciente. La posibilidad
de detectar secuencias de ADN repetidas,
en localizaciones y/o número diferente
para cada bacilo, nos permite la diferen-
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
119
ciación de cepas y seguir el rastro del bacilo de la tuberculosis. Estos estudios se
iniciaron con el descubrimiento de una secuencia de inserción denominada IS6110,
específica del bacilo de la tuberculosis. El
número de copias de la secuencia IS6110
es variable y estas se localizan en distintas
posiciones del cromosoma de forma polimórfica en las diferentes cepas. El estudio de esta secuencia, en cada cepa,
permite obtener un patrón similar a un
código de barras.
Nuestros primeros trabajos se dirigieron
al estudio de la estabilidad de este polimorfismo. Se estudiaron las cepas aisladas
de pacientes tuberculosos y cepas aisladas
de los mismos pacientes años más tarde
(Otal, 1991). Confirmar que el patrón era
diferente entre distintos pacientes y que
a su vez permanecía estable en un mismo
paciente nos permitió considerar su potencial utilidad en la detección de futuras
epidemias. Posteriormente, nuestros esfuerzos se dirigieron a conocer el mecanismo biológico de ese polimorfismo, descubriendo que era debido al salto o
transposición de esta secuencia IS6110
(Mendiola, 1992). Comprobada la utilidad
del método, por su estabilidad en el
tiempo y su universalidad entre cepas, al
deberse a un mecanismo de transposición
o salto común a otras bacterias, el método de diferenciación de cepas de bacilos
de la tuberculosis comenzó a ser empleado por diferentes laboratorios de
todo el mundo, pero, al utilizarse diferentes sitios de corte del genoma de bacilo y marcando ese polimorfismo de
forma diferente, no permitía la comparación entre laboratorios. En una reunión
celebrada en los CDC (Centers for Disease
Control) de Atlanta, se planteó la nece-
sidad de estandarizar el método de diferenciación de las cepas por RFLP (polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción), con la secuencia de inserción
IS6110, para su uso universal en la medicina humana. En este consenso participó
activamente la Universidad de Zaragoza
junto con, entre otros, los CDC de
Atlanta, el Instituto Pasteur de París, el
RVIM de Holanda o la UCLA (Van
Embden, 1993). Actualmente, este es el
método universalmente utilizado para la
diferenciación del bacilo de la tuberculosis
y es utilizado sistemáticamente para estudios epidemiológicos. El método publicado en 1993 por Van Embden continúa
siendo el patrón universal de la epidemiología molecular de la tuberculosis.
Después de más de 20 años de uso en estudios de epidemiología molecular del bacilo de la tuberculosis por RFLP-IS6110,
sigue siendo el patrón oro, y decenas de
miles de cepas en todo el mundo han sido
estudiadas de forma estandarizada, permitiendo la comparación de bases de
datos, lo que facilita el estudio del comportamiento del bacilo. Los resultados de
estas técnicas se pueden analizar mediante programas informáticos de análisis
de imágenes y son almacenados en bases
de datos. Cada patrón o código de barras
de las nuevas cepas se compara con las
ya existentes en la base de datos y, si coinciden, se estudia la relación entre los pacientes. La Universidad de Zaragoza sigue
participando en el estudio comparativo internacional de diferentes métodos de tipado, colaborando en la búsqueda de
nuevos métodos que permitan acortar
tiempos o mejorar la técnica (Otal, 1997),
comparándolos con los métodos utilizados en la actualidad (Kremer, 1999).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
120
Actualmente, la técnica RFLP-IS6110 está
siendo reemplazada por métodos más rápidos, basados en la reacción en cadena
de la polimerasa, que necesitan menor
cantidad de bacilos para realizarse, y cuya
lectura se realiza mediante 24 dígitos, llamada MIRU-VNTR (Supply, 2006).
Estas técnicas moleculares nos permiten
identificar una transmisión de tuberculosis
(un individuo sano es contagiado por un
individuo enfermo), una reactivación (una
cepa que infectó previamente y que se
encontraba en fase silente en un individuo) o una reinfección con una cepa
nueva, dependiendo de que los patrones
genéticos de las cepas aisladas de los individuos sean idénticos o no.
Estudios de epidemiología
molecular en la Comunidad
Autónoma de Aragón
Los estudios efectuados entre los años
1993 y 1995 fueron pioneros en nuestro
país (Samper, 1993). Permitieron establecer
las similitudes y diferencias de la transmisión de la tuberculosis con estudios internacionales y posteriormente nacionales
(Iglesias, 1998; Samper, 1998). Para estos
estudios fue fundamental la colaboración
de los Servicios de Microbiología de los dos
grandes hospitales de la provincia de
Zaragoza: el Hospital Clínico Universitario
Lozano Blesa y el Hospital Miguel Servet, así
como la de los otros hospitales de Aragón.
Desde el año 2004, en colaboración y coordinación con la Consejería de Sanidad del
Gobierno de Aragón, se realiza la caracterización molecular sistemática de las cepas
aisladas en Aragón. Este trabajo permite
detectar y estudiar la presencia de los brotes
activos, y posibilita a los microbiólogos des-
cartar contaminaciones de laboratorio y diferenciar, dentro del complejo Mycobacterium tuberculosis, las subespecies que
afectan a humanos: M. tuberculosis, M.
bovis, M. bovis BCG y M. africanum. Estas
investigaciones también permiten a los epidemiólogos realizar estudios poblacionales
e identificar grupos y factores de riesgo, y
a su vez a los sistemas de vigilancia epidemiológica el seguimiento de casos y la detección de brotes para un mejor control de
la enfermedad (Iglesias, 2002). Desde el
punto de vista de la investigación básica,
estos estudios nos permiten reconocer
cepas que puedan tener aumentada su virulencia, posibilitando el estudio de los mecanismos de patogenicidad del bacilo de la
tuberculosis.
Las técnicas de epidemiología molecular
también se han aplicado a los bacilos de la
tuberculosis aislados en animales para su
utilización en medicina veterinaria. Se estudiaron aislamientos de bóvidos y cabras
(Gutiérrez, 1995), siendo posible detectar
en algún caso la transmisión de determinadas cepas a humanos (Gutiérrez, 1997).
Por otra parte, se estudió la localización
de la secuencia de inserción IS6110 en
cepas causantes de tuberculosis tanto en
vacas como en humanos que presentaban
una reactivación de la enfermedad, con la
finalidad de estudiar la posible relación de
dicha secuencia con la capacidad del bacilo para permanecer en estado de latencia en el hombre (Otal, 2008).
Estudios de epidemiología
molecular a nivel nacional e
internacional
Nuestro grupo participa de forma muy activa en estudios de epidemiología de la tu-
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
121
berculosis con otras comunidades autónomas como, entre otras, Galicia, Navarra
(Dorronsoro, 2000), la Comunidad de
Madrid (Cacho, 2005) y la Comunidad
Valenciana (García, 2002). En Gran
Canaria (Pena, 2003), estos estudios han
descrito la posibilidad de reinfección con
nuevas cepas del bacilo, en pacientes con
una tuberculosis previa (Caminero,
2001a), y que la introducción en el año
1993 en la isla de Gran Canaria de una
cepa de un determinado patrón genético,
denominado “Beijing”, produjera ese año
el mayor brote de tuberculosis en la isla.
Estudios de años posteriores demostraron
que, en 4 años, esta cepa pasó a representar el 27% de los casos de tuberculosis
de toda la isla (Caminero, 2001b), indicando la enorme capacidad de transmisión del brote “Beijing”. Posteriores estudios de esta cepa denominada GC1237
nos han permitido la localización de 19
copias de la secuencia de inserción IS6110
en su genoma (Alonso, 2011), lo que a su
vez ha posibilitado diseñar un ensayo para
la rápida detección de esta cepa (MillánLou, 2012). Se han estudiado los factores
que pueden afectar el comportamiento
de este aislado y se ha desarrollado una
prueba rápida de diagnóstico con la finalidad de ser introducida en los laboratorios de origen para detectar rápidamente
los casos, ya que el control de ese brote
específico reduciría de forma considerable
la incidencia de la tuberculosis en la isla
(Alonso, 2011; Millán-Lou, 2011).
Las técnicas de epidemiología molecular
también las hemos aplicado a los bacilos
bovinos de la tuberculosis aislados en animales, en colaboración con la Facultad de
Veterinaria de la Universidad de Zaragoza,
para su utilización en medicina veterinaria,
y a aislados en humanos, en colaboración
con el Instituto Carlos III de Madrid; se estudiaron aislamientos de bóvidos y cabras
(Gutiérrez, 1995), los patrones predominantes entre estos animales. En cuanto a la
situación respecto a los humanos, se detectó en algún caso la transmisión de determinadas cepas a humanos (Gutiérrez,
1997), y que los casos de tuberculosis producidos por M. bovis y M. caprae en
España representan una proporción pequeña respecto al total de casos de tuberculosis, y están ligados a exposición ocupacional y a la procedencia de países
endémicos (Ervalin, 2009).
En colaboración con grupos de veterinaria
nacionales, se estudió la epidemiología de
la tuberculosis en animales de ganadería
y salvajes (Gortazar, 2005). Igualmente,
con grupos de veterinaria latinoamericanos, para el estudio epidemiológico de
tuberculosis en explotaciones ganaderas
argentinas (Zumarraga, 1999b) y en animales salvajes, como los lobos marinos de
las costas argentinas y de la Patagonia
(Zumarraga, 1999a).
Estudio de los mecanismos
de adaptación del bacilo a los
fármacos antituberculosos:
estudio de los mecanismos
de resistencia
Como hemos indicado anteriormente, la
utilización de antibióticos constituye una de
las formas más eficaces de luchar contra las
infecciones bacterianas. El estudio de los
mecanismos por los que una bacteria se
vuelve resistente a los antibióticos ayuda a
prevenir este fenómeno, que representa un
grave problema sanitario. Hasta el presente,
las cepas resistentes a los fármacos que se
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
122
utilizan en el tratamiento de la tuberculosis
que se han estudiado a nivel genético
tienen modificaciones en el sitio diana de
acción del fármaco, lo que les confiere unos
niveles de resistencia significativos desde el
punto de vista clínico. Sin embargo, se han
encontrado bacilos resistentes en los que
las proteínas diana no están alteradas, por
lo que la resistencia está producida por otro
mecanismo diferente. Nos interesamos en
el estudio de los mecanismos por los cuales
el bacilo de la tuberculosis aumenta la capacidad de hacerse más resistente, como
es el aumento de tasas de mutación (Rad,
2003).
Siguiendo la línea de investigación clásica
iniciada por el profesor Gómez-Lus en el
estudio de los mecanismos de resistencia
en bacterias, nos enfocamos en el estudio
de los mecanismos de resistencia aplicado
a las micobacterias. Inicialmente, estudiamos las enzimas modificantes de antibióticos (Aínsa, 1996, 1997) y actualmente
estamos investigando la contribución de
las bombas de eflujo en el fenómeno de la
resistencia a antibióticos en el bacilo de la
tuberculosis, en colaboración con otros laboratorios europeos (Aínsa, 1998; Silva,
1998; De Rossi, 2002). Las bombas de
eflujo actúan como sistemas de expulsión
de determinadas sustancias, entre ellas elementos tóxicos para la bacteria, como los
antibióticos, y por este motivo podrían facilitar la adquisición de mutaciones que
confieren altos niveles de resistencia. El bacilo tiene más de 40 bombas de eflujo de
distintas familias (De Rossi, 2006) y, al igual
que sucede en otras especies bacterianas,
además de la resistencia a fármacos, las
bombas de eflujo están implicadas en otros
procesos metabólicos (Ramón-García,
2009, 2012). En consecuencia, resulta in-
teresante explorar la posibilidad de utilizar
inhibidores de eflujo en la terapia de la tuberculosis (Rodrigues, 2011).
Epidemiología molecular de la
tuberculosis multirresistente
De los fármacos disponibles actualmente
para el tratamiento de la tuberculosis, dos
de ellos, la isoniazida y la rifampicina, son
de enorme importancia. La bacteria que
adquiere resistencia, al menos a estos dos
fármacos, la denominamos tuberculosis
multirresistente. Por la dificultad de su tratamiento, se convierten en las formas más
graves de tuberculosis. Su estudio y control están considerados de enorme importancia desde el punto de vista sanitario,
epidemiológico y de Salud Pública.
Tradicionalmente, en modelos animales se
ha estudiado que los bacilos que se hacen
resistentes a los fármacos son menos virulentos, perdiendo su capacidad de infectar
tanto al ratón como al cobayo. Estos estudios han sido corroborados por nuestros
trabajos de epidemiología molecular, en los
que encontramos que las cepas sensibles a
los fármacos, en general, se transmiten más
que las cepas multirresistentes. Sin embargo, determinadas cepas multirresistentes
se transmiten de forma epidémica. Tras la
ocurrida en los años 90 de Nueva York, se
estudió, en colaboración con hospitales de
Málaga y de Madrid, la primera epidemia
de tuberculosis multirresistente ocurrida en
España (Samper, 1997), con una alta tasa
de reinfección (Rivero, 2001), que, posteriormente, afectó a gran número de comunidades autónomas, incluida la aragonesa.
Una cepa resistente a la mayor parte de los
fármacos conocidos contra la enfermedad
se diseminó entre enfermos con sida pro-
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
123
vocando una elevadísima mortalidad.
Después de este suceso, con la idea de detectar posibles epidemias de tuberculosis
multirresistente, y en colaboración con la
mayoría de los Servicios de Microbiología
de los hospitales del país, nuestra universidad se planteó el estudio sistemático de
las cepas multirresistentes de tuberculosis y
se estableció una red de vigilancia de la tuberculosis multirresistente española, pionera a nivel mundial (Samper, 2000, 2005).
Estudio de la tuberculosis
multirresistente a nivel
nacional
Desde enero de 1998 se realiza de forma
sistemática el estudio genético de cepas del
bacilo de la tuberculosis, multirresistentes
a los fármacos, en coordinación con el
Instituto de Salud Carlos III de Madrid,
donde se informan los casos idénticos que
aparecen entre diferentes comunidades autónomas. Este sistema de alerta de brotes
de tuberculosis multirresistente posibilita la
actuación en caso de epidemias.
La red de vigilancia española de la tuberculosis multirresistente se denomina Grupo
Español de Trabajo sobre TB-MR. Está formada por los laboratorios de micobacterias del Sistema Nacional de Salud, y coordinada por el grupo de Genética de
Micobacterias de la Facultad de Medicina
de la Universidad de Zaragoza (http://genmico.unizar.es/).
Estudio de la tuberculosis
multirresistente a nivel
internacional
Desde enero de 1998 se realiza de forma
sistemática el estudio genético de cepas
del bacilo de la tuberculosis, multirresistentes a los fármacos, en coordinación
con el Instituto de Salud Carlos III de
Madrid, donde se informan los casos
idénticos que aparecen entre diferentes
comunidades autónomas. Con más de 10
años de continuidad, esta red de vigilancia molecular de la tuberculosis multirresistente en España la forman los laboratorios de micobacterias del Sistema
Nacional de Salud, y está coordinada por
el grupo de Genética de Micobacterias de
la Universidad de Zaragoza (http://genmico.unizar.es/) (Gavín, 2011). Este sistema de alerta de brotes de tuberculosis
multirresistente posibilita la detección de
epidemias en nuestro país o en el país de
origen de nuestros inmigrantes (Gavín,
2009).
A nivel europeo, el ECDC apoya el mantenimiento de una base de datos de los
casos de tuberculosis multirresistentes, localizada en Holanda, que contiene los patrones genéticos de la cepas de tuberculosis multirresistente aisladas en los
laboratorios de la Unión Europea, donde
se posibilita la comparación de cada
nuevo caso. El intercambio de datos hace
posible detectar brotes entre diferentes
países (Devaux, 2009).
El trabajo en red nos permitió estudiar el
traspaso de fronteras del bacilo de la tuberculosis. En el caso de un estudio con investigadores latinoamericanos de Argentina,
Brasil, Chile, Colombia, Colombia y
Venezuela, pudimos comprobar que la tuberculosis multirresistente predominante en
nuestros países no se detectaba en el resto
de los países; sin embargo, es importante
mantener esta vigilancia (Ritacco, 2011). En
Europa, el ECDC trabaja en ello desde
2008, y en su nuevo programa para luchar
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
124
contra la enfermedad ve importante la continuidad de los estudios moleculares (PRog).
Desarrollo de herramientas
genéticas para estudiar el
bacilo de la tuberculosis
En los años 70 se desarrolla la Genética y
Biología Molecular, utilizando distintas
bacterias y virus como modelos. Las técnicas moleculares aplicadas al bacilo de la
tuberculosis se desarrollaron con más de
20 años de retraso. Las razones de esta
demora son diversas. El bacilo es difícil de
manipular, debe manipularse en laboratorios de seguridad biológica, por tratarse
de un patógeno que se transmite por vía
respiratoria, y presenta un crecimiento
muy lento. Experimentos que en otras
bacterias no patógenas se realizan en
días, con el bacilo de la tuberculosis se retrasan meses o años. A todo esto, se
sumó el optimismo de los años 70, en
que se pensaba que era posible la erradicación de la tuberculosis, menospreciando
al enemigo, creyendo que no sería necesario estudiar y conocer el bacilo para luchar contra él.
Para manipular directamente el bacilo de
la tuberculosis ha sido necesario desarrollar útiles genéticos en microorganismos
emparentados que nos sirven de modelo.
Para la puesta a punto de estos nuevos
útiles genéticos se eligen las especies no
patógenas.
El bacilo de la tuberculosis pertenece al
género de las “micobacterias”. La investigación genética del género se inicia por
dos grupos a finales de los años 80: uno
en Estados Unidos y otro en Europa. El
grupo americano está dirigido por el profesor Jacobs de la Facultad de Medicina
del “Albert Einstein Institut” de Nueva
York, y al grupo europeo lo dirige la profesora Gicquel del Instituto Pasteur de
París.
Por esta época, distintos miembros del actual Grupo de Genética de Micobacterias
se formaron en el Instituto Pasteur. En este
periodo, se aísla el transposón Tn610, que
fue modificado genéticamente, introduciendo un marcador de resistencia a kanamicina, denominándose al nuevo transposón Tn611 (Martín, 1990). Con este se
demostró, por primera vez, la transposición
en micobacterias. También participamos en
el desarrollo de las técnicas de manipulación genética por introducción de DNA por
electrotransformación (Hermans, 1991) y
desarrollamos vectores que permiten insertar genes de forma estable en las micobacterias (Martín, 1991).
Participamos en la construcción de una
serie de vectores que replican de forma
condicional, como los plásmidos termosensibles para la replicación, para poder
seleccionar gran número de sucesos de
transposición. La replicación del plásmido,
a una temperatura permisiva, permite que
la transposición ocurra en el interior de la
bacteria. Al aumentar la temperatura, la
bacteria pierde el plásmido termosensible,
pudiendo seleccionar los sucesos de transposición ocurridos durante la incubación
a temperaturas permisivas. Estos plásmidos mutantes termosensibles para la replicación en micobacterias fueron obtenidos por mutagénesis química in vitro
con hidroxilamina. Se obtuvo un plásmido
derivado de pAL5000 seleccionando mutantes resistentes a kanamicina a 30 ºC
pero sensibles a 39 ºC (Guilhot, 1992;
Gavigan, 1995), que pueden ser utilizados
para el reemplazamiento génico, por re-
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
125
combinación homóloga en el bacilo de la
tuberculosis (Jackson, 1996).
En 1992 se crea el Grupo de Investigación
en Genética de las Micobacterias en la
Universidad de Zaragoza. El grupo se
plantea contribuir al desarrollo de las herramientas necesarias para poder manipular el bacilo de la tuberculosis y buscar
nuevos elementos genéticos móviles,
“transposones”, como útiles de mutagénesis en micobacterias, que faciliten el estudio de los mecanismos de patogenicidad del bacilo de la tuberculosis. Se
aíslan otros transposones (Guilhot, 1992;
García, 1994) y se desarrolla un sistema
de mutagénesis por transposición de alta
eficacia (Guilhot, 1994; Gavigan, 1998;
Pérez, 1998).
Desde nuestro grupo también contribuimos a la identificación y construcción
de plásmidos en micobacterias que
pueden ser útiles para la manipulación del
bacilo de la tuberculosis. Se aíslan nuevos
plásmidos de cepas clínicas (Gavigan,
1997) y se realizan construcciones de
plásmidos para simplificar la manipulación
en el laboratorio (Aínsa, 1996).
Hoy, el conocimiento generado por decenas de equipos de investigación en tuberculosis, que desde los años 90 se incorporaron al estudio molecular del
bacilo, es enorme, destacando la posibilidad de estudios genómicos a partir del
año 1998, en que el equipo del profesor
Cole publica la primera secuencia del genoma completo de un bacilo de la tuberculosis. El importante esfuerzo invertido
en capital humano y recursos en investigación contra la tuberculosis hace que
hoy dispongamos de las herramientas necesarias para poder manipular los bacilos
y podamos plantearnos metas tan ambiciosas como desactivar el bacilo de la tuberculosis.
El sueño de una nueva vacuna
contra la tuberculosis
La experiencia de la vacuna viva BCG
La vacuna actual contra la tuberculosis,
BCG, es una vacuna viva atenuada, que
confiere protección para los casos graves
de tuberculosis. Su uso es recomendado
por la Organización Mundial de la Salud
en países con alta incidencia de tuberculosis, siendo actualmente la vacuna más
utilizada en todo el mundo. En los casos
de tuberculosis respiratoria, el grado de
protección que confiere es muy variable,
encontrándose entre el 70% en estudios
realizados en Inglaterra y una falta de protección en estudios realizados en la India
y en personas en las que la tuberculosis
se presenta asociada a sida. Desarrollar
vacunas más eficaces que la actual BCG
contra las formas respiratorias y erradicar
la tuberculosis es una prioridad.
La vacuna BCG se obtuvo cultivando sucesivamente más de 200 veces en el laboratorio, con las técnicas rudimentarias
microbiológicas de la época, un bacilo
tuberculoso aislado de vacas, hasta que
disminuyó su patogenicidad para los humanos. Los estudios genéticos actuales
de la vacuna BCG señalan que más de
100 genes se han perdido en la cepa vacunal en diferentes regiones del genoma, sugiriendo que esta extrema atenuación sea causa de la pérdida de su
eficacia. A esto debemos añadir que distintos laboratorios de todo el mundo han
subcultivado esta cepa, lo que ha provo-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
126
cado la aparición de diferencias genéticas e inmunológicas entre las distintas
variantes de BCG.
Los avances en investigación en el campo
de las vacunas, de la inmunología y el desarrollo de la genética de micobacterias,
anteriormente descrito, hacen posible que
nos planteemos la investigación y desarrollo de nuevas vacunas contra la tuberculosis.
Mejorar la eficacia de la actual vacuna
BCG
Dos son las estrategias fundamentales en
la investigación de nuevas vacunas contra
la tuberculosis. Por un lado, mejorar la inmunidad conferida por la actual BCG, y por
otro, la construcción de nuevas vacunas
más eficaces y capaces de reemplazar la actual vacuna BCG (Martín, 2005).
Desde el inicio del Proyecto Europeo
“Tuberculosis Vaccine Development” del
V Programa Marco de la Unión Europea,
se han desarrollado y estudiado más de
100 candidatos a vacuna, basados en proteínas del bacilo (vacunas subunidades), y
más de una veintena de vacunas vivas.
Actualmente, se están ensayando diversos
candidatos en diferentes modelos animales para determinar su grado de atenuación, de inmunidad y de protección,
que permita garantizar su eficacia contra
la tuberculosis en humanos.
Es la primera vez, en más de 80 años,
que nuevos candidatos a vacuna contra
la tuberculosis han pasado a evaluarse
en ensayos clínicos en humanos. Los primeros estudios se han publicado a finales de 2004 por la Universidad de
Oxford. Estos primeros ensayos tratan de
aumentar la inmunidad de BCG, en indi-
viduos previamente vacunados, utilizando virus recombinantes que contienen un antígeno del bacilo de la tuberculosis con la idea de mejorar la
protección de BCG.
Desarrollo de vacunas vivas capaces
de reemplazar a BCG
El desarrollo de una nueva vacuna con
mayor grado de protección, que pueda
sustituir a la actual BCG, es un reto para
la comunidad científica que permitiría,
con un bajo coste, el plantearse erradicar
la tuberculosis a medio plazo y reemplazar
a la actual BCG (Martín, 2005). Nuevos
candidatos vacuna, que hagan posible
erradicar la tuberculosis en áreas endémicas, han de conferir una protección superior a la de BCG en las formas de tuberculosis respiratoria en adultos, teniendo
en cuenta la población coinfectada con
VIH, y que puedan ser producidas a gran
escala y bajo coste. Para este objetivo, las
vacunas vivas se plantean como buenos
candidatos potenciales.
Desarmar al bacilo de la tuberculosis.
Elección de la estrategia
La estrategia elegida por el Grupo de
Genética de Micobacterias de la
Universidad de Zaragoza, en colaboración
con el Instituto Pasteur, ha sido –a partir
del conocimiento del bacilo y del desarrollo de las herramientas genéticas para
su manipulación– partir de una cepa virulenta de tuberculosis y eliminar genes de
forma racional para construir una nueva
vacuna. Una estrategia similar, pero utilizando distintos genes, es la elegida por el
otro grupo pionero en genética de micobacterias, el grupo del “Albert Einstein
Institut” de Nueva York.
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
127
Empezar desde el principio de una
forma racional con la tecnología y conocimiento actual. ¿Qué genes elegir?
Nos planteamos construir una nueva vacuna viva a partir de un bacilo aislado de
un paciente e inactivar genes de virulencia
de forma racional. Esta estrategia es más
laboriosa, implica partir de cero y demostrar, en una primera etapa, la atenuación
del candidato a vacuna construido y, en
segundo lugar, una inmunidad superior a
BCG, con el ambicioso objetivo de reemplazar a la actual BCG.
Nuestra hipótesis de partida tuvo su
origen en nuestros estudios sobre epidemiología molecular de cepas multirresistentes: si solo unas pocas cepas se transmiten más fácilmente que el resto, será
porque estas poseen alguna característica
que las hace aumentar su virulencia. Por
lo tanto, si logramos saber a nivel genético cómo aumentan su virulencia, podremos inactivar ciertos genes para disminuir su virulencia.
Tras las investigaciones de epidemiología
molecular de tuberculosis multirresistentes
en nuestro país, concentramos nuestros
estudios en la cepa causante del mayor
brote (Samper, 1997), y encontramos que
un gen llamado phoP, y anotado como
posible regulador de genes de virulencia
en el genoma de M. tuberculosis descrito
por Cole, estaba altamente expresado en
esta cepa (Soto, 2004), por lo que su inactivación podría disminuir la virulencia del
bacilo de la tuberculosis.
En un aislamiento clínico de tuberculosis
inactivamos únicamente el gen phoP, mediante las técnicas de ingeniería genética
desarrolladas anteriormente (Pérez, 2001).
La inactivación de este único gen conducía
a una enorme atenuación, tanto en el modelo celular como en el modelo ratón
(Pérez, 2001). Estudios posteriores demostraron una mayor atenuación que BCG en
modelo ratón con sistema inmunológico
disminuido (Martín, 2006).
Hoy sabemos que el gen phoP forma parte
de un sistema de dos componentes, que
es el mecanismo usado por las bacterias
para hacer frente a cambios en su alrededor. Como consecuencia de la eliminación del gen phoP, el bacilo de la tuberculosis no puede responder a ciertos cambios
en el medio ambiente –como, por ejemplo,
la infección de un paciente– y, por tanto,
pierde virulencia. Nuestros estudios permitieron desvelar el mecanismo de acción del
gen phoP en el bacilo de la tuberculosis
(Gonzalo-Asensio, 2008a) y aprovechar
este conocimiento para identificar los aproximadamente 80 genes bajo el control del
gen phoP (Gonzalo-Asensio, 2008b). Entre
dichos genes se encuentran algunos implicados en la síntesis de lípidos de virulencia,
la ausencia de estos lípidos en el mutante
phoP contribuye a la gran atenuación de
este nuevo candidato a vacuna (GonzaloAsensio, 2006).
Los ensayos de protección realizados en
colaboración con equipos nacionales e internacionales de Inglaterra, Francia y
México contra la infección por el bacilo
de la tuberculosis han mostrado muy
buenos resultados en modelo ratón, y una
protección superior a BCG en modelo cobayo, con una inmunidad mayor que la
actual vacuna BCG (Martín, 2006).
Recientes ensayos con primates, realizados en el PBRC de Holanda, demuestran que el mutante phoP es capaz de
proteger a estos animales frente a una infección con el bacilo de la tuberculosis.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
128
Ensayos del prototipo de vacuna
hacia el ensayo clínico en humanos
Los buenos resultados en fase preclínica
de este candidato a vacuna, construido
de forma racional por la inactivación de
genes que regulan la virulencia, hacen
del mutante phoP un prometedor candidato a vacuna y apuntan a su futuro ensayo en humanos. Uno de los principales
retos de las vacunas vivas es su absoluta
seguridad para su uso en humanos. Una
vez demostrada su atenuación y protección, en ambos casos mejor que la actual vacuna BCG, estamos trabajando
en una nueva generación de vacuna basada en el mutante phoP, añadiendo
una nueva mutación que aumente su
seguridad.
Los futuros retos de la investigación
en nuevas vacunas contra
la tuberculosis
La vacunación contra la tuberculosis
plantea grandes retos. Un tercio de la población mundial está infectada con el bacilo de la tuberculosis y, recientemente,
los estudios de epidemiología molecular
de la tuberculosis han comprobado que
la reinfección con nuevas cepas es más
frecuente de lo que inicialmente se pensaba, por lo tanto, a diferencia de otras
enfermedades, la propia infección con el
bacilo no genera una respuesta inmune
eficaz ni duradera (Martín, 2005). Las vacunas vivas atenuadas de forma racional
por la inactivación de genes que regulan
la virulencia están siendo unas prometedoras candidatas a vacuna.
El desarrollo de una nueva vacuna con
mayor grado de protección, que pueda
sustituir a la actual BCG, es actualmente
un reto para la comunidad científica, que
permitiría, con un bajo coste, el plantearse erradicar la tuberculosis a medio
plazo.
Otro reto en la vacunación contra la tuberculosis es proteger a la población que
actualmente está vacunada con BCG o infectada con M. tuberculosis (Martín,
2006). Recientes experimentos, utilizando
vacunas de subunidades proteicas en animales previamente vacunados con BCG,
están dando buenos resultados.
Las vacunas vivas derivadas de un mutante phoP en una cepa de tuberculosis
construida de forma racional se encuentran en avanzados ensayos preclínicos.
Con el horizonte de erradicar la tuberculosis, las vacunas vivas atenuadas son
buenas candidatas por su bajo coste de
producción, así como por la enorme experiencia acumulada durante más de 90
años, tanto en el uso de BCG como en su
producción.
Actualmente, el proyecto “vacuna tuberculosis” cuenta con un socio fabricante,
CZ Veterinaria, que tiene una amplia experiencia en la producción de vacunas de
uso en veterinaria, y recientemente ha
constituido una filial para el desarrollo de
vacunas para humanos, BIOFABRI.
Nuestro plan de investigación aplicada es
el desarrollo de una vacuna viva atenuada
contra la TB para su evaluación clínica en
humanos.
Bibliografía recomendada
Aínsa JA, Blokpoel MC, Otal I, Young DB, De
Smet KA, Martin C. Molecular cloning and
characterization of Tap, a putative multidrug
efflux pump present in Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium tuberculosis. J
Bacteriol 1998; 180:5.836-43.
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
129
Aínsa JA, Martín C, Cabeza M, De la Cruz F,
Mendiola MV. Construction of a family of
Mycobacterium/Escherichia coli shuttle vectors
derived from pAL5000 and pACYC184: their
use for cloning an antibiotic-resistance gene
from Mycobacterium fortuitum. Gene 1996;
176:23-6.
Caminero JA, Pena MJ, Campos-Herrero MI,
Rodríguez JC, Afonso O, Martín C, Pavón JM,
Torres MJ, Burgos M, Cabrera P, Small PM,
Enarson DA. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European island with a moderate incidence of disease. Am J Respir Crit Care
Med 2001; 163:717-20.
Aínsa JA, Martín C, Gicquel B, Gomez-Lus R.
Characterization of the chromosomal aminoglycoside 2'-N-acetyltransferase gene from
Mycobacterium fortuitum. Antimicrob Agents
Chemother 1996; 40:2.350-5.
Caminero JA, Pena MJ, Campos-Herrero MI,
Rodríguez JC, García I, Cabrera P, Lafoz C,
Samper S, Takiff H, Afonso O, Pavón JM,
Torres MJ, Van Soolingen D, Enarson DA,
Martín C. Epidemiological evidence of the
spread of a Mycobacterium tuberculosis
strain of the Beijing genotype on Gran
Canaria Island. Am J Respir Crit Care Med
2001; 164:1.165-70.
Aínsa JA, Pérez E, Pelicic V, Berthet FX, Gicquel
B, Martín C. Aminoglycoside 2'-N-acetyltransferase genes are universally present in mycobacteria: characterization of the aac(2')-Ic gene
from Mycobacterium tuberculosis and the
aac(2')-Id gene from Mycobacterium smegmatis. Mol Microbiol 1997; 24:431-41.
Alonso H, Aguilo JI, Samper S, Caminero JA,
Campos-Herrero MI, Gicquel B, Brosch R, Martín
C, Otal I. Deciphering the role of IS6110 in a
highly transmissible Mycobacterium tuberculosis
Beijing strain, GC1237. Tuberculosis (Edinb)
2011; 91:117-26.
Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, Brodin P,
Buchrieser C, Eiglmeier K, Garnier T, Gutiérrez
C, Hewinson G, Kremer K, Parsons LM, Pym AS,
Samper S, Van Soolingen D, Cole ST. A new
evolutionary scenario for the Mycobacterium
tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci USA
2002; 99:3.684-9.
Brosch R, Gordon SV, Garnier T, Eiglmeier K,
Frigui W, Valenti P, Dos Santos S, Duthoy S,
Lacroix C, Garcia-Pelayo C, Inwald JK, Golby
P, Garcia JN, Hewinson RG, Behr MA, Quail
MA, Churcher C, Barrell BG, Parkhill J, Cole ST.
Genome plasticity of BCG and impact on vaccine efficacy. Proc Natl Acad Sci USA 2007 27;
104(13):5.596-601.
Cacho Calvo J, Astray Mochales J, Pérez
Meixeira A, Ramos Martos A, Hernando García
M, Sánchez Concheiro M, Domínguez Pérez
JR, Gómez AB, Samper S, Martín C. Ten-year
population-based molecular epidemiological
study of tuberculosis transmission in the metropolitan area of Madrid, Spain. Int J Tuberc
Lung Dis 2005; 9:1.236-41.
Codina G, Vidal R, Martín-Casabona,
Miravitlles M, Martín C. Multidrug-resistant tuberculosis caused by W-related strains in three
immunocompetent foreign-born patients. Int
J Tuberc Lung Dis 1999; 3:82-4.
De Rossi E, Aínsa JA, Riccardi G. Role of mycobacterial efflux transporters in drug resistance: an unresolved question. FEMS Microbiol
Rev 2006; 30:36-52.
De Rossi E, Arrigo P, Bellinzoni M, Silva PA,
Martín C, Aínsa JA, Guglierame P, Riccardi G.
The multidrug transporters belonging to major
facilitator superfamily in Mycobacterium tuberculosis. Mol Med 2002; 8:714-24.
Devaux I, Kremer K, Heersma H, Van
Soolingen D. Clusters of multidrug-resistant
Mycobacterium tuberculosis cases, Europe.
Emerg Infect Dis 2009; 15:1.052-60.
Dorronsoro I, Martín C, Cabodevilla B, Ojer M,
Ruiz A. Effect of the number of samples studied on the diagnosis of tuberculosis. Enferm
Infecc Microbiol Clin 2000; 18:215-8.
García MJ, Guilhot C, Lathigra R, Menéndez
MC, Domenech P, Moreno C, Gicquel B, Martín
C. Insertion sequence IS1137, a new IS3 family
element from Mycobacterium smegmatis.
Microbiology 1994; 140(Pt. 10):2.821-8.
García MR, Rodríguez JC, Navarro JF, Samper
S, Martín C, Royo G. Molecular epidemiology
of tuberculosis in Elche, Spain: a 7-year study.
J Med Microbiol 2002; 51:273-7.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
130
Gavigan JA, Aínsa JA, Pérez E, Otal I, Martín C.
Isolation by genetic labeling of a new mycobacterial plasmid, pJAZ38, from Mycobacterium
fortuitum. J Bacteriol 1997; 179:4.115-22.
Guilhot C, Gicquel B, Martín C. Temperaturesensitive mutants of the Mycobacterium
plasmid pAL5000. FEMS Microbiol Lett 1992;
77:181-6.
Gavigan JA, Guilhot C, Gicquel B, Martín C.
Use of conjugative and thermosensitive cloning vectors for transposon delivery to
Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol
Lett 1995; 127:35-9.
Guilhot C, Otal I, Van Rompaey I, Martín C,
Gicquel B. Efficient transposition in mycobacteria: construction of Mycobacterium smegmatis insertional mutant libraries. J Bacteriol
1994; 176:535-9.
Gavigan JA, Martín C. Conjugating DNA into
mycobacteria. Methods Mol Biol 1998;
101:119-28.
Gutiérrez M, Samper S, Gavigan JA, García
Marín JF, Martín C. Differentiation by molecular typing of Mycobacterium bovis strains
causing tuberculosis in cattle and goats. J Clin
Microbiol 1995; 33:2.953-6.
Gavín P, Iglesias MJ, Jiménez MS, RodríguezValín E, Ibarz D, Lezcano MA, Revillo MJ, Martín
C, Samper S; on behalf of The Spanish Working
Group on MDR-TB. Long-term molecular surveillance of multidrug-resistant tuberculosis in
Spain. Infect Genet Evol 2011 May 27.
Gonzalo Asensio J, Maia C, Ferrer NL, Barilone
N, Laval F, Soto CY, Winter N, Daffe M,
Gicquel B, Martín C, Jackson M. The virulenceassociated two-component PhoP-PhoR system
controls the biosynthesis of polyketide-derived
lipids in Mycobacterium tuberculosis. J Biol
Chem 2006; 281:1.313-6.
Gonzalo-Asensio J, Soto CY, Arbués A, Sancho
J, Del Carmen Menéndez M, García MJ,
Gicquel B, Martín C. The Mycobacterium tuberculosis phoPR operon is positively autoregulated in the virulent strain H37Rv J Bacteriol
2008; 190(21):7.068-78.
Gonzalo-Asensio J, Mostowy S, HardersWesterveen J, Huygen K, Hernández-Pando R,
Thole J, Behr M, Gicquel B, Martín C. PhoP: a
missing piece in the intricate puzzle of
Mycobacterium tuberculosis virulence. PLoS
One 2008; 3(10):e3496.
Gortazar C, Vicente J, Samper S, Garrido JM,
Fernández-De-Mera IG, Gavin P, Juste RA,
Martín C, Acevedo P, De La Puente M, Hofle U.
Molecular characterization of Mycobacterium
tuberculosis complex isolates from wild ungulates in south-central Spain. Vet Res 2005;
36:43-52.
Guilhot C, Gicquel B, Davies J, Martín C.
Isolation and analysis of IS6120, a new insertion sequence from Mycobacterium smegmatis. Mol Microbiol 1992; 6:107-13.
Gutiérrez M, Samper S, Jiménez MS, Van
Embden JD, Marín JF, Martín C. Identification
by spoligotyping of a caprine genotype in
Mycobacterium bovis strains causing human tuberculosis. J Clin Microbiol 1997; 35:3.328-30.
Hermans J, Martín C, Huijberts GN, Goosen T,
De Bont JA. Transformation of Mycobacterium
aurum and Mycobacterium smegmatis with the
broad host-range gram-negative cosmid vector
pJRD215. Mol Microbiol 1991; 5:1.561-6.
Iglesias MJ. Epidemiología molecular de la tuberculosis en Zaragoza 1993-1995. Tesis
Doctoral Universidad de Zaragoza. 1998.
Iglesias MJ, Rabanaque MJ, Gómez-López LI.
La tuberculosis en la provincia de Zaragoza.
Estimación mediante el método captura recaptura. Revista Clinica Española 2002;
202:249-54.
Jackson M, Berthet FX, Otal I, Rauzier J, Martín
C, Gicquel B, Guilhot C. The Mycobacterium
tuberculosis purine biosynthetic pathway: isolation and characterization of the purC and
purL genes. Microbiology 1996; 142(Pt.
9):2.439-47.
Kremer K, Van Soolingen D, Frothingham R,
Haas WH, Hermans PW, Martín C, Palittapongarnpim P, Plikaytis BB, Riley LW, Yakrus
MA, Musse JM, Van Embden JD. Comparison
of methods based on different molecular epidemiological markers for typing of
Mycobacterium tuberculosis complex strains:
interlaboratory study of discriminatory power
and reproducibility. J Clin Microbiol 1999;
37:2.607-18.
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
131
Martín C. The dream of a vaccine against tuberculosis; new vaccines improving or replacing BCG? Eur Respir J 2005; 26:162-7.
Martín C. 2006. Tuberculosis vaccines: Past,
Present and Future. Current Opinion in
Pulmonary Medicine (in press).
Martín C, Mazodier P, Mediola MV, Gicquel B,
Smokvina T, Thompson CJ, Davies J. Site-specific integration of the Streptomyces plasmid
pSAM2 in Mycobacterium smegmatis. Mol
Microbiol 1991; 5:2.499-502.
Martín C, Timm J, Rauzier J, Gómez-Lus R,
Davies J, Gicquel B. Transposition of an antibiotic resistance element in mycobacteria.
Nature 1990; 345:739-43.
Martín C, Williams A, Hernández-Pando R,
Cardona PJ, Gormley E, Bordat Y, CYS, Clark
SO, Hatch GJ, Aguilar D, Ausina V, Gicquel B.
2006. The live Mycobacterium tuberculosis
phoP mutant strain is more attenuated than
BCG and confers protective immunity against
tuberculosis in mice and guinea pigs. Vaccine
(enviado para su publicación).
Mendiola MV, Martín C, Otal I, Gicquel B.
Analysis of the regions responsible for IS6110
RFLP in a single Mycobacterium tuberculosis
strain. Res Microbiol 1992; 143:767-72.
Millán-Lou, Alonso H, Gavin P, HernándezFebles M, Campos-Herrero MI, Copado R,
Cañas F, Kremer K, Caminero JA, Martín C,
Samper S. Rapid test for identification of a
highly transmissible Mycobacterium tuberculosis Beijing strain of Sub-Saharan origin. J Clin
Microbiol 2012; 50:516-8.
Mostowy S, Inwald J, Gordon S, Martín C,
Warren R, Kremer K, Cousins D, Behr MA.
Revisiting the evolution of Mycobacterium
bovis. J Bacteriol 2005; 187:6.386-95.
Otal I, Martín C, Vincent-Levy-Frebault V,
Thierry D, Gicquel B. Restriction fragment
length polymorphism analysis using IS6110 as
an epidemiological marker in tuberculosis. J
Clin Microbiol 1991; 29:1.252-4.
Otal I, Samper S, Asensio MP, Vitoria MA,
Rubio MC, Gómez-Lus R, Martín C. Use of a
PCR method based on IS6110 polymorphism
for typing Mycobacterium tuberculosis strains
from BACTEC cultures. J Clin Microbiol 1997;
35:273-7.
Otal I, Gómez AB, Kremer K, De Haas P, García
MJ, Martín C, Van Soolingen D. Mapping of
IS6110 insertion sites in Mycobacterium bovis
isolates in relation to adaptation from the
animal to human host. Veterinary
Microbiology 2008; 129:333-41.
Pena MJ, Caminero JA, Campos-Herrero MI,
Rodríguez-Gallego JC, García-Laorden MI,
Cabrera P, Torres MJ, Lafarga B, Rodríguez de
Castro F, Samper S, Canas F, Enarson DA,
Martín C. Epidemiology of tuberculosis on
Gran Canaria: a 4 year population study using
traditional and molecular approaches. Thorax
2003; 58:618-22.
Pérez E, Gavigan JA, Otal I, Guilhot C, Pelicic
V, Giquel B, Martín C. Tn611 transposon mutagenesis in Mycobacterium smegmatis using
a temperature-sensitive delivery system.
Methods Mol Biol 1998; 101:187-98.
Pérez E, Samper S, Bordas Y, Guilhot C,
Gicquel B, Martín C. An essential role for phoP
in Mycobacterium tuberculosis virulence. Mol
Microbiol 41:179-87.
Rad ME, Bifani P, Martín C, Kremer K, Samper
S, Rauzier J, Kreiswirth B, Blázquez J, Jouan M,
Van Soolingen D, Gicquel B. Mutations in putative mutator genes of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family. Emerg
Infect Dis 2003; 9:838-45.
Ramón-García S, Martín C, Thompson CJ,
Aínsa JA. Role of the Mycobacterium tuberculosis P55 efflux pump in intrinsic drug resistance, oxidative stress responses, and growth.
Antimicrob Agents Chemother 2009 Sep;
53(9):3.675-82.
Ramón-García S, Mick V, Dainese E, Martín C,
Thompson CJ, De Rossi E, Manganelli R, Aínsa
JA. 2012. Functional and genetic characterization of the Tap efflux pump in
Mycobacterium bovis BCG. Antimicrob Agents
Chemother (en prensa).
Ritacco V, Iglesias MJ, Ferrazoli L, Monteserin
J, Dalla Costa ER, Cebollada A, Morcillo N,
Robledo J, De Waard JH, Araya P, Aristimuño
L, Díaz R, Gavin P, Imperiale B, Simonsen V,
Zapata EM, Jiménez MS, Rossetti ML, Martín
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
132
C, Barrera L, Samper S. Conspicuous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis
cluster strains do not trespass country borders
in Latin America and Spain. Infect Genet Evol
2011 Jun 21.
Rivero A, Márquez M, Santos J, Pinedo A,
Sánchez MA, Esteve A, Samper S, Martín C.
High rate of tuberculosis reinfection during a
nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by Mycobacterium bovis
strain B. Clin Infect Dis 2001; 32:159-61.
Rodrigues L, Aínsa JA, Amaral L, Viveiros M.
Inhibition of drug efflux in mycobacteria with
phenothiazines and other putative efflux inhibitors. Recent Pat Antiinfect Drug Discov
2011; May; 6(2):118-27.
Rodríguez E, Sánchez LP, Pérez S, Herrera L,
Jiménez MS, Samper S, Iglesias MJ. Human tuberculosis due to Mycobacterium bovis and M.
caprae in Spain, 2004-2007. Int J Tuberc Lung
Dis Dec; 13(12):1.536-41.
Samper S, Iglesias MJ, Rabanaque MJ, Gómez
LI, Lafoz MC, Jiménez MS, Ortega A, Lezcano
MA, Van Soolingen D, Martín C. Systematic
molecular characterization of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis complex isolates from Spain. J Clin Microbiol 2005;
43:1.220-7.
Samper S, Iglesias MJ, Rabanaque MJ, Lezcano
MA, Vitoria LA, Rubio MC, Gómez-Lus R,
Gómez LI, Otal I, Martín C. The molecular epidemiology of tuberculosis in Zaragoza, Spain:
a retrospective epidemiological study in 1993.
Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2:281-7.
Samper S, Iglesias MJ, Tello O. The Spanish
multidrug resistant tuberculosis network. Euro
Surveill 2000; 5:43-5.
Samper S, Martín C, Pinedo A, Rivero A,
Blázquez J, Baquero F, Van Soolingen D, Van
Embden J. Transmission between HIV-infected
patients of multidrug-resistant tuberculosis
caused by Mycobacterium bovis. AIDS 1997;
11:1.237-42.
Samper S, Otal I, Rubio MC, Vitoria MA,
Gómez-Lus R, Martín C. Application of RFLP
to typing strains of Mycobacterium tuberculosis. Enferm Infecc Microbiol Clin 1993;
11:547-51.
Silva PE, Bigi F, De la Paz Santangelo M,
Romano MI, Martín C, Cataldi A, Aínsa JA.
Characterization of P55, a multidrug efflux
pump in Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents
Chemother 2001; 45:800-4.
Soto CY, Menéndez MC, Pérez E, Samper S,
Gómez AB, García MJ, Martín C. IS6110 mediates increased transcription of the phoP virulence gene in a multidrug-resistant clinical
isolate responsible for tuberculosis outbreaks.
J Clin Microbiol 2004; 42:212-9.
Supply P, Allix C, Lesjean S, Cardoso-Oelemann
M, Rüsch-Gerdes S, Willery E, et al. Proposal for
standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number
tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2006; 44(12):4.498-510.
Van Embden JD, Cave MD, Crawford JT, Dale
JW, Eisenach KD, Gicquel B, Hermans P, Martín
C, McAdam R, Shinnick TM, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by
DNA fingerprinting: recommendations for a
standardized methodology. J Clin Microbiol
1993; 31:406-9.
Williams A, Hatch GJ, Clark SO, Gooch KE,
Hatch KA, Hall GA, Huygen K, Ottenhoff TH,
Franken KL, Andersen P, Doherty TM,
Kaufmann SH, Grode L, Seiler P, Martín C,
Gicquel B, Cole ST, Brodin P, Pym AS,
Dalemans W, Cohen J, Lobet Y, Goonetilleke
N, McShane H, Hill A, Parish T, Smith D, Stoker
NG, Lowrie DB, Kallenius G, Svenson S,
Pawlowski A, Blake K, Marsh PD. Evaluation
of vaccines in the EU TB Vaccine Cluster using
a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb) 2005; 85:29-38.
Zignol M, Van Gemert W, Falzon D, Sismanidis
C, Glaziou P, Floyd K, Raviglione M. Surveillance
of anti-tuberculosis drug resistance in the world:
an updated analysis, 2007-2010. Bull World
Health Organ 2012; 90:111-9.
Zumarraga MJ, Bernardelli A, Bastida R, Quse
V, Loureiro J, Cataldi A, Bigi F, Alito A, Castro
Ramos M, Samper S, Otal I, Martín C, Romano
MI. Molecular characterization of mycobacteria isolated from seals. Microbiology 1999;
145(Pt. 9):2.519-26.
Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI
133
Zumarraga MJ, Martín C, Samper S, Alito A,
Latini O, Bigi F, Roxo E, Cicuta ME, Errico F,
Ramos MC, Cataldi A, Van Soolingen D,
Romano MI. Usefulness of spoligotyping in
molecular epidemiology of Mycobacterium
bovis-related infections in South America. J
Clin Microbiol 1999; 37:296-303.
http://www.who.int/tb/publications/mdr_surveillance/en/index.html.
Direcciones con información
de interés
Grupo de Genética de Micobacterias.
Universidad de Zaragoza: http://genmico.
unizar.es/.
World Health Organization (2010) Multidrug
and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB):
2010 global report on surveillance and response.
Geneva, Switzerland. WHO/HTM/TB/2010.3:
World Health Organization (2011) Global
Tuberculosis Control: WHO Report 2011.
Geneva, Switzerland. WHO/HTM/TB/2011.16:
http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/index.html.
CZ Veterinaria: www.czveterinaria.com/.
BIOFABRI: http://biofabri.com/.
Las enfermedades priónicas, un antes y un
después para la seguridad de los alimentos
Dra. Marta Monzón Garcés, Dra. Cristina Acín Tresaco, Dra. Rosa Bolea Bailo,
Dra. Eva Monleón Moscardó, Dra. M.ª Antonia Vargas Vargas, Dr. Bernardino
Moreno Burgos, M.ª Belén Marín González, Rodrigo S. Hernández Aco,
J. Luis Pitarch Moré, Carlos Alfonso Hedman Altamirano,
William Jirón Toruño, Hicham Filali, Dra. Rocío Sarasa Orcastegui,
Dra. M.ª Carmen Garza García y Dr. Juan J. Badiola Díez
La aparición de la encefalopatía espongiforme bovina en el Reino Unido, y con posterioridad en el resto de países de la Unión
Europea, desencadenó la crisis alimentaria
más importante que se ha producido en
Europa en las últimas décadas. El impacto
social, mediático, político, sanitario, ganadero y en las industrias derivadas ha sido
enorme. La desconfianza de los consumidores europeos hacia los productos bovinos
y en general hacia la cadena alimentaria no
ha tenido parangón, y las consecuencias
económicas han sido de una gran dimensión, aunque todavía no se han evaluado
en su totalidad.
La lucha contra esta enfermedad ha sido
especialmente complicada, dadas las dificultades inherentes a las características singulares y poco conocidas del agente causal
y a las particularidades de sus mecanismos
patogénicos y vías de transmisión y de los
métodos de diagnóstico. No obstante, los
avances científicos experimentados sobre
esta enfermedad y las relacionadas con ella
en estas dos últimas décadas, y la instauración por la Comisión Europea de programas
de vigilancia y control bien diseñados y ejecutados, ha posibilitado minimizar el impacto sobre la salud pública europea y reducir de manera muy ostensible la
incidencia y prevalencia de la enfermedad
en todo el territorio de la Unión Europea.
Una herencia adicional y muy positiva de la
crisis alimentaria provocada por la encefalopatía espongiforme bovina ha sido una
mejoría muy sustancial del sistema de control de los alimentos, que ha supuesto la
asunción de una mayor responsabilidad por
los operadores de la cadena alimentaria,
bajo el principio de garantizar la seguridad
de los alimentos “desde el campo a la
mesa”, lo que ha sido percibido como algo
muy positivo por los consumidores europeos y ha situado a la UE como uno de los
lugares con mejores estándares de seguridad alimentaria del mundo.
La proteína prión PrPsc es la responsable
de un grupo de enfermedades neurodegenerativas letales, conocidas como enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), que afectan no
solamente a humanos sino también a diferentes especies de animales, tanto domésticos como salvajes (1-3), que presentan una serie de hechos comunes,
aunque no únicos, entre los que destacan:
hipertrofia e hiperplasia de astrocitos, formación de vacuolas en las células del sistema nervioso, pérdida de neuronas y acúmulo de la proteína PrPsc (PrP 27-30).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
136
Tabla 1. Especies animales afectadas y etiopatogenia.
Enfermedad
EEB
Scrapie
CWD
ETV
EEF
Especie
Bovino
Ovino y caprino
Cérvidos
Visones
Felinos
Etiopatogenia
Infección
Infección
Infección
Desconocida
Infección
EEB: encefalopatía espongiforme bovina; CWD: caquexia crónica del ciervo;
ETV: encefalopatía transmisible del visón; EEF: encefalopatía espongiforme felina.
Estas enfermedades de origen animal se
propagan generalmente por infección,
asumiendo como causa probable la ingesta de alimento contaminado. Hay
que destacar que, aunque genéricamente se las clasifique como “infecciones”, no son realmente infecciones en
el concepto clásico, ya que el agente in-
fectante no se reproduce a sí mismo en
la célula huésped, como hacen los virus,
sino que induce a una proteína para que
cambie de conformación. Así, ambas
proteínas, aunque muy parecidas en su
secuencia, no son la misma molécula, ya
que la proteína infectante es de otro
animal.
Tabla 2. Enfermedades humanas y etiopatogenia.
Enfermedades
Etiopatogenia
Kuru.
Infección. Canibalismo ritualista.
Creutzfeldt-Jakob iatrogénico (i-ECJ).
Infección por contaminación priones
(hormona crecimiento).
Variante de Creutzfeldt-Jakob (v-ECJ).
Infección por priones ¿bovinos?
Creutzfeldt-Jakob familiar (f-ECJ).
Hereditaria.
Creutzfeldt-Jakob esporádico (s-ECJ).
Mutación somática o ¿conversión PrPc en PrPsc?
Gerstman-Sträussler-Sheinker (GSS).
Hereditaria.
Insomnio familiar fatal (FFI).
Hereditaria.
Insomnio esporádico fatal (FSI).
Mutación somática o ¿conversión PrPc en PrPsc?
Respecto a las EET humanas, la etiología
es más variada, ya que pueden ser infecciosas, hereditarias y esporádicas. Las infecciosas, no solo son ritualistas como el
kuru (los nativos de la tribu Fore de las tierras altas de Nueva Guinea se comían, por
costumbres rituales, el cerebro de sus difuntos), sino que un porcentaje importante, dentro de la rareza de este tipo de
patologías, puede ser de origen iatrogénico (tratamiento con hormonas de crecimiento, trasplante de médula, otro tipo
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
137
de operaciones quirúrgicas cuando el material no ha sido esterilizado adecuadamente para eliminar el prión) o por ingesta de alimento contaminado con
proteína prión de origen animal. Las hereditarias conllevan modificaciones en el
gen de la proteína y pueden ser inserciones y mutaciones.
El scrapie es la enfermedad prototipo de
las EET y la que se conoce desde hace más
tiempo. La primera descripción de esta
enfermedad data del año 1732.
El agente causal
Todas las EET están originadas por un
agente transmisible de propiedades extraordinarias, tales como i) largos tiempos de
incubación (meses, años e incluso décadas), ii) resistencia a altas temperaturas,
iii) resistencia al tratamiento con formaldehído, iv) resistencia a la radiación ultravioleta, y v) resistencia a las radiaciones ionizantes. Todas estas propiedades son
incompatibles con la presencia de ácidos
nucleicos, lo cual hizo sospechar que el
agente causante de estas enfermedades
transmisibles carecía de material genético.
Ello dio lugar a la especulación sobre tal
origen molecular, y así se propusieron inicialmente varias hipótesis sobre su origen
molecular, entre las cuales se incluyen estar
formados por un “polisacárido replicante”
(4), un ácido nucleico y proteína (5) o solamente por proteínas (1), o bien ser un
virus lento. De todas las hipótesis planteadas sobre el origen de la enfermedad, la
única aceptada actualmente es la propuesta por Prusiner en 1982 (“solamente
es una proteína”), que cuenta con gran número de evidencias experimentales,
aunque todavía no se ha podido cristalizar,
lo que da pie a que algunos autores argumenten que además de la proteína existe
algo más; así, Aiken et al. (6) y Manuelidis
(7), entre otros, han mantenido durante
largos años que la proteína envuelve un
fragmento del DNA mitocondrial.
La hipótesis predominante basada en que
está constituido “solamente por una proteína” fue inicialmente propuesta por
Griffith en una publicación en Nature en el
año 1967 (8). Pero no fue hasta 1982
cuando Stanley B. Prusiner actualizó y
enunció de forma detallada esta teoría, provocando con ello un debate en la comunidad científica al afirmar que el agente
infeccioso responsable de ciertas enfermedades degenerativas del sistema
nervioso central en animales y más raramente en el hombre era simplemente una
proteína a la cual le dio el nombre de prión
(Proteinaceous infectious particles), contraviniendo con ello una creencia, hasta entonces admitida por la comunidad científica, de que todo agente responsable de
enfermedades transmisibles necesita material genético (DNA o RNA), imprescindible
para que la enfermedad prevalezca en el
huésped. La conversión de PrPc (proteína
celular normal) en PrPsc (isoforma anormal
causante de la enfermedad) implica un
cambio en la conformación de la proteína:
el contenido en α-hélice disminuye mientras que aumenta el contenido en hoja plegada β, pero ambas proteínas tienen la
misma secuencia de aminoácidos. Existen
abundantes apoyos experimentales para
asegurar que la proteína celular de membrana (PrPc) y la proteína prión patológica
(PrPsc) tienen la misma estructura primaria
(secuencia de aminoácidos; Prusiner, 1990).
Por lo tanto, se acepta que esta estructura
primaria de PrPc puede adoptar dos dife-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
138
rentes conformaciones que explican la existencia de PrPc y PrPsc. Cuando las dos estructuras secundarias se comparan por técnicas espectroscópicas, FTIR (fourier
transformer infrared), RMN (resonancia
magnética nuclear) (9, 10), muestran que
la proteína celular tiene un 40% de estructura en α-hélice y apenas un 3% de hoja
plegada en β, mientras que la isoforma patológica tiene un 30% de α-hélice y un
40% de hoja plegada en β.
Estudios comparativos de ambas proteínas con marcadores metabólicos demuestran que el cambio de conformación
es un proceso postraduccional, que conlleva un cambio drástico en las propiedades de la proteína (Pan et al., 1993).
Así, mientras que la proteína normal celular es soluble en detergentes suaves no
desnaturalizantes y se digiere fácilmente
con proteasas (proteinasa K), la isoforma
patológica es resistente a los detergentes
y solo es parcialmente digerida por proteasas, produciendo la isoforma conocida
como PrPsc 27-30, llamada así debido a
que deriva de la PrPsc y que su tamaño es
de 27-30 kDa (2, 3).
El gen que codifica a la proteína celular
PrPc se expresa de forma constitutiva en
tejidos neuronales y no neuronales de los
animales adultos, pero se encuentra bajo
un control muy riguroso durante el desarrollo embrionario (11-13). Los niveles
más altos de mRNA y PrPc se localizan en
el tejido neuronal, especialmente en el hipocampo, y más específicamente en las
sinapsis, mientras que existen niveles sensiblemente más bajos en otros tejidos,
como son corazón, músculo esquelético,
y no se encuentran en el páncreas e hígado. El hecho es que los genes de la proteína PrP de humanos y ratones están localizados en los cromosomas homólogos
20 y 2, respectivamente, que se haya
identificado en más de 15 especies de
mamíferos y que su secuencia genética
está altamente conservada, con una homología del 90%. En casi todos ellos, el
gen está compuesto por dos exones, uno
de los cuales no se traduce, y se encuentran separados por un intrón de aproximadamente 10 kb. Solamente tiene un
marco de lectura (ORF), que en humanos
(14), hámster (15), ratón (16), rata (17) y
oveja (18) han sido secuenciados. La proteína que codifica tiene aproximadamente
250 aminoácidos y está localizado a 10
nucleótidos del extremo 3´ del aceptor de
splicing (corte y empalme) del exón 2. En
ratones, ovejas y ratas, el gen que codifica la PrP tiene tres exones siendo el exón
3 muy semejante al exón 2 de hámster
(19). El promotor contiene regiones ricas
en GC y carece de caja TATA, por lo que
la región rica en GC funciona como un
posible sitio de unión del factor de transcripción SP1 (20).
Ante la incertidumbre causada por la dualidad conformacional de la proteína prión
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
139
se han tratado de buscar, tanto en los
genes humanos como en los ovinos, otros
motivos genéticos que expliquen esta
doble conformación, pero hasta la fecha
no se han encontrado ni posibles exones,
ni otros marcos de lectura (ORF) que permitan splicing alternativo, ni otros motivos
genéticos que expliquen la existencia de
estas dos proteínas de propiedades tan diferentes.
La síntesis de la proteína PrPc se realiza en
el retículo endoplasmático rugoso, en
forma de una pre-proteína que consta de
254 aminoácidos (según la especie animal)
y en la que se pueden destacar las siguientes características estructurales:
1. En el extremo amino-terminal, una secuencia señal de 22 aminoácidos (péptido señal).
2. Desde el aminoácido 51 al 91, cinco repeticiones de un octapéptido.
3. Un núcleo hidrofóbico de unos 30 aminoácidos –112 al 145– muy conservados
en todas las especies de mamíferos.
4. Cuatro segmentos separados que, por
estudios de predicción de modelos estructurales por ordenador, son candidatos para formar estructuras secundarias.
5. Tres aminoácidos susceptibles de glucosilarse: Asn 181, Asn 197 y Ser 232.
6. Dos Cys (179 y 214) que forman un
puente disulfuro que estabiliza la molécula.
7. Una región hidrofóbica de 22-23 aminoácidos en el extremo carboxi-terminal.
Una vez terminada la síntesis, la proteína
sufre un proceso de maduración complejo
antes de convertirse en la proteína celular
normal. El proceso de maduración empieza
en el retículo endoplasmático rugoso y termina de completarse en el aparato de
Golgi con el proceso de glicosilación.
El descubrimiento de la proteína prión supuso un gran avance para caracterizar la
etiología de las EET, al proporcionar un
marcador molecular específico de dichas
enfermedades. Así, aceptando como válida la teoría de Prusiner, por la que la
PrPsc es una variante conformacional de
la PrPc, los diferentes estudios de conversión postulan un modelo de propagación
del prión que involucra una interacción
proteína-proteína, entre la PrPc del
huésped y la PrPsc externa, que actúa
promoviendo la conversión de PrPc a
PrPsc en un proceso autocatalítico, que a
su vez procede muy eficientemente al interaccionar proteínas con la misma estructura primaria (21). Sin embargo, el mecanismo concreto de formación de la PrPsc
todavía se desconoce. Algunos estudios
especulan que esta proteína tiene una capacidad inherente para promover su
propio cambio conformacional, mientras
otros piensan que es necesaria una asociación de esta proteína con un agente infeccioso (proteína X) para su propagación
(2, 3, 22).
Aunque se ha avanzado mucho en el conocimiento del papel de la proteína prión
en las EET, la función biológica de la PrPc
no es del todo conocida. Sin embargo, se
ha sugerido que debe jugar un importante papel en el mantenimiento y/o regulación de las funciones neuronales.
Estudios realizados demuestran su capacidad para unir cobre a la PrPc, y se ha
propuesto su relación en la regulación de
la concentración de cobre presináptico y
en la transmisión sináptica. También se la
ha relacionado con la señalización en la
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
140
superficie celular o con la adhesión celular, debido a su unión a la membrana
plasmática a través de la GPI anteriormente mencionada.
Métodos de diagnóstico
Las técnicas de diagnóstico de este grupo
de enfermedades se basan en la observación de las lesiones características de este
grupo de enfermedades y en la detección
de la PrPsc en el sistema nervioso central,
principalmente mediante técnicas inmunoquímicas (OIE, 23). Al contrario que
otras enfermedades infecciosas, las enfermedades causadas por la proteína prión
no se pueden diagnosticar mediante la
mayoría de los métodos convencionales.
Dado que el agente causal de las EET carece de ácidos nucleicos, no se pueden utilizar técnicas como la PCR que se basan
en la detección del genoma. Asimismo, los
individuos infectados no reconocen como
“extraña” la proteína PrPsc, por lo que no
se produce una respuesta inmunológica
específica y no son aplicables técnicas serológicas. Tampoco existen técnicas in vitro
para aislar el agente causal, por lo que el
método utilizado para demostrar la infec-
Figura 1A. Vacuolización del pericarion neuronal de
una oveja afectada de scrapie.
tividad del agente es la inoculación en animales de experimentación.
Los métodos laboratoriales de diagnóstico
de las EET reconocidos oficialmente se realizan post mórtem en muestras de tejido
del sistema nervioso central (OIE, 23).
Actualmente no existe ningún test de
diagnóstico de la EEB que se pueda
aplicar en animales vivos. En el caso del
scrapie; dado que la PrPsc se puede distribuir por el sistema linforreticular en
gran cantidad, la detección de esta proteína en tejido linfoide obtenido mediante
biopsias es el único método fiable de
diagnóstico in vivo (24), aunque su sensibilidad no es del 100%.
Tradicionalmente, el diagnóstico de las
EET se ha basado en la observación de las
lesiones características de estas enfermedades mediante microscopía óptica. Estas
lesiones son únicamente microscópicas y
se localizan exclusivamente en el sistema
nervioso central (25); se caracterizan por
una neurodegeneración espongiforme,
acompañada generalmente de gliosis, degeneración y pérdida neuronal y, en determinados casos, amiloidosis cerebral
(26). La lesión característica es la vacuoli-
Figura 1B. Vacuolización del neuropilo de una oveja
afectada de scrapie.
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
141
zación, generalmente bilateral y simétrica,
del pericarion neuronal y del neuropilo de
la sustancia gris (espongiosis; figura 1) localizada en regiones neuroanatómicas
concretas (23, 26, 27). Las principales
áreas del sistema nervioso central donde
se localiza la vacuolización son las astas
dorsales en la médula espinal, el núcleo
del tracto solitario, el núcleo dorsal del
nervio vago, el núcleo del tracto espinal
del nervio trigémino, los núcleos vestibulares y la formación reticular en la médula
oblongada, la sustancia gris central en el
mesencéfalo, el área paraventricular en el
hipotálamo y el tálamo y el área septal.
Con menor frecuencia e intensidad se
pueden observar también vacuolizadas
otras áreas del sistema nervioso central,
como el hipocampo, la corteza cerebelar
o cerebral y los núcleos basales (25, 28).
Un estudio realizado al inicio de la epidemia de EEB en Reino Unido demuestra
que mediante el examen histopatológico
de una única sección de la médula
oblongada a nivel del óbex (figura 2), valorando el núcleo del tracto solitario y el
núcleo del tracto espinal del nervio trigémino, se pueden detectar el 99,6% de
los casos que presentan lesiones (29). En
el caso del scrapie ovino, la vacuolización
es más destacada en la médula espinal,
tronco del encéfalo y tálamo, pero, a diferencia de la EEB, existe una gran variación en la distribución topográfica de las
lesiones entre los individuos (23, 30, 31).
La vacuolización puede afectar a la sustancia gris de diversas áreas del encéfalo,
observándose en un alto porcentaje de
los casos en la corteza cerebral y cerebelar (31). Entre los factores que pueden
influir en el perfil lesional, se han descrito: la cepa del agente causal del
scrapie, el genotipo del gen PRNP, la vía
de infección, la edad del hospedador en
el momento de la infección y la duración
de la fase clínica (27, 32). A pesar de la
variabilidad existente, el área que con
mayor frecuencia e intensidad está afectada es la médula oblongada al nivel del
óbex, siendo generalmente el núcleo
dorsal del nervio vago la primera localización de la vacuolización. Otras localizaciones que frecuentemente se encuentran afectadas en las primeras fases de
la enfermedad son el núcleo del tracto
solitario, el rafe medio, el núcleo del
tracto espinal del nervio trigémino y el
núcleo de la oliva (33, 34).
Figura 2A. Extracción del tronco del encéfalo. Ovino
afectado de scrapie.
Figura 2B. Médula oblongada en el tronco del encéfalo (punta del bisturí). Ovino afectado de scrapie.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
142
En 1998 se detectaron unos casos atípicos
de scrapie, de los que se hablará más adelante, que no presentan vacuolización en
la médula oblongada al nivel del óbex,
siendo las áreas más afectadas la corteza
cerebelar y cerebral y, en menor medida,
el mesencéfalo. Este perfil lesional atípico
se acompaña de una distribución de la
PrPsc y un patrón de glicosilación diferente a otros casos de scrapie, se presenta
en mayor proporción en ovejas con al
menos un haplotipo AHQ y se ha asociado a una nueva cepa de scrapie, posiblemente de origen espontáneo (35, 36).
A pesar de la uniformidad en el perfil lesional presente en la EEB y en menor medida en el scrapie, el examen histopatológico del encéfalo no garantiza la
confirmación del diagnóstico de todos los
casos clínicos de estas enfermedades. Las
lesiones vacuolares varían en intensidad y
en determinados casos pueden ser mínimas o insuficientes para confirmar el
diagnóstico, dando lugar a resultados no
concluyentes (29, 33).
Por otro lado, se puede observar una vacuolización del tejido nervioso atribuible
a otras causas, tanto patológicas como no
patológicas. Por ejemplo, en bovinos con
signos neurológicos, así como en animales sanos, se ha observado una vacuolización del pericarion neuronal en diversas regiones neuroanatómicas cuya
causa se desconoce; se presenta frecuentemente en el núcleo rojo y en el núcleo
habenular, y ocasionalmente en otras
áreas, como la formación reticular, la sustancia gris intermedia de la médula espinal, el núcleo parasimpático y el núcleo
motor del nervio facial, el núcleo motor
del nervio oculomotor, el núcleo gracilis y
el núcleo cuneado lateral (37, 38). En el
caso del ovino también se puede detectar
vacuolización en neuronas, y en el neuropilo en diferentes localizaciones en animales no afectados por una EET, entre las
que se encuentra el núcleo dorsal del
nervio vago (23, 39). Asimismo, diversas
causas debidas a la toma o procesado defectuoso de la muestra pueden producir
artefactos que se asemejan a las lesiones
producidas por una EET (29, 40, 41).
Finalmente, destacar que el término encefalopatía espongiforme es un término
descriptivo que en neuropatología alude
a cualquier enfermedad en la que la espongiosis o vacuolización es la lesión predominante (42). La espongiosis puede
afectar tanto a la sustancia gris como a la
blanca, siendo las enfermedades priónicas
el principal ejemplo de enfermedades que
cursan con vacuolización de la sustancia
gris. La necrosis cerebrocortical o la intoxicación por plomo produce una espongiosis laminar en el neuropilo de la corteza cerebral (43). La espongiosis de la
sustancia blanca es característica de diversas alteraciones tóxicas y metabólicas,
como la encefalopatía hepática o la encefalopatía renal (37).
Respecto a la gliosis, consiste en una respuesta común e inespecífica de las células
de la glía frente a diferentes estímulos y
que también está presente frecuentemente en las enfermedades priónicas
(43). En este grupo de enfermedades
puede observarse una astrogliosis hipertrófica y una activación de la microglía,
generalmente asociadas a los depósitos
de PrPsc, la vacuolización y la degeneración neuronal (28, 44-46). Los astrocitos,
como la microglía, pueden acumular PrPsc
tanto en casos naturales como experimentales de EET (47,48).
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
143
Otra lesión característica de las EET es la
degeneración y pérdida neuronal, estudiada principalmente en animales de experimentación inoculados con el agente
causal. En casos de infección natural de
EEB y scrapie se han observado, además
de la vacuolización, otras formas de degeneración neuronal, como neuronas necróticas diseminadas acompañadas en
ocasiones por neuronofagia, neuritas distróficas y neuronas contraídas y basofílicas
(31). En la EEB se observa un despoblamiento neuronal en determinados núcleos del sistema nervioso central, llegando a producirse una reducción de
hasta el 50% de las neuronas en los núcleos vestibulares (49, 50) y en el núcleo
de la oliva (51). Entre los núcleos en los
que no se ha detectado una pérdida significativa de neuronas se encuentran el
dorsal del nervio vago, el hipogloso, el
caudado y el rojo (50, 51). En el scrapie
se han detectado alteraciones intensas,
con una apariencia laminar, en las neuronas piramidales de la lámina V de la corteza cerebral frontal (31).
En diversas EET humanas y animales se ha
observado la presencia de placas densas de
amiloide en el sistema nervioso central coincidentes con un inmunomarcaje frente a la
PrPsc (26, 28, 52-54). Estas placas son
abundantes en determinadas EET humanas. Concretamente en el kuru, las denominadas placas de “tipo kuru” pueden
observarse junto con finas espículas radiales, mientras que en la v-ECJ reciben el
nombre de placas floridas al encontrarse rodeadas de vacuolas (55). La amiloidosis cerebral es también frecuente en el scrapie
ovino y, en menor medida, en el caprino.
Se localiza en el cerebelo y en áreas rostrales del encéfalo, principalmente en la
corteza cerebral. Se presentan como placas
generalmente con forma estrellada, rodeadas por áreas de vacuolización del neuropilo y una marcada astrocitosis; también
son frecuentes las placas con disposición
perivascular (31, 53, 56). La presencia de
este tipo de placas en la EEB es muy escasa.
Por otro lado, puesto que una característica común y específica de las EET es la
acumulación en el sistema nervioso central de la proteína PrPsc (figura 3), este se
considera el único marcador molecular
identificado asociado a estas enfermedades (2, 3). La acumulación de PrPsc en
el tejido nervioso es previa a la neurodegeneración espongiforme (57, 58), por lo
que la utilización de métodos sensibles de
detección de la PrPsc permite el diagnóstico de los animales infectados en los que
las lesiones neuropatológicas son mínimas
o no están presentes. Además, dada la
alta resistencia de los priones a la degradación y a diversos agentes fisicoquímicos
(59), estas técnicas se pueden aplicar en
tejidos autolíticos o congelados en los que
la falta de integridad del tejido impide el
diagnóstico histopatológico.
La mayoría de los métodos de diagnóstico
actuales se basan en la detección del fragmento resistente a la proteinasa K (PrPres)
de la PrPsc mediante el uso de anticuerpos específicos. Los anticuerpos que
se utilizan en el diagnóstico de las EET no
discriminan entre ambas isoformas de la
proteína, por lo que previamente a la detección de la PrPres es necesario degradar
la PrPc, generalmente con proteinasa K
(PK).
La inmunohistoquímica detecta la PrPsc in
situ, lo que permite determinar tanto la
presencia de la PrPsc como su distribución
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
144
Figura 3. Acúmulos de PrPsc en el tejido nervioso de la médula oblongada. Bovino afectado de EEB.
en el tejido, su localización celular y las
características morfológicas de la acumulación. Diversos trabajos demuestran la
capacidad de la inmunohistoquímica para
detectar la PrPsc en tejidos en los que no
es posible realizar un diagnóstico histopatológico, ya que han perdido su morfología por la autolisis o por la congelación
(60-62). Los depósitos de PrPsc pueden
observarse, tanto asociados a las lesiones
histopatológicas, como en áreas donde
no se presenta vacuolización o esta es mínima (61, 63). La inmunotinción suele ser
bilateral (64) y se localiza principalmente
en el tronco del encéfalo, aunque en el
caso del scrapie con frecuencia se distribuye por todo el sistema nervioso central
(65, 66).
El diagnóstico de las EET por inmunohistoquímica debe realizarse mediante la
identificación del patrón característico de
inmunotinción, a través de su distribución
topográfica y una localización celular específica (25, 64). Los diferentes tipos de
inmunotinción específicos del depósito de
PrPsc en el scrapie (60, 63, 64, 67) han
sido descritos detalladamente por
González et al. (66, 68) siendo estos los
siguientes: intraneuronal, intraglial, estre-
llado, subpial, perivascular, subependimario, ependimario, lineal, punteado fino,
partículas gruesas, coalescente, perineuronal y en placas.
La especificidad y sensibilidad de la técnica inmunohistoquímica depende en
gran medida de la metodología y los anticuerpos utilizados (63, 65, 69, 70).
Como se ha descrito anteriormente, los
anticuerpos utilizados para la detección
de la PrPsc reconocen las dos isoformas
de la proteína prión y tanto el proceso de
fijación como la acumulación y formación
de agregados de la PrPsc ocultan los epítopos necesarios para la reacción con el
anticuerpo. Ello implica la necesidad de
utilizar una metodología que permita la
supresión de la PrPc, así como una recuperación e incremento de la exposición de
los epítopos ocultos de la PrPsc (63). Para
ello, diversos pretratamientos han sido
aplicados previamente a la inmunotinción
para desenmascarar epítopos, potenciando la inmunotinción específica y minimizando la inespecífica.
Al contrario que en la EEB, en el scrapie
se produce una amplia distribución de la
PrPsc en el organismo, principalmente en
el sistema linforreticular (71). En la actua-
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
145
lidad, la demostración de la presencia de
la PrPsc en el tejido linfoide está utilizándose cada vez más para el diagnóstico del
scrapie tanto in vivo como post mórtem
(72-76). La aplicación de técnicas inmunohistoquímicas sobre muestras de tejido
linfoide obtenido mediante biopsia, principalmente de tonsilas palatinas (72),
tercer párpado (73) y mucosa rectal (77,
78), permite diagnosticar la enfermedad
incluso en fases preclínicas de la misma.
En animales con genotipos susceptibles se
ha descrito una sensibilidad del test realizado en biopsia de tejido linfoide asociado al tercer párpado y a la mucosa
rectal del 85-90% (73, 79). Sin embargo,
esta técnica presenta algunas limitaciones,
debido principalmente a que algunos animales infectados únicamente presentan
depósitos de PrPsc en el sistema nervioso
central.
La técnica de Western blot para la detección de la PrPsc es un método de diagnóstico de las EET de una alta sensibilidad
con el que se obtienen resultados cualitativos que permiten confirmar la especificidad de la señal (80). Puesto que, como
se ha mencionado anteriormente, tanto
la PrPc como la PrPsc tienen un peso molecular (Pm) de 33-35 kDa (2, 3, 81), si
ambas proteínas se someten a un proceso
de digestión con PK, la PrPc se degrada
completamente, mientras que en la PrPsc
se elimina el extremo N-terminal quedando una fracción de la misma resistente
a la PK de un Pm de 27-30 kDa, denominada PrP 27-30 o PrPres (12). La técnica de
Western blot permite la detección del fragmento PrPres de la PrPsc mediante la reacción específica con anticuerpos (figura 4).
La metodología básica consiste en la extracción del fragmento resistente de la
PrPsc mediante una digestión con PK, la
separación de las proteínas en un gel de
poliacrilamida mediante una electroforesis
y su transferencia a una membrana de nitrocelulosa. En este protocolo general, la
OIE recomienda incluir una extracción con
detergentes (N-laurilsarcosina) y varios
pasos de ultracentrifugación, lo que permite obtener una mayor concentración de
proteína y, por lo tanto, una mayor sensibilidad de la técnica (82). La sensibilidad
de esta técnica depende también de otros
factores, como el proceso de extracción o
los anticuerpos utilizados (83).
La detección de la PrPres mediante la técnica de Western blot se utiliza frecuentemente en el diagnóstico de la EEB y del
scrapie, especialmente para confirmar
aquellos casos en los que las lesiones neuropatológicas son mínimas o no están
presentes o el tejido no es adecuado para
el examen histopatológico por autolisis,
congelación o destrucción de las áreas de
localización de las lesiones (84-89). La detección de la PrPsc en animales preclínicos
que no presentan lesiones en el sistema
nervioso central indica una mayor sensibilidad de la técnica respecto al examen
histopatológico (34, 90). También se ha
demostrado una mayor sensibilidad de la
técnica de Western blot con respecto a la
demostración de las SAF (Scrapie
Associated Fibrils) (91). Además, en animales afectados por EEB se han detectado
depósitos de PrPsc en áreas del sistema
nervioso central donde las lesiones histopatológicas no suelen presentarse, como
en el cerebelo o la corteza cerebral,
aunque las señales más intensas se obtienen en la médula oblongada y el mesencéfalo (85, 88).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
146
Figura 4. Bandas específicas de la PrPsc en una
muestra de médula oblongada de ovino afectado de
scrapie.
Las fibrillas asociadas a scrapie (SAF), observables mediante microscopía electrónica, son marcadores ultraestructurales
específicos de las EET (92) cuyo constituyente principal es la PrPsc (93). Se observaron por primera vez en ratones y hámsteres infectados experimentalmente con
el agente causal del scrapie (94), y posteriormente se han detectado en diversas
EET, como el scrapie ovino (92) y el caprino (95). Su detección en los primeros
casos de EEB en Reino Unido constituyó
una evidencia adicional al cuadro clínico
y lesional para incluir a esta nueva enfermedad dentro del grupo de las EET (96).
Estas fibrillas se pueden observar mediante
microscopía electrónica utilizando técnicas
de tinción negativa en fracciones subcelulares de tejido nervioso de animales afectados por la EEB y el scrapie, y se pueden
identificar por su morfología característica.
La metodología consiste básicamente en el
tratamiento de fracciones subcelulares del
tejido nervioso con detergentes que solubilizan la PrPc, mientras que la PrPsc se
agrega en forma de varillas o fibrillas que
posteriormente se pueden separar mediante ultracentrifugación y visualizar en el
microscopio electrónico (81, 92).
Las SAF miden entre 100-500 nm de longitud, presentan una disposición lineal y
están compuestas de dos o cuatro fila-
mentos de 4-6 nm de ancho. En función
de su morfología se pueden identificar
principalmente dos tipos, tipo I y II,
aunque también se han observado fibrillas que tienen propiedades de ambos
tipos (94).
La alta especificidad de la técnica y su eficacia en tejidos autolíticos o congelados
(92, 97, 98), dio lugar a que se utilizara
en el diagnóstico del scrapie y la EBB
como un criterio de diagnóstico independiente y de apoyo a las técnicas histopatológicas en el programa de vigilancia de
estas enfermedades en Reino Unido (99).
Patogenia y transmisión
La puerta de entrada más habitual del
agente etiológico en los casos de EEB y
scrapie es la vía oral. Así, se acepta que se
produce a través del consumo de piensos
o leches maternizadas contaminados con
la proteína prión (25). En la enfermedad
del scrapie, otro de los procedimientos
más importantes de acceso del agente es
la ingesta de la placenta. También se contemplan otras vías en el caso de la enfermedad de scrapie (la presencia de pequeñas heridas en la piel, por ejemplo),
que también podrían contribuir a la entrada de la PrPsc en animales de las especies ovina y caprina cuando están en contacto con otros animales infectados o
simplemente por la contaminación presente en el medio en rebaños afectados
de la enfermedad (61, 100).
En la infección natural, el agente causal
penetra en el organismo por vía oral a
través del tracto intestinal. Sin embargo,
en los estudios experimentales se han
descrito otras vías efectivas, como la intracerebral, la intraperitoneal, la intrave-
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
147
nosa, la intraocular y conjuntival y a través
de escarificaciones en la piel (61, 101103). Los puntos de entrada del agente
tras la ingestión de material contaminado
pueden ser distintos, aunque siempre implican al sistema inmunitario (104). Tanto
en la EEB como en el scrapie, la PrPsc
entra en el organismo principalmente a
través del tejido linfoide asociado al intestino (GALT), sobre todo a la altura del
íleon, ya que este alberga la placa de
Peyer ileal, que actúa como tejido linfoide
primario e involuciona con la edad. En
consecuencia, parece que existe mayor
susceptibilidad a contraer la enfermedad
a edades tempranas (105). En el mecanismo de incorporación desempeñan un
papel importante las células M, que se localizan adyacentes a las placas de Peyer,
intercaladas en el epitelio de recubrimiento intestinal. Las células M son enterocitos modificados (presentan linfocitos
B subyacentes) capaces de captar proteínas sin su posterior degradación a fin de
presentarlas como antígenos al sistema
linforreticular. Así, la PrPsc pasa al sistema
linforreticular, donde se acumula y se replica en células macrofágicas y en células
dendríticas foliculares (104). Estos tipos
celulares, junto con los linfocitos B, son
cruciales en la patogenia de las EET.
Estudios efectuados en ratones transgénicos demostraron que, en ausencia de
linfocitos B, los ratones eran resistentes a
la infección por PrPsc. Más tarde se demostró que la ausencia de linfocitos B impedía que maduraran las células dendríticas foliculares, evitando así que estas
acumularan la proteína prión (106).
Asimismo, otros autores sostienen que la
expresión de PrPc en linfocitos B no es necesaria para que se produzca neuroinva-
sión (107). Los folículos linfoides, estructuras en las que se encuentran las células
dendríticas foliculares, son muy eficaces
para la replicación de la PrPsc. De hecho,
se ha demostrado que la presencia de
estas estructuras en localizaciones no habituales, como sucede en casos de inflamación crónica, permite la acumulación
de PrPsc. Eso hace que, por ejemplo, en
las mamitis crónicas que cursan con la formación de folículos linfoides, pueda excretarse PrPsc a través de la leche (por
ejemplo, coinfección con lentivirus de los
pequeños rumiantes) o, en el caso de nefritis crónicas, por la orina (108-110). En
resumen, las células M captan la PrPsc y
la incorporan al tejido linfoide subepitelial (104), donde son procesados por las
células dendríticas foliculares.
La tonsila palatina se considera otro punto
de entrada del agente; desde el punto de
vista histológico, en este punto el tejido
linfoide se caracteriza por intercalarse con
epitelio escamoso del paladar. El objetivo
del tejido linfoide en esta localización y en
condiciones normales es la identificación
de antígenos que penetren en el organismo por vía oral. Tras un tiempo de permanencia variable en dicho tejido, el
agente se dirige al sistema nervioso central por dos rutas principales: una directa,
a través del sistema nervioso periférico, y
otra indirecta, que implica la participación
del sistema linforreticular (nódulos linfáticos, bazo, amígdalas) y del sistema nervioso periférico (104, 111). En el caso del
scrapie se ha observado una amplia participación del sistema linforreticular (100),
mientras que en la EEB esa participación
es mínima (112). En el sistema linforreticular, la participación más relevante es la
del bazo, aunque depende de la vía de
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
148
inoculación (101, 113). Una vez que la
PrPsc está presente en el bazo, su concentración aumenta hasta estabilizarse, previamente a la neuroinvasión del sistema
nervioso central (113). De hecho, en la
enfermedad del scrapie algunos autores
señalan que el diagnóstico de la enfermedad, tomando como muestras objeto
de estudio tanto la médula oblongada
como el sistema linforreticular (nódulo retrofaríngeo, tonsila palatina, biopsia de
tercer párpado, por el tejido linfoide asociado a la membrana nictitante, o de mucosa rectal), permitiría diagnosticar también gran parte de los casos preclínicos,
debido a la temprana distribución de la
proteína prión en el tejido linforreticular
(74-76, 79, 114). No obstante, la replicación de la proteína prión en el sistema linforreticular no es requisito indispensable
en todos los casos (115, 116). De hecho,
la participación del citado sistema puede
verse influida por factores endógenos o
exógenos (por ejemplo, dosis infectivas
elevadas) al individuo (117, 118). Así, en
animales de experimentación se ha descrito neuroinvasión de prión en ausencia
de sistema linforreticular (119), realizándose el proceso directamente por transporte axonal (120).
En el caso de los pequeños rumiantes, la
ruta de neuroinvasión de la proteína prión
varía sustancialmente dependiendo del
agente infeccioso implicado, de la especie
del huésped y de la susceptibilidad genética propia del individuo (100, 111, 121,
122). Así, factores como el genotipo del
huésped pueden hacerla variar considerablemente. En ovinos que portan los genotipos más resistentes al codón 136 del
gen PRNP (por ejemplo, ARR), la implicación del sistema linforreticular en la repli-
cación de la proteína prión es muy pequeña, y la neuroinvasión se produce sin
que el sistema linforreticular acumule
PrPsc (119).
En la EEB, la replicación del prión se restringe al sistema nervioso central (123),
siendo mínima la replicación del prión en
el tejido linforreticular. Es importante destacar que el tejido linfoide intestinal se extiende proximal y distalmente a lo largo del
tracto gastrointestinal. En el sistema linforreticular, la PrPsc se distribuye por su extensión (sobre todo en la especie ovina, dependiendo también de genotipos
específicos) y se transfiere al sistema nervioso entérico (111), que se considera el
punto de entrada del agente causal del
scrapie en el sistema nervioso, ya que se ha
detectado PrPsc en dicho sistema durante
las primeras fases de la infección. No se conoce con precisión el mecanismo de transferencia del agente causal desde el sistema
linforreticular al sistema nervioso central,
pero diversos estudios sugieren que se produce desde las células dendríticas foliculares hasta las fibras nerviosas que inervan
los folículos linfoides, siendo mayor la velocidad de neuroinvasión cuanto menor es
la distancia topográfica entre estas células
y las terminaciones nerviosas (122, 124).
La difusión del agente puede ser pasiva,
desde las células degeneradas que lo liberan hasta las terminaciones nerviosas, o
mediante el transporte de células móviles,
como los macrófagos o las células dendríticas (115). Inicialmente se pueden observar depósitos de PrPsc, en los ganglios
de los plexos que se encuentran en el íleon,
que se van distribuyendo progresivamente
a lo largo de todo el sistema nervioso entérico, presentando un patrón de diseminación similar al del sistema linforreticular
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
149
(122, 125). Desde el sistema nervioso entérico, utilizando estructuras nerviosas del
sistema nervioso autónomo, y en concreto
del sistema parasimpático, la PrPsc podría
llegar al sistema nervioso central por dos
puntos: a través de la médula espinal a
nivel torácico (columna intermediolateral,
segmentos T5-L1), mediante el nervio esplácnico y los ganglios mesentéricos craneal y celíaco, o a través de la médula
oblongada, en el núcleo motor dorsal del
nervio vago. Estos hallazgos han sido descritos en trabajos realizados sobre la distribución tisular de la PrPres mediante técnicas inmunohistoquímicas en modelos
experimentales murinos (111, 126).
No obstante, los primeros lugares del sistema nervioso central donde se acumula
la PrPsc, tanto en casos naturales del
scrapie y de EEB como en diversos modelos experimentales, son la médula
oblongada y la médula espinal torácica
(127, 128). Una vez alcanzado el sistema
nervioso central, el agente se disemina de
forma ascendente y descendente a través
del mismo (129). Asimismo, desde la descripción de los primeros casos de scrapie
atípico, se sabe que en animales que presentan esta variante de la enfermedad, el
depósito de PrPsc no se realiza principalmente en la médula oblongada, sino que
su mayor concentración se localiza en el
cerebelo (35).
Sin embargo, no se puede descartar que
el proceso de neuroinvasión ocurra en
parte por la fracción de PrPsc que circula
por la sangre, y que el agente acceda al
encéfalo a través de este fluido (101,
107). En 2002 se publicaron trabajos que
describen la transmisión del scrapie mediante transfusiones sanguíneas (130), lo
que reforzó la teoría de que la disemina-
ción de esta proteína se produjese también por la vía hematógena. Por ello, esta
vía de distribución del prión puede representar una ruta alternativa de neuroinvasión a la del sistema nervioso entérico/sistema nervioso autónomo, que se apoya
en la descripción de la presencia de depósitos de PrPsc en los órganos circunventriculares del cerebro, en los que la barrera
hematoencefálica no existe (131).
Otra vía de diseminación descrita ha sido
la linfática, ya que se ha detectado PrPsc
en los senos subcapsulares de los ganglios
linfáticos (116).
Actualmente, todavía no se conocen por
completo las rutas naturales de transmisión de las EET. Se acepta que la transmisión horizontal se produce sobre todo mediante la excreción alimentaria y la
ingestión oral, pero los largos periodos de
incubación que caracterizan a estas enfermedades hacen que sea muy difícil relacionar los casos clínicos con sus fuentes
de infección originales.
Los estudios epidemiológicos sugieren
que la transmisión natural del scrapie clásico ocurre principalmente por vía horizontal, ya sea por contacto directo entre
animales o, indirectamente, mediante la
contaminación del ambiente (132). Se ha
observado que este tipo de transmisión se
produce de forma natural cuando ovejas
sanas sin ninguna exposición previa se
ponen en contacto con ovejas infectadas
de scrapie. En consecuencia, se asume
que la PrPsc se elimina a través de excreciones (heces y orina) o secreciones (leche
y saliva) (133).
Se estima que las principales fuentes de
contaminación ambiental en la enfermedad de scrapie son la placenta (134,
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
150
135), las heces (101) y las canales de animales infectados. En el scrapie ovino se reconoce la transmisión materna en condiciones naturales, aunque resulta difícil de
evaluar, dado el posible contagio lateral
entre animales de todas las edades. Existe
un relativo desconocimiento respecto a la
vía de infección de una oveja afectada de
scrapie hacia su descendencia y si la infección ocurre in utero, en el periodo posnatal
o en ambos momentos. La transmisión
vertical “pura”, aquella que se produce
in utero, nunca ha sido demostrada (6). La
presencia de PrPsc e infectividad en la placenta, incluso en estados preclínicos de la
enfermedad, sugiere que la transmisión
tendría lugar desde las madres infectadas
de scrapie a su descendencia y a otros animales durante el periodo de parto a través
de la placenta. Se ha observado que no
todos los animales infectados acumulan
PrPsc en la placenta y que el mismo animal
no acumula PrPsc en todas las gestaciones.
Dicha acumulación parece depender del
genotipo del feto (134-136), ya que no se
han detectado depósitos de PrPsc en placentas de ovejas infectadas de scrapie cuyo
feto presenta genotipo resistente al scrapie
clásico. En las ovejas ARR/VRQ con scrapie
no se acumula PrPsc en sus placentas, incluso cuando el genotipo fetal es VRQ/VRQ
(considerado susceptible). Esto podría estar
asociado a la falta de PrPsc en el tejido linfoide en animales infectados con genotipo
ARR/VRQ y, en consecuencia, a una ineficiente diseminación de PrPsc en la placenta
(137). Sin embargo, la acumulación de
PrPsc en la placenta no solo depende del
genotipo de la madre y del genotipo del
feto, sino también de la posición del feto
en el útero. La proteína patológica puede
estar presente en cotiledones de fetos con
genotipos resistentes a scrapie cuando se
produce un parto múltiple, en que los fetos
(con genotipo resistente y susceptible)
están compartiendo el mismo cuerno uterino. Esto se podría explicar por la existencia de anastomosis sanguíneas entre cotiledones de los diferentes fetos (136). La
duración de la exposición de los corderos
a las placentas tras la época de partos
afecta a la transmisión a la descendencia.
Así, los corderos que se separan inmediatamente después del parto de sus madres
infectadas de scrapie y del rebaño presentan menos incidencia de scrapie en la
edad adulta que aquellos que se separan
más tarde o que los que no son segregados. La progenie de ovejas que desarrollan scrapie presenta más probabilidad de
contraer la enfermedad que la procedente
de ovejas aparentemente sin scrapie, debido tanto a la influencia de la genética
como a la transmisión de la enfermedad.
No obstante, aunque de forma excepcional, existen animales nacidos de ambos
padres infectados de scrapie que no desarrollan la enfermedad. Cuando solo uno de
los padres está afectado, sobre todo si es
el macho, el riesgo para la descendencia se
reduce. En consecuencia, se acepta que la
transmisión materna es mucho más importante que la paterna, aunque esta diferencia es menor si la progenie es separada
tras el parto, protegiéndose de este modo
de una posterior infección horizontal (132).
En el ganado vacuno, todas las evidencias
indican que en condiciones naturales el
agente de la EEB no se propaga horizontalmente en el entorno mediante excreciones y/o secreciones, ni verticalmente a
través de transmisión materna (138, 139).
Así, se acepta que la epidemia de la EEB
fue debida a la intervención humana, al
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
151
utilizarse canales de animales infectados
con priones para la producción de harinas
de carne y hueso como fuente de alimentación del ganado vacuno. La retirada de
estas harinas para la alimentación animal
ha tenido un claro efecto sobre la incidencia de la EEB, que se ha reducido de
forma drástica.
La transmisión materna y/o vertical en la
EEB, desde la madre al ternero, parece ser
muy rara o incluso inexistente en estadios
tempranos de incubación de la enfermedad, pero el riesgo aumenta dependiendo del periodo transcurrido entre el
nacimiento del ternero y el comienzo de
los signos clínicos en la madre. Así, se
considera que, en una vaca afectada de
EEB que tenga el parto hasta 6 meses
antes o después de la aparición de los
signos clínicos, la probabilidad de que su
ternero adquiera la enfermedad aumenta
considerablemente (140, 141). Sin embargo, no se sabe si la transmisión puede
ocurrir por vía transplacentaria durante la
gestación o tempranamente en el periodo
posnatal a través de secreciones o excreciones maternas (133).
Se han sugerido otras posibles vías de entrada de la PrPsc, como la mucosa olfatoria
en humanos (142) o las heridas en la
lengua en un modelo de enfermedad transmisible del visón (ETV) en hámsteres (143).
Todos los estudios realizados sobre la patogenia y transmisión del scrapie y la EEB son
los que han precisado qué órganos y tejidos
pueden ser considerados peligrosos para el
consumo humano, siendo calificados como
material específico de riesgo (MER). En
España, el RD 3454 del año 2000 define el
programa integral coordinado de vigilancia
de las EET, y por tanto, regula su retirada,
tratamiento y control documental. No obstante, es el Real Decreto 1911 del año 2000
y sus posteriores modificaciones el que define concretamente qué materiales deben
ser retirados de la cadena alimentaria como
medida de protección del consumidor. De
esta forma, quedan definidos en función
de la especie los siguientes tejidos y órganos:
• Bovinos:
– El cráneo, excluida la mandíbula e incluidos el encéfalo y los ojos, y la médula espinal de los bovinos de más de
12 meses.
– La columna vertebral, excluidas las
vértebras de la cola, las apófisis espinosas y transversas de las vértebras
cervicales, torácicas y lumbares, y la
cresta sacra media y las alas del sacro,
pero incluidos los ganglios de la raíz
dorsal, de los animales mayores de
30 meses.
– Las amígdalas, los intestinos, desde el
duodeno hasta el recto, y el mesenterio
de los bovinos de todas las edades.
• Ovinos y caprinos:
El cráneo, incluidos el encéfalo y los ojos,
las amígdalas y la médula espinal de los
ovinos y caprinos de más de 12 meses o
en cuya encía haya hecho erupción un incisivo definitivo, así como el bazo y el
íleon de los ovinos y caprinos de todas las
edades.
Factores genéticos
Los factores genéticos que influyen en la
susceptibilidad y el desarrollo de una EET
animal continúan todavía en fase de estudio. Es una cuestión relevante, ya que
el descubrimiento de un gen directa-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
152
mente implicado en el desarrollo de este
grupo de enfermedades ha permitido la
aplicación de un sistema de control mediante la selección de animales resistentes, lo que se ha llevado a cabo en la
especie ovina en la Unión Europea.
El gen de la proteína prión (PRNP) tiene
una longitud variable, entre 16.000 y
22.000 bases, y está formado por dos o
tres exones (dependiendo de la especie),
si bien toda la región codificante (ORF) se
encuentra en un único exón. Este gen codifica una glicoproteína de membrana, la
PrPc, que posee entre 230 y 255 aminoácidos, y cuya secuencia está altamente
conservada entre especies. Este gen se ha
identificado en un gran número de especies, tanto domésticas como salvajes. La
homología entre las distintas especies es
muy elevada; por ejemplo, un 94% de la
secuencia nucleotídica de las especies bovina y ovina es idéntica. A su vez, estas especies muestran una homología con el
gen humano del 66,7 y el 65,4%, respectivamente. En relación con él se ha descrito un gran número de polimorfismos o
variantes genéticas en distintas especies
que se pueden clasificar en:
• Mutaciones puntuales: un cambio de un
nucleótido en un codón da lugar a un
cambio aminoacídico en la proteína.
• Inserciones y deleciones: se producen en
la región de octapéptidos, dando lugar
a un número distinto de repeticiones
(según los diferentes individuos).
El desarrollo de una EET de forma natural
está muy influido por las alteraciones en
el gen del hospedador que codifica para
la proteína PrP (144). Estos polimorfismos
pueden influir en la conversión de PrPc en
la isoforma PrPsc (145). Los mecanismos
por los que una variante alélica individual
conduce a una susceptibilidad alterada o
a un cambio en el periodo de incubación
no han sido bien definidos. Se ha propuesto que, en humanos, los polimorfismos del gen PRNP pueden presentarse
en sitios críticos implicados en la transición de conformación de PrPc a PrPsc
(146).
El gen de la proteína PrPc humana se localiza en el cromosoma 20, tiene una longitud de 16.000 bases y codifica una proteína de 253 aminoácidos. Ciertas
mutaciones dan lugar a un cambio aminoacídico que, al provocar una modificación conformacional del plegamiento de
la proteína prión, origina una EET. Se han
observado mutaciones en las formas familiares de la ECJ, en el síndrome de
Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) y
en el insomnio familiar letal. Por ejemplo,
la mutación que supone el cambio de
prolina por leucina en el codón 102 es suficiente para causar una forma de GSS.
Los distintos polimorfismos observados en
la especie humana se deben a inserciones
o deleciones de octapéptidos o a mutaciones puntuales. En la actualidad se han
descrito 25 mutaciones en el gen PRNP
humano, pero no todas ellas ligadas al desarrollo de la enfermedad. La causa más
frecuente de ECJ familiar es la mutación
puntual en el codón 20, que aparece en
más del 70% de las familias con ECJ hereditaria en todo el mundo.
La predisposición genética tiene su influencia en todos los tipos de ECJ (familiar, iatrogénica y esporádica). El codón
129 parece ser el que está implicado en
esta predisposición. Así, los casos iatrogénicos resultantes del uso de la hormona
del crecimiento están asociados con el ge-
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
153
notipo homocigoto valina en este codón.
Por otro lado, los casos de la v-ECJ han
aparecido en individuos homocigotos metionina.
El gen que codifica para la proteína prión
bovina tiene un tamaño de 20-22.000
bases y se encuentra en el cromosoma 13
(13q17). La secuencia aminoacídica de la
proteína codificada difiere de la ovina en
siete u ocho posiciones. Como consecuencia de la epidemia de EEB sufrida en
el Reino Unido, se han llevado a cabo diversos trabajos con el fin de detectar la
base genética de esta enfermedad en la
especie bovina. Además de la necesidad
de contacto con el agente (relacionada
con el consumo de alimentos contaminados), la epidemiología de esta enfermedad induce a pensar que, al igual que
ocurre en otras especies (humanos u
ovinos), existe un componente genético.
Se han descrito algunos polimorfismos en
el gen PRNP de esta especie (W84R,
G100S, K113R, V115M, H143R, S146N y
N177S), pero la demostración de su relevancia respecto a la susceptibilidad frente
a la EEB está todavía en fase de estudio
(147, 148).
Recientemente, se ha demostrado la asociación entre la susceptibilidad a EEB y la
inserción/deleción de 12 y 23 pares de
bases (pb) en la región promotora del gen
PRNP (149, 150). El mayor efecto lo produce la deleción en homocigosis, tanto de
las 12 como de las 23 pb. Las primeras investigaciones destinadas a la identificación de una base genética que pudiera
explicar la diferencia en cuanto a la susceptibilidad y al desarrollo de una EET se
llevaron a cabo en la especie ovina. De
hecho, la influencia de la genética del
hospedador en esta especie es una de las
mejor conocidas, incluso se han llegado a
establecer relaciones entre algunos polimorfismos del gen PRNP y la susceptibilidad al scrapie. En la actualidad, como ya
se ha indicado, se están aplicando estos
conocimientos en el control de esta enfermedad.
La revisión realizada por Kimberlin, en
1979 (151), resume los conocimientos de
la época respecto a la susceptibilidad o la
resistencia genética frente a la enfermedad, tanto experimental como natural.
En esta revisión se hacía referencia a dos
hechos fundamentales que ayudaron a
comprender la complejidad de la enfermedad. Uno de ellos consistía en proponer que los animales podían mostrar
resistencia a la enfermedad, pero tal vez
no a la infección, de forma que podrían
existir animales que tuvieran un periodo
de incubación más largo que su propia
vida, pero no por ello dejar de transmitir
el agente causal. Otro era la posibilidad
de que los animales fueran resistentes a
la única cepa utilizada en todos los experimentos realizados hasta el momento
(SSBP-1), pero que no lo fueran para otras
nuevas cepas de scrapie todavía no caracterizadas.
El descubrimiento de un gen celular que
codificaba la proteína PrPc fue una de las
aportaciones más importantes que revolucionó la genética del scrapie (12). A
partir de ese momento, todos los estudios
de susceptibilidad genética a la enfermedad giraron en torno a diferentes polimorfismos descritos en el gen PRNP. A
partir de esta información, se comprobó
la existencia de un polimorfismo en el
codón 171 que codificaba dos aminoácidos (glutamina/arginina) (152). Pese a
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
154
que en aquel momento se desconocía la
importancia de este descubrimiento, el
polimorfismo del codón 171 ha sido uno
de los más importantes en el control del
scrapie, y está asociado, como se referirá
más adelante, a la susceptibilidad o la resistencia a la enfermedad.
En 1995, el equipo de investigación de
Belt estableció las cinco variantes haplotípicas presentes en el gen PRNP ovino y
su asociación con el scrapie. Aunque
existen diferencias en la frecuencia de los
haplotipos entre las razas ovinas y en los
haplotipos asociados a la enfermedad, se
han observado algunas características comunes entre ellas. Por ejemplo, el haplotipo VRQ está asociado a una alta incidencia de scrapie y el haplotipo ARR a
una incidencia baja; este último tiene un
efecto dominante, ya que tanto los animales homocigotos como los heterocigotos presentan un menor riesgo de padecer la enfermedad; respecto a los
haplotipos AHQ, ARQ y ARH, su asociación con la enfermedad depende en gran
medida de la raza (153).
En la especie ovina, el gen PRNP tiene un
tamaño de 20.000 pb y codifica para una
proteína de 256 aminoácidos. Este gen ha
sido localizado en el cromosoma 13. El
gen presenta un alto grado de polimorfismo, y hasta la fecha se han descrito 40
mutaciones que suponen un cambio aminoacídico en 27 codones distintos (154).
La mayoría son raros y no se han asociado
a ningún fenotipo de la enfermedad, ni
en la infección natural ni en la experimental. Sin embargo, las variantes genéticas de los codones 136, 154 y 171 parecen tener influencia en la susceptibilidad
a la enfermedad. Del conjunto total de
posibles alelos (2x2x3), solo cinco se de-
tectan con una frecuencia relativamente
alta. La forma original del gen parece ser
la variante ARQ, habiéndose originado el
resto de haplotipos mediante mutaciones
puntuales. La frecuencia y la distribución
de las distintas combinaciones varían
según la raza. En los últimos años se han
publicado numerosos trabajos en los que
se determina la distribución de estos
alelos en otras razas europeas. Concretamente, parece ser que los haplotipos predominantes en las poblaciones ovinas españolas son ARQ, ARR, ARH (155) y ARQ
en las poblaciones ovinas afectadas por la
enfermedad (156). Resultados similares se
han obtenido en la raza sarda italiana y
en razas portuguesas. Según los datos obtenidos principalmente de razas británicas
y francesas, existe una clara influencia del
genotipo de PRNP para los codones 136,
154 y 171 en la susceptibilidad del animal
a presentar el scrapie clásico. El genotipo
de PRNP se muestra como el principal
factor asociado a la incidencia de esta enfermedad si se tiene contacto con el
agente causal. Las conclusiones que se
obtuvieron a partir de estas investigaciones se resumen a continuación:
• El haplotipo VRQ es el más estrechamente relacionado con la susceptibilidad al scrapie. Los animales homocigotos para este haplotipo son los que
presentan mayor riesgo. Los heterocigotos con el haplotipo resistente (ARR
y AHQ) tienen menor riesgo.
• La forma original ARQ también se ha
asociado a la susceptibilidad a presentar
esta enfermedad, aunque con un
menor riesgo o una penetrancia menor
que el VRQ.
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
155
• Los haplotipos ARR y AHQ se han asociado a la resistencia a esta EET.
El grupo nacional de información de
scrapie establecido en el Reino Unido desarrolló una Guía universal para clasificar
los 15 posibles genotipos del gen PRNP
en niveles de riesgo. Con este objetivo, se
establecieron distintas clasificaciones de
genotipos teniendo en cuenta los alelos
predominantes en las distintas razas. Los
genotipos se agrupan en función del nivel
de riesgo del animal y del de su posible
progenie. Dawson et al. (153) proporcionan las tablas de riesgos, resaltando
que las interpretaciones de esta clasificación están basadas en probabilidades y no
en certezas. Las tablas se revisan de forma
periódica y pueden estar sujetas a modificaciones. Las distintas agrupaciones de
los genotipos se basan en el riesgo al desarrollo de la enfermedad (R) y han sido
valoradas de R1 a R5:
• R1: indica un riesgo muy bajo de desarrollar la enfermedad en el individuo y
un riesgo muy bajo en la progenie de
primera generación.
• R2: indica un riesgo bajo del individuo
y de la progenie.
• R3: indica un riesgo bajo individual,
pero el de la progenie puede aumentar
en función del genotipo del otro parental.
• R4: indica que el scrapie se puede encontrar de forma ocasional y que la progenie tiene mayor riesgo que la del
grupo anterior.
• R5: indica que este ovino tiene el mayor
riesgo de desarrollar scrapie.
Esta guía realiza distintas clasificaciones
en función de los alelos predominantes de
las razas; no obstante, se ha establecido
una única clasificación universal para
todas las razas.
En los últimos años, como se ha adelantado, se han descrito casos de scrapie
cuyas características clínicas, patológicas,
inmunoquímicas y estructurales difieren
en gran medida de la enfermedad clásica.
En la actualidad, se considera que estos
casos se han producido como consecuencia de la aparición de cepas atípicas
de scrapie diferentes de las descritas hasta
ahora, denominadas genéricamente
cepas clásicas.
La primera descripción de la presencia de
cepas atípicas de scrapie en Europa se realizó en Noruega; su descubrimiento en
el año 1998 dio origen al propio nombre
de una de estas cepas, la Nor98. Una de
las características más importantes del
scrapie atípico es que parece estar asociado a animales con un genotipo resistente al scrapie clásico, incluidos los ARR
homocigotos. Además, pocos casos de
scrapie atípico están asociados al haplotipo sensible (VRQ). Del mismo modo, se
ha observado una relación entre el polimorfismo 141 leucina (L)/fenilalanina (F)
y la susceptibilidad a las cepas atípicas
(157).
Ante la imposibilidad de disponer de un
método fiable para el diagnóstico in vivo
de las EET, su control se debe realizar mediante la ejecución de una vigilancia activa y pasiva. Como complemento, el genotipado se utiliza como una herramienta
para pronosticar el riesgo de padecer la
enfermedad. Cuando se detecta un caso
positivo, una vez que se realiza el análisis
de los restantes animales del rebaño, muy
pocos animales son diagnosticados como
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
156
positivos, de forma que el sacrificio masivo de toda la explotación podría ser una
medida desmesurada. Sería preferible
analizar el genotipo de los animales del
rebaño y sacrificar solo a los que posean
una clínica compatible con EET y los que
tengan un genotipo sensible. Los programas de vigilancia basados en el genotipo de los animales se están aplicando en
diversos países y, aunque todavía es un
poco precipitado extraer conclusiones, parecen estar dando resultados alentadores
en el control del scrapie clásico.
Por otro lado, además de los programas
de vigilancia activa y pasiva, distintas
Decisiones de la Comisión Europea se dirigen hacia el establecimiento de programas de mejora enfocados a la selección de una resistencia del ganado ovino
a las EET, junto con la definición de medidas que cabría tomar en caso de ser detectado un foco de scrapie; ambas medidas están basadas principalmente en el
genotipo para el gen PRNP.
Epidemiología y programas de
vigilancia y control de la EEB
y scrapie
Los estudios epidemiológicos llevados a
cabo al inicio de la epidemia de la EEB,
confirmaron que la fuente común de
todos los casos investigados era el uso de
piensos comerciales fabricados con harinas de carne y hueso, por lo que se sospechó que estas eran el principal vehículo
de transmisión de la enfermedad (158).
La aceptación de que la causa inicial de la
EEB era el consumo de piensos contaminados motivó la prohibición en el Reino
Unido en 1988 de alimentar a los rumiantes con harinas procedentes de ru-
miantes. Se asume que el origen de la enfermedad se produjo a consecuencia de
una modificación efectuada a comienzos
de los años 80 en los procesos de transformación de restos de matadero para la
producción de las harinas de carne y
hueso, utilizadas como suplemento de los
piensos destinados a alimentar a animales
de producción. Dicha modificación se produjo en los sistemas de producción utilizados en las plantas transformadoras, que
hasta entonces eran sistemas continuos,
que fueron sustituidos por otros discontinuos o en fases. Asimismo, se suprimió el
uso de solventes orgánicos hidrocarbonados para la separación más eficiente de
la materia grasa de las harinas de carne y
hueso, factor al que se atribuye una gran
transcendencia causal (159), y se llevaron
a cabo cambios en el tratamiento térmico
que muy probablemente impidieron la
inactivación completa del agente causal
de la enfermedad de scrapie en dichos
productos, manteniéndose así una elevada carga infectiva (160). Aunque esta
hipótesis basada en la transmisión de la
enfermedad por harinas de carne y hueso
es la más aceptada, existen otras teorías
diferentes que tratan de explicar su
origen, como las que apuntan la posibilidad de que un nuevo agente, originado
posiblemente por una mutación del gen
PRNP bovino u ovino, fuera el origen de
la EEB.
Hasta julio de 1991, en torno al 70% de
las explotaciones afectadas solo presentaron uno o dos casos de EEB, lo que parece indicar que la dosis de exposición fue
baja. Aun así, se supone que una proporción importante de la cabaña bovina británica (unos 4 millones de adultos) estuvo
expuesta al agente causal desde 1981-
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
157
1982 hasta el verano de 1988, fecha en
que se implantó la prohibición del consumo de proteínas de origen animal. Esto
explica por qué el número de casos de
EEB en el Reino Unido ha sido tan elevado
(159). A partir de 1993, en este mismo
país, el número de animales afectados por
EEB fue decreciendo gracias al descenso
de nuevas infecciones, como consecuencia principalmente de la prohibición
establecida en 1988 de alimentar a los rumiantes con harinas de carne y hueso
(161). Sin embargo, se continuaron detectando varios casos en animales nacidos
tras la prohibición, por la contaminación
de los alimentos para el ganado bovino
con ingredientes que se utilizaban en la
alimentación de otras especies (162). Para
evitar esta contaminación cruzada, en
2001 se prohibió el uso de este tipo de
harinas procedentes de cualquier mamífero para la alimentación animal. No obstante, se han detectado nuevos casos de
EEB en animales nacidos tras esta prohibición y, aunque el origen de la infección
todavía está investigándose, los datos preliminares sugieren que se debe a la importación de alimentos contaminados (163).
Al principio se pensó que el problema
afectaba únicamente al Reino Unido, pero
el paso del tiempo ha demostrado que no
era así. Desde 1990, cada vez fueron más
los países que detectaron casos de la enfermedad, y como resultado del establecimiento en 2001 del Programa de vigilancia de la EEB en la Unión Europea
(Reglamento CE 999/2001), muchos países que se consideraban libres de la enfermedad fueron identificando casos,
aunque el único en el que se ha producido una verdadera epidemia ha sido el
Reino Unido.
Los programas sistemáticos de vigilancia
comunes de las EET llevados a cabo en la
Unión Europea a partir de 2001 se han
centrado en la investigación de casos de
EEB en el ganado vacuno, de scrapie en
el ovino y caprino y, más recientemente,
de la enfermedad crónica caquectizante
en ciervos domésticos y de vida silvestre.
Estos programas se basan en sistemas de
vigilancia pasiva y activa.
La información que se ha obtenido sobre
la epidemiología de este grupo de enfermedades ha sido extraída en buena parte
de los informes anuales que publica la
Comisión Europea (Dirección General
SANCO) sobre los programas de análisis
y monitorización para la detección de la
presencia de las EET en los rumiantes de
la Unión Europea (EU TSE Annual Reports
2010).
En lo que se refiere a los bovinos, el programa de vigilancia ha sido obligatorio
para todos los animales que hubieran superado una determinada edad, que,
según señala la legislación comunitaria,
fue establecida a partir de 2001 en los
animales de más de 30 meses (en España
e Italia 24 meses, por decisión de cada
país), habiéndose procedido a una progresiva elevación de la edad límite de análisis, en la actualidad, entre 48 y 72
meses, dado que en la actualidad la inmensa mayoría de casos se detectan en
animales de más de esa edad.
El programa establece varios grupos diana:
• Bovinos sanos sacrificados en el matadero para consumo humano.
• Bovinos muertos o que se han sacrificado en la explotación o en el transporte. En este caso se establece que los
Estados miembros pueden no llevar a
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
158
cabo la toma de muestras en zonas remotas con una baja densidad de animales, aunque ese grupo de animales
no puede superar el 10% de la población total del país.
• Bovinos que han sido sacrificados de urgencia.
• Bovinos que muestran signos de enfermedad en la inspección ante mortem en
el matadero.
• Bovinos pertenecientes a explotaciones
en las que se ha detectado algún caso
de EEB, bien de la cohorte de edad (nacidos 1 año antes o después del caso de
EEB), de la cohorte de alimentación
(criados junto con el caso de EEB durante el primer año de vida) y cualquier
otro sacrificado por tener un vínculo
epidemiológico con un caso de EEB.
• Bovinos clínicamente sospechosos de
estar afectados de una EET por presentar síntomas compatibles con ella
(Reglamento CE 999/2001, artículo 3) y
sujetos a las medidas que se establecen
en los artículos 12 y 13 de dicha norma.
En cuanto al programa llevado a cabo en
la investigación de una EET en ovinos y
caprinos, se analiza una muestra representativa de la población ovina y caprina
de cada país. En este caso se consideran
los siguientes grupos diana:
• Animales sacrificados para consumo humano, en los que se analiza un mínimo
anual de animales de más de 18 meses.
• Animales que no se sacrifican para consumo humano, grupo constituido por
los muertos en la explotación, los sacrificados de urgencia y los que presentan
signos de enfermedad en la inspección
ante mortem. El muestreo, constituido
por animales de más de 18 meses, tiene
que cubrir unos mínimos.
• Animales sacrificados a consecuencia de
las actuaciones que se llevan a cabo
para erradicar la enfermedad en rebaños con casos detectados de EET.
• Animales clínicamente sospechosos de
estar afectados de una EET por presentar síntomas compatibles con ella.
Recientemente, y para dar cumplimiento a
lo establecido en la Decisión 2007/182/EC,
de 19 marzo de 2007, se ha establecido
un programa de vigilancia para detectar los
casos de encefalopatía crónica y caquectizante en cérvidos domésticos y silvestres,
que incluye diferentes especies y grupos.
El establecimiento de programas de vigilancia en otras especies es voluntario por
parte de los Estados miembros de la UE.
El muestreo y la analítica en el caso de la
vigilancia activa se han llevado a cabo mediante la toma de fragmentos de tejido
nervioso procedente de la médula oblongada y su análisis mediante los test rápidos
autorizados por la CE (Reglamento CE
999/2001). La confirmación de los casos
positivos o no concluyentes de la vigilancia
activa y la de los animales sospechosos se
realiza mediante estudios histopatológicos,
inmunocitoquímicos, con un immunoblotting o mediante la demostración de las
fibrillas SAF con microscopía electrónica.
Además, la discriminación entre EEB y
scrapie es obligatoria desde junio de 2005
(Reglamento CE 36/2005). Los procedimientos utilizados se basan en test de immunoblotting, inmunocitoquímica o ELISA.
Adicionalmente, ciertas muestras deben someterse a pruebas de bioensayo en ratones.
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
159
Finalmente, se lleva cabo un programa de
genotipado en ovinos, como ya se ha citado antes, mediante el muestreo y análisis del genotipo del gen PRNP. Este debe
realizarse en todos los ovinos afectados
de scrapie y en una muestra de ovinos
mayores de 18 meses de edad.
Los últimos datos sobre los resultados del
programa de vigilancia y monitorización
de la EEB publicados por la Comisión
Europea corresponden al año 2010. En lo
que se refiere al muestreo, se estima que
desde 2001 se han analizado en la Unión
Europea alrededor de 96 millones de vacunos. La mayoría de los análisis se llevaron a cabo en la población de animales
sacrificados para consumo humano (en
torno al 80% de media). Alrededor del
5% del total de los análisis de la UE se
han realizado en España.
A la hora de valorar los casos de EEB detectados en la UE, hay que tener en cuenta
que el programa de vigilancia activa comenzó a aplicarse en 2001, en concreto a
partir del mes de julio de ese año. Existe
una clara diferencia entre el tipo de vigilancia aplicado en el Reino Unido y el del
resto de la UE. De hecho, la mayoría de los
casos del Reino Unido han sido detectados
a través de la sospecha clínica (vigilancia
pasiva), a diferencia de lo ocurrido en los
demás países de la UE, en los que la mayoría de casos se han identificado mediante el sistema de vigilancia activa.
Tras la aparición de los primeros casos de
EEB en 1987 en el Reino Unido, donde se
registraron cifras crecientes hasta alcanzar
un máximo de casos en 1992, en que se
diagnosticaron 37.280 en todo el país, la
incidencia de casos anuales comenzó a
decrecer progresivamente como conse-
cuencia de la medida adoptada por las
autoridades británicas en junio de 1988,
en que deciden prohibir el uso de harinas
de carne y hueso de origen rumiante para
la elaboración de piensos destinados al
consumo bovino.
En 1989 se describen los primeros casos
en la República de Irlanda, en 1990 en
Portugal y Suiza, en 1991 en Francia y en
1992 en Alemania y Dinamarca. A partir
de ese año siguen incorporándose nuevos
países de dentro y fuera de la UE a la lista
de países afectados. Como ya se ha indicado, el país que ha registrado un número
más elevado de casos en términos absolutos ha sido el Reino Unido. En otros
países también se ha producido un número apreciable de casos, aunque las cifras son muy inferiores a las del Reino
Unido: Irlanda, Portugal, Francia, España,
Suiza y Alemania. Sin embargo, la mayoría de ellos cuentan con los censos de
bovino de más de 2 años de edad más
elevados de la UE.
Desde 2001 se observa una clara tendencia a la disminución del número de
casos en el conjunto de la UE. La tasa de
incidencia anual de casos de EEB (número de casos autóctonos por millón de
bovinos de más de 24 meses de edad) en
los países del mundo que han registrado
casos ha experimentado amplias variaciones, dependiendo de las fechas de
aplicación de las medidas de lucha
contra la enfermedad y, muy en particular, de la aplicación de la medida clave
de prohibir la utilización de las harinas
de carne y hueso de origen animal para
la alimentación del ganado bovino. Estas
cifras las facilita la Organización Mundial
de la Sanidad Animal (www.oie.int) a
partir de la información suministrada por
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
160
los distintos países. En el Reino Unido, el
país que ha presentado la epizootía más
destacada, en el que se registraron los
primeros casos de EEB y en el que primero se aplicaron las medidas para reducir el número de casos, la tasa de incidencia anual de casos comienza a
decrecer a partir de 1993, tendencia que
se ha mantenido hasta la actualidad. En
España, la tasa de incidencia máxima de
casos se produce en 2003 y comienza a
disminuir a partir de 2004, en una tendencia que se ha mantenido de forma
continuada hasta la actualidad. Portugal,
Irlanda, España y Reino Unido son los
países de la UE que presentan las prevalencias más altas.
La prevalencia de la enfermedad (ratio de
casos positivos de EEB por 10.000 ani-
males analizados) en los 27 países de la
UE se ha ido reduciendo año tras año, independientemente de que el número de
análisis realizados se haya incrementado
o haya permanecido estable. Esa reducción progresiva se ha observado en los
principales grupos diana de población, es
decir, tanto en animales sacrificados para
consumo como en los grupos de riesgo.
La mayoría de los positivos se detectan
cada año en los meses de otoño e invierno (en verano y primavera el número
es menor).
Por todo lo comentado, puede afirmarse
que en el conjunto de la Unión Europea,
y en particular en los 15 países previos a
la incorporación de los 12 últimos, aunque
el número de análisis realizado a partir de
2001 se ha mantenido estable (figura 5),
12.000.000
10.996.023 11.057.727
10.425.549
10.123.880 10.113.914
10.000.000
10.051.735
9.728.273
8.487.675
8.000.000
7.528.862
7.504.787
2009
2010
6.000.000
4.000.000
2.000.000
0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
Figura 5. Número de análisis realizados anualmente en el periodo 2001-2010 en la UE (EU. DG Health &
Consumers).
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
161
es evidente que se ha producido una reducción gradual de la incidencia (figura 6)
y la prevalencia (figura 7) de la EEB. Otra
conclusión que cabe extraer es que la capacidad de detección precisa de casos
está claramente relacionada con la im-
2500
2.167
2.124
2000
1500
1.376
1000
865
561
500
320
175
0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
125
67
45
2008
2009
2010
Figura 6. Evolución del número de casos positivos de EEB en la UE desde 2001 (EU. DG Health & Consumers).
3,00
2,50
2,55
2,04
2,00
1,50
1,25
1,00
0,78
0,55
0,50
0,32
0,18
0,00
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
0,12
0,09
0,06
2008
2009
2010
Figura 7. Evolución de la prevalencia de casos positivos de EEB en los animales analizados en la UE desde 2001
(EU. DG Health & Consumers).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
162
en los bovinos de los 12 países de más
reciente incorporación a la UE. Esa distribución característica de los casos de
EEB se observa también en las dos principales poblaciones vacunas analizadas
(animales sacrificados para consumo y
animales de riesgo) en la UE en el periodo 2001-2008. Todo ello indica sin
duda que las medidas adoptadas, y particularmente la prohibición del consumo
por los bovinos de piensos elaborados
con harinas de carne y hueso, han sido
realmente efectivas.
plantación generalizada de la vigilancia
activa en el año 2001.
Otra cuestión de interés es la distribución
de los casos de EEB por edades en los
países de la UE. De hecho, un fenómeno
general y claramente apreciable en el
conjunto de los 15 países iniciales de la
UE es la tendencia a detectar los casos
de EEB en animales de edad cada vez
mayor y, recíprocamente, la reducción
progresiva del número de casos de EEB
en animales jóvenes (figura 8). Este
hecho no es tan claramente observable
180
160
140
120
100
80
60
2001
2002
2003
2004
2005
Healthy slaughtere
2006
2007
2008
2009
2010
Risk animals
Figura 8. Edad media (en meses) de los casos positivos de EEB detectados de la UE en el periodo 2001-2010 en
poblaciones bovinas sacrificadas para consumo (marrón) y de riesgo (azul) (EU. DG Health & Consumers).
Un dato importante es conocer el grado
de cumplimiento de la medida de prohibición del uso de harinas de carne y
hueso en la fabricación de piensos. Para
ello resulta relevante conocer la distribución de los casos de EEB en la UE según
el año de nacimiento (figura 9). De
acuerdo con la información proporcio-
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
163
1000
160
900
140
800
120
700
600
100
500
80
400
60
300
Irlanda
Reino Unido
Francia
Alemania
España
Italia
Holanda
2004
2002
2001
2000
1999
1998
1997
1996
1995
1994
1993
1992
1991
1990
2004
2003
2002
2001
2000
1999
1998
1997
1996
1995
1994
1993
1992
0
1991
0
1990
20
<1990
100
<1990
40
200
Portugal
Figura 9. Distribución de los casos de EEB detectados en el periodo 2001 a 2010 por año de nacimiento en ocho
países de la UE (EU. DG Health & Consumers).
nada por los Estados miembros de la UE,
esta distribución es variable e indica el
grado de uso de harinas de carne y
hueso contaminadas de la alimentación
bovina de cada país y el cumplimiento de
las prohibiciones de su utilización.
El Reino Unido y Portugal registraron el
mayor porcentaje de casos entre 1993 y
1995, aunque Portugal registró otro
pico de casos en 1996-1997, Francia e
Irlanda en 1994-1996, Alemania, Italia
y Holanda en 1995-1997, y España en
1995-1999. El número de casos de EEB
en animales nacidos después de la
prohibición definitiva y generalizada del
uso de harinas de carne y hueso en la
alimentación bovina en 2001 ha sido
bajo (35 en 2001, 15 en 2002, 10 en
2003, 7 en 2004 y 1 en 2005). Ello indica que la medida ha sido efectiva,
aunque existen diferencias por países
según las distintas fechas de aplicación
de la prohibición, sobre todo entre los
que la aplicaron con anterioridad a 2001
y los 12 países que se incorporaron a la
UE después de 2001.
Un dato relevante es que, a partir de
2006, se han detectado muy pocos animales con EEB, y entre ellos, solo dos tenían menos de 48 meses. Esta es la razón
por la que se ha decidido elevar la edad
límite de análisis a los 4 o 6 años. Otro
dato importante es que solo tres animales
tenían menos de 30 meses; dos de ellos
se detectaron en 2001 y uno en 2007.
Los primeros casos de EEB en España
fueron diagnosticados a finales de 2000 en
el Centro Nacional de Referencia de las EET
de Zaragoza en dos vacas de Galicia, mediante el sistema de vigilancia pasiva. Una
de ellas, confirmada el 22 de noviembre de
2000, procedía del municipio de Carballedo
(Lugo), había nacido el 30 de mayo de
1995 y era de raza cruzada. La segunda,
confirmada en diciembre del mismo año y
procedente del municipio de Coristanco (A
Coruña), había nacido en septiembre de
1995 y era de raza Fleckwich (164). A principios de 2001, en consonancia con lo establecido por la legislación europea, se introduce en España el sistema de vigilancia
activa (RD 3454/2000). A partir de ese año
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
164
de Sanidad de la Producción Agraria del
Ministerio del Agricultura, Alimentación y
Medio Ambiente (www.eeb.es), y en los facilitados periódicamente a la CE y la OIE.
y en los siguientes, comenzaron a detectarse nuevos casos en todas las comunidades autónomas, aunque con especial frecuencia en algunas de ellas. Los datos de
las analíticas realizadas a partir de ese año
y sus resultados constan en los informes
epidemiológicos anuales sobre las EET en
España publicados por la Dirección General
El número de focos de EEB detectados en
España desde el año 2000 hasta finales
de 2011 ha sido de 783. El número mayor
se registró en el año 2003 (figura 10).
N.º focos/año
200
167
150
137
127
98
100
82
68
50
39
25
0
18
13
2009
2010
2
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
Figura 10. Distribución anual de los focos de EEB detectados en España en el periodo 2001 a 2010 (Ministerio
de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).
El número de análisis realizados desde
2001 hasta la actualidad se ha mante-
nido relativamente constante (figura
11).
Número de test
700.000
600.000
578.125
546.056 567.366
621.818
539.856
500.000
400.000
524.543
468.168
466.833
424.943
386.588
300.000
200.000
100.000
0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
Figura 11. Distribución anual de los test realizados para la detección de la EEB en el periodo 2001 a 2010 (Ministerio
de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
165
Como se hizo referencia con anterioridad, los animales afectados de EEB en
España habían nacido mayoritariamente
entre los años 1995 y 1999 (figura 12).
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Nacimiento casos
Casos detectados
Figura 12. Distribución anual de los casos de EEB detectados en España y su relación con los años de nacimiento
en el periodo 2001 a 2010 (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).
En relación con la distribución geográfica de los focos de EEB en España, la
mayoría de casos se concentran fundamentalmente en la mitad noroccidental
del país, coincidiendo con el área de
mayor densidad de vacuno de más de 2
años de edad (Galicia, Castilla y León,
Asturias, Cataluña, Cantabria, Baleares
y Extremadura) (figura 13). Galicia y
Castilla y León han reunido cerca de los
dos tercios de los casos registrados en
España. Se han observado algunas concentraciones de casos en ciertas comarcas o zonas concretas, como el occidente de A Coruña, la Tierra Llana de
Lugo, el occidente de Asturias, el norte
de Navarra y Cataluña, Menorca y a lo
largo de la carretera nacional 630. Al
principio la mayoría de los casos se detectaban en vacas más jóvenes (media de
6,4-6,8 en 2001-2003), para progresivamente detectarse en animales mayores
(media de 9,1 y 10,25 en 2007 y 2008),
de forma similar a lo ocurrido en otros
países de la UE. En lo que respecta a la
raza y tipo de producción, la gran mayoría de los casos de EEB se han registrado en vacunos de leche, en concreto
de raza frisona y en animales mestizos.
Y en cuanto a la incidencia en las distintas poblaciones de riesgo, al inicio se
detectó un número importante en animales sacrificados para el consumo humano en el matadero, y gradualmente
se han diagnosticado mayoritariamente
en la población de animales de riesgo.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
166
Figura 13. Distribución provincial de los focos de EEB detectados en España en el periodo 2001 a 2011 (Ministerio
de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).
Respecto al programa de vigilancia del
scrapie, se establece no tanto por el
riesgo para la seguridad alimentaria que
podía suponer el agente del scrapie, ya
que hasta ahora no ha sido demostrado,
sino por la sospecha de la posible transmisión del agente de la EEB al ganado
ovino y caprino, a través del consumo de
alimentos elaborados con harinas de
carne y hueso contaminadas. De hecho,
se sabe que los ovinos y caprinos son receptivos al agente bovino, lo que ha sido
demostrado experimentalmente. El sistema de vigilancia llevado a cabo en la UE
en el caso del scrapie ovino y caprino ha
sido muy similar al utilizado para la vigilancia de la EEB. Las diferencias esenciales
son que, en este caso, el programa de vi-
gilancia activa se implantó en 2002, y que
no es obligatorio para toda la población
ovina y caprina, sino para una muestra representativa de ella (distintas razas, sistemas de producción, estaciones del
año...). Los métodos de análisis son similares a los utilizados para el ganado vacuno. La cifra de animales analizados en
la UE se incrementó sustancialmente a
consecuencia de la introducción de la vigilancia activa en 2002, ya que con anterioridad el sistema mayoritario de análisis
era la vigilancia pasiva. La población diana
en la que se ha llevado a cabo el mayor
número de análisis ha sido la de los animales sacrificados para consumo humano. El número de muestras analizadas
se reduce significativamente en 2008,
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
167
como consecuencia de la introducción en
julio de 2007 del Reglamento (EC)
727/2007, que enmienda los programas
de monitorización de las EET en los pequeños rumiantes.
La incidencia y prevalencia de casos de
scrapie ha sido superior en el ovino que en
el caprino. Se han detectado casos en la
mayoría de los países de la UE, aunque se
ha registrado un mayor número de casos
por 10.000 ovinos analizados en los animales sacrificados para consumo humano
en Chipre, Eslovenia, Grecia, Eslovaquia y
Holanda (figura 14). En la población de animales de riesgo, los países con cifras más
elevadas fueron Chipre, Grecia, Rumania,
Italia y Reino Unido (figura 15).
1.000
382,3
100
32,5
24,2
16,0
10,5
10
7,2
5,9
9,8
5,6
3,7
3,2
2,7
3,4
2,1
1,8
1
6,6
5,6 6,2
9,0
0,9
0,0
0,0 0,0 0,0
BE BG CZ DK DE EE EL ES FR iE
0,0
1,0
0,0
IT CY LV LT LU HU MT NL AT PL PT RO SI SK FI SE UK NO
Figura 14. Prevalencia de casos de scrapie en ovinos sacrificados para consumo en los países miembros de la UE
en el periodo 2002-2010 (EU. DG Health & Consumers).
10.000
1.190,4
1.000
187,2
100
64,5
39,9
21,8
19,1
10
7,7
6,6
13,0
12,8
10,9
5,2
5,2
3,7
3,1
1,5
1
1,5
BE BG CZ DK DE EE EL ES FR iE
0,0 0,0 0,0
0,0
26,8
19,119,2
10,5
8,0
4,1
0,0
IT CY LV LT LU HU MT NL AT PL PT RO SI SK FI SE UK NO
Figura 15. Prevalencia de casos de scrapie en animales de riesgo en los países miembros de la UE en el periodo
2002-2010 (EU. DG Health & Consumers).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
168
La prevalencia de esta enfermedad en las
dos principales poblaciones diana (animales sacrificados para consumo y animales de riesgo) fue significativamente
superior en los animales de riesgo que en
los destinados a consumo humano.
Respecto a la edad de presentación de los
casos, la mayoría de los diagnosticados en
el periodo 2000-2008 tenían entre 18 y
60 meses (figura 16).
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
< 12
2002
12-23
2003
24-35
2004
36-47
2005
48-59
2006
2007
60-71
2008
72-83
2009
84-95
> 95
2010
Figura 16. Evolución de la distribución de la edad de los casos de scrapie en la UE y Noruega en el periodo 20022010 (EU. DG Health & Consumers).
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
< 12
Atypica
12-23
24-35
36-47
48-59
60-71
72-83
84-95
> 95
Others
Figura 17. Comparación de las edades medias de aparición de casos de scrapie clásico y atípico en la UE en el periodo 2002-2010 (EU. DG Health & Consumers)
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
169
Se han detectado casos de scrapie atípico
en varios países miembros de la UE, llegando a representar en algunos de ellos un
número importante respecto al total de
casos. En cuanto a la edad de presentación,
los casos de scrapie atípico se diagnosticaron en animales de mayor edad (figura
17). Tras aplicar los test discriminatorios,
que permiten diferenciar el agente de la
EEB del agente del scrapie en los pequeños
rumiantes en los casos en que se ha diagnosticado una EET, en 2008 no se detectó
ninguno positivo, aunque hubo 10 animales que ofrecieron resultados no concluyentes (nueve ovinos y un caprino).
Bibliografía
1. Prusiner SB. Novel proteinaceous infectious
particles cause scrapie. Science 1982; 216
(4.542):136-44.
2. Prusiner SB. Prions. Proc Natl Acad Sci USA
1998; 95(23):13.363-83.
3. Prusiner SB. The prion diseases. Brain Pathol
1998; 8(3):499-513.
4. Alper T, Cramp WA, Haig DA, Clarke MC.
Does the agent of scrapie replicate without
nucleic acid? Nature 1967; 214(5090):764-6.
5. Weissmann C. A unified theory of prion propagation. Nature 1991; 352(6.337):679-83.
6. Aiken JM, Williamson JL, Marsh RF. Evidence
of mitochondrial involvement in scrapie infection. J Virol 1989; 63(4):1.686-94.
7. Manuelidis L. A 25 nm virion is the likely
cause of transmissible spongiform encephalopathies. J Cell Biochem 2007;
100(4):897-915.
8. Griffith JS. Self-replication and scrapie.
Nature 1967; 215(5.105):1.043-4.
9. Pan KM, Baldwin M, Nguyen J, Gasset M,
Serban A, Groth D, Mehlhorn I, Huang Z,
Fletterick RJ, Cohen FE, et al. Conversion of
alpha-helices into beta-sheets features in the
formation of the scrapie prion proteins. Proc
Natl Acad Sci USA 1993; 90(23):10.962-6.
10. Zhang H, Kaneko K, Nguyen JT, Livshits TL,
Baldwin MA, Cohen FE, James TL, Prusiner
SB. Conformational transitions in peptides
containing two putative alpha-helices of
the prion protein. J Mol Biol 1995;
250(4):514-26.
11. Chesebro B, Race R, Wehrly K, Nishio J,
Bloom M, Lechner D, Bergstrom S, Robbins
K, Mayer L, Keith JM, et al. Identification of
scrapie prion protein-specific mRNA in
scrapie-infected and uninfected brain.
Nature 1985; 315(6.017):331-3.
12. Oesch B, Westaway D, Walchli M,
McKinley MP, Kent SB, Aebersold R, Barry
RA, Tempst P, Teplow DB, Hood L E, et al.
A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30
protein. Cell 1985; 40(4):735-46.
13. Prusiner SB, Scott MR. Genetics of prions.
Annu Rev Genet 1997; 31:139-75.
14. Kretzschmar HA, Stowring LE, Westaway D,
Stubblebine WH, Prusiner SB, Dearmond SJ.
Molecular cloning of a human prion protein
cDNA. DNA 1986; 5(4):315-24.
15. Lowenstein DH, Butler DA, Westaway D,
McKinley MP, DeArmond SJ, Prusiner SB.
Three hamster species with different
scrapie incubation times and neuropathological features encode distinct prion
proteins. Mol Cell Biol 1990; 10
(3):1.153-63.
16. Locht C, Chesebro B, Race R, Keith JM.
Molecular cloning and complete sequence
of prion protein cDNA from mouse brain
infected with the scrapie agent. Proc Natl
Acad Sci USA 1986; 83(17):6.372-6.
17. Liao YC, Tokes Z, Lim E, Lackey A, Woo
CH, Button JD, Clawson GA. Cloning of
rat prion-related protein cDNA. Lab Invest
1987; 57(4):370-4.
18. Goldman W, Hunter N, Multhaup G,
Salbalm J, Foster D, Beyreuther K, Hope J.
The PrP gene in natural scrapie. Alzheimer
Disease and Associated Disorders 1988; 330.
19. Westaway D, Cooper C, Turner S, Da Costa
M, Carlson GA, Prusiner SB. Structure and
polymorphism of the mouse prion protein
gene. Proc Natl Acad Sci USA 1994;
91(14):6.418-22.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
170
20. McKnight S, Tjian R. Transcriptional selectivity of viral genes in mammalian cells.
Cell 1986; 46(6):795-805.
21. Weber S, Dorman DC, Lash LH, Erikson K,
Vrana KE, Aschner M. Effects of manganese
(Mn) on the developing rat brain: oxidativestress related endpoints. Neurotoxicology
2002; 23(2):169-75.
22. Lasmezas CI. The transmissible spongiform
encephalopathies. Rev Sci Tech 22(1):23-36.
2003.
23. Organización Internacional de Epizootias.
Manual of standards for diagnostic tests
and vaccines. 2008.
24. Gavier-Widén D, Stack MJ, Baron T,
Balachandran A, Simmons M. Diagnosis of
transmissible spongiform encephalopathies in animals: a review. J Vet Diagn Invest
2005; 17(6):509-27.
25. Wells GA, Wilesmith JW. The neuropathology and epidemiology of bovine spongiform encephalopathy. Brain Pathol 1995;
5(1):91-103.
26. Wells GA, McGill IS. Recently described
scrapie-like encephalopathies of animals:
case definitions. Res Vet Sci 1992;
53(1):1-10.
27. Ligios C, Jeffrey M, Ryder SJ, Bellworthy
SJ, Simmons MM. Distinction of scrapie
phenotypes in sheep by lesion profiling. J
Comp Pathol 2002; 127(1):45-57.
28. Wells GA, Wilesmith JW, McGill IS. Bovine
spongiform encephalopathy: a neuropathological perspective. Brain Pathol 1991;
1(2):69-78.
29. Wells GA, Hancock RD, Cooley WA,
Richards MS, Higgins RJ, David GP. Bovine
spongiform encephalopathy: diagnostic
significance of vacuolar changes in selected nuclei of the medulla oblongata.
Vet Rec 1989; 125(21):521-4.
30. Detwiler LA. Scrapie. Rev Sci Tech 1992;
11(2):491-537.
31. Wood JL, McGill IS, Done SH, Bradley R.
Neuropathology of scrapie: a study of the
distribution patterns of brain lesions in
222 cases of natural scrapie in sheep,
1982-1991. Vet Rec 1997; 140(7):167-74.
32. Begara-McGorum I, González L,
Simmons M, Hunter N, Houston F, Jeffrey
M. Vacuolar lesion profile in sheep
scrapie: factors influencing its variation
and relationship to disease-specific PrP
accumulation. J Comp Pathol 2002;
127(1):59-68.
33. Begara-McGorum I, Clark AM, Martin S,
Jeffrey M. Prevalence of vacuolar lesions
consistent with scrapie in the brains of healthy cull sheep of the Shetland Islands.
Vet Rec 2000; 147(16):439-41.
34. Hamir AN, Miller JM, Schmerr MJ, Stack
MJ, Chaplin MJ, Cutlip RC. Diagnosis of
preclinical and subclinical scrapie in a naturally infected sheep flock utilizing currently available post-mortem diagnostic
techniques. J Vet Diagn Invest 2001;
13(2):152-4.
35. Benestad SL, Sarradin P, Thu B, Schonheit
J, Tranulis MA, Bratberg B. Cases of
scrapie with unusual features in Norway
and designation of a new type, Nor98. Vet
Rec 2003; 153(7):202-8.
36. Lühken G, Buschmann A, Brandt H, Eiden
M, Groschup MH, Erhardt G.
Epidemiological and genetical differences
between classical and atypical scrapie
cases. Vet Res 2007; 38(1):65-80.
37. McGill IS, Wells GA. Neuropathological findings in cattle with clinically suspect but
histologically unconfirmed bovine spongiform encephalopathy (BSE). J Comp Pathol
1993; 108(3):241-60.
38. Gavier-Widen D, Wells GA, Simmons MM,
Wilesmith JW, Ryan J. Histological observations on the brains of symptomless 7year-old cattle. J Comp Pathol 2001;
124(1):52-9.
39. Schreuder BE, Van Keulen LJ, Smits MA,
Langeveld JP, Stegeman JA. Control of
scrapie eventually possible? Vet Q 1997;
19(3):105-13.
40. Wells GA, Wells M. Neuropil vacuolation
in brain: a reproducible histological processing artefact. J Comp Pathol 1989;
101(4):355-62.
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
171
41. Jeffrey M. A neuropathological survey of
brains submitted under the Bovine
Spongiform Encephalopathy Orders in
Scotland. Vet Rec 1992; 131(15):332-7.
42. Wells GA. Pathogenesis of BSE. Vet Res
Commun 2003; 27(Suppl. 1): 25-8.
43. Summers BA, Cummings JF, Lahunta A.
Veterinary Neuropathology. Eds. Summers
BA, Cummings JF, Lahunta A. St Louis:
Mosby, 1995.
44. Lazarini F, Boussin F, Deslys JP, Tardy M,
Dormont D. Astrocyte gene expression in
experimental mouse scrapie. J Comp
Pathol 1994; 111(1):87-98.
45. Rezaie P, Lantos PL. Microglia and the pathogenesis of spongiform encephalopathies. Brain Res Brain Res Rev 2001;
35(1):55-72.
46. Titeux M, Galou M, Gomes FC, Dormont
D, Neto VM, Paulin D. Differences in the
activation of the GFAP gene promoter by
prion and viral infections. Brain Res Mol
Brain Res 2002; 109(1-2):119-27.
47. Ye X, Scallet AC, Kascsak RJ, Carp RI.
Astrocytosis and amyloid deposition in
scrapie-infected hamsters. Brain Res 1998;
809(2):277-87.
48. Andréoletti O, Berthon P, Levavasseur E,
Marc D, Lantier F, Monks E, Essen JM,
Schelcher F. Phenotyping of protein-prion
(PrPsc)-accumulating cells in lymphoid and
neural tissues of naturally scrapie-affected
sheep by double-labeling immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 2002;
50(10):1.357-70.
49. Jeffrey M, Halliday WG, Goodsir CM. A
morphometric and immunohistochemical
study of the vestibular nuclear complex in
bovine spongiform encephalopathy. Acta
Neuropathol (Berl) 1992; 84(6):651-7.
protein deposition and vacuolation in the olivary nuclear complex, the dorsal vagal nucleus and the hypoglossal nucleus in BSE-affected cattle. 21st Annual Meeting of the
European Society of Veterinary Pathology.
Dublin. 2003; 109.
52. McBride PA, Bruce ME, Fraser H.
Immunostaining of scrapie cerebral amyloid
plaques with antisera raised to scrapie-associated fibrils (SAF). Neuropathol Appl
Neurobiol 1988; 14(4):325-36.
53. Jeffrey M, Goodsir CM, Holliman A,
Higgins RJ, Bruce ME, McBride PA, Fraser
JR. Determination of the frequency and
distribution of vascular and parenchymal
amyloid with polyclonal and N-terminalspecific PrP antibodies in scrapie-affected
sheep and mice. Vet Rec 1998;
142(20):534-7.
54. Glatzel M, Aguzzi A. The shifting biology
of prions. Brain Res Brain Res Rev 2001;
36(2-3):241-8.
55. Ferrer I. Neuropatología de las encefalopatías espongiformes transmisibles en el
ser humano. Med Clin (Barc) 2002;
119(1):44-51.
56. Wood JL, Done SH. Natural scrapie in
goats: neuropathology. Vet Rec 1992;
131(5):93-6.
57. DeArmond SJ, Prusiner SB. The neurochemistry of prion diseases. J Neurochem
1993; 61(5):1.589-601.
58. Jeffrey M, Martin S, Barr J, Chong A, Fraser
JR. Onset of accumulation of PrPres in murine ME7 scrapie in relation to pathological
and PrP immunohistochemical changes. J
Comp Pathol 2001; 124(1):20-8.
59. Taylor DM. Inactivation of transmissible degenerative encephalopathy agents: A review. Vet J 2000; 159(1):10-7.
50. Jeffrey M, Halliday WG. Numbers of neurons in vacuolated and non-vacuolated
neuroanatomical nuclei in bovine spongiform encephalopathy-affected brains. J
Comp Pathol 1994; 110(3):287-93.
60. Miller JM, Jenny AL, Taylor WD, Marsh RF,
Rubenstein R, Race RE. Immunohistochemical detection of prion protein in
sheep with scrapie. J Vet Diagn Invest 1993;
5(3):309-16.
51. Breslin PD, Bassett HF, Mc Elroy M, Markey
B. A study of cell population changes, prion
61. Foster JD, Wilson M, Hunter N.
Immunolocalisation of the prion protein
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
172
(PrP) in the brains of sheep with scrapie.
Vet Rec 1996; 139(21):512-5.
62. Monleón E, Monzón M, Hortells P, Vargas
A, Badiola JJ. Detection of PrP(sc) in samples presenting a very advanced degree of
autolysis (BSE liquid state) by immunocytochemistry. J Histochem Cytochem 2003;
51(1):15-8.
63. Hardt M, Baron T, Groschup MH. A comparative study of immunohistochemical methods for detecting abnormal prion protein
with monoclonal and polyclonal antibodies.
J Comp Pathol 2000; 122(1):43-53.
64. Ryder SJ, Spencer YI, Bellerby PJ, March
SA. Immunohistochemical detection of PrP
in the medulla oblongata of sheep: the
spectrum of staining in normal and
scrapie-affected sheep. Vet Rec 2001;
148(1):7-13.
65. Haritani M, Spencer YI, Wells GA.
Hydrated autoclave pretreatment enhancement of prion protein immunoreactivity
in formalin-fixed bovine spongiform encephalopathy-affected
brain. Acta
Neuropathol (Berl) 1994; 87(1):86-90.
66. González L, Martin S, Jeffrey M. Distinct
profiles of PrP(d) immunoreactivity in the
brain of scrapie- and BSE-infected sheep:
implications for differential cell targeting
and PrP processing. J Gen Virol 2003;
84(Pt. 5):1.339-50.
67. O'Rourke KI, Baszler TV, Miller JM, Spraker
TR, Sadler-Riggleman I, Knowles DP.
Monoclonal antibody F89/160.1.5 defines
a conserved epitope on the ruminant prion
protein. J Clin Microbiol 1998;
36(6):1.750-5.
68. González L, Martin S, Begara-McGorum I,
Hunter N, Houston F, Simmons M, Jeffrey
M. Effects of agent strain and host genotype on PrP accumulation in the brain
of sheep naturally and experimentally affected with scrapie. J Comp Pathol 2002;
126(1):17-29.
69. Bell JE, Gentleman SM, Ironside JW,
McCardle L, Lantos PL, Doey L, Lowe J,
Fergusson J, Luthert P, McQuaid S, Allen
IV. Prion protein immunocytochemistry -
UK five centre consensus report.
Neuropathol Appl Neurobiol 1997;
23(1):26-35.
70. Monleón E, Monzón M, Hortells P, Vargas
A, Acín C, Badiola JJ. Detection of PrPsc
on lymphoid tissues from naturally affected scrapie animals: comparison of
three visualization systems. J Histochem
Cytochem 2004; 52(2):145-51.
71. Jeffrey M, González L. Classical sheep
transmissible spongiform encephalopathies: pathogenesis, pathological phenotypes and clinical disease. Neuropathol
Appl Neurobiol 2007; 33(4):373-94.
72. Schreuder BE, Van Keulen LJ, Vromans ME,
Langeveld JP, Smits MA. Tonsillar biopsy and
PrPSc detection in the preclinical diagnosis
of scrapie. Vet Rec 1998; 142(21):564-8.
73. O'Rourke KI, Duncan JV, Logan JR,
Anderson AK, Norden DK, Williams ES,
Combs BA, Stobart RH, Moss GE, Sutton
DL. Active surveillance for scrapie by third
eyelid biopsy and genetic susceptibility testing of flocks of sheep in Wyoming. Clin
Diagn Lab Immunol 2002; 9(5):966-71.
74. Monleón E, Monzón M, Hortells P, Bolea
R, Acín C, Vargas F, Badiola JJ. Approaches
to Scrapie diagnosis by applying immunohistochemistry and rapid tests on central nervous and lymphoreticular systems.
J Virol Methods 2005; 125(2):165-71.
75. Langeveld JP, Jacobs JG, Erkens JH, Bossers
A, Van Zijderveld FG, Van Keulen LJ. Rapid
and discriminatory diagnosis of scrapie
and BSE in retro-pharyngeal lymph nodes
of sheep. BMC Vet Res 2006; 2:19.
76. González L, Dagleish MP, Martin S, Dexter
G, Steele P, Finlayson J, Jeffrey M.
Diagnosis of preclinical scrapie in live
sheep by the immunohistochemical examination of rectal biopsies. Vet Rec 2008;
162(13):397-403.
77. González L, Jeffrey M, Sisó S, Martin S,
Bellworthy SJ, Stack MJ, Chaplin MJ, Davis
L, Dagleish MP, Reid HW. Diagnosis of preclinical scrapie in samples of rectal mucosa. Vet Rec 2005; 156(26):846-7.
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
173
78. Espenes A, Press CM, Landsverk T, Tranulis
MA, Aleksandersen M, Gunnes G,
Benestad SL, Fuglestveit R, Ulvund MJ.
Detection of PrP(Sc) in rectal biopsy and
necropsy samples from sheep with experimental scrapie. J Comp Pathol 2006;
134(2-3):115-25.
79. Dennis MM, Thomsen BV, Marshall KL,
Hall SM, Wagner BA, Salman MD,
Norden DK, Gaiser C, Sutton DL.
Evaluation of immunohistochemical detection of prion protein in rectoanal mucosa-associated lymphoid tissue for diagnosis of scrapie in sheep. Am J Vet Res
2009; 70(1):63-72.
80. Deslys JP, Lasmezas CI, Comoy E, Domont
D. Diagnosis of bovine spongiform encephalopathy. Vet J 2001; 161(1):1-3.
81. Meyer RK, McKinley MP, Bowman KA,
Braunfeld MB, Barry RA, Prusiner SB.
Separation and properties of cellular and
scrapie prion proteins. Proc Natl Acad Sci
USA 1986; 83(8):2.310-4.
82. Bradley R. Protocols for the laboratory diagnosis and confirmation of BSE and Scrapie.
Comisión Europea. Directorate General for
Aggriculture. Unit for Veterinary Legislation
and Zootechnics 1994.
83. Madec JY, Groschup MH, Buschmann A,
Belli P, Calavas D, Baron T. Sensitivity of the
Western blot detection of prion protein
PrPres in natural sheep scrapie. J Virol
Methods 1998; 75(2):169-77.
84. Mohri S, Farquhar CF, Somerville RA, Jeffrey
M, Foster J, Hope J. Immunodetection of a
disease specific PrP fraction in scrapie-affected sheep and BSE-affected cattle. Vet
Rec 1992; 131(23):537-9.
85. Katz JB, Pedersen JC, Jenny AL, Taylor WD.
Assessment of western immunoblotting
for the confirmatory diagnosis of ovine
scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE). J Vet Diagn Invest 1992;
4(4):447-9.
86. Race RE, Ernst D, Sutton D. Severe autolysis does not prevent scrapie diagnosis
in sheep. J Vet Diagn Invest 1994;
6(4):486-9.
87. Cooley WA, Davis LA, Keyes P, Stack MJ. The
reproducibility of scrapie-associated fibril and
PrPSc detection methods after long-term
cold storage of natural ovine scrapie-affected brain tissue. J Comp Pathol 1999;
120(4):357-68.
88. Madec JY, Belli P, Calavas D, Baron T.
Efficiency of Western blotting for the specific immunodetection of proteinase K-resistant prion protein in BSE diagnosis in
France. Vet Rec 2000; 146(3):74-6.
89. Manousis T, Sachsamanoglou M, Toumazos
P, Verghese-Nikolakaki S, Papadopoulos O,
Sklaviadis T. Western blot detection of
PrP(Sc)in Cyprus sheep with natural scrapie.
Vet J 2000; 159(3):270-3.
90. Race R, Ernst D, Jenny A, Taylor W, Sutton
D, Caughey B. Diagnostic implications of
detection of proteinase K-resistant protein
in spleen, lymph nodes, and brain of
sheep. Am J Vet Res 1992; 53(6):883-9.
91. Cooley WA, Clark JK, Stack MJ.
Comparison of scrapie-associated fibril detection and Western immunoblotting for
the diagnosis of natural ovine scrapie. J
Comp Pathol 1998; 118(1):41-9.
92. Stack MJ, Scott AC, Done SH, Dawson M.
Scrapie associated fibril detection on decomposed and fixed ovine brain material.
Res Vet Sci 1993; 55(2):173-8.
93. Hope J, Reekie LJ, Hunter N, Multhaup G,
Beyreuther K, White H, Scott AC, Stack MJ,
Dawson M, Wells GA. Fibrils from brains of
cows with new cattle disease contain
scrapie-associated protein. Nature 1988;
336(6197):390-2.
94. Merz PA, Somerville RA, Wisniewski HM,
Iqbal K. Abnormal fibrils from scrapie-infected brain. Acta Neuropathol (Berl)
1981; 54(1):63-74.
95. Perrin GG, Perrin GJ, Benoit C. Detection
of scrapie-associated fibrils in scrapie in
goats. Vet Rec 1991; 129(19):432.
96. Wells GA, Scott AC, Johnson CT, Gunning
RF, Hancock RD, Jeffrey M, Dawson M,
Bradley R. A novel progressive spongiform
encephalopathy in cattle. Vet Rec 1987;
121(18):419-20.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
174
97. Scott AC, Wells GA, Chaplin MJ, Dawson
M. Bovine spongiform encephalopathy:
detection of fibrils in the central nervous
system is not affected by autolysis. Res
Vet Sci 1992; 52(3):332-6.
98. Wells GA, Scott AC, Wilesmith JW,
Simmons MM, Matthews D. Correlation
between the results of a histopathological examination and the detection of
abnormal brain fibrils in the diagnosis
of bovine spongiform encephalopathy.
Res Vet Sci 1994; 56(3):346-51.
99. Stack MJ, Aldrich AM, Kitching AD, Scott
AC. Comparison of biochemical extraction
techniques for the detection of scrapie-associated fibrils in the central nervous system
of sheep naturally affected with scrapie. J
Comp Pathol 1996; 115(2):175-84.
100. Van Keulen LJ, Vromans ME, Van
Zijderveld FG. Early and late pathogenesis
of natural scrapie infection in sheep.
APMIS 2002; 110(1):23-32.
101. Maignien T, Lasmezas CI, Beringue V,
Dormont D, Deslys JP. Pathogenesis of
the oral route of infection of mice with
scrapie and bovine spongiform encephalopathy agents. J Gen Virol 1999; 80(Pt.
11):3.035-42.
102. Detwiler LA, Baylis M. The epidemiology of
scrapie. Rev Sci Tech 2003; 22(1):121-43.
103. Mohan J, Brown KL, Farquhar CF, Bruce
ME, Mabbott NA. Scrapie transmission
following exposure through the skin is
dependent on follicular dendritic cells in
lymphoid tissues. J Dermatol Sci 2004;
35(2):101-11.
104. Mabbott NA, Bruce ME. The immunobiology of TSE diseases. J Gen Virol 2001;
82(Pt .10):2.307-18.
105. St Rose SG, Hunter N, Matthews L, Foster
JD, Chase-Topping ME, Kruuk LE, et al.
Comparative evidence for a link between
Peyer’s patch development and susceptibility to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Infect Dis 2006; 6:5.
106. Klein MA, Frigg R, Flechsig E, Raeber AJ,
Kalinke U, Bluethmann H, et al. A crucial
role for B cells in neuroinvasive scrapie.
Nature 1997; 390(6.661):687-90.
107. Aguzzi A, Heikenwalder M. Pathogenesis
of prion diseases: current status and future
outlook. Nat Rev Microbiol 2006;
4(10):765-75.
108. Ligios C, Sigurdson CJ, Santucciu C,
Carcassola G, Manco G, Basagni M, et al.
PrPSc in mammary glands of sheep affected by scrapie and mastitis. Nat Med
2005; 11(11):1.137- 8.
109. Seeger H, Heikenwalder M, Zeller N,
Kranich J, Schwarz P, Gaspert A, et al.
Coincident scrapie infection and nephritis
lead to urinary prion excretion. Science
2005; 310(5.746):324-6.
110. Aguzzi A. Prion diseases of humans and
farm animals: epidemiology, genetics and
pathogenesis. J Neurochem 2006;
97(6):1.726-39.
111. Beekes M, McBride PA. Early accumulation of pathological PrP in the enteric
nervous system and gut-associated lymphoid tissue of hamsters orally infected
with scrapie. Neurosci Lett 2000;
278(3):181-4.
112. Van Keulen LJ, Langeveld JP, Garssen GJ,
Jacobs JG, Schreuder BE, Smits MA.
Diagnosis of bovine spongiform encephalopathy: a review. Vet Q 2000;
22(4):197-200.
113. Hill AF, Collinge J. Subclinical prion infection. Trends Microbiol 2003;
11(12):578-84.
114. Vargas F, Luján L, Bolea R, Monleón E,
Martín-Burriel I, Fernández A, et al.
Detection and clinical evolution of scrapie
in sheep by 3rd eyelid biopsy. J Vet Intern
Med 2006; 20(1):187-93.
115. Aguzzi A. Peripheral prion pursuit. J Clin
Invest 2001; 108(5):661-2.
116. Ersdal C, Ulvund MJ, Espenes A,
Benestad SL, Sarradin P, Landsverk T.
Mapping PrPSc propagation in experimental and natural scrapie in sheep with
different PrP genotypes. Vet Pathol 2005;
42(3):258-74.
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
175
117. Fraser JR. Infectivity in extraneural tissues
following intraocular scrapie infection. J
Gen Virol 1996; 77(Pt. 10):2.663- 8.
118. Andreoletti O, Berthon P, Marc D,
Sarradin P, Grosclaude J, Van Keulen L,
et al. Early accumulation of PrP(Sc) in
gut-associated lymphoid and nervous
tissues of susceptible sheep from a
Romanov flock with natural scrapie. J
Gen Virol 2000; 81(Pt. 12):3.115-26.
119. Jeffrey M, Begara-McGorum I, Clark S,
Martin S, Clark J, Chaplin M, et al.
Occurrence and distribution of infectionspecific PrP in tissues of clinical scrapie
cases and cull sheep from scrapie-affected farms in Shetland. J Comp Pathol
2002; 127(4):264-73.
120. Race R, Oldstone M, Chesebro B. Entry
versus blockade of brain infection following oral or intraperitoneal scrapie administration: role of prion protein expression
in peripheral nerves and spleen. J Virol
2000; 74(2):828-33.
121. Glatzel M, Aguzzi A. Peripheral pathogenesis of prion diseases. Microbes Infect
2000; 2(6):613-9.
122. Heggebo R, González L, Press CM,
Gunnes G, Espenes A, Jeffrey M. Diseaseassociated PrP in the enteric nervous
system of scrapie-affected Suffolk sheep.
J Gen Virol 2003; 84(Pt. 5):1.327-38.
126. Beekes M, McBride PA, Baldauf E.
Cerebral targeting indicates vagal spread
of infection in hamsters fed with scrapie.
J Gen Virol 1998; 79(Pt. 3):601-7.
127. Baldauf E, Beekes M, Diringer H.
Evidence for an alternative direct route
of access for the scrapie agent to the
brain bypassing the spinal cord. J Gen
Virol 1997; 78(Pt. 5):1.187-97.
128. Jeffrey M, Martin S, Thomson JR, Dingwall
WS, Begara-McGorum I, González L. Onset
and distribution of tissue PrP accumulation
in scrapie-affected suffolk sheep as demonstrated by sequential necropsies and
tonsillar biopsies. J Comp Pathol 2001;
125(1):48-57.
129. Kimberlin RH, Walker CA. Pathogenesis
of mouse scrapie: evidence for neural
spread of infection to the CNS. J Gen
Virol 1980; 51:183-7.
130. Hunter N, Foster J, Chong A, McCutcheon
S, Parnham D, Eaton S, et al. Transmission
of prion diseases by blood transfusion. J
Gen Virol 2002; 83(Pt. 11):2.897-905.
131. Siso S, Jeffrey M, González L. Neuroinvasion in sheep transmissible spongiform
encephalopathies: the role of the haematogenous route. Neuropathol Appl
Neurobiol 2009; 35(3):232-46.
132. Hoinville LJ. A review of the epidemiology of scrapie in sheep. Rev Sci Tech
1996; 15(3):827- 52.
123. Buschmann A, Groschup MH. Highly bovine spongiform encephalopathy- sensitive transgenic mice confi rm the essential restriction of infectivity to the nervous
system in clinically diseased cattle. J Infect
Dis 2005; 192(5):934-42.
133. Wrathall AE, Holyoak GR, Parsonson IM,
Simmons HA. Risks of transmitting ruminant spongiform encephalopathies (prion
diseases) by semen and embryo transfer
techniques. Theriogenology 2008;
70(5):725-45.
124. Prinz M, Heikenwalder M, Junt T,
Schwarz P, Glatzel M, Heppner FL, et al.
Positioning of follicular dendritic cells
within the spleen controls prion neuroinvasion. Nature 2003; 425(6.961):957-62.
134. Andreoletti O, Lacroux C, Chabert A,
Monnereau L, Tabouret G, Lantier F, et al.
PrP(Sc) accumulation in placentas of ewes
exposed to natural scrapie: infl uence of foetal PrP geno type and effect on ewe-tolamb transmission. J Gen Virol 2002; 83(Pt.
10):2.607-16.
125. Van Keulen LJ, Schreuder BE, Vromans
ME, Langeveld JP, Smits MA. Scrapie-associated prion protein in the gastrointestinal tract of sheep with natural scrapie.
J Comp Pathol 1999; 121(1):55-63.
135. Tuo W, O’Rourke K, Zhuang D, Cheevers
W, Spraker T. Pregnancy status and fetal
prion genetics determine PrPSc accumu-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
176
lation in placentomes of scrapie infected
shhep. PNAS 2002; 99(9):6.310-5.
136. Alverson J, O’Rourke KI, Baszler TV. PrPSc
accumulation in fetal cotyledons of
scrapie-resistant lambs is infl uenced by
fetus location in the uterus. J Gen Virol
2006; 87(Pt. 4):1.035-41.
137. Lacroux C, Corbiere F, Tabouret G, Lugan
S, Costes P, Mathey J, et al. Dynamics
and genetics of PrPSc placental accumulation in sheep. J Gen Virol 2007; 88(Pt.
3):1.056-61.
138. Curnow RN, Hau CM. The incidence of
bovine spongiform encephalopathy in
the progeny of affected sires and dams.
Vet Rec 1996; 138(17):407-8.
139. Wrathall AE, Brown KFD, Sayers AR, Wells
GAH, Simmons MM, Farrelly SSJ, et al.
Studies of embryo transfer from cattle clinically affected by bovine spongiform encephalopathy (BSE). Veterinary Record
2002; 150:365-78.
140. Wilesmith JW, Wells GA, Ryan JB, GavierWiden D, Simmons MM. A cohort study
to examine maternally-associated risk
factors for bovine spongiform encephalopathy. Vet Rec 1997; 141(10):239-43.
141. Donnelly CA. Statistical aspects of BSE and
vCJD: models for epidemics. Monographs
on Statistics and Applied Probability n. 84.
Londres-Nueva York-Washington DC:
Chapman and Hall-CRC Boca Raton 84,
1999.
142. Zanusso G, Ferrari S, Cardone F, Zampieri P,
Gelati M, Fiorini M, et al. Detection of pathologic prion protein in the olfactory epithelium in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med 2003; 348(8):711-9.
143. Bartz JC, Kincaid AE, Bessen RA. Rapid
prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol 2003; 77(1):583-91.
hisms modulate the in vitro conversion
of sheep prion protein to protease resistant forms. PNAS USA 1997; 94:4.9316.
146. Glockshuber R, Hornemann S, Reik R,
Billeter M, Wider G, Liemann S, et al.
Folding and three-dimensional NMR
structure of the recombinant cellular
prion protein from the mouse. En: Harris
DA, ed. Prions: molecular and cellular
biology. Wymondham: Horizon Scientific
Press, 1999; 1-25.
147. Heaton MP, Leymaster KA, Freking BA,
Hawk DA, Smith TP, Keele JW, et al.
Prion gene sequence variation within diverse groups of US sheep, beef cattle,
and deer. Mamm Genome 2003;
14:765-77.
148. Zhang L, Li N, Fan B, Fang M, Xu W. PRNP
polymorphisms in Chinese ovine, caprine
and bovine breeds. Anim Genet 2004;
35:457-61.
149. Juling K, Schwarzenbacher H, Williams JL,
Fries RA. Major genetic component of BSE
susceptibility. BMC Biology 2006; 4:33.
150. Haase B, Doherr M, Seuberlich T,
Drögemüller C, Dolf G, Nicken P, et al.
PRNP promoter polymorphisms are associated with BSE susceptibility in Swiss and
German cattle. BMC Genetics 2007;
8:15.
151. Kimberlin RH. An assessment of genetical
methods in the control of scrapie. Livest
Prod Sci 1979; 6:233-42.
152. Goldmann W, Hunter N, Foster J,
Salbaum JM, Beyreuther K, Hope J. Two
alleles of a neural protein gene linked to
scrapie in sheep. PNAS USA 1990;
87:2.476-80.
144. Hunter N. PrP genetics in sheep and the
application for scrapie and BSE. Trends
Microbiol 1997; 5:331-4.
153. Dawson M, Hoinville LJ, Hosie BD,
Hunter N. Guidance on the use of PrP
genotyping as an aid to the control of
clinical scrapie. Vet Rec 1998; 142:6235.
145. Bossers A, Belt PBGM, Raymond GJ,
Caughey B, De Vries R, Smits MA.
Scrapie susceptibility-linked polymorp-
154. Goldmann W. PrP genetics in ruminant
transmissible spongiform encephalopathies. Vet Res 2008; 39:30.
Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos
177
155. Acín C, Martín-Burriel I, Goldmann W,
Lyahyai J, Monzón M, Bolea R, et al.
Prion protein gene polymorphisms in healthy and scrapie-affected Spanish sheep.
J Gen Virol 2004; 85:2.103-10.
156. Acín C, Martín-Burriel I, Monleón E,
Rodellar C, Badiola JJ, Zaragoza P. PrP
polymorphisms in Spanish sheep affected
with natural scrapie. Vet Rec 2004;
155:370-2.
157. Moum T, Olsaker I, Hopp P, Moldal T,
Valheim M, Moum T, et al.
Polymorphisms at codons 141 and 154
in the ovine prion protein gene are associated with scrapie Nor98 cases. J Gen
Virol 2005; 86:231-5.
158. Wilesmith JW, Wells GA, Cranwell MP,
Ryan JB. Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies. Vet Rec
1988; 123(25):638-44.
159. Kimberlin RH. Bovine spongiform encephalopathy. Rev Sci Tech OIE 1992;
11:441-89.
160. Wilesmith JW, Ryan JB, Atkinson MJ.
Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies on the origin. Vet
Rec 1991; 128(9):199-203.
161. Prince MJ, Bailey JA, Barrowman PR,
Bishop KJ, Campbell GR, Wood JM.
Bovine spongiform encephalopathy. Rev
Sci Tech OIE 2003; 22(1):37-60.
162. Hoinville LJ, Wilesmith JW, Richards MS.
An investigation of risk factors for cases
of bovine spongiform encephalopathy
born after the introduction of the feed
ban. Vet Rec 1995; 136(13):312-8.
163. Wilesmith JW. Preliminary epidemiological analyses of the first 16 cases of BSE
born after July 31, 1996, in Great Britain.
Vet Rec. 2002; 15115:451-2.
164. Badiola JJ, Monleón E, Monzón M, Acín
C, Luján L, Fernández D, Simmons M,
Vargas A. Description of first cases of BSE
in Spain. Vet Rec 2002; 151:509-10.
Normativa reguladora
Europea
Reglamento (CE) n.º 999/2001 del Parlamento
Europeo y del Consejo, de 22 de mayo de
2001, por el que se establecen disposiciones
para la prevención, el control y la erradicación
de determinadas encefalopatías espongiformes transmisibles.
EU. Report on the monitoring and testing of
ruminants for the presence of transmissible
spongiform encephalopathies (TSEs) in the EU
in 2010. Disponible en http://ec.europa.eu/
food/food/biosafety/bse/preliminary_annual_re
port_tse2010_en.pdf.
Decisión de la Comisión 2007/182/CE, de 19
de marzo de 2007, relativa a un estudio
sobre la caquexia crónica en los cérvidos [notificada con el número C(2007)860].
Reglamento (CE) n.º 36/2005 de la Comisión,
de 12 de enero de 2005, por el que se modifican los anexos III y X del Reglamento (CE) n.º
999/2001 del Parlamento Europeo y del
Consejo, por lo que se refiere a la vigilancia
epidemiológica de las encefalopatías espongiformes transmisibles en animales bovinos,
ovinos y caprinos.
Reglamento (CE) n.º 727/2007 de la Comisión,
de 26 de junio de 2007, por el que se modifican los anexos I, III, VII y X del Reglamento
(CE) n.º 999/2001 del Parlamento Europeo y
del Consejo, por el que se establecen disposiciones para la prevención, el control y la erradicación de determinadas encefalopatías espongiformes transmisibles.
Nacional
Real Decreto 3454/2000, de 22 de diciembre, por el que se establece y regula el
Programa Integral coordinado de vigilancia
y control de las encefalopatías espongiformes transmisibles de los animales (y sus
posteriores modificaciones).
Real Decreto 1911/2000, de 24 de noviembre,
por el que se regula la destrucción de los materiales especificados de riesgo en relación con
las encefalopatías espongiformes transmisibles
(y sus posteriores modificaciones).
Biotecnología de la producción de
antibióticos beta-lactámicos
Dr. Ricardo Vicente Ullán
Antibióticos β-lactámicos
Los antibióticos son compuestos de bajo
peso molecular producidos por microorganismos y que a bajas concentraciones
son capaces de inhibir selectivamente el
crecimiento de otros microorganismos
(acción bacteriostática) o provocarles la
muerte (acción bactericida). Pertenecen al
grupo de agentes quimioterapéuticos en
el que se engloban antivirales, antifúngicos y antiparásitos (Davies, 1990). Estos
compuestos son considerados metabolitos secundarios, puesto que no son necesarios para el crecimiento, desarrollo o
reproducción de los microorganismos que
los producen. Su función biológica es controvertida y se atribuye a que su producción confiere una ventaja frente a otros
microorganismos en la competencia por
los nutrientes (Martín y Demain, 1980).
Los antibióticos β-lactámicos son antibióticos de naturaleza peptídica que se
forman mediante síntesis no ribosomal de
tres aminoácidos: L-valina, L-cisteína y
ácido L-α-aminoadípico. Su estructura química da nombre al grupo y se basa en un
anillo β-lactámico de 4 átomos
(3 átomos de carbono y 1 átomo de nitrógeno). Con la excepción de las monobactamas y nocardicinas, que solo presentan el anillo β-lactámico, estos
antibióticos están formados por un sistema
bicíclico, siendo la estructura de este segundo anillo la que permite su clasifica-
ción. Adicionalmente, este tipo de antibióticos posee cadenas laterales que le confieren carácter hidrofóbico o hidrofílico.
Los antibióticos β-lactámicos se clasifican
en cinco grandes grupos (O´Sullivan y Sykes,
1986; Kycers y col., 1997; Asbel y Levison,
2000; Petri y col., 2001; Chambers y col.,
2005) (figura 1):
• Penicilinas: son producidas por hongos
filamentosos y se caracterizan porque
poseen el núcleo penam en su estructura química.
• Cefalosporinas: en su estructura química poseen el núcleo ceph-3-em y son
sintetizadas tanto por hongos filamentosos como por bacterias Gram positivas y Gram negativas.
• Clavamas: producidas por especies del actinomiceto Gram positivo Streptomyces;
poseen en su estructura química el núcleo
clavam.
• Carbapenemas: en su estructura química poseen el núcleo carbapenema,
estando producidas tanto por bacterias
Gram positivas como Gram negativas.
• Monolactamas: son producidas por bacterias Gram positivas y Gram negativas;
agrupa las nocardicinas y las monobactamas.
Los antibióticos β-lactámicos actúan como
agentes bactericidas al inhibir la biosíntesis del peptidoglicano de la pared celular bacteriana durante la división celular.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
180
Estructura química
H
N
R
S
O
Penicilinas
CH3
N
O
CH3
Antibióticos
Penam COOH
H
N
R
R
O
O
S
N
CH2R
COOH
Ceph-3-em
O
N
O
R
H
HR
Cefalosporinas
Cefamicinas
Cefabacinas
Citinovorinas
Ácido
clavulánico
Microorganismos productores
Hongos
Bacterias
filamentosos
Gram+
Gram–
P. chysogenum
P. notatum
E. nidulans
A. chysogenum
P. persinicus
Flavobacterium sp.
K. tethys
S. clavuligerus
L. lactamgenus
A. lactamdurans
S. clavuligerus
Clavam
R
H
H COOH
R
N
O
Carbapenem
H
N R
R
O
N
O
SO3H
H
N
R
OH
O
Tienamicinas
Ácidos olivánicos
Epitienamicinas
Nocardicinas
S. clavuligerus
S. olivaceus
N. uniformis
Subsp.
Tsuyamanensis
Monobactamas
A. radiobacter
P. acidophila
N
O
H
E. carotovora
Serratia sp.
COOH
Monolactam
Figura 1. Clasificación de los antibióticos β-lactámicos según su estructura química.
Su mecanismo de acción consiste en la
unión covalente a las proteínas PBP (penicillin binding proteins) dada su similitud
estructural con su sustrato natural acil-Dalanina-D-alanina. Las enzimas PBP
quedan bloqueadas de manera irreversible y no pueden catalizar la unión de las
moléculas de peptidoglicano en la reacción de entrecruzamiento en la última
etapa de la síntesis de la pared celular. El
resultado, tras la acción de los antibióticos
β-lactámicos, es una pared celular defectuosa que finalmente se degrada por
completo tras la activación de hidrolasas
y autolisinas endógenas (Kong y col.,
2010).
Estructura química de
penicilinas y cefalosporinas
Las penicilinas son antibióticos β-lactámicos
que contienen el núcleo penam como estructura química esencial. Su estructura tridimensional fue determinada en el año
1945 por Dorothy Crowfoot Hodgkin, aplicando la difracción por rayos X (Hodgkin,
1949). El núcleo penam o anillo 6-aminopenicilánico consiste en un anillo tiazolidínico unido a un anillo β-lactámico. Además
del núcleo penam, anclado a su grupo
amino poseen una cadena lateral, consistente en diferentes derivados del grupo
acilo en función del tipo de penicilina (fi-
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
181
gura 2A). La formación del anillo β-lactámico es previa a la formación del anillo tiazolidínico en el proceso de síntesis del núcleo penam (Cooper, 1993; Burzlaff y col.,
1999). El anillo tiazolidínico y la cadena lateral, conjuntamente, son responsables de
las propiedades farmacológicas, el espectro
antibacteriano, la susceptibilidad a β-lactamasas y la potencia antibiótica de cada tipo
de penicilina, mientras el anillo β-lactámico
es el responsable de la acción antibacteriana. Las penicilinas hidrofóbicas son exclusivamente sintetizadas por algunas especies del género Penicillium y Emericella
nidulans (Aspergillus nidulans).
de las penicilinas (Abraham y Newton,
1961; Loder y col., 1961; Hodgkin y
Maslen, 1961). La cefalosporina posee características hidrofílicas debidas a la cadena lateral de D-α-aminoadípico que
aparece unida al anillo β-lactámico en el
grupo amino del carbono 7 (figura 2B).
Las cefalosporinas son sintetizadas por los
hongos Acremonium chrysogenum
(Cephalosporium acremonium), Paecilomyces persicinus y Kallichroma tethys,
junto con las bacterias Gram positivas
Streptomyces clavuligerus y Amycolatopsis lactamdurans (Nocardia lactamdurans), que sintetizan también cefamicinas,
además de bacterias Gram negativas,
como Lysobacter lactamgenus y Flabobacterium sp. (además sintetizan cefabacinas) (Brakhage y col., 2009; Martín y
col., 2010).
Las cefalosporinas contienen el núcleo
ceph-3-em (cefen) que está constituido
por el anillo β-lactámico y un anillo dihidrotiazínico (figura 2B) diferente al sistema de anillos β-lactámico-tiazolidínico
B
A
Anillo tiazolidínico
H
N
R
H2N
S
O
O
Anillo dihidrotiazínico
H
N
COOH
Anillo ß-lactámico
H
N
D
COOH
R1
O
O
S
N
CH2R2
COOH
Anillo ß-lactámico
Figura 2. Penicilinas y cefalosporinas (A) Estructura química de las penicilinas donde se muestran los anillos
β-lactámico y tiazolidínico característicos del núcleo penam. (B) Estructura química de las cefalosporinas formada
por los anillos β-lactámico y dihidrotiazínico correspondientes al núcleo cefen junto con la cadena lateral hidrofílica D-α-aminoadípico.
Ruta biosintética de los
antibióticos penicilina y
cefalosporina C en hongos
filamentosos
La biosíntesis de penicilina y cefalosporina
(figura 3), tanto en bacterias como en
hongos filamentosos (Brakhage y col.,
2009; Martín y col., 2010), comienza con
la condensación no ribosómica de tres precursores aminoacídicos: ácido L-α-aminoadípico, L-cisteína y L-valina para formar el
tripéptido δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
182
valina (LLD-ACV) (Aharonowitz y col., 1992;
Martín, 2000). Esta reacción la cataliza la
ACV sintetasa (codificada por el gen
pcbAB) (Díez y col., 1990; Gutiérrez y col.,
1991; MacCabe y col., 1991).
El siguiente paso en la ruta biosintética consiste en la ciclación del tripéptido para
formar isopenicilina N (IPN), que es el primer
intermediario de la ruta con actividad antibiótica. Esta reacción está catalizada por la
IPN sintasa (codificada por el gen pcbC)
(Samson y col., 1985; Carr y col., 1986;
Ramón y col., 1987; Barredo y col., 1989a).
Estas dos primeras reacciones enzimáticas
son comunes en todos los procesos biosintéticos de antibióticos β-lactámicos. A partir
de aquí la ruta puede dirigirse hacia la biosíntesis de penicilinas hidrofóbicas, como
ocurre en Penicillium y E. nidulans con la
producción de las penicilinas G y V, o bien
hacia la biosíntesis de cefalosporina C en el
caso de Acremonium chrysogenum,
Paecilomyces persicinus y Kallichroma
tethys.
Los hongos filamentosos P. chrysogenum y
E. nidulans sintetizan penicilina G (benzilpenicilina) y penicilina V (fenoximetilpenicilina) por la sustitución de la cadena lateral
del L-α-aminoadipil de la IPN por cadenas
laterales no polares, como son el ácido fenilacético o fenoxiacético, respectivamente.
El proceso tiene lugar en dos pasos catalizados por dos actividades enzimáticas codificadas por el gen penDE (Barredo y col.,
1989b; Montenegro y col., 1990). En un
primer paso la cadena lateral de L-α-aminoadípico de la IPN se elimina formando el
ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) en una
reacción catalizada por la actividad isopenicilinil N amidohidrolasa. Posteriormente,
al 6-APA se le incorpora una cadena lateral
hidrofóbica de un ácido aromático previamente activado como CoA por una arilCoA ligasa (Gledhill y col., 1997; LamasMaceiras y col., 2006; Wang y col., 2007;
Yu y col., 2011). En el caso de la penicilina
G (PenG), el ácido fenilacético es activado
como fenilacetilcoenzima A en una reacción catalizada por la actividad acil-CoA: 6APA aciltransferasa (Álvarez y col., 1993).
El ácido fenoxiacético es el que se incorpora
al 6-APA para formar la penicilina V (PenV).
En P. chrysogenum el gen penDE posee un
marco de lectura abierto que codifica una
proteína de 39,94 kDa y, al igual que en
E. nidulans, posee tres intrones en la mitad
final del gen (Barredo y col., 1989b;
Montenegro y col., 1990; Tobin y col.,
1990). La conversión de IPN a PenG está catalizada por una única enzima (isopenicilina
N aciltransferasa) con dos subunidades
(Whiteman y col., 1990) que se sintetiza
como una preproteína de 40 kDa, sufriendo
posteriormente un procesamiento postraduccional (Tobin y col., 1990).
El primer paso específico de la ruta que
conduce hacia la biosíntesis de cefalosporina C (CPC) implica la epimerización de la
cadena lateral del ácido L-α-aminoadípico
a D-α-aminoadípico, formándose penicilina
N (PenN), que es el precursor común a
todas las cefalosporinas. Esta reacción está
catalizada por una IPN epimerasa
(Kovacevic y col., 1990; Coque y col., 1993)
en el caso de bacterias, y por un sistema de
al menos dos enzimas en A. chrysogenum.
Dichas enzimas son una isopenicilinil N-CoA
sintetasa (codificada por el gen cefD1) y
una isopenicilinil N-CoA epimerasa (codificada por el gen cefD2), pudiendo existir
una tioesterasa, probablemente inespecífica, que libera la PenN del CoA (Ullán y
col., 2002a).
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
183
L-α-aminoadípico
L-cisteína
(L-α-AAA)
H2N
H2N
COOH
COOH
L-valina
H2N
SH
COOH
COOH
ACV sintetasa
pcbAB
H
N
H2N
COOH
SH
O
O
NH
δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina
COOH
(LLD-ACV)
Isopenicilina N sintetasa
(Ciclasa)
pcbC
Fenilacetil-CoA
6-APA
H2O
L-α-AAA
Fenilacetil-CoA penDE
CoA
H
N
O
O
H
N
S
O
O
N
COOH
Isopenicilina N
Isopenicilina N
aciltransferasa
CoA
L-α-AAA
H 2N L
H
COOH
Isopenicilina N-CoA sintetasa
Isopenicilina N-CoA epimerasa
cefD1
cefD2
H
N
H2N D
H COOH
O
COOH
Desacetoxicefalosporina C
sintetasa (expandasa)
cefEF
N
COOH
N
Penicilina N
S
Penicilina G
(PenG)
S
O
H
N
H2N D
H COOH
S
O
N
O
COOH
Desacetoxicefalosporina C
(DAOC)
Desacetoxicefalosporina C
cefEF
sintetasa (hidroxilasa)
H
N
H 2N D
H COOH
S
O
O
OH
N
COOH
Desacetilcefalosporina C
(DAC)
Acetil-CoA
Desacetilcefalosporina C
acetiltransferasa
cefG
CoA
H2N D
H COOH
H
N
O
O
S
OCOCH3
N
COOH
Cefalosporina C
(CPC)
Figura 3. Estructura química y ruta biosintética de los antibióticos penicilina G y cefalosporina C.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
184
A continuación la PenN es convertida en
desacetoxicefalosporina C (DAOC) en una
reacción catalizada por una DAOC sintetasa
(conocida como expandasa). Mediante esta
reacción, el anillo tiazolidínico de la PenN
sufre una expansión para originar el anillo
dihidrotiazínico (que poseen todas las cefalosporinas) y el núcleo ceph-3-em (Kupka y
col., 1983; Dotzlaf y Yeh, 1987).
En el siguiente paso, el grupo metilo del
carbono 3 de DAOC es hidroxilado y posteriormente oxidado para originar desacetilcefalosporina C (DAC). Dicha reacción
está catalizada por una DAC sintetasa (hidroxilasa).
En bacterias, estas reacciones sucesivas de
hidroxilación y oxidación están catalizadas
por dos enzimas diferentes (Jensen y col.,
1985), mientras que en A. chrysogenum
ambas están catalizadas por una única enzima bifuncional, denominada DAOC sintetasa (expandasa)/DAC sintetasa (hidroxilasa), codificada por el gen cefEF (Samson
y col., 1987).
El último paso para la formación de CPC
en A. chrysogenum conlleva la acetilación
de la cadena lateral de DAC, procediendo
el grupo acetilo que se transfiere del
acetil-CoA. Esta reacción está catalizada
por la acetil-CoA: DAC acetiltransferasa,
una enzima de 49 kDa codificada por el
gen cefG (Gutiérrez y col., 1992; Matsuda
y col., 1992; Mathison y col., 1993).
Organización de los genes de
biosíntesis de penicilina y
cefalosporina C en hongos
filamentosos
En los hongos filamentosos E. nidulans y
P. chrysogenum, los tres genes implicados
en la biosíntesis de penicilinas (pcbAB,
pcbC y penDE) forman parte de una agrupación génica (cluster) situada en el cromosoma VI y en el cromosoma I, respectivamente (figura 4A) (Fierro y col., 1993;
Montenegro y col., 1990). En el caso de
P. chrysogenum, el cluster se localiza en
el centro de una región de ADN de 120 kb,
que aparece amplificada en tándem en las
cepas industriales (Fierro y col., 2006; Van
den Berg y col., 2007). Las repeticiones
aparecen separadas entre sí por un hexanucleótido altamente conservado, cuya
secuencia es TGTAAA/T (Barredo y col.,
1989c; Fierro y col., 1995, 2006; Newbert
y col., 1997).
En A. chrysogenum, los genes de biosíntesis de CPC están disponibles en una
sola copia en el genoma y se organizan
en dos clusters: el temprano y el tardío
(figura 4B). El cluster temprano agrupa
a los genes pcbAB y pcbC, los cuales se
transcriben en sentido opuesto (Skatrud
y col., 1989; Skatrud, 1992). A continuación del gen pcbC (corriente abajo) se
encuentran los genes cefD1 y cefD2 bajo
el control de un único promotor bidireccional (Ullán y col., 2002a). Este cluster
se encuentra localizado en el cromosoma
VII (4,6 Mb) en A. chrysogenum C10
(Gutiérrez y col., 1999) y en el cromosoma VI en la cepa 394-4 (Skatrud y
Queener, 1989).
Por otro lado, los genes cefEF y cefG, que
se transcriben de manera divergente a
partir de un único promotor bidireccional,
se encuentran agrupados en el cluster
tardío localizado en el cromosoma I
(2,2 Mb) en A. chrysogenum C10 (ATCC
48272) (Gutiérrez y col., 1999) y en el II
en el caso de A. chrysogenum 394-4
(Skatrud y Queener, 1989).
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
185
A
Emericella nidulans
pcbAB
pcbC penDE
Penicillium chrysogenum
pcbAB
B
pcbC penDE
Acremonium chrysogenum
cluster temprano
cefR
cefP cefT ORF3
pcbAB
pcbC
cefD2 cefD1 cefM
cluster tardío
cefEF
cefG
Figura 4. (A) Organización cromosómica de los genes de biosíntesis de penicilina en P. chrysogenum y E. nidulans. (B) Organización cromosómica de los genes de biosíntesis, de cefalosporina C en A. chrysogenum. En el
cluster temprano se muestra la localización de los genes de secreción cefT, cefM y cefP junto con la del gen regulador cefR (ver más adelante).
En A. chrysogenum, el cluster temprano
se encuentra en el cromosoma VI y el
tardío en el cromosoma II. Sin embargo,
en las cepas de alta producción, como
ATCC 48272, la localización cromosómica
de estos clusters es diferente (Smith y col.,
1991), indicando que durante la mejora
de las mismas han ocurrido reordenamientos significativos en los cromosomas
(Gutiérrez y col., 1999).
Compartimentación de las
rutas de biosíntesis de
penicilina y cefalosporina C
Los pasos específicos de la ruta biosintética
de penicilinas en P. chrysogenum están
compartimentados dentro de las células
fúngicas, transcurriendo en el citosol y en
los peroxisomas (revisiones de Van de
Kamp y col., 1999; Evers y col., 2004). Así,
la condensación no ribosómica de los aminoácidos L-cisteína, L-valina y L-α-aminoadípico, catalizada por la ACV sintetasa, es
una reacción citosólica (Van der Lende y
col., 2002). Igualmente está descrita como
citosólica la reacción de ciclación de LLDACV en IPN catalizada por la IPN sintasa
(Ramos y col., 1985; Müller y col., 1991).
Finalmente, el reemplazamiento de la cadena lateral de L-α-aminoadípico de la IPN
por una cadena hidrofóbica es una reacción que transcurre en el interior de los peroxisomas. Este reemplazamiento comprende tanto la activación de la cadena
hidrofóbica (Gledhill y col., 1997; LamasMaceiras y col., 2006; Wang y col., 2007;
Yu y col., 2011) como la incorporación de
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
186
dicha cadena (Müller y col., 1991, 1992,
1995) en el 6-APA procedente de la eliminación de la cadena lateral de IPN. Otro
dato que avala la localización de estas enzimas en peroxisomas es que la sobreexpresión de la peroxina Pc-Pex11p (proteína
implicada en la biogénesis de peroxisomas
en P. chrysogenum) duplica la producción
de PenG (Kiel y col., 2005). Estos autores
relacionan dicho incremento de la producción con el aumento en el número de peroxisomas presentes en la célula fúngica.
En resumen, la ruta biosintética de penicilinas transcurre entre dos compartimentos:
el citosol y los peroxisomas.
En el caso de A. chrysogenum se presuponía que todas las enzimas están localizadas en el citosol a pesar de no haberse
realizado estudios directos sobre este tema
(Van de Kamp y col., 1999; Evers y col.,
2004). Esta localización citosólica no tenía
aún en cuenta el descubrimiento de los
genes cefD1 y cefD2 responsables de la
epimerización de IPN en PenN (Ullán y col.,
2002a). El análisis bioinformático de las secuencias de las proteínas CefD1 y CefD2
muestran señales PTS de localización en
peroxisomas (Reumann, 2004); en concreto, señales PTS-1 (Secuencia consenso:
S/C/A-K/R/H-L) y PTS-2 [Secuencia consenso: (R/L)(L/V/I)-X5-(H/Q)(L/A)] para
CefD2 y señal PTS-1 para CefD1 (Teijeira y
col., 2009; Martín y col., 2010; Ullán y col.,
2010). De tal forma que si dicha epimerización transcurre en los peroxisomas, se requiere un transporte tanto del sustrato
(IPN) como del producto (PenN) a través de
la membrana peroxisomal en el cual estarían implicadas proteínas transportadoras
de membrana. En el cluster temprano de
biosíntesis de CPC (figura 4B) se encuentran dos genes denominados cefP (Ullán y
col., 2010) y cefM (Teijeira y col., 2009),
que codifican dos proteínas de membrana.
El análisis de las proteínas CefM y CefP mediante herramientas bioinformáticas revela
la presencia de dominios Pex19p en ambas
proteínas. Este dominio es característico de
proteínas de membrana peroxisomal de
clase I que son reconocidas por la peroxina
Pex19p para ser internalizadas en dicha
membrana (Rottensteiner y col., 2004;
Matsuzono y col., 2006).
El gen cefM está localizado corriente abajo
del gen cefD1 (figura 4B) y codifica una
proteína de 482 aminoácidos (con un peso
molecular deducido de 52,2 kDa) formada
por 12 segmentos transmembrana (TMS) y
con los motivos conservados A, B, C, D2 y
G característicos del grupo de proteínas
transportadoras de la superfamilia MFS
(Major Facilitator Superfamily). La presencia
de estos motivos y los 12 segmentos transmembrana en la proteína CefM la incluyen
dentro de la familia 3. Dichas proteínas actúan mediante un mecanismo de antiporte
protón motriz. La interrupción del gen cefM
causa un acúmulo intracelular de PenN
junto con una drástica reducción en la producción tanto de CPC como de PenN
(Teijeira y col., 2009).
En el mismo cluster temprano de cefalosporinas está localizado el gen cefP
(figura 4B), el cual codifica una proteína
con 11 dominios transmembrana constituida por 866 aminoácidos y con un peso
molecular deducido de 99,2 kDa. Los
transformantes interrumpidos en cefP son
incapaces de sintetizar cefalosporinas de
forma eficiente y acumulan IPN en los
caldos de cultivo, lo cual indica que la
conversión de IPN en PenN está bloqueada (Ullán y col., 2010).
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
187
Estudios de microscopía confocal de fluorescencia muestran que ambas proteínas
están localizadas en la membrana peroxisomal (Teijeira y col., 2009; Ullán y col.,
2010). Estos resultados en su conjunto indican que la ruta biosintética de CPC en A.
chrysogenum está compartimentada y
transcurre entre el citosol y los peroxisomas.
Según esta hipótesis (figura 5), la proteína
CefP importa IPN desde el citosol a la matriz peroxisomal para su conversión en PenN
mediante la acción combinada de las proteínas CefD1 y CefD2. Posteriormente, el
intermediario PenN es transportado desde
el lumen peroxisomal al citosol mediante la
proteína CefM para su conversión en DAC
y CPC, reacciones catalizadas por las enzimas expandasa/hidroxilasa y DAC-acetiltransferasa, respectivamente.
El gen cefT está localizado en el cluster
temprano de genes de biosíntesis de cefalosporina (figura 4B) y codifica una proteína de 561 aminoácidos con un peso
molecular deducido de 61,3 kDa (Ullán y
col., 2002b). La proteína CefT pertenece a
la familia de transportadores de drogas
(MDR), y en concreto a la familia MFS
(Major Facilitator Superfamily). Dicha proteína tiene 12 segmentos transmembrana
y contiene los motivos A, B, C, D2 y G característicos de la familia 3 (transportadores
antiporter droga H+) dentro de la superfamilia MFS (la misma que la proteína CefM).
La sobreexpresión del gen cefT incrementa
hasta el 100% la secreción de cefalosporinas; sin embargo, su interrupción no bloquea la producción de dicho antibiótico.
Además, la expresión heteróloga del gen
cefT en P. chrysogenum indica que la proteína CefT está implicada en la secreción
de β-lactamas hidrofílicas (que contienen
la cadena lateral de ácido α-aminoadípico)
(Ullán y col., 2008) y que está localizada en
la membrana plasmática (Nijland y col.,
2008). Adicionalmente, en el cluster temprano, corriente arriba del gen pcbAB, se
encuentra la ORF3 (figura 4B), que codifica
una D-hidroxiácido deshidrogenasa de función desconocida (Ullán y col., 2002b).
En cuanto a la regulación de la secreción
de los intermediarios y del producto final
de la ruta biosintética de CPC en el cluster
temprano corriente arriba del gen cefP se
encuentra el gen CefR (figura 4B), que codifica una proteína reguladora con un dominio fungal-trans (dominio característico
de múltiples reguladores fúngicos). La
inactivación dirigida del gen cefR disminuye y retrasa la producción de cefalosporinas e incrementa la secreción de
PenN. Por otro lado, la sobreexpresión del
gen cefR disminuye la secreción de PenN,
evitando la pérdida de este intermediario
y por tanto incrementando la producción
de CPC. El análisis transcripcional de los
genes biosintéticos y de los transportadores de la ruta biosintética de CPC en los
transformantes interrumpido y sobreexpresado en cefR reveló que la proteína
CefR actúa como un represor de los genes
cefT y cefM (figura 5), evitando así la pérdida de intermediarios (IPN, PenN y DAC)
y favoreciendo la síntesis de CPC (producto final). Así, mientras la interrupción
del gen cefR provoca un incremento de la
expresión de los genes cefM y cefT (provoca pérdida de intermediarios), su sobreexpresión la disminuye (retiene los intermediarios e incrementa la producción del
producto final CPC). La proteína CefR
constituye el primer ejemplo de un modulador de transportadores de β-lactamas
en hongos filamentosos (Teijeira y col.,
2011).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
188
Figura 5. Modelo propuesto para la compartimentación de la ruta biosintética de cefalosporina C en A. chrysogenum. Se muestra la localización de los transportadores CefT, CefM y CefP. CefR actúa como un represor de la
expresión de los genes cefM y cefT. L-α-AAA, ácido L-α-aminoadípico; L-Cys, L-cisteína, L-Val, L-valina; ACV,
δ-(L-α-aminoadipill)-L-cisteinil-D-valina; ACVS, ACV sintetasa; IPNS isopenicilina N sintasa; IPN, isopenicilina N;
IPN-ACS, isopenicilina N-CoA sintetasa; IPN-ACE, isopenicilina N-CoA epimerasa; PenN, penicilina N; EH, expandasa/hidroxilasa; DAC, desacetilcefalosporina C; DAC-AT, DAC acetiltransferasa; CPC, cefalosporina C.
Biotecnología en la
producción de penicilinas
Historia del descubrimiento
de la penicilina
En 1928, Fleming aisló la primera cepa
productora de penicilina (Fleming, 1929)
conocida como Penicillium notatum
NRRL-1249 (Clutterbuck y col., 1932).
Posteriormente, en 1938, Howard Walter
Florey (médico patólogo), Ernst Boris
Chain (bioquímico) y Norman Heatley
(bioquímico) iniciaron una investigación
detallada de las propiedades terapéuticas
de la penicilina. De esta forma, mientras
Florey se ocupaba de los aspectos biológicos y farmacológicos, Chain se encargó
de evaluar las propiedades químicas y bio-
químicas. Por otro lado, Heatley se ocupó
de los aspectos relacionados con la producción del antibiótico estudiando la
forma de cultivar la mayor cantidad posible del hongo y cómo recuperar el principio activo del caldo. Como resultado de
estos trabajos se establecieron las bases
para la producción de la penicilina y su
uso tal y como lo conocemos actualmente
(Chain y col., 1940).
Posteriormente, en 1943, en un mercado
de la localidad de Peoria en Illinois
(EE.UU.) y a partir de un melón cantaloupe de aspecto mohoso, se aisló una
nueva cepa conocida como Penicillium
chrysogenum NRRL-1951 (ATCC 9480).
En dicha cepa, la capacidad productora
estaba mejorada con respecto a la ante-
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
189
rior y además era adecuada para el crecimiento en cultivos sumergidos (Raper y
Alexander, 1945; Raper, 1946). Esta capacidad de crecimiento en medio líquido
permitía llevar a cabo fermentaciones, por
lo cual se potenciaba aún más la capacidad productora.
Programas de mejora industrial en la
producción de penicilinas
Partiendo de la P. chrysogenum NRRL-1951
y mediante el uso de agentes mutagénicos
se fueron seleccionando las cepas que presentaban una mayor producción. De esta
manera se llegó a la cepa WisQ176, pasando de una producción de penicilina de
60 μg/ml en P. chrysogenum NRRL-1951 a
una de 2.500 μg/ml.
P. chrysogenum WisQ176 fue incluida en
distintos programas de mejora de cepas,
en busca de una cepa con un gran rendimiento productivo (Backus y Stauffer,
1955; Hopwood y Merrick, 1977). Los
agentes mutagénicos más utilizados fueron
los rayos X, los rayos UV, mostazas nitrogenadas y, más recientemente, nitrosoguanidina, agentes alquilantes y nitritos. En
estos programas de mejora de cepas también han sido aplicadas otro tipo de técnicas como son la fusión parasexual de
protoplastos y la ingeniería genética.
La fusión parasexual de protoplastos pretendía conseguir el intercambio de ADN
entre dos cepas superproductoras para facilitar una hibridación interespecífica en la
que los organismos recombinantes presentaran un genotipo diferente al de las cepas
parentales. El genotipo del organismo recombinante sería el producto de la unión
de todas las mutaciones que conducen a
una mayor capacidad productiva en las dos
cepas de partida. Teóricamente, la capacidad productora del fenotipo resultante
sería igual a la de las dos cepas parentales
juntas (Anné, 1977; Tahoun, 1993).
Mediante ingeniería genética, la mejora
de la producción se ha llevado a cabo realizando mutagénesis dirigida, incrementando la dosis génica de enzimas involucradas en etapas limitantes del proceso de
biosíntesis y expresando de forma heteróloga los genes biosintéticos (Chiang,
2004). De esta manera, la sobreexpresión
tanto del gen ppt (que codifica la enzima
PPTasa encargada de activar la ACVS)
(García-Estrada y col., 2008) como del
gen LaeA (que codifica la proteína
PcLaeA, un regulador global del metabolismo secundario que regula positivamente la expresión de los genes de biosíntesis de penicilina) (Kosalková y col.,
2009) tienen como consecuencia un incremento en la producción de penicilina.
El resultado de los programas de mejora
son cepas industriales como P2 (Panlabs,
Taiwán), DS04825 (DSM antiinfectives,
Holanda) o AS-P-78 y E1 (Antibióticos S.A,
España) cuya producción de penicilina en
cultivo sumergido (feed-batch) puede
llegar a los 70 g/l (Olano y col., 2008). Esta
mayor producción en estas cepas industriales es el resultado del elevado número
de copias del cluster de biosíntesis que,
como se indicó anteriormente, están incluidas en una región de ADN que aparece
amplificada en tándem en las cepas industriales. De esta forma, mientras P. chrysogenum NRRL-1951 tiene una sola copia del
cluster de biosíntesis, P. chrysogenum E1
cuenta con un número de entre 12 y 14
copias (Fierro y col., 2006). Además, en las
cepas industriales existe una mayor expresión de los genes biosintéticos de penici-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
190
linas (Barredo y col., 1989c; Fierro y col.,
1995; Newbert, 1997; Kosalková y col.,
2007).
Por otro lado, la vía del homogentisato
también ha sufrido modificaciones durante
los programas de mejora industrial de las
cepas. Esta vía, que se utiliza para el catabolismo del ácido fenilacético (el precursor
de cadena lateral en la biosíntesis de
PenG), está disminuida en P. chrysogenum
Wisconsin 54-1255 y en buena lógica en
las cepas derivadas. La causa es la modificación de una fenilacetato hidroxilasa (citocromo P450 monooxigenasa) codificada
por el gen pahA, que conduce a una reducción de la degradación de ácido fenilacético y, por lo tanto, a una mayor disposición de este ácido para la síntesis de
PenG (Rodríguez-Saiz y col., 2001).
mentación de la cepa industrial en cultivo
feed-batch sumergido, donde se añaden
los precursores de cadena lateral, ácido
fenilacético para PenG o ácido fenoxiacético para PenV. La fermentación transcurre
en reactores de acero inoxidable con capacidades de 20.000 a 500.000 litros y a
una temperatura óptima de 25 a 27 ºC.
Al ser un proceso aeróbico requiere un
aporte continuo de O2 (0,05-0,1 vol O2
vol cultivo-1 min-1) que se mezcla con el
medio de cultivo gracias a impulsores de
tipo turbina (Elander, 2003).
Producción de penicilinas
semisintéticas
Una fermentación típica de PenG consta
de dos-tres fases iniciales de crecimiento
de 40 horas con un tiempo de duplicación
de 6 horas (durante las que se genera la
mayor parte de la masa celular) seguida
de una fase de producción de penicilina
que puede extenderse hasta las 120-160
horas. Una vez concluida la fermentación,
se separa el micelio del medio de cultivo
por filtración, empleando un filtro rotatorio a vacío tipo cilindro. A continuación,
el caldo de cultivo filtrado, rico en PenG,
es inmediatamente enfriado a 0-4 ºC con
el objeto de disminuir la degradación enzimática y química en etapas posteriores.
El antibiótico PenG, al ser un ácido, es altamente soluble en solventes orgánicos,
por lo se que extrae eficientemente con
acetato de amilo, butilo o isobutilo y a un
pH ácido (2,5-3,0), que se consigue añadiendo al medio de cultivo filtrado H2SO4
o H3PO4. Además puede hacerse un tratamiento con carbón activo para eliminar
pigmentos y otras impurezas. La PenG extraída se cristaliza añadiendo excesos de
Na+ o K+ y los cristales obtenidos se lavan
con un solvente volátil y se secan.
La estrategia seguida para producir penicilinas biosintéticas consiste en una fer-
Ambas penicilinas biosintéticas (PenG y
PenV) pueden ser empleadas directamente
Más recientemente, Van der Berg y col.
(2008) han visto que la abundancia de peroxisomas y el aumento de la transcripción de los genes que codifican las enzimas encargadas de la biosíntesis de los
aminoácidos precursores también están
directamente relacionados con el aumento de la producción. Los estudios de
proteómica muestran que durante el proceso de mejora de cepas el incremento en
la producción de penicilina parece ser una
consecuencia de la disminución tanto de
la biosíntesis de otros metabolitos secundarios como de la capacidad infectiva del
hongo, además del resultado de un aumento en el metabolismo redox y en la
biosíntesis de NADPH (Jami y col., 2010).
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
191
o para obtener el 6-APA, mediante una desacilación química o enzimática. El 6-APA
se utiliza como núcleo estructural para producir una gran variedad de penicilinas semisintéticas, al incorporarle diferentes cadenas laterales (Rollinson y Geddes, 2007).
La síntesis química tradicional de 6-APA comenzó alrededor de 1970 y se mantuvo
durante 15-20 años. Este procedimiento
era altamente contaminante, ya que requería productos químicos y solventes,
siendo desplazada por la síntesis enzimática que la convirtió en no rentable (Demain
y Elander, 1999). Actualmente, la producción industrial de 6-APA se realiza por la hidrólisis enzimática de la PenG o PenV mediante la inmovilización de las enzimas
PenG acilasa y PenV acilasa, respectivamente. Estas enzimas se obtienen a partir
de cepas recombinantes de Escherichia coli,
Bacillus megaterium (ambas para la PenG
acilasa) y Fusarium oxysporum (para la PenV
acilasa), cuyas actividades enzimáticas están
mejoradas (Arrollo y col., 2003; Rajendhran
y Gunasekaran, 2004; Sio y Quax, 2004).
El principal problema que presentan las
penicilinas es la pérdida de su funcionalidad dada su susceptibilidad al ataque de
β-lactamasas y su ligera inestabilidad en
medio ácido. Para solucionar este problema se crearon las penicilinas semisintéticas, en las cuales al núcleo 6-APA se le
incorporan diferentes cadenas laterales. La
presencia de estas cadenas laterales les
confiere diferentes propiedades a las penicilinas, como son la biodisponibilidad, el
espectro antibacteriano, la estabilidad, la
tolerancia, así como la eficacia contra una
amplia gama de bacterias, incluidas varias
especies de estreptococos y estafilococos,
Gram negativas aerobias y muchas anaerobias. Las penicilinas semisintéticas se
pueden agrupar en cinco categorías: penicilinas penicilinasa resistentes o antiestafilocócicas (meticilina, oxacilina, nafcilina,
cloxacinina y dicloxacilina), aminopenicilinas
(ampicilina, amoxicilina y bacampicilina),
carboxipenicilinas (carbenicilina y ticarcilina), ureidopenicilinas (mezlocilina, azlocilina y piperacilina) y penicilinas con inhibidor de β-lactamasas (amoxicilina-ácido
clavulánico, ampicilina-sulbactam, ticarcilina-ácido clavulánico y piperacilina-tazobactam) (Jacoby y Medeiros, 1991; Kalant
y Roschlau, 1998; Oshiro, 1999; Kadurina
y col., 2003).
Biotecnología en la
producción de cefalosporinas
Historia del descubrimiento de la
cefalosporina C
La historia del descubrimiento de las cefalosporinas (Hamilton-Miller, 2000) se remonta al año 1945, cuando en la localidad de Cagliari (Cerdeña, Italia)
Giusseppe Brotzu observó que, a pesar de
que la fiebre tifoidea era endémica en
Cerdeña, las personas que se bañaban y
consumían marisco crudo en las proximidades donde se vertían aguas residuales
al mar no enfermaban. Consciente de
este hecho pensó que en el mar podría
haber algún tipo de proceso de autodepuración, posiblemente debido a la producción de antibióticos por la flora autóctona. Por lo tanto, se puso a trabajar
aislando y bioensayando, frente a patógenos, los microorganismos procedentes
del mar. Como resultado de esta búsqueda aisló un hongo productor de antibióticos que procedía de aguas residuales
vertidas al mar (Brotzu, 1948). Este autor
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
192
observó que en los cultivos había sustancias que inhibían el crecimiento de
Salmonella typhi, S. paratyphi B, Yersinia
pestis, Brucella melitensis, Vibrio cholerae
y Staphylococcus aureus. Sin embargo, no
presentaba actividad aparente frente a las
cepas bacterianas Escherichia coli y
Shigella dysenteriae. Brotzu también realizó ensayos clínicos en los que trataba pacientes afectados por infecciones causadas por estafilococos o estreptococos
mediante la inyección intramuscular o
rectal de los extractos crudos (filtrados)
procedentes del cultivo de este hongo. El
efecto del tratamiento en los pacientes
(salvo por una sensación desagradable de
ardor local) era la desaparición del dolor,
la reducción de la inflamación, la disminución de la fiebre y finalmente la resolución bacteriológica de la infección.
Todos estos trabajos se publicaron en una
revista médica italiana denominada
Trabajos del Instituto de la Higiene de
Cagliari, con el título: “Búsqueda de un
nuevo antibiótico” (Brotzu, 1948). Este
hongo inicialmente denominado Cephalosporium acremonium fue rebautizado más
tarde con el nombre de Acremonium chrysogenum (Gams, 1971). Estos primeros estudios realizados por Brotzu no concluyeron
en la purificación del antibiótico debido a
la falta de financiación y tuvieron su continuidad en el laboratorio Sir Willian Dunn
School of Pathology en la Universidad de
Oxford. El grupo de Oxford demostró que
la cepa de Brotzu producía los antibióticos
cefalosporina P y cefalosporina N. La cefalosporina P es un compuesto de naturaleza
esteroide químicamente relacionado con
los ácidos fusídico y helvólico y que es activo frente a bacterias Gram positivas. La
cefalosporina N es una penicilina hidrofílica
que es activa frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas (Burton y Abraham,
1951; Crawford y col., 1952) a través del
grupo carboxilo de su cadena lateral D-αaminoadipil (Abraham y col., 1953). Este
último compuesto fue denominado penicilina N (PenN) (Florey, 1955) y nunca se comercializó.
Durante los estudios sobre PenN,
Abraham sospechaba que otra sustancia
estaba presente en las preparaciones, ya
que aparecía una absorción considerable
de luz ultravioleta a una longitud de onda
de 260 nm que no correspondía a PenN.
Este compuesto fue el tercer antibiótico
aislado de A. chrysogenum y se denominó cefalosporina C (CPC). La CPC
posee algunas ventajas con respecto a las
penicilinas, como son la resistencia a penicilinasas estafilococales y el hecho de
tener una mayor estabilidad en medio
ácido.
Programas para la obtención
de cepas industriales de
A. chrysogenum; condiciones
de fermentación
Los programas de mejora comenzaron a
mediados de los años 50 y se realizaron a
partir de la cepa original de A. chrysogenum aislada por Brotzu mediante el uso
de agentes mutagénicos, concretamente
radiación UV. De esta manera se obtuvo la
cepa M-8650, que constituyó en la cepa
de partida en numerosos programas industriales de mejora de la producción de
cefalosporinas (Elander y Aoki, 1982).
Como ejemplo de estos programas de mejora, la compañía americana Eli Lilly & Co.
obtuvo el mutante CW-19, el cual puede
producir 15 veces más CPC que el aislado
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
193
original de Brotzu (Elander y Espenshade,
1976).
Actualmente, la producción de las cepas
industriales de A. chrysogenum se sitúa
en torno a los 20-25 g/l y, a diferencia de
P. chrysogenum, estas cepas contienen
únicamente una sola copia de los genes
biosintéticos.
El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante sobre A. chrysogenum ha permitido la actuación directa sobre los genes
implicados en la biosíntesis, regulación y
secreción de CPC. De esta forma, el incremento del número de copias del gen cefEF
conduce a un incremento en la producción
de un 47% con respecto a la cepa control
y a una falta del indeseado intermediario
PenN en los caldos de fermentación
(Skatrud y col., 1989). Posteriormente, se
demostró que el efecto de este incremento
era también resultado del incremento en
la dosis del gen cefG (Gutiérrez y col.,
1992, 1999). En esta línea, Gutiérrez y col.
(1997) incrementaron el nivel de transcripción del gen cefG tras colocar este gen
bajo el control de promotores de expresión
fuerte. El resultado fue una mayor producción de CPC de hasta 4-5 veces con respecto a la de la cepa parental, como consecuencia de una mayor actividad
DAC-acetiltransferasa que procuraba una
conversión más eficiente de DAC en CPC.
Esta misma ingeniería genética ha hecho
posible que la sobreexpresión del gen cefT
o del tándem de genes cefD1-cefD2 duplique la producción de cefalosporinas con
respecto a la de la cepa control (Ullán y
col., 2002b, 2004).
Otro aspecto a tener en cuenta son las
condiciones en las cuales se fermenta
A. chrysogenum para maximizar la pro-
ducción de CPC. Así, se observó que la
adición de DL-metionina estimula la producción de CPC, proporcionando el
átomo de azufre del antibiótico (Demain,
1963) e induce las enzimas de síntesis de
CPC (Drew y Demain, 1973; Komatsu y
col., 1975; Sawada y col., 1980; Velasco
y col., 1994; Martín y Demain, 2002).
Igualmente, estos estudios determinaron
que la L-cisteína y la L-valina son precursores del núcleo 7-ACA (ácido 7-aminocefalosporánico) (Trown y col., 1963a;
Demain, 1963), mientras que el L-α-aminoadípico es precursor de la cadena lateral D-α-aminoadipil (Trown y col.,
1963b). Por otro lado, la concentración
de oxígeno disuelto en el medio (DOC)
tiene que mantenerse por encima de un
20%, ya que valores inferiores tienen
como consecuencia un acúmulo del intermediario PenN en los caldos, disminuyendo de manera considerable la producción de CPC. De esta manera, mantener
los niveles de DOC en un 40% conduce
a una mayor producción de CPC. Esto es
debido no solo a las características aerobias de A. chrysogenum sino a los requerimientos de oxígeno por parte de las enzimas de la ruta biosintética de CPC (Zhou
y col., 1992).
La composición del medio de cultivo varía
dependiendo de la cepa industrial de
A. chrysogenum, pero en líneas generales
se trata de medios complejos cuyos componentes principales son líquidos de maceración de maíz (principal fuente de nitrógeno y fósforo), soja y harina de
semillas de algodón o de cacahuete
(fuentes de proteínas). Como fuentes de
carbono de consumo rápido está la glucosa, y de consumo lento, el almidón o el
aceite de soja. También se incluyen sales
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
194
y, por supuesto, el aminoácido DL-metionina (Barber y col., 2004).
Los procesos fermentativos para la producción industrial de CPC se inician con
el inóculo de la biomasa fresca (de la cepa
industrial de A. chrysogenum) procedente
de placas de medio sólido en un medio
de cultivo líquido que proporcionan biomasa. Dicha biomasa se utiliza como inóculo de los llamados estados vegetativos
de la fermentación, un total de tres que
sirven para producir suficiente cantidad
de biomasa para inocular fermentadores
de 100 m3 en la llamada fase de producción, en la cual se sintetiza CPC (Barber y
col., 2004). Finalizada la fermentación, la
CPC tiene que ser purificada a través de
un proceso sumamente complejo en el
que se incluye una costosa purificación
cromatográfica. En el primer paso, la biomasa y el caldo que contiene el antibiótico se separan por filtración. A continuación, el caldo filtrado se pasa a través de
un par de columnas de cromatografía de
interacción hidrofóbica para separar las
proteínas, péptidos, sales y otras impurezas que incluyen los intermediarios DAC
y DAOC. La primera columna, conocida
como scavenger, se llena de una resina de
adsorción (por ejemplo, Diaion HP20) que
presenta una mínima adsorción de CPC y
que permite la unión de compuestos coloreados e hidrofóbicos. La segunda columna, denominada adsorber, consiste en
una resina hidrófoba, como Sepabeads
SP700, a la que se une la CPC. La elución
de los antibióticos es resultado de un
cambio de pH y su purificación se lleva a
cabo a través de cromatografía de intercambio iónico, lo que elimina las impurezas coloreadas. Finalizado el proceso se
obtiene una solución acuosa de CPC, la
cual puede ser cristalizada en forma de su
sal sódica o potásica o utilizada para producir 7-ACA.
Producción industrial de
cefalosporinas semisintéticas
A nivel farmacológico, las cefalosporinas
semisintéticas más importantes derivan de
los anillos 7-ACA y 7-ADCA. Dichos anillos cefalosporánicos se obtienen mediante la ingeniería genética de los
hongos filamentosos A. chrysogenum y
P. chrysogenum.
Producción industrial de 7-ACA
La escasa eficacia como antibiótico de la
CPC impulsó el desarrollo de nuevos derivados semisintéticos más activos mediante la introducción en el núcleo 7-ACA
de diferentes cadenas laterales en la posición 7´ y modificaciones en 3´. Estas alteraciones mejoran el espectro antibacteriano, la estabilidad frente a β-lactamasas
y, en general, incrementan las propiedades farmacocinéticas de la molécula.
El 7-ACA puede obtenerse con métodos
químicos o enzimáticos mediante la eliminación del grupo 7-aminoadipil de la cadena lateral de la molécula de CPC.
Básicamente, en los métodos químicos,
después de la protección del grupo amino
y carboxilo de la CPC, se emplea pentacloruro fosfórico para eliminar el 7-aminoadipil, obteniendo una molécula de 7ACA con una calidad excelente (figura
6A). El uso de los métodos químicos para
la producción industrial de 7-ACA fue iniciado por Morin y col. (1969) y, si bien ha
sido notablemente mejorado, resulta medioambientalmente insostenible, ya que
son necesarios solventes orgánicos que
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
195
generan residuos químicos sumamente
tóxicos (Barber y col., 2004).
Actualmente, la conversión industrial de
CPC en 7-ACA se realiza a través de un
proceso enzimático en dos pasos (figura
6A) empleando las enzimas D-aminoácido
oxidasa (DAO) y glutaril acilasa (GLA)
(Conlon y col., 1995; Riethorst y Reichert,
1999). En el primer paso, la CPC es desaminada oxidativamente a ceto-adipyl-7ACA (CA-7-ACA) por medio de la actividad enzimática DAO. El peróxido de
hidrógeno producido en la reacción provoca de manera espontánea la descarboxilación oxidativa del CA-7-ACA, originando el glutaril-7-ACA (GL-7-ACA).
Finalmente, en la segunda etapa este
compuesto se hidroliza a 7-ACA y glutarato por la acción de la enzima GLA.
Dicha enzima también acepta CA-7-ACA
como sustrato, pero su afinidad es baja y
la reacción es fuertemente inhibida en
presencia de GL-7-ACA.
Otro proceso alternativo para la conversión enzimática de CPC en 7-ACA resulta
de la acción combinada de DAO, GLA y
una catalasa. De esta manera, la enzima
DAO cataliza la desaminación oxidativa
de CPC a CA-7-ACA y la catalasa elimina
todo el peróxido de generados durante la
reacción, evitando así la formación de
GL-7-ACA. Bajo estas condiciones, GLA
convierte CA-7-ACA en 7-ACA y cetoglutarato (Guisan y col., 2002).
Un intento significativo para una producción directa de 7-ACA (recuperable de los
caldos de fermentación) fue llevada a
cabo por Isogai y col. (1991). En A. chrysogenum se introdujo un operón biosintético de 7-ACA formado por dos genes:
uno que codifica una DAO de Fusarium
solanarum y otro que codifica una GLA de
Pseudomonas diminuta. La cepa resultante transforma directamente CPC en 7ACA (figura 6B), junto con los ácidos
7-aminodesacetilcefalosporánico (7-DAC)
y 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7ADCA). Sin embargo, los niveles producidos de 7-ACA no resultaron industrialmente rentables, pero ponían de
manifiesto la posibilidad de expresar
genes bacterianos en hongos.
Producción industrial de 7-ADCA
El proceso tradicional para la producción
industrial del 7-ADCA tiene lugar tras la
fermentación de P. chrysogenum mediante un proceso con múltiples pasos,
que además es costoso y contaminante
(figura 6D). En dicho proceso tiene lugar
la expansión química del núcleo de la
PenG a fenilacetil-7-ADCA, seguido de la
eliminación de la cadena lateral aromática
mediante una desacetilación enzimática
catalizada por una penicilina acilasa
(Herbasch y col., 1984).
La alta capacidad de P. chrysogenum para
producir antibióticos, el mayor coste de
los procesos fermentativos de A. chrysogenum y la ingeniería genética han promovido la creación de cepas de P. chrysogenum con capacidad de producir el
anillo cefalosporánico. La primera aproximación fue la fermentación de cepas recombinantes de P. chrysogenum que portaban los genes cefD (epimerasa) y cefE
(expandasa) de S. clavuligerus, pero que,
sin embargo, presentaron una baja producción de la molécula DAOC, que es la
precursora del 7-ADCA tras la eliminación
en el carbono 7 de la cadena lateral alifática D-α-aminoadipil (figura 6F) (Cantwell
y col., 1992; Beckman y col., 1993).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
196
A
B
A. chrysogenum
C
A. chrysogenum
ACV
ACV
IPN
IPN
Pen N
ACV
IPN penDE
A. chrysogenum
cefD1-cefD2
Pen N
DAC
Pen N
A. chrysogenum
cefEF
DAC
CPC
DAC
(extracelular)
A. chrysogenum
cefEG
CPC
Pentacloruro
fosfórico
P. chrysogenum TA98
CPC
(intracelular)
Operón DAO-GLA
DAO
GLA
CA-7-ACA
GL-7-ACA
NH2
O
S
OCOCH3
N
COOH
7-ACA
D
P. chrysogenum
E
P. chrysogenum
ACV
ACV
IPN
IPN
Ácido
adípico
Ácido
fenilacético
F
P. chrysogenum
S. clavuligerus
cefE (expandasa)
Expansión
química
del anillo
ACV
IPN
IPN
S. clavuligerus
cefE (expandasa)
Pen N cefEF
S. clavuligerus
cefE (expandasa)
DAOC
DAO
DAOC
CA-7-ADCA
GLA
NH2
Penicilina
acilasa
ACV
Pen N
Adipil-7-ADCA
Fenilacetil-7-ADCA
A. chrysogenum
(cepa cefEF)
S. clavuligerus
cefD (epimerasa)
Adipil-6-APA
Penicilina G
G
O
GL-7-ADCA
S
N
GLA
CH3
COOH
7-ADCA
Figura 6. Estrategias para la producción de 7-ACA y 7-ADCA en A. chrysogenum y P. chrysogenum.
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
197
Un método alternativo a la expansión química para producir 7-ADCA se basa en utilizar cepas de P. chrysogenum que expresan
los genes cefE de S. clavuligerus o el gen
cefEF de A. chrysogenum. De esta forma,
cuando en la fermentación se añade ácido
adípico como precursor de la cadena lateral
en lugar de ácido fenilacético se forma
adipil-6-APA, el cual, por la acción de la actividad enzimática expandasa, se expande
a adipil-7-ADCA (Crawford y col., 1995).
Posteriormente, el tratamiento enzimático
con DAO elimina la cadena lateral de ácido
adípico produciendo 7-ADCA (figura 6E).
Siguiendo un enfoque similar, los genes
cefEF de A. chrysogenum y cmcH de S. clavuligerus (que codifica una carbamoil transferasa) se expresaron en P. chrysogenum,
dando lugar a la producción de ad7ACCCA (ácido adipoil-7-amino-3-carbamoiloxymethil-3-cefem-4-carboxílico). Este
compuesto es altamente estable y se utiliza
como precursor en la elaboración de cefalosporinas semisintéticas (Harris y col.,
2009).
Durante la búsqueda de cepas de P. chrysogenum con aplicación industrial para la
producción de cefalosporinas, se obtuvo la
cepa P. chrysogenum TA98 (Ullán y col.,
2007). Este transformante deriva del mutante P. chrysogenum npe6 pyrG– (Cantoral
y col., 1993), que carece de la actividad IPN
aciltransferasa como consecuencia de una
mutación en el gen penDE (Fernández y
col., 1994) y tiene integrados en su genoma todos los genes cefD1, cefD2, cefEF
y cefG (genes específicos de la ruta biosintética de CPC de A. chrysogenum). De esta
forma, en P. chrysogenum TA98, la IPN, que
es normalmente transformada en penicilina
G o penicilina V en la cepa parental, es
transformada en DAC y CPC (figura 6C).
Sin embargo, en los caldos de cultivo solo
se detecta DAC y no CPC que sí se detecta
a nivel intracelular. La ausencia extracelular
de CPC puede ser el resultado de su degradación en los caldos de fermentación o por
la falta de un transportador apropiado del
que carece P. chrysogenum (Ullán y col.,
2008).
Velasco y col. (2000) desarrollaron otro proceso alternativo al expresar el gen cefE de
S. clavuligerus en una cepa industrial de
A. chrysogenum previamente interrumpida
en el gen cefEF. El resultado es un transformante que produce mayoritariamente
DAOC, que es el sustrato para la producción de 7-ADCA mediante dos pasos enzimáticos (figura 6G). En el primer paso,
DAOC se transforma en ácido cetoadipil-7ADCA (C-7-ADCA) mediante una DAO de
Rhodotorula gracilis (Alonso y col., 1998).
Este compuesto reacciona espontáneamente con el peróxido de hidrógeno producido en la reacción, originándose el ácido
glutaril-7-ADCA (GL-7-ADCA). Finalmente,
el GL-7-ADCA se hidroliza a 7-ADCA por
una GLA de Acinetobacter sp. La ventaja
principal de este sistema de producción es
su eficiencia tanto a nivel industrial como
medioambiental, ya que evita el uso de procesos químicos.
Cefalosporinas semisintéticas
La base de las cefalosporinas comerciales
en la elaboración de las cefalosporinas semisintéticas la constituyen los núcleos
7-ACA, 7-ADCA y 7 DAC, aparte de los
núcleos derivados de las cefamicinas. La
adición en estos núcleos de una nueva cadena lateral en la posición 7' o la alteración de los 3' conduce a la modificación
de las propiedades farmacocinéticas de la
cefalosporina semisintética resultante,
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
198
cambiando el espectro antibacteriano y
posibilitando una mayor estabilidad frente
a β-lactamasas. En función de su espectro
y la resistencia enzimática a la degradación se han desarrollado cefalosporinas
comerciales de hasta cuatro generaciones
(Demain y Elander, 1999; Barber y col.,
2004).
Las cefalosporinas de primera generación
aparecieron en la década de los 60 (19641969), presentan un espectro de acción
moderado, son generalmente susceptibles
a β-lactamasas y son menos eficaces que
las penicilinas frente a microorganismos
anaerobios. Son activas contra numerosas
bacterias Gram positivas y su espectro se
extiende también a muchas Gram negativas, como cepas de E. coli, varias especies de Klebsiella (como K. pneumoniae),
Proteus indol negativos (no positivos)
Salmonella, Shigella y especies de
Enterobacter. Sin embargo, no tienen ninguna actividad contra Bacteroides fragilis,
enterococos, estafilococos resistentes a
meticilina, Pseudomonas, Acinetobacter,
Enterobacter o Serratia. Los miembros de
esta familia de antibióticos son la cefradina, la cefalexina, el cefadroxilo, la cefalotina, la cefaloridina, la cefapirina, la cefazolina y la cefradina. La cefradina y
cefalexina son ácido resistentes, por lo
que pueden administrarse por vía oral, a
diferencia de la cefalotina, que solo se
puede hacer por vía intravenosa.
Las cefalosporinas de segunda generación
aparecieron en la década de los 70 y poseen un espectro antibacteriano mayor
que las de la primera. Son en líneas generales más resistentes a β-lactamasas, pero
tienen una escasa penetración de la barrera hematoencefálica. Presentan actividad frente a un mayor número de bac-
terias Gram positivas y Gram negativas,
especialmente frente a estas últimas.
Entre su espectro antibacteriano se sitúan
Haemophilus influenzae, E. coli,
Klebsiella, cepas de enterobacter, cepas
indol positivas, Neissseria gonorreae,
Neissseria meningitidis y microorganismos
anaerobios. Son ineficaces frente a
Pseudomonas aeruginosa, especies
Actinobacter y un buen número de anaerobios estrictos. Ejemplos de la segunda
generación de cefalosporinas son el cefaclor, la cefuroxima, la cefatrizina, el cefamandol, la ceforanida, el cefonicid y el
cefmetazol. Dentro de esta generación
también se incluyen el cefmetazol, el cefotetán y la cefoxitina (con actividad
frente a bacterias anaeróbicas), a pesar de
pertenecer al grupo de cefamicinas
dentro de los antibióticos β-lactámicos.
Las cefalosporinas de tercera generación
(década de los 80) poseen en líneas generales una actividad similar a las de la
primera generación frente a bacterias
Gram positivas. Sin embargo, las de tercera generación son más resistentes a las
betalactamasas y poseen una mayor actividad antibacteriana frente a numerosas
infecciones provocadas por gérmenes
Gram negativos, como Proteus vulgaris, y
diferentes especies de los géneros
Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus,
Neisseria y Moraxella. Por otro lado, su actividad es menor frente a estafilococos,
aunque por lo general son eficaces contra
las cepas de Streptococcus pneumoniae
resistentes a la penicilina. Algunas cefalosporinas de esta generación pueden
atravesar la barrera hematoencefálica con
relativa facilidad (alcanzando importantes
concentraciones en el líquido cefalorraquídeo) y penetrar en el sistema nervioso
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
199
central, lo que los hace efectivos en el tratamiento de la meningitis bacteriana causada por bacterias sensibles a este antibiótico. Algunos ejemplos de estas
cefalosporinas son la cefixima, el ceftibuteno, la cefotaxima, la ceftriaxona, la ceftazidima y la ceftizoxima (Klein y Cunha,
1995).
La cuarta generación de cefalosporinas
tiene una mayor resistencia a las β-lactamasas que la generación anterior. Su espectro de actividad es más amplio (Gram
positivas y Gram negativas, pobre contra
anaerobios) con una reducción de la resistencia por parte de las bacterias Gram
negativas debido a las características de
la estructura química de la molécula antibiótica. Además, la mayoría puede cruzar
la barrera hematoencefálica, lo cual las
hace eficaces contra la meningitis.
También estos antibióticos se utilizan para
combatir las infecciones causadas por
P. aeruginosa. Como ejemplo de la cuarta
generación de cefalosporinas está la cefepima, la cefpiroma, la cefquinoma, la
cefclidina, el cefoselis, el cefluprenam y el
cefozoprán.
Para mejorar la actividad antibiótica de las
cefalosporinas y minimizar la aparición de
microorganismos resistentes, algunas de
estas cefalosporinas semisintéticas han sido
combinadas con inhibidores de β-lactamasas. Un ejemplo es la combinación de la
cefalosporina de tercera generación cefoperazona y el inhibidor sulbactam en el producto comercial Sulperazone® (Demain y
Elander, 1999). Por otro lado, las cefalosporinas de quinta generación se han desarrollado en el laboratorio para luchar específicamente contra cepas resistentes a los
antibióticos. En particular, el ceftobiprol y la
cefatarolina son eficaces contra bacterias
Gram negativas y Gram positivas, incluidas
las cepas resistentes a meticilina (SARM) de
Staphylococcus aureus y Streptococcus
pneumoniae (Kollef, 2009; Steed y Rybak,
2010). Actualmente, los programas de investigación están centrados en el desarrollo
de nuevas generaciones de cefalosporinas
semisintéticas con las cuales se pretende incrementar la estabilidad frente β-lactamasas, el espectro de acción y su biodisponibilidad.
Perspectivas futuras
Los antibióticos β-lactámicos destacan
sobre las demás familias de antibióticos
porque son los más prescritos en todo el
mundo. La mayoría de estos antibióticos,
concretamente las penicilinas y cefalosporinas, presentes en el mercado son comercializados como genéricos. Únicamente
un pequeño porcentaje, como el ceftobiprole, son nuevas moléculas sujetas a patentes farmacéuticas. Sin embargo, la presencia de los β-lactámicos en el mercado
de los antibióticos ha pasado de un 50%
en 1998 a un 65% en la actualidad. En
cifras, se ha pasado de 11 a 18 billones
de dólares, 10 en el caso de las cefalosporinas y 8 en el caso de las penicilinas
(Schmidt y col., 2010). Los estudios de genómica y proteómica han contribuido al
conocimiento de las bases moleculares
que justifican la mayor producción de antibiótico por parte de las cepas industriales. Las líneas de investigación actuales
se centran en el estudio del transporte,
tanto de los intermediarios biosintéticos
como de la secreción del producto final.
Igualmente es objeto de estudio la interacción entre el metabolismo primario y
secundario, así como las interacciones de
los componentes involucrados en la bio-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
200
síntesis de los antibióticos β-lactámicos.
También es relevante el conocimiento de
los circuitos reguladores y las vías de
transducción de señales. La presencia tan
fuerte de los β-lactámicos hace que, a
pesar de llevar más de 50 años en el mercado de los antibióticos, son un importante pilar para el tratamiento de las infecciones bacterianas. Por este motivo se
está intentando tanto economizar los procesos de producción de los antibióticos
β-lactámicos como innovar con nuevos
derivados semisintéticos.
Bibliografía recomendada
Abraham EP, Newton GG. The structure of
cephalosporin C. Biochem J 1961; 79:377-93.
Abraham EP, Newton GGF, Crawford K,
Burton HS, Hale CW. Cephalosporin N: a new
type of penicillin N. Nature 1953; 171:343.
Aharonowitz Y, Cohen G, Martín JF. Penicillin
and cephalosporin biosynthetic genes: structure, organization, regulation, and evolution.
Annu Rev Microbiol 1992; 46:461-95.
Alonso J, Barredo JL, Díez B, Mellado E, Salto F,
García JL, Cortés E. D-amino-acid oxidase gene
from Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) ATCC 26217. Microbiology 1998;
144(Pt. 4):1.095-101.
Álvarez E, Meesschaert B, Montenegro E,
Gutiérrez S, Díez B, Barredo JL, Martín JF. The
isopenicillin-N acyltransferase of Penicillium
chrysogenum has isopenicillin-N amidohydrolase, 6-aminopenicillanic acid acyltransferase
and penicillin amidase activities, all of which
are encoded by the single penDE gene. Eur J
Biochem 1993; 215:323-32.
Anné J. Somatic hybrization between Penicillium
chrysogenum species after induced fusion of
their protoplasts. Agricultura 1977; 25:1-17.
Arroyo M, De la Mata I, Acebal C, Castillón
MP. Biotechnological applications of penicillin
acylases: state-of-the-art. Appl Microbiol
Biotechnol 2003; 60:507-14.
Asbel LE, Levison ME. Cephalosporins, carbapenenms and monobactams. Infect Dis Clin
North Am 2000; 14:435-47.
Backus MP, Stauffer JF. The production and selection of a family of strains in Penicillium chrysogenum. Mycologia 1995; 47:429-63.
Barber MS, Giesecke U, Reichert A, Minas W.
Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv Biochem Eng
Biotechnol 2004; 88:179-215.
Barredo JL, Cantoral JM, Álvarez E, Díez B,
Martín JF. Cloning, sequence analysis and
transcriptional study of the isopenicillin N synthase of Penicillium chrysogenum AS-P-78. Mol
Gen Genet 1989a; 216:91-8.
Barredo JL, Van Solingen P, Díez B, Álvarez E,
Cantoral JM, Kattevilder A, Smaal EB, Groenen
MA, Veenstra AE, Martín JF. Cloning and characterization of the acyl-coenzyme A: 6-aminopenicillanic-acid-acyltransferase gene of
Penicillium chrysogenum. Gene 1989b;
83:291-300.
Barredo JL, Díez B, Álvarez E, Martín JF. Large
amplification of a 35-Kb DNA fragment carrying two penicillin biosynthetic genes in high
penicillin producing strains of Penicillium chrysogenum. Curr Genet 1989c; 16:453-59.
Beckman R, Cantwell CA, Whiteman P, Qeener
SW, Abraham EP. Production of deacetoxycephalosporin C by transformants of Penicillium
chrysogenum: Antibiotic biosynthetic pathway
engineering. In: R.H. Baltz, C.G. Hegeman and
P.L. Skatrud (eds.). Industrial microorganisms:
basic and applied molecular genetics. American
Society for Microbiology, Washington DC, USA.
1993c; 177-82.
Brakhage AA, Thön M, Spröte P, Scharf DH,
Al-Abdallah Q, Wolke SM, Hortschansky P.
Aspects on evolution of fungal beta-lactam
biosynthesis gene clusters and recruitment of
trans-acting factors. Phytochemistry 2009;
70:1.801-11.
Brotzu G. Richerche su di un nuovo antibiotico. Lav Ist d´Igiene Cagliari 1948; 1-11.
Burton HS, Abraham EP. Isolation of antibiotics from a species of Cephalosporium.
Cephalosporins P1, P2, P3, P4 and P5.
Biochem J 1951; 50:164-74.
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
201
Burzlaff NI, Rutledge PJ, Clifton IJ, Hensgens
CM, Pickford M, Adlington RM, Roach PL,
Baldwin JE. The reaction cycle of isopenicillin
N synthase observed by X-ray diffraction.
Nature 1999; 401:721-24.
Cantoral JM, Gutiérrez S, Fierro F, Gil-Espinosa
S, Van Liempt H, Martín JF. Biochemical and
characterization and molecular genetics of
nine mutants of Penicillium chrysogenum impaired in penicillin biosynthesis. J Biol Chem
1993; 268:737–44.
Cantwell C, Beckmann R, Whiteman P,
Queener SW, Abraham EP. Isolation of deacetoxycephalosporin C from fermentation broths
of Penicillium chrysogenum transformants:
construction of a new fungal biosynthetic
pathway. Proc R Soc Lond B 1992; 248:283-9.
Carr LG, Skatrud PL, Scheetz ME, Queener SW,
Ingolia TD. Cloning and expression of the isopenicillin N synthetase gene from Penicillium
chrysogenum. Gene 1986; 48:257-66.
Chain E, Florey HW, Gardner AD. Penicillin as
a chemotherapeutic agent. Lancet 1940;
ii:226-8.
Chambers HF, Mandell GL, Bennett GL, Dolin
R. Penicillins. Principles and Practice of
Infectious Diseases. 6th ed. New York: Elsevier
Churchill Livingstone, 2005; 281-93.
Chiang SJ. Strain improvement for fermentation and biocatalysis processes by genetic engineering technology. J Ind Microbiol Biotechnol
2004; 31:99-108.
Clutterbuck PW, Lovel IR, Raistrick H. Studies
in the biochemistry of the microorganisms.
XXVI. The formation from glucose by members of the Penicillium chrysogenum species
of a pigment, an alkali soluble protein and penicillin. The antibacterial substance of Fleming.
Biochem J 1932; 26:1.907-18.
Conlon HD, Baqai J, Baker K, Shen YQ, Wong
BL, Noiles R, Rausch CW. Two-step immobilized enzyme conversion of cephalosporin C
to 7-aminocephalosporanic acid. Biotechnol
Bioeng 1995; 46:510-3.
Cooper RD. The enzymes involved in biosynthesis of pencillin and cephalosporin; their
structure and function. Bioorg Medic Chem
1993; 1:1-17.
Coque JJ, Martín JF, Liras P. Characterization
and expression in Streptomyces lividans of
cefD and cefE genes from Nocardia lactamdurans: the organization of the cephamycin gene
cluster differs from that in Streptomyces clavuligerus. Mol Gen Genet 1993; 236:453-8.
Crawford K, Heatley NG, Boyd PF, Hale CW,
Kelley BK, Miller GA, Smith N. Antibiotic production by a species of Cephalosporium. J Gen
Microbiol 1952; 6:47-59.
Crawford L, Stepan AM, McAda PC,
Rambonsek JA, Conder MJ, VinciVA, Reeves CD.
Production of cephalosporin intermediates by
feeding adipic acid to recombinant Penicillium
chrysogenum strains expressing ring activity.
Bio/technology 1995; 13:58-62.
Davies J. What are antibiotics? Archaic functions for modern activities. Mol Microbiol
1990; 4:1.227-32.
Demain AL, Elander RP. The beta-lactam antibiotics: past, present, and future. Antonie Van
Leeuwenhoek. 1999; 75:5-19.
Demain AL. Biosynthesis of cephalosporin C
and its relation to penicillin formation. Trans
N.Y. Acad Sci 1963; 25:731-40.
Díez B, Gutiérrez S, Barredo JL, Van Solingen
P, Van der Voort LH, Martín JF. The cluster of
penicillin biosynthetic genes. Identification
and characterization of the pcbAB gene encoding the alpha-aminoadipyl-cysteinylvaline synthetase and linkage to the pcbC
and penDE genes. J Biol Chem 1990;
265:16.358-65.
Dotzlaf JE, Yeh WK. Copurification and characterization of deacetoxycephalosporin C
synthetase/hydroxylase from Cephalosporium
acremonium. J Bacteriol 1987; 169:1.611-8.
Drew SW, Demain AL. Methionine control of
cephalosporin C formation. Biotechnol Bioeng
1973; 15(4):743-54.
Elander RP, Aoki H. Chemistry and biology of
β-lactam antibiotics. In R. B. Morin & M.
Gorman (Eds). Vol. 3: The biology of β-lactam
antibiotics. New York: Academic Press, 1982;
84-154.
Elander RP, Espenshade MA. The role of microbial genetics. In B. M. Miller & W. Litsky (Eds).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
202
Industrial Microbiology. New York: McGrawHill, 1976; 192-256.
Elander RP. Industrial production of betalactam antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol
2003; 61.385-92.
Evers ME, Trip H, van den Berg MA, Bovenberg
RA, Driessen AJ. Compartmentalization and
transport in beta-lactam antibiotics biosynthesis.
Adv Biochem Eng Biotechnol 2004; 88:111-35.
Fernández FJ, Gutiérrez S, Velasco J,
Montenegro E, Marcos AT, Martín JF. Molecular
characterization of three loss-of-function mutations in the isopenicillin N acyltransferase gene
(penDE) of Penicillium chrysogenum. J Bacteriol
1994; 176:4.941-8.
Fierro F, Barredo JL, Díez B, Gutiérrez S,
Fernández FJ, Martín JF. The penicillin gene
cluster is amplified in tandem repeats linked
by conserved hexanucleotide sequences. Proc
Natl Acad Sci USA 1995; 92:6.200-4.
Fierro F, García-Estrada C, Castillo NI, Rodríguez
R, Velasco T, Martín JF. Transcriptional and bioinformatics analysis of the 58.6 kb DNA region
amplified in tandem repeats contain the penicillin gene cluster in Penicillium chrysogenum.
Fungal Genet Biol 2006; 43:618-29.
Fierro F, Gutiérrez S, Díez B, Martín JF.
Resolution of four large chromosomes in penicillin-producing filamentous fungi: the penicillin gene cluster is located on chromosome II
(9.6 Mb) in Penicillium notatum and chromosome I (10.4 Mb) in Penicillium chrysogenum.
Mol Gen Genet 1993; 241:573-8.
Fleming A. On the antibacterial action of a
Penicillium with special reference to theiruse
in the isolation of B. influenzae. Brit J Exp
Pathol 1929; 10:226-36.
Florey HW. Antibiotic products of a versatile
fungus. Ann Intern Med 1955; 43:480-90.
Gams W. Cephalosporium-artige Schimmelpilze
(Hyphomycetes). Stuttgar: Fischer Verlag G (Ed.),
1971; 262 pp.
García-Estrada C, Ullán RV, Velasco-Conde T,
Godio RP, Teijeira F, Vaca I, Feltrer R, Kosalková
K, Mauriz E, Martín JF. Post-translational
enzyme modification by the phosphopantetheinyl transferase is required for lysine and pe-
nicillin biosynthesis but not for roquefortine or
fatty acid formation in Penicillium chrysogenum. Biochem J 2008; 415:317-24.
Gledhill L, Greaves PA, Griffin JP. PhenylacetylCoA ligase from Penicillium chrysogenum.
Patent IPN WO97/02349, Smithkline Beecham
U.K. 1997.
Guisan JM., Fernández-Lafuente R, FernándezLorente G, Betancort L, Hidalgo A, Mateo C.
A process for the preparation of cephalosporin
acid derivatives from cephalosporin C. Patente
Europea (02075989.0). 2002.
Gutiérrez S, Díez B, Montenegro E, Martín JF.
Characterization of the Cephalosporium acremonium pcbAB gene encoding alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase, a large
multidomain peptide synthetase: linkage to
the pcbC gene as a cluster of early cephalosporin biosynthetic genes and evidence of
multiple functional domains. J Bacteriol 1991;
173:2.354-65.
Gutiérrez S, Fierro F, Casqueiro J, Martín JF.
Gene organization and plasticity of the betalactam genes in different filamentous fungi.
Antonie van Leeuwenhoek. 1999; 75:81-94.
Gutiérrez S, Velasco J, Fernández FJ, Martín JF.
The cefG gene of Cephalosporium acremonium is linked to the cefEF gene and encodes
a deacetylcephalosporin C acetyltransferase
closely related to homoserine O-acetyltransferase. J Bacteriol 1992; 174:3.056-64.
Gutiérrez S, Velasco J, Marcos AT, Fernández
FJ, Fierro F, Barredo JL, Díez B, Martín JF.
Expression of the cefG gene is limiting for cephalosporin biosynthesis in Acremonium chrysogenum. Appl Microbiol Biotechnol 1997;
48:606-14.
Hamilton-Miller JM. Sir Edward Abraham's
contribution to the development of the cephalosporins: a reassessment. Int J Antimicrob
Agents 2000; 15:179-84.
Harris DM, Westerlaken I, Schipper D, Van der
Krogt ZA, Gombert AK, Sutherland J,
Raamsdonk LM, Van den Berg MA, Bovenberg
RA, Pronk JT, Daran JM. Engineering of
Penicillium chrysogenum for fermentative production of a novel carbamoylated cephem antibiotic precursor. Metab Eng 2009; 11:125-37.
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
203
Herbasch GJM, Van der Beek CP, Van Dijck
PWM. The penicillins: properties, biosynthesis
and fermentation. En: Biotechnology of industrial antibiotics. Vandamme E (Ed.). New York:
Marcel Dekker 1984.
Klein NC, Cunha BA. Third-generation cephalosporins. Med Clin North Am 1995; 79:705-19.
Hodgkin DC, Maslen EN. The x-ray analysis of
the structure of cephalosporin C. Biochem J
1961; 79:393-402.
Komatsu KI, Mizuno M, Kodaira R. Effect of
methionine on cephalosporin C and penicillin
N production by a mutant of Cephalosporium
acremonium. J Antibiot 1975; 28(11):881-8.
Hodgkin DC. The X-ray analysis of the structure of penicillin. Adv Sci 1949; 6:85-9.
Hopwood DA, Merrick MJ. Genetics of antibiotic production. Bacteriol Rev 1977;
41:595-635.
Isogai T, Fukagawa M, Aramori I, Iwami M,
Kojo H, Ono T, Ueda Y, Kohsaka M, Imanaka
H. Construction of a 7-aminocephalosporanic
acid (7ACA) biosynthetic operon and direct
production of 7ACA in Acremonium chrysogenum. New York: Biotechnology 1991;
9:188-91.
Jacoby GA, Medeiros A. More extended-spectrum β-lactamases. Antimicrob Agents
Chemother 1991; 324:601-12
Jami MS, Barreiro C, García-Estrada C, Martín
JF. Proteome analysis of the penicillin producer
Penicillium chrysogenum: Characterization of
protein changes during the industrial strain improvement. Mol Cell Proteomics 2010;
9:1.182-98.
Jensen SE, Westlake DW, Wolfe S. Deacetoxycephalosporin C synthetase and deacetoxycephalosporin C hydroxylase are two separate
enzymes in Streptomyces clavuligerus. Tokio:
J Antibiot 1985; 38:263-5.
Kadurina M, Bocheva G, Tonev S. Penicillin and
semisynthetic penicillins in dermatology. Clinics
in Dermatology 2003; 21:12-23.
Kalant H, Roschlau W. Penicillins In:
Principles of medical pharmacology, (6th ed).
New York-Oxford: Oxford University Press,
1998; 658-71.
Kiel JA, Van der Klei IJ, Van den Berg MA,
Bovenberg RA, Veenhuis M. Overproduction
of a single protein, Pc-Pex11p, results in 2-fold
enhanced penicillin production by Penicillium
chrysogenum. Fungal Genet Biol 2005;
42:154-64.
Kollef MH. New antimicrobial agents for methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Crit
Care Resusc 2009; 11:282-6.
Kong KF, Schneper L, Mathee K. Beta-lactam
antibiotics: from antibiosis to resistance and
bacteriology. APMIS 2010; 118:1-36.
Kosalková K, Rodríguez-Saiz M, Barredo JL,
Martín JF. Binding of the PTA1transcriptional
activator to the divergent promoter region of
the first two genes of the penicillin pathway
in different Penicillium species. Curr Genet
2007; 52:229-37.
Kosalková K, García-Estrada C, Ullán RV, Godio
RP, Feltrer R, Teijeira F, Mauriz E, Martín JF. The
global regulator LaeA controls penicillin
biosynthesis, pigmentation and sporulation,
but not roquefortine C synthesis in Penicillium
chrysogenum. Biochimie 2009; 91:214-25.
Kovacevic S, Tobin MB, Miller JR. The betalactam biosynthesis genes for isopenicillin N
epimerase and deacetoxycephalosporin C
synthetase are expressed from a single transcript in Streptomyces clavuligerus. J Bacteriol
1990; 172:3.952-8.
Kupka J, Shen Y-Q, Wolfe S, Demain AL.
Studies on the ring-cyclization and ring-expansion enzymes of beta-lactam biosynthesis in
Cephalosporium acremonium. Can J Microbiol
1983; 29:488-96.
Kycers A, Crowe S, Grayson ML, Hoy J. The
Penicillins and Related Drugs. The Use of
Antibiotics: A Clinical Review of Antibacterial,
Antifungal, and Antiviral Drugs. 5th ed.
Oxford, United Kingdom: ButterworthHeinemann Publishing, 1997; 1-250.
Lamas-Maceiras M., Vaca I, Rodríguez E,
Casqueiro J, Martín JF. Amplification and disruption of the phenylacetyl-CoA ligase gene
of Penicillium chrysogenum encoding an arylcapping enzyme that supplies phenylacetic
acid to the isopenicillin N acyltransferase.
Biochem J 2006; 395:147-55.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
204
Loder B, Newton GG, Abraham EP. The cephalosporin C nucleus (7-aminocephalosporanic
acid) and some of its derivatives. Biochem J
1961; 79:408-16.
MacCabe AP, Van Liempt H, Palissa H, Unkles
SE, Riach MB, Pfeifer E, Von Döhren H,
Kinghorn JR. Delta-(L-alpha-aminoadipyl)-Lcysteinyl-D-valine synthetase from Aspergillus
nidulans. Molecular characterization of the
acvA gene encoding the first enzyme of the
penicillin biosynthetic pathway. J Biol Chem
1991; 266:12.646-54.
Martín JF, Demain AL. Control of antibiotic
biosynthesis. Microbiol Rev 1980; 44:230-51.
Martín JF, Demain AL. Unraveling the methionine-cephalosporin puzzle in Acremonium chrysogenum. Trends Biotechnol 2002; 20:502-7.
Martín JF, Ullán RV, García-Estrada C. Regulation
and compartmentalization of β-lactam biosynthesis. Microb Biotechnol 2010; 3:285-99.
Martín JF. Alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine
synthetases in beta-lactam producing organisms. From Abraham's discoveries to novel
concepts of non-ribosomal peptide synthesis.
Tokio: J Antibiot, 2000; 53:1.008-21.
Mathison L, Soliday C, Stepan T, Aldrich T,
Rambosek J. Cloning, characterization, and use
in strain improvement of the Cephalosporium
acremonium gene cefG encoding acetyl transferase. Curr Genet 1993; 23:33-41.
Matsuda A, Sugiura H, Matsuyama K,
Matsumoto H, Ichikawa S, Komatsu K. Cloning
and disruption of the cefG gene encoding
acetyl coenzyme A: deacetylcephalosporin C
Oacetyltransferase from Acremonium chrysogenum. Biochem Biophys Res Commun 1992;
186:40-6.
Matsuzono Y, Matsuzaki T, Fujiki. Functional
domain mapping of peroxin Pex19p: interaction with Pex3p is essential for function and
translocation. J Cell Sci 2006; 119:3.539-50.
Montenegro E, Barredo JL, Gutiérrez S, Díez B,
Álvarez E, Martín JF. Cloning, characterization
of the acyl-CoA: 6-amino penicillanic acid acyltransferase gene of Aspergillus nidulans and
linkage to the isopenicillin N synthase gene.
Mol Gen Genet 1990; 221:322-30.
Morin RB, Jackson BG, Flynn EH, Roeske RW,
Andrews SL. Chemistry of cephalosporin antibiotics. XIV. The reaction of cephalosporin C
with nitrosyl chloride. J Am Chem Soc 1969;
91:1.396-400.
Müller WH, Bovenberg RA, Groothuis MH,
Kattevilder F, Smaal EB, Van der Voort, LH,
Verkleij AJ. Involvement of microbodies in penicillin biosynthesis. Biochim Biophys Acta
1992; 1.116:210-3.
Müller WH, Essers J, Humbel BM, Verkleij AJ.
Enrichment of Penicillium chrysogenum microbodies by isopycnic centrifugation in nycodenz
as visualized with immuno-electron microscopy.
Biochim Biophys Acta 1995; 1.245:215-20.
Müller WH, Van der Krift TP, Krouwer AJ,
Wosten HA, Van der Voort LH, Smaal EB,
Verkleij AJ. Localization of the pathway of the
penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. EMBO J 1991; 10:489-95.
Newbert RW, Barton B, Greaves P, Harper J,
Turner G. Analysis of a commercially improved
Penicillium chrysogenum strain series: involvement of recombinogenic regions in amplification and deletion of the penicillin biosynthesis
gene cluster. J Ind Microbiol Biotechnol 1997;
19:18-27.
Nijland JG, Kovalchuk A, van den Berg MA,
Bovenberg RA, Driessen AJ. Expression of the
transporter encoded by the cefT gene of
Acremonium chrysogenum increases cephalosporin production in Penicillium chrysogenum. Fungal Genet Biol 2008; 45:1.415-21.
O´Sullivan J, Sykes RB. β-Lactam antibiotics. En:
Biotechnology, a comprehensive treatise in 8
volumes, vol 4. Eds. Pape H. y Rehm H-J.
Weinheim, Germany: VCH Verlagsgesellschaft,
1986; 247-81.
Olano C, Lombó F, Méndez C, Salas JA.
Improving production of bioactive secondary
metabolites in actinomycetes by metabolic engineering. Metab Eng 2008; 10:281-92.
Oshiro BT. The Semisynthetic Penicillins. Primary
Care Update for OB/GYNS. 1999; 6:56-60.
Petri WA Jr, Hardman JG, Limbird LE, Gilman
AG. Antimicrobial Agents: Penicillins,
Cephalosporins, and Other β-lactam Antibiotics.
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
205
The Pharmacological Basis of Therapeutics. 10th
ed. New York: McGraw-Hill Medical Publishing
Division, 2001; 1.189–18.
Rajendhran J, Gunasekaran P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. J Biosci Bioeng
2004; 97:1-13.
Ramón D, Carramolino L, Patiño C, Sánchez F,
Peñalva MA. Cloning and characterization of
the isopenicillin N synthetase gene mediating
the formation of the beta-lactam ring in
Aspergillus nidulans. Gene 1987; 57:171-81.
Ramos FR, López-Nieto MJ, Martín JF.
Isopenicillin N synthetase of Penicillium chrysogenum, an enzyme that converts delta-(Lalpha-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine to isopenicillin N. Antimicrob Agents Chemother
1985; 27:380-7.
Raper KB, Alexander DF. Penicillin. V.
Mycological aspects of penicillin production.
J. Elisha Mitchell Sci Soc 1945; 61:74-113.
Raper KB. The development of improved penicillin-producing molds. Ann NY Acad Sci
1946; 58:41-56.
Reumann S. Specification of the peroxisome
targeting signals type 1 and type 2 of plant peroxisomes by bioinformatics analyses. Plant
Physiol 2004; 135:783-800.
Riethorst W, Reichert A. An industrial view on
enzymes for the cleavage of cephalosporin C.
Chimia 1999; 53:600-7.
Rodríguez-Saiz M, Barredo JL, Moreno MA,
Fernández-Cañón JM, Peñalva MA, Díez B.
Reduced function of a phenylacetate-oxidizing
cytochrome p450 caused strong genetic improvement in early phylogeny of penicillin-producing strains. J Bacteriol 2001; 183:5.465-71.
Rolinson GN, Geddes AM. The 50th anniversary of the discovery of 6-aminopenicillanic
acid (6-APA). Int J Antimicrob Agents 2007;
29:3-8.
Rottensteiner H, Kramer A, Lorenzen S, Stein
K, Landgraf C, Volkmer-Engert R, Erdmann R.
Peroxisomal membrane proteins contain
common Pex19p-binding sites that are an integral part of their targeting signals. Mol Biol
Cell 2004; 15:3.406-17.
Samson SM, Belagaje R, Blankenship DT,
Chapman JL, Perry D, Skatrud PL, Van Frank
RM, Abraham EP, Baldwin JE, Queener SW.
Isolation, sequence determination and expression in Escherichia coli of the isopenicillin N
synthetase gene from Cephalosporium acremonium. Nature 1985; 318:191-4.
Samson SM, Dotzlaf JE, Slisz ML, Becker GW,
van Frank RM. Veal LE, Yeh W-K, Miller JE,
Queener SW, Ingolia TD. Cloning and expression of the fungal expandase/hidroxylase gene
involved in cephalosporin biosynthesis.
Bio/Technology 1987; 5:1.207-14.
Sawada Y, Konomi T, Solomon NA, Demain
AL. Increase in activity of β-lactam synthetases
after growth of Cephalosporium acremonium
with methionine or norleucine. FEMS
Microbiol Lett 1980; 9:281-4.
Schmidt FR. The ‚-lactam antibiotics: current
situation and future prospects in manufacture
and therapy. In: The Mycota. Vol. X: Industrial
Applications. 2nd Edition. Springer Berlin
Heidelberg. 2010; 10:101-21.
Sio CF, Quax WJ. Improved beta-lactam acylases and their use as industrial biocatalysts.
Curr Opin Biotechnol 2004; 15:349-55.
Skatrud PL. Genetic engineering of betalactam antibiotic biosynthetic pathways in filamentous fungi. Trends Biotechnol 1992;
10:324-9.
Skatrud PL, Queener SW. An electrophoretic
molecular karyotype of an industrial strain of
Cephalosporium acremonium. Gene 1989;
78:331-8.
Skatrud PL, Tietz AJ, Ingolia TD. Use of recombinant DNA to improve production of cephalosporin C by Cephalosporium acremonium.
Bio/Technology 1989; 7:476-85.
Smith AW, Collis K, Ramsden M, Fox HM,
Peberdy JF. Chromosome rearrangements in
improved cephalosporin C producing strains
of Acremonium chrysogenum. Curr Genet
1891; 19:235-7.
Steed ME, Rybak MJ. Ceftaroline: a new cephalosporin with activity against resistant Gram
positive pathogens. Pharmacotherapy 2010;
30:375-89.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
206
Tahoun MK. Gene manipulation by protoplast
fusion and penicillin production by Penicillium
chrysogenum. Appl Biochem Biotechnol 1993;
39-40:445-53.
Teijeira F, Ullán RV, Fernández-Aguado M,
Martín JF. CefR modulates transporters of
beta-lactam intermediates preventing the loss
of penicillins to the broth and increases cephalosporin production in Acremonium chrysogenum. Metab Eng 2011; 13:532-43.
Teijeira F, Ullán RV, Guerra SM, García-Estrada
C, Vaca I, Martín JF. The transporter CefM involved in translocation of biosynthetic intermediates is essential for cephalosporin production. Biochem J 2009; 418:113-24.
Tobin MB, Fleming MD, Skatrud PL, Miller JR.
Molecular characterization of the acyl-coenzyme A: isopenicillin N acyltransferase gene
(penDE) from Penicillium chrysogenum and
Aspergillus nidulans and activity of recombinant enzyme in Escherichia coli. J Bacteriol
1990; 172:5.908-94.
Trown PW, Sharp M, Abraham EP. AlphaOxoglutarate as a precursor of the D-alphaaminoadipic acid residue in cephalosporin C.
Biochem J 1963a; 86:280-4.
Trown PW, Smith B, Abraham EP. Biosynthesis
of cephalosporin C from amino acids. Biochem
J 1963b; 86:284-91.
Ullán RV, Campoy S, Casqueiro J, Fernández
FJ, Martín JF. Deacetylcephalosporin C production in Penicillium chrysogenum by expression
of the isopenicillin N epimerization, ring expansion, and acetylation genes. Chem Biol
2007; 14:329-39.
Ullán RV, Casqueiro J, Bañuelos O, Fernández
FJ, Gutiérrez S, Martín JF. A novel epimerization system in fungal secondary metabolism
involved in the conversion of isopenicillin N
into penicillin N in Acremonium chrysogenum.
J Biol Chem 2002a; 277:46.216-25.
Ullan RV, Casqueiro J, Naranjo L, Vaca I, Martín
JF. Expression of cefD2 and the conversion of
isopenicillin N into penicillin N by the twocomponent epimerase system are rate-limiting
steps in cephalosporin biosynthesis. Mol Genet
Genomics 2004; 272:562-70.
Ullán RV, Liu G, Casqueiro J, Gutiérrez S,
Bañuelos O, Martín JF. The cefT gene of
Acremonium chrysogenum C10 encodes a
multidrug efflux pump protein that significantly increases cephalosporin C production.
Mol Genet Genomics 2002b; 267:673-83.
Ullán RV, Teijeira F, Guerra SM, Vaca I, Martín
JF. Characterization of a novel peroxisome
membrane protein essential for conversion of
isopenicillin N into cephalosporin C. Biochem
J 2010; 432:227-36.
Ullán RV, Teijeira F, Martín JF. Expression of the
Acremonium chrysogenum cefT gene in
Penicillum chrysogenum indicates that it encodes an hydrophilic beta-lactam transporter.
Curr Genet 2008; 54:153-61.
Van de Kamp M, Driessen AJ, Konings WN.
Compartmentalization and transport in betalactam antibiotic biosynthesis by filamentous
fungi. Antonie Van Leeuwenhoek. 1999;
75:41-78.
Van den Berg MA, Albang R, Albermann K, et
al. Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum.
Nat Biotechnol 2008; 26:1.161-8.
Van den Berg MA, Westerlaken I, Leeflang C,
Kerkman R, Bovenberg RAL. Functional characterization of the penicillin biosynthetic gene
cluster of Penicillium chrysogenum Wisconsin
54–1255. Fungal Genet Biol 2007; 44:830-44.
Van der Lende TR, Van de Kamp M, Berg M,
Sjollema K, Bovenberg RA, Veenhuis M,
Konings WN, Driessen AJ. Delta-(L-alphaAminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase,
that mediates the first committed step in penicillin biosynthesis, is a cytosolic enzyme.
Fungal Genet Biol 2002; 37:49-55.
Velasco J, Adrio JL, Moreno MA, Díez B, Soler
G, Barredo JL. Environmentally safe production
of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7ADCA) using recombinant strains of
Acremonium chrysogenum. Nature Biotechnology 2000; 18:857-61.
Velasco J, Gutiérrez S, Fernández FJ, Marcos
AT, Arenos C, Martín JF. Exogenous methionine increases levels of mRNAs transcribed
from pcbAB, pcbC, and cefEF genes, encoding
enzymes of the cephalosporin biosynthetic
Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos
207
pathway, in Acremonium chrysogenum. J
Bacteriol 1994; 176:985-91.
chrysogenum and Aspergillus nidulans. FEBS
Lett 1990; 262:342-4.
Wang FQ, Liu J, Dai M, Ren ZH, Su CY, He JG.
Molecular cloning and functional identification
of a novel phenylacetyl-CoA ligase gene from
Penicillium chrysogenum. Biochem Biophys
Res Commun 2007; 360:453-8.
Yu ZL, Liu J, Wang FQ, Dai M, Zhao BH, He JG,
Zhang H. Cloning and characterization of a novel
CoA-ligase gene from Penicillium chrysogenum.
Praha: Folia Microbiol, 2011; 56:246-52.
Whiteman PA, Abraham EP, Baldwin JE,
Fleming MD, Schofield CJ, Sutherland JD,
Willis AC. Acyl coenzyme A: 6-aminopenicillanic acid acyltransferase from Penicillium
Zhou W, Holzhauer-Rieger K, Dors M, Schügerl
K. Influence of medium composition on the
cephalosporin C production with a highly productive strain Cephalosporium acremonium. J
Biotechnol 1992; 23:315-29.
Avance en el trasplante de órganos
mediado por el uso de inmunosupresores.
Nuevos retos de la biología molecular
Dr. Carlos Barreiro Méndez
“Jesus, Dit gant werk!”
(“¡Jesús, esto va a
funcionar!”)
“Jesus, Dit gant werk!” fue la frase que
el Dr. Christiaan Neethling Barnard pronunció mientras incrédulamente observaba cómo latía el corazón que acababa
de implantar. El escenario sobre el que
actuaba este cirujano de 45 años era un
quirófano del hospital Groote Schurr de
Ciudad de El Cabo y el receptor era un
comerciante de ultramarinos llamado
Louis Washkansky. Esto sucedió un domingo 3 de diciembre de 1967. La donante (Dénise Darvall), una joven oficinista de 25 años, había sido atropellada
por un automóvil horas antes. Este fue
el primer trasplante de corazón en humanos, el cual catapultó a cirujano y receptor a la fama mundial. Desafortunadamente, 18 días después el paciente
murió de una neumonía. Pero la semilla
del proceso quirúrgico ya estaba plantada y esta permitió al Dr. Barnard continuar con los trasplantes cardiacos. Este
primer trasplante se produjo 3 días
antes de que el Dr. Adrian Kantrowitz
del Maimonides Medical Center de
Brooklyn realizara el primer trasplante
pediátrico de corazón. Posteriormente,
el tercer trasplante cardiaco se produjo
el 2 de enero de 1968, no sin un aura
de polémica, ya que el receptor era un
hombre blanco (Dr. Philip Blaiberg) y el
donante era un hombre negro (Clive
Haupt). Este corazón latió durante 563
días y ayudó a incrementar la fama del
Dr. Barnard, que pasó a formar parte del
star-system mediático, llegando a la portada de la revista Time y algunas de la
prensa rosa. Aunque el Dr. Barnard permanece en el subconsciente colectivo
cuando se piensa en trasplantes, muchos otros fueron los que previamente
se habían dedicado a los trasplantes de
órganos.
El origen de los injertos vegetales no
está muy claro, pero las antiguas civilizaciones que se dedicaban al cultivo arbóreo ya observaron la unión natural de
árboles compatibles a través de ramas
creciendo contiguas. Al igual que sucede con estos injertos en las plantas,
donde se puede conseguir que un único
tronco produzca diferentes variedades
de manzana o inclusive almendras y melocotones a la par, el hombre ha tratado
de conseguir desde antiguo el éxito en
los trasplantes. Ya en la Ilíada (siglo VIII
a.C.) Homero hace referencia a Quimera
(mitológico animal mezcla de león,
cabra y serpiente matado por
Belerofonte), presentando la idea de
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
210
mezcla de partes procedentes de diferentes especies en un solo cuerpo.
Posteriormente, Jacobo de la Vorágine
en su libro La Leyenda Dorada (siglo XIII),
donde describe la vida de unos 180
santos y mártires cristianos, relata el
primer alotrasplante u homotrasplante
(dentro de la misma especie) al citar
cómo los santos Cosme y Damián (patrones de cirujanos, farmacéuticos, médicos, peluqueros, dentistas y trabajadores de los balnearios) trasplantaron
una pierna completa, procedente de un
criado etíope muerto la noche anterior,
a un presbítero de una iglesia de París
encomendada a la protección de los dos
santos (Calne, 1965). Pero ya en el siglo
VII a.C. se tuvo la primera noticia de autotrasplantes (mismo individuo) atribuidos al cirujano hindú Sushruta, el
cual reconstruyó narices y orejas con
trozos de piel tomados del propio individuo. Este método no fue conocido por
los cirujanos europeos hasta que
Gaspare Tagliacocci en el siglo XVI injertó
un colgajo de brazo en la nariz de un rinotomizado, consiguiendo que este se
revascularizase. Posteriormente, Joseph
Constantine Carpue lo reintrodujo en
Europa a finales del siglo XVIII tras su experiencia como médico militar británico
en la India, donde aprendió estas técnicas de rinoplastia. Jacques Louis
Reverdin, en 1870, detalló el injerto libre
desde el propio individuo, con la salvedad de que el injerto era grueso, lo
que facilitó la rápida revascularización,
al contrario de los anteriores, que eran
finos. Actualmente hay autotrasplantes
de piel, vena, arteria, hueso y otros tejidos (Gracia, 1996). En lo relativo a xenotrasplantes (entre especies), la pri-
mera referencia documentada proviene
de 1668, cuando el médico holandés
Job van Meeneren realizó el primer trasplante exitoso con hueso craneal de
perro para reparar el craneo herido de
un soldado ruso. Posteriormente, la
iglesia ortodoxa rusa lo tacharía de antinatural.
Como suele suceder en casi todas las
aplicaciones técnicas, el avance en una
determinada área de conocimiento
viene determinado por el progreso en
otras áreas paralelas que resuelven dificultades técnicas colaterales. Así, en
1901, Karl Landsteiner descubrió y tipificó los grupos sanguíneos (sistema
ABO), lo que abrió las puertas a los trasplantes de órganos líquidos, como es el
caso de la sangre (Pace, 1997). Un año
después, el investigador galo Alexis
Carrel describió la anastomosis vascular,
presentando las técnicas conocidas hoy
en cirugía vascular para la ligación de
venas y arterias. Este avance hizo factible realizar trasplantes de riñón, pero
seguían produciéndose rechazos, salvo
en el caso de gemelos univitelinos.
Habría de pasar casi una generación
para que en 1958 Jean Dausset y Jan
Van Rood consiguieran explicar ese rechazo en los trasplantes gracias al descubrimiento del sistema HLA (Human
Leukocyte Antigen) de histocompatibilidad en humanos (Carral y Parellada,
2003). El propio Jan Van Rood creó 10
años después la Fundación Eurotrasplante con el fin de encontrar receptores
compatibles para los riñones donados a
nivel europeo. En la tabla 1 se resumen
algunos de los principales avances en el
campo de los trasplantes a nivel mundial.
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
211
Tabla 1. Relación cronológica de los principales hitos en la evolución de los trasplantes.
Fecha
VII
Hitos históricos para los trasplantes
a.C. Primeros autotrasplantes para la reconstrucción de narices y orejas (Sushruta; Varanasi,
India).
1597
Gaspare Tagliacozzi describe su método de reconstrucción nasal utilizando autoinjertos
de piel (Universidad de Bolonia, Italia).
1667
Primera transfusión sanguínea de un cordero a un niño de 15 años (Dr. Jean-Baptiste
Denis; Francia).
1668
Primer trasplante óseo documentado de cráneo de perro a un soldado ruso (Job van
Meeneren; Amsterdam, Holanda).
1770
John Hunter trasplantó el espolón de un gallo a su cresta (Royal College of Surgeons,
Reino Unido).
1816
Joseph Constantine Carpue describe su sistema de reconstrucción nasal con tejido de
la frente (Londres, Reino Unido).
1846
William TG. Morton utiliza dietiléter en una demostración pública para producir
anestesia quirúrgica (Massachusetts General Hospital, Boston, EE.UU.).
1865
Joseph Lister describe los antisépticos (Glasgow Royal Infirmary, Glasgow, Escocia).
1901
El Dr. Karl Landsteiner describe los grupos sanguíneos (Universidad de Viena, Austria).
1902
El Dr. Alexis Carrel describe sus técnicas para la unión de arterias y venas (Montreal,
Canadá).
1905
Primer trasplante de córnea duradero (Dr. Eduard Zirm; Hospital Olomouc, Moravia).
1913
Primer riñón artificial creado en Gran Bretaña. Permitía limpiar la sangre utilizando
anticoagulantes de sanguijuelas.
1932
Se crea el primer banco de sangre desde individuos muertos en Leningrado (Rusia). En
1936 se crearía el primer banco de sangre desde vivos en el Chicago's Cook County
Hospital debido al desarrollo de los anticoagulantes. Esto abriría las puertas a los bancos
de hueso, córneas...
1933
Primer trasplante de riñón entre humanos. Funcionó 2 días (Dr. Yu Yu; Voronoy, Ucrania).
1954
Trasplante de riñón entre gemelos univitelinos (Dr. Joseph Murray y Dr. David Hume;
Brigham Hospital, Boston, EE.UU.).
1959
Trasplante de riñón entre gemelos no univitelinos previa irradiación del receptor (Dr.
Joseph Murray; Brigham Hospital, Boston, EE.UU.).
1962
Primer trasplante de riñón desde donante muerto (Dr. Joseph Murray y Dr. David
Hume; Brigham Hospital, Boston, EE.UU.).
1963
Primer trasplante de pulmón (Dr. James Hardy; University of Mississippi Medical Center,
Jackson, EE.UU.).
1966
Primer trasplante de páncreas/riñón (Dr. Richard Lillehei y Dr. William Kelly; University of
Minnesota, Minneapolis, EE.UU.).
1967
Primer trasplante de hígado (Dr. Thomas Starzl; University of Colorado, Denver, EE.UU.).
1967
Primer trasplante de corazón (Dr. Christiaan Barnard; Groote Schuur Hospital, Cape
Town, Sudáfrica).
1968
Una mujer texana de 20 años se convierte en la primera donante multiorgánica.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
212
Tabla 1. Relación cronológica de los principales hitos en la evolución de los trasplantes
(continuación).
Fecha
Hitos históricos para los trasplantes
1968
Se establece la Uniform Donor Card como documento para legalizar la donación de
órganos post mórtem.
1970
Descubrimiento de la ciclosporina A producida por el hongo Tolypocladium inflatum
por la compañía Sandoz (Basilea, Suiza).
1973
Primer trasplante de médula ósea de un donante no pariente (Memorial Sloan-Kettering
Cancer Center, New York City, EE.UU.).
1981
Primer trasplante corazón/pulmón (Dr. Brice Reitz; Stanford University Medical Center,
Stanford, EE.UU.).
1982
Primer trasplante de un corazón artificial (Jarvik-7) (William DeVries; University of Utah,
EE.UU.).
1983
La FDA (Food and Drugs Administration) aprueba el uso del inmunosupresor
ciclosporina A.
1983
Primer trasplante de un único pulmón (Dr. Joel Cooper; Toronto General Hospital,
Toronto, Canadá).
1984
Científicos de la compañía Fujisawa (Japón) descubren el FK506 o tacrolimus producido
por la bacteria Streptomyces tsukubaensis como un inmunosupresor más potente que
la ciclosporina A.
1986
Primer trasplante doble de pulmón (Dr. Joel Cooper; Toronto General Hospital, Toronto,
Canadá).
1988
La FDA aprueba el Viaspan, solución para la conservación de órganos donados (hígado,
riñón, páncreas, corazón…).
1989
Primer trasplante de intestino delgado en un niño desde donante fallecido (Dr. Olivier
Goulet; París, Francia).
1989
Primer trasplante de hígado de donante vivo (Dr. Christoph Broelsch; University of
Chicago Medical Center, Chicago, EE.UU.).
1990
Primer trasplante de pulmón de donante vivo (Dr. Vaughn Starnes; Stanford University
Medical Center, Palo Alto, EE.UU.). Se trasplantó el lóbulo de un pulmón de mujer
adulta a su hija de 12 años.
1990
El Papa Juan Pablo II apoya la donación de órganos como la última expresión del amor
y la caridad humanas.
1992
Primer trasplante de hígado de babuino a humano (Dres. Satoru Todo, Andreas Tzakis y
John Fung; University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, EE.UU.).
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
213
Tabla 1. Relación cronológica de los principales hitos en la evolución de los trasplantes
(continuación).
Fecha
1992
1994
1995
1997
1998
1999
2005
2010
Hitos históricos para los trasplantes
El Concilio Rabínico Ortodoxo de América reconoce el trasplante de órganos para el
cumplimiento de pikuach nefesh (requerimiento de salvar vidas siempre que sea
posible). Las principales religiones mundiales apoyan la donación de órganos y tejidos.
La FDA aprueba el tacrolimus en la presentación Prograf®.
El Dr. Charles Vacanti del Centro Médico de la Universidad de Massachusetts
(Worcester, EE.UU.) logró injertar en un ratón una oreja previamente cultivada en
laboratorio con forma humana.
Sarah Marshall fue la paciente más joven en recibir un trasplante múltiple de hígado,
estómago, páncreas e intestino grueso con 6 meses de vida.
Primer trasplante de mano (Dr. Earl Owen y Dr. Jean-Michel Dubernard; Lyon, Francia).
La FDA aprueba la rapamicina (sirolimus).
Primer trasplante facial parcial (Dr. Bernard Devauchelle y Dr. Jean-Michel Dubernard;
Amiens, Francia).
Primer trasplante total de rostro (Hospital Vall d'Hebron, Barcelona, España).
Basada en los datos obtenidos de: New York Organ Donor Network (http://www.donatelifeny.org/all-abouttransplantation/organ-transplant-history/); The Gift of a Lifetime (Fusionspark Media: http://www.organtransplants.org/ understanding/history/index.html); Gracia (1996) y Tilney (2000).
Legislación y ética
de trasplantes
Como diría Sebastián en la verbena de
la Paloma: “Hoy las ciencias adelantan
que es una barbaridad”. Y afortunadamente así ha sido en el caso de los trasplantes de órganos en las últimas décadas, lo que casi de una manera
inmediata ha presentado los primeros
problemas éticos. Así, la bioética nació
por pura necesidad como consecuencia
de la revolución científica y técnica operada en las ciencias biosanitarias a partir
de los años 50. El término bioética surge
en los años 70 de la mano del oncólogo
norteamericano Van Rensselaer Potter y
el obstetra de origen holandés André
Hellegers con la idea de actuar de
puente en la ruptura existente entre la
cultura científica y la cultura humanística. Y así trata de responder a preguntas que a lo largo del siglo XIX y principios del XX no se plantearon, ya que se
pensaba que lo científico y técnicamente
correcto no podía ser malo. Al igual que
sucedió con la moratoria de Asilomar
(península de Monterrey, California) en
1975, donde se planteó un periodo de
análisis sobre los peligros biológicos potenciales de las moléculas de ADN recombinado, así los propios integrantes
de la comunidad médico-científica
fueron planteándose los límites éticos de
los trasplantes. Son muchas las disquisiciones que la nueva técnica de trasplantes presenta, ya que muchos son los
factores que se ponen en juego. Por
ejemplo: i) no todo el mundo que necesita un trasplante lo obtiene en el mo-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
214
mento, como indica el Centro para la
Bioética de la Universidad de Minnesota
(http://www.ahc.umn.edu/bioethics/); ii)
¿se debe hacer todo lo que técnicamente se puede? (Gracia, 2001); iii)
¿deben poner los médicos en riesgo la
vida de un donante sano para salvar o
mejorar la de un enfermo? (Troug,
2005). A todo esto debemos sumar que
de los 66.000 trasplantes de riñón, los
21.000 de hígado o los 6.000 de corazón descritos en 2005 por la
Organización Mundial de la Salud
(OMS), el 10% fueron a través del "turismo de trasplantes de órganos”
(Biggins et al., 2009), donde países
como China obtienen, en gran medida,
estos órganos de prisioneros ejecutados
(Delmonico, 2011). Para evitar esta última situación se publicó la declaración
de Estambul sobre tráfico de órganos y
turismo de trasplantes, sumándose a la
condena que la OMS ha hecho durante
décadas e instando a la prohibición de
este tipo de comercio (The Declaration
of Istanbul on Organ Trafficking and
Transplant Tourism, 2008).
Cabría esperar que a todos los problemas o cuestiones técnicas, metodológicas y morales se pudieran unir las diferentes interpretaciones religiosas de la
donación o el trasplante de tejidos humanos. Así, se podría pensar, como dijo
nuestro hidalgo caballero Don Quijote
de La Mancha a su inseparable Sancho:
“Con la iglesia hemos topado”. Pero por
contra, actualmente las principales religiones aceptan la donación de órganos
como manera de preservar la vida humana. Algunas lo hacen de manera colectiva y en otros casos lo dejan como
decisión personal del individuo.
La evolución de la ética de los trasplantes
ha seguido un camino paralelo a las necesidades que la técnica iba solucionando
o planteando en cada época. Así, si la dividimos por décadas desde los años 50,
siguiendo la reflexión de Diego Gracia
(2001), estas podrían ser las etapas:
• Años 50, ética de la mutilación: a raíz
de los primeros trasplantes se plantea la
duda de hasta dónde se podía crear un
mal a una persona en aras de un bien
futuro.
• Años 60, ética de la experimentación: tras el éxito de los primeros trasplantes y ante el aumento de los
mismos se planteó si se estaban usando
a los humanos como cobayas.
• Años 70, ética de la donación: se
plantea la problemática de la donación
in vivo y los problemas que el comercio
de órganos puede acarrear. También se
tratan de fijar los límites de la muerte
para la donación.
• Años 80, ética de la distribución: se
plantean los criterios de selección de pacientes ante un recurso escaso como
son los órganos.
• Años 90, ética de la organización: se
ve que el éxito o fracaso de los programas de trasplantes dependen sobremanera de factores organizativos.
Aunque parece que la teoría y la práctica
de los trasplantes están bastante completas, en épocas venideras surgirán
nuevos problemas morales que se deberán solventar desde la visión de la ética
biomédica. La tabla 2 recoge algunos de
los momentos más importantes de la historia de los trasplantes que se han visto
refrendados por la legislación.
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
215
Tabla 2. Avances legales en el campo de la donación y trasplante de órganos y tejidos
humanos.
Año
1963
1964
1966
1971
1971
1972
1972
1979
1984
1986
1989
1996
1998
1999
2001
2002
2009
2010
Avances legales
La FDA publicó el nuevo reglamento para regir la experimentación de nuevos fármacos.
Declaración de Helsinki, estableció los requisitos éticos para los experimentos o ensayos
con seres humanos.
Los NIH (National Institutes of Health) y el Departamento de Salud y Bienestar (DHEW)
publicaron: Clinical Investigations Using Human Subjects, obligando a la revisión previa
de los protocolos de experimentación en humanos por un comité de la institución.
El Department of Health, Education and Welfare (DHEW) publicó el denominado
Yellow book (The Institutional Guide to DHEW Policy on Protectionn of Human
Subjects). En 1974 pasó a ser norma.
Mohandas y Chou publicaron los denominados “criterios de Minnesota” estableciendo
criterios para la definición de la muerte cerebral. 1976 y 1979: los Reales Colegios de
Médicos del Reino Unido definen el “Código del Reino Unido”, describiendo la
Brainstem Death o Clinical Death (muerte clínica). En 1981 se publica el Uniform
Determination of Death Act. Con ello se define la muerte cerebral.
En EE.UU. se establece la Uniform Organ Donor Card que permite a cualquiera mayor
de 18 años ser donante.
El congreso de los EE.UU., mediante el programa End Stage Renal Disease (ESRD),
incluye el trasplante de hígado a través de Medicare (seguro social administrado por el
gobierno de EE.UU.).
Mediante la Ley 30/1979 se establece la “muerte cerebral” y se regula la extracción y
trasplante de órganos de forma oficial en España.
La NOTA (National Organ Transplant Act, EE.UU.) establece un registro computarizado
de trasplantes. Se prohíbe la compra/venta de órganos en EE.UU.
El Omnibus Reconciliation Act incluye la obligación de los hospitales americanos que
traten pacientes Medicare o Medicaid a preguntar a sus familiares sobre la donación de
órganos.
Creación de la ONT (Organización Nacional de Trasplantes) en España.
Se regulan las actividades relativas a la utilización de tejidos humanos en España.
El Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. indica que las
organizaciones de trasplantes deben ser informadas de cada muerte hospitalaria.
Se regulan las actividades de obtención y utilización clínica de órganos.
Se regulan las buenas prácticas clínicas en la experimentación con productos clínicos
para humanos dentro de la Unión Europea.
Se establece la Convención de Derechos Humanos y Biomedicina en lo relativo a
trasplante de órganos y tejidos de origen humano en Europa.
Se aprueba el estatuto de la ONT.
Se publica la directiva de la UE sobre normas de calidad y seguridad de los órganos
humanos destinados al trasplante.
Basada en la información obtenida del documento Ethics of Organ Transplantation de la Universidad de
Minnesota (EE.UU.); la Organización Nacional de Trasplantes de España y Gracia (2001).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
216
Unidos u otras zonas del mundo, según
confirmó en enero de 2011 el secretario general de Sanidad, José Martínez Olmos,
siendo el español un modelo considerado
como “ejemplo a imitar”.
Estado de los trasplantes en
España
Los avances técnicos y farmacológicos han
facilitado que el número de trasplantes
haya aumentado casi de manera exponencial en España en las últimas décadas.
Según la ONT, durante 2010 se registraron
en España 1.502 donantes reales de órganos sólidos, situando la tasa por millón
de población (pmp) en 32,0 (figura 1). De
estas donaciones, 210 fueron donantes en
los que desafortunadamente ningún órgano pudo ser finalmente utilizado, lo que
presentó una cifra de donación efectiva de
1.292 y una tasa de donantes efectivos
pmp de 27,5. Estos datos en 2009 fueron
de 206 donantes no efectivos, por lo tanto,
una tasa real de donación efectiva de 29,9
donantes pmp. Estas cifras de donación nacional son las más altas del mundo, muy
por encima de la Unión Europea, Estados
En lo referente a la distribución por sexos,
el 60,7% de las donaciones provienen de
hombres, mientras que un 39,3% proceden de mujeres. Así, el donante tipo de
España sería hombre con más de 45 años
cuya causa de muerte sería el accidente cerebrovascular. Por comunidades, la mayor
tasa por millón de población la presentó
Cantabria (44,1), seguida de La Rioja (43,8),
el País Vasco (42,2) y Castilla y León (40,2),
aunque esta última fue la primera en su esfuerzo por incrementar el número de donantes (+18,4%). A la cola de esta tasa de
donantes se situó Extremadura (19,8),
Cataluña (26,8) y Castilla-La Mancha (27,6).
Si los datos se analizan por el número de
50
1.800
1.600
1.409 1.443
1.400
1.495
1.546 1.509 1.550
1.577 1.606
1.502
40
1.334 1.345 1.335
1.250
1.200
1.000
800
35
1.155
33,6 33,9
1.037 1.031
960
869
25,0
27,0 26,8
45
31,5
32,5
35,1
33,8 34,3 34,2 34,4
33,7 33,8 34,6
29,0
32,0
30
25
20
22,6
600
15
400
10
200
5
0
1993
1995
Número
1997
1999
2001
2003
2005
2007
2009
0
Tasa (PMP)
Figura 1. Número de donantes y tasa de donación (pmp: por millón de población) en España entre 1993 y 2010.
(Datos obtenidos de la ONT).
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
217
400
349
350
318
300
353
336
341
310
287 292 278 282
290 294 287
292
274
274
254
250
241
232
200
217
164
150
100
97
73
50
0
1988
1990
1992
1994
1996
1998
2000
2002
2004
2006
2008
2.500
1.996 2.023
2.000
1.800
1.861
1.633
1.707
1994
1996
1.938 1.924
2.032
2.131 2.125
2.200 2.157 2.211 2.229
2010
2.328
2.098
1.492 1.488
1.500
1.371
1.240
1.000 873
1.039
500
0
1988
1990
1992
1998
2000
2002
2004
2006
1.200
1.033 1.037 1.040
1.000
1.070 1.051
2008
2010
1.112 1.108 1.099
960 954 972
971
899
790
800
698 700
614
600
468 495
412
400
200
0
313
123
1988
170
1990
1992
Corazón
1994
1996
Riñón
1998
2000
2002
2004
2006
2008
2010
Hígado
Figura 2. Número de trasplantes de corazón, riñón e hígado en España entre 1988 y 2010. (Datos obtenidos de
la ONT).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
218
donantes, el primer puesto lo ocupa
Andalucía (261), seguido de Madrid (231)
y Cataluña (201).
Las cifras de 2010 suponen una ruptura en
la tendencia ascendente en la donación de
órganos de los años anteriores, cuyas posibles causas son múltiples, apareciendo
entre ellas la evolución descendente de la
mortalidad por accidente cerebrovascular,
el descenso de traumatismos craneoencefálicos ligado a la reducción de los accidentes de tráfico y cambios cualitativos en
los cuidados al final de la vida.
El creciente número de donaciones ha
tenido su reflejo en el número de ór-
ganos trasplantados, que, como se ve en
la figura 2, en el caso de corazón, riñón
e hígado ha ido incrementándose paulatinamente. Además, según los datos de
la ONT, España presenta un éxito de supervivencia postrasplante equiparable a
los existentes a nivel mundial (tabla 3).
Así, hasta octubre de 2004 se habían realizado 35.763 trasplantes renales,
11.529 trasplantes hepáticos, 4.607 trasplantes cardiacos, 1.226 trasplantes pulmonares, 568 trasplantes pancreáticos y
15 trasplantes intestinales, lo que sumaron un total de 53.708 trasplantes de
órganos realizados.
Tabla 3. Mayor supervivencia postrasplante (en años) de diferentes órganos a nivel
mundial y español. (Datos de la ONT, 1 de enero de 2005).
Órgano
Riñón
Hígado
Corazón
Páncreas
Pulmón
Supervivencia (años)
Mundial
España
41
35
34
19
25
20
21
17
16
13
Aparición de los
inmunosupresores
La acumulación de avances experimentales y tecnológicos en el ámbito biosanitario ha permitido llegar hasta el actual
número de trasplantes que exitosamente
se han conseguido, llegando muchos de
ellos a una longevidad inimaginable hace
escasamente unas décadas. Según la
ONT, en los años 80 se produjo un auténtico despegue de la técnica de trasplantes
influenciada de manera muy importante
por el uso de inmunosupresores. Estos
compuestos son sustancias que anulan o
reducen (según dosis) la respuesta del sistema inmunitario, lo que facilita el mantenimiento de los órganos trasplantados.
La necesidad de sustancias que repriman
el sistema inmune se hizo presente desde
el momento en que se intentaron realizar
homotrasplantes o xenotrasplantes, o sea
aquellos que no provenían del propio individuo. Esta necesidad se fue haciendo
más acuciante según los descubrimientos,
como los grupos sanguíneos o el com-
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
219
plejo de histocompatibilidad, fueron exponiendo las diferencias existentes entre
distintos individuos, lo que mostraba que
estamos lejos de ser todos iguales, inmunológicamente hablando.
Una vez conocido el sistema que permitía
la compatibilidad entre órganos, el siguiente paso fue evitar el rechazo, para lo
cual en 1959 se realizó el primer trasplante
de riñón entre gemelos no univitelinos
previa radiación del receptor. Tras este proceso, el receptor vivió 26 años (Gracia,
1996), pero en términos generales los resultados de la radiación no fueron la solución deseada, ya que los receptores quedaban indefensos antes las infecciones.
Este problema de las infecciones ha sido
una de las mayores causas iniciales de mortalidad entre trasplantados.
La historia reciente de los trasplantes de
órganos está plagada de episodios de rechazo agudo. A raíz de la introducción de
nuevos agentes inmunosupresores el éxito
en los trasplantes ha llegado a ser algo
común (McPartland y Pomposelli, 2007).
Actualmente, dos son los inmunosupresores que se vienen empleando en trasplantes de órganos (riñón, hígado, corazón...) para su mantenimiento: la
ciclosporina y el tacrolimus.
Inicialmente se utilizaron corticoides como
tratamiento antirrechazo tras el trasplante, pero estos compuestos afectan a
varias líneas de leucocitos, mientras que
los inhibidores de la calcineurina, como la
ciclosporina y el tacrolimus, son específicos sobre las células T. Asimismo, su uso
ha reducido los casos de rechazo y las infecciones secundarias provocadas por el
tratamiento con corticoides (Duncan y
Wilkes, 2005).
Ciclosporina: orígenes y aplicaciones
En 1969 y 1970 dos especies de hongos
imperfectos (o mitospóricos: se reproducen asexualmente) fueron aisladas de
muestras de suelo de Wisconsin (EE.UU.)
y Hardanger Vidda (Noruega) por científicos de la compañía Sandoz Ltd. (actualmente Novartis). Estos hongos fueron clasificados como Cylindrocarpon lucidum y
Tolypocladium inflatum, respectivamente
(Tribe, 1998). Ambos sintetizaban metabolitos neutros y lipofílicos con estructura
de ciclopéptidos (Kürnsteiner et al.,
2002). Estos compuestos presentaban un
estrecho rango de actividad antifúngica
principalmente contra Aspergillus niger y
Neurospora crassa. Las pruebas de actividad inmunosupresora mostraron que se
trataba de metabolitos únicos, ya que inhibían muy selectivamente la proliferación
de linfocitos y no la de otras células somáticas. Asimismo, se observó que suprimían la inmunidad mediada por células y
por anticuerpos. La mezcla inicial de metabolitos presentó dos compuestos: ciclosporina A y ciclosporina B, viéndose que la
primera era mucho más activa (Tribe,
1998). La estructura de ciclosporina A fue
identificada como un péptido cíclico de
11 aminoácidos presentando la configuración en “S” de los L-aminoácidos naturales, con la excepción de la D-alanina de
la posición 8. Siete de los aminoácidos demostraron estar N metilados y el presente
en la posición 1 servía para diferenciar las
ciclosporinas.
Mientras el hongo C. lucidum no presentó
interés comercial debido a la baja producción de ciclosporina A, T. inflatum fue depositado en la colección de cultivos NRRL
(Northern Regional Research Lab), también
conocida como ARS (Agricultural Research
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
220
Service), bajo el número de acceso 8044
(=ATCC34921). Inicialmente esta especie
había sido denominada Trichoderma
polysporum, pero cuando Grams en 1971
describió el género Tolypocladium a partir
de un aislado en Obergurgl (Austria), pasó
a denominarse Tolypocladium inflatum y
este ha sido el nombre utilizado por
Sandoz desde 1978 para denominar esta
cepa. Esta especie fue posteriormente reclasificada en 1983 como Tolypocladium
niveum, para que posteriormente Von Arx
(1986) fusionase los géneros Beauveria y
Tolypocladium pasando a denominarse al
productor de la ciclosporina A como
Beauveria nivea. Actualmente, la colección
americana de cultivos tipo (ATCC:
American Type Culture Collection) mantiene esta última nomenclatura, aunque
se ha demostrado que diferentes aislados
depositados en diferentes colecciones presentan patrones que permiten diferenciar
B. nivea de T. Inflatum, lo que presenta serias implicaciones en el ámbito de las patentes (Kürnsteiner et al., 2002).
La ciclosporina fue el primer metabolito
procedente de un microorganismo utilizado en clínica para regular el crecimiento
y la función de células de mamífero normales. En 1973, el mercado de los trasplantes era demasiado pequeño y cuando
Sandoz evaluó los costes que suponía la
aprobación por la FDA del uso de la ciclosporina en humanos (250 millones de dólares) decidió abandonar el proceso. La solución para proseguir venía de la mano de
hallar alguna aplicación dentro de un área
de investigación ya aprobada por la FDA.
Así, se probó como antiinflamatorio, ya
que en los primeros test se había incluido
su administración a ratas con encefalomielitis alérgica (en humanos, esclerosis múl-
tiple), observándose una marcada mejora.
Los primeros análisis mostraron su eficiencia en reacciones inflamatorias mediadas por el sistema inmune. Evitando, al
contrario de lo que sucedía con otros antiflogísticos, la formación de úlceras. Por
ello, su primera indicación fue en el tratamiento de la artritis reumatoide, aun
cuando sus propiedades inmunosupresoras eran incuestionables. Finalmente, en
1976 se determinó su estructura (figura
3), viéndose que el segundo aminoácido
en la ciclosporina A era un alfa-amino butírico mientras que en la ciclosporina B era
una alanina. En 1976, Borel y colaboradores publicaron las características de la
ciclosporina: i) selectivo con los linfocitos
(principalmente células T ayudadoras y
efectoras); ii) suprime la repuesta inmune
mediada por células y anticuerpos y la inflamación crónica; iii) inhibe la fase de inducción de las células linfoides; iv) no era
tóxico para los linfocitos al tener un efecto
reversible; v) era efectiva en todos los mamíferos testados (ratón, conejo, mono,
perro...); vi) no presentaba efectos cardiovasculares, psicotrópicos u otros que afectasen su efectividad en humanos. Como
casi cualquier nuevo compuesto, en los estudios iniciales comenzó a mostrar algunos efectos secundarios, como disfunciones hepáticas, que se redujeron
disminuyendo la dosis y combinándola
con esteroides (Tribe, 1998; Heusler y
Pletscher, 2001). Finalmente, la ciclosporina fue aprobada por la FDA en 1983 y
salió al mercado comercializada por
Sandoz como Sandimmun®. Trece años
después, en 1996, 200.000 trasplantados
utilizaban la ciclosporina. Actualmente se
pueden encontrar diferentes formulaciones y proveedores de la ciclosporina.
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
221
Así, en España existen al menos 15 formulaciones diferentes (desde 25 a 100 mg),
tanto en cápsulas como en solución, de diferentes fabricantes (p. ej.: Cantabria
Pharma SL, Germed Pharma).
En definitiva, el descubrimiento de la ciclosporina supuso un hito en el avance
del tratamiento postrasplante, facilitando
la supervivencia de muchos de los órganos trasplantados.
CH3
CH3
H3C
CH3
HO
H 3C
CH3
O
N
N
N
O
CH3
H3C
N
CH3
O
CH3
CH3
N
H 3C
N
CH3
H
N
N
O
CH3
O
CH3
H3C
CH3
CH3
O
H
N
N
H
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O
H 3C
O
H
N
CH3
Figura 3. Estructura de la ciclosporina descrita por Sandoz en 1976.
Tacrolimus: el relevo generacional
La importancia de la ciclosporina es innegable como primer fármaco antirrechazo,
permitiendo la disminución de fallos postrasplante, rechazo agudo e infección sistémica. A pesar de ello, según su uso se
fue generalizando se detectaron efectos
secundarios que debían tenerse en
cuenta. Así, Patel y Kobashigawa en 2004
revisaron los efectos colaterales descritos
para la ciclosporina tras 20 años de experiencia en trasplantes cardiacos: i) hipertensión; ii) hiperlipemia; iii) infecciones;
iv) riesgo de cáncer; v) efectos sobre el
sistema nervioso central; vi) hipertricosis;
vii) hepatotoxicidad; viii) efectos sobre la
médula ósea; ix) nefrotoxicidad. Aun así,
nuevas dosificaciones y sistemas de aplicación más eficaces han permitido reducir
los efectos secundarios de la ciclosporina
(Patel y Kobashigawa, 2004).
Estos efectos adyacentes, y posiblemente
el hecho del pujante éxito en el mercado
de la ciclosporina, hicieron que comenzase una búsqueda de nuevos compuestos inmunosupresores procedentes
de otros microorganismos. Se buscaba
que estos presentasen menores efectos
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
222
secundarios y un mayor efecto inmunosupresor. En los análisis de producción de
ciclosporina se había observado que esta
inhibía la generación de células T citotóxicas y liberación de las linfoquinas de las
células T-ayudadoras, especialmente la interleucina 2 (IL2), la cual sirve de factor
de crecimiento de las células T. Por ello,
la búsqueda de nuevos inmunosupresores se realizó mediante la denominada
“reacción de linfocitos mezclados” (MLR:
mixed lymphocyte reaction), la cual correlaciona in vitro el rechazo a alotrasplantes con una reacción dependiente de
IL2. De esta manera se testaron las muestras de los caldos de cultivo de miles de
microorganismos aislados del suelo.
Como resultado se descubrió una cepa,
denominada 9993, que producía un potente inmunosupresor. Dicha cepa, que
provenía de un aislado obtenido de
Tsukuba (Prefectura de Ibaraki, Japón), resultó pertenecer al género Streptomyces y
A
de ahí el nombre de Streptomyces tsukubaensis (figura 4). El género Streptomyces
se encuadra dentro de las actinobacterias
y está compuesto por bacterias Gram positivas cuyo genoma presenta un alto contenido en G+C (guanina y citosina). Dicho
género es el mayor productor de compuestos de interés industrial (Olano et al.,
2008), muy por encima de los hongos, por
lo cual no era de extrañar que entre su batería de compuestos se encontrase alguno
con efecto inmunosupresor. Y así fue
cómo en 1984 un caldo de S. tsukubaensis presentó un claro resultado positivo
en los test MLR sin inhibir la proliferación
constitutiva de las células. Este compuesto
que inicialmente fue denominado
FR900506 (FK 506), posteriormente también se llamó fujimicina o tacrolimus
(Tsukuba Macrolide Inmunossupresant)
(Kino y Goto, 1993; Wallemacq y Reding,
1993).
B
Figura 4. Micrografías de S. tsukubaensis. A) Colonias de S. tsukubaensis en medio ISP4. B) Micrografía electrónica de barrido. Fotos cedidas por M. Martínez-Castro (Instituto de Biotecnología de León-INBIOTEC).
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
223
La búsqueda de este compuesto se realizó por la empresa farmacéutica japonesa Fujisawa Pharmaceutical Co. (desde
2004 denominada Astellas Pharma Inc.,
tras la fusión entre Yamanouchi y
Fujisawa) (Kino et al., 1987a, 1987b;
Kino y Goto, 1993). Este compuesto, producido por especies filogenéticamente di-
HO
ferentes del género Streptomyces (Garrity
et al., 1993), fue el primer inmunosupresor macrólido descubierto. Posteriormente, se han descubierto varias moléculas similares en estructura y función,
como la rapamicina (sirolimus) y la ascomicina (FK520 o FR 900520), entre otros
(figura 5).
HO
CH3O
O
CH3
N
O
H3C
O
O
O
OH
O
HO
CH3O
CH3
HO
CH3
N
CH3
CH3
OCH3 OCH3
Tacrolimus
O
H3 C
CH3O
CH3 CH3 OCH3
O
CH3
CH2
O
O
O
OH
O
HO
CH3
N
CH3
CH3
O
CH3
O
HO
H3 C
O
HO
H 3C
O
O
O
CH3
OCH3
O
CH3
OCH3 OCH3
Ascomicina
Rapamicina
Figura 5. Estructura química del tacrolimus y otros macrólidos inmunosupresores. La ascomicina solo difiere del
tacrolimus en la cadena lateral del carbono 21 (indicado con un óvalo) mientras que la rapamicina (sirolimus) presenta una estructura más diferente.
La estructura de FK-506 fue deducida
mediante degradación química, estudios
de espectroscopía y cristalografía de
rayos X. Finalmente se vio que era una
nueva clase de macrólido lactona, cuyo
anillo consta de 23 miembros (figura 5),
cuyo análogo más próximo, cuando se
descubrió, era la rapamicina (sirolimus).
Este último compuesto fue inicialmente
descrito como un antifúngico producido
por Streptomyces, pero posteriormente
también se describió su actividad inmunosupresora, aunque con diferente mecanismo de acción. A pesar de presentar
diferentes estructuras (figuras 3 y 5), el
tacrolimus y la ciclosporina poseen la
propiedad de inhibir los linfocitos T.
Diferentes análogos relacionados estructuralmente con el tacrolimus fueron inicialmente aislados por los investigadores
de Fujisawa: i) metil- (FR900425); ii) etil(FR900520); iii) prolina- (FR900525),
pero el más activo fue el tacrolimus (FK506) (Kino y Goto, 1993). La ascomicina,
por su parte, es un compuesto prácticamente idéntico con una única diferencia
en el carbono 21, donde el tacrolimus
presenta una cadena lateral alilo
(-CH=CH2) y la ascomicina una cadena
etilo (-CH2-CH3), mientras que la rapamicina, de estructura menos similar, está
compuesta por un anillo de 31 átomos
con tres enlaces dobles conjugados
(Reynolds y Demain, 1997).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
224
Aplicaciones de tacrolimus
En los últimos años, el uso de la ciclosporina A ha disminuido en favor del tacrolimus debido a la menor toxicidad y especialmente a la mayor efectividad de este
último (Gummert et al., 1999; MeierKriesche et al., 2006) (figura 6). El tacrolimus presenta una actividad entre 100 y
200 veces superior a la descrita para la ciclosporina A en la supresión de la respuesta inmune (Ochiai et al., 1987;
Sawada et al., 1987) y reduce en gran medida los efectos metabólicos adversos que
la ciclosporina produce en el organismo
(Mor et al., 1997). También puede utilizarse para el tratamiento del rechazo a
aloinjertos cuando otros medicamentos no
son eficaces como inmunosupresores (Patel
y Kobashigawa, 2007), otros fármacos esteroides (Westhoff y Van der Giet, 2007),
antirreumáticos (Kitahara y Kawai, 2007)
o inmunomoduladores en inflamaciones
intestinales (Chow y Leong, 2007).
Durante más de una década, el tacrolimus
se ha comercializado por la compañía
Astellas Pharma bajo la marca comercial
Prograf® (adultos) Advagraf® (adultos, de
liberación más lenta que Prograf®) y
Modigraf® (niños) (www.emea.europa.eu).
Actualmente otras compañías han aparecido en el mercado debido a la expiración
de las patentes, como es el caso de Sandoz
desde 2009, o Watson Laboratories, Inc.,
Mylan Pharma y Dr Reddys Labs LTD desde
2010 (www.fda.gov).
Los inhibidores de la calcineurina también
son efectivos como pomada para uso tópico en el tratamiento de la dermatitis
atópica (Koo et al., 2005; Ingram et al.,
2009), seborreica o la balanitis de Zoon
(Rallis et al., 2007). El tacrolimus se comercializa en formato pomada bajo el
nombre de Protopic® y la ascomicina
como Pimecrolimus®. Además, estos compuestos presentan una potente actividad
antifúngica, lo que sugiere un papel en la
naturaleza como inhibidores de microorganismos competidores de la especie de
Streptomyces que los produce (Arndt et
al., 1999).
El tacrolimus presenta un amplio rango de
aplicaciones, especialmente en enfermedades autoinmunes. Aunque estos usos
aún se encuentran en fase experimental,
actualmente se ha probado la eficacia y seguridad en el tratamiento de la artritis reumatoide (Akimoto et al., 2008) y también
se han obtenido buenos resultados en el
tratamiento de la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn y otras enfermedades autoinmunes. También se ha descrito su posible aplicación como antiviral en cultivos
celulares infectados con ortopoxvirus (Reis
et al., 2006). Estos resultados aún deben
ser confirmados con estudios clínicos más
amplios (Benson et al., 2008).
Los agentes inmunosupresores, como el tacrolimus y la rapamicina, también presentan propiedades antimitóticas, anticoagulantes y antiinflamatorias, lo que
permite su uso en stents, dispositivos metálicos colocados en arterias coronarias
para evitar su obstrucción (Romano et al.,
2010). La neurorregeneración y la neuroprotección son otras de las propiedades
que presenta el tacrolimus, por lo que podría ser efectivo en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson (Guo et al., 2001).
Todas estas posibles nuevas aplicaciones
están siendo cuidadosamente analizadas
para valorar los riesgos y ventajas de las terapias con tacrolimus, ya que el tratamiento con este compuesto presenta
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
225
A
100
80
% Pacientes
60
40
20
0
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
Corazón
Pulmón
Corazón
y pulmón
Año
B
100
75
% Pacientes
50
25
0
Riñón
Páncreas
Páncreas
tras riñón
Ciclosporina
Páncreas
y riñón
Hígado
Intestino
Tacrolimus
Figura 6. Evolución del empleo de los inmunosupresores (ciclosporina y tacrolimus) en trasplantes de órganos.
A) Tendencia en el tratamiento para el mantenimiento de la inmunosupresión en trasplantes de hígado. B)
Empleo de inhibidores de calcineurina expresados por órgano trasplantado en 2004 (modificado de: MeierKriesche et al., 2006).
efectos secundarios, como nefrotoxicidad
o hipertensión, que hay que valorar (Bai et
al., 2010).
En el caso de la clínica veterinaria, el tacrolimus se utiliza para el tratamiento de
la queratoconjuntivitis Sicca, la cual se caracteriza por el enrojecimiento e inflamación de la conjuntiva debido a una carencia de lágrimas (Hendrix et al., 2011).
Biosíntesis del inmunosupresor
tacrolimus
La ruta de biosíntesis de tacrolimus es similar a la de otros policétidos macrólidos
descritos hasta el momento, como la eritromicina (Cortes et al., 1990) o la rapamicina (Schwecke et al., 1995), y sigue
un mecanismo similar a la síntesis de
ácidos grasos. Dicha ruta consiste en una
condensación secuencial de ácidos carboxílicos de cadena corta (normalmente
2-4 átomos de carbono), activados en
forma de ésteres de coenzima A (CoA).
Esta síntesis implica complejos sistemas
enzimáticos conocidos como policétido
sintasas codificados por genes de tamaños superiores a 20 kb (kilopares de
bases). La síntesis de los inmunosupre-
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
226
sores tacrolimus, rapamicina y ascomicina es llevada a cabo por sistemas híbridos de policétido sintasas (PKS: polyketide synthases)/sintasas de péptidos no
ribosomales (NRPS: nonribosomal peptide synthases).
moléculas de metoximalonil-CoA (pasos 7
y 8) y una molécula de 5 átomos de carbono (propilmalonil-CoA o alilmalonil-CoA)
(paso 4). En la biosíntesis de la ascomicina
se ha descrito que la unidad que se incorpora en el paso 4 es etilmalonil-CoA; dicha
unidad supondrá la diferencia con la molécula de tacrolimus. Tras 10 rondas de
condensación, una molécula de pipecolato
(derivado del metabolismo de la lisina) se
une a la cadena mediante la formación de
un enlace amida con un grupo acilo seguido de la ciclación de la cadena formando el anillo macrólido. Dicho anillo
La unidad iniciadora en la biosíntesis de tacrolimus es dihidrociclohexil carbonil CoA,
un derivado del ácido siquímico (precursor
de los aminoácidos aromáticos). Las unidades que van a constituir el esqueleto carbonado comprenden 2 moléculas de malonil-CoA (pasos 3 y 10), 5 moléculas de
metilmalonil-CoA (pasos 1, 2, 5, 6 y 9), 2
fkbC
fkbB
Módulo de
iniciación
Mód. 1
Mód. 2
DH KR
Mód. 3
DH KR
Mód. 4
Mód. 5
Mód. 7
ER
DH KR
DH KR
DH
KR
fkbA
Mód. 6
Mód. 8
ER
DH KR
CAS ER ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP
Mód. 9
Mód. 10
ER
DH KR
KR
S
KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP
O
O
S
O
S
26
S
O
H
HO
OH HO
S
O
O
OH
OH
26
H
OH
HO
S
HO
O
21
O
OH
26
HO
H
OH
ácido
siquímico
HO
H3CO
fkbM
OH
HO
CH2
O
14
OH
14
OH
S
O
OH
H
OH
HO
21
O
OH
OH
OH
26
OH
H
OH
N
fkbP
26
HO
CH3
30
10
21
O
H
HO
29
O
OH
26
OH
O
10
OH
H
OH
8
OH
OH
26
O
21
O
OH
OH
N
S
8
+
21
O
OH
26
H
OH
34
31
O-Metilación
OH
HO
HO 32
14
18
21
O
H
HO
O
OH
18
21
O
OH
S
10
O
O
14
26
OH
S
18
OH
26
S
14
O
O
OH
26
H
OH
S
21
O
OH
H
OH
S
18
fkbL
S
Lisina
H
HO
OH
24
27
2
6
N
9
21
20
O
H3CO
O
O
CH3
17
15
CH3
14
fkbD
Hidroxilación
Oxidación
HO
O
O
O
OH
11
H3 C
13
OCH3
fkbO
Figura 7. Ruta de biosíntesis de tacrolimus. Las flechas que aparecen en la parte superior representan las policétido sintasas y los rectángulos marcan los módulos (Mod.) de los que se componen cada policétido sintasa. Los
diferentes dominios catalíticos se representan con círculos: ACP, proteína transportadora de grupos acilo; AT, acil
transferasa; CAS, CoA-sintasa; DH, deshidratasa; ER, enoil-reductasa; KR, oxoacil-reductasa; KS, oxoacil-sintasa.
La cadena policetídica aparece en diferentes colores dependiendo de la policétido sintasa que está implicada (rosa
FkbB, verde FkbC y azul FkbA), la unidad iniciadora se representa en negro y en naranja el ácido pipecólico. En
la parte inferior izquierda se recoge la estructura completa del tacrolimus con las diferentes modificaciones pospolicétido sintasa. Algunos de los genes implicados en la biosíntesis de tacrolimus se representan con flechas anchas marcando la función que desempeñan. (Tomado de Martínez Castro, 2011; modificado de Motamedi y
Shafiee, 1998).
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
227
sufre diferentes modificaciones pospolicétido sintasa: el carbono 9 es hidroxilado y
oxidado dando lugar a la configuración ·
cetoamida y el grupo hidroxilo presente en
el carbono 31 es metilado (Motamedi et
al., 1997; Wu et al., 2000; Goranovic et al.,
2010).
Especies productoras de tacrolimus
dentro del género Streptomyces
El descubrimiento de S. tsukubaensis como
productor de tacrolimus supuso un boom
en la búsqueda de nuevas cepas de
Streptomyces productoras que todavía
continúa en nuestros días. Esto ha hecho
que hayan aparecido una o dos nuevas especies de “supuestos” Streptomyces productores de tacrolimus cada año durante
la última década (tabla 4). Muchas de estas
especies son de compañías o centros que
no las ceden para investigación ni las depositan en colecciones, por lo que es prácticamente imposible verificar su producción.
Uno de nuestros más grandes cómicos,
Paco Martínez Soria, protagonizó en 1969
la comedia “Se armó el belén”. Este sería
el título que actualmente mejor definiría la
situación de muchos de estos supuestos
productores de tacrolimus. Aun así, se han
realizado diferentes estudios taxonómicos
con el objetivo de profundizar en la relación entre estas cepas, poniendo de manifiesto la gran lejanía filogenética entre las
misma. Esto sugiere la transferencia horizontal de genes como explicación a que
estas cepas compartan rutas de biosíntesis
similares (Garrity et al., 1993; Muramatsu
et al., 2005).
Mecanismo de acción de los
inmunosupresores
El mecanismo de acción de estos compuestos inmunosupresores se basa en el
bloqueo de la actividad de los linfocitos T.
Aunque químicamente no están relacionados, el tacrolimus y la ciclosporina A
Tabla 4. Especies del género Streptomyces productoras de compuestos inmunosupresores
utilizados en trasplantes de órganos (modificado de Martínez-Castro, 2011).
Inmunosupresor
Sinónimo
Productor
S. tsukubaensis
Streptomyces sp. ATCC 55098 (MA 6858)
Streptomyces sp. ATCC 53770 (MA 6548)
Streptomyces sp. MA 6949
Streptomyces kanamiceticus KCC-S0436
Streptomyces glaucescens
Streptomyces clavuligerus CKD 1119
Tacrolimus
FK506
Fujimicina
Ascomicina
FK520
FR9520
Inmunomicina
Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis
S. tsukubaensis
Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus
Streptomyces tubercidicus
Rapamicina
Sirolimus
Streptomyces hygroscopicus
Everolimus
Derivado de la rapamicina
Streptomyces hygroscopicus
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
228
ejercen su efecto de manera muy similar
mediante la inactivación de la calcineurina
(Wiederrecht et al., 1993), mientras que la
rapamicina, compuesto macrólido similar
estructuralmente al tacrolimus, bloquea
una ruta diferente de activación de los linfocitos T, el conocido como sistema mTOR
(mammalian target of rapamycin) (Neuhaus
et al., 2001).
El tacrolimus o FK506 difunde a través de
la membrana plasmática de las células
T (figura 8), uniéndose en el interior citoplasmático a una proteína denominada inmunofilina FKBP12 (FK506-binding protein-12kDa) (Siekierka et al., 1989). La
ciclosporina A actúa de manera similar
uniéndose a una inmunofilina denominada
ciclofilina (CpN). Los complejos formados
por los fármacos inmunosupresores y las
inmunofilinas bloquean la función de la
calcineurina, una serina/treonina fosfatasa
dependiente de calcio, impidiendo su acceso y desfosforilación a determinados sustratos (Clipstone y Crabtree, 1992), como
el NF-AT (nuclear factors of activated
T cells). Si la fracción citosplasmática del
NF-AT no es desfosforilada no puede acceder al núcleo donde se uniría a la fracción
nuclear formando el complejo activo de
este factor transcripcional. Entre los genes
regulados por los factores NF-AT, se encuentran genes que se requieren para la activación de las células B, como la interleucina 4 (IL-4) y el ligando CD40 y genes
implicados en la proliferación de las células
T, como la interleucina 2 (IL-2). Por lo tanto,
la presencia de los fármacos inmunosupresores en las células T origina una depresión
en el sistema inmune, evitando así el rechazo al órgano trasplantado (Ho et al.,
1996; Dumont, 2000).
Figura 8. Mecanismo de acción del tacrolimus. Obsérvese cómo la unión del tacrolimus a la proteína de unión citosólica FKBP12 crea un complejo que impide la acción de la calcineurina-fosfatasa dependiente de calcio, la cual
imposibilita al factor nuclear de las células T activadas (NF-AT) penetrar en el núcleo y activar la producción de citoquinas (modificado de Dé Tran et al., 2001).
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
229
Beneficios económicos generados por
los inmunosupresores
EvaluatePharma® (http://www.evaluatepharma.com) es la página web dedicada a
suministrar información sobre empresas del
sector farmacéutico y biotecnológico, así
como de sus productos. En ella se puede
seguir la evolución de los distintos productos prescritos en clínica. Basándonos en
sus datos podemos ver cómo se encuentra
actualmente el mercado de los inmunosupresores. Estos compuestos incrementaron
sus ventas un 8% en 2010 con respecto al
2009. En términos económicos, el tacrolimus en su formulación Prograf® fue el in-
munosupresor más vendido, generando sus
ventas 1.826 millones de dólares, lo que supone un 29% del mercado mundial de inmunosupresores (figura 9) y 585 millones
más de beneficios que el compuesto situado en segundo lugar.
Actualmente existen 1.605 sustancias o
formulaciones inmunosupresoras en el
mercado según EvaluatePharma®. Este
número se prevé que siga aumentando
ya que hay dos nuevos inmunosupresores listos para salir al mercado, dos en
fase clínica III, cinco en fase clínica II,
cinco en fase clínica I y once en fase preclínica.
Ventas por años (mill. $)
Porcentaje
Posición
Marca
Compuesto
Compañía
2008
2009
2010
2008
2009
2010
1
2
3
4
5
Otros
Prograf®
CellCept®
Neoral®
Myfortic®
Stelara®
Tacrolimus
Micofenolato mofetil
Ciclosporine
Ácido micophenólico
Ustekinumab
Astellas Pharma
Roche
Novartis
Novartis
Johnson & Johnson
1.882
1.942
956
290
1.037
6.107
1.945
1.455
919
353
33
1.117
5.823
1.826
1.241
871
444
393
1.518
6.293
31%
32%
16%
5%
17%
33%
25%
16%
6%
1%
19%
29%
20%
14%
7%
6%
24%
Total
Inmunosupresores (2010)
Otros 24%
Prograf® 29%
Stelara® 6%
Myfortic® 7%
Neoral® 14%
CellCept® 20%
Figura 9. Ventas de inmunosupresores a nivel mundial. Superior: tabla de beneficios de los 5 inmunosupresores
más vendidos entre 2008 y 2010, indicándose la marca comercial, compuesto, compañía productora y beneficios generados en millones de dólares y en porcentaje. Inferior: representación de los porcentajes de ventas de
los inmunosupresores en 2010. Datos obtenidos de EvaluatePharma® (http://www.evaluatepharma.com).
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
230
Nuevas tendencias
Haddad y colaboradores (2006), en un estudio sobre pacientes trasplantados de hígado, comparaban la eficiencia de la ciclosporina versus tacrolimus concluyendo que:
“el tacrolimus es superior a la ciclosporina
tras el trasplante de hígado, pero estos pacientes deben tener controlado el desarrollo
de diabetes”. Asimismo, recomiendan que
se realice más investigación para disociar los
efectos no deseables de estos inhibidores
de la calcineurina de su beneficioso efecto
inmunosupresor. El tacrolimus a veces es
utilizado solamente con pacientes en estadios severos de enfermedad o hipersensibles a otros tratamientos debido a sus
efectos colaterales (disfunción renal, efectos
gastrointestinales, neurológicos, hipertricosis o hiperplasia gingival). Tratamientos
prolongados con este compuesto requieren
un estricto seguimiento terapéutico debido
a su estrecho índice terapéutico (medida del
margen de seguridad de un medicamento)
y a la gran variabilidad entre individuos, que
puede llevar a daños debido a sobre o infradosis (Roy et al., 2006). Esto se debe a
su baja biodisponibilidad (fracción de la
dosis administrada que alcanza su diana),
que acarrea una variable exposición sistémica cuando se dosifica oralmente, lo que
a veces requiere su aplicación intravenosa
(Tamura et al., 2003). Por ello, la investigación en análogos que permitan mejorar la
biodisponibilidad oral, que reduzcan la toxicidad sistémica debida a la incorrecta dosificación y faciliten la administración oral
es de gran interés (Borris et al., 1990; Moss
et al., 2010). Esta investigación debe ir encaminada a explorar diferentes perfiles farmacocinéticos e interacciones entre compuestos para la mayor supervivencia del
paciente y del órgano trasplantado, con los
menores efectos secundarios (Haddad et
al., 2006).
La figura 7 muestra la biosíntesis del tacrolimus, en la cual grandes genes denominados policétido sintasas (PKS) presentan
varios módulos que realizan la incorporación de las diferentes precursoras que conforman la molécula. La modificación de
estos módulos, de los genes que realizan
las modificaciones post-PKS (p. ej: fkbO, figura 6), el reemplazamiento de los genes
que inician el proceso para que utilicen
otras moléculas precursoras o inclusive el
uso de moléculas iniciadoras no naturales
son soluciones que se están aplicado para
obtener moléculas con propiedades farmacocinéticas mejoradas (Moss et al., 2010).
Para poder realizar estas modificaciones es
necesario poseer un conocimiento muy detallado de los procesos de síntesis de los inmunosupresores. Esto se consigue mediante la obtención de la secuencia
completa de las agrupaciones de genes implicadas en la síntesis e inclusive de los genomas de los microorganismos productores, como ha sucedido con el genoma
de S. tsukubaensis (Barreiro et al., 2012).
Con la llegada de los nuevos sistemas de
secuenciación ultrarrápida, como 454 lifescience® (Roche), Solexa® (Illumina), Ion
Torrent® (Applied Biosystems), se han podido obtener genomas completos en unos
pocos días. Aunque actualmente el cuello
de botella se encuentra en el editado de
dichos genomas, la actual velocidad de obtención de secuencia génica está abriendo
la puerta a la aplicación de otras ómicas.
Este neologismo engloba a aquellas áreas
de la biología molecular que estudian los
constituyentes de esa área de manera colectiva, como puede ser la Proteómica, que
estudia el conjunto de las proteínas gene-
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
231
radas por un genoma en un tiempo y condiciones concretas. Así, la Proteómica,
Transcriptómica, Lipidómica o Metabolómica (Greenbaum et al., 2001) facilitan la
síntesis de nuevos análogos con mejores
características funcionales. En el caso del
inmunosupresor rapamicina (sirolimus, figura 5) producida por Streptomyces hygroscopicus ha aparecido una batería de
derivados con diferentes propiedades
como antitumorales o inmunosupresores.
Así el temsirolimus, comercializado como
Torisel® (Wyeth Pharmaceuticals), es un
éster soluble de la rapamicina de reciente
aprobación por la FDA que presenta actividad contra los carcinomas renales avanzados. Otros análogos de la rapamicina se
encuentran en fase III o han sido aprobados para determinados usos (Rini, 2008).
El everolimus producido por Novartis
[marca comercial: Zortress® (EE.UU.),
Certican® (Europa y otros países) para trasplantes y Afinitor® para oncología] ha sido
recientemente aprobado para su uso en
cáncer de riñón (marzo de 2010), prevención de rechazo en trasplante renal (abril
de 2010) o metástasis progresiva en tumores neuroendocrinos de páncreas (mayo
de 2011) y se encuentra en fase III en otros
tipos de cáncer. El ridaforolimus (AP23573,
MK-8669 o deforolimus) desarrollado por
Merck y Ariad Pharmaceuticals ha superado la fase III en junio de 2011 para metástasis de tejidos blandos y sarcomas de
hueso. El zotarolimus (ABT-578), un derivado sintético de la rapamicina diseñado
para su uso en stents producido por
Medtronic, Inc. bajo el nombre de
Endeavor®, se comercializa desde 2008.
Igualmente el umirolimus (biolimus o biolimus A9) es un derivado altamente hidrofóbico de la rapamicina utilizado también
para recubrir stents propiedad de Biosensors International.
Por otra parte, la mejora en la eficacia de
los inmunosupresores también se puede
lograr a través de la dosificación. Actualmente, los médicos disponen de un completo arsenal de sustancias inmunosupresoras. Obviamente cada uno de estos
compuestos, como hemos visto a lo largo
del capítulo, presenta una serie de efectos
secundarios que en muchos casos acarrean
enfermedades cardiovasculares. Esto es
algo que también se tiene en cuenta a la
hora de dosificar inmunosupresores. Por
todo ello, la monitorización de los fármacos
(TDM: Therapeutic Drugs Monitoring), que
asegure el mantenimiento de los niveles
plasmáticos correctos de los inmunosupresores dentro de sus rangos terapéuticos, llevará a la inmunosupresión individual, lo que
prevendrá la sobre e infradosificación
(Sprangers et al., 2011), aunque esto actualmente no es completamente posible
debido a varias razones: i) no existen test
fiables que permitan predecir el estado inmunológico del paciente; ii) no se ha establecido plenamente la contribución de cada
inmunosupresor a las diferentes complicaciones producidas; iii) no existen pruebas
suficientemente representativas para la supresión del uso de determinados inmunosupresores comerciales (Sprangers et al.,
2011).
Por tanto, se puede concluir que la evolución en el trasplante de órganos y su
mantenimiento es el resultado de la acumulación de diferentes conocimientos.
Entre ellos, el descubrimiento de los compuestos inmunosupresores, que ha supuesto un importante avance sobre el que
se debe seguir investigando desde todas
las ramas biosanitarias.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
232
Agradecimientos
Quiero agradecer al grupo de Streptomyces
especializado en tacrolimus de INBIOTEC
(Instituto de Biotecnología de León), especialmente a mi colaboradora, Dra. Miriam
Martínez-Castro.
Bibliografía recomendada
Akimoto K, Kusunoki Y, Nishio S, Takagi K,
Kawai S. Safety profile of tacrolimus in patients
with rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol
2008; 27(11):1.393-7.
Arndt C, Cruz MC, Cárdenas ME, Heitman J.
Secretion of FK506/FK520 and rapamycin by
Streptomyces inhibits the growth of competing
Saccharomyces cerevisiae and Cryptococcus neoformans. Microbiology 1999; 145(Pt. 8):1.9892.000.
Bai JP, Lesko LJ, Burckart GJ. Understanding
the genetic basis for adverse drug effects: the
calcineurin inhibitors. Pharmacotherapy 2010;
30(2):195-209.
Barreiro C, Prieto C, Sola Landa A, Solera E,
Martínez Castro M, Pérez Redondo R, García
Estrada C, Aparicio JF, Fernández Martínez LT,
Santos Aberturas J, Salehi Najafabadi A,
Rodríguez García A, Tauch A, Martín JF. Draft
genome of Streptomyces tsukubaensis NRRL
18488, the producer of the clinically important
immunosuppressant tracrolimus (FK506). J
Bacteriol 2012; 194(14):3.756-7.
Benson A, Barrett T, Sparberg M, Buchman AL.
Efficacy and safety of tacrolimus in refractory
ulcerative colitis and Crohn's disease: a singlecenter experience. Inflamm Bowel Dis 2008;
14(1):7-12.
Biggins SW, Bambha K, Terrault N, Inadomi J,
Roberts JP, Bass N. Transplant tourism to
China: the impact on domestic patient-care
decisions. 2009; 23(6):831 8.
Borel JF, Feurer C, Gubler HU, Stähelin H.
Biological effects of cyclosporin A: a new antilymphocytic agent. Agents Actions. 1976;
6(4):468-75.
Borris RP, Wicker LS, Zink DL, Lien TH. Novel
immunosuppressant compound. Patente:
EP19890309089. 1990.
Calne RY. Introducción e historia de los trasplantes de tejidos. En: Trasplante Renal.
Edición española. Zaragoza. España: Editorial
Acribia, 1965.
Carral JM, Parellada J. Aspectos históricos y
bioéticos sobre los trasplantes de órganos. Rev
Cub Med Int Emerg 2003; 2:80-3.
Chow DK, Leong RW. The use of tacrolimus in
the treatment of inflammatory bowel disease.
Expert Opin Drug Saf 2007; 6(5):479-85.
Clipstone NA, Crabtree GR. Identification of
calcineurin as a key signalling enzyme in Tlymphocyte activation. Nature 1992; 357
(6.380):695-7.
Cortes J, Haydock SF, Roberts GA, Bevitt DJ,
Leadlay PF. An unusually large multifunctional
polypeptide in the erythromycin-producing
polyketide synthase of Saccharopolyspora
erythraea. Nature 1990; 348(6.297):176-8.
Delmonico FL. Transplantation: Transplant tourism-an update regarding the realities. Nat Rev
Nephrol 2011; 7(5):248-50.
Dé Tran QH, Guay E, Chartier S, Tousignant J.
Tacrolimus in dermatology. J Cutan Med Surg
2001; 5(4):329-35.
Dumont FJ. FK506, an immunosuppressant targeting calcineurin function. Curr Med Chem
2000; 7(7):731-48.
Duncan MD, Wilkes DS. Transplant-related immunosuppression: a review of immunosuppression and pulmonary infections. Proc Am
Thorac Soc 2005; 2(5):449-55.
Garrity GM, Heimbuch BK, Motamedi H,
Shafiee A. Genetic relationships among actinomycetes that produce the immunosuppressant macrolides FK506, FK520/FK523 and rapamycin. J Ind Microbiol 1993; 12(1):42-7.
Goranovic D, Kosec G, Mrak P, Fujs S, Horvat
J, Kuscer E, Kopitar G, Petkovic H. Origin of
the allyl group in FK506 biosynthesis. J Biol
Chem 2010; 285(19):14.292-300.
Gracia D. Trasplante de órganos: medio siglo de
reflexión ética. Nefrología 2001; XXI(Supl. 4).
Gracia D. Historia del trasplante de órganos.
En: Trasplantes de órganos problemas técnicos, éticos y legales. Javier Gafo (ed.).
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
233
España: Editorial Universidad Pontificia
Comillas, 1996; 13 32.
Greenbaum D, Luscombe NM, Jansen R, Qian
J, Gerstein M. Interrelating Different Types of
Genomic Data, from Proteome to Secretome:
’Oming in on Function. Genome Res 2001;
11:1.463-8.
Gummert JF, Ikonen T, Morris RE. Newer immunosuppressive drugs: a review. J Am Soc
Nephrol 1999; 10(6):1.366-80.
Guo X, Dillman JF 3rd, Dawson VL, Dawson
TM. Neuroimmunophilins: novel neuroprotective and neuroregenerative targets. Ann
Neurol 2001; 50(1):6-16.
Haddad E, McAlister V, Renouf E, Malthaner
R, Kjaer MS, Gluud LL. Cyclosporin versus
Tacrolimus for Liver Transplanted Patients.
Surgery Publications. Paper 2006; 29.
Hendrix DV, Adkins EA, Ward DA, Stuffle J,
Skorobohach B. An investigation comparing
the efficacy of topical ocular application of tacrolimus and cyclosporine in dogs. Vet Med Int
2011; 487592.
Heusler K, Pletscher A. The controversial early
history of cyclosporin. Swiss Med Wkly 2001;
131(21-22):299-302.
Ho S, Clipstone N, Timmermann L, Northrop
J, Graef I, Fiorentino D, Nourse J, Crabtree GR.
The mechanism of action of cyclosporin A and
FK506. Clin Immunol Immunopathol 1996;
80(3 Pt. 2):S40-5.
Ingram JR, Martin JA, Finlay AY. Impact of topical calcineurin inhibitors on quality of life in
patients with atopic dermatitis. Am J Clin
Dermatol 2009; 10(4):229-37.
Kino T, Goto T. Discovery of FK-506 and update. Ann NY Acad Sci 1993; 685:12-21.
Kino T, Hatanaka H, Hashimoto M, Nishiyama
M, Goto T, Okuhara M, Kohsaka M, Aoki H,
Imanaka H. FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces. I.
Fermentation, isolation, and physico-chemical
and biological characteristics. Tokio: J Antibiot,
1987a; 40(9):1.249-55.
Kino T, Hatanaka H, Miyata S, Inamura N,
Nishiyama M, Yajima T, Goto T, Okuhara M,
Kohsaka M, Aoki H, Ochiai T. FK-506, a novel
immunosuppressant isolated from a
Streptomyces. II. Immunosuppressive effect of
FK-506 in vitro. Tokio: J Antibiot, 1987b;
40(9):1.256-65.
Kitahara K, Kawai S. Cyclosporine and tacrolimus for the treatment of rheumatoid arthritis.
Curr Opin Rheumatol 2007; 19(3):238-45.
Koo JY, Fleischer AB Jr, Abramovits W, Pariser
DM, McCall CO, Horn TD, Gottlieb AB, Jaracz
E, Rico MJ. Tacrolimus ointment is safe and effective in the treatment of atopic dermatitis:
results in 8000 patients. J Am Acad Dermatol
2005; 53(2 Suppl. 2):S195-205.
Kürnsteiner H, Zinner M, Kück U. Immunosuppressant. En: The Mycota: a comprehensive treatise on fungi as experimental systems
for basic and applied research. Esser K, Bennet
JW, Osiewacz HD (ed.). Editorial: SprinegVerlag Berlin Heidelberg (Alemania). 2002;
129-55.
Martínez-Casto M. Control por fosfato en la
biosíntesis del inmunosupresor tacrolimus en
dos especies del género Streptomyces. Tesis
Doctoral. Universidad de León. 2011.
McPartland KJ, Pomposelli JJ. Update on immunosuppressive drugs used in solid-organ
transplantation and their nutrition implications. Nutr Clin Pract 2007; 22(5):467-73.
Meier-Kriesche HU, Li S, Gruessner RW, Fung
JJ, Bustami RT, Barr ML, Leichtman AB.
Immunosuppression: evolution in practice and
trends, 1994-2004. Am J Transplant 2006; 6(5
Pt. 2):1.111-31.
Mor E, Yussim A, Chodoff L, Schwartz ME.
New immunosuppressive agents for maintenance therapy in organ transplantation.
BioDrugs 1997; 8(6):469-88.
Moss SJ, Wilkinson B, Martin CJ, Stanley AE,
Schell UE. Novel compounds and methods for
their production. Patente: WO/2010/004304.
2010.
Motamedi H, Cai SJ, Shafiee A, Elliston KO.
Structural organization of a multifunctional
polyketide synthase involved in the biosynthesis of the macrolide immunosuppressant
FK506. Eur J Biochem 1997; 244(1):74-80.
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
234
Motamedi H, Shafiee A. The biosynthetic gene
cluster for the macrolactone ring of the immunosuppressant FK506. Eur J Biochem 1998;
256(3):528-34.
Romano A, Jensen MR, McAlpine J. Toward
the optimization of stent-based treatment for
coronary artery disease. Curr Opin Drug Discov
Devel 2010; 13(2):157-8.
Muramatsu H, Mokhtar SI, Katsuoka M, Ezaki
M. Phylogenetic Analysis of Immunosuppressant
FK506-Producing Streptomycete Strains.
Actinomycetologica 2005; 19(2):33-9.
Roy JN, Barama A, Poirier C, Vinet B, Roger M.
Cyp3A4, Cyp3A5, and MDR 1 genetic influences on tacrolimus pharmacokinetics in
renal transplant recipients. Pharmacogenetics
2006; 16(9):659-65.
Neuhaus P, Klupp J, Langrehr JM. mTOR inhibitors: an overview. Liver Transpl 2001;
7(6):473-84.
Ochiai T, Nakajima K, Nagata M, Suzuki T,
Asano T, Uematsu T, Goto T, Hori S, Kenmochi
T, Nakagoori T, et al. Effect of a new immunosuppressive agent, FK 506, on heterotopic cardiac allotransplantation in the rat. Transplant
Proc 1987; 19(1 Pt. 2):1.284-6.
Olano C, Lombó F, Méndez C, Salas JA.
Improving production of bioactive secondary
metabolites in actinomycetes by metabolic engineering. Metab Eng 2008; 10(5):281?92.
Pace RA. Aspectos éticos de los trasplantes de
órganos. En: Cuadernos del programa regional
de bioética. OPS-OMS. 1996; 4:149-70.
Patel JK, Kobashigawa JA. Cardiac transplant
experience with cyclosporine. Transplant Proc
2004; 36(2 Suppl):323S-330S.
Patel JK, Kobashigawa JA. Tacrolimus in heart
transplant recipients: an overview. BioDrugs
2007; 21(3):139-43.
Rallis E, Korfitis C, Gregoriou S, Rigopoulos D.
Assigning new roles to topical tacrolimus. Expert
Opin Investig Drugs 2007; 16(8):1.267-76.
Reis SA, Moussatché N, Damaso CR. FK506, a
secondary metabolite produced by Streptomyces, presents a novel antiviral activity against
Orthopoxvirus infection in cell culture. J Appl
Microbiol 2006; 100(6):1.373-80.
Reynolds KA, Demain AL. Rapamycin, FK506
and Ascomycin-related compounds. En:
Biotechnology of antibiotics, ed. Strohl WR,
Segunda. Marcel Dekker, INC. 1997; 497-520.
Rini BI. Temsirolimus, an inhibitor of Mammalian
target of rapamycin. Clin Cancer Res 2008;
14:1.286-90.
Sawada S, Suzuki G, Kawase Y, Takaku F.
Novel immunosuppressive agent, FK506. In
vitro effects on the cloned T cell activation. J
Immunol 1987; 139(6):1.797-803.
Schwecke T, Aparicio JF, Molnar I, Konig A,
Khaw LEE, Haydock SF, Oliynyk M, Caffrey P,
Cortes J, Lester JB, Bohm GA, Staunton J,
Leadlay PF. The biosynthetic gene cluster for
the polyketide immunosuppressant rapamycin. Proc Natl Acad Sci USA 1995;
92:7.839-43.
Siekierka JJ, Staruch MJ, Hung SH, Sigal NH.
FK-506, a potent novel immunosuppressive
agent, binds to a cytosolic protein which is distinct from the cyclosporin A binding protein,
cyclophilin. J Immunol 1989; 143(5):1.580-3.
Sprangers B, Kuypers DR, Vanrenterghem Y.
Immunosuppression: does one regimen fit all?
Transplantation 2011; 92(3):251-61.
Tamura S, Tokunaga Y, Ibuki R, Amidon GL,
Sezaki H, Yamashita S. The site specific transport
and metabolism of Tacrolimus in the rat small intestine. The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics 2003; 306:310-6.
Tilney NL. Transplantation and its biology: from
fantasy to routine. J Appl Physiol 2000;
89(5):1.681-9.
Tribe HT. The Discovery and Development of
Cyclosporin. Mycologist. 1998; 12(1):20-2.
Truog RD. The ethics of organ donation by living
donors. N Engl J Med 2005; 353(5):444-6.
Wallemacq PE, Reding R. FK506 (tacrolimus),
a novel immunosuppressant in organ transplantation: clinical, biomedical, and analytical
aspects. Clin Chem 1993; 39(11 Pt. 1):2.21928.
Westhoff TH, Van der Giet M. Tacrolimus in
the treatment of idiopathic nephrotic syn-
Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...
235
drome. Expert Opin Investig Drugs 2007;
16(7):1.099-110.
Wiederrecht G, Lam E, Hung S, Martin M,
Sigal N. The mechanism of action of FK-506
and cyclosporin A. Ann NY Acad Sci 1993;
696:9-19.
Wu K, Chung L, Revill WP, Katz L, Reeves
CD. The FK520 gene cluster of Streptomyces
hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC
14891) contains genes for biosynthesis of
unusual polyketide extender units. Gene
2000; 251:81-90.
Direcciones web de interés
Centro para la Bioética de la Universidad de
Minnesota: http://www.ahc.umn.edu/bioethics/.
Fusionspark Media: http://www.organtransplants.org/understanding/history/index.html.
New York Organ Donor Network: http://www.
donatelifeny.org/all-about-transplantation/
organ-transplant-history/.
Organización Nacional de Trasplantes de España:
http://www.ont.es/Paginas/default.aspx.Evaluate
Pharma: http://www.evaluatepharma.com.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 236
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 237
Aplicaciones de la tecnología de
microarrays o micromatrices
Dr. Antonio Rodríguez García
Introducción: tecnología y
biología molecular
Según defiende el físico Freeman Dyson
(Dyson, 2001), el desarrollo de nuevas
tecnologías es el principal motor del progreso científico. Un ejemplo clásico es la
utilización del telescopio por Galileo, que
le permite descubrir montañas en la luna,
nuevas estrellas, satélites en torno a
Júpiter, etc. Gracias a estos descubrimientos y por medio del razonamiento inductivo, Galileo argumenta a favor de la
teoría copernicana e inicia la era de la física moderna. Sin embargo, el impacto de
las innovaciones tecnológicas es más patente en las modernas ciencias biológicas.
Si la biología molecular se concibe como
el estudio de la estructura, replicación y
expresión de los genes y de la estructura,
interacción y función de los productos génicos, este estudio ha sido posible gracias
a las técnicas usadas para identificar, aislar
y estudiar el ADN, el ARN y las proteínas.
Por medio de la clonación, hibridación de
ácidos nucleicos, secuenciación del ADN
y reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), además del análisis funcional génico, se ha podido determinar la secuencia de genomas completos. En este
aspecto, la tecnología de micromatrices
ofrece la posibilidad de interrogar sobre
la actividad de todo el genoma.
Inicialmente, el estudio de la expresión génica se ha basado en el principio de hibri-
dación específica entre moléculas de ácidos
nucleicos con secuencias complementarias.
Este fenómeno se utilizó en primer lugar
para la detección de fragmentos de ADN
separados electroforéticamente en geles
de agarosa por medio de la hibridación con
una sonda complementaria. La sonda correspondía a la secuencia de estudio y estaba marcada radiactivamente (Southern,
1975). El mismo fundamento fue aplicado
para el análisis de los transcritos de un
único gen, la denominada habitualmente
como técnica Northern (Alwine y col.,
1977). En esta técnica, las moléculas de
ARN diana se fijan a un filtro de nailon después de una electroforesis en gel de agarosa que las separa por tamaño. La sonda
de ADN corresponde a un fragmento del
gen de estudio y está marcada con un isótopo radiactivo o químicamente. Tras la hibridación, la señal proporcionada por la
sonda del gen de estudio permite detectar
el tamaño del ARN mensajero y cuantificar
la transcripción en el momento de la extracción de la muestra.
Con el desarrollo de la tecnología de micromatrices se puede analizar en un experimento la transcripción, no de un
único gen, sino de todo el genoma de un
organismo. Micromatrices de ADN (o microarreglos, más frecuente en la literatura
americana) es el término castellano para
los denominados microarrays (del griego
mikro, pequeño, y del francés arayer, a su
vez del latín arredrare, arreglar) o DNA
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 238
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
238
chips. Las micromatrices permiten la medición simultánea de la transcripción de
cientos, miles o de todos los genes de un
organismo. Una vez que, hoy en día y
cada vez más, se dispone de la secuencia
genómica de miles de organismos, las micromatrices constituyen una herramienta
fundamental de la genómica funcional.
Además de aumentar el conocimiento de
la función génica, la tecnología de las micromatrices, junto con otras técnicas
ómicas, colabora a la revolución en la que
se bate la biología molecular, una revolución en el abordaje del estudio de la vida.
Durante los años 80 y 90, la biología molecular se preocupó principalmente del estudio de la función biológica de genes y
de proteínas considerados individualmente. Este enfoque reduccionista se enfrenta a la visión del organismo biológico
como un sistema. No cabe duda de que
el funcionamiento biológico surge de las
interacciones entre los genes, sus productos y el ambiente celular. La descripción matemática de las redes reguladoras
y de las interacciones entre genes y productos, esto es, la biología de sistemas, es
el futuro del estudio de la vida y necesita
del inventario lo más completo posible de
los componentes moleculares en un momento o estado del sistema.
Desarrollo histórico de la
tecnología de micromatrices
Durante los años 90 se desarrollaron en
paralelo dos tecnologías de micromatrices.
La primera tecnología en lograr la publicación de un análisis de expresión génica fue
la tecnología de matrices impresas de ADN
complementario (cDNA microarrays). Esta
tecnología fue desarrollada en el labora-
torio de Patrick Brown en la Universidad
de Stanford. Consiste en la impresión de
clones de ADN complementario (ADNc)
sobre un cristal del tamaño de un portaobjetos de los usados en microscopía. Se
obtiene una matriz ordenada de pequeñas
zonas circulares o puntos que contienen
las moléculas de ADN depositadas sobre
el cristal (spotted microarrays). Dos muestras de ARN se marcan con sendos fluoróforos y se hibridan simultáneamente sobre
una misma micromatriz para comparar la
abundancia de transcritos entre ambas
(genotipo control y mutante, por ejemplo).
El uso de dos fluoróforos es característico
(two-color microarrays o micromatrices de
dos colores). En el primer ensayo se analizó la expresión diferencial de 45 genes
de Arabidopsis (Schena y col., 1996). Esta
tecnología se hizo accesible a laboratorios
de cierto tamaño y abrió la posibilidad del
estudio masivo (high throughput) de la expresión génica en muchas áreas de la investigación biomédica aun cuando la secuenciación de genomas completos
estaba iniciándose. Ya en 1997, Lashkari
y col. publican el primer trabajo propiamente genómico con el análisis de la expresión génica de 2.479 genes de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En este
caso utilizaron como ADN sondas productos de PCR en vez de clones de ADNc.
La segunda tecnología también se desarrolló en California y no por casualidad,
ya que aplicaba los procedimientos para
la fabricación de microprocesadores del
vecino Silicon Valley para la síntesis fotolitográfica de oligonucleótidos sobre
cristal (Fodor y col., 1991, 1993). Se necesita un equipamiento industrial caro y sofisticado, y por ello este método de fabricación no es accesible a un laboratorio
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 239
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
239
En los primeros años del siglo XXI la tecnología de micromatrices se pone de
moda por lo que promete en el campo de
las investigaciones científicas y de las aplicaciones médicas y biotecnológicas. Esta
expansión del uso de las micromatrices se
manifiesta en el crecimiento rápido del
número de publicaciones que contienen
los términos microarray y gene en la Web
of Knowledge (el último término de búsqueda sirve para descartar artículos de ingeniería: figura 1). Por esta época también crece el número de genomas
secuenciados, lo que posibilita el análisis
genómico de la transcripción diferencial
en varios organismos modelo. Como en
toda implantación de una nueva tecnología, durante los primeros años se perfeccionan los métodos de fabricación de
las micromatrices y los procedimientos
bioquímicos. A su vez, aparecen nuevos
métodos estadísticos y programas bioinformáticos para hacer posible, fiable y
práctico el análisis de los grandes conjuntos de datos que se generan. No obstante, la utilización de las micromatrices
ha estado limitada por el coste elevado
del material fungible y del equipamiento
para la fabricación en el laboratorio y para
la lectura de la fluorescencia una vez hibridada la micromatriz; también por la dificultad técnica para efectuar los ensayos
de una tecnología novedosa, y por la
complejidad y tamaño de los datos gene-
rados, que exigían un cambio en el modo
de planificar la investigación y de interpretar los resultados experimentales. Por
último, los resultados publicados en los
primeros años de expansión no siempre
se hicieron con el rigor experimental apropiado, lo que hizo recelar de la técnica.
Hoy en día, la tecnología de micromatrices
está madura. La fabricación industrial garantiza una gran calidad, los procedimientos bioquímicos están desarrollados
y estandarizados para que la fiabilidad de
los resultados no dependa de las prestaciones de la propia técnica.
Número de referencias en Web of Knowledge
que contienen “microarray” y “gene”
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
universitario. De hecho, su desarollo está
asociado a la empresa Affymetrix, que,
desde entonces, es referente mundial y fabrica y comercializa las micromatrices de
oligonucleótidos con la marca GeneChip®.
El primer análisis de la expresión génica
utilizando esta tecnología se publicó en
1996 (Lockhart y col.).
Figura 1.
Fundamento metodológico
¿Qué se entiende por una micromatriz?
El fundamento metodológico ha sido desarrollado por Schena (2003), que define
la micromatriz como una colección ordenada de elementos microscópicos sobre
un sustrato plano que permite la unión
específica de secuencias o productos génicos. Esta definición abarca otras aplica-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 240
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
240
ciones además del estudio de la transcripción génica, que es el campo al que esta
discusión se ciñe. En este ámbito, los “elementos” hacen referencia a las moléculas
de ADN que están fijadas en áreas definidas del soporte. Estas moléculas son
consideradas como las sondas, ya que se
conoce su naturaleza: a qué gen hacen
referencia las moléculas de cada elemento. Estos elementos están ordenados
y dispuestos sobre un sustrato plano para
facilitar su fabricación, la lectura de las señales que emitan y su identificación. El
sustrato plano, además, permite la reducción del volumen de la muestra, a diferencia de lo que ocurre con el soporte de
nailon de los experimentos de tipo
Northern. Son elementos microscópicos
(15-30 µm para la técnica fotolitográfica,
50-350 µm para las micromatrices impresas) para posibilitar el análisis paralelo
y cinéticas rápidas de reacción. En una
matriz de expresión habitual el número de
elementos es de unos diez mil, pero
puede llegar a contener cientos de miles,
lo que posibilita el análisis de un genoma
entero. Por último, la técnica ha de favorecer la unión específica de las moléculas
que están en solución (moléculas diana)
con las moléculas fijadas (sonda). En el
caso de las matrices de ADN, la unión específica se realiza por la hibridación entre
cadenas complementarias. La unión específica permite que la señal proveniente de
un elemento se relacione con la abundancia (análisis cuantitativo, por tanto) del
transcrito de un gen. Es este un factor
fundamental para la exactitud de los resultados.
Schena (2003) ha definido el ciclo metodológico (figura 2) del análisis con micromatrices que nos sirve para explorar las
fases y requerimientos para utilizar con
éxito esta tecnología. Consta de cinco
etapas, que empiezan por la definición
del problema o pregunta que queremos
hacer al sistema biológico y terminan con
el análisis de los resultados experimentales
obtenidos. A diferencia de las técnicas no
masivas, el trabajo en la poyata del laboratorio emplea mucho menos tiempo que
el trabajo delante del ordenador para analizar e interpretar los datos obtenidos. Es
de esperar que, si el diseño del experimento fue adecuado, podamos contestar
a la pregunta inicial, aunque es posible,
de ahí lo de ciclo metodológico, que
surjan nuevas preguntas que inicien un
nuevo proceso de análisis.
Diseño experimental
Para que el uso de las micromatrices sea
fructífero, esto es, que merezca la pena la
inversión económica, en tiempo y en esfuerzo, se deben cuidar todas las fases del
ciclo metodológico, pero la etapa crucial
y probablemente más importante es la
primera. Se debe establecer cuidadosamente la pregunta biológica con la que
interrogaremos a nuestro sistema experimental, pregunta que en análisis de expresión trata sobre saber qué genes se transcriben, cuánto, cuándo y dónde (el porqué
que completaría las “cinco W” de la práctica periodística quedaría para la fase final
de interpretación de los resultados). El
cuánto se transcriben los genes necesita
una matización. Generalmente, los valores
que se obtienen son valores relativos, no
absolutos, e implican la comparación entre
dos condiciones experimentales. Se pueden comparar: a) genotipos (genotipo o
genotipos mutantes comparados con la
referencia, el genotipo parental, silvestre
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 241
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
241
Pregunta biológica
Diseño del experimento
Análisis y modelado
Preparación de las muestras
A) Cuantificación, preprocesamiento,
análisis estadístico, agrupamiento,
representación; B) Interpretación
1) Fabricación de la micromatriz;
2) Obtención de los ác. nuc. diana
marcados con fluoróforos
Detección
Reacciones bioquímicas
Ajuste del lector, obtención de
las imágenes
Hibridación y lavados
Figura 2.
o salvaje); b) tratamientos a fármacos, tóxicos o estreses en experimentos que
comparan el organismo tratado con el no
tratado o control; c) muestras obtenidas
de distintos tejidos u órganos para desentrañar la expresión espacial de los genes
en un organismo pluricelular; d) muestras
de tejidos enfermos para compararlas con
muestras del mismo tejido sano; e) muestras obtenidas en una serie temporal para
ver la evolución de un sistema biológico,
como pueda ser un cultivo bacteriano o
para estudiar el desarrollo de un organismo. Este último diseño se puede combinar con los anteriores para ver el cambio
de expresión inducido como respuesta a
un tratamiento o estrés.
Una vez establecido qué queremos averiguar sobre la expresión génica de nuestro
sistema, se aborda el diseño experimental.
Se debe determinar, antes que nada, qué
tipo de plataforma usar. Los distintos fabricantes de micromatrices se listarán más
adelante, pero la cuestión clave es si usar
micromatrices de un canal o color
(Affymetrix) o de dos colores, ya que esto
determina el diseño experimental. Las micromatrices monocanal tienen una gran
flexibilidad a la hora de hacer comparaciones entre condiciones, ya que las
muestras se ensayan por separado (una
muestra, una matriz). En cambio, con las
micromatrices de dos colores se analizan
dos muestras distintas simultáneamente.
Si pretendemos comparar la expresión
entre solo dos condiciones (silvestre frente
a mutante, por ejemplo), el diseño sería
el más sencillo: muestras de las dos condiciones se hibridarían en la misma micromatriz. Este diseño de comparación directa [figura 3, i)] presenta la ventaja de
ser más económico (se requieren la mitad
de micromatrices que muestras) y de dar
lugar a una mayor precisión, ya que se minimizan las variaciones técnicas de una hibridación a otra (como en el caso de las
matrices monocanal o de las comparaciones indirectas).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 242
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
242
A
A
C
i)
A
C
ii)
B
iii)
B
A
B
B
C
D
…
iv)
Referencia
Figura 3.
La comparación directa está limitada por
el número de condiciones que se quiere
ensayar. Si tenemos tres condiciones, la
alternativa es hacer comparaciones directas entre las condiciones más relevantes y comparar indirectamente las
demás condiciones [A con C, figura 3, ii)]
o hacer todas las combinaciones entre
condiciones [figura 3, iii)], lo cual es más
costoso en tiempo, esfuerzo y material.
Esta opción será más costosa cuantas
más condiciones distintas se ensayen.
Otro inconveniente de este planteamiento es que es más dificultoso ampliar
el experimento a nuevas condiciones
(nuevos mutantes, por ejemplo), ya que
las muestras iniciales pueden haberse
agotado. La alternativa es hacer comparaciones indirectas por medio de una
muestra de referencia que se incluya en
todas las hibridaciones [figura 3, iv)]. Esta
referencia puede prepararse a partir de
una mezcla de ARN de las condiciones
ensayadas, puede ser comercial (en caso
de ensayos con organismos modelo multicelulares, especialmente de tejidos humanos) o, una solución muy conveniente
y frecuente en procariotas, puede ser
ADN genómico. El ADN genómico es
mucho más estable y fácil de extraer que
el ARN. Además, no sufre de las variaciones en su composición (número de
copias de cada gen) por factores biológicos que sufre el ARN. Las ventajas de
este diseño es que un experimento
hecho en un determinado momento se
puede ampliar muy fácilmente a nuevas
condiciones y muestras, que el diseño es
sencillo e inmediato, y que todas las
comparaciones se efectuarán con la
misma precisión [a diferencia de, por
ejemplo, el diseño ii) de la figura 3]. Los
inconvenientes es que se emplea una
matriz por muestra (como en las matrices monocanal) y en que las comparaciones son indirectas y, por ello, se pierde
algo de precisión. Un valor añadido importante cuando se utiliza ADN genómico como referencia es que se obtiene
un valor de expresión para condición y
gen que se aproxima a un valor absoluto
de expresión. Es un valor similar al que
se obtiene con las matrices monocanal.
Estos valores ayudan a la interpretación
de los resultados, especialmente en las
series temporales.
El diseño experimental se completa determinando el número de réplicas biológicas
para cada condición. Esto es, de cuántos
organismos (pluricelulares) o de cuántos
cultivos (unicelulares) se obtienen muestras. Es claro que cuantas más réplicas,
mayor poder tendrá la prueba estadística;
la limitación viene del coste y de la disponibilidad. En general, se suelen utilizar un
mínimo de tres réplicas biológicas. En series temporales, no obstante, puede ser
suficiente con una única réplica biológica
para un análisis detallado con un gran número de muestras, apoyada por otra u
otras réplicas para corroborar los cambios
más importantes.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 243
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
243
Preparación de las muestras:
fabricación de las micromatrices
Por el método de fabricación se pueden
distinguir dos grandes grupos de micromatrices: el depósito del ADN sonda
sobre el soporte o la síntesis del ADN
sonda en el mismo soporte (síntesis in
situ). El primer tipo corresponde a las micromatrices impresas y se obtienen depositando los ADN sondas sobre cristales
portaobjetos por medio de un robot. El
equipamiento es asequible para un laboratorio universitario. Se requiere la síntesis
previa de las sondas: clones de ADN complementario, productos de PCR o bien oligonucleótidos obtenidos de un servicio de
síntesis. En un principio este método de
fabricación permitió la expansión de la
tecnología de micromatrices cuando los
proveedores industriales eran escasos o
caros sus productos, o no se contaba con
la matriz industrial para el organismo de
estudio. Sin embargo, hoy en día este tipo
de matrices queda confinado para usos
especiales, como la utilización como
sonda de grandes fragmentos de ADN
(BAC) en micromatrices teseladas (tiling)
para análisis genómicos que exceden el
objetivo de esta discusión. Ello es debido
a que se han abaratado los precios de las
micromatrices industriales de síntesis in
situ y a la preferencia por las sondas de
oligonucleótidos.
En el transcurso del desarrollo de la tecnología ha habido un debate sobre la longitud más adecuada del ADN sonda para
el análisis de la expresión diferencial. El
consenso indica que las sondas más adecuadas son las sondas de oligonucleótidos
y la obtención de sondas de oligonucleótidos está accesible para la síntesis in situ.
Las micromatrices de este tipo son todas
industriales y, dado que estas matrices no
adolecen de los problemas de variabilidad
técnica en la deposición de más o menos
cantidad de sonda en cada elemento de la
micromatriz, han desplazado a las micromatrices impresas. La calidad y fiabilidad
de las micromatrices industriales, además,
está garantizada. Otras ventajas importantes son la flexibilidad en la fabricación
(no se necesita la síntesis previa de una colección de oligonucleótidos) y la densidad
de sondas. Dos fabricantes representativos
son Affymetrix, ya mencionado, y Agilent.
El primero utiliza la síntesis fotolitográfica,
el segundo la tecnología de chorro de
tinta. Estas distintas tecnologías se traducen en que las micromatrices de Affymetrix tienen limitado el tamaño de los
oligonucleótidos sondas a 25 nucleótidos,
mientras que las de Agilent alcanzan los
60 nucleótidos. En principio, el tamaño
mayor de las sondas de Agilent indica una
mejor calidad en los resultados. La contrapartida es que la tecnología fotolitográfica logra una mayor densidad de
sondas. En estos momentos, las densidades máximas logradas por estos fabricantes corresponden a 6 millones de
sondas por micromatriz de Affymetrix
frente al millón de Agilent. Una ventaja
importante de Agilent es su flexibilidad:
aceptan pedidos de tan solo una micromatriz, con un conjunto personalizado y
único de sondas. Affymetrix requiere un
pedido mínimo de micromatrices para organismos fuera de catálogo y cobra el servicio de diseño. Las micromatrices de
Affymetrix son monocanal, mientras que
las de Agilent se usan generalmente
como de doble canal, aunque pueden
usarse como de un solo color.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 244
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
244
Dada la buena calidad y reproducibilidad
de las micromatrices industriales y que
hoy se cuenta con procedimientos de laboratorio estandarizados, el factor más
determinante para la calidad de los resultados es el diseño de las sondas. Una vez
que se ha secuenciado el genoma de un
organismo o que se cuenta con un banco
de secuencias expresadas (EST, expressed
sequence tag), por medios bioinformáticos se eligen las secuencias que definirán
las sondas de la micromatriz y sus propiedades. Son cuatro los factores que determinan el rendimiento de las sondas: especificidad, sensibilidad, ruido y sesgo. La
especificidad de una sonda (que solamente hibride con ella las moléculas diana
provenientes del gen correspondiente) aumenta con la longitud de la sonda hasta
unos 100 nucleótidos, aproximadamente.
Para maximizar la especificidad de las
sondas se utilizan programas bioinformáticos que buscan coincidencia total o parcial en la secuencia elegida con otras regiones del genoma potencialmente
expresadas. La sensibilidad es la capacidad
para detectar cantidades mínimas de las
moléculas diana. Aumenta con la longitud de la sonda y depende de factores
menos controlables a la hora del diseño
(propiedades termodinámicas de la secuencia, concentración de la sonda en el
elemento de la matriz, química de la superficie de la matriz y accesibilidad de la
diana en las condiciones de hibridación).
El ruido de una sonda se define como la
variación aleatoria entre hibridaciones replicadas. Disminuye con la longitud de la
sonda. El sesgo constituye una desviación
sistemática de la medida que proporciona
la sonda respecto del valor real y es difícil
de eliminar, aunque disminuye con la lon-
gitud de la sonda. De lo expuesto se deduce que la longitud de la sonda mejora
la sensibilidad, el ruido y el sesgo, y hasta
100 nucleótidos, la especificidad. Las estrategias que han adoptado los fabricantes para optimizar el diseño de sus
sondas son básicamente dos: o bien consiguen la síntesis in situ de sondas de un
tamaño cercano al óptimo, como Agilent
(60 nucleótidos), o bien compensan la insuficiente longitud de las sondas con la
inclusión de sondas múltiples por cada
gen, caso de Affymetrix (sondas de 25
nucleótidos, pero mayor densidad de fabricación). El promediado de sondas múltiples por gen consigue cancelar el ruido,
ya que es aleatorio, y minimiza el sesgo si
las sondas poseen sesgos distintos.
Preparación de las muestras:
obtención de los ácidos nucleicos
diana marcados con fluoróforos
La obtención de las moléculas diana con
las que se van a hibridar las micromatrices
constituye obviamente un paso clave para
el éxito del experimento. El material de
partida habitual son muestras de tejidos
u órganos, o muestras de cultivos de células de las que se extrae el ARN. Es fundamental que la muestra sea representativa de la condición experimental de
estudio. Esto puede ser un auténtico desafío en el caso de muestras de tumores,
pues células cancerígenas pueden estar
entremezcladas con células normales.
El método de extracción de ARN puede
influir en los resultados, por lo que, una
vez establecido el método adecuado, no
se debe variar. El ARN es un material delicado, fácilmente degradable por las ribonucleasas. Hay que asegurar que los
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 245
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
245
tubos y soluciones estén libres de estas
enzimas ubicuas y llevar guantes siempre,
además de renovarlos frecuentemente.
Existen detergentes comerciales, como
RNaseZap® de Ambion, para la limpieza
de pipetas y gradillas. Además, los sistemas de reactivos comerciales para la purificación de ARN de diversas fuentes ahorran la necesidad de la preparación de
reactivos libres de ribonucleasas.
A la hora de la toma de la muestra es necesario determinar la cantidad de tejido
o células para extraer la suficiente cantidad de ARN. Habitualmente son suficientes 10 µg de ARN, que se obtienen
con 2 mm3 de la mayoría de tipos de tejidos. Otro factor importante es evitar los
cambios en el ARN durante la manipulación de la muestra. Para ello, o bien se congela inmediatamente en nitrógeno líquido,
o bien se utilizan reactivos comerciales que
paralizan la maquinaria celular de síntesis
y degradación del ARN, además de aumentar la estabilidad del ARN, mientras se
conservan las muestras refrigeradas o congeladas hasta el momento de la extracción.
Soluciones estabilizantes habituales son
RNAlater® (Ambion) y RNAprotect Bacteria®
(Qiagen), para muestras de células eucariotas o de procariotas, respectivamente, y
los tubos PAXgene® para muestras de
sangre.
debe ser 2:1 o superior como indicador
de la pureza del ARN. Estas medidas se realizan idealmente en instrumentos que
emplean cantidades mínimas de la solución de ARN, de 1 a 2 µl, como es el caso
del espectrofotómetro NanoDrop™. Por
otro lado, el análisis de la integridad del
ARN es esencial para que los transcritos
no estén degradados y para evitar sesgos
en los resultados por comparar muestras
de distinta calidad. En electroforesis en gel
de agarosa desnaturalizante se puede visualizar las bandas correspondientes a los
ARN ribosomales, que deben ser nítidas,
guardar una relación próxima a 2 entre
sus intensidades y no mostrar trazas de
degradación. No obstante, el instrumento
que se ha convertido en el estándar para
el control de la integridad del ARN en el
análisis de expresión es el aparato de electroforesis capilar en chip Bioanalyzer 2100
de Agilent. Además de ahorrar tiempo y
trabajo, proporciona una cuantificación
precisa de la integridad del ARN por
medio del valor del denominado RIN (RNA
integrity number), que debe idealmente
ser superior a 8 (el valor máximo es de
10). En ciertos tipos de muestras es difícil
alcanzar ese valor. En ese caso, se debe
cuidar que todas las muestras tengan valores comparables para evitar el sesgo técnico en caso contrario.
El ARN extraído debe ser analizado para
comprobar la concentración, pureza e integridad. Por medio de un barrido espectrofotométrico se detectan contaminaciones de la preparación, además de
obtenerse una estimación de la concentración por medio de la relación de la absorbancia a 260 nm. Así, una unidad de A260
indica una concentración de 40 µg/ml de
ARN total. Además, la relación A260/A280
Las muestras de ARN deben ser marcadas
para poder identificar la señal debida a su
abundancia cuando son hibridadas con
las micromatrices. El procedimiento habitual implica la síntesis de ADN complementario a partir de la retrotranscripción,
utilizando como molde las muestras de
ARN y como cebadores, o bien oligonucleótidos de secuencia aleatoria (normalmente una mezcla de hexanucleótidos
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 246
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
246
con todas las combinaciones de cuatro nucleótidos en cada posición), o bien polímeros de timina para obtener ADN complementario de los ARN mensajeros
exclusivamente en el caso de los organismos ecuariotas. En el proceso de retrotranscripción se puede incorporar el fluoróforo si se sustituye parte de un
desoxinucleótido por el desoxinucleótido
unido al fluoróforo. Este es el marcaje directo. El desoxinucleótido marcado usado
habitualmente es dCTP-Cy3 (unido al fluoróforo cianina 3) o dCTP-Cy5 (unido a cianina 5). En las matrices de dos colores, las
dos muestras que van a ser hibridadas
con la misma micromatriz son marcadas
con estos dos fluoróforos, una con uno y
la otra con el otro, para poder diferenciar
la señal de fluorescencia que proviene de
cada una. Los fluoróforos Cy3 y Cy5 (siglas utilizadas frecuentemente para referirse a ellos) no son totalmente equivalentes como marcadores. Ello es debido
en gran parte a que tienen distinto tamaño molecular y en el marcaje directo
no se incorporan con la misma tasa en el
proceso de retrotranscripción. Para evitar
el sesgo en los resultados debido al fluoróforo utilizado, se realiza un intercambio
de los fluoróforos (dye-swap) entre réplicas biológicas de las condiciones. Por
ejemplo, si se comparan dos condiciones
A y B, en una hibridación se marca una
muestra de A con Cy3 y una muestra de
B con Cy5, pero en una segunda hibridación se intercambian los fluoróforos (A
con Cy5 y B con Cy3), idealmente usando
muestras que sean réplicas biológicas de
las primeras. El sesgo debido al distinto
tamaño del fluoróforo se evita haciendo
un marcaje indirecto. En la retrotranscripción, en vez del dCTP unido al fluoróforo
se incorpora aminoalil-dCTP. Este nucleótido modificado puede, en un segundo
paso del marcaje, incorporar el fluoróforo
en la reacción química denominada de
acoplamiento (coupling). Aun usando
marcaje indirecto, se suele recomendar el
intercambio de fluoróforos, porque estos
no tienen las mismas propiedades de fluorescencia.
Reacciones bioquímicas: hibridación y
lavados
El fin último de esta fase es maximizar la
hibridación específica entre las moléculas
diana en solución y las moléculas sonda
fijadas al soporte de la micromatriz. Una
vez marcadas con los fluoróforos las
muestras de las moléculas diana, se diluyen en la solución de hibridación de
composición adecuada y se ponen en
contacto en la superficie de la micromatriz. A continuación se incuba a una temperatura adecuada durante un tiempo determinado para que la cinética de las
reacciones de hibridación permita la máxima señal y la máxima especificidad en
las condiciones de salinidad de la solución
de hibridación y de concentración de las
moléculas diana y sonda.
En la hibridación, además de los anteriores, es necesario cuidar los factores siguientes. Primero, la cantidad de marcaje
que se añade a la hibridación de cada
muestra. Es necesario cuantificar tanto la
cantidad total de fluoróforo incorporado
como la tasa de incorporación en las
muestras marcadas (porcentaje de nucleótidos con fluoróforo). Este control también se realiza espectrofotométricamente
en instrumentos como el NanoDrop™, que
emplea volúmenes mínimos de muestra.
Para evitar la desecación del mínimo vo-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 247
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
247
lumen de hibridación, la micromatriz se
incuba en un compartimento hermético.
Por último, la solución debe repartirse homogéneamente por la superficie de la micromatriz. En el caso de las micromatrices
de portaobjetos, la solución de hibridación se distribuye y se mantiene homogéneamente plana depositando un cubreobjetos sobre el líquido. El conjunto de
ambos cristales se introduce en un estuche estanco. Otros sistemas son, por
ejemplo, el de Agilent, en el que la estanqueidad de la solución se garantiza con
un cristal del mismo tamaño del portaobjetos con una goma toroidal que abarca
el área de la matriz. Cuando se sella con
este cristal la solución de hibridación, se
deja un espacio de aire, una burbuja que
permite la agitación continua de la solución sobre la superficie de la matriz
cuando el conjunto de cristales se introduce en un horno rotatorio. Además, este
sistema permite la hibridación independiente de hasta ocho micromatrices replicadas sobre la superficie de un mismo
portaobjetos, lo que resulta en una mayor
economía, pues el precio del cristal es el
mismo tanto si lleva una única matriz (de
244.000 sondas) como 8 matrices (de
15.000 sondas).
Tras el periodo de incubación, los lavados
se realizan con soluciones salinas con pH
amortiguado de composición semejante
a las utilizadas en las hibridaciones tipo
Southern o Northern. El objetivo es eliminar restos de moléculas diana hibridadas de forma inespecífica o depositadas
sobre la superficie del cristal.
Detección
Las moléculas diana que han quedado
unidas a los elementos de la matriz
portan con ellas los fluoróforos. Para detectar los fluoróforos se utilizan lectores
de fluorescencia especialmente diseñados
para micromatrices. La mayor parte de los
modelos pueden leer micromatrices de
formato portaobjetos; sin embargo, las
micromatrices de Affymetrix requieren el
escáner del propio fabricante. El coste del
escáner constituye la mayor inversión
dentro del equipamiento necesario para
utilizar esta tecnología.
El escáner excita cada fluoróforo utilizando una luz láser de longitud de onda
correspondiente al máximo de absorción
del fluoróforo y recoge la luz de la longitud de onda del máximo de emisión por
medio de filtros. Para detectar la luz emitida, en la mayor parte de los dispositivos
usan tubos fotomultiplicadores. El barrido
de la micromatriz para detectar la fluorescencia emitida por uno u otro fluoróforo
puede hacerse de forma simultánea o secuencialmente. En cualquier caso se obtienen dos archivos de imagen tipo “tiff”,
uno para cada canal.
Análisis e interpretación de los datos
Esta fase final requiere obligatoriamente
el uso de ordenadores y de aplicaciones
bioinformáticas específicas para poder
manejar la gran cantidad de datos que se
generan en el experimento. Esta fase
bioinformática se puede subdividir en una
serie de tareas. La primera consiste en extraer de las imágenes “tiff” la señal de
fluorescencia de cada elemento y la fluorescencia de fondo. Esta cuantificación se
realiza por medio de programas de análisis de imágenes diseñados especialmente
para el tipo y estructura de las imágenes
generadas por el escáner. Lo que se obtiene es un conjunto de valores, tales
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 248
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
248
como el promedio de los valores de los píxeles que están comprendidos por el contorno de cada elemento de la micromatriz, para definir la señal de fluorescencia
bruta, y el promedio de los valores de los
píxeles del entorno de cada elemento
para definir la señal de fondo local.
Ambos valores se aplican a cada elemento
de la matriz y a cada canal.
Los valores de los archivos de cuantificación son normalizados usando programas
específicos. La normalización consiste en
una serie de operaciones con los datos
crudos para eliminar la parte de la variación de los datos que es debida a factores
técnicos y no a la propia biología. Los procedimientos de normalización más empleados asumen que la expresión de la
mayor parte de los genes no cambia entre
condiciones y que los cambios son aproximadamente simétricos, es decir, que la
magnitud del incremento de la expresión
total es igual a la magnitud del descenso
de la expresión. A veces estos requisitos
no se cumplen y es necesario buscar fórmulas alternativas.
Los valores de fluorescencia normalizados
son utilizados para realizar pruebas estadísticas que comparan dos condiciones
para determinar qué genes presentan diferencias significativas en sus valores. Otro
abordaje de los datos implica el agrupamiento de los genes que se comportan de
la misma forma en una serie de condiciones ensayadas, esto es, que tienen el
mismo perfil de transcripción (término
adecuado para resumir los valores de
transcripción especialmente en series temporales). En uno y otro caso se trata de
clasificar los genes según su comportamiento. Otra forma de abordaje consiste
en comprobar qué funciones están afec-
tadas por los cambios transcripcionales y
de qué forma. Dado que estos resultados
del análisis implican conjuntos de valores
numerosos, se hace muy importante el
papel de las representaciones, tanto para
obtener una visión totalizadora de los
cambios observados como para comunicar y presentar los resultados del análisis. El producto final de esta fase sería la
interpretación biológica de los cambios
observados: qué función y explicación
tienen los cambios de expresión, y contestar a la pregunta formulada al inicio del
experimento.
Los resultados del experimento con micromatrices han necesitado de la validación
con pruebas complementarias, por ejemplo, comprobando por PCR cuantitativa los
cambios en los genes más significativos y
representativos. Gracias al aumento de la
calidad y fiabilidad general de los resultados, estos ensayos de validación han devenido menos exigentes, aunque no ha desaparecido su requerimiento totalmente.
Campos de aplicación de las
micromatrices: estudio de la
expresión génica en
organismos modelo
Inaugurada la época de la genómica funcional con la secuenciación completa de
genomas, se ha hecho necesario contar
con herramientas capaces de analizar la
función génica de forma que abarquen
todo el genoma de los organismos. En el
estudio de la expresión de los genes, las
micromatrices han hecho posible este
análisis masivo. Un campo principal de
aplicación ha sido y es la investigación de
organismos modelo con el objetivo de
profundizar en el conocimiento de su bio-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 249
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
249
logía molecular. Los objetivos de estas investigaciones son varios. Uno de los
campos más fructíferos, por la facilidad
del diseño experimental y de la interpretación de los datos, y por lo valioso del conocimiento generado para la explicación
del funcionamiento del organismo, es el
estudio de las redes reguladoras. La comparación entre genotipos de un regulador
transcripcional (silvestre, inactivado, sobreexpresado) permite determinar qué
genes están bajo el control del regulador,
bien sea un activador o un represor. Los
fenómenos biológicos que se desencadenan por sí mismos en el tiempo, tales
como el desarrollo de organismos pluricelulares, procesos de diferenciación, o la
evolución de cultivos, se estudian adecuadamente con series temporales de muestras. El estudio de las respuestas a cambios ambientales, sean nutricionales o
como defensa ante agentes estresantes,
también han ganado en conocimiento
por medio del análisis con micromatrices.
Todos estos estudios transcriptómicos no
han de considerarse aisladamente de otras
técnicas. La integración de los datos transcriptómicos con otros estudios ómicos,
como la proteómica, la metabolómica, la
determinación de sitios de unión en el ADN
de proteínas reguladoras, etc., es un paso
obligado para avanzar en el enfoque de la
biología de sistemas.
Aplicación de las
micromatrices en el campo
de la biomedicina en general
y de las ciencias veterinarias
en particular
Desde el inicio de la tecnología, un campo
de aplicación en el que se depositaron
grandes esperanzas fue el estudio de las
bases moleculares de enfermedades, especialmente del cáncer. La comparación
de tejidos o células sanos con enfermos
ha permitido la identificación de genes
que aumentan o disminuyen la expresión
con la enfermedad. Estos genes indican
qué procesos están alterados por la enfermedad, con lo que se apuntan dianas
para el tratamiento. Además, es posible
identificar con esta metodología biomarcadores que ayuden al diagnóstico y al
pronóstico. Cabe señalar que se han realizado estudios de hasta 40 tipos de
cáncer en humanos con micromatrices de
expresión, y un objetivo que se ha seguido es poder identificar de forma fiable
y rápida el tipo de cáncer. Gracias a esta
técnica se han podido discriminar tipos
que por otras técnicas no es posible.
La industria farmacéutica ha empleado y
emplea con profusión el análisis de expresión con micromatrices en todas las fases
del desarrollo de un nuevo fármaco. Un
primer paso, como se ha comentado
antes, sería la identificación de posibles
dianas terapéuticas. En segundo lugar, el
análisis de expresión, ampliando el número de muestras o utilizando modelos
animales, incluyendo incluso el análisis de
mutaciones, serviría para validar esas
dianas. Una vez elegida la diana o dianas,
el análisis de la expresión ayuda en el rastreo de sustancias activas, al identificar
cambios en la diana terapéutica tras la administración de tales fármacos potenciales. Por lo mismo, puede aplicarse para
elegir la sustancia más activa y para anticipar efectos adversos usando modelos
animales o líneas celulares. En la fase de
ensayos clínicos, el análisis de la expresión
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 250
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
250
génica sirve para monitorizar la efectividad y la toxicidad.
puesta inmune y también ha sido aplicada
para la evaluación de la toxicidad.
La identificación de biomarcadores que
permitan el diagnóstico, incluso de variedades de una misma enfermedad, es un
campo con un gran interés, como se ha
indicado anteriormente. Asimismo, los
biomarcadores pueden servir para predecir la eficacia de un tratamiento. Las micromatrices permiten el análisis de expresión para identificar tales biomarcadores,
pero también se emplean para el análisis
de genotipos mediante la comparación de
muestras de ADN en vez de ARN. En el
campo de la biomedicina, el estudio de
los genotipos asociados con enfermedades sirve, además de para identificar el
origen genético, para evaluar el riesgo de
padecer una enfermedad.
En el área de la farmacogenómica, la tecnología de micromatrices ha dado el salto
de la investigación básica a un producto
comercial, desarrollado por la farmacéutica Roche. El denominado AmpliChip
CYP450® sirve para determinar cuál de las
90 variantes del gen CYP2D6 y cuál de las
tres variantes de CYP2C19 presenta un
determinado paciente. Las variantes de
estos genes determinan la capacidad de
eliminación de fármacos y, por tanto, el
conocimiento derivado de la prueba permite establecer la dosis personalizada más
adecuada. Recientemente, las autoridades
europeas han aprobado el uso de la instrumentación de Affymetrix (GCS 3000Dx)
para realizar los ensayos con esta micromatriz, con lo que se abre la puerta a la
generalización de este tipo de pruebas.
En la lucha contra las enfermedades infecciosas, el estudio de los agentes infecciosos encuentra un gran campo de aplicación en el análisis con micromatrices.
Numerosos trabajos de investigación se
han centrado en determinar qué genes se
expresan en el patógeno durante la infección, para diferenciarlos de genes implicados en un modo de vida libre, o bien
genes que se expresen durante determinadas fases de su ciclo vital. Un objetivo
práctico es, de nuevo, establecer dianas
para el combate farmacológico del patógeno. Además, permiten el análisis de los
procesos de interacción con el hospedador. Otro campo de aplicación es la detección de patógenos por medio del análisis del ADN extraído. Esta aplicación es
especialmente útil en la identificación de
virus pues evita su complicado cultivo. En
el desarrollo y evaluación de vacunas, la
técnica sirve para la evaluación de la res-
En el campo de la biomedicina, especialmente en lo que concierne a la salud humana, la cantidad de datos generados en
numerosos ensayos hace que se necesite
contar con bases de datos públicas (GEO
y ArrayExpress) en las que los investigadores puedan consultar y reinterpretar los
resultados de otros laboratorios a la luz
de los nuevos conocimientos. La disponibilidad de los datos crudos, convenientemente anotados, también permite que se
puedan realizar estudios que combinen
experimentos realizados independientemente en distintos laboratorios y que al
ser analizados conjuntamente revelen
nuevos resultados. Para que estos metaanálisis den el mayor fruto es necesario
que los datos depositados hayan sido generados con procedimientos robustos. El
esfuerzo más importante para promover
la generalización de la calidad en el pro-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 251
Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices
251
cedimiento experimental es el Microarray
Quality Control Project (Shi y col., 2008).
La tecnología de micromatrices promete
aportar la potencia de generación de
datos y conocimiento en las siguientes
aplicaciones específicamente veterinarias:
el estudio de las bases fisiológicas de la
producción animal se beneficia, por
ejemplo, del análisis de la expresión génica en músculo, comparando los patrones de expresión de razas con distinta
calidad de carne, para averiguar qué
genes o rutas metabólicas favorecen o determinan unas u otras cualidades. Por otra
parte, lo que sería un enfoque nutrigenómico, el conocimiento sobre el efecto en
la expresión génica de la dieta y de los suplementos alimenticios, ayudará a diseñar
dietas y piensos más sanos o productivos.
En sanidad animal, además del estudio de
los patógenos, las micromatrices sirven
para determinar los genotipos más resistentes a enfermedades. Bien con el análisis genotípico, proteómico o de expresión
génica, la determinación de biomarcadores útiles para la selección promete acelerar la obtención de razas y variedades
con características mejoradas. Como
ejemplo de las posibilidades que se abren,
cabe citar aquí que la empresa Affymetrix
ofrece ya micromatrices de última generación para el análisis genotípico bovino,
la denominada Axiom® Genome-Wide
BOS 1 Array. Es de desear que este tipo
de estudios se extienda para obtener el
máximo beneficio de una tecnología tan
potente y que hoy en día ya está madura
y accesible a muchos laboratorios.
Bibliografía recomendada
Dyson FJ. The sun, the genome and the
Internet: tools of scientific revolutions. New
York (USA): Oxford University Press, 2001.
Fodor SP, Rava RP, Huang XC, Pease AC,
Holmes CP, Adams CL. Multiplexed biochemical assays with biological chips. Nature
1993; 364:555-6.
Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu
AT, Solas D. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science
1991; 251:767-73.
Lashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath
AF, Gentile C, Hwang SY, Brown PO, Davis
RW. Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis.
Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:13.057-62.
Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie
MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang
C, Kobayashi M, Horton H, Brown EL.
Expression monitoring by hybridization to
high-density oligonucleotide arrays. Nat
Biotechnol 1996; 14:1.675-80.
Russell S, Meadows LA, Russell RR. Microarray
Technology in Practice. San Diego, EE.UU.:
Academic Press, 2009.
Schena M. Microarray Analysis. New Jersey,
EE.UU.: Wiley, 2003.
Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO.
Quantitative monitoring of gene expression
patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270:467-70.
Shi L, Perkins RG, Fang H, Tong W. Reproducible
and reliable microarray results through quality
control: good laboratory proficiency and appropriate data analysis practices are essential. Curr
Opin Biotechnol 2008; 19:10-8.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 252
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 253
Sanidad animal y biotecnología
Dr. Elías F. Rodríguez Ferri (1)
Introducción
Antecedentes
El escalado progresivo de la población
humana, que, según previsiones realizadas recientemente, puede alcanzar los
9.500 millones para el 2050 (2), supone
un incremento espectacular, de más del
50% si se compara con los valores del
2000 (6.000 millones) o de 6 veces más
de la población existente en 1900 (1.600
millones) (3). Los últimos cálculos apuntan
a la duplicación de la población humana
cada 30 años, lo que arroja valores más
que preocupantes, con multitud de problemas asociados, comenzando por la necesidad de abastecimiento de agua y alimentos.
Por otra parte, la importancia creciente de
los alimentos de origen animal en la dieta
humana es un hecho constatado. A nivel
mundial, en el periodo 1983-93, pasaron
de 14 a 21 kg de carne per cápita y de 35
a 40 kg en el caso de la leche, siendo el
cambio especialmente importante en los
países en desarrollo. Puede afirmarse que
la demanda y consumo relativos de productos de origen animal crece a mayor velocidad que lo que sucede con otro tipo
de alimentos, como, por ejemplo, los cereales, y todo dentro de un contexto previsible de crecimiento progresivo exponencial de la población humana, para
satisfacer su demanda de abastecimiento.
Para satisfacer esta demanda, en 2009 se
produjeron en el mundo un total de 61,8
Figura 1. Población mundial. Proyección a 2050
(http://snus-news.blogspot.com/2010/09/developing-world-lifestyle-related.html).
millones (M) de Tm de carne de bovino y
13 M de Tm de carne de ovejas y cabras
(4); a los que se suman 106,1 M de Tm de
carne de cerdo y 79,6 de carne de pollo.
La producción de leche, por su parte, ascendió a 696,5 M de Tm y la de huevos a
67,4 M de Tm. El conjunto de capturas de
pescado, crustáceos, moluscos, cefalópodos, etc., ascendió en 2008 a 142,2 M
de Tm. Los censos mundiales de ganado
bovino y búfalos ascendieron en 2009 a
1.570,547 M de cabezas y los de ovejas y
cabras (conjuntamente) a 1.939,243 M,
siendo los de cerdos de 941,213 M de cabezas y los de pollos de 18.555 M.
Sin duda, son tan espectaculares las cifras
anteriores que resulta difícil pensar que
sean insuficientes, pero los cálculos más
optimistas contemplan la necesidad de
multiplicar los efectivos para abastecer las
necesidades que impone la demanda. En
cualquier caso, los cambios no supondrán, simplemente, un incremento (necesario) de los censos, sino toda una serie
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 254
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
254
de modificaciones en estructuras e infraestructuras que van desde las que afectan
a la producción de alimentos-pienso para
la alimentación de los animales a la transformación de la tierra, etc. Resulta muy
difícil llevar a cabo este tipo de previsiones-estimaciones, pero no hay duda de
que ocuparán a nuestros hijos de forma
preferente en las próximas décadas.
rros policía, perros utilizados en la búsqueda de supervivientes en los desastres
naturales, perros lazarillo, etc.
Pecaríamos de muy incompletos e imparciales si la representación de los animales
en relación con el ser humano quedara reducida a la simple y única presencia de
una fuente de alimento de primera necesidad y de calidad. Los animales forman
con el hombre un todo indivisible y complementario, ocupando el supernicho
ecológico que representa la Tierra, con interacciones necesarias e imprescindibles.
Los animales que viven en libertad, los
animales salvajes de todos los órdenes,
mamíferos y aves, vertebrados e invertebrados, terrestres y acuáticos, constituyen
el mayor activo de este planeta y mantienen con la tierra o el agua que les sustenta, con el hombre y su espacio vital, un
equilibrio consecuencia de la evolución
iniciada en el mismo momento en que el
reloj de la Tierra comenzó su andadura,
ahora hace ya más de 4.000 millones de
años. A estas utilidades de los animales
para el hombre, tan simples en apariencia,
pero tan necesarias, se suma una larga
lista de otros apoyos que van, desde su
uso como elementos de compañía o de
ocio humanos a su utilidad en la experimentación, como modelos animales para
la ciencia médica, o su uso como motores
de trabajo aún en amplias zonas del
mundo, como parte elemental de terapias
asistidas, etc., o simplemente como colaboradores de la sociedad actual como pe-
Veterinaria. Medicina Veterinaria y
ciencias veterinarias
Este panorama obliga de forma, siquiera
interesada, a conocer todo cuanto afecta
de forma positiva y negativa a su existencia, que de forma directa o indirectamente condicionan la vida humana.
A lo largo del siglo XX se ha producido una
interesante transición de la tradicional Medicina Veterinaria a lo que podríamos denominar Ciencias Veterinarias, denominación a la que con frecuencia se acude para
dar idea de la extensión de funciones de la
Veterinaria actual, que forma parte de un
mundo muy complejo, con interconexiones
de todo tipo, culturales, económicas y sociales, y, naturalmente, profesionales. La
Veterinaria actual cumple funciones muy
relevantes para la sociedad, todas ellas claramente interrelacionadas: Sanidad Animal
y Salud Pública, Biomedicina, Producción
Animal, Seguridad y Tecnología de la
Producción Alimentaria y Bienestar Animal
y Medio Ambiente.
Para hacer frente a este complicado panorama de actividades y servicios, actualmente muy atomizados, se precisa que el
veterinario adquiera capacidades nuevas
dotándose de una mentalidad que le permita conseguir el éxito en todos estos cometidos. Algunos expertos (5) han señalado la necesidad de vertebrar todas estas
actividades en torno a un eje central que
constituya el punto de apoyo necesario,
proponiendo para ello el concepto “un
solo mundo de medicina veterinaria” con
el que pretenden que el veterinario “co-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 255
Sanidad animal y biotecnología
255
necte”, “se interconexione” con su entorno vital, comprenda el alcance de sus
“habilidades” y de las obligaciones que la
sociedad le impone, y obtenga la identidad que necesita a los ojos del mundo.
ella, el carbunco bacteridiano o la tuberculosis (humana y bovina) lo estuvieron en
el origen del conocimiento de la etiología
microbiana de las enfermedades infecciosas (7).
Sanidad Animal
Un Mundo, una Medicina, una Salud
La Sanidad Animal se ocupa del estudio
de los procesos infecciosos que afectan a
la salud de los animales, incluyendo sus
causas (microorganismos y parásitos), sus
consecuencias (la enfermedad), así como
los procedimientos relacionados con su
prevención, control y erradicación (epidemiología, diagnóstico, terapia, bioseguridad, vacunaciones, medidas relacionadas con las relaciones comerciales entre
países, etc.).
Ha sido, precisamente, la interfaz entre la
Sanidad Animal y la Salud Pública, con
ocasión de la emergencia de la gripe aviar
por el virus influenza H5N1 y el riesgo de
pandemia, lo que ha hecho renacer antiguas propuestas que en la actualidad
están siendo defendidas con pasión por
algunos sectores, tanto de la Medicina
Humana como Veterinaria. Nos referimos,
claro está, a la corriente que demanda la
integración de la Medicina Humana y la
Veterinaria, de la Salud Pública y la
Sanidad Animal, para ser más precisos, en
particular en lo que se refiere a las enfermedades emergentes, especialmente zoonosis emergentes, bajo el mensaje “Un
Mundo, una Salud”, inicialmente, “Un
Mundo, una Medicina, una Salud”.
Antes del nacimiento de la Microbiología,
la Sanidad Animal formaba parte de la
Medicina Veterinaria integral, empíricamente. Igual que el animal representa un
todo que constituye a la vez medio de
transporte, fuente de alimento, vestido,
combustible, recreo y compañía, la dedicación a la prevención y curación de las
enfermedades infecciosas de los animales
carece de conocimientos acerca de su etiología y de instrumentos y métodos para
poder controlarla. A finales del siglo XIX,
los avances conseguidos a partir de los
trabajos de Pasteur y Koch y sus respectivas escuelas acerca de la etiología microbiana de las enfermedades infecciosas,
igual que el papel de los microorganismos
en otras responsabilidades (producción y
alteración de los alimentos, etc.), permiten entender la presencia de vínculos
entre la Sanidad Animal y la Salud Humana (Salud Pública), lo que facilita, igualmente, abordar la Medicina Comparada
y la investigación biomédica. Igual que
La emergencia y reemergencia de enfermedades infecciosas con potencial pandémico están teniendo lugar desde el pasado
siglo, con una alarmante regularidad, y
una gran mayoría de las mismas son zoonosis. De hecho, de los más de 1.400 patógenos humanos reconocidos, el 61,6%
son de origen animal, son zoonósicos (8).
Como término medio, desde la Segunda
Guerra Mundial, cada año ha emergido o
reemergido una enfermedad nueva y el
76% de ellas son zoonosis (9). Jones et al.
(2008) (10) han señalado recientemente
en un estudio llevado a cabo sobre 335
enfermedades infecciosas emergentes
descritas en los EE.UU. entre 1940 y
2004, que el 60% de las mismas fueron
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:05
Página 256
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
256
Figura 2. Zoonosis emergentes (AVMA, 2008) (11).
zoonosis y que más del 70% de ellas correspondían a fauna salvaje. Como se ve,
todos los datos apuntan en la dirección
de una gran importancia relativa de las
zoonosis en las enfermedades emergentes que afectan al hombre, al menos
a lo largo de todo el siglo pasado y la situación se mantiene en el presente.
Los factores que dirigen la emergencia de
las enfermedades infecciosas, incluidas las
zoonosis emergentes, pueden agruparse
entre aquellos que se suceden en el entorno humano, los que lo hacen en el sistema agroganadero y de producción de
alimentos y, finalmente, los que tienen
lugar en los ecosistemas naturales. Los
primeros son, sin duda, muy numerosos
e incluyen los cambios en la demanda de
alimentos, la urbanización, el aumento de
la densidad y concentración de la población humana y/o animal, la proximidad de
humanos y animales, los cambios demográficos, el incremento de la movilidad,
las tasas de pobreza y el deterioro de los
servicios de salud pública y servicios veterinarios. En relación con los segundos
deben considerarse, por su parte, los
censos ganaderos y la concentración espacial de explotaciones animales, la ausencia de sistemas de bioseguridad, el incremento en el comercio de animales
vivos y de productos de origen animal, la
vacunación inapropiada o el uso indebido
de fármacos, sobre todo antibióticos, o los
sistemas de explotación intensiva. Por último, en lo que se refiere a la influencia de
los ecosistemas naturales, deben considerarse también el efecto de la invasión humana en territorios salvajes y el uso indebido de la tierra, incluyendo las prácticas
de deforestación, la caza furtiva incontrolada, el comercio de animales exóticos o
el comercio clandestino de animales vivos
y el consumo de carne procedente de animales salvajes, todo lo cual condiciona e
influye en la fragmentación del hábitat,
pérdida de biodiversidad y cambio climático. A estos factores deben sumarse también los dependientes de los propios
agentes patógenos y su evolución y adaptación particular, dependiente de su naturaleza (principalmente virus, pero también
bacterias, protozoos, hongos o priones),
sobre la que influyen muchas de las variables enunciadas antes y otras propias.
Tanto la vigilancia (detección y diagnóstico), como el control de las enfermedades zoonósicas emergentes han sido y
son, actualmente, cuestiones de gran
complejidad, en las que cuentan, y no
Figura 3. La interfaz entre el hombre y los animales
y sus consecuencias en la aparición de enfermedades emergentes (12).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 257
Sanidad animal y biotecnología
257
poco, problemas de comunicación y consulta entre las autoridades e instituciones
de Salud Pública y de Veterinaria. Hoy se
sabe bien que estos canales de comunicación deben establecerse con claridad y
mejorarse, para incluir los animales salvajes y los ecosistemas.
Tanto los hábitats naturales como el
medio ambiente que está manejado por
humanos, como ocurre con los sistemas
y las cadenas de producción de alimentos,
constituyen hábitats en los que pueden
emerger, circular, cambiar su dinámica de
presentación, e incluso cambiar de especie hospedadora, los agentes patógenos productores de enfermedades infecciosas (de los animales y del hombre).
El reconocimiento de la interrelación de
los respectivos dominio de Salud y los
riesgos que representan las zoonosis (especialmente para el hombre), demanda
una interacción más horizontal entre
Sanidad Animal y Salud Pública, o lo que
es lo mismo, entre todos los sectores que
poseen responsabilidades y competencias
sobre ellas (instituciones, departamentos,
ministerios y profesiones), incluyendo la
Medicina Humana y la Veterinaria. Esta es
la idea de “Una Salud”, que se viene reclamando desde muchos sectores como
una necesidad ya desde 2003, con ocasión de la emergencia de la influenza aviar
altamente patógena, o gripe aviar, en el
sudeste asiático. Desde aquella fecha, la
detección, prevención y control de la
gripe aviar ha sido una especie de cruzada, con atención al más alto nivel internacional, que ha propiciado reuniones a
nivel ministerial en Beijing y Bamako en
2006, en Nueva Delhi en 2007, en Sharm
el-Sheikh en 2008 y una consulta sobre
Salud en Winnipeg en 2009. Nunca antes
había sucedido nada parecido; de todo
ello ha surgido el “Global Program on
Aviar Influenza” (GPAI), que, aunque no
cumpla con todas las aspiraciones con las
que fue diseñado, ha establecido un precedente significativo para el control de las
enfermedades emergentes, cuyo progreso
y desarrollo futuro corresponde tanto a
las organizaciones internacionales como
a las instituciones nacionales. La tarea implica la detección, identificación, predicción, prevención y control de las enfermedades infecciosas emergentes, incluyendo
en ellas a las que se ocupan de la fauna
salvaje y el medio ambiente.
Figura 4. Iniciativa “Una Salud”. http://www.onehealthinitiative.com/.
La iniciativa “Una Salud”, que representa
el reconocimiento de las interconexiones
entre la salud humana, animal y ecológica
(ambiental), busca incrementar la comunicación, colaboración y cooperación a
través de un amplio número de disciplinas
que incluyen la Medicina Humana y
Veterinaria, la Salud Pública, la Microbiología, la Parasitología, la Inmunología, la
Ecología, la Epidemiología y otras. Puede
definirse como “una estrategia mundial
para ampliar las colaboraciones y comunicaciones interdisciplinarias en todos los
aspectos de la salud referidos al hombre,
los animales y el ambiente” (13). “Una
Salud” representa una ocasión extraordinaria de convergencia y sinergia en el ámbito de las enfermedades infecciosas,
principalmente emergentes, entre las
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 258
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
258
oportunidades de los países industrializados y los países en desarrollo (14).
y Etimologías) que han sido referidos por
Cordero (1987).
En la mitología griega ya se hace referencia a la figura del centauro Quirón, al
que se refiere Lucio Moderato Columela
(4-70 d.C.) en su obra De re rustica, que
además de maestro prudente, juicioso y
sabio, era músico, y conocía las artes de
la curación con las que aliviaba el sufrimiento de humanos y animales. Era, pues,
un claro precedente del médico y veterinario actuales. Como señala Cordero
(1987) (15), Quirón representa el símbolo
de la unidad, pues no solo actuó como
médico, veterinario y naturalista, sino que
compartió su sabiduría con numerosos
discípulos, incluidos Asclepio (Esculapio)
en Medicina (considerado el padre de la
Medicina) y Melampo, en Veterinaria.
La Historia, por su parte, se encarga de
unir la Medicina Humana y la Veterinaria
en alguno de los acontecimientos más
notables que sucedieron en el pasado,
como el que se refiere al que fuera uno
de los más grandes azotes del ganado
bovino a lo largo de los años, la peste bovina, la segunda enfermedad infecciosa
que se ha declarado extinguida, después
de la viruela, merced a los beneficios de
la vacunación.
Las Facultades de Veterinaria en España y,
en otros lugares, han elegido el simbolismo de su figura (“el primer médico de
animales”) para representarlas. El excelente vitral que figura en el vestíbulo de
la Facultad de Veterinaria de León, obra
del artista leonés D. Luis García Zurdo, representa al centauro Quirón, y la recién
nacida Academia de Ciencias Veterinarias
de Castilla y León ha adoptado esta figura
como parte de su emblema. La figura de
Quirón se acompaña, en la vidriera, de
textos de Virgilio y San Isidoro (Geórgicas
Giovanni Maria Lancisi (1654-1720) (16)
que fue médico personal de varios Papas,
anatomista y epidemiólogo, es reconocido
como un precursor del concepto de “Una
Medicina, una Salud” cuando fue encargado por Clemente XI para llevar a cabo
un estudio sobre la enfermedad, con el
propósito de su control. Publicó De bovilla
peste (1715), en la que describe la enfermedad y propone medidas para su control; la más relevante de todas, la que hoy
conocemos como stamping out, consistente en el sacrificio y destrucción de los
animales sospechosos (vaciado sanitario)
alrededor del foco de infección, proporcionando instrucciones precisas acerca del
enterramiento de los animales sacrificados, de la prohibición del movimiento
de los animales y de la adopción de me-
Figura 5. Vidriera de Quirón en la Facultad de Veterinaria de León. Autor: Luis García Zurdo.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 259
Sanidad animal y biotecnología
259
didas higiénicas y políticas pertinentes,
principios que fueron aplicados posteriormente (aún hoy lo siguen siendo) a otras
muchas enfermedades en los programas
de control y erradicación. Aunque la peste
bovina no es una zoonosis, su repercusión
sobre la Salud Pública es evidente, al ser
causa de hambre y desolación económica,
reiteradamente descrita y temida. No en
vano fue esta enfermedad una de las razones que justificaron, como ya hemos
señalado, (ver notas 6 y 7, al final), la creación de las primeras escuelas de
Veterinaria, igual que de la Organización
Mundial de la Sanidad Animal (OIE).
A comienzos del siglo XVIII, E. Jenner, el
primer inmunólogo, realizó la primera vacunación de la que se tiene noticia, inoculando virus de la viruela de las vacas al
niño James Phipps, protegiéndole del
virus humano. Más recientemente, Rudolf
Virchow (1821-1902), un médico y patólogo alemán, considerado el padre de la
Medicina Moderna, llegó a afirmar que
“entre la Medicina Humana y Animal, no
deberían existir líneas divisorias”. Virchow,
que era hijo de un carnicero, fue el primero en utilizar el término “zoonosis” en
sus estudios sobre triquinosis, describiendo el ciclo de Trichinella spiralis en el
tejido muscular del cerdo.
En 1964, Calvin Schwabe, considerado el
fundador de la Epidemiología Veterinaria,
acuñó el término “Una Medicina” para
expresar la interrelación existente entre la
salud humana y la animal y las realidades
necesarias para la prevención de las zoonosis. “Una Medicina” significaba el reconocimiento de los riesgos que las zoonosis representan para el ser humano, sus
necesidades alimentarias y su economía.
Reconocidas las interrelaciones de la salud
del hombre, de los animales y del ecosistema, la forma más racional de coordinar
las políticas y la acción entre las instituciones responsables de Salud Pública,
ciencia médica y servicios veterinarios conduce a la definición del mensaje “Una
Salud”, al que aquí nos referimos.
En 1975, la FAO, la OIE y la OMS editaron
un informe conjunto titulado “La contribución de la Veterinaria a la práctica de la
Salud Pública” (The Veterinary Contribution to Public Health Practice), que estableció el concepto de Salud Pública
Veterinaria (también se ha referido como
Veterinaria de Salud Pública) como un área
de cooperación entre las tres organizaciones que puede considerarse el embrión
de lo que, años más tarde, se convertiría
en la plataforma para respuesta internacional frente a la peste aviar. El concepto
de “Una Salud” fue ampliado después incorporando la salud de los ecosistemas
además de la del hombre, animales domésticos y animales salvajes. El mismo
Cordero (1987), referido antes, se manifiesta a favor de la unidad de la ciencia y,
como tal, de la existencia de una única
Medicina, “una ciencia y arte de curar,
cualquiera que sea el ser vivo al que se
aplique”. En 2004, la Sociedad Mundial de
Conservación (World Conservation Society)
celebró en la Universidad Rockfeller un simposio titulado “Un Mundo, una Salud”.
Todas las especies de animales, incluyendo el hombre, y las plantas, los
hongos, protozoos y bacterias, en definitiva, todas las formas de vida que pueblan
la Tierra (excepción hecha de los virus que
son parásitos absolutos, dependientes de
otras formas de vida), comparten principios básicos de metabolismo, reproducción y desarrollo. La mayoría de los
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 260
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
260
agentes patógenos pueden infectar más
de una especie hospedadora y solo unos
pocos se restringen a una, aunque este
no sea un hecho definitivo, ni permanente, pues constantemente se producen
cambios o saltos de la “barrera de especie” que hacen que agentes conocidos
aparezcan (emerjan) como nuevos en una
especie hospedadora diferente.
El hombre siempre ha estado sometido al
riesgo de contraer enfermedades infecciosas, desde su época de cazador a la
época en la que se asienta y se convierte
en agricultor y ganadero. Es más, la domesticación y cría de los animales para su
beneficio (producción de alimentos, ropa
y trabajo) supone un evidente incremento
del riesgo, relacionado con la proximidad,
más estrecha de aquellos y este. La persistencia de enfermedades emergentes de
origen zoonósico ha sido especialmente
subrayada en el siglo XX sobre numerosas
enfermedades de los animales, como la
rabia, la brucelosis, la tuberculosis o el
carbunco bacteridiano. El último tercio se
caracterizó por la emergencia de enfermedades víricas, destacando sobre todas
ellas el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (sida) y, mas recientemente, el
síndrome respiratorio agudo grave (SARS),
encefalopatía espongiforme bovina (EEB)
y, principalmente, la influenza o gripe
aviar y su potencial riesgo de pandemia
por el virus influenza H5N1.
Estas enfermedades unen, a su interés sanitario, un no menos importante interés
económico, calculado tanto en función de
los costes directos como indirectos y en
conjunto. Se ha calculado, por ejemplo,
que la emergencia de la EEB, el SARS, la
gripe aviar por H5N1 y la influenza por
H1N1 han supuesto pérdidas económicas
directas (pérdidas derivadas de costes por
servicios de Salud Pública y Sanidad
Animal, indemnizaciones por pérdidas de
animales o pérdidas en producciones) de
más de 20.000 millones de dólares en los
últimos años, a lo que se suman no
menos de 200.000 millones de dólares de
pérdidas indirectas (pérdidas en otras
partes de la cadena de producción alimentaria, comercio, turismo, etc.). Solo
en el Reino Unido, entre 1990 y 2008, las
pérdidas económicas debidas a la EEB sumaron más de 7.000 millones de dólares
y la influenza aviar, en el sudeste asiático,
fue causa de más de 10.000 millones de
dólares de pérdidas en el sector ganadero.
Si la influenza aviar se resolviera en la temida pandemia de gripe (lo que todavía
no se ha descartado), las pérdidas alcanzarían los 2 billones de dólares (17).
Todavía, al lado de las enfermedades infecciosas emergentes, hay que contar con
otras enfermedades, las denominadas
“enfermedades desatendidas”, como la
rabia, la tuberculosis bovina, la brucelosis
o diferentes enfermedades parasitarias
que suponen cargas significativas para la
salud, la mayoría de las cuales tienen una
gran importancia en los países más pobres. Cada año fallecen en el mundo más
de 55.000 seres humanos como consecuencia de la rabia, de los que el 95% o
más de los casos tienen lugar en Asia y
África. De tuberculosis se cuentan casi 2
millones, de los que hasta el 8% de los
mismos son de origen bovino (18) (no
siendo este el único origen animal). La
lista podría continuar con infecciones o
toxiinfecciones transmitidas por alimentos, principalmente salmonelosis,
campilobacteriosis, infecciones entéricas
o extraintestinales por E. coli y otras,
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 261
Sanidad animal y biotecnología
261
cuyos costes alcanzan valores extraordinarios, computando tratamientos, hospitalizaciones, fallecimientos y secuelas. Por
ejemplo, un reciente informe del Banco
Mundial relativo a los costes directos e indirectos por enfermedades transmitidas
por alimentos en Vietnam daba la cifra de
1.000 millones de dólares al año (19), y
eso que unánimemente se admite una subestimación de las cifras.
Pese al progreso científico, existe una amplia variedad de factores que facilitan y
justifican el incremento actual de la incidencia de las enfermedades emergentes.
Debe considerarse, por ejemplo, la explotación intensiva y la concentración de los
animales, la presión de los sistemas de
producción de alimentos, el incremento
mundial de los viajes y el comercio, en general, que afecta al hombre, los animales
y los productos de origen animal, todo lo
cual ha permitido la evolución de los
agentes patógenos que al final produce
una creciente y variada gama de riesgos.
En cualquier caso, las fuentes de infección
en las enfermedades zoonósicas no se limitan al hombre y los animales domésticos, sino que también se extienden a la
fauna salvaje, que representa, además,
uno de los puntos principales. Los ecosistemas salvajes se caracterizan por un ajustado equilibrio dinámico entre todos sus
componentes, que incluyen flujos de materia orgánica y energía, y de organismos
vivos. Mientras que los agentes patógenos son una parte muy importante de
este balance, la previsión de su exceso
está compensada con circuitos negativos,
como los que inducen más resistencia en
los hospedadores. Conceptualmente
existen dos tipos de factores que pueden
desestabilizar los ecosistemas salvajes y su
papel en la salud global: por un lado, su
destrucción y fragmentación, como sucede por ejemplo en el caso de la deforestación, que rompe el equilibrio entre
las diferentes especies y que puede hacer
que una en particular se convierta en dominante. Por otro lado, también se puede
desestabilizar el sistema como resultado
de la interacción de los ecosistemas con
el hombre, pues de ello pueden derivarse
más oportunidades para el intercambio de
patógenos, incluyendo la transmisión a individuos “vírgenes” o sin protección. Las
explotaciones animales en las zonas tropicales, el consumo de carne de animales
salvajes o el ecoturismo son ejemplos de
tipos de interacciones que pueden crear
oportunidades para que los agentes patógenos ejecuten “saltos” de la barrera
de especie. En la práctica, ambos factores
pueden solaparse y facilitar la aparición o
emergencia de agentes patógenos “aparentemente nuevos” en ecosistemas de
nuevo origen.
Uno de los factores más importantes en el
control de cualquier enfermedad emergente es su detección precoz, así como el
conocimiento de su epidemiología. Ambos
elementos permitirán a los organismos
competentes organizar y ejecutar las medidas que correspondan en relación con
el control de la enfermedad, actuando
sobre la fuente de infección, reduciendo
su difusión y previniendo la progresión a
una forma endémica. Cualquier retraso o
error en las primeras fases tiene consecuencias sobre las siguientes. Puede existir, por ejemplo, falta o disponibilidad de
recursos inapropiados o faltos de sensibilidad o especificidad, que conducen a fallos diagnósticos, pero también pueden
deberse a fallos en la propia capacidad
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 262
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
262
humana o técnico-administrativa, lo que
con frecuencia se observa en países en
desarrollo, con estructuras burocráticas
complejas o deficientes. Estos problemas,
a la postre, impiden la efectividad de los
recursos económicos, cuando existen, o
hacen que los disponibles resulten las más
de las veces insuficientes. Pero muchos de
estos problemas no solo suceden en los
países en desarrollo sino también en el
mundo desarrollado, por el cruce de competencias entre profesiones, celos corporativos y mala organización, que en el
pasado ha dado múltiples pruebas negativas, y todo lo contrario de lo que se ha
aprendido sustancialmente desde los
graves acontecimientos de la epidemia de
gripe aviar por el virus influenza H5N1. El
GPAI, al que antes se hizo alusión, puso
de manifiesto las ventajas que se derivan
de una actuación conjunta, coordinada y
colaboradora entre los servicios veterinarios y los de salud pública, que han sido
definidas en dos niveles distintos: por un
lado, el establecimiento de canales de comunicación, informativos, acerca de la
aparición de brotes, entre los organismos
de competencia en Salud Pública y
Sanidad Animal, y por otro lado, una coordinación necesaria.
Apostar por “Una Salud” supone intervenir en numerosos planos profesionales,
incluyendo los curricula formativos, en los
que se debe incidir más en aspectos que
se traducen en ventajas para el objetivo
final de controlar o erradicar las zoonosis
emergentes y las enfermedades emergentes en general. Énfasis especial debe
hacerse en el conocimiento epidemiológico de estas enfermedades y su repercusión en los ecosistemas humano y animales, pero también en los estudios
etiológicos y patogénicos, en el desarrollo
de métodos de diagnóstico rápidos y precisos que permitan el establecimiento de
un sistema de vigilancia muy sensible y
eficaz, igual que en la aplicación de las
nuevas y modernas tecnologías al desarrollo de procedimientos eficaces para su
control, incluyendo medidas sanitarias y
preventivas, en particular la disponibilidad
de vacunas.
Los compromisos de la Sanidad
Animal
L. King (2009) señala como competencias
fundamentales de la Sanidad Animal y
Salud Pública, en los que está comprometida la profesión Veterinaria, las siguientes:
1) inocuidad y seguridad alimentaria; 2)
resistencia a los antimicrobianos; 3) degradación ambiental y sostenibilidad; 4)
aumento de la huella ecológica del carbono e ingente consumo energético de
los sistemas de producción animal; 5) vulnerabilidad de los animales por la intensificación de los sistemas productivos; 6)
movimientos de animales exóticos y sus
derivados; 7) bioterrorismo y agroterrorismo; 8) intervención de la fauna salvaje
en la transmisión de enfermedades; 9) enfermedades transmitidas por los alimentos, el agua o por vectores; 10) aparición y reaparición de nuevas zoonosis
(emergentes y reemergentes); 11) aparición y reaparición de nuevas enfermedades de los animales (emergentes y reemergentes), y 12) comercio mundial de
alimentos y animales.
Es verdad que esas tareas recogen mayoritariamente los campos en los que la proyección sanitaria de la Veterinaria actual
está actuando, o debe estarlo, más o
menos. Desde un punto de vista acadé-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 263
Sanidad animal y biotecnología
263
mico, preferimos establecer los objetivos
de la Sanidad Animal en dos grandes
grupos, que podríamos denominar objetivos generales y objetivos concretos, respectivamente.
El objetivo general más simple no puede
ser otro que lograr la erradicación de las
enfermedades infecciosas de los animales,
en todas sus aptitudes y opciones posibles
(domésticos, de compañía, salvajes, etc.),
incluyendo las que son transmisibles al
hombre. Como puede fácilmente comprenderse, lograr esto es, simplemente,
una utopía y como tal debe entenderse.
No obstante, igual que el deber del médico es eliminar la enfermedad humana,
el del veterinario debe ser hacer lo propio
con las que afectan a los animales, tarea
todavía mucho más ardua, habida cuenta
de la multitud de especies que sería preciso considerar, sin descartar ninguna. Por
esta razón, la Sanidad Animal se plantea
otras alternativas de mayor concreción,
compatibles con la idea final de lo posible,
haciendo uso de los instrumentos que la
ciencia y la técnica ponen a su alcance.
Enfermedades infecciosas de los animales,
Sanidad Animal en suma, supone considerar, en la práctica, un alto número de
variables para tratar siquiera de definir
groseramente su alcance; distintas especies animales, diferentes agentes patógenos causales, intereses prioritarios (por
ejemplo, producción de alimentos, comercio, Salud Pública), relaciones con la
ecología, el medio ambiente, la conservación y la biodiversidad, disponibilidad de
infraestructura y recursos, etc., que en
cada caso marcan las actuaciones de las
autoridades responsables, pero cuya complejidad puede incrementarse hasta el infinito.
Los desafíos o los retos que supone intentar conseguir el objetivo general son
numerosos y exigen de sus ejecutores preparación, conocimiento, medios tecnológicos, capacidad de trabajo e integración
en equipo, además de una buena dosis
de generosidad y entrega y, por encima
de todo, una gran vocación. Consideraremos, en primer lugar, los dos elementos
imprescindibles en los que se mueve la
Sanidad Animal, sus causas y sus consecuencias (las de la enfermedad infecciosa).
No se puede entender la Sanidad Animal
sin un conocimiento adecuado de los
agentes causales de las enfermedades infecciosas de los animales. Es un desafío
actual de la Sanidad Animal, y lo seguirá
siendo en el futuro, el estudio de los
agentes patógenos, bacterias, hongos,
protozoos, helmintos, virus y priones,
como de cualquier otra especie que tenga
tal consideración y que pueda ser descrita
en los años venideros. No se puede combatir al enemigo sin conocerle antes y
mucho menos si este hace gala de una
gran diversidad, presenta una enorme heterogeneidad y una gran ventaja evolutiva
en relación con otros seres vivos, que
viene dada por la velocidad de reproducción y crecimiento y la extrema simplicidad estructural de algunos de ellos,
como sucede con los virus, que les permite adaptarse evolutivamente a las condiciones del medio, adquiriendo, mediante procedimientos simples, caracteres
que les proporcionan una posición cómoda y les permite sobrevivir. La Sanidad
Animal, como parte especializada de la
Veterinaria, necesita conocer cómo y en
qué condiciones, bacterias, protozoos,
hongos o virus utilizan estructuras, pro-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 264
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
264
ductos de secreción, mecanismos o estrategias, factores de virulencia en suma,
que les permiten superar los mecanismos
de defensa orgánica, colonizar el hospedador susceptible y consumar el proceso
infeccioso. Conociendo estos hechos se
descubren también puntos débiles del
enemigo patógeno que podrán ser utilizados en su contra, de algún modo.
Tanto como ello, a la Sanidad Animal le
interesa también la identificación y caracterización, en la mayor profundidad posible, de los agentes patógenos implicados en una determinada enfermedad,
pues de tal conocimiento pueden obtenerse datos que se aprovechen después
para el establecimiento de prácticas en estrategias o programas de lucha general o
particular. A este respecto, dos consideraciones son necesarias: por un lado, entender que pese a que el nivel taxonómico de especie ha venido siendo el
criterio más utilizado para otorgar responsabilidad o no a un determinado agente
en una enfermedad concreta, los nuevos
métodos de identificación y clasificación
antigénica y sobre todo genética o molecular ponen de manifiesto, además de
ciertas inexactitudes fenotípicas, la existencia en muchos casos de una gran variabilidad intraespecífica (tipos, subtipos,
biotipos, patotipos, serotipos, serovares,
genotipos, etc.), con diferencias, en ocasión, tan importantes en lo que se refiere
a la patogenicidad y virulencia, que la implicación de especie en el suceso morboso
carece de valor, y desde este punto de
vista es casi obligado referirse a la “cepa”,
al tipo, a la serovar, factores predisponentes, susceptibilidad y condiciones de
la misma, etc. Los recursos finos de caracterización de los patógenos permiten,
además, cuando se estudia una determinada enfermedad en una población de referencia concreta (una explotación animal,
una población en un territorio geográfico
determinado, etc.) e incluso en un mismo
individuo, concluir acerca de cuestiones
epidemiológicas (fuente de infección, mecanismo de entrada en una explotación,
etc.) y adoptar estrategias o disposiciones
concretas con el objetivo de controlar la
enfermedad, impedir su difusión, etc. En
este punto es obligado entender que en
el ámbito animal especialmente, pero no
exclusivamente, las etiologías singulares,
únicas o puras, cada vez están siendo más
excepción que regla. Sea por el sistema
de explotación (en el caso de los animales
domésticos), por la menor resistencia de
las razas más productoras, o por otra razones, es más frecuente en la práctica encontrarse con procesos de etiología mixta,
compleja, mezclas de bacterias, de bacterias y virus, de virus y protozoos, o de
todos ellos, adquiriendo especial relevancia en el resultado final agentes patógenos que por sus propios medios serían
incapaces de producir daño o daño importante en hospedadores sanos, mientras que de su asociación con otros, aprovechándose de caídas de inmunidad,
especialmente de la resistencia innata a la
infección, los resultados pueden ser desastrosos, comprometiendo la vida del individuo y el hundimiento económico de
la explotación, llegado el caso.
Debe reconocerse que en este punto,
como en el anterior, los estudios sobre patógenos humanos o los de aquellos que
tienen el doble interés humano y animal,
por ser causa de zoonosis, están marcando el camino para todos. Además de
ello, las nuevas tecnologías y en particular
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 265
Sanidad animal y biotecnología
265
la genómica y la proteómica, especialmente desde la secuenciación del genoma humano, están poniendo a disposición de los científicos, investigadores y
tecnólogos recursos impensables hace tan
solo unos años. La Sanidad Animal, tiene
ante si un importante desafío referido al
desarrollo y uso de la Biotecnología aplicada al conocimiento de los agentes que
producen enfermedades infecciosas de los
animales, desde la secuenciación del genoma de agentes patógenos de animales
para la identificación de factores de virulencia a la utilización de secuencias específicas para el desarrollo de métodos de
diagnóstico y vacunas (ver después).
En cualquier caso, la enfermedad es una
consecuencia de la compleja interacción
entre un hospedador susceptible y un
agente dotado de suficiente capacidad
para establecerse en el primero y producirle daño, incluso la muerte. Por esta
razón, tanto como conocer al enemigo,
el agente patógeno, es preciso conocer
también el modo en que tiene lugar la enfermedad misma, para lo cual es necesario comprender primero en qué bases
asienta la susceptibilidad o resistencia a
uno determinado, cómo puede mejorarse
la segunda o disminuir la primera y de
qué manera se desarrolla el proceso patogénico que, al final, justifica el cuadro
clínico o el desenlace fatal si aquel no se
supera.
En lo primero, uno de los desafíos de la
Sanidad Animal tiene que ver con resolver
el enigma que relaciona los patógenos
con sus hospedadores respectivos: ¿qué
hace que los agentes patógenos sean tan
diferentes en lo que a disponibilidad de
hospedadores susceptibles se refiere?,
¿qué diferencias definen un patógeno de
hospedador único, como sucede en el
caso de la peste porcina africana, y otro
capaz de producir enfermedad en una
amplia variedad de animales, como sucede con el virus de la rabia o las especies
de bacterias del género Brucella? ¿Existen
razones de ventaja evolutiva en alguno de
los casos?, ¿solamente puede explicarse
la susceptibilidad o resistencia en función
de la existencia de receptores celulares específicos, como ocurre en la discriminación o facilitación de los virus de la influenza aviar, por los receptores presentes
en las células aviares?, ¿qué otras razones
justifican la resistencia?, ¿la resistencia es
estable?, ¿cómo se producen los saltos de
la barrera interespecífica? Son muchas las
preguntas y escasas las respuestas, pero
la Sanidad Animal debe estar en primera
línea para investigar estos hechos, pues
no solo es el interés de su conocimiento
para su control, sino como un servicio más
a ese interés común al que nos referimos
más atrás, bajo el enunciado “Un Mundo,
una Medicina, una Salud”, pues al fin y al
cabo muchos de los agentes de enfermedades animales o de zoonosis (SARS,
Nipah, VIH, EEB, etc.) cuando se han descrito por vez primera en el hombre no ha
sido otra cosa que el resultado de un salto,
no previsto, desde una especie animal,
como consecuencia de razones mal comprendidas, en la mayor parte de los casos,
objeto de hipótesis o teorías de difícil justificación y cuyo descubrimiento interesa
por igual a la Medicina Humana y a la
Veterinaria. Estudiando la resistencia natural, heredable, a la infección por determinados agentes patógenos, se están
dando también pasos de gran interés para
la selección animal para caracteres de resistencia frente a enfermedades infec-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 266
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
266
ciosas, como la mastitis bovina u ovina, la
tembladera ovina (scrapie) y otras; un camino que representa una línea de gran interés, si se puede desvincular de otros condicionantes negativos.
En su defensa ante la infección, el hospedador susceptible pone en marcha mecanismos inespecíficos (inmunidad innata) y
específicos (inmunidad adaptativa) que
tratan de resolver a su favor el desenlace
de la agresión patógena. Unos y otros contribuyen definitivamente al cuadro clínico
que caracteriza la enfermedad, y en no
pocas ocasiones las lesiones y secuelas se
deben tanto a la agresión como a la propia
respuesta. Por esta razón interesa tanto a
la Sanidad Animal conocer lo que sucede
en las distintas etapas de la infección-enfermedad, qué recursos pone en juego el
organismo y cuáles son sus consecuencias
y, desde la óptica médica, si procede o no
la intervención para modular la respuesta
y con ello sus consecuencias negativas. De
este conocimiento pueden derivarse métodos de prevención y/o control nuevos,
más eficaces y selectivos pero, como antes
señalábamos, no solo eso, sino que de
estos conocimientos también puede beneficiarse la Medicina Humana, como una especie de pago por servicios contrarios o
complementarios. Haemophilus influenzae
y Neisseria meningitidis son dos patógenos
humanos específicos, de gran interés médico, causas principales de meningitis en
niños. Actinobacillus pleuropneumoniae y
Haemophilus parasuis son dos patógenos
específicos del cerdo, muy semejantes a los
anteriores, especialmente el segundo, que
es causa también de meningitis en el ganado porcino, además de otros problemas
de tipo respiratorio o sistémico. Se están
produciendo avances significativos en el
conocimiento tanto de los mecanismos de
virulencia como en la patogénesis de
ambos grupos, que son utilizados como
modelos aplicables unos a los otros.
Tradicionalmente, el conocimiento de la
respuesta inmune se ha venido vinculando
de modo principal a la respuesta humoral,
estableciendo una relación más o menos
directa entre título de anticuerpos y eficacia de inmunidad activa protectora. El
profundo impulso de la Inmunología, referido tanto a la respuesta humoral y su
ontogenia, como sobre todo a la respuesta
celular y la suya, conjuntamente con los
mecanismos efectores puestos en juego
en cada caso, han de ser utilizados por la
Sanidad Animal para conocer la dinámica
que se establece en relación con las poblaciones y subpoblaciones de linfocitos T implicados en la respuesta, la intervención de
los distintos linajes de células presentadoras de antígeno y su eficacia correspondiente en el procesado de los mismos, la
complicada diversidad de receptores de
superficie en los distintos tipos de células
y los mediadores químicos implicados
como señales o estimuladores inmunes en
la activación de las distintas estirpes de células. En este desafío, igualmente, la Sanidad Animal va de la mano de la Medicina
Humana, a la que sirve de campo de pruebas, de planta piloto en la que experimentar muchos de los avances que después
se aplican también en el hombre.
Desde el punto de vista de la enfermedad,
uno de los compromisos a los que se enfrenta la Sanidad Animal en los próximos
años tiene que ver con el desarrollo de la
epidemiología de las enfermedades infecciosas, en particular a la que se refiere a las
enfermedades emergentes, con especial
atención a las zoonosis. En un mundo glo-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 267
Sanidad animal y biotecnología
267
balizado, con enormes facilidades para el
traslado de los agentes patógenos entre territorios, incluso muy distantes, vehiculados
por hospedadores susceptibles, enfermos
o reservorios subclínicos, domésticos o salvajes, de forma legal o clandestina, de
modo natural o con intervención humana, apoyados por medios de transporte
que mueven al año cantidades ingentes
de todo tipo de especies, productos de
origen animal en los que puede mantenerse el riesgo, etc., con una sucesión tan
larga y prolija como la que se ha citado de
factores que favorecen la emergencia de
las enfermedades, su propia dinámica, su
epidemiología, es una cuestión absolutamente crítica, necesaria e insustituible
tanto para la prevención como para la
aplicación de medidas y estrategias de
lucha, control y erradicación, con oportunidades de éxito. Por si fuera poco, a todo
ello se suma en estos momentos el creciente interés e influencia demostrada del
aumento de la temperatura del planeta
(lo que hemos denominado cambio climático), que facilita cambios que desplazan
vectores invertebrados y vertebrados,
principalmente roedores, habituales portadores de muchos agentes patógenos,
que cambian los patrones epidemiológicos tradicionales. Sirvan de ejemplo los
sucedidos en relación con la lengua azul,
la encefalitis del Nilo Occidental o la tularemia para poder entender el alcance de
estos extremos.
La Sanidad Animal debe prepararse a conciencia para estos cambios, desde las
aulas de las Facultades de Veterinaria al
campo (en los que muchas veces los profesionales se encuentran con procesos
irreconocibles tal como les fueron dados
a conocer académicamente, siendo causa
de sorpresa), desarrollando metodologías
capaces de organizar, calcular o prever la
dirección de un determinado proceso. El
desarrollo de un sistema de Vigilancia
Epidemiológica, apoyado en marcadores
centinelas, cualquiera que sea su carácter,
tipo o condición, debe anticipar los cambios que anuncian la presencia de la enfermedad, antes incluso que se produzca
la aparición de un foco o de que se disponga de un diagnóstico definitivo.
La Sanidad Animal, nuevamente, debe incorporar los instrumentos y métodos que
las nuevas tecnologías (biología y genética
moleculares, microbiología, inmunología,
biotecnología) ponen a su disposición para
llevar a cabo estudios comparativos que
permitan, una vez establecido un foco de
infección, anticiparse a su progreso, para
evitar que se alcancen dimensiones mayores, de brote epidémico, pongamos por
caso. Debe tenerse presente, en el caso de
los animales domésticos productores de
alimentos, la extraordinaria dimensión de
efectivos en una explotación y la facilidad
de difusión ante un posible caso o foco de
enfermedad infecciosa, particularmente si
su modo de transmisión es respiratorio,
pero no solo, también cuando es el agua
o el alimento contaminado el vehículo de
difusión. Aunque distinto, la explotación
extensiva, la cría de animales al aire libre
en extensiones grandes, tiene también
otro tipo de oportunidades de difusión
nada despreciables, que incluyen la posibilidad de contacto con fuentes de infección ambientales, en las que los animales
salvajes pueden estar en el núcleo del proceso. Nuevamente, un análisis epidemiológico riguroso, de concepto y contenido,
no de simple compromiso de encuesta
(cuyo valor no se cuestiona, especial-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 268
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
268
mente si está diseñada con criterios científicos), representa a la vez un reto y un
recurso inestimable en la organización de
los planes de lucha.
El diagnóstico es el primer paso firme para
denunciar la presencia de la enfermedad
y poner en marcha los recursos para la
lucha y control, que complementan los
que se refieren a la vigilancia. Aunque en
materia de diagnóstico todos los métodos
son útiles, cada tipo de población o condición exige una consideración diferente,
y la Sanidad Animal debe responder a
todas con eficacia y prontitud. El diagnóstico debe ser rápido y certero y, en la medida de lo posible, dependiendo de las
condiciones que se den en cada caso, integrar la mayor información disponible
para asegurar el dictamen. Exceptuando
el caso de animales de aptitudes singulares (animales de compañía o de gran
valor por razón de una aptitud o capacidad especiales), lo cierto es que el valor
del “ojo clínico”, más subjetivo, ha venido
cediendo progresivamente posiciones a
favor de los controles sistemáticos realizados al azar sobre muestras remitidas al
laboratorio. Es tanto lo que se pone en
juego que cada vez se improvisa menos,
y ante la menor sospecha se ponen en
práctica las pertinentes medidas de control que el técnico considera más adecuadas o la Administración exige. Un retraso de días en aclarar la naturaleza de
una enfermedad infecciosa puede suponer
un desastre incontrolable, pero también
un diagnóstico equivocado, y la adopción
de medidas que no se correspondan con
la causa de la misma conduce a idéntico
resultado. En cada situación, lo que se refiere a la gravedad, tasa de difusión, morbilidad y mortalidad, debe de ser ponde-
rado para establecer el límite máximo de
tiempo disponible para decidir la conclusión, aunque, como norma, cuanto más
rápido se obtenga esta, mayor facilidad
para su control.
Los métodos tradicionales basados en el
estudio del cuadro clínico y anatomopatológico, si se quedan en eso, suelen ser insuficientes. El laboratorio es insustituible,
entre otras razones porque su capacidad
de acierto se basa en datos objetivos, que
deben ser interpretados correctamente.
Ahora bien, el dilema se plantea en relación con el uso de métodos de demostración directa del agente (en el caso de microorganismos o parásitos, su aislamiento,
identificación y caracterización), de partes
o fragmentos del mismo (detección de
material genético o de sus antígenos) o indirecta (detección de anticuerpos, estudio
de la inmunidad de base celular y sus mediadores, etc.). Siempre es preferible, si la
gravedad del caso lo aconseja y justifica,
utilizar métodos rápidos, preferiblemente
directos, pero aunque sean indirectos y
susceptibles de errores (principalmente
problemas derivados de la sensibilidad y
especificidad de la técnica), confirmando
después mediante técnicas convencionales
que, además de ello, permiten disponer
de un material aprovechable en otras determinaciones y estudios.
Pero, como quiera que sea, las enfermedades infecciosas, particularmente las enfermedades víricas, de mayor complejidad
en el diagnóstico directo, exigen ante
todo respuestas rápidas, y este es el compromiso particular de la Sanidad Animal
en este campo: el desarrollo de métodos
capaces de llevar a cabo, con rigor y certeza, cientos o miles de estudios en el
menor tiempo posible. Resumiendo pues,
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 269
Sanidad animal y biotecnología
269
podríamos señalar que en materia de
diagnóstico los desafios implican: sensibilidad, especificidad, rapidez y adaptabilidad.
Las técnicas moleculares, sin duda alguna,
son la respuesta de mayor autoridad en la
actualidad, sin despreciar los métodos serológicos. Nuevamente la Biotecnología,
la Biología Molecular, las nuevas tecnologías en suma, prestan a la Sanidad Animal
el auxilio que necesita, y su avance se produce a tanta velocidad en los últimos años
que en ocasiones resulta difícil seguir su
desarrollo. Por esta razón la Sanidad
Animal no solo debe formar especialistas
en estas tecnologías, sino procurar su actualización periódica y permanente.
Por último, diagnosticado un proceso particular, se impone su control y eliminación
y/o su prevención a partir de aquella. Este
es también un campo critico para la
Sanidad Animal, en el que se producen algunos de los compromisos de mayor actualidad. Hemos de diferenciar cuanto se
refiere a recursos y métodos que utilizan
la inmunidad (activa y pasiva) como herramienta de trabajo (principalmente vacunas y sueros o inmunoglobulinas purificadas) y lo que se refiere al uso de
antimicrobianos, cuya situación actual,
como es sabido, está sometida al inconveniente de la generación de resistencias,
lo que está propiciando iniciativas de todo
tipo, tendentes a la búsqueda de sustitutos y alternativas. En este campo,
además, hemos de considerar las novedades que representan las nuevas tecnologías de la mano de la Biotecnología. Por
último, hemos de referirnos también al
concepto moderno de Bioseguridad, que
integra todas las actuaciones, métodos y
recursos dirigidos a impedir la entrada de
los agentes patógenos en una explotación
animal o su difusión en ella.
La Vacunología, término aceptado en la
actualidad para la rama de la Biología que
se ocupa del estudio, diseño y desarrollo
de vacunas, nació directamente de la aplicación de un agente de enfermedad
animal (virus vaccinia) para proteger de
una enfermedad humana (viruela); ya nos
hemos referido a ello en otro lugar, y los
primeros progresos estuvieron directamente ligados a la Sanidad Animal de la
mano de las vacunas contra el carbunco
bacteridiano, cólera aviar o mal rojo porcino, junto a la vacuna frente a la rabia,
todas ellas desarrolladas por Louis Pasteur,
en lo que se considera la primera etapa
de la Inmunología. Después vendrían los
descubrimientos de Salmon y Smith
acerca de las vacunas inactivadas, y los de
Gastón Ramón en relación con los adyuvantes y los toxoides, junto a un sinfín de
aportaciones más que han puesto en
manos de la Ciencia Médica, Humana y
Veterinaria, un instrumento insustituible
en la lucha contra las enfermedades infecciosas. Téngase en cuenta, como se ha
dicho, que en la extinción de la viruela
(oficialmente el 9 de diciembre de 1979)
y de la peste bovina (2011), las dos únicas
enfermedades en las que se ha logrado
tal propósito hasta la fecha, el uso de vacunas ha sido decisivo.
A lo largo de este camino se han identificado dos tipos de productos: las vacunas
que utilizan como inmunógeno el mismo
agente, pero atenuado, que en su forma
primitiva (salvaje) produce la enfermedad,
y las que utilizan este, previamente inactivado. La preparación del primero ha sufrido a lo largo de estos años considerables modificaciones para mantener su
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 270
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
270
capacidad inmunizante asegurando su
inocuidad. Hasta tiempos recientes, estos
procedimientos han sido principalmente
empíricos, fortuitos las más de las veces
(hallazgo de una cepa particular de una
bacteria o virus, menos patógena de
forma espontánea o fruto de modificaciones inducidas artificialmente, que inoculada inducía protección, o largamente
perseguida mediante procedimientos de
lo más variado: pases ciegos por hospedadores diferentes al natural, cultivo en
condiciones disgenésicas, etc.), en los
que, en cualquier caso, no se podía asegurar la estabilidad del producto final en
las condiciones de uso y, en ocasiones,
una atenuación deficiente producía errores capaces de producir enfermedad (vacunal) en el animal destinado a ser protegido, además del riesgo permanente que
representa incorporar nuevos agentes en
el ambiente de las explotaciones animales
o dondequiera que pueda ser utilizado.
El segundo de los caminos (vacunas inactivadas) garantiza la seguridad del producto, puesto que el agente productor de
la enfermedad es inactivado con anterioridad a su uso, mediante procedimientos
físicos o químicos, pero a cambio de ello
cede buena parte de su capacidad inmunógena, siendo por ello menos efectivo.
En parte se puede mejorar esta capacidad
mediante la utilización de adyuvantes de
inmunidad, e inoculaciones repetidas
(dosis de recuerdo), pero nunca se logra
obtener un producto equivalente, en términos de eficacia, al que representan las
vacunas vivas.
La lucha contra las enfermedades infecciosas en la que participan estos poderosos instrumentos está sometida en la
actualidad a un profundo cambio del que
debe participar sin excusas la Sanidad
Animal. Además de ello, la Vacunología
ha abierto en la actualidad sus puertas a
procesos de naturaleza esporádica, no infecciosa, incluyendo tumores y alergias,
que si bien en el mundo de los animales
productores de alimentos en general carece de consideración, sí la tiene en el
caso de los animales de compañía, o de
valor singular por otras aptitudes.
Planteado como antes en relación con la
doble estrategia de uso, en el campo de
los productos vivos, la Genómica permite
en la actualidad identificar factores de virulencia, que incluso solo se expresan en
el hospedador, in vivo, en el curso de la
infección. Métodos directos o inversos
(genética reversa) permiten localizar las
secuencias de mayor interés y, a partir de
ahí, proceder según mejor convenga. Los
métodos de Ingeniería Genética en uso
permiten obtener mutantes atenuados,
deficientes en tal o cual gen que codifican
para un factor crítico (factor de virulencia
o relacionado con rutas metabólicas imprescindibles), permitiendo la obtención
de productos seguros desde el punto de
vista de su inocuidad, generando, en
cambio, buenas respuestas protectoras.
Además de ello, un campo que está revolucionando los programas de control
contra enfermedades infecciosas de los
animales, se basa en el diseño de vacunas
marcadas, en las que la manipulación genética impide por ejemplo la presencia de
un antígeno determinado, para el que
puede desarrollarse un método de diagnóstico específico, a la carta, permitiendo
el desarrollo de un programa de lucha o
control en base a la utilización de una vacuna y su complemento diagnóstico. Este
método (DIVA, Differentiating Infected
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 271
Sanidad animal y biotecnología
271
from Vaccinated Animals) ha sido utilizado con éxito en el caso de la enfermedad de Aujeszky, influenza aviar y
otras, y está llamado a ser un recurso principal en la lucha contra las enfermedades
infecciosas. En el lado contrario, las modernas versiones de vacunas inactivadas
están representadas por las vacunas de
subunidades y las vacunas de ADN. En el
primero de los casos, los avances tecnológicos (genómica, transcriptómica y proteómica) permiten localizar los genes y sus
productos de expresión que tengan
mayor interés desde el punto de vista de
la respuesta inmune protectora, compararles con bancos de datos referidos a
otras bacterias o virus y, utilizando un sistema de expresión adecuado (virus, bacterias, levaduras, células de insecto o células de mamífero, por ejemplo), lograr su
expresión recombinante y su purificación,
obteniendo de este modo un producto
final en base exclusiva a una proteína o
varias, sin el riesgo que supone la presencia del agente vivo ni la inconveniencia
de otros productos que nada influyen en
el efecto buscado. Como en el caso de las
bacterinas, este tipo de productos inducen una inmunidad de corta duración
que hace necesario el desarrollo de adyuvantes, inmunomoduladores, para los que
igualmente existen expectativas inmejorables en la actualidad. La Sanidad Animal
se está incorporando a estas nuevas corrientes de desarrollos vacunales y su interés es doble: por un lado, el que resulta
de su objetivo directo de participar con
productos de última generación en la
lucha y control de las enfermedades infecciosas de los animales, pero, por otro
lado, constituye, como se ha dicho en
otros lugares, un campo de prueba exce-
lente para productos de iguales características aplicables al hombre.
Los sueros terapéuticos, que tantos beneficios han representado en el pasado reciente, para resolver compromisos de urgencia en pacientes animales en los que
la vacunación no disponía del tiempo necesario para desarrollar una respuesta
protectora, o cuando la etiología de la enfermedad se correspondía con toxinas
producidas por bacterias, han evolucionado también considerablemente. Al
avance que supusieron los métodos de
purificación de inmunoglobulinas y el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales, mediante la técnica de hibridomas,
en las que la fusión de una célula de mieloma con células B generaba un híbrido
capaz de producir de forma indefinida anticuerpos contra un epítopo particular, ganando extraordinariamente en selectividad y eficacia, se le ha venido a sumar
en la actualidad la posibilidad de producir
anticuerpos recombinantes a partir de células de mamífero adaptadas a su destino
(el hombre, principalmente), con lo que
se prolonga su duración y eficacia. Bien
es verdad que esta frontera de la Biotecnología está restringida en la actualidad a la Medicina Humana, pero no tenemos dudas de que su aplicación no
tardará en llegar a situaciones particulares
de la Sanidad Animal, que en cualquier
caso debe permanecer a la expectativa,
vigilante de los progresos que en este interesantísimo campo se están produciendo y por los que ya están apostando
las principales industrias biotecnológicas
a nivel mundial.
En lo que se refiere a la búsqueda de alternativas para los antimicrobianos tradicionales, los antibióticos, su uso se ha res-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 272
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
272
tringido (de hecho, están prohibidos
como promotores del crecimiento) en algunas especies de ciclo corto y siempre
condicionado a evitar la inducción de resistencias que al final exigen un alto
precio en la terapéutica humana. En la actualidad asistimos a la búsqueda de otras
alternativas antimicrobianas, sean estas
de origen natural (aceites esenciales,
ácidos orgánicos, etc.) o de otra naturaleza, sin olvidar antiguos recursos que
fueron desplazados cuando se produjo el
descubrimiento de los antibióticos, como
sucede en el caso de la terapia fágica, que
ya se está planteando como una iniciativa
merecedora de toda atención en situaciones concretas, como mastitis bovinas y
otras.
Recursos
Establecido el contexto de riesgo por la
presencia y difusión de enfermedades infecciosas producidas por microorganismos, las posibilidades de control y, en su
caso, erradicación están condicionadas a
dos circunstancias: por un lado, el diagnóstico, y por otro, la aplicación de medidas de control. El primero debe cumplir
los requisitos de rapidez, sensibilidad, especificidad y exactitud, y va dirigido tanto
a la detección directa como indirecta del
agente etiológico. En el primer caso, una
vez aislado este por métodos convencionales, el propósito es llevar a cabo su
identificación, caracterización y tipificación. Las determinaciones moleculares
(detección de genes) o inmunológicas (detección de antígenos) no recuperan el
agente etiológico, solamente detectan su
presencia, pero pueden tener una extraordinaria importancia por su rapidez, sensibilidad y especificidad.
El diagnóstico indirecto utiliza recursos derivados de la respuesta inmune (humoral
y celular) y detecta la huella que deja la
presencia del agente en el hospedador
enfermo y está condicionado por los
mismos elementos.
En relación con las medidas de control,
una vez realizado el diagnóstico en las
mejores condiciones, la Sanidad Animal
debe poner en práctica recursos eficaces,
rápidos, carentes de efectos secundarios,
que permitan al menos reducir drásticamente los niveles de prevalencia de la enfermedad y, siempre que sea posible, lograr su erradicación.
En la actualidad, el recurso principal a disposición de la Sanidad Animal para hacer
frente con éxito a la difícil tarea a la que
se enfrenta reside en la disponibilidad de
tecnologías derivadas de la Biotecnología.
De hecho, ahora mismo es difícil entender
el futuro, no ya de la Sanidad Animal,
sino de la Ciencia Veterinaria en general,
sin el concurso de la Biotecnología.
El término “Biotecnología” fue utilizado
por primera vez en 1919 por Karl Ereky,
un ingeniero agrónomo húngaro para referir un proceso de producción masiva de
cerdos utilizando remolacha azucarera
como alimento primario transformable,
en definitiva, describiendo procesos de
obtención de productos a partir de distinto
tipo de materias primas con el concurso
de organismos vivos. Bien es verdad que
su desarrollo se produjo (de forma explosiva) cuando se incorporaron técnicas de
Ingeniería Genética (tecnología del ADN
recombinante) al trabajo con microorganismos (procariotas y eucariotas), que permitieron primero la selección y obtención
de fragmentos del ADN de un microor-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 273
Sanidad animal y biotecnología
273
ganismo introduciéndolo después en otro,
que expresaba así moléculas ajenas. La
Ingeniería Genética hizo de la Biotecnología una ciencia principal desde el punto
de vista científico, y las aplicaciones comerciales han representado después una
nueva revolución biológica.
En esencia, la Biotecnología supone el uso
de organismos vivos o compuestos obtenidos a partir de aquellos, con valor para
el hombre o los animales. Es un enfoque
multidisciplinario compuesto por variedad
de técnicas derivadas de la investigación en
Biología Molecular y Celular, Microbiología,
Inmunología y otras disciplinas afines, que
pueden ser utilizadas dondequiera que se
utilicen microorganismos (bacterias, virus,
hongos, protozoos, etc.) o células (vegetales o animales). La OCDE define la Biotecnología como “la aplicación de principios
científicos de la Química, Biología, Microbiología e Ingeniería al procesamiento de
materiales por agentes biológicos, para
proveer bienes y servicios”.
El espectacular desarrollo de la Biotecnología se produjo en el campo de la fabricación de nuevos medicamentos y vacunas y en la obtención de cultivos y
animales modificados genéticamente, con
el ánimo de producir alimentos (de origen
vegetal y animal) para el consumo humano y animal. Desde la síntesis biotecnológica de insulina obtenida en 1978
por recombinación genética a partir de E.
coli, se produjo una carrera desenfrenada
por obtener nuevos productos con el concurso microbiano y de estas nuevas tecnologías. La lista de productos hoy disponibles por estos procedimientos es cada
día más numerosa e incluye hormonas,
proteínas de utilidad en distintos ámbitos,
antibióticos, antitumorales, antiparasita-
rios, anticuerpos monoclonales, etc. Se ha
generado, de este modo, una pujante industria biotecnológica que con carácter
global representa ya un sector estratégico
para muchos países y ello no solo de los
que forman parte del mundo desarrollado, sino que por su bajo coste representa también una oportunidad para los
países en desarrollo.
Genómica y Proteómica. El término
Genómica surgió a finales de 1986 con el
nombre de una nueva revista dedicada a la
publicación de resultados de los trabajos,
entonces en curso, relativos a la secuenciación del genoma humano. Un año antes,
en 1985, se había publicado, por primera
vez, una técnica denominada “reacción en
cadena de la polimerasa”, abreviadamente PCR (polymerase chain reaction),
que abrió grandes posibilidades para detectar y analizar diferencias entre el ADN
(las secuencias) del genoma de los animales. Cuando se combinó con marcadores genéticos, se dispuso de una herramienta extraordinaria que permitió el
estudio detallado de los genes que constituían el genoma de la vaca, y años después, nuevas técnicas y variantes de la
PCR permitieron realizar estudios de expresión génica a gran escala para visualizar cambios en el nivel de expresión de
cientos de miles de genes en tejidos particulares. Se secuenció el genoma de la
gallina y después el de la vaca, al que siguieron el de los primeros microorganismos, cuya lista hoy supera el centenar.
La Organización Mundial de la Sanidad
Animal (OIE) (20) ha establecido cuatro
prioridades de la Genómica en su relación
con la Sanidad Animal, incluyendo el desarrollo de estudios cuantitativos de genética de poblaciones para la búsqueda
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 274
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
274
empleado ascendió a 148.648 y la cifra
de negocios a 53.152 millones de euros.
La facturación de las empresas biotec (las
que tienen como actividad principal la
biotecnología) alcanzó los 7.711 millones
de euros, lo que supone el 15% del total
del sector. Conviene recordar el carácter
transversal de la Biotecnología, que hace
que las empresas de distintos sectores incorporen cada vez más actividades biotec
en sus productos y servicios, por lo que es
lógico que se produzca este tipo de incrementos cuando las nuevas tecnologías
emergentes se consolidan en el tejido productivo.
de marcadores de rasgos sanitarios, estudios de genómica funcional para el análisis de las interacciones patógeno-hospedador, la búsqueda de herramientas para
el diagnóstico y control de las enfermedades animales y el apoyo integral. La
Sanidad Animal, como la Salud Pública
(Salud Humana), es un campo de un
enorme atractivo para el desarrollo y aplicación de los recursos generados por la
Biotecnología, aunque es preciso reconocer que, al menos en el campo industrial, las distancias que se mantienen en
la actualidad entre ambas son enormes.
Comoquiera que sea, en este contexto, el
desarrollo de la Genómica, Proteómica,
Bioinformática y otras técnicas moleculares han supuesto un impulso tecnológico determinante en la investigación.
Entre el resto de indicadores, destacan los
incrementos de casi un 7% en el personal
empleado en I+D biotec y de más del 5%
en el gasto en I+D privado. Conviene destacar igualmente que las empresas que
han hecho I+D en Biotecnología han crecido un 12% y que otros indicadores de
output, como el número de patentes solicitadas, casi se han duplicado (+ 85% en
el último año), datos que confirman las
buenas perspectivas de este sector en el
contexto nacional.
En el último informe de la Sociedad ASEBIO (Asociación Española de Bioempresas)
(21), correspondiente a 2010 (figura 6) y
aprobado en mayo de este año, se hace
referencia a que este sector alcanzó en
2009 un total de 1.095 empresas con actividades en Biotecnología, de las que 399
(el 36,4%) afirman que esta es su actividad principal y/o exclusiva. El personal
600.000
500.000
400.000
376.146
294.845
300.000
200.000
100.000
485.466
460.653
200.114
79.396
19.058
88.124
22.549
108.648
103.911
26.149
31.101
148.648
53.152
0
2005
2006
Facturación (M €)
2007
Empleo (n.º de trabajadores)
2008
2009
Gastos en I+D (k€)
Figura 6. Evolución de los principales indicadores del sector biotecnológico español (ASEBIO, 2011).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 275
Sanidad animal y biotecnología
275
Industria
12
Salud animal y acuicultura
17
Medio ambiente
18
Agricultura y producción forestal
18
Salud humana
38
Alimentación
42
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Figura 7. Distribución de empresas del sector biotecnológico, según área de aplicación (ASEBIO, 2011).
El gráfico siguiente (figura 7) pone de manifiesto que las empresas del sector alimentario (42%) por primera vez son las que
predominan entre las empresas con actividades en el ámbito de la Biotecnología y
las aplicaciones en salud humana (38%)
ocupan el segundo puesto, mientras que
en un segundo grupo se sitúan las empresas con actividades relacionadas con
aplicaciones medioambientales (18%),
Sanidad Animal y acuicultura (17%) y agricultura y producción forestal (18%).
En la actualidad, la Biotecnología, como
la Informática, se ha diversificado tanto
que se ha convertido en una herramienta
imprescindible en cantidad innumerable
de campos científicos e industriales, lo
que ha supuesto la necesidad de un sistema de clasificación de usos relacionado
con sus características comunes o su utilidad final que confluyen en cinco agrupaciones fundamentales de los usos biotecnológicos, que se identifican por un
sistema de colores (22). La Biotecnología
Roja agrupa los usos relacionados con la
medicina e incluye la obtención de antibióticos, vacunas, nuevos fármacos, téc-
nicas y métodos moleculares relacionados
con el diagnóstico, terapias regenerativas
y desarrollo de la Ingeniería Genética para
el tratamiento de enfermedades mediante
manipulación genética; a esta nos referiremos en particular en el caso de la
Sanidad Animal. La Biotecnología Blanca se ocupa de los usos relacionados con
los procesos industriales y presta especial
atención al diseño y desarrollo de productos energéticamente más eficientes
y/o menos contaminantes, como es el
caso de la utilización de microorganismos
(principalmente bacterias y hongos) para
la producción de productos químicos,
nuevos materiales de uso doméstico y
biocombustibles. La Biotecnología Gris
engloba las aplicaciones relacionadas con
el medio ambiente, tanto en lo que se refiere al mantenimiento de la biodiversidad
como a la eliminación de contaminantes
(biodegradación para la eliminación de
metales pesados o hidrocarburos, principalmente); la primera se ocupa, por
ejemplo, de estudios moleculares para el
análisis genético de poblaciones y especies o los estudios de clonación en el caso
de especies en peligro de extinción, o la
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 276
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
276
utilización de tecnologías de almacenamiento de genomas. La Biotecnología
Verde se ocupa de la agricultura, desde
la creación de nuevas especies de plantas
de interés a la producción de fertilizantes
y biopesticidas, o el cultivo in vitro y la clonación de vegetales. La creación de nuevas variedades de plantas (plantas transgénicas) ha suscitado el mayor interés y
controversia social; persigue la obtención
de variedades resistentes a enfermedades
y plagas, variedades con mejores propiedades nutricionales y variedades que actúen como biofactorías para la producción de sustancias de interés médico,
biosanitarios o industrial, de fácil aislamiento y purificación. Finalmente, la Biotecnología Azul se ocupa de la explotación de los recursos marinos para la
generación de productos y aplicaciones
de interés industrial, como ocurre en el
caso de productos químicos utilizables en
alimentación, medicina, cosmética, agricultura, etc. Ha sido definida como la de
mayor proyección a medio plazo.
En España, la Biotecnología, como la salud,
son consideradas prioridades estratégicas
en el actual Plan Nacional de Investigación
Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica en el que se define como “uno de
los factores clave de la revolución de la
economía basada en el conocimiento…
cuyo avance potencia nuevas disciplinas
científicas, aporta respuestas y genera
aplicaciones socioeconómicas múltiples…
la investigación en este campo es una actividad muy importante para el éxito de
cualquier estrategia que se proponga mejorar la salud de los ciudadanos, la mejora
de la producción agraria, la alimentación,
las tecnologías de la producción, la generación de energía, el desarrollo sostenible
y la conservación y mejora del medio ambiente… podemos afirmar que la
Biotecnología no es una ciencia per se,
sino que aglutina varias disciplinas, como
agricultura, biología, bioquímica, genética, ingeniería, medicina, microbiología,
veterinaria, etc.” (23).
Aplicaciones de la
Biotecnología en el
diagnóstico de enfermedades
infecciosas en Sanidad Animal
Introducción
Numerosos y recientes avances tecnológicos de la Biología Molecular y la Biotecnología han permitido el desarrollo de
nuevas pruebas de diagnóstico, más eficaces, o utilizables en él. Se incluyen, por
ejemplo, diversos tipos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), métodos de
amplificación isotérmica, micromatrices
(microarrays), detección de proteínas por
amplificación de ácidos nucleicos, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas,
biosensores y otros muchos métodos para
la detección de patógenos o de la respuesta inmune frente a la infección.
Aunque el aislamiento de una molécula
de ADN se llevó a cabo por primera vez
en 1869 a partir de núcleos aislados de
linfocitos humanos, siendo entonces denominada “nucleína”, su composición
fue determinada 10 años después, estableciendo la presencia de cuatro bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y
timina. Sin embargo, no fue hasta 1944
cuando Avery, MacLeod y McCarty pasaron a la historia de la Ciencia al demostrar que el ADN era el material genético
responsable de la herencia (24). A este
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 277
Sanidad animal y biotecnología
277
descubrimiento siguieron otros no menos
trascendentes, como la estructura de
doble cadena (o doble hebra) realizada
por Watson y Crick en 1953 (25), en la
que las bases nitrogenadas permanecen
unidas externamente por grupos fosfato,
formando una cadena en cuyo interior interactúan con bases complementarias de
la otra cadena (adenina con timina y citosina con guanina) a través de enlaces de
hidrógeno. Cada cadena sirve de molde,
en la herencia, para su propia replicación
(replicación semiconservativa). En 1960 se
descubrió la enzima polimerasa (26), lo
que permitió definir el sitio de inicio de la
síntesis del ADNbc, considerado este el
origen de todos los métodos de síntesis
de ADN in vitro. A partir de aquí, la sucesión de acontecimientos ha sido realmente vertiginosa. En el cuadro que sigue
(cuadro 1) se resumen los principales descubrimientos sucedidos a partir de 1960:
El descubrimiento de la renaturalización
o hibridación del ADN realizado por Doty
et al. (1961), después de su desnaturalización por calentamiento, constituyó el
punto de partida de todas las técnicas desarrolladas posteriormente bajo la denominación de hibridación, con la única diferencia que en los métodos actuales se
introduce un fragmento de una cadena
denominado “sonda” que, al estar en
mayor concentración que el ADNbc y producirse la renaturalización, forma un híbrido. La utilización de enzimas capaces
de cortar el ADN en secuencias palindrómicas específicas, que en condiciones normales tiene como fin proteger a las bacterias de infecciones por fagos, degradando
su ácido nucleico, permitió obtener y estudiar fragmentos discretos y específicos
del ADN, lo que, unido al siguiente descubrimiento de enzimas con capacidad de
unir fragmentos separados (ADN ligasa),
permitió llevar a cabo estudios de recombinación in vitro, dando origen a la tecnología del ADN recombinante, es decir,
Cuadro 1. Cronología de los descubrimientos más importantes en el campo de la
tecnología del ADN.
Año
1961
1962
1966
1967
1972
1975
1977
1981
1985
1997
2001
Descubrimiento
Desnaturalización y renaturalización del ADN.
Aislamiento y purificación de las enzimas de
restricción.
Descubrimiento del código genético.
Aislamiento y purificación de la enzima ADN
ligasa.
Desarrollo de las técnicas de clonación del ADN.
Hibridación del ADN con sondas de secuencia
específica.
Métodos de secuenciación de ADN.
Primeros animales transgénicos.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Secuenciación de genomas bacterianos
completos.
Secuenciación del genoma humano.
Referencia
Doty y Marmur
Arber
Niremberg, Ochoa y Khorana
Geller
Boyer, Cohen y Berg
Southern
Sanger y Barrel; Maxam y Gilbert
Palmiter y Brinster
Mullis
Tomb, Cole y Parkill
Venter y Collins
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 278
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
278
a la Ingeniería Genética o, lo que es lo
mismo, a la Biotecnología moderna.
Diagnóstico molecular
Con carácter general es preciso señalar
que la detección de material genético
(ADN o ARN) de un microorganismo en
muestras clínicas posee la consideración
de indicar su presencia en el hospedador
de donde proceden las muestras en el
momento de obtenerlas, aunque no
puede asegurar que el microorganismo
en cuestión estuviese activo (es decir,
vivo). La detección de ARNm sí que indica,
por el contrario, que el microorganismo
de procedencia está metabólicamente activo, es decir, vivo (27). En cualquier caso,
este tipo de detección molecular tiene la
ventaja de que permite la identificación
de una infección de forma directa, sin la
necesidad del cultivo del microorganismo
responsable, actividad que en algunos
casos reviste peligrosidad para el especialista. El diagnóstico basado en la detección directa del gen o fragmento del
ácido nucleico mediante hibridación con
sondas específicas puede completarse con
otras determinaciones que amplifican secuencias específicas incrementando la
sensibilidad del procedimiento.
La hibridación se basa en la capacidad de
dos cadenas sencillas de ácido nucleico
(ADN o ARN) complementarias en su secuencia de bases, para formar enlaces específicos y organizar una doble hélice en
cualquier combinación posible (ADNADN, ADN-ARN o ARN-ARN). Para que se
produzca la formación de híbridos estables debe haber un alto grado de complementariedad.
Una sonda es un fragmento determinado
de ADN o ARN marcado química o radiactivamente, utilizado para localizar determinadas secuencias de ácidos nucleicos
mediante hibridación. La hibridación se
puede llevar a cabo en diversos formatos,
por ejemplo, en solución, con la cadena
diana unida a un soporte sólido o in situ,
sobre un corte tisular o un microorganismo fijado a un soporte. La sonda
puede producirse por síntesis química o
mediante técnicas recombinantes, y en el
proceso de su producción se marca (con
enzimas, fluorocromos o isotopos radiactivos) para su detección. En la práctica, la
hibridación es útil para detectar o confirmar los resultados de otras pruebas
(28), como sucede en el caso de los microarrays y otras (ver después).
La electroforesis en gel es una herramienta muy útil para separar macromoléculas de diferentes tamaños y cargas eléctricas. Las moléculas de ADN tienen, por
lo general, una carga constante por
unidad de masa, por lo que se pueden separar casi completamente en geles de
agarosa o acrilamida, sobre la base de su
tamaño o conformación. Los geles de
agarosa o acrilamida actúan como tamices moleculares, retardando el paso de
las moléculas más grandes en relación
con las más pequeñas. Para las moléculas
más grandes son mejores los geles de
agarosa, mientras que los de acrilamida
lo son para las moléculas más pequeñas.
Aunque los procedimientos para separar
ácidos nucleicos y proteínas tienen el
mismo principio, presentan algunas diferencias técnicas debido a las características particulares de cada clase de molécula.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 279
Sanidad animal y biotecnología
279
En 1975, Southern (29) desarrolló un método para fijar ADN digerido por enzimas
de restricción a un soporte sólido y llevar
a cabo después la hibridación con sondas
específicas. La técnica permitió ubicar los
genes y otras secuencias de ADN sobre
fragmentos resultantes de la restricción
enzimática separados por electroforesis
en gel. La principal característica de la técnica es la transferencia de las moléculas
de ADN, que han sido separadas por electroforesis en gel, a una membrana de
nailon o nitrocelulosa. Esta técnica fue denominada Southern-blot en honor a su
descubridor. En la práctica, el ADN se desnaturaliza (se abren sus dos cadenas)
antes o durante la transferencia, disponiendo el gel en una solución alcalina.
Una vez finalizada la transferencia, el ADN
se inmoviliza sobre la membrana por exposición a temperatura elevada o a radiación ultravioleta y se incuba con él una
sonda de ADN que contiene la secuencia
de interés y que solamente hibridará con
moléculas que contengan la secuencia de
nucleótidos complementaria a la suya. Las
sondas pueden marcarse por métodos diferentes (radiactividad, colorantes, quimioluminiscencia, etc.), de tal modo que
después de la hibridación pueda revelarse
de acuerdo con el método que corresponda al procedimiento de marcaje.
Igual que sucede con el ADN, las moléculas de ARN también pueden separarse
por electroforesis en geles de agarosa,
transferirse a membranas de nailon o nitrocelulosa y analizarse. La transferencia
de ARN se denomina Northern-blot como
reconocimiento de que el método es, en
realidad, la imagen de espejo de la técnica de Southern-blot. Aunque ambos
procedimientos son idénticos, las molé-
culas de ARN son muy sensibles a la degradación por ARNasas, lo que exige
mucha precaución para evitar la contaminación con ellas. Además, la mayoría de
las moléculas de ARN contienen estructuras secundarias (debidas a emparejamientos intracatenarios), por lo que
deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas sobre la base de su tamaño.
La electroforesis en gel de poliacrilamida
representa una herramienta muy importante para la separación y caracterización
de proteínas, cuyos polipéptidos integrantes se separan en presencia del detergente dodecil sulfato sódico (SDS),
capaz de desnaturalizar las primeras.
Como en el caso de los ácidos nucleicos,
los polipéptidos una vez separados por
electroforesis, también pueden transferirse desde el gel a una membrana de nitrocelulosa y ser detectados mediante la
utilización de anticuerpos específicos. Esta
transferencia se denomina Western-blot
y se lleva a cabo mediante el uso de corriente eléctrica. El anticuerpo se suele
marcar, bien con isotopos radiactivos, que
permiten la detección por autorradiografía, o con enzimas que producen un
producto visible cuando se adiciona el
sustrato correspondiente. Más adelante
se desarrollarían otras variaciones que no
utilizan la separación electroforética,
como el dot-blot o slot-blot, que es una
técnica simplificada de las anteriores en la
que las moléculas (ADN o ARN) se detectan en una mancha (un blot) transfiriéndola primero a una membrana y utilizando después una sonda (en el caso de
Northern y Southern-blot) o anticuerpos
(en el caso de Western-blot).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 280
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
280
Los métodos de secuenciación del ADN
fueron desarrollados entre 1975 y 1977,
a partir de dos aproximaciones diferentes
(30); mientras que la primera permite leer
el código genético rompiendo la molécula
de ADN en nucleótidos específicos, la segunda va incorporando nucleótidos que
bloquean la extensión de la síntesis del
ADN, lo que se presta mejor para la secuenciación automática (31).
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
En 1985, Mullis aplicó algunas de las metodologías descritas antes para llevar a
cabo la síntesis de ADN in vitro de forma
exponencial, en un procedimiento que
fue denominado reacción en cadena de
la polimerasa (PCR, de Polymerase Chain
Reaction) (32), metodología que ha sido
considerada una auténtica revolución en
el contexto de la Biología Molecular, y que
permite el análisis tanto de ADN como de
ARN a partir de cantidades minúsculas de
muestras de cualquier origen y para la que
se han desarrollado multitud de aplicaciones diagnósticas. En 1993, K. B. Mullis
recibió el Premio Nobel de Química.
La PCR es una tecnología poderosa que
implica la síntesis enzimática, in vitro, de
millones de copias de un fragmento específico de ADN sobre la base de ciclos
sucesivos de amplificación exponencial, y
todo ello a partir de una mezcla compleja
de ADN. La reacción se basa en la hibridación y extensión de un par de oligonucleótidos, sintetizados artificialmente, que
se utilizan como iniciadores o cebadores
(primers) que delimitan la secuencia de
ADN de doble cadena que se desea amplificar y que son secuencias cortas de alrededor de 20 nucleótidos, orientados en
direcciones contrarias (forward -5’→3’ y
reverse 3’→5’), cuyo diseño constituye
parte principal de la técnica. A partir de
los primers, en presencia de una enzima
ADN polimerasa termorresistente (Taq-polimerasa) y de oligonucleótidos, se lleva a
cabo la síntesis exponencial.
Cada ciclo de amplificación, de los que en
la reacción se producen entre 25 y 40,
tiene lugar en tres fases o etapas: en
primer lugar, la desnaturalización del ADN
problema, seguido del alineamiento y finalmente la extensión. La desnaturalización se lleva a cabo, de ordinario, a 95 °C
y la separación permite que cada hebra del
ADN sirva de molde o plantilla para la síntesis de una nueva molécula. El tiempo de
desnaturalización depende de la longitud
de la plantilla y de ordinario oscila entre
30 segundos y 1 minuto. Debido a que al
comienzo de la amplificación es necesario
separar todo el ADN de la muestra en estudio, inicialmente se lleva a cabo, por una
sola vez, una incubación a 95 °C durante
5 minutos. Después se produce la alineación entre los primers y el ADN molde, que
se lleva a cabo entre 45 y 60 °C. Sigue
luego la intervención de la ADN-polimerasa, que se une complementariamente a
los nucleótidos libres y a la secuencia del
molde. La extensión se lleva a cabo a la
temperatura de máxima eficiencia de la
enzima (72 °C) y el tiempo necesario para
ello dependerá de la distancia entre los
primers. Se ha calculado que la polimerasa es capaz de incorporar 60 nucleótidos por segundo a 70 °C por lo que en
1 minuto pueden incorporarse más de
1.000 pares de bases (pb). En cada ciclo
de amplificación se produce de forma logarítmica un número de copias equiva-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 281
Sanidad animal y biotecnología
281
lente al exponente del número de cadenas del molde de ADN disponibles (33).
El alineamiento (emparejamiento) es, seguramente, la fase más crítica de la amplificación, puesto que se basa en la complementariedad entre las bases nitrogenadas
del molde (el ADN problema) y los primers. Factores como la temperatura,
entre otros, influyen decisivamente, en relación con la cantidad de ADN disponible,
en la especificidad de la reacción. En el
diagnóstico de enfermedades infecciosas,
con esta magnitud de amplificación es
posible el análisis de moléculas de ADN o
ARN a partir de cantidades mínimas de
muestra; por ejemplo, si consideramos
que una bacteria contiene 10-9 g de ADN,
la amplificación por PCR permitirá generar
alrededor de 0,1 µg (esto es, 10-6 g) de
una región específica de ADN de origen
bacteriano, lo que supone, en la práctica,
poder identificar secuencias presentes en
tan solo 10 o 50 copias de ADN presentes
en una muestra de origen clínico, y todo
ello sin condiciones especiales de mantenimiento (en teoría podría llevarse a cabo
el diagnóstico a partir de tan solo una
copia).
El método más utilizado para la visualización del producto amplificado es la electroforesis en agarosa (Southern), en la que
se produce la migración eléctrica del ADN
amplificado, proporcionalmente al tamaño.
Las técnicas de PCR también presentan
problemas de ejecución, por lo general
debidos a la inhibición por factores que
anulan la actividad polimerasa. La gran
sensibilidad es su inconveniente principal,
pues facilita errores debidos, por ejemplo,
a la falta de esterilidad, que puede llevar
a la amplificación de ADN que no se corresponde con el de la muestra que se investiga. Se aconseja, por ello, la separación de fases y la limpieza exhaustiva de
la superficie de trabajo entre pruebas (el
uso de lejía, otros desinfectantes, lámparas ultravioleta y psoraleno son habituales). En los laboratorios donde se llevan
a cabo este tipo de determinaciones, la
muestra se prepara en un lugar distinto
de aquel en el que está alojado el termociclador, con cabinas de seguridad biológica para reducir ambientes cargados de
amplicones correspondientes a microorganismos, además de la inclusión de todo
tipo de controles-testigos. En el diseño de
primers debe tenerse en cuenta que cada
uno debe integrar entre 18 y 24 bases; si
son demasiado cortos, se pierde especificidad, y si son demasiado largos, se pierde
rendimiento. Por otra parte, la proporción
óptima entre bases púricas y pirimídicas
debe ser de 1:1 (con una oscilación admitida del 40-60%) y que comiencen y terminen con una o dos bases púricas.
Finalmente, los primers no deben incluir
en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, para evitar la formación de dímeros.
Variaciones
Se pueden considerar los siguientes tipos
de variaciones en la denominada PCR básica (34):
• PCR específica de alelo. Se utiliza para
identificar los polimorfismos de una sola
base (SNPs) en el diagnóstico y clonación.
• PCR “ensamblado”. Lleva a cabo la síntesis artificial de largas secuencias de
ADN en una PCR con oligonucleótidos
largos, con secuencias solapantes cortas.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 282
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
282
• PCR asimétrica. Para amplificar preferentemente una cadena de ADN original con respecto a la otra.
• PCR cuantitativa. Para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo real).
• PCR de colonia. Para el estudio de colonias de bacterias.
• PCR-TAIL (PCR termal de entrelazado
asimétrico). Para aislar una secuencia
desconocida que flanquea otra conocida.
• Amplificación dependiente de helicasa. Utiliza la enzima helicasa y una
temperatura constante, en lugar de la
polimerasa de ADN y los ciclos repetidos
de desnaturalización-extensión.
• PCR “hot-start” (de arranque en caliente). Reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales.
• PCR específica de intersecuencia
(ISSR). Se utiliza en la determinación de
la huella genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia
simple, para producir una huella genética única, de longitudes de fragmento
amplificadas.
• PCR inversa. Solo cuando se conoce
una secuencia interna. Es muy útil en la
identificación de secuencias flanqueantes a secuencias de inserción (IS).
• PCR mediada por ligación. Utiliza pequeños empalmadores o enlazadores de
ADN ligados al ADN de prueba y múltiples primers hibridando a estos.
• PCR específica de metilación (MSP).
Para detectar metilaciones en islas CpG
(alta concentración de pares C-G que
habitualmente conforman promotores)
de ADN genómico.
• Amplificación múltiple dependiente
de sonda (MLPA. Multiplex Ligationdependent Probe Amplification).
Permite amplificar varias secuencias objetivo con un único par de primers, evitando las limitaciones de resolución de
la PCR multiplex.
• PCR “touchdown”. Una variante que se
utiliza cuando se desconoce la secuencia
exacta de los extremos de la secuencia a
amplificar, asumiendo que puede existir
alguna base desaparecida en el alineamiento primer-secuencia. Reduce el
fondo de inespecificidad bajando gradualmente la temperatura de hibridación
a lo largo del progreso de la PCR.
• PAN-AC. Utiliza condiciones isotermas
para la amplificación y puede ser utilizado en células vivas.
Tipos de PCR
Se consideran los siguientes, principales:
• PCR anidada. El producto de amplificación es utilizado como molde para
una segunda amplificación con primers
que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Es un tipo de PCR
muy específica y muy sensible.
• PCR in situ. Especialmente adaptada
para llevar a cabo determinaciones en
secciones de tejidos o en células, donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación, ordinariamente sobre preparaciones fijadas
en un portaobjetos. Se lleva a cabo una
primera amplificación de ADN en blanco
y luego se detecta mediante hibridación
in situ convencional con sondas de ADN/
ARN, lo que permite una gran sensibilidad.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 283
Sanidad animal y biotecnología
283
• PCR multiplex. Se amplifica más de
una secuencia en la misma reacción.
Utiliza dos o más parejas de primers en
un único tubo con el fin de amplificar
simultáneamente múltiples segmentos
de ADN. Combina en una única reacción todos los pares de primers correspondientes a los sistemas que se desean
amplificar simultáneamente y obtiene la
información correspondiente a varios
loci en una reacción única, con lo que
precisa menor cantidad de ADN molde
para el análisis, además de menor cantidad de reactivos y de que permite una
rápida construcción de los datos.
• PCR con transcriptasa inversa (RTPCR). Utiliza ARN como molde inicial en
lugar de ADN y una transcriptasa inversa
para llevar a cabo la síntesis de ADN
complementario al ARN (ADNc). Puede
utilizarse para el estudio de ARNm casi
a nivel de una célula individual, para determinar la presencia o ausencia de un
transcripto, para estimar el nivel de su
expresión y para el clonado de ADNc, sin
necesidad de construir una genoteca.
La reacción consiste en la síntesis de una
cadena de ADN a partir de ARNm por
medio de la enzima transcriptasa inversa
(reversa), por lo general, extraída de
virus tumorales de ARN, que utiliza ARN
como molde o plantilla para sintetizar
una cadena de ADN. La cadena complementaria se sintetiza por PCR. Ciclos sucesivos de PCR estándar permiten disponer de cantidades apropiadas de
ADNc para diversas utilidades.
• PCR en tiempo real (Real Time-PCR)
o PCR cuantitativa (qPCR, Q-PCR). Es
una variante utilizada para amplificar y
cuantificar de forma absoluta, simultá-
neamente, el producto de la amplificación del ADN o ARN presentes en la
muestra original o para identificar con
una muy alta probabilidad de certeza
muestras de ADN específicas a partir de
su temperatura de fusión.
Como en la PCR convencional, utiliza un
molde o plantilla de ADN, al menos un
par de primers específicos, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), un tampón
de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable, mezcla a la que se
le adiciona una sustancia marcada con
un fluorocromo que, al ser excitado a la
longitud de onda adecuada, permite
medir la tasa de producción de uno o
más productos específicos. La medida se
realiza después de cada ciclo de amplificación.
En muchos casos, el molde o plantilla
no es desde el principio ADN, sino que
puede ser ADNc (complementario), de
una cadena, obtenido por retrotranscripción del ARN, en cuyo caso se denomina RT-PCR cuantitativa o RT-PCR en
tiempo real, o también RT-Q-PCR (35).
La PCR en tiempo real es la metodología
más moderna para el estudio de la expresión génica (junto a los microarrays
o micromatrices), aunque otros métodos tradicionales, como el Northernblot, también permiten su abordaje. A
diferencia de la PCR estándar, en la que
la cantidad de producto final no siempre
refleja la cantidad de ADN molde presente antes de la amplificación, la PCR
en tiempo real (RT-PCR) sí permite averiguar cuánto ADN o ARN molde (este
último convertido en ADNc mediante
una transcriptasa inversa) existe en una
muestra problema. A tal efecto, en la
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 284
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
284
mezcla de reacción se incorpora una
sonda marcada con un colorante fluorescente, un fluorocromo (o fluoróforo),
cuantificando la señal durante la fase
exponencial de la reacción. En los ciclos
iniciales la fluorescencia va aumentando
a medida que se van acumulando logarítmicamente los productos de PCR,
pero como a medida que avanzan los ciclos de PCR también se van gastando
los sustratos y disminuye la eficacia de
la polimerasa, al final, aunque la tasa de
producto aumenta, la progresión ya no
es exponencial.
La PCR en tiempo real se lleva a cabo en
un termociclador capaz de hacer incidir
sobre cada muestra un haz de luz de
una longitud de onda determinada y detectar la fluorescencia emitida por un
fluorocromo excitado, permitiendo a la
vez calentar y enfriar rápidamente las
muestras para aprovechar las capacidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de las ADN polimerasas. Este tipo de termocicladores
registran de forma continua la cantidad
de producto generado, de ahí el nombre
(real time, en tiempo real).
La PCR en tiempo real incluye variantes
basadas en el uso de fluorocromos inespecíficos y otras basadas en sondas moleculares específicas, dependientes de la
secuencia. En las primeras, el ADN, que
multiplica su cantidad con cada ciclo, se
une de forma inespecífica al fluorocromo produciendo fluorescencia, que
es medida por el termociclador, que detecta así la generación exponencial del
ADN de doble cadena. En definitiva, los
flurocromos inespecíficos, del que es
ejemplo el “SYBR-Green Dye”, detectan
la generación exponencial de ADNbc
mediante su unión inespecífica con él.
Permite cuantificar una sola secuencia
por reacción pero tiene la ventaja de
que utiliza solo un par de primers normales, lo que abarata su coste, pero
solo es capaz de amplificar un producto
en cada reacción.
Las técnicas basadas en sondas específicas
utilizan una sonda unida (al menos un oligonucleótido) a dos fluorocromos, que hibrida en la zona intermedia entre el primer
directo (forward) y el inverso (reverse), es
decir, en el amplicón. Incluyen, por ejemplo, sondas tipo Taqman, que están marcadas con un fluorocromo en el extremo
3’ y un bloqueante (quencher) en el extremo 5’. Cuando la sonda está intacta,
presenta una transferencia energética de
fluorescencia por resonancia (FRET), que
no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, debido a la degradación de la
Figura 8. Sondas inespecíficas en q-PCR. SYBR “ Green Dye (http://www.nfstc.org) y específicas, tipo Taqman
(www.en.wikipedia.org).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 285
Sanidad animal y biotecnología
285
sonda mediante la actividad 5’-3’ exonucleasa de la ADN polimerasa, o bien a la
separación física de los fluorocromos por
un cambio en la conformación de la
sonda, lo que permite monitorizar el
cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen. En
definitiva, en la PCR, cuando la polimerasa
encuentra la sonda, la hidroliza y separa el
bloqueante, permitiendo la fluorescencia,
que se relaciona con la cantidad de amplicón. Otras sondas utilizables incluyen los
tipos “Molecular Beacons” y “Scorpion”.
La técnica de PCR a tiempo real (Q-PCR)
elimina cualquier proceso post-PCR,
puesto que monitoriza la progresión de la
amplificación en el momento en que se
produce. A diferencia de la PCR convencional (también denominada de punto
final), que mide la acumulación del ADN
al final de un número determinado de ciclos, con la Q-PCR la medición se lleva a
cabo durante el proceso de amplificación
mediante fluorescencia, de tal forma que
su aumento es proporcional a la cantidad
de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente utilizando un sistema
que lleve a cabo la amplificación y que a
la vez sea capaz de leer la fluorescencia.
En la PCR en tiempo real, debido a su elevada sensibilidad, uno de los puntos críticos está representado por la calidad del
material de partida, lo que supone que la
extracción de los ácidos nucleicos revista
una importancia fundamental, en lo que,
pese a los avances realizados, aún se carece de un sistema automático y universal
que se pueda utilizar con cualquier tipo
de muestra.
La variabilidad que se introduce en la
cuantificación y que conlleva un error en
la estima deriva de la integridad del ADN
y de la eficiencia enzimática, entre otros
factores, razón por la que se han desarrollado numerosos sistemas de estandarización, desde los que cuantifican de forma
absoluta la expresión génica a los que lo
hacen de forma relativa para el gen de
prueba respecto de otro, al que se suele
denominar “normalizador”, seleccionado
en base a su expresión casi constante.
Estos genes normalizadores suelen denominarse “house-keeping genes” por su
implicación habitual en funciones básicas
de supervivencia celular, lo que implica expresión constitutiva. De este modo, efectuando en cada experimento la medida
de los genes de interés y dividiéndolos por
la expresión del gen normalizador seleccionado, se pueden comparar los primeros aun sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión. Son genes
normalizadotes comunes los que codifican para la tubulina, gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, ARN ribosomales, etc.
La PCR permite identificar y genotipar la
especie y cepa implicada en un proceso
infeccioso determinado, para lo cual se
amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas
características de tamaño o temperatura
de fusión que permitan identificarlo de
forma inequívoca. En el caso de infecciones víricas que impliquen la integración
del genoma del patógeno en el ADN del
hospedador, la PCR cuantitativa posibilita
la determinación de la carga viral existente y, por tanto el estadio de la enfermedad (36).
En estudios de expresión génica se utiliza
una PCR en tiempo real, pues los transcritos de ARNm pueden copiarse y ampli-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 286
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
286
ficarse mediante la transcriptasa inversa
(a la que también se la designa como RT,
de reverse transcriptase, lo que introduce
alguna confusión con la RT de real time).
En este caso, el procedimiento proporciona una medida del nivel de transcripción del gen correspondiente a la secuencia de los primers utilizados. A veces
este método se denomina RT-RT-PCR (Real
Time-Reverse Transcriptase-PCR) (37).
Amplificación isotérmica
La amplificación isotérmica resulta de convertir, en forma cíclica, una molécula de
ARN a otra de ADNbc y, a partir de ella,
llevar a cabo la transcripción a ARN, el
cual sirve de molde para un nuevo ciclo
de amplificación (38). Se requieren dos
primers que definen el ARNm a amplificar
y uno de ellos contiene, además, una secuencia “promotora” para la enzima que
realiza la transcripción, la ARN polimerasa.
Además de esta última, participan también una transcriptasa reversa y una
ARNasa H.
La amplificación isotérmica solo amplifica
ARN y su principal aplicación reside en el
diagnóstico y cuantificación de procesos
infecciosos originados por virus ARN. La
cuantificación se realiza coamplificando el
ARN de la muestra conjuntamente con
calibradores internos o ARN de concentración conocida, y se mide mediante
electroquimioluminiscencia (39) .
Hibridación de ADN ramificado (Branched DNA)
Se basa en hibridaciones sucesivas con
sondas que reconocen, por una parte, la
secuencia de ADN o ARN problema y, por
otra, secuencias introducidas en la reacción para amplificar la señal de hibrida-
ción (40). Esta metodología, que es altamente reproducible, se utiliza en enfermedades infecciosas humanas para la
cuantificación de ácidos nucleicos en pacientes de VIH o hepatitis B y C.
Micromatrices (microarrays) de ADN
Aunque la terminología utilizada para
este tipo de técnicas es muy variada y se
utilicen términos como biochip, DNA
Chip, gene array o gene chip, el término
microarray (micromatrices) es el que parece que cuenta con mayor aceptación internacional.
Los microarrays son series de matrices espacialmente ordenadas, con ligandos
(sondas de ADN) químicamente inmovilizados en puntos concretos o en una
matriz sólida, como un fragmento de vidrio (portaobjetos) o de propileno (41).
En la práctica de la reacción diagnóstica,
las sondas del microarray se incuban con
las muestras sospechosas, de prueba, que
contienen el material genético en estudio, previamente marcado, de tal modo
que, al producirse la hibridación, se produce una señal en la celda reconocida,
que es anotada. Un microarray es, pues,
un dispositivo basado en la hibridación
molecular.
Como matrices pueden utilizarse distintos
tipos de materiales, como vidrio, silicona
o nailon. En ellos se fijan o “imprimen”
sondas (spots) de oligonucleótidos (fragmentos de ADN) conocidos, y en una ubicación precisa, para lo que se dispone de
robots que realizan el trabajo de forma
automática. Sobre ellos se sitúan o “hibridan” fragmentos de ADN desconocido,
procedentes de tejidos o muestras de pacientes. En caso positivo, las bases complementarias se reconocen y se visualiza
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 287
Sanidad animal y biotecnología
287
su hibridación mediante el uso de sustancias fluorescentes, aunque también se
puede utilizar quimioluminiscencia o radiactividad.
La miniaturización permite el anclaje, en
unos pocos centímetros, de cientos o varios miles de “spots” de oligonucleótidos,
alineados en filas y columnas, cada uno de
los cuales se corresponde a una secuencia
específica del ADN. De ordinario se utilizan
entre 5.000 y 8.000 sondas, que representan la totalidad de genes expresados
por un microorganismo (42), pudiéndose
alcanzar 20.000, 60.000 sondas en un
único soporte y aún muchas más (43).
De esta reacción se obtiene un puzle en
el que la lectura de los puntos marcados
permite identificar la presencia o ausencia
de los diferentes fragmentos y componer
un cuadro genómico o huella genética
para la muestra problema. La identificación puede ser, en ocasiones, laboriosa y
puede precisar de la ayuda de algoritmos
y programas informáticos que ayuden a
la interpretación de los resultados.
Cada mancha de muestra es de tan solo
10 µm de diámetro. Para preparar las matrices se pueden utilizar ADN complementarios de partes de genes seleccionados
de los patógenos; sin embargo, si se va a
investigar un gran número de patógenos,
entonces sería más fácil desde un punto
de vista logístico utilizar oligonucleótidos
grandes, por ejemplo, de alrededor de
70 nucleótidos, como ocurrió durante la
identificación y los estudios epidemiológicos en la epidemia de SARS.
Los microarrays son un sistema de detección de alto rendimiento que permite la
identificación simultánea de un gran número de moléculas diana (analitos o deter-
minantes genéticos o antigénicos) que se
unen específicamente al ligando inmovilizado del array, siendo después leídos en
un escáner, originando un patrón de luz
característico. Los datos obtenidos se interpretan informáticamente, procesándose
sobre datos previamente almacenados, por
lo que la ausencia de estandarización hace
difícil la aplicación de programas informáticos universales. Su importancia en el diagnóstico se prevé tan importante como lo
es en el presente la PCR.
Esta técnica, aunque habitualmente se
asocie al estudio del ADN, también se
puede aplicar al estudio de las proteínas
e hidratos de carbono, y constituye una
auténtica revolución en el campo de la
Bioinformática; debe recordarse que hasta
hace pocos años este tipo de estudios estaba limitado al de un pequeño número
de genes simultáneamente.
Los microarrays permiten:
• Medir la expresión de genes (microarray
expression analysis).
• Estudiar la mutación de un gen (microarray for mutation analysis).
• Estudiar la presencia de genes o su expresión relacionados con factores de virulencia, como elemento decisivo en relación con los estudios de patogénesis
de las enfermedades infecciosas.
• Llevar a cabo el genotipado, análisis de
expresión y secuenciación de genes de
interés, en relación con agentes patógenos.
Los microarrays de ADN que se comercializan en la actualidad incluyen:
• Microarrays de alta densidad: este
tipo de microarrays permite una gran
densidad de integración y la realización
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 288
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
288
de un importante número de ensayos
de manera simultánea. Hasta el momento, la empresa líder en microarrays
de alta densidad es Affimetrix.
• Microarrays de media y baja densidad: suelen utilizarse para trasladar a
una escala más práctica los resultados
obtenidos con microarrays de alta densidad. Son importantes cuando lo que
se busca es fiabilidad y flexibilidad.
En la práctica, el ácido nucleico se extrae
a partir de una muestra y se realiza una
RT-PCR empleando oligonucleótidos cebadores al azar. De esta manera, parte de
todos los ácidos nucleicos de la muestra,
tanto de origen hospedador como patógeno, se amplifican. Estos productos de
PCR, representativos de cada ácido nucleico de la muestra, se marcan con un
colorante fluorescente y se aplican a la
micromatriz. En condiciones óptimas solo
el ADN procedente del patógeno se unirá
al ADN del portaobjetos.
Se pueden diseñar micromatrices para detectar patógenos a distintos niveles de diferenciación; por ejemplo, se pueden preparar oligonucleótidos capaces de detectar
y diferenciar patógenos a nivel de género.
Se elegiría un número, diez, por ejemplo,
de oligonucleótidos con un grado elevado
de conservación de secuencia (oligonucleótidos consenso) dentro de un género
dado, de modo que una sonda fabricada
a partir de una muestra de campo que
contenga un miembro de este género
probablemente hibridaría con al menos
alguno de los nucleótidos, mientras que
no hibridaría (o lo haría en menor grado)
con aquellos correspondientes a los géneros relacionados (por ejemplo, para diferenciar aislados de Apthovirus, cau-
santes de la fiebre aftosa, FMDV) a partir
de cepas de Enterovirus de la familia
Picornaviridae. Después se podrían seleccionar otros juegos de oligonucleótidos,
colocarlos en el mismo porta de la matriz,
capaces de caracterizar un patógeno de
forma más específica, (p.ej. para diferenciar los siete tipos de FMDV e incluso potencialmente afinar después a nivel de
subtipo).
En los últimos años, la tecnología de microarrays ha emergido como el método
de elección para estudios de genómica
funcional, de expresión génica a gran escala, proporcionando un procedimiento
eficiente y rápido para investigar el transcriptoma completo de una célula o un microorganismo, es decir, el conjunto de
genes que en un momento dado se están
expresando en ella (que han sido transcritos a ARNm), por lo que su análisis permite estudiar la expresión diferencial en
diferentes estados. En este caso particular,
el análisis mediante micromatrices permite conocer cuánto ADN o ARN (ADNbc)
está presente en una muestra, permite
identificar y genotipar especie y cepa; es
una metodología adecuada en el caso de
agentes de difícil cultivo, cultivo lento o
incultivables, con una gran sensibilidad,
además de corto tiempo de obtención de
datos, aun en el caso de infecciones víricas con integración del genoma vírico en
el de la célula hospedadora, como sucede
en retrovirus, permite determinar la carga
viral y el estadio de la enfermedad y, en
definitiva, en estudios de expresión génica
proporciona una medida del nivel de
transcripción del gen.
Aunque ningún campo se ha beneficiado
más de este tipo de tecnología que los estudios de patogénesis (ver después), los
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 289
Sanidad animal y biotecnología
289
microarrays poseen también numerosas
aplicaciones en la clínica humana y veterinaria, tanto en lo que se refiere al diagnóstico como en la identificación de
nuevas dianas terapéuticas. En la actualidad, las potencialidades en Sanidad
Animal son enormes (44) en función de
que la gran cantidad de información disponible procedente, sobre todo de experimentos científicos está generando un
nuevo tipo de software analítico (45).
Claramente, el análisis de micromatrices
presenta un enorme potencial cuando se
investigan enfermedades de etiología desconocida, enfermedades en las que
puede estar presente más de un patógeno (se pueden buscar cientos de patógenos de manera simultánea sobre una
única micromatriz) y cuando se precisa la
subtipificación. Para mejorar la sensibilidad en la detección de los patógenos se
pueden complementar las micromatrices
con amplificaciones por PCR que se diseñan para amplificar uno o más genes
conservados o secuencias múltiples, y
también mediante el uso de biosensores.
En el caso de Salmonella, por ejemplo, un
patógeno de importancia en Salud Pública y en Sanidad Animal, por su condición
de patógeno o al ser algunas especies
animales reservorios de ellas, se han desarrollado microarrays (Ahn y Walt, 2005)
(46) con oligonucleótidos de los genes
invA y spvB, con una sensibilidad de 103
a 104 ufc/ml después de 1 hora de hibridación a partir de una mezcla que contenía otros patógenos comunes. También
se han desarrollado para otros patógenos
de interés en este campo, como sucede
con E. coli 0157:H7 (47), un patógeno de
triste actualidad (por aproximación en el
curso del presente año) en el que los au-
tores incorporaron cuatro genes de virulencia, los correspondientes a la intimina,
las toxinas stx-I y II y la hemolisina A, demostrándose hasta 32 veces más sensible
que las PCR convencionales para la detección, y el caso que corresponde a otros
patógenos de origen animal transmitidos
por alimentos, como Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens (48), que
incorpora los genes de las toxinas producidas por ambos, o un método de detección de Mycobacterium spp. basado en
una proteína de shock térmico que permite su detección a partir de mezclas
complejas (49). También, en el caso de
Bacillus anthracis, Burton et al. (2005) (50)
desarrollaron un microarray para la detección y diferenciación de este patógeno.
En el caso de los virus, Liu et al. (2006)
(51) desarrollaron un microarray para la
detección de los virus del PRRS y fiebre aftosa a partir de dos secuencias del primero y una secuencia del virus aftoso. Por
último, señalaremos la realización de microarrays para la detección de multipatógenos, como el sistema desarrollado por
Wilson et al. (2002) (52) para la detección
de un total de 18 patógenos, incluyendo
procariotas, eucariotas y virus.
Es seguro que el futuro de esta tecnología
es muy halagüeño desde el punto de vista
diagnóstico, aunque es de esperar que los
reactivos y el equipamiento de las micromatrices sean menos costosas a medida
que se popularice su uso, lo que conducirá a una mayor aplicación en el diagnóstico de las enfermedades animales, permitiendo la investigación de los virus o la
caracterización de las cepas bacterianas
en términos de virulencia, sensibilidad antimicrobiana u otros marcadores importantes.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 290
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
290
Proteómica
El estudio de las proteínas es un recurso
crucial en el diagnóstico en Sanidad Animal. Su aproximación puede llevarse a
cabo mediante dos estrategias principales
disponibles en la actualidad, que permiten
identificar moléculas orgánicas e inorgánicas en modo rápido, fiable y con alto
rendimiento. El estudio e identificación de
proteínas (proteómica) puede considerarse paralelo a la genómica, permitiendo
conocer las proteínas codificadas por un
genoma en particular y llevar a cabo una
predicción de los iones que se generan
durante la fragmentación en los diferentes sistemas de análisis, obteniendo así
“huellas digitales” que permiten identificar una molécula exacta por comparación con las generadas teóricamente a
partir de las bases de datos genómicas.
También puede utilizarse para identificar
secuencias de ADN, lo que permite llevar
a cabo un análisis rápido y automatizado
de productos de PCR (puede utilizarse,
por ejemplo, en ensayos de PCR multiplex
y se ha probado en la práctica con numerosos patógenos respiratorios, incluyendo
virus y agentes patógenos de otro tipo, de
procedencia humana) (53).
Por un lado, la electroforesis bidimensional (EBM) separa mezclas complejas de
proteínas e informa del estado de la infección o los efectos de una terapia determinada o la influencia del ambiente,
igual que permite el estudio del momento
del ciclo celular o el efecto de mutaciones.
En la primera fase, las proteínas son separadas según su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque), y en la segunda, lo son atendiendo a su tamaño molecular, que
condiciona su movilidada electroforética
en una técnica de SDS-PAGE (tratamiento
detergente seguido de electroforesis en
gel de poliacrilamida). En la actualidad, la
electroforesis bidimensional diferencial en
gel (DIGE) es la tecnología más fiable.
Marca las proteínas con FC espectralmente diferenciables y permite procesar a
la vez varias muestras. Reduce la variabilidad entre geles al analizar muestras en el
mismo gel, a la vez que garantiza la fiabilidad estadística como consecuencia de
utilizar réplicas biológicas y fluorocromos
de gran sensibilidad y rango lineal, además
de un software único (DeCyder).
En lo que se refiere a la espectrometría de
masas (EMS), puede definirse como una
técnica analítica que mide iones derivados
de moléculas, después de su tratamiento.
Utiliza espectrómetros de masas que analizan con precisión la composición de diferentes elementos químicos e isótopos
atómicos, separando los núcleos en función de su relación masa-carga, pudiendo
utilizarse tanto para identificar los diferentes elementos que forman un compuesto como para determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en
un mismo compuesto. En la práctica, el
EMS calienta hasta vaporizarlo, e ionizar
los diferentes átomos, un haz del material procedente del compuesto de prueba.
El haz de iones produce un patrón específico en el detector, que permite analizar
el compuesto.
El espectrómetro de masas tipo MALDITOF utiliza una técnica de ionización suave
(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) acoplada con un detector de iones
(Time-Of-Fligh), en definitiva, un método
de deserción/ionización láser asistida por
matriz y un detector de iones (MALDITOF-TOF). La técnica es rápida, fiable y de
alto rendimiento y permite el análisis de
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 291
Sanidad animal y biotecnología
291
biomoléculas (proteínas, péptidos, azúcares, secuencias de ácidos nucleicos, amplicones…), incluso de grandes moléculas
orgánicas, frágiles cuando son ionizadas
por métodos convencionales. MALDI-TOF
obtiene “huellas peptídicas digitales” o
tándem MS, con las que identifica las moléculas por comparación con bases de
datos.
lógica (el biomarcador o marcador biológico) aprovechando la especificidad de las
interacciones biomoleculares, reaccionando con ella, y un transductor o sensor
capaz de interpretar la reacción de reconocimiento biológico que produce el receptor y “traducirla” en una señal eléctrica cuantificable a través de un sistema
“de salida”.
Biosensores. Aplicación al diagnóstico
molecular
Los dos constituyentes del biosensor están
integrados formando una unidad y es precisamente esta unión íntima la que confiere al dispositivo sus especiales características de sensibilidad y selectividad (55).
Un biosensor es un dispositivo de análisis
que convierte una señal biológica en una
señal eléctrica (figura 9). Según la IUPAC
(International Union of Pure and Applied
Chemistry), un biosensor es “un sistema receptor-transductor, integrado en un dispositivo capaz de proporcionar información
analítica selectiva, cualitativa y cuantitativa
utilizando un elemento de reconocimiento
biológico” (54). Se trata pues de un dispositivo o sistema compacto, integrado
por dos elementos, un receptor biológico
(biorreceptor), que es el biosensor propiamente dicho, preparado para detectar específicamente una sustancia o señal bio-
El biorreceptor es, sin duda, el componente más crucial del sistema biosensor;
es la clave de su especificidad y puede clasificarse en diferentes grupos, de acuerdo
con su composición o carácter. En general, incluyen anticuerpos, enzimas, ácidos
nucleicos (ADN), receptores o componentes celulares (células completas, membranas, otros componentes subcelulares,
como mitocondrias, proteínas no enzimáticas, sistemas celulares, secciones de tejidos, etc.), que responden básicamente a
Figura 9. Esquema de componentes principales de un biosensor (56).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 292
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
292
procesos biocatalíticos (el caso de las enzimas), inmunológicos (el caso de los anticuerpos) y genómicos (el ADN). Su función consiste en proporcionar especificidad
y selectividad, respondiendo únicamente
a un analito en particular o una molécula
de interés, evitando de este modo reacciones cruzadas o interferencias con otras
sustancias.
El transductor desempeña un importante
papel en el proceso de detección. Como
transductores pueden utilizarse, principalmente, dispositivos electroquímicos, ópticos y mecano-acústicos. También se describen transductores piezoeléctricos y
calorimétricos o térmicos. Cada uno de
estos grupos puede dividirse en tipos marcados y no marcados según que el efecto
se mida directamente o mediante la detección de una señal particular dependiente del marcador utilizado, siendo
estos últimos, generalmente, los más utilizados.
Además de la sensibilidad y la selectividad, una de las características fundamentales de los biosensores es la posibilidad de realizar el análisis de la sustancia
a determinar en tiempo real y de forma
directa (sin necesidad de marcador) a diferencia de cualquier análisis biológico o
clínico que requiere siempre un marcador
(ya sea colorimétrico, fluorescente o radioactivo). Estas características permiten
la posibilidad de realizar análisis cualitativos y cuantitativos, además de evaluar
la cinética de la interacción (constante de
afinidad, asociación, disociación…) y, por
tanto, dilucidar los mecanismos fundamentales de dicha interacción.
En el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, los receptores comunes son las
secuencias de ácidos nucleicos y los anticuerpos. Los primeros se utilizan como receptores tipo sonda, del mismo modo que
lo hacen en una hibridación, mientras que
los segundos captan los antígenos específicos correspondientes.
En la clasificación pueden utilizarse distintos criterios. Si se considera el tipo de
interacción, esta puede ser biocatalítica
(se basa en el uso de sistemas que contienen enzimas o multienzimáticos) o de
afinidad. Si es el tipo de interacción el
considerado, puede hablarse de interacción directa o indirecta
En relación con el marcaje de las moléculas, existen biosensores marcados y no
marcados: los primeros detectan una señal
o marcaje específico, como puede ser la
fluorescencia o la actividad enzimática;
son los más utilizados. Los no marcados
miden directamente la reacción bioquímica en la superficie del transductor.
Respecto del tipo de transductor, se incluyen: biosensores ópticos o fotométricos, que se basan en la recepción de luz
que, o bien pasa a través de la muestra o
se refleja; biosensores electroquímicos, en
los que el elemento de reconocimiento
biológico (el receptor bioquímico) es retenido en contacto directo con un elemento
de transducción electroquímica, y, finalmente, biosensores piezoeléctricos y acústicos, que se Zbasan en el uso de cristales
capaces de sufrir una deformación cuando
se les aplica un potencial eléctrico a través
del cual es posible obtener características
de frecuencia de resonancia.
El reconocimiento molecular que tiene
lugar en el receptor biológico requiere la
intervención de la señal biológica o biomarcador, que con la molécula de recono-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 293
Sanidad animal y biotecnología
293
cimiento (biorreceptor) y bajo el desarrollo
de algún tipo de reacción, genera una
señal específica (señal biológica). Las moléculas de reconocimiento se generan en
base al conocimiento del biomarcador relevante, que puede proceder del patógeno
que produce una enfermedad o del propio
hospedador que la padece (57, 58).
Los biomarcadores que proceden del
agente patógeno necesitan ser altamente
específicos, mientras que los derivados del
hospedador enfermo o sospechoso pueden
ser específicos o inespecíficos. Habitualmente, los biomarcadores derivados del
hospedador ofrecen la ventaja añadida de
que muchos pueden generarse para cada
partícula infecciosa.
Los biomarcadores pueden ser ácidos nucleicos, proteínas o metabolitos de bajo
peso molecular. Además de las moléculas
de carácter antigénico, como biomarcadores, la detección de la actividad enzimática en particular derivada de los
agentes infecciosos también tiene valor
diagnóstico, como ocurre con la actividad
ureasa en Helicobacter pylori o la beta-Dglucuronidasa de Escherichia coli. Por su
parte, los cambios en la actividad de determinadas enzimas y derivados del hospedador también han sido utilizados como
indicadores generales de infección bacteriana, como ocurre con la lisozima del
suero y la mieloperoxidasa, así como proteínas de estrés, como la IL-6 y la proteína
C-reactiva. Como hemos señalado, los
biomarcadores derivados del hospedador,
aunque son útiles como indicadores de infección, son menos convenientes para
identificar un agente infeccioso particular,
incluso aunque sean capaces de diferenciar entre etiologías bacterianas y virales,
pero no necesariamente son específicos.
Los biomarcadores basados en los ácidos
nucleicos, derivados del agente patógeno,
son muy importantes, tanto en términos
de la exactitud de su identificación como
del límite de detección (sensibilidad) que
puede lograrse utilizando la amplificación
por PCR. Los sistemas de PCR rápida han
hecho grandes progresos en los últimos
años y se está estudiando su integración
en los sistemas µTAS (sistema de análisis
micro total, Micro Total Analysis Systems)
(59). Estos sistemas de biosensores basados en los ácidos nucleicos pueden ser
plataformas genéricas eficaces, aunque
no pueda diferenciarse entre células vivas
y muertas y el ácido nucleico, en este último caso, pueda degradarse rápidamente.
Como se ha señalado antes, los biorreceptores son las moléculas de reconocimiento. Se incluyen los siguientes tipos:
• Biorreceptores basados en enzimas.
Las enzimas pueden ser utilizadas como
biorreceptores en base a su capacidad
de unión específica al sustrato o debido
a la transformación catalítica de una
molécula en una forma detectable. En
la mayoría de los estudios, la utilidad
más buscada ha sido la capacidad catalítica, y las tres enzimas más utilizadas
son la peroxidasa (de rábano picante),
la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa
(60), siendo su principal limitación la estabilidad de la enzima, que depende de
la temperatura, el pH y otras condiciones, a pesar de lo cual, estas enzimas
son los biorreceptores más utilizados (en
la diabetes, para detectar los niveles de
glucosa en sangre, y también se han
propuesto para detectar bajos niveles de
pesticidas) (61).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 294
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
294
• Biorreceptores basados en anticuerpos. También se les conoce como inmunosensores porque utilizan anticuerpos
como elemento receptor del biomarcador, en base a la reacción antígenoanticuerpo, como es sabido, altamente
selectiva. Aunque las determinaciones
basadas en la reacción antígeno-anticuerpo (inmunoensayos) son de uso
común en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, ninguna de ellas
ha sido suficientemente sofisticada para
permitir su automatización, facilitando
la realización de gran número de muestras en un corto espacio de tiempo. El
desarrollo de los inmunosensores para
el diagnóstico de enfermedades, principalmente humanas, ha merecido últimamente mucha atención, principalmente como consecuencia de esa
necesidad reiteradamente citada de disponer de sistemas rápidos y sensibles
(adaptables y automatizables, si ello es
posible).
Aunque habitualmente los inmunosensores incorporan anticuerpos al sensor
(biorreceptor), también pueden incorporar el antígeno para detectar al anticuerpo, y, en un caso y otro, utilizan
fundamentalmente transductores ópticos y electroquímicos.
• Biorreceptores basados en ácidos
nucleicos (ADN). La detección de secuencias específicas de ADN utilizando
sondas marcadas, no radiactivas, constituyen la base de este tipo de bioreceptores, utilizable para la detección de una
amplia variedad de patógenos, principalmente bacterias o virus. El método
consiste en la inmovilización de una
sonda, un oligonucleótido sintético,
corto, de 20-40 mer (bases repetidas),
cuya secuencia es complementaria a la
de la molécula diana de interés, de tal
modo que la exposición del biorreceptor
a una muestra que contiene la diana da
lugar a la formación de un híbrido. Para
detectar la formación de la doble cadena se han adaptado diversos tipos de
transductores, incluyendo dispositivos
ópticos, piezoeléctricos o electroquímicos, siendo estos últimos los procedimientos más comunes.
Los transductores transforman la señal
biológica en una señal eléctrica, como se
ha señalado. Los transductores electroquímicos incluyen distintas opciones, como
los sensores amperométricos, muy utilizados en el caso de la glucosa, o los potenciométricos [que se han utilizado con
éxito en inmunoensayos de varios tipos
de agentes patógenos, como el virus de
la enfermedad de Newcastle (62), encefalitis equina venezolana (63) o en la detección de E. coli (63) en varios tipos de
alimentos].
Los transductores ópticos son los que más
interés han recibido para el diagnóstico/
detección de enfermedades, como se comentó anteriormente. Este sistema puede
implicar la detección directa del analito de
interés o indirectamente a partir de
sondas marcadas óptimamente, y pueden
agruparse en cuatro tipos de biosensores:
de absorción y reflexión, de quimioluminiscencia, de fluorescencia y de fosforescencia, todos los cuales requieren del uso
de espectrofotómetro.
La espectroscopía de infrarrojos es, en la
actualidad, un instrumento muy popular
para la detección de distintos tipos de microorganismos como E. coli, Mycobacterium spp., Staphylococcus spp., hongos
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 295
Sanidad animal y biotecnología
295
como Candida albicans, etc. (65). El espectrómetro de infrarrojos puede proporcionar una “huella” del microorganismo
revelando cambios en las vibraciones de
los puentes moleculares que informan de
la composición química de la muestra sospechosa, aunque no es lo suficientemente
sensible como para detectar directamente
el agente patógeno a partir de una matriz compleja, como puede ser la sangre,
por ejemplo, por lo que la muestra en estudio necesita ser sometida al cultivo
previo. Puede también utilizarse espectroscopía de luz reflejada, un procedimiento atractivo para la detección de patógenos directamente, sin marcar, como
ocurre en el caso de Salmonella enterica
Enteritidis o Listeria monocytogenes.
La quimioluminiscencia puede ser utilizada para detectar reacciones bioquímicas
específicas. Implica la producción de luz
como resultado de una reacción química
entre un analito y una sustancia fluorescente, por ejemplo, rodamina B. Para algunos investigadores, el transductor quimioluminiscente es el sistema óptico más
conveniente para detectar reacciones antígeno-anticuerpo y otros lo han utilizado
para la detección de ADN. En cualquier
caso es un sistema muy sensible.
Los transductores fluorescentes, que utilizan una fuente externa de luz para iniciar la transición electrónica en un átomo
o molécula, son, probablemente, los métodos de detección más sensibles y se han
utilizado para la detección de varios microorganismos y toxinas microbianas,
como B. anthracis, Francisella tularensis,
toxina colérica, enterotoxina estafilocócica, toxina botulínica, etc., comparándola
con el ELISA estándar.
Aunque las primeras descripciones de biosensores se produjeron hace ya casi 40
años, no hace más de 15 que comenzaron
a difundirse y comercializarse, especialmente en el campo de la salud, aunque el
campo de aplicación ha sido limitado. Sin
embargo, las nuevas tecnologías en los
campos de ingeniería de proteínas, nanotecnología, Biología Molecular e Inmunología, han reavivado el interés por este
campo, a la vez que los avances en genómica y proteómica identificando nuevos
biomarcadores de enfermedades, incluyendo enfermedades infecciosas, han permitido desarrollos de gran interés práctico
(66).
En la actualidad, los biosensores representan un campo con una tasa de expansión impresionante, estimada en más del
60% anual en los últimos años, en su mayoría dependiente de la industria referida
a la salud humana (por ejemplo, en relación con la diabetes, los biosensores de
glucosa han acaparado la atención de los
especialistas), aunque pueden ser perfectamente aplicables a la evaluación de alimentos, la vigilancia del medio ambiente
o la Sanidad Animal (especialmente en el
caso de animales de compañía). Se ha calculado que más del 30% del mercado de
análisis de todo tipo, a nivel mundial, estimado en más de 12.000 millones de
análisis al año, lo acapara cuanto se refiere a la salud humana, permaneciendo
por ello abiertas grandes posibilidades de
expansión a otras áreas, incluyendo, evidentemente, a la Sanidad Animal y las
ciencias veterinarias en general (por
ejemplo, para el control de la fertilidad en
especies de renta y seguridad alimentaria,
tanto en lo que se refiere a la contaminación con agentes patógenos como en re-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 296
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
296
lación con la composición y fraudes, etc.)
(67). Algunas compañías pretenden comercializar esta tecnología actualmente
en el campo veterinario (68, 69), incluyendo biosensores para la detección de E.
coli 0157:H7 y otros. El inconveniente reside, sin embargo, y por el momento, en
su coste y en el impacto social.
Tecnología de genes bioindicadores
–bioreporters– bioluminiscentes e integrados en circuitos (CIBB)
En los últimos años, las aplicaciones biológicas que tienen que ver con la utilización de genes indicadores han comenzado
a suscitar un inusitado interés por parte de
los científicos y tecnólogos. Una de ellas
se refiere a los CIBB (circuitos integrados
bioindicadores bioluminiscentes), un tipo
de dispositivo que utiliza chips diseñados
para recoger señales emitidas por bacterias especialmente alteradas, creadas mediante manipulación genética, que emiten
luz verdosa (o azul verdosa) en presencia
de contaminantes químicos o biológicos.
La enzima que cataliza la reacción luminiscente es una luciferasa, un tipo de enzima que se detecta, entre otros, en bacterias y en hongos. Los genes aislados,
responsables de la reacción luminiscente,
constituyen bioinformadores o bioindicadores (bioreporters), de tal modo que,
ante un producto químico determinado o
un agente físico dispuesto en su ambiente, responden emitiendo luz.
Un bioreporter contiene dos elementos
genéticos esenciales, un promotor y un
gen reporter (un gen indicador, es decir,
que, cuando se expresa, existe o se produce alguna característica que es aprovechable como indicio de su presencia).
El promotor (controla el inicio de la transcripción a ARNm, es decir, es el punto
donde se fija la ARN polimerasa) es transcrito cuando está presente un determinado agente en el ambiente del microorganismo. En una bacteria normal el gen
promotor está unido a otros genes que se
transcriben igualmente, traduciéndose en
proteínas que ayudan a la bacteria a com-
Signal
Promoter
Reporter
Gene
Transcription
mRNA
Analyte
Figura. 10. Anatomía de un organismo bioreporter (70).
Translation
Reporter
Protein
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 297
Sanidad animal y biotecnología
297
batir o a adaptarse al agente al que han
sido expuestas. En el caso de un bioreporter, estos genes, o parte de ellos, han
sido eliminados y reemplazados por el
gen reporter. De este modo, al activarse
el promotor, se activa el gen reporter, lo
que conduce a la producción de proteínas
reporter que generan algún tipo de señal
detectable. Por tanto, la presencia de una
señal indica que el bioreporter ha detectado la presencia de un determinado
agente en su ambiente.
Aunque originalmente esta tecnología se
desarrolló para el análisis de factores que
afectan a la expresión de los genes,
pronto se descubrió su aplicación para la
detección de contaminantes ambientales
(71) y desde entonces se ha introducido
en otros campos, como el diagnóstico
médico (medicina humana), la seguridad
alimentaria y otros. La versatilidad del sistema depende de la disponibilidad de sistemas de genes reporter que sean capaces de generar distintos tipos de señales.
Además, los genes reporter pueden insertarse genéticamente en bacterias, levaduras, plantas o células de mamíferos,
proporcionando entonces una funcionalidad considerable en un amplio rango de
vectores.
Sistemas de genes indicadores (reporter). Para la construcción de microorganismos bioindicadores (bioreporter) se dispone de varios tipos de genes reporter y
las señales que generan pueden detectarse mediante la utilización de distintos
procedimientos, incluyendo métodos colorimétricos, fluorescentes, luminiscentes,
quimioluminiscentes o electroquímicos.
En algunos casos, la señal solamente se
produce en presencia de un sustrato secundario, que tiene que ser incorporado
al bioensayo, mientras que otras veces la
señal debe activarse por una fuente de luz
externa, y en unos pocos casos la señal se
autoinduce. Se consideran los siguientes:
• Sistema de la luciferasa bacteriana (lux).
La luciferasa es el nombre genérico de
una enzima que cataliza una reacción
que produce y emite luz. Las luciferasas
pueden encontrarse en bacterias y en
hongos, además de en otros organismos, y los genes responsables de la reacción bioluminiscente (genes lux) han
sido aislados y utilizados extensamente
en la construcción de bioreporters que
emiten una luz azul-verdosa con intensidad máxima a 490 nm. Se producen
variantes en función de la temperatura
(< 30 ºC, < 37 ºC y < 45 ºC) y de la
combinación de genes lux implicados
(existen cinco tipos de genes lux: luxA,
luxB, luxC, luxD y luxE), lo que proporciona bioreporters luxAB, luxCDABE e
inespecíficos.
Los bioreporters luxAB solo completan
la reacción bioluminiscente en presencia
de un determinado sustrato. A partir de
bacterias, levaduras y otros sistemas celulares (células de insectos, de mamíferos, de nematodos o de plantas) se
han desarrollado diferentes opciones.
Por ejemplo, se han utilizado en estudios de detección de antimicrobianos
(incluidos antibióticos), biofilms, contaminantes ambientales, patógenos en
alimentos, inmunoensayos, tecnologías
IVET (de expresión in vivo), patógenos
de plantas o infecciones por virus, entre
otros. En el caso de los bioreporters
luxCDABE, que incorpora todos los
genes lux, no requieren la adición de
ningún sustrato, ni excitación alguna externa para generar luz, de tal manera
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 298
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
298
que este bioindicador siempre que se exponga a un analito diana produce bioluminiscencia en menos de 1 hora, lo
que le hace especialmente interesante
desde el punto de vista práctico, por lo
que se ha incorporado en diversos arrays
de metodologías diseñadas para la detección de contaminantes ambientales
y, experimentalmente, en sistemas de
seguimiento de infecciones experimentales por agentes patógenos en ratones,
por ejemplo, en el caso de S. enterica
Typhimurium (72). Los bioindicadores
inespecíficos solo se utilizan para la detección de toxinas químicas.
• Sistema de la luciferasa de la luciérnaga
(luc). Esta luciferasa cataliza una reacción que produce luz visible en el rango
de 550-575 nm de longitud de onda.
Igual que sucede con otra luciferasa,
producida por un escarabajo, que es
bioluminiscente en un pico más estrecho (595 nm) y requiere de la incorporación externa de luciferina. Sobre ellos
se han desarrollado numerosos bioindicadores para la detección de contaminantes ambientales y puede resultar
muy prometedor en el campo del diagnóstico médico (ya se ha utilizado en el
caso de tumores) (73), veterinario, y en
el de la fisiología de la reproducción (74).
Sistema Aequorin. Aequorin es una fotoproteína aislada de la medusa Aequorea
victoria que en presencia de calcio (Ca) y
coelenterazina produce una reacción en
la que se genera luz azul en el rango de
460 a 470 nm de longitud de onda. Esta
proteína se ha incorporado en células B
humanas para la detección de bacterias y
virus patógenos en un sistema que se denomina CANARY (Cellular Analysis and
Notification of Antigen Risks and Yields)
(75) en el que la exposición de las células
B recombinantes a antígenos procedentes
de distinto tipo de patógenos da lugar a
la producción de luz como resultado de la
activación de una cascada de señales intracelulares que liberan Ca dentro de la
célula.
Los linfocitos B como bioindicadores son
muy rápidos, sensibles y específicos. En
un estudio diseñado para la identificación
de Yersinia pestis, por ejemplo, se pudieron detectar menos de 50 ufc en un
tiempo inferior a 3 minutos, incluido el
tiempo de concentración, y la probabilidad de detección estuvo en el intervalo
de entre el 62% (para 20 ufc) y el 99%
(para 200 ufc), siendo la tasa de falsos positivos de tan solo el 0,4%. En el caso de
E. coli en alimentos, se han detectado valores de 500 ufc/g en menos de 5 minutos, incluyendo el tiempo de preparación de la muestra, muy por debajo de lo
requerido, por ejemplo, en el caso de una
PCR, en el que los tiempos necesarios van
de 30 a 60 minutos y el límite de detección es mucho mayor. También se han llevado a cabo ensayos similares para la detección de F. tularensis, el virus de la
encefalitis equina venezolana, B. anthracis, Salmonella Typhimurium o S. aureus,
etc. (76), señalándose que la posibilidad
de crear bioindicadores específicos es
prácticamente infinita. Además de ello,
los linfocitos B como bioinformadores son
un material muy adecuado en casos que
requieren un rápido tratamiento (77).
Sistema de la proteína verde fluorescente (GFP). Se trata de otra fotoproteína
aislada y clonada, procedente de la misma
medusa, que produce una señal fluorescente azul al ser excitada con una fuente
de luz UV, sin necesidad de sustrato exó-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 299
Sanidad animal y biotecnología
299
geno, por lo que tiene mucho interés en
el caso de estudios con células vivas. Se
ha utilizado extensamente en construcciones de bioindicadores en bacterias y levaduras o en células de mamífero, permitiendo detectar infecciones por virus (por
ejemplo, el virus VIH).
CIBB. Como en el caso de los biosensores,
el uso de la luz como indicador terminal
tiene la ventaja de que puede medirse fácilmente mediante transductores ópticos.
Los BBIC (bioindicadores bioluminiscentes
integrados en circuitos) están formados por
dos componentes principales: por un lado,
un fotodetector, y por otro, un bioindicador
bioluminiscente que produce una señal que
es capturada por el primero (el fotodetector) en un chip, procesándola. Después
puede manejarla y almacenarla (78).
La tecnología de los bioreporters representa
un método cuantitativo, de bajo coste, selectivo y rápido para la detección y vigilancia
de sustancias químicas o agentes biológicos
en aplicaciones que incluyen la contaminación ambiental, el diagnóstico médico o la
seguridad alimentaria, entre otros. Su interés se relaciona, además, con la posibilidad de implementarse con sistemas de
tiempo real, ensayos in vivo, etc., que proporcionan una perspectiva nueva sobre la
fisiología de las bacterias o las interacciones
intercelulares. El estudio de las enfermedades infecciosas o el uso de modelos animales con distintos fines, entre otros, la respuesta a tratamientos médicos, son campos
de utilidad muy claros.
Diagnóstico basado en el estudio de
la respuesta inmune
El estudio de la respuesta inmune para el
diagnóstico de animales enfermos ha sido
una línea de trabajo que tiene su origen en
los primeros estudios de fijación del complemento (desviación del complemento) o
reacción de Bordet-Wasserman, utilizada
desde su descripción en 1906 en el diagnóstico de la sífilis humana, más tarde aplicada al diagnóstico del muermo y de la perineumonía contagiosa bovina (reacción de
Campbell y Turner). De igual modo, también se sitúa en sus comienzos los estudios
de Widal (Prueba de Widal) en 1898 para
el diagnóstico por aglutinación de infecciones entéricas (fiebre tifoidea) o los de
Kraus sobre la precipitación. En 1945,
Coombs describió la prueba de la antiglobulina (prueba de Coombs) para la detección de anticuerpos incompletos en el
caso de la brucelosis, aplicable después al
diagnóstico humano; y en 1969, Morgan
describió la prueba del Rosa de Bengala
(una modificación del Card Test) para el
diagnóstico rápido de la brucelosis animal,
más tarde aplicada también a la enfermedad humana. En el momento actual, la
Inmunología presta a la Sanidad Animal
apoyo muy importante en materia de
diagnóstico.
Como ya hemos referido en otros lugares,
una condición que caracteriza las intervenciones en Sanidad Animal referidas a
los animales domésticos productores de
alimentos (no así en otras opciones) es la
necesidad de disponer de formatos que
permitan realizar en las mejores condiciones números elevados de determinaciones y, si fuera posible, su automatización. La aparición en los años 70 de los
soportes en microplaca de poliestireno de
96 pocillos estimuló el desarrollo de una
industria auxiliar que pasó de los laboriosos microdiluidores utilizados entonces
en las pruebas de fijación del comple-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 300
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
300
mento a los dispositivos de micropipetas
automáticas con puntas desechables que
supusieron en este sentido un avance
considerable. Al tiempo, se puso de manifiesto la necesidad de disponer de
pruebas versátiles, sensibles, eficaces y rápidas. Por el camino han quedado numerosas determinaciones de la respuesta inmune (detección de anticuerpos o de
antígenos) de desarrollo laborioso o complicado, por lo general restringido a unos
pocos laboratorios capaces de disponer
de infraestructura o instalaciones adecuadas para su aplicación, como es el
caso de los distintos sistemas de inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis (RIA),
hemaglutinación y hemadsorción, inmunodifusión, etc.
ELISA
En 1971, Engvall y Perlman describieron la
prueba ELISA (enzyme-linked immunosorben assay) (79) y demostraron su valor
cuantitativo utilizando fosfatasa alcalina.
Más tarde, Perlman publicó estudios sobre
citotoxicidad de linfocitos humanos (80) y
una selección de inmunógenos y epítopos
en el curso de una investigación sobre el
desarrollo de la malaria (81). Ello supuso,
sin duda, un hito muy importante en el
diagnóstico inmunológico de las enfermedades infecciosas. ELISA puede definirse
como una técnica de tipo bioquímico en
la que una cantidad de un antígeno desconocido se fija a una superficie y después
se aplica un anticuerpo conocido que, si
coincide con el antígeno, se fija a él. El anticuerpo va unido a una enzima y en la
fase final del proceso se añade un sustrato
que cambia de color cuando sobre él
actúa la enzima disponible, fijada al conjunto.
El ELISA puede evaluar la presencia de anticuerpos o de antígeno en una muestra
problema, por lo que puede modificarse
para determinar concentraciones de anticuerpos en el suero o la presencia de antígeno desconocido en una muestra clínica
sospechosa. Igualmente posee innumerables aplicaciones en muchos campos, por
ejemplo, para la determinación de antígenos en alimentos (alérgenos, por ejemplo) o en toxicología. En la determinación
de anticuerpos, puede aumentarse de
modo importante su sensibilidad mediante
el uso de anticuerpos secundarios.
Los tipos más conocidos de ELISA incluyen
respectivamente, ELISA directo, ELISA indirecto (ELISAi), ELISA sándwich y ELISA
competición. En el ELISA directo, que es
el formato más simple de la prueba, el antígeno de prueba (la solución sospechosa
de contener el antígeno) se utiliza para
fijar en las microplacas. Posteriormente se
añade el anticuerpo conocido, marcado
con la enzima (habitualmente fosfatasa
alcalina o peroxidasa). Al añadir el sustrato específico de la enzima, en caso de
que exista antígeno y se corresponda con
él, se producirá color, que se mide, o visualmente o mediante un espectrofotómetro. En todos los casos se incluyen controles positivos y negativos que sirven
para establecer el umbral que marca el
valor a partir del cual la reacción se considera positiva.
En el ELISA indirecto (ELISAi), probablemente el más utilizado, el antígeno problema se fija a la microplaca utilizando
como bloqueo seroalbúmina bovina o caseína. A continuación se añade el anticuerpo primario, conocido, que se unirá
al antígeno si se corresponde con él y más
tarde se añade y se une el anticuerpo se-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 301
Sanidad animal y biotecnología
301
cundario, antiespecie, con la particularidad de que este último está marcado
con una enzima que no modifica las propiedades del anticuerpo. Por último, se
añade el sustrato de la enzima (para peroxidasa, habitualmente TMB –tetrametilbencidina–), que cambia de color si la enzima está presente y este se mide con un
espectrofotómetro. En un tiempo determinado, la reacción se detiene con NaOH.
Entre cada fase se incluyen lavados para
eliminar el reactivo sobrante. Existe una
relación entre la producción de color y la
cantidad de antígeno de prueba presente
en la reacción. La detección tiene mayor
sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o
más anticuerpos secundarios por cada primario. El ELISAi es el método de elección
para detectar la presencia de anticuerpos
séricos contra gran cantidad de antígenos
microbianos.
La enzima actúa como un amplificador,
incluso aunque solo permanezcan unidos
unos pocos anticuerpos marcados, de tal
modo que las moléculas de la enzima
pueden producir muchas moléculas señal.
La desventaja principal del ELISAi reside
en que la inmovilización del antígeno es
inespecífica y cuando se utiliza suero
como fuente de antígeno todas las proteínas presentes en la muestra se pueden
unir a la placa compitiendo con el antígeno de prueba (este problema se resuelve en la modalidad de “captura o
competición”, ver después).
El ELISAi se puede ejecutar en un formato
cualitativo o cuantitativo; en el primer
caso se obtiene un resultado simple, positivo o negativo, y el punto de corte entre
ambos se determina mediante un cálculo
estadístico teniendo en cuenta la informa-
ción obtenida de los controles, considerando 2 o 3 veces la desviación estándar.
Para la determinación del punto de corte
se elige un control negativo, de absorbancia conocida y baja, por duplicado, y
se procesa como una muestra cualquiera,
calculando la media de ambas absorbancias y la desviación estándar, que se multiplica por 3 y se suma al valor promedio
obtenido antes. En las pruebas cuantitativas se hace necesario construir una curva
patrón de densidades ópticas, elaborada
con una serie de diluciones de una solución conocida de la molécula diana.
En el ELISA sándwich (ELISAs), también
denominado “de captura antigénica” se
recubre el pocillo de la microplaca con un
primer anticuerpo conocido y, después de
eliminar el exceso por lavado, se añade la
muestra problema en la que se investiga
la presencia del antígeno que, en caso de
existir, quedará retenido por el primer anticuerpo, pegado a la placa. Después de
un nuevo lavado, se añade un segundo
anticuerpo, en este caso marcado con la
enzima. Este ensayo gana en especificidad
y sensibilidad debido a la amplificación de
la señal que permite el segundo anticuerpo.
Del ELISAs se han descrito dos variantes, el
ELISAs DAS (Double Antibody Sandwich) y
el ELISAs HADAS (Heterologous Antiglobulin Double Antibody Sandwich). En el
primero se utilizan dos anticuerpos específicos del mismo tipo, uno de ellos marcado, que se unen a dos sitios diferentes
del antígeno (el primero se fija a la microplaca y el segundo se añade después de
añadir el antígeno sospechoso) (82),
mientras que el segundo anticuerpo, que
se dirige también frente a un epítopo diferente, es un anticuerpo heterólogo, ob-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 302
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
302
Figura 11. ELISA, ELISAi y ELISAs (http://www.piercenet.com).
tenido en una especie distinta de la de
procedencia del primero (83).
El ELISA “de captura” permite la detección de antígenos procedentes de bacterias o virus (de agentes patógenos, en general) a partir de muestras clínicas. Es un
procedimiento muy utilizado en Sanidad
Animal, por ejemplo, en el diagnóstico de
anaplasmosis, diarrea vírica bovina, peste
bovina o peste de los pequeños rumiantes, virus respiratorio sincitial, enfermedades por priones (EEB, tembladera, etc.),
listeriosis, salmonelosis, brucelosis, infecciones por E. coli, etc. (84).
Un tipo de ELISA denominado “de competición” incluye el uso de un primer anticuerpo, no marcado, que se incuba en
presencia de su antígeno correspondiente,
cuya presencia se investiga en la muestra
sospechosa (antígeno de prueba). Emplea
placas tapizadas con Ac (o el antígeno específico marcado, si lo que se investiga es
la presencia de anticuerpos, aunque lo habitual es lo primero) específico, marcado,
que compite por la unión del antígeno de
prueba con los complejos previamente incubados. Cuanto más antígeno (o anti-
cuerpo, según el caso) exista en la muestra, menor anticuerpo (o antígeno, según
el caso) será capaz de unirse al antígeno
(o anticuerpo, según el caso) en el pocillo,
pues uno y otro competirán por el complementario. En la práctica, la concentración más alta del antígeno supondrá la
existencia de la señal más débil, en realidad, la ausencia de color, que en este
caso será indicio de resultado positivo. Su
ventaja principal reside en la capacidad de
utilizar muestras crudas o complejas, que
todavía en este caso son capaces de
unirse selectivamente a cualquier antígeno que esté presente en la muestra.
En el diagnóstico serológico, en Sanidad
Animal, el ELISA de competición para la
investigación de anticuerpos ha desplazado en los últimos años, prácticamente,
al ELISAi, tanto en la vigilancia serológica
como en determinaciones a gran escala
(OIE, 2009), pues permite analizar muestras procedentes de muchas especies sin
necesidad de utilizar conjugados específicos de especie marcados con una enzima distinta para cada especie de prueba. En el diagnóstico de la lengua azul,
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 303
Sanidad animal y biotecnología
303
por ejemplo, el uso de un anticuerpo monoclonal muy conservado (frente a la proteína P7 del virus) permitió la detección
de anticuerpos frente a todos los tipos del
virus y no reaccionaba contra otros orbivirus (85). También se ha utilizado este
formato en el diagnóstico de la PPC, la
babesiosis, la brucelosis o la fiebre aftosa,
entre otros (OIE, 2009).
El ELISA MP (múltiple y portátil), también
denominado ELISA reverso, utiliza varillas
de poliestireno como fase sólida con 8-10
ojivas. Todo el dispositivo está incluido en
un tubo de ensayo que contiene la
muestra problema, y las fases siguientes
(lavado, incubación con el conjugado y
posteriormente con el sustrato) se llevan
a cabo por inmersión de las ojivas en micropocillos de microplacas estándar, previamente rellenas con los reactivos. Las
ventajas residen en que cada una de las
ojivas puede ser sensible a un reactivo diferente (antígeno o anticuerpo) con lo
que puede establecerse una multiprueba
que puede resolver simultáneamente varias sospechas; además, puede aumentarse el volumen de la muestra, con lo
que la sensibilidad aumenta de forma
proporcional (no sirve solo en el caso de
muestras clínicas, sino también de alimentos o de muestras ambientales). Se
ha utilizado, por ejemplo, para la detección simultánea de dos tipos distintos de
inmunoglobulinas (IgM e IgG) en el caso
de la fiebre de Lassa (86) con resultados
de alta sensibilidad, por ejemplo cuando
se comparó con inmunofluorescencia.
También se ha recomendado en el caso
de flavivirus (87), en la detección de Ac
del virus de la encefalitis del Nilo Occidental y en la detección de IgM, IgA e IgG
frente a T. gondii. Igualmente que en la
detección de IgE en casos de alergias. En
cualquier caso, este tipo de ELISA se ha
definido como altamente sensible y específico (mejor que IFD).
Con carácter general, en todas las variantes ELISA que utilizan como elemento
conocido un anticuerpo específico, de su
calidad depende la sensibilidad y especificidad de la prueba. A este respecto, la
alternativa es la disponibilidad de antisueros (anticuerpos) policlonales o monoclonales (ver después). Los segundos, dirigidos frente a epítopos muy conservados
del antígeno, ofrecerán determinaciones
de una reactividad amplia, mientras que
si están dirigidos frente a epítopos muy
específicos (poco conservados) ganarán
en especificidad.
Citometría de flujo
Es una metodología de análisis individual
de células que mide las características de
dispersión de la luz y la fluorescencia, después de hacer pasar una fuente de luz
sobre una suspensión celular. El estudio
celular individualizado se refiere siempre
a un alto número de células, ordinariamente entre cinco y diez mil, que suponen una muestra suficientemente representativa del conjunto de la población.
En el citómetro, la suspensión de células
en una solución isotónica se hace pasar a
través de un pequeño orificio de tal modo
que necesariamente tienen que hacerlo
de forma individual (en fila), formando
parte de una corriente continua o flujo cilíndrico.
La citometría de flujo permite la medición
rápida de ciertas características físicas y
químicas de las células, que son útiles
para el diagnóstico hematológico e inmunológico, incluyendo lo que se refiere al
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 304
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
304
número y clasificación de las poblaciones
celulares, entre otras.
Al interaccionar las células con la luz, la
dispersan. La medida de la reflexión lateral de la dispersión permite evaluar el
tamaño, la granularidad y/o la complejidad celular. Si antes de la utilización de
la luz se dispone la presencia de anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos, se puede evaluar la presencia
de un antígeno particular, correspondiente al anticuerpo, en la superficie celular. Las señales luminosas obtenidas
pueden transformarse en impulsos eléctricos, que se pueden amplificar y convertir en señales digitales, las cuales
pueden procesarse después con ayuda de
la bioinformática.
Distintos fluorocromos permiten estudiar
la presencia de diferentes marcadores de
modo simultáneo (en la actualidad pueden detectarse simultáneamente hasta 13
fluorocromos de diferentes longitudes de
onda). La citometría de flujo utiliza citómetros de flujo o FACS (fluorescent acti-
Figura 12. Fundamentos de la citometría de flujo.
http://www.cnb.csic.es.
vated cell sorter) que evalúan las células
en una suspensión en función de los dos
caracteres citados (tamaño y fluorescencia), permitiendo un análisis multiparamétrico, combinando y relacionando distintos parámetros de la misma célula (88).
El objetivo del análisis por inmunofluorescencia en citometría de flujo es asignar
cada célula a un grupo específico de ellas
que comparten propiedades comunes
después de identificar, como primera fase,
las células de interés en cada caso concreto; por ejemplo, para el análisis de subpoblaciones linfocitarias se requiere seleccionar un área de trabajo diferenciando
los linfocitos por sus propiedades de dispersión particulares (en general, se utiliza
el tamaño contra la complejidad celular)
y una vez que las células de interés se han
separado del resto, se puede utilizar la inmunofluorescencia para determinar la
proporción o el número de células que
poseen un determinado marcador, pongamos por caso el CD4, con el fin de
identificar la respuesta y su progresión
frente a un determinado agente patógeno, virus o bacteria.
La citometría de flujo permite evaluar diferentes parámetros celulares, incluyendo
valores intracelulares y extracelulares.
Entre los primeros pueden diferenciarse
los que corresponden al núcleo (por
ejemplo, ADN, pares de bases, ADN/ARN,
ADN/proteínas totales, ADN/antígenos
nucleares, ADN/antígenos celulares, receptores nucleares, expresión de genes reporter, morfología nuclear, otros componentes nucleares, etc.) o al citoplasma
(por ejemplo, proteínas totales, estructurales, funcionales, glicoproteínas, lípidos,
funciones intracelulares, etc.), mientras
que entre los segundos pueden mencio-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 305
Sanidad animal y biotecnología
305
narse los parámetros de superficie (receptores, pared celular, sitios de unión a lectinas, densidad, unión de ligandos, etc.)
o los parámetros extracelulares, generalmente proteínas secretadas. En general,
la evaluación de parámetros evaluables
por citometría de flujo están condicionados a la disponibilidad de anticuerpos
marcados con fluorocromos, específicos
frente a ellos. El conjunto de esta información permite caracterizar el fenotipo
de superficie, su estado intracelular, su patrón de secreción o su ciclo celular.
En el campo diagnóstico, la citometría de
flujo permite determinar la presencia o
ausencia de determinado tipo de antígenos en los compartimentos celulares
(superficie, citoplasma, mitocondrias o
núcleo) y fuera de ellas (antígenos circulantes), lo que permite consecuentemente
aumentar tanto la especificidad como la
sensibilidad de la prueba. En relación con
el análisis de anticuerpos, pueden estudiarse tanto los anticuerpos circulantes
como los que están unidos a células.
La citometría de flujo está considerada en
la actualidad uno de los métodos de análisis celular más relevantes y constituye,
además, un complemento muy valioso de
otro tipo de metodologías para el estudio
de las células. La posibilidad de utilizar,
conjugándolos, anticuerpos monoclonales
o policlonales con marcadores fluorescentes ha permitido llevar a cabo estudios
sobre distribución de determinantes y receptores de la superficie de los microorganismos y las células y, en este último caso,
ha permitido identificar subpoblaciones
celulares (89), incluso diferentes en la
misma muestra, aun cuando estas estén
escasamente representadas, una opción
cuantitativa de gran utilidad práctica.
Aunque la introducción de la citometría de
flujo en el campo del estudio y diagnóstico
celular tiene tras de sí una larga historia,
pues comenzó a aplicarse al análisis de las
células a comienzos de los años 60, los microbiólogos no comenzaron a utilizar esta
técnica hasta finales de los años 70 (90) y
las primeras aplicaciones estuvieron limitadas por la inespecificidad de la unión de
los colorantes fluorescentes y la capacidad,
también limitada, de la informática. Cuando emergieron las técnicas moleculares,
como la PCR, la secuenciación del ADN o
la hibridación, se volvió a retomar la posibilidad de uso de pruebas que no dependieran del cultivo para el análisis microbiano, tanto de un modo cualitativo como
cuantitativo. Estos nuevos desarrollos facilitaron hasta cierto grado el uso de la citometría de flujo, como de otras técnicas,
que permiten la detección y análisis de microorganismos no cultivados, con alta precisión, especialmente en combinación con
otros métodos.
En el campo de las enfermedades infecciosas, la citometría de flujo permite la medida de las características físicas y químicas
de bacterias en suspensión en microsegundos, pudiéndose obtener información
sobre la pureza o heterogeneidad de una
población en minutos (91). En la actualidad, la citometría de flujo se aplica de
forma generalizada para los análisis de microbiología ambiental y, en el campo de
las enfermedades producidas por bacterias y otros microorganismos, fundamentalmente en estudios sobre la patogénesis,
estudiando la evolución de parámetros
que se influyen en el curso de la infección
o la respuesta, particularmente en poblaciones y subpoblaciones de linfocitos y
otras células. En el diagnóstico microbio-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 306
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
306
lógico de infecciones, las primeras aplicaciones son relativamente recientes y datan
de los años 80, fundamentalmente para
la detección de microorganismos en procesos sistémicos, a partir de la sangre de
pacientes humanos; por ejemplo, E. coli
era detectado en muestras de sangre, por
citometría de flujo, utilizando bromuro de
etidio, con un umbral mínimo de detección tan bajo como solo 10 células por mililitro (92). Poco después se introdujeron
los anticuerpos fluorescentes, que mejoraron sensiblemente las técnicas de detección que se aplicaron a otras especies,
como Salmonella, Legionella, Pseudomonas (Álvarez-Barrientos A., et al., 2000), y
después a otras, incluyendo S. aureus,
Chlamydia, Leptospira, Listeria, F. tularensis
y hongos de varias especies (93), aunque
este desarrollo inicial estuvo también limitado por la disponibilidad y coste de los
aparatos de medida.
En la actualidad la citometría de flujo es
un método imprescindible para detectar y
cuantificar el tamaño de la infección, sin
la limitación que supone el que algunos
microorganismos sean de difícil cultivo o
no cultivables. Combinada con técnicas de
Biología Molecular, permite detectar directamente y enumerar microorganismos específicos en poblaciones mixtas y para el
estudio de funciones biológicas (94).
En el caso de los virus, el obstáculo principal es su pequeño tamaño, aunque se
han diseñado modificaciones de los citómetros que permiten optimizar la detección y cuantificación (95); se ha descrito,
por ejemplo, su aplicación en la detección
e identificación de herpesvirus, picornavirus y retrovirus (Laguado, 2007), y en el
campo veterinario las descripciones son
todavía poco numerosas; por ejemplo, se
ha aplicado directamente a la detección
de micoplasmas (Mycoplasma agalactiae,
M. putrefaciens, M. capricolum subsp. capricolum y M. mycoides subsp. mycoides
LC) en leche (96), medio en el que también se han estudiado otros patógenos,
como Pseudomonas spp o Salmonella
Typhimurium (97, 98). Los micoplasmas
también han sido objeto de estudio en el
caso de M. agassizii, un agente que produce desórdenes respiratorios en la tortuga y que se han cuantificado por citometría de flujo (99).
No obstante, en este campo, los estudios
indirectos sobre microorganismos o procesos producidos por ellos, en lo que se
refiere a la patogénesis de las enfermedades o la respuesta celular del hospedador natural o experimental (incluyendo
respuesta a vacunaciones), son más frecuentes; en este sentido, por ejemplo, se
ha descrito el seguimiento de la respuesta
inmune frente a Mycoplasma gallisepticum en aves (100), o de la inmunidad celular en el caso de Brucella melitensis y B.
ovis (101), estudios de infecciones latentes
en terneros por Chlamydophila pecorum
y Ch. abortus (102), o la respuesta frente
a una vacuna experimental y controles de
infección en el caso de H. paraseis (103).
También se ha utilizado la citometría de
flujo en el estudio experimental de la patogénesis de la tularemia, utilizando el
modelo ratón y la cepa LVS (104). En el
caso de los virus y enfermedades producidas por ellos de interés en Sanidad
Animal, se ha descrito su uso en el síndrome debilitante posdestete del ganado
porcino, producido por circovirus (105) y
en el virus del PRRS (106), o en el estudio
de la patogénesis de las infecciones por
retrovirus felinos, modelo tradicional de
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 307
Sanidad animal y biotecnología
307
las infecciones por estos mismos agentes
(107), entre otros. También existen publicados estudios similares en el caso de la
leishmaniasis canina (108).
En definitiva, la citometría de flujo, sola o
en combinación con las nuevas tecnologías, es un instrumento de gran valor en
el estudio de enfermedades infecciosas de
los animales, tanto por lo que se refiere a
la detección, identificación y cuantificación
directa de sus etiologías, con ventajas referidas al estudio de un microorganismo
en particular, como en lo que se refiere a
los estudios derivados del hospedador en
el curso de la infección natural, experimental o en la valoración de productos vacunales. De forma especial, su utilidad es
aun mayor en el caso de infecciones producidas por microorganismos no cultivables o de difícil cultivo en el laboratorio.
Reactivos para las pruebas
inmunológicas
La principal limitación para el diseño y desarrollo de pruebas diagnósticas que reúnan las características deseables (rapidez,
sensibilidad, especificidad y coste reducido) reside en la producción de antígenos
y anticuerpos de calidad, que, en base a
la especificidad de la reacción antígenoanticuerpo, conocido uno de ellos, permita la búsqueda del contrario. En la actualidad, la Biotecnología hace posible la
obtención y producción de proteínas y secuencias nucleotídicas de alta pureza y en
cantidades suficientes, permitiendo incluso modificar su estructura química, ganando en reactividad (109).
Obtención de anticuerpos
Con carácter general, la producción de anticuerpos específicos requiere disponer con
anterioridad de antígenos de calidad, en
cantidad y pureza suficientes. Pueden plantearse dos alternativas generales en lo que
a la obtención de anticuerpos se refiere:
por un lado, pueden obtenerse anticuerpos policlonales, cuya reactividad puede
ser discreta, pues representa una mezcla
de inmunoglobulinas, específicas en
mayor o menor medida de un antígeno
completo, pero resultado de la respuesta
inmune frente a sus epítopos, cada uno
de los cuales induciría un clon de células
B (células plasmáticas) que producirían inmunoglobulinas con una secuencia característica; además, el resultado depende
también del sistema elegido para la producción (la especie animal, vía de inoculación), la propia inmunogenicidad del antígeno y el protocolo utilizados.
Por otro lado, la alternativa a las inmunoglobulinas policlonales está representada
por los anticuerpos monoclonales (AcMo).
El término se refiere a una población de
moléculas de inmunoglobulina idénticas,
con actividad anticuerpo, y todas ellas con
la misma especificidad. Su obtención procede del trabajo pionero de Kohler y
Milstein, que en 1975 demostraron la posibilidad de producir anticuerpos (monoclonales) mediante la obtención de un
“hibridoma”, fruto de la fusión de linfocitos B con células de mieloma, trabajo
que les valió el premio Nobel de Medicina
de 1984 (110). La técnica original de
Kohler y Milstein (figura 13) se inicia con
la inmunización de ratones (Balb/c) con
un antígeno para el que se desea la obtención de los anticuerpos. Cuando el título de anticuerpos séricos es adecuado,
se sacrifican los animales y se obtiene el
bazo, que se tritura para obtener una población de células B que se fusionan con
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 308
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
308
células de mieloma. La fusión se facilita
mediante la adición lenta de polietilenglicol (alternativamente pueden utilizarse
virus, como el virus Sendai, o pulsos eléctricos), y al final se obtienen diversidad de
hibridomas que heredan las características
fenotípicas de las células B y mieloma, esto
es, crecen indefinidamente y producen anticuerpos que corresponden a los distintos
epítopos con el que fueron inmunizados
los animales. Se procede a la selección de
los híbridos que producen el anticuerpo de
interés y se clonan, controlando la producción del anticuerpo deseado. En definitiva,
la metodología para la preparación de anticuerpos monoclonales revolucionó el sistema de producción al hacer posible la
producción de anticuerpos dirigidos frente
a un solo epítopo, además de otras ventajas no menos importantes, como la posibilidad de almacenar las células híbridas
productoras (hibridomas) para volver a
producirlos cuando fuera necesario y la capacidad de producción en función de las
necesidades de cada caso (111). La técnica
de Köhler y Milstein produce anticuerpos
monoclonales “de primera generación”,
que han desplazado a los policlonales de
muchas aplicaciones, permitiendo el desarrollo y mejora de numerosas pruebas
diagnósticas basadas en la disponibilidad
de anticuerpos de calidad como reactivo
conocido para la búsqueda del antígeno
correspondiente, sospechoso de estar presente en una muestra clínica en estudio.
En general, muchas determinaciones serológicas de investigación del antígeno
dependen en su valoración de la calidad
(especificidad, avidez y afinidad) del anticuerpo utilizado y, por lo general, los monoclonales son mucho más valiosos que
los anticuerpos policlonales.
Las nuevas tecnologías de Ingeniería Genética han permitido, en la actualidad, la
producción de anticuerpos en ausencia de
inmunización animal, generándolos por
separado como recombinantes las cadenas pesadas y ligeras que forman su estructura, que una vez reunidas para
formar la molécula completa (no siempre
de forma necesaria) constituyen los denominados anticuerpos recombinantes (AcR)
o de segunda generación que, a diferencia de los primeros, se caracterizan por
ser (si así se desea) multivalentes y multiespecíficos.
Debe recordarse que los genes estructurales que codifican las inmunoglobulinas
se organizan en forma de exones discretos, que corresponden a dominios
completos en la proteína, separados por
intrones cuyas secuencias pueden manipularse para añadir secuencias nuevas en
lugares específicos, seleccionados previamente, sin que ello suponga riesgo de alterar la secuencia codificante presente en
los exones. A nivel proteico, la organiza-
Figura 13. Producción de anticuerpos monoclonales
de primera generación (Köhler y Milstein, 1975).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 309
Sanidad animal y biotecnología
309
ción estructural-funcional de las inmunoglobulinas en la forma de estos módulos
discretos o dominios, en donde se encuentra almacenada la información necesaria para realizar una función específica,
facilita también estos objetivos. De este
modo, es posible clonar regiones génicas
responsables de una especificidad de interés y ensamblarla con otras, para dar
forma a un anticuerpo funcional, prácticamente de cualquier clase de inmunoglobulina, aunque hasta la fecha este tipo
de estudios se han referido al hombre.
Se pueden producir, así, moléculas completas, similares a las que se obtienen de
forma natural en las que están presentes
las dos porciones estructurales, fragmentos
Fab y Fc, como ocurre con los denominados anticuerpos quiméricos y humanizados, o bien un conjunto de proteínas
basadas en la estructura de la inmunoglobulina, pero no estructuradas, como entidades recombinantes autónomas, incluyendo fragmentos Fab, Fv de cadena
sencilla (scFv), “diabodies”, “triabodies”,
etc. Estas últimas pueden presentarse también como proteínas de fusión, en las que
se combina una porción Fab o Fc con una
enzima, una toxina, un receptor celular,
una citoquina, etc., dependiendo del uso
o el destino que se prevea para ella (terapia
de tumores, enfermedades crónicas, autoinmunidad, etc.).
Los anticuerpos quiméricos son moléculas
artificiales en las que las porciones constantes de las cadenas pesadas y ligeras
proceden de una inmunoglobulina humana, mientras que las regiones variables
de ambas cadenas se obtienen a partir de
un anticuerpo monoclonal obtenido en
ratón. Con ello se reduce la inmunogenicidad para el hombre de los anticuerpos
de ratón, al suprimir las regiones constantes, sin afectar a su especificidad. La
técnica fue desarrollada por Morrison y
Schlom (1990) (112) y Boulianne (113) e
implica el aislamiento y clonación de los
genes VH y VL del ratón mediante RT-PCR,
utilizando ARN total como molde o
ARNm de un hibridoma secretor de in-
Figura 14. La molécula de inmunoglobulina con actividad anticuerpo y los genes que la codifican.
http://caibco.ucv.ve/.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 310
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
310
terés, y como primers oligonucleótidos
complementarios a los extremos 3’ y 5’ de
cada gen. Posteriormente se insertan en
vectores de expresión (ordinariamente células de mamífero –CHO–, pero también
de plantas, pues se busca que las proteínas se secreten glicosiladas) a los que previamente se han incorporado los genes
que codifican para las cadenas H y L humanas, siendo después transfectados en
forma estable a una línea celular seleccionada.
Los fragmentos de anticuerpos se obtienen, por lo general, en sistemas de procariotas, principalmente en E. coli, y deben
estar formados por las regiones hipervariables de unión al antígeno, bien como
parte de la región variable de las cadenas
ligeras y pesadas (Fv) o como parte del
framento Fab, que además de las ante-
riores incluye los dominios constantes de
las cadenas ligeras y parte de los dominios
de las cadenas pesadas. Para evitar la expresión intracitoplasmática, que genera
cuerpos de inclusión con los inconvenientes que ello supone (proteínas no funcionales, recuperación ineficiente, no glicosilación), en 1988 (114) se demostró la
expresión en el periplasma de la bacteria,
que se comporta como si se tratase de
una célula eucariota (producción en el retículo endoplásmico) con todas sus ventajas.
En el mismo año se describió también la
producción en E. coli (posteriormente se
ha expresado en levaduras –Pychia pastoris–, en hongos filamentosos, células de
insecto y células de mamífero) de una versión recombinante del fragmento Fv en la
que los dominios VH y VL se encontraban
Figura 15. Obtención de anticuerpos quiméricos para su uso en el hombre a partir de monoclonales obtenidos
en ratón. http://caibco.ucv.ve/.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 311
Sanidad animal y biotecnología
311
unidos físicamente a través de un ligando
peptídico, pequeño y flexible, formado
por aproximadamente 15 aminoácidos,
que permitía el arreglo espacial adecuado
de los dominios VH y VL, generándose un
Fv funcional. Estas construcciones fueron
denominadas Fv de cadena sencilla (del
inglés single chain Fv, scFv) y resultan más
estables que el Fv convencional, conservando toda la capacidad de reconocer y
ligar antígenos. Es uno de los formatos
preferidos para producir fragmentos recombinantes de Ac con capacidad para
unir antígenos, para preparar proteínas de
fusión con especificidad antigénica y para
construir genotecas de Ac.
También se utilizan en la expresión de
scFvs sistemas basados en el uso de fagos
filamentosos tipo f (fagos tipos f1, fd y
M13) que resultan muy convenientes para
expresar dominios de anticuerpos, pues
su estabilidad en forma cristalizada o liofilizada facilita el almacenaje y el transporte, reduciendo los costes de producción.
Se han aplicado diversas estrategias para
producir dímeros o polímeros de AcR y en
muchas de ellas se utiliza el entrecruzamiento por medios químicos de dos fragmentos individuales, obtenidos y purificados de forma independiente, lo que
genera algunos problemas. Una estrategia
más efectiva se basa en la construcción
scFv, pero la longitud del ligando se reduce a tan solo cinco aminoácidos, lo que
imposibilita la formación de un Fv funcional entre dos dominios VH y VL en una
misma molécula, pero conduce a la interacción de dos moléculas de scFv que
forman un dímero que posee dos sitios de
combinación con el antígeno. Si la especificidad de los dominios VH y VL es la
misma, el producto obtenido es un homodímero bivalente (“diabody” o “fragmento bivalente”).
Utilizando el mismo formato, también es
posible producir moléculas recombinantes
con dos especificidades diferentes (por
ejemplo, A y B). Los polipéptidos producidos a partir de estas construcciones son
incapaces de formar scFv funcionales de
manera individual, pero sí son capaces de
aparearse apropiadamente para generar
heterodímeros (se les ha denominado anticuerpos biespecíficos), en donde ambas
especificidades se encuentran físicamente
asociadas. Si se elimina el péptido que
sirve de ligando entre los dominios VH y
VL y ambas regiones se expresan como un
polipéptido continuo, se forma un trímero
funcional con capacidad para ligar tres
determinantes antigénicos al que se designa como “triabodies” (“fragmento trivalente”).
Finalmente, las nuevas tecnologías han
permitido también el diseño y producción
de moléculas artificiales denominadas
proteínas de fusión, en las que se combinan estructuras y funciones procedentes
de dos o más proteínas naturales. Pueden
combinarse porciones, dependiendo del
uso previsto, moléculas de Ac diferentes,
o con toxinas, interleucinas, moléculas de
adhesión, componentes de la matriz extracelular, hormonas, factores de crecimiento, etc.
En la actualidad, existen programas informáticos para diseñar moléculas formadas
por un único dominio variable (VHs), complementarias a la estructura de su epítopo
diana (115). También pueden producirse
los fragmentos correspondientes a las regiones variables de los anticuerpos con-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 312
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
312
Figura 16. Fragmentos de anticuerpos recombinantes. http://caibco.ucv.ve/.
formados con dos cadenas peptídicas ensambladas en una cadena peptídica única
(dsFv).
El uso de los AR de especificidad dirigida
o como vehículo de fármacos está dirigido
al tratamiento de enfermedades autoinmunes humanas y otro tipo de enfermedades crónicas humanas, aunque también
se han producido anticuerpos capaces de
identificar proteínas de B. anthracis útiles
en el diagnóstico, especialmente en el
contexto de su consideración como arma
biológica es lo que representa, sin duda,
uno de los aspectos de mayor interés y
perspectivas futuras.
En el campo de la Sanidad Animal, la información disponible hasta la fecha acerca de la producción de anticuerpos recombinantes es más bien escasa; Foord
et al. (2007) describieron la producción
de anticuerpos recombinantes frente a la
proteína no estructural 3ABC del virus de
la fiebre aftosa en forma de scFV utilizando una librería de fagos en un sistema
de expresión en E. coli e inmunizando en
pollos para comprobar su aplicación en
una vacuna DIVA (ver después), en la que
el sistema de diagnóstico utilizado fue un
ELISA competición que diferenciaba ani-
males vacunados de animales infectados
(116).
Pero no solo las inmunoglobulinas son
susceptibles de la aplicación de este tipo
de metodología para su producción biotecnológica, in vitro, sino que otras moléculas, incluyendo otras proteínas, son
igualmente susceptibles de ello, como sucede con proteínas ricas en leucina y
otras. Además, mediante síntesis química
de oligonucleótidos, pueden generarse
moléculas de ARN o ADN sintéticas
(genes sintéticos) con capacidad para
reconocer específicamente otras moléculas, incluso con mayor especificidad de
la de los anticuerpos, como sucede con
los aptámeros, que se han descrito para
el diagnóstico de algunos tipos de cáncer
y que pueden competir con los anticuerpos en investigación y diagnóstico
(117-119).
Tecnología de aptámeros
Los aptámeros son cadenas sencillas de
70 a 100 oligonucleótidos sintéticos (de
ADN o ARN), que reconocen de forma específica y con alta afinidad varios tipos de
moléculas diana mediante plegamientos
tridimensionales de su cadena. Se ob-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 313
Sanidad animal y biotecnología
313
tienen mediante selección de genotecas
de oligonucleótidos combinatoriales (de
secuencias al azar) mediante el método
SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment) (120), una técnica de química combinatoria que selecciona el oligonucleótido que se une con
más afinidad a la diana de prueba. Posee
una región central de entre 30 y 60 nucleótidos, que incluye una secuencia aleatoria
y, además, dos regiones flanqueantes de
secuencia conocida. Estas moléculas adoptan estructuras globulares complejas que
les permiten propiedades de reconocimiento molécular, uniéndose de forma específica y estable a sus dianas, entre las
que se cuentan proteínas, ácidos nucleicos,
estructuras multiméricas, pequeños componentes orgánicos e incluso organismos
enteros. Existen aptámeros formados por
cadenas peptídicas que interaccionan dentro de la célula con otras proteínas formando bucles, cuya afinidad es comparable a la de los anticuerpos, con los que
se han comparado.
Los aptámeros están considerados como
una alternativa o un complemento a los
anticuerpos monoclonales en el diagnóstico y en la terapia de enfermedades (se les
ha señalado como anticuerpos de tercera
generación). Tienen la condición de sensores moleculares y son capaces de interferir con las moléculas diana, igual que lo
hacen los anticuerpos con los antígenos,
sobre los que se han señalado varias ventajas, incluyendo la posibilidad de su obtención frente a proteínas no inmunogénicas, la capacidad de regeneración, su
estabilidad a temperatura ambiente, su
baja inmunogenicidad, la posibilidad de
modificar su estructura por plegamiento,
su bajo coste, la posibilidad de obtención
por síntesis química, su alta reproducibilidad y la capacidad de marcaje (121).
También se ha señalado su actividad frente
a receptores de la superficie celular y receptores relacionados con la unión con anfígenos (122). Entre sus inconvenientes se
citan su vida corta, especialmente en sangre, debido a la degradación rápida por
nucleasas, y la rápida eliminación a nivel
renal, lo que limita su uso a situaciones
particulares. En cualquier caso se ha señalado su utilidad diagnóstica (sensores moleculares) y terapéutica (interfieren con la
actividad biológica de moléculas diana),
por ejemplo, frente a enfermedades producidas por priones (123).
Polímeros impresos molecularmente
(MIP)
Los ligandos naturales de las proteínas
son moléculas proteináceas, como ocurre
con los receptores celulares o bacterianos, los anticuerpos o los ácidos nucleicos, que también se implican con determinadas funciones, como la catálisis o la
transducción de señales. Con el objeto
de reproducir estas propiedades de
unión se han producido redes de polímeros con capacidad de reconocimiento específico y sitios de unión que son complementarios a un molde, que puede ser
una biomolécula o un compuesto sintético, técnica que se denomina impresión
molecular.
El concepto de impresión molecular es similar al de hacer un molde de goma o
plastilina para encajar perfectamente una
plantilla. El producto de la impresión molecular se denomina un polímero impreso
molecularmente (molecularly imprinted
polymer, MIP). Los MIP tambien se denomina receptores poliméricos sintéticos o
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 314
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
314
anticuerpos artificiales o “plastibodies” y
se caracterizan por su simplicidad, estructura de red y bajo coste, y en los últimos
años se han diseñado estructuras de este
tipo con propósitos de reconocimiento
macromolecular (124). Comparándolos
con anticuerpos monoclonales o policlonales, son más estables, más baratos y
consumen menos tiempo en las técnicas
de uso. Hasta la fecha se han descrito
para el diagnóstico de enfermedades bacterianas, víricas y fúngicas de las plantas
y en la detección de compuestos orgánicos de interés médico en el hombre (por
ejemplo, hemoglobina) o en los animales
(seroalbúmina bovina).
Obtención de antígenos
Los antígenos proteicos pueden obtenerse
directamente del microorganismo cuya
detección se persigue mediante la prueba
diagnóstica en la que van a ser utilizados,
bien como parte del microorganismo
completo o separado del mismo, o mediante la aplicación de los nuevos métodos biotecnológicos, en forma de proteínas recombinantes, si se conoce la
secuencia del gen y su producto correspondiente. Incluso la ingeniería genética
puede introducir modificaciones en las secuencias que hagan más fácil la purificación, o más eficaz su intervención en el
proceso de inmunización, produciendo títulos más altos del anticuerpo deseado,
en suma más eficientes, acelerando el
proceso y disminuyendo los costes. En el
caso de microorganismos extremadamente virulentos, la tecnología recombinante puede facilitar la producción de antígenos de interés a partir de organismos
inocuos, reduciendo el riesgo de infección
en el proceso productivo.
Otros métodos de diagnóstico, de base
compleja, en Sanidad Animal
Pruebas rápidas
Con carácter general, la Biología Molecular se revela como una alternativa de interés para el estudio de la respuesta inmune frente a los métodos clásicos de
detección de antígeno o anticuerpo.
En su conjunto las pruebas rápidas (RDT,
rapid diagnostic tests) buscan disponer de
procedimientos rápidos, incluso inmediatos, que permitan establecer cuanto
antes tratamientos terapéuticos al paciente
(en Medicina Humana se han definido
como “pruebas de punto de atención”,
que en Sanidad Animal serían equivalentes
a “pruebas de establo”) y adoptar cuanto
antes decisiones para el control del
agente sobre individuos conocidos susceptibles al mismo. El formato más habitual de este tipo de determinaciones consiste en una tira de membrana en la que
se fija el material de prueba, sospechoso
(el antígeno sospechoso), sumergiendo
después la misma en un recipiente que
contiene los anticuerpos conocidos (anticuerpos de detección) y los reactivos de
revelado, produciéndose resultados evidenciables, incluso en pocos minutos.
Además permiten procesar un número
importante de muestras, con sensibilidad
y especificidad aceptables, por lo que
están siendo motivo de interés tanto en
el caso de la Medicina Humana como en
la Sanidad Animal.
Las RDT son tiras basadas en el principio
de inmunocromatografía para identificar
antígenos o anticuerpos, con interés diagnóstico; un reactivo (antígeno o anticuerpo) es reconocido por el otro (anticuerpo o antígeno) mantenido en un
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 315
Sanidad animal y biotecnología
315
líquido que migra a través del papel,
como consecuencia del paso de la corriente eléctrica.
La Biotecnología interviene en varios niveles para hacer posible esta disponibilidad: por un lado, mediante la identificación de biomarcadores (una determinada
proteína rica en histidinas o una enzima,
por ejemplo, una lactato deshidrogenasa
o una lactasa), su clonación y producción
recombinante, en el caso de los anfígenos, y en el de los anticuerpos, mediante la disponibilidad de anticuerpos
monoclonales o recombinantes.
Las tiras pueden contener en su extremo
distal el anticuerpo monoclonal (o policlonal, según proceda) que reconoce el
biomarcador específico del microorganismo sospechoso. Para el diagnóstico,
por ejemplo, se coloca en el extremo proximal de la tira diagnóstica la muestra
sospechosa (por ejemplo, sangre, orina,
heces, etc.) junto a un amortiguador de
lisis celular que contiene un anticuerpo dirigido frente a un antígeno blanco del microorganismo de prueba, marcado con
una enzima. La migración del líquido de la
muestra pone en contacto a los tres reactivos (biomarcador –antígeno–, anticuerpo
marcado y anticuerpo monoclonal), produciendo, en caso de correspondencia,
una línea de color al añadir el sustrato coloreado de la enzima.
Entre los ejemplos mejor conocidos de
este tipo de determinaciones figuran RTD
para el diagnóstico de malaria en enfermos sospechosos, sobre la base de
identificar un biomarcador representado
por una proteína rica en histidinas 2
(PRH2), en la lactato deshidrogenasa
(p.D.) o en una aldolasa (125). En su ex-
tremo, las tiras contienen Acm que reconocen el biomarcador.
En la práctica, se impregna el extremo
proximal de la tira con una gota de sangre
del paciente sospechoso, junto con un
tampón de lisis y un Acm marcado con un
colorante. Al migrar el líquido se ponen
en contacto los tres reactivos. La presencia
del biomarcador es reconocida (en caso
positivo) por el Acm marcado y produce
una banda visible. En este caso, la sensibilidad supera el 95% comparada con el
análisis por microscopía, aunque, dependiendo de variaciones en el marcador,
pueden existir diferencias de sensibilidad.
Inmuno-PCR (iPCR)
Los inmunoensayos representan en general un procedimiento de diagnóstico
muy versátil, capaz de llevar a cabo la detección directa de proteínas pertenecientes
a los agentes patógenos, o indirectamente, detectar anticuerpos frente a ellos.
De modo particular, el ELISA combina la
especificidad de los anticuerpos con la
Figura 17. Desarrollo de RTD (126).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 316
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
316
sensibilidad de una prueba enzimática,
pero es incapaz de detectar algunos antígenos cuando están presentes en concentraciones muy bajas, por lo que parece
que el nivel de transcripción de los genes
es bajo, probablemente debido a los mecanismos de persistencia en el hospedador. La PCR, por su parte, es un método muy sensible, capaz de detectar una
simple molécula de ADN, lo que la convierte en una elección excelente para la
detección directa de ácido nucleico procedente de un agente infeccioso y, en
consecuencia, para el diagnóstico microbiológico, aunque en algunos casos la
proteína diana se expresa en un número
mayor de copias que el que corresponde
al ácido nucleico.
Uniendo las ventajas de la PCR y la técnica ELISA se obtiene una combinación a
la que se ha denominado “inmuno-PCR”
(iPCR), descrita inicialmente por Sano et
al. en 1992 (127), que une al poder de
amplificación de la PCR la versatilidad del
ELISA, permitiendo mejorar la capacidad
de detección del antígeno de interés en
valores de entre 100 y 10.000 veces
(128). Los recientes avances, en particular
los derivados de la nanotecnología, están
haciendo de la inmuno-PCR un método
de elección para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas (129), en particular allí donde se precisa análisis ultrasensibles de proteínas, anticuerpos,
citoquinas y otros.
La inmuno-PCR permite tanto la detección de antígenos como de anticuerpos,
y ha sido utilizada ya para detectar antígenos proteicos de origen bacteriano o vírico (en rotavirus, VIH, norovirus, S. aureus, etc.) (130-133). También se ha
adaptado para la detección de anticuer-
pos, como sucede en el caso del sarampión, a partir de sueros de procedencia
humana (134).
El concepto básico de la iPCR es un ELISA
con una modificación particular. La capacidad de reconocimiento del antígeno por
parte de un anticuerpo específico permanece, pero puede amplificarse y cuantificarse un fragmento de un ADNbc utilizando la tecnología de la PCR cuantitativa
(qPCR), reemplazando la parte enzimática
del ensayo. En términos generales, el método puede dividirse en dos fases, la primera de las cuales es idéntica al ELISA
convencional, esto es, la inmovilización de
la molécula sospechosa (diana) y la separación de un anticuerpo detector. La
unión del anticuerpo conocido a la molécula de prueba, en lugar de ser detectada
mediante un enzima, como ocurre en el
ELISA convencional, es identificada por
una secuencia de ADN conjugada al anticuerpo detector, y la molécula que contiene el ADN funciona como en el ELISA,
reconociendo específicamente la primera
unión y al mismo tiempo proporcionando
una molécula reporter, en este caso el
ADN. El fragmento de ADN se integra
después en la segunda fase del ensayo, al
ser amplificado por PCR hasta un nivel detectable. Como consecuencia de ello, la
señal amplificada correlaciona con el número de uniones y, por lo tanto, de la
cantidad del antígeno de prueba (135).
La iPCR requiere utilizar una molécula que
actúa como ligando entre el ADN marcado y los anticuerpos. Normalmente se
utiliza estreptavidina. El antígeno diana,
sospechoso, que recubre la placa de microtiter, es detectado por un anticuerpo
específico. Las moléculas del ligando se
unen al complejo antígeno-anticuerpo y
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 317
Sanidad animal y biotecnología
317
a la secuencia de ADN, que después se
amplifica por PCR. La cantidad de producto PCR es proporcional a la cantidad
de antígeno que es detectado por los anticuerpos. Además, para mejorar el límite
de detección del ELISA clásico, la sensibilidad del iPCR permite el análisis de pequeñas cantidades de muestra, lo que resulta de especial interés en el caso de
estudios en los que la disponibilidad de
material sospechoso es escaso. La iPCR es
compatible con una amplia variedad de
materiales objeto de estudio, como puede
ser sangre, suero, orina, saliva, heces, cultivos celulares, alimentos, extractos de
plantas, etc., lo que facilita su uso.
Como se señaló al principio, como consecuencia de distintos tipos de avances se ha
conseguido una reducción del tiempo de
ejecución de las pruebas y una estandarización de los protocolos, además de un
aumento de la especificidad, todo ello de-
Figura 18. Comparación de ELISA e iPCR (136).
bido a la introducción de nanopartículas
en un formato líquido de la reacción, en
vez de en microplaca (137), como se
muestra en la figura 17 (Malou y Raoult,
2011), tanto para el caso de la detección
de antígeno como para la detección de
anticuerpos.
Además de las mejoras en el límite de detección, las ventajas del sistema que incorpora nanoparticulas incluye también
una reducción de las fases de lavado y periodo de incubación, así como la reducción de las interacciones inespecíficas y el
aumento de la especificidad, etc.
Aplicaciones de la iPCR al desarrollo
de pruebas diagnósticas
La iPCR se ha propuesto como un método
conveniente para la detección de bacterias y virus incultivables, en el caso de infecciones latentes indetectables. Además,
en algunos casos en que la PCR clásica re-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 318
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
318
Figura 19. Avances en la iPCR asociados a la incorporación de nuevas tecnologias. En (a) iPCR con nanopartículas de oro: el anticuerpo captura (conocido y fijado por Fc a una placa magnética de captura) adsorbe al antígeno diana; a continuación se añaden nanopartículas de oro con ADN marcado y anticuerpos de detección
también marcados, formándose un inmunocomplejo que libera el ADN después del calentamiento y se amplifica por qPCR, lo que permite la detección del antígeno de prueba. En (d), detección de anticuerpos mediante el sistema Tus-Ter. El anticuerpo de prueba se une a la proteína LG que recubre una placa microtiter. El
anticuerpo de prueba, unido a la proteína Tus se añade al anterior. Se une después el ADN a la proteína Tus y
finalmente se amplifica por qPCR (Malou y Raoult, 2011).
quiere fases adicionales para la purificación o concentración de las muestras de
ADN o ARN vírico o bacteriano, lo que supone la pérdida de potencial de las
mismas, todo ello además de otras utilidades en biomedicina de tumores, seguridad alimentaria o contaminación ambiental. También se ha utilizado en el
seguimiento de enfermedades autoinmunes y después de programas de vacunación, en el hombre.
La iPCR se ha adaptado, por ejemplo, para
detectar Streptococcus pyogenes utilizando como antígeno carbohidratos de la
pared celular de este microorganismo (138)
con un límite de detección de 10-5 células/µl, equivalente a 100 antígenos, lo que
supone sensibilidades superiores a las obtenidas con ELISA y muy específico. También se ha adaptado a la detección de
S. aureus, utilizando como antígeno la proteína A (139), también con gran sensibilidad, pero no tan específico. En el caso de
virus, se ha adaptado para la detección de
ARN del VIH-1 en el plasma sanguíneo,
con límites de detección de 50 partículas
víricas/ml (140), o en el caso de norovirus
en muestras de alimentos (Tian y Man-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 319
Sanidad animal y biotecnología
319
drell, 2006) con una sensibilidad superior
a la de ELISA y diez veces más sensible
que la RT-PCR. Se ha destinado también
a la detección de rotavirus (Adler et al.,
2005), hantavirus (141) y el virus influenza
H5N1 (142), en el que ha mejorado sustancialmente la sensibilidad del ELISA (mil
veces más sensible) y la RT-PCR (cien veces
más sensible). También se ha adaptado a
la detección de anticuerpos, por ejemplo
en la vigilancia de campañas de vacunación humanas, cuando se precisa gran
sensibilidad, como ocurre en el sarampión
(Mckie et al., 2002). También se ha utilizado para la detección de priones en el
caso de la encefalopatía espongiforme
bovina (143) y en el scrapie o tembladera
ovina en cricetos infectados experimentalmente (144).
En definitiva, se trata de una técnica de
grandes perspectivas, extraordinariamente
sensible, tanto en la detección de antígenos como de anticuerpos, en la que se
necesitan todavía más estudios para profundizar en su conocimiento. Los estudios
relacionados con el diagnóstico en materia de Sanidad Animal son, hasta la
fecha, muy escasos. Sería de interés su
utilidad en casos de difícil identificación,
por razón de microorganismos de difícil
cultivo o incultivables, así por la repercusión de reservorios, de agentes de enfermedades animales y de zoonosis.
Estudios de expresión génica
y patogénesis de
enfermedades infecciosas
Introducción
En el curso de la infección, los agentes patógenos deben lograr acceder, persistir y
reproducirse en lugares, habitualmente
privilegiados, dentro del hospedador. Para
lograr este propósito es necesario disponer de, o producir, determinados factores (ordinariamente factores de virulencia) que rompen el equilibrio fisiológico
del hospedador y le producen daño,
cuando no resultan letales, en casos extremos, además de otros que les permiten
evadir el sistema inmune y/o adquirir los
nutrientes necesarios.
Debido a que el ambiente con el que se
encuentran los agentes patógenos en el
hospedador vivo es muy diferente del
medio ambiente externo, los patógenos
deben regular los genes necesarios, en coordinación, a medida que ellos se desplazan en el ambiente del hospedador y
desde un nicho a otro.
El principal propósito de la investigación
de la patogénesis bacteriana es comprender de qué forma los agentes patógenos interactúan con los hospedadores
para causar enfermedad. El núcleo central de estas investigaciones reside en conocer qué productos de genes se requieren y se expresan en el curso de la
infección natural y cómo cambia esta expresión en el tiempo (desde la colonización inicial hasta que tiene lugar la enfermedad y difusión del patógeno desde la
fuente de infección a nuevos hospedadores) y el espacio (en diferentes células
o tejidos dentro del hospedador). Necesitamos conocer cómo se adaptan los patógenos al microambiente del hospedador, qué tipo de presiones selectivas
actúan sobre el agente patógeno en cada
microambiente, qué factores son responsables del daño y cómo se sortea o se defiende (o evade) el patógeno frente al sistema inmune.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 320
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
320
Aunque los análisis que proporcionan información sobre la expresión de unos
pocos genes relacionados con la adhesión
e invasión celular por parte de los microorganismos (virus y bacterias invasivas) han
sido el núcleo central de la mayor parte de
la información disponible hasta la fecha
sobre la patogénesis, uno de los aspectos
más importantes se refiere a comprender
cómo tienen lugar los cambios de expresión a nivel completo del genoma microbiano. La información adicional generada
por los estudios de genomas completos va
más allá de la derivada del aislamiento y
caracterización de los genes y productos
génicos, porque el análisis del genoma
completo permite identificar y caracterizar
las redes reguladoras.
En general, la Genómica se ocupa del estudio del genoma de un organismo, que
incluye la identificación de sus genes y
elementos reguladores, en definitiva, de
todos los elementos que componen el
material genético. El primer genoma bacteriano completamente secuenciado fue
el de Haemophilus influenzae, publicado
en 1995. En la actualidad son más de 200
los genomas de procariotas (incluyendo
arqueas y bacterias) que se han secuenciado y más de 500 están en proceso de
secuenciación (145). Algunos autores hablan ya de más de 1.000 microorganismos de genoma secuenciado.
El conocimiento de la secuencia genómica
completa de los microorganismos es el
paso necesario para poder comprender su
biología y evolución, lo que implica, en el
caso de los patógenos, identificar genes
de virulencia, dianas de los antibióticos,
conocer nuevos candidatos para el diseño
y elaboración de vacunas, nuevas estrategias diagnósticas e investigar las interac-
ciones que tienen lugar con el hospedador y los mecanismos que conducen a
la enfermedad, esto es, comprender las
claves en las que asienta la patogénesis.
El diluvio de datos generados por los trabajos de secuenciación genómica ha forzado un salto cualitativo en la aplicación
de la Bioinformática, necesario para poder
analizar la información producida. La evolución de la Biología “in silico” no es la
única alianza interdisciplinaria surgida de
la era posgenómica. La tecnología de los
microarrays, proteómica, inmunoinformática, biología estructural y química combinatoria, en todas las cuales se ha basado el conocimiento de la genómica, han
abierto la puerta a otras tecnologías de
alto rendimiento que han incrementado
la eficiencia con la que han podido identificarse nuevos genes de virulencia,
dianas potenciales para fármacos y antibióticos y estrategias para el diseño de vacunas, como antes señalamos.
El genoma de una bacteria esta compuesto por genes conservados y genes accesorios, variables. Elementos genéticos
móviles, como plásmidos, transposones,
secuencias de inserción, integrones, profagos, islas genómicas e islas de patogenicidad, son parte de los genes accesorios
y poseen una influencia significativa en el
fenotipo y en la biología de los microorganismos, facilitando, además, el intercambio genético ínter e intraespecie, lo
que contribuye a su diversidad, desempeñando un papel muy importante en la patogenicidad de los microorganismos. Un
análisis genómico más detallado permite
descubrir otros pequeños elementos genéticos, como sucede con genes ARN (no
codificantes), que pueden desempeñar un
papel significativo en la regulación génica.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 321
Sanidad animal y biotecnología
321
Los genomas bacterianos están altamente
diversificados en lo que se refiere a tamaño, número de copias, topología o
contenido G+C. La mayoría de los cromosomas bacterianos están continuamente
experimentando una reorganización muy
activa, con deleciones, duplicaciones y adquisiciones de ADN mediante transferencia horizontal, todo lo cual produce
una gran diversidad, encargándose después la selección natural de escoger a los
más adaptados. La mayoría de los genomas contienen genes accesorios que
incluyen determinantes para la adaptación al hospedador, virulencia y resistencia
a los antibióticos.
El incremento progresivo del número de
genomas secuenciados está permitiendo
conocer cada vez con mayor profundidad
los procesos moleculares que tienen lugar
en la evolución de los microorganismos,
especialmente en las bacterias. El análisis
genómico comparativo entre cepas virulentas y no virulentas de la misma especie
proporciona una información muy valiosa
sobre los mecanismos de adquisición y
evolución de la virulencia. Los factores de
virulencia se definen como genes o productos de genes que facilitan la interacción bacteriana, la subversión, la destrucción de las células del hospedador o la
neutralización de sus mecanismos de defensa.
Las especies virulentas han evolucionado
desde grupos numerosos y divergentes de
bacterias. Los estudios de prevalencia de
bacterias patógenas han puesto de manifiesto que su representación sobre el total
de especies microbianas es muy pequeña
y que siempre derivan de especies no patógenas o de cepas o especies estrechamente emparentadas. Las propiedades de
una bacteria que determinan si será o no
patógena son numerosas, y los genes correspondientes se adquieren a partir de
otras especies, mediante la participación
de plásmidos (conjugación) o fagos (transducción) o directamente del ambiente exterior (transformación). En el caso de las
bacterias intracelulares no patógenas, evolucionan a virulentas a partir de mutaciones
endógenas, que incluyen deleciones, inserciones, duplicaciones de genes, fusiones y
reordenaciones (figura 20).
Dentro de una misma especie, las variaciones en la virulencia entre cepas son
una circunstancia habitual. La disponibilidad de genomas secuenciados permite
el uso de microarrays de ADN para investigar la base genética de esa variación.
Genómica funcional. Estudios de
microarrays de ADN
La tecnología de microarrays de ADN ha
facilitado la identificación de determinantes relacionados con la virulencia,
genes responsables de la susceptibilidad
o de la especificidad de hospedador y
genes bacterianos y del hospedador que
se activan o se reprimen durante la infección. En el estudio de la identificación y
verificación del papel de los genes sospechosos de estar relacionados con la virulencia, son críticas la disponibilidad de
mutantes isogénicos y las pruebas de virulencia. Desgraciadamente, para la mayoría de los genomas de patógenos secuenciados, el 25% o más de los ORF
identificados no coinciden con ningún
gen conocido y, por ello, sus funciones
son desconocidas (se les denomina genes
FUN, de “functions unknow”). Con frecuencia, estos genes FUN son específicos
de especie o de cepa.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 322
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
322
M
Plasmaid
N
Pl
L
DNA
M
PAI
M
N
N
L
L
m
Mutations
Non virulent strain
L
Virulent strains
Figura 20. Evolución de una especie avirulenta a virulenta. Mecanismos de transferencia de genes de factores
de virulencia.
Para poder comprender los mecanismos
de patogénesis necesitamos de estrategias multidisciplinares con el fin de definir
y probar la estructura de este tipo de
genes. A tal efecto, los microarrays de
ADN y la modalidad de PCR de análisis de
genoma completo (WGPScanning) permiten analizar y comparar el contenido de
genes de las cepas bacterianas secuenciadas con los de otros aislados de la
misma especie o de cepas estrechamente
relacionadas.
Los microarrays de ADN, elaborados a
partir del ADN o bien del ADNc desnaturalizado o de los productos genómicos
amplificados por PCR para preparar las
matrices de ADN (spotted DNA arrays), se
han utilizado para medir la expresión de
todo el genoma (bien de modo natural o
como respuesta a cualquier variable de
tiempo ambiental) o de grandes regiones
del mismo de muchas bacterias, y también para comparar el contenido genético
completo de las cepas bacterianas secuenciadas con las de las cepas estrechamente relacionadas o con otros aislados
de la misma especie. De este modo, por
ejemplo, los microarrays han facilitado la
identificación de determinantes sospechosos de virulencia y de los genes que
determinan la especificidad de hospedador en algunas bacterias, como ocurre
en el caso del género Porucella, en el que,
cuando se dispuso del genoma completo
de B. melitensis 16M, se preparó un microarray con oligonucleótidos de alta densidad con el fin de compararlo con el genoma de otras especies del género (146),
y los resultados pusieron de manifiesto
que la mayoría de ORF de B. melitensis estaban presentes en el resto de especies
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 323
Sanidad animal y biotecnología
323
(B. abortus, B. ovis, B. suis, B. neotomae
y B. canis), lo que evidenciaba que este
género presentaba una diversidad genética muy limitada y que muchos de los
genes potencialmente relacionados con la
virulencia se agrupaban en nueve GEI
(islas genómicas). Al comparar B. melitensis con B. ovis y B. neotomae, que no
son patógenas para el hombre, mediante
microarrays seguido de clonaje por PCR y
secuenciación, pudo comprobarse que
había 84 ORF que estaban presentes en
B. melitensis y ausentes en B. ovis, 80 de
los cuales se agrupaban en cinco regiones
correspondientes a otras tantas islas genómicas del genoma de B. melitensis. B.
neotomae, sin embargo, pese a no ser patógena para el hombre, también presentaba tales islas. La posible explicación
puede tener que ver con que en esta especie el nivel de expresión es mucho más
bajo que en B. melitensis o simplemente
que los genes de referencia están inactivados (este tipo de cambios no los detecta el microarray).
Los microarrays también se han utilizado
para detectar e identificar genes específicos de cepa o la diversidad intraespecífica, como sucede en el caso de muchos
patógenos bacterianos, como Streptococcus pneumoniae, Salmonella enterica
Typhimurium, Campylobacter jejuni,
E. coli y otros (147, 148). También se han
utilizado para analizar la expresión de
genes en el genoma completo (transcriptoma) de E. coli uropatógeno en el curso
de la infección experimental en el ratón
(149), en el que se han propuesto hasta
25 genes previamente implicados con la
virulencia bacteriana, incluyendo los relacionados con la adquisición de Fe, síntesis
de cápsula, de proteínas secretadas, etc.
Utilizando tecnología de micromatrices
se han estudiado los efectos transcripcionales globales (la expresión génica) sobre
las células del hospedador susceptible, en
varios patógenos bacterianos, principalmente de interés en Medicina Humana,
como Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori o Chlamydia trachomatis, además de otros agentes de
zoonosis, como Listeria monocytogenes
o Salmonella Typhimurium (150, 151).
Muchos de los genes sobrerregulados codifican para citoquinas proinflamatorias
(como IL-8, IL-6 y otras) y muchos de los
subregulados lo hacen para factores
transcripcionales y moléculas de adhesión
celular (152).
Esta capacidad de producir información
de interés para la comprensión de los mecanismos de patogénesis de las bacterias
patógenas, sin embargo, no ha rendido
toda su capacidad plena, principalmente
como consecuencia de los problemas asociados con la expresión de los genes durante las infecciones reales en las que
surgen cuestiones como el bajo número
de bacterias en los tejidos vivos, dificultades en la purificación de las bacterias (y
del ARN bacteriano) a partir de los tejidos,
la inestabilidad potencial del ARNm
(aunque esto puede resolverse en buena
medida mediante el uso de reactivos de
estabilización actualmente disponibles,
como el ARN tardío –Qiagen, Hilden,
Alemania–) y su degradación durante la
purificación, además de la necesidad de
un modelo animal y otros problemas.
Además de los problema anteriores hay
que tener en cuenta también que, a causa
de la especificidad de la hibridación del
ADN, pequeñas cantidades de ARN euca-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 324
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
324
riota copurifican y afectan desfavorablemente a los resultados de los microarrays.
Así pues, existen problemas de diverso
tipo para medir la expresión génica a lo
largo del proceso infeccioso, desde la fase
inicial de invasión/colonización a la de
multiplicación y difusión tisular hasta la
fase final de la enfermedad, con daño en
el hospedador. Algunos estudios actuales
pueden proporcionar, a medio plazo, información del modo en que las bacterias
regulan la expresión génica en diferentes
fases de la infección.
La primera generación de estudios de
aplicación de micromatrices de ADN para
el conocimiento de las claves de la patogénesis bacteriana se centraron en el análisis de la expresión de los genes durante
el crecimiento, en condiciones determinadas (in vitro) que reproducían algún aspecto de la infección. Estos estudios per-
mitieron una descripción detallada de la
respuesta bacteriana a las limitaciones de
Fe (153, 154), limitación de nutrientes
(155, 156), ambiente ácido (157), caída
de la tensión de oxígeno (158), densidad
bacteriana (159) y formación de biofilms.
También se han llevado a cabo varios estudios para analizar los efectos de los reguladores transcripcionales, con el objeto
de definir completamente las redes reguladoras (160).
La segunda generación de estudios llevados a cabo con microarrays se ha ocupado en medir directamente la expresión
génica en la interacción con las células eucariotas durante el crecimiento bacteriano
dentro del hospedador (tabla 1).
En un total de cuatro experimentos publicados se comparó el crecimiento in vivo
con el crecimiento in vitro en medios de
laboratorio. Tres de los estudios analizaron
Tabla 1. Medición a gran escala de la expresión de genes o proteínas en infecciones
reales o interacciones con células del hospedador.
Especie
Crecimiento in vivo
B. burgdorferi
Tipo de experimento
Microarray ADN
Perfil antigénico
Id. P. multocida
Microarray ADN
Id. V. cholerae
Interacción con células
en cultivos de tejidos
Chlamydia pneumoniae
Id. N. meningitidis
Electroforesis en dos
dimensiones
Microarray ADN
Descripción del estudio
Crecimiento en membranas de
diálisis implantadas en ratas.
Alteración de la expresión de
lipoproteínas y del perfil
antigénico durante la adaptación
a hospedador, en el ratón.
Expresión de genes durante el
crecimiento en sangre y en
hígado de pollos infectados.
Expresión de genes durante el
crecimiento en asa de íleon de
conejo y en heces “en agua de
arroz”.
Expresión de proteínas durante
el crecimiento en células Hep-2
en respuesta a IFN-γ.
Interacción con células epiteliales
y endoteliales.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 325
Sanidad animal y biotecnología
325
directamente la expresión del genoma
bacteriano completo durante el crecimiento en los tejidos de un hospedador
eucariota vivo (161-163), mientras que el
cuarto analizó la expresión génica en bacterias recién liberadas de los tejidos del
hospedador, en el lumen del intestino.
Tres de los estudios llevaron a cabo hibridaciones competitivas de ARN in vivo e in
vitro, para comparar directamente la expresión génica en dos lugares distintos,
mientras que el cuarto estudio comparó
la expresión génica de muestras de ambos
in vivo e in vitro respecto de una muestra
de referencia común (ADN genómico).
A pesar de que los análisis se llevaron a
cabo sobre diferentes especies de bacterias (Vibrio cholerae y Pasteurella multocida), se pudieron observar similaridades
en los cuatro experimentos. Todos ellos
mostraron sobrerregulación sustancial de
los genes implicados en el metabolismo
de los aminoácidos, biosíntesis de purinas
y transporte del Fe. Los genes de los operones ily y pur estaban sobrerregulados y
muchos de los cambios revelaron también
sobrerregulación de los genes implicados
en el transporte de aminoácidos y carbohidratos. Incluso se observó un gran número
de transportadores ABC también sobrerregulados. En cualquier caso, en el ambiente
in vivo, bien en asa de íleon de conejo, hígado o en heces diarreicas (cólera), los nutrientes disponibles estaban marcadamente reducidos cuando se comparaban
con los del medio in vitro. Aunque los estudios corrientes han comparado la expresión génica con el crecimiento en medios
ricos in vitro, la razón principal para esta
aproximación ha sido el deseo de identificar potenciales genes de virulencia, más
que los sobrerregulados in vivo, simple-
mente en respuesta al ambiente nutricional in vivo. Sin embargo, muchos de
estos genes han sido identificados por
mutagénesis marcada (STM) como necesarios para la supervivencia in vivo (164,
165).
Estos estudios demostraron también que
un número de genes implicados en el metabolismo energético estaban sobrerregulados durante el crecimiento in vivo.
Específicamente, en cada experimento, alguno de los genes más sobrerregulados
incluian los que codificaban alternativas
particulares a los complejos aceptores de
electrones. Tanto en el caso de V. cholerae, purificado a partir de heces diarreicas, como en P. multocida, purificada
a partir de sangre de aves, el operón nap
(periplasmic nitrate reductase) estaba altamente sobrerregulado. En el caso de
V. cholerae cultivado en asa de íleon de
conejo, el operón frd (fumarate reductase) estaba sobrerregulado, y en P. multocida, aislado y purificado a partir de hígado de pollo, el operón dms (dimetil
sulfoxide reductase) estaba, igualmente,
sobrerregulado. El complejo aceptor de
electrones terminal más apropiado está
generalmente determinado por la tensión
de oxígeno y esta difiere entre los distintos
tejidos in vivo. Incluso el crecimiento de
V. cholerae en asa intestinal de conejo y
P. multocida en hígado, indican la sobrerregulación de un número de genes por
anaerobiosis. Como antes, estas medidas
fueron comparadas con el crecimiento in
vitro en medios de laboratorio, definiendo
la anaerobiosis por comparación con el
ambiente in vitro altamente aeróbico.
Estos experimentos in vivo han demostrado la variable expresión de factores de
virulencia conocidos. En V. cholerae, en el
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 326
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
326
que están definidos muchos factores de
virulencia, solo se expresan un pequeño
número de estos en los microorganismos
purificados a partir de la diarrea, incluyendo los genes implicados en el metabolismo de aminoácidos, metabolismo de las
purinas y respuesta de tolerancia a los
ácidos. Ninguno de estos genes incluidos
en el regulón ToxR/TcpP/ToxT fue identificado como expresado de forma diferencial en su nicho hospedador, lo que indica
que estos genes se expresan transitoriamente y no son necesarios para que la
bacteria se elimine del hospedador. Sin
embargo, un número de genes de virulencia se expresaban en las bacterias
cuando se cultivaban en el asa ligada de
intestino de conejo. Un total de 12 genes
de los 300 que se expresaban in vivo formaban parte del grupo funcional en la
patogénesis, e incluían reguladores de la
virulencia como tcpP, tcpH y toxR, los
genes de la hemolisina y transportadores
de la hemolisina hlyA y hlyB y el gen de la
proteasa con actividad hemaglutinina
hapR. En el caso de P. multocida, una tercera parte de los genes identificados
como factores de virulencia por STM también se identificaron como regulados diferencialmente durante el crecimiento en
sangre de pollo.
En el caso de Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), se han publicado también varios estudios sobre expresión génica, dos de ellos estudiaron los cambios
en la expresión del genoma completo durante el crecimiento en membranas de
diálisis implantadas en la cavidad peritoneal de rata (166) y uno más se centró específicamente en la expresión de lipoproteínas durante el crecimiento en ratones
(167). Los perfiles de expresión génica ob-
servados diferían sustancialmente de los
observados en el caso de P. multocida y
V. cholerae cuando crecía en tejidos. Se observaron pocos cambios en los genes implicados en el metabolismo energético o
en el de los aminoácidos, carbohidratos o
en el transporte del hierro, lo que se interpreta debido a la baja tasa de crecimiento
en el ambiente de los mamíferos. El
cambio más notable observado en B. burgdorferi implicó la expresión de componentes de membrana externa, particularmente lipoproteínas, por lo que parece
que B. burgdorferi responde primariamente a la respuesta innata o adaptativa
del sistema inmune o a ambas, resultando
en la subregulación de un gran número de
componentes de superficie, incluyendo alrededor de 100 lipoproteínas.
En el caso de muchos patógenos humanos específicos, no existen modelos
animales bien definidos, por lo que los estudios de expresión génica durante las infecciones reales son muy complicados o
imposibles de realizar. En algunos casos
se han llevado a cabo estudios de interacción con células, como sucede en el caso
de N. meningitidis, comparando los resultados de expresión sobre células epiteliales o endoteliales respecto de los que
se observan en cultivos in vitro, en medios
de cultivo (168).
En definitiva, la comparación de estudios
in vivo con estudios definidos in vitro, permite la deconstrucción de los estímulos
que actúan en el microambiente representado por el nicho hospedador. Esta posibilidad representa un aspecto prometedor de los estudios de expresión génica
que todavía no ha sido completamente
explorada. En el caso de P. multocida,
cuando crece en pollos, el perfil de expre-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 327
Sanidad animal y biotecnología
327
sión de la bacteria en dos de cada tres
animales es similar a los genes que se observan sobrerregulados en condiciones de
escasez de hierro in vitro. Tal análisis comparativo puede ampliar el conocimiento
de cómo la presión selectiva actúa sobre
los patógenos durante la infección. De
hecho, este primer análisis de P. multocida
indica que al menos en una de las infecciones el perfil de expresión de los genes
bacterianos difiere del que se observa en
condiciones limitantes de hierro, lo que
sugiere que una respuesta bacteriana a
bajas concentraciones de Fe solo se produce en algunos hospedadores o en
ciertos estadios de la infección (169).
PCR de análisis de genoma completo
(WGPScanning)
La PCR de genoma completo (WGPScanning –Whole Genome PCR Scanning–)
representa otra estrategia para el análisis
genómico desarrollada por Ogura et al.
(2006) (170), cuyo principio se basa en diseñar un set de parejas de primers que
amplifican segmentos superpuestos con
segmentos adyacentes en ambos extremos y que cubren el genoma completo
de una cepa de referencia secuenciada.
Comparando los fragmentos amplificados
con los del genoma de referencia, puede
determinarse si las regiones diana están
organizadas en el mismo orden y si los
segmentos entre las regiones diana están
sometidos a cualquier cambio estructural
principal, incluyendo deleciones o inserciones. Los autores señalados desarrollaron un set de pares de primers basados
en la secuencia genómica de E. coli 0157,
con el fin de determinar la diversidad genómica de este linaje, demostrando su
existencia en grado significativo, a lo que
contribuía la variación de los profagos localizados en las islas genómicas.
Construcción de mutantes isogénicos
de genes candidatos de virulencia
Como se ha señalado al principio, para
definir y verificar el papel de los genes en
estudio como potenciales genes de virulencia y en consecuencia implicados en el
proceso de patogénesis de las enfermedades con las que se relacionan, se hace
necesaria la construcción de mutantes isogénicos. Tales mutantes deben ser estudiados posteriormente, bien en ensayos
de virulencia en cultivos celulares o en
modelos animales de la enfermedad o en
la enfermedad natural misma, confirmando de este modo su papel o papeles
en la patogénesis.
Genómica comparada para la
identificación de genes de virulencia
Depende de la disponibilidad de genomas
secuenciados. Sobre las disponibilidades
de los existentes, se han publicado ya algunos estudios que han puesto de manifiesto, por ejemplo, interrelaciones positivas entre el contenido de genes y el
tamaño del genoma cuando se refieren a
bacterias, arqueas y eucariotas. Los genomas más pequeños se caracterizaron
por los genes esenciales.
En un estudio en el que se compararon
las secuencias genómicas completas de
cinco proteobacterias y una cepa no patógena, se concluyó que las cinco bacterias patógenas compartían aproximadamente la mitad de sus genes y que las
variaciones que se relacionaban con la virulencia incluían genes que codificaban,
por ejemplo, para el LPS, flagelos o lipoproteínas.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 328
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
328
En un futuro es previsible que la información procedente de la genómica se combine con un detallado análisis proteómico
(ver después), pues los genes sospechosos
de virulencia, identificados a partir de la
secuenciación de los genomas, deben ser
verificados experimentalmente mediante
la construcción de mutantes isogénicos,
probando las construcciones en modelos
animales apropiados, trabajo en el que se
impone el uso de animales transgénicos y
ratones knockout, deficientes en la respuesta inmune innata o en rutas de transducción de señales.
Transcriptómica
La transcriptómica (171) se ocupa del estudio y comparación de los transcriptomas. Bajo esta denominación se refieren
los conjuntos de ARNm (o transcritos) presentes en una célula, tejido, microorganismo u organismo y sus niveles relativos
de expresión en condiciones definidas. En
otras palabras, los transcriptomas refieren
el conjunto de genes que se están expresando en un momento dado y que constituyen el fenotipo molecular de la célula
u organismo de prueba.
Si se toma como referencia cuanto se conoce acerca de la transcriptómica humana, se ha descrito que solamente el
3% de los genes están expresándose en
un momento dado, lo que, a primera
vista, pudiera hacer pensar que el transcriptoma es mucho más simple que el genoma y, sin embargo, nada más lejos de
la realidad, porque el transcriptoma es
mucho más amplio que la parte que se
transcribe del genoma. La complejidad
obedece a la existencia de empalmes alternativos del ARN (splicing) y otros cambios, de tal modo que cada gen puede
dar lugar, potencialmente, a muchos
transcritos, cada uno de los cuales puede
1st Reaction
pre-mRNA
1st Exon
Intron
2nd Exon
2nd Reaction
Intron Lariat
Spliced mRNA
Translation
Figura 21. Splicing del ARN (http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_splicing).
Discard
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 329
Sanidad animal y biotecnología
329
tener un único perfil de expresión. En
casos extremos, donde un gen tiene muchos intrones y se somete a un procesamiento diferencial amplio, potencialmente
puede producir miles o millones de transcritos distintos.
Pese a su complejidad, nunca se considera
un sistema in vivo completo porque todos
los genes no se expresan simultáneamente, ni al mismo nivel. Las células o los
microorganismos (bacterias, hongos, etc.)
transcriben un set básico de genes constitutivos (housekeeping genes) cuya actividad se requiere siempre para funciones
elementales, pero hay que tener en
cuenta que otros genes, probablemente
la mayoría, se expresan solo de forma regulada, como parte de un programa de
desarrollo o en respuesta a estímulos externos, por ejemplo. De igual modo, los
eventos postranscripcionales (los empalmes, por ejemplo) también son procesos regulados.
En una célula en particular, algunos
ARNm son muy abundantes, otros lo son
de forma moderada y el resto lo son solo
raramente. Con el fin de obtener una
perspectiva global de la expresión del ARN
en un microorganismo o en una célula,
deben cuantificarse todos estos transcritos al mismo tiempo, lo que requiere el
uso de un formato de ensayo que sea a
la vez selectivo y sensible. A tal efecto
existen dos alternativas comunes para el
análisis de la expresión del ARN global:
por un lado, el muestreo directo de secuencias a partir de una fuente de poblaciones de ARN o de librerías de ADNc, o
a partir de bases de datos de secuencias
derivadas de los mismos o un análisis de
hibridación con colecciones de secuencias
de ADN no redundantes inmovilizadas en
un soporte sólido, esto es, microarrays de
ADN. Aunque este tipo de análisis habitualmente se denomina “perfil transcripcional”, no supone en realidad la búsqueda del nivel de transcripción sino el
nivel de ARNm en estado estacionario,
que también tiene en cuenta la tasa de
rotación del ARN. Además, la mayoría de
las técnicas de perfil transcripcional no
miden el nivel de ARN absoluto, sino más
bien los niveles comparativos relativos
dentro y/o entre muestras.
Los niveles de ARNm en estado estacionario pueden cuantificarse directamente
mediante el muestreo de secuencias. Los
primeros estudios de expresión génica a
gran escala implicaron el muestreo de secuencias marcadas (EST, Expressed
Sequence Tags) a partir de librerías de
ADNc. Históricamente, el primer estudio
de expresión global de genes se basó en
la secuenciación a gran escala de clones
de librerías de ADNc (172). Con carácter
general, se considera que una librería de
ADNc que no ha sido “normalizada” es
representativa de los ARNm en la población fuente utilizada para prepararlo.
Algunos ARNm (y los correspondientes
ADNc) son muy abundantes, en tanto que
otros son extremadamente raros. Por
ejemplo, si se pican 5.000 clones al azar
a partir de la librería y se obtienen las secuencias parciales, los transcritos más
abundantes podrían ser más representativos entre las secuencias obtenidas que
los transcritos raros. El análisis estadístico
de estos resultados permitiría determinar
los niveles de expresión relativa. Esta estrategia no es particularmente sensible y
depende de la disponibilidad de datos EST
a partir de fuentes apropiadas. El pro-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 330
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
330
blema principal reside, además, en la gran
cantidad de secuencias que requiere.
Veculescu et al. (1995) (173) propusieron
una técnica de análisis seriado de la expresión génica (SAGE, serial analysis of gene
expression), que implica esencialmente la
generación de EST muy cortos (de 9 a 14
nucleótidos) denominados “SAGE tags”
(etiquetas de análisis seriado de expresión
de genes), que se unen en largos concatámeros (en tándem) que son clonados y,
después, secuenciados. El tamaño de las
“SAGE tags” se acerca al límite menor requerido para una identificación de genes
específicos sin ambigüedades. Las “etiquetas” concatamerizadas son secuenciadas y las secuencias se analizan para resolver la secuencia individual, lo que da
una idea de la abundancia de ARNm.
En comparación con la secuenciación aleatoria de las librerías de ADNc, SAGE es
hasta 50 veces más eficiente, porque cada
concatámero representa la presencia de
muchos ADNc. La ventaja principal, sin
embargo, es que los datos obtenidos son
representaciones digitales de los niveles
de expresión absoluta que permiten la
comparación directa entre nuevos experimentos y las bases de datos existentes. El
método SAGE descrito originalmente por
Veculescu et al. (1997) se muestra en la
figura 22. ARN PolyA+ es transcrito de
forma reversa utilizando un primer oligodT biotinilado y el ADNc es digerido con
una enzima de restricción (NlaIII) que le
divide intensamente y que reconoce la secuencia de 4 pb CATG y de la que es esperable que le corte cada 250 pb. El extremo 3’ de cada ADNc se captura por
afinidad a estreptavidina, lo que da lugar
a un grupo representativo de extremos de
ADNc que se pueden utilizar para generar
etiquetas de análisis seriado de expresión
de genes. El grupo se divide después en
dos subgrupos, cada uno de los cuales se
fusiona a un enlazador (linker) diferente.
Estos enlazadores o conectores contienen
sitios de reconocimiento para enzimas de
restricción de tipo III, tales como la enzima
FokI, la cual tiene la propiedad inusual de
cortar fuera del sitio de reconocimiento,
en un número específico de bases corriente abajo. La división con una enzima
de este tipo, por lo tanto, genera la
“SAGE tags” unida a parte del enlazador.
Las etiquetas (tags) están ligadas “cola
con cola” para generar dímeros denominados “ditags” (bi-etiquetas) y entonces
es cuando se amplifican por PCR utilizando los enlazadores como primers. Los
productos de la amplificación se tratan
con la enzima de restricción NlaIII, para
eliminar los enlazadores, y los dímeros de
etiquetas se concatamerizan. Los concatámeros se clonan por un procedimiento
estándar y los plásmidos resultantes se secuencian para revelar la composición del
concatámero (Primrose y Twyman, 2006)
(174).
El método SAGE de perfiles de expresión,
modificado para reducir la probabilidad
de genes indeterminados (ambiguos), se
ha aplicado a muchos sistemas diferentes.
En el contexto de las enfermedades humanas se ha utilizado ampliamente, sobre
todo en procesos cancerígenos humanos
(175, 176). En Microbiología, SAGE se ha
aplicado para estudiar el transcriptoma de
levaduras y dividir el genoma en dominios
funcionales de expresión. También en el
caso de Plasmodium falciparum, el agente
de la malaria, para estudiar el transcriptoma en diferentes estadios del ciclo biológico (177). En los últimos años, las apli-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 331
Sanidad animal y biotecnología
331
caciones en Sanidad Animal han proliferado con rapidez; Miller et al. (2008) (178)
estudiaron el efecto del virus del PRRS
sobre los macrófagos alveolares porcinos;
Nelly et al. (2008) estudiaron los efectos
de la infección por el virus de la diarrea vírica sobre células endoteliales (179) y Hu
et al. (2008) (180) llevaron a cabo un estudio sobre la adaptación metabólica de
Cryptococcus neoformans en el curso de
la infección pulmonar. En estas fechas
también se propusieron diversas mejoras
del método, como es el caso del RL-SAGE
(Robust-Long SAGE) (181), que incrementa significativamente la eficiencia en
el clonaje de concatámeros y el tamaño
del inserto.
La tecnología de microarrays de ADN ha
emergido como un método de elección
para el análisis de la expresión de ARN de
alto rendimiento, permitiendo el análisis
paralelo de miles de genes en un dispositivo miniaturizado. En este caso, las matrices diana de ADN se prueban por hibridación con una sonda compleja, por
ejemplo, una sonda que comprende muchas secuencias diferentes que se preparan a partir de una población de ARN
procedente de una célula, una bacteria o
un tejido. La composición de la sonda refleja la abundancia de transcritos individuales en la población de ARN fuente. El
uso de los microarrays permite la medida
simultánea de los niveles relativos de muchos transcritos, aunque una limitación
importante reside en que estos dispositivos son cerrados y solamente pueden
medirse las secuencias representadas en
los arrays, al contrario de lo que ocurre
con las técnicas de muestreo de secuencias, que son sistemas abiertos.
En los análisis de expresión están disponibles dos tipos principales de microarrays
de ADN, los arrays de “spots” (manchas)
de ADN y los “chips” de oligonucleótidos
impresos. En los primeros puede utilizarse
un formato sobre nailon o sobre vidrio.
Figura 22. Principio del análisis seriado de expresión
de genes (SAGE) (Veculescu et al., 1997, modificado
por Primrose and Twyman, 2006) [Anchoring
enzyme (Nla III); Tagging enzyme (Fok I); B Biotin].
La disponibilidad de set de clones para la
fabricación de los arrays de spots no es
grande, pero es suficiente. Tres compañías
(Research Genetics, Incyte Genomics y
Genosys Biotech) disponen de colecciones
humanas, de ratón o de rata, y entre los
procariotas se incluyen E. coli y Bacillus
subtilis (en ambos casos, colección completa de ORF), además de algunas otras
bacterias (aunque colecciones parciales) y
también se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Arabidopsis tha-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 332
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
332
liana, Caenorhabditis elegans y Drosophila
(Primrose y Twyman, 2006) (tabla 2).
Aunque con alguna discusión, se admite
que los microarrays de spots y los chips,
funcionan aproximadamente igual en términos de sensibilidad; en cualquier caso,
una importante diferencia entre ambos es
que para la fabricación de los chips se requiere información previa de secuencias
completas, mientras que en el caso de los
spots pueden generarse utilizando clones
no anotados (anónimos) a partir de librerías de ADNc sin caracterizar, pudiendo
utilizarse, entonces, para el descubrimiento de genes de novo. La ventaja de
los chips es que están diseñados in silico,
por ejemplo, utilizando bases de datos
como fuente de información, lo que supone que no es necesario mantener sets
de clones físicos de ADN.
En los últimos años se ha producido un
incremento exponencial del número de
experimentos publicados basados en los
arrays y han surgido aplicaciones extremadamente diversas que cubren, entre
otros, el campo de la clínica y la farmacología.
Como hemos señalado ya en otras ocasiones, la Sanidad Animal cumple, desde
el punto de vista humano dos principios
y aplicaciones fundamentales: por un
lado, el estudio e interés que se deriva del
conocimiento y control de las enfermedades compartidas (las zoonosis) en las
que la fuente animal condiciona la enfermedad humana, bien como consecuencia
de que el animal padezca la enfermedad
o cuando se comporta como un reservorio subclínico del agente que la produce
y, en segundo lugar, cuando consideramos las distintas especies animales,
desde los roedores a los primates, pero sin
excluir ninguna otra especie, como modelos de estudio, para la obtención de conocimientos que después se aplican al
hombre. En este último sentido, por
ejemplo, la tecnología de manipulación
genética que acabamos de señalar es
capaz ahora de diseñar estrategias alternativas para crear modelos de enfermedades específicas, como ciertas formas de
cáncer producidas en ratón o de enfermedades producidas por priones, en el caso
del hámster o el ratón, por poner simplemente unos pocos ejemplos. En el caso
de las enfermedades infecciosas, la tecnología de las vacunas de ADN (ver después) es otro ejemplo de la utilización de
estas técnicas, particularmente interesante donde no existen tratamientos convencionales o fallan las vacunas tradicionales, como sucede con la tuberculosis y
otras (en el caso del hombre, sarampión,
VIH, Ébola o enfermedades por priones,
entre otras).
Las aplicaciones de los perfiles de expresión en el campo de la salud han estado
hasta ahora dirigidas de forma casi exclusiva al hospedador humano, tanto para
identificar perfiles transcripcionales que
permitan la identificación de nuevos marcadores de enfermedad (sobre todo
cáncer, en los que se utilizan, por ejemplo,
para la clasificación de tumores) como de
la investigación de posibles nuevas drogas
para uso terapéutico. No obstante, las
aplicaciones, tanto en el campo humano
como veterinario, son muy amplias.
En el campo de la biomedicina veterinaria,
se han aplicado estudios de perfiles de expresión génica principalmente en el caso
de los perros, en situaciones de cardiomiopatías, degeneración de la válvula mi-
Moderado
Caro, pero los precios bajan
Spotting (manchado) manual o robotizado
Nailon
Radioactiva o enzimática
Volumen elevado (hasta 50 ml*), ~ a 65 ºC.
Autorradiografía o fosforimagen para
sondas isotópicas, escáner plano para
sondas enzimáticas
Bajo
Barato
Fabricación
Substrato
Marcado de la sonda
Hibridación
Adquisición de datos
* Debe señalarse que en los microarrays de nailon existen opciones de hasta 5.000 rasgos por cm2 y solamente requieren 100-200 µl de solución de
hibridación.
Imposible, no disponible
Alto
13:06
Coste del array
prefabricado
Fabricación casera
> 5.000
1-10*
Densidad (rasgos/cm2)
Chips (Affymetrix)
Oligonucleótidos de una cadena
.
Secuencias derivadas de bases de
datos públicas o privadas.
Sintetizadas químicamente
Típicamente, 20-25 nucleótidos
Los clones sencillos están
representados por sets de ~ 20
oligos no solapados, para reducir
los falsos positivos
64.000 para los chips disponibles,
pero experimentalmente hay
versiones de hasta 1 millón
Síntesis fotolitográfica en el chip
Vidrio o silicio
Fluorescente
Volumen bajo (200 ml) a 40 ºC
Escáner confocal
17/12/12
Spotting robotizado
Vidrio
Fluorescente dual
Volumen muy bajo (10 µl) a ~ 65 ºC
Escáner confocal
Los rasgos individuales representan
clones no redundantes; alta sensibilidad de
hibridación
Microarrays de spots de vidrio
Fragmentos de ADNbc genómico o clones de
ADNc o productos derivados de PCR
Mantiene series de clones, bien anotados o
anónimos. Deben derivar de una fuente de
ARN o comercializados
Macroarrays de spots de nailon
Fragmentos de ADNbc genómico o clones
de ADNc o productos derivados de PCR
Origen (fuente) de la diana Mantiene series de clones, bien anotados
o anónimos. Deben derivar de una fuente
de ARN o comercializados
Tamaño
Típicamente, 100-300 pb
Formato del array
Los rasgos individuales
representan clones no redundantes;
alta sensibilidad de hibridación
Propiedad
Composición de la diana
Tabla 2. Propiedades de diferentes tipos de arrays de ADN para análisis de expresión (Primrose y Twyman, 2006).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
Página 333
Sanidad animal y biotecnología
333
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 334
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
334
tral, dermatitis atópica, atrofia pancreática o enfermedades del sistema nervioso
central (SNC) (182). Además de las anteriores, otros procesos como fibrilación
atrial, fallo cardiaco, enfermedad crónica
renal y miositis, también estudiados mediante perfiles de expresión, han servido
de modelo para las correspondientes enfermedades humanas (Kort et al., 2009).
En otras especies animales se han utilizado, por ejemplo, en la mastitis bovina
producida por S. aureus (183) o en la artritis ósea de los caballos (184). También
se han utilizado en la identificación de
marcadores diagnósticos, dianas terapéuticas o factores relacionados con la resistencia natural en paratuberculosis (185),
tripanosomiasis en el ganado bovino
(186), salmonelosis (187) y cocidiosis en
aves (188), en la anemia infecciosa del
salmón del Atlántico, producido por un
isavirus, de la familia Orthomyxoviridae
(189), parasitosis de los ovinos por nematodos gastrointestinales (190), así como
en la respuesta a la vacunación frente a
diversos procesos en peces de consumo,
como el lenguado o la trucha (septicemia
hemorrágica vírica, necrosis hematopoyética infecciosa), o en el ganado bovino. En
todos los casos, los estudios de perfiles de
expresión mejoraron el conocimiento de
la biología de las enfermedades y añadieron nuevas estrategias de diagnóstico,
terapéutica y manejo, que se tradujeron
en una mejora de la calidad de vida y supervivencia o mayor eficiencia en la producción, según el caso.
Estudios de proteómica
Si la genómica se ocupa del estudio del
genoma, su expresión conduce a la formación del transcriptoma que es el com-
plemento de los ARNm que reflejan los
genes estructurales de un organismo; sin
embargo, esto es mucho más complejo
de lo que parece a simple vista, dado que
la transcripción del genoma es sensible a
una amplia variedad de factores relacionados con el contexto de la célula y su entorno. En un momento dado, incluso,
solo se expresan un subset del total de
genes, tanto se trate de una célula individual (una procariota o una eucariota) o
asociada formando tejidos en un hospedador. Cuando las condiciones cambien
también cambiará la expresión del transcriptoma, por lo que el principal factor de
confusión es el tiempo, una dimensión
ausente en los estudios genómicos. En las
eucariotas puede introducirse otro elemento de diversidad representado por los
“empalmes”, que pueden producir varios
ARNm a partir de un gen único. La transcriptómica (la descripción del transcriptoma y su expresión), por tanto, es potencialmente más compleja que la genómica.
La conversión del transcriptoma en su producto, esto es en la proteína, produce el
correspondiente proteoma. El proteoma
es el conjunto de proteínas expresadas por
un genoma a partir de una célula (procariota o eucariota). La proteómica es la descripción del proteoma.
Puesto que en las células y organismos
completos el transcriptoma es dependiente del tiempo, el proteoma también
lo es igualmente, aunque este último se
diferencia tanto del genoma como del
transcriptoma porque en los dos primeros
la información es esencialmente lineal (secuencial), mientras que en el proteoma
está definida tanto por estructuras secuenciales como tridimensionales (191).
Por otra parte, mientras que la comple-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 335
Sanidad animal y biotecnología
335
jidad del genoma es finita, es decir, que
puede alcanzarse aun cuando se trate del
genoma de eucariotas superiores, la del
proteoma es prácticamente infinita (192).
El análisis global de proteínas pone de
manifiesto las modificaciones postraduccionales, los productos del empalme alternativo del ARNm y la degradación selectiva de las proteínas, todos los cuales
no pueden ser conocidos cuando se
miden directamente los niveles de transcritos del ARNm.
Existen dos estrategias principales, y diferentes, de la proteómica para analizar las
mezclas complejas de proteínas. Uno de
los métodos lleva a cabo la separación de
las proteínas completas por electroforesis
bidimensional en gel de policrilamida (2DPAGE o 2DE) y la subsiguiente identificación de las proteínas individuales mediante espectrometría de masas (MS),
incluyendo MALDI-TOF.
El otro método se suele denominar tecnología multidimensional de identificación
de proteínas (MUDPIT) y lleva a cabo la separación de los péptidos proteolíticos por
cromatografía líquida, y su identificación
por espectrometría de masas acoplada en
tándem a una técnica de ionización suave
asociada a la espectrometría (MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization –desorción/ionización láser asistida por matriz– y TOF por Time-Of-Flight –detector
de iones–) (193, 194), (coupled electrospray ionization-tandem mass spectrometry). También pueden utilizarse arrays.
Existen algunos problemas técnicos que limitan el alcance de los análisis proteómicos.
El análisis del proteoma con electroforesis
bidimensional (2-DGE) habitualmente excluye las proteínas de gran tamaño, hidro-
fóbicas, o aquellas que poseen un punto
isoeléctrico extremadamente alcalino. Las
proteínas hidrofóbicas a menudo están
enmascaradas a consecuencia de su insolubilidad durante el isoelectroenfoque, los
problemas derivados de la extracción de
los péptidos hidrofóbicos a partir de matrices en gel y las dificultades de ionización de este tipo de péptidos (hidrofóbicos) para el análisis por espectrometría
de masas. Las proteínas de gran tamaño
o básicas habitualmente no se resuelven,
porque no entran en el gradiente del isoelectroenfoque o no permanecen solubles
durante él.
El MUDPIT resuelve muchas de las limitaciones impuestas por la solubilidad de las
proteínas durante el isoelectroenfoque de
la 2-DGE. Sin embargo, los geles en dos
dimensiones proporcionan una referencia
visual de la expresión de las proteínas por
comparación, y también permiten observar las modificaciones postraduccionales y la escisión de las proteínas, que no
resultan evidentes utilizando MUDPIT.
Además, MUDPIT no proporciona información cuantitativa (195). En cualquier
caso, 2-DGE y MUDPIT son tecnologías
complementarias y para obtener resultados óptimos deben usarse ambos sistemas (196). Sin embargo, al contrario de
las estrategias basadas en el ARNm, estas
tecnologías son incapaces de dilucidar el
proteoma completo.
Los arrays representan un conjunto de
moléculas que se pueden construir con
ayuda de robots. Son, en realidad, una extensión de los microarrays de ácidos nucleicos o chips, que utilizan ADNc (o los
oligonucleótidos correspondientes) derivados de una librería que pueden ensa-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 336
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
336
yados con ARNm obtenido a partir de células.
Algunos autores consideran que los arrays
forman parte de la proteómica (197). En
cualquier caso, se utilizan en proteómica
para comparar niveles de transcritos y
proteínas y para identificar las interacciones proteína-proteína, entre otras utilidades. Su valor principal reside en que
permiten conocer los patrones que pueden estar relacionados con el estímulo
causal o la patología de base, lo que tiene
algún valor diagnóstico potencial.
Los arrays de proteínas son, sin embargo,
mucho más complejos que los microarrays
de ácidos nucleicos. Pueden construirse
inmovilizando las moléculas de prueba
(algunas veces denominadas reactivos
analitos específicos, ASR) o las proteínas
de prueba. El procedimiento de unión
también es muy variable y refleja la gran
dificultad que existe para unir proteínas
nativas y mantener su estructura tridimensional a lo largo de los análisis. ASR
puede incluir anticuerpos, péptidos o aptámeros (198). También se han preparado
arrays de proteínas que reflejen, o casi, el
proteoma completo, y pueden utilizarse
para identificar la función, las interacciones proteína-proteína, etc. (199).
Es de esperar que los datos obtenidos de
los estudios con microarrays correlacionen
con los resultados de estudios proteómicos obtenidos de los mismos sistemas.
Sin embargo, en un estudio llevado a
cabo con levaduras en los que se compararon los resultados de la expresión de
proteínas (niveles de ARNm) con los obtenidos utilizando un análisis seriado de
la técnica de expresión génica, se obtuvo
un coeficiente de correlación de 0,4, lo
que indicaba que los niveles de expresión
de proteínas correlacionaban escasamente con los datos cuantitativos del
ARNm (200). Cuando se llevó a cabo un
estudio más global, en el que se compararon los niveles de ARNm obtenidos por
análisis con microarrays con los obtenidos
con niveles de expresión de proteínas utilizando una estrategia de MUDPIT/isótopo-etiqueta de afinidad codificada, se
encontró que la expresión de ARNm y el
set de proteínas implicadas en algunas
rutas biológicas sí que estaban fuertemente correlacionadas, al contrario que
otras. Este hallazgo sugiere que los mecanismos de regulación postranscripcional
están operativos en algunos casos cuando
es escasa la correlación entre los niveles
de expresión proteica y los datos cuantitativos de ARNm (201), lo que puede ser
el resultado de problemas técnicos asociados con la precisión de la medida, bien
del ARNm o bien de los niveles de la expresión proteica en una escala general
(202). No obstante, si los instrumentos
utilizados para la medida de los genes y
de la expresión de proteínas son exactos,
los datos de expresión deberían correlacionar para los transcritos y las proteínas
que conforman las vías biológicas que no
están sujetas a regulación postranscripcional o postraduccional.
Aunque el uso de la proteómica para analizar las bacterias patógenas promete
avances importantes, todavía no existe
ningún ejemplo de un análisis global de
la expresión de la proteína de un patógeno bacteriano en crecimiento dentro de
su hospedador natural o en un modelo
animal. Esta situación es consecuencia de
los problemas técnicos relacionados con
la separación de las bacterias de los te-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 337
Sanidad animal y biotecnología
337
jidos del hospedador y con la obtención
de suficiente material para llevar a cabo
un análisis en serie para que tenga significado estadístico.
Aunque no se han publicado estudios de
expresión de proteínas bacterianas en el
interior del hospedador, varios investigadores han analizado la expresión de proteínas durante el crecimiento in vitro en
condiciones que reproducen algún aspecto de la infección, incluyendo la respuesta a los cambios de la temperatura,
limitación del Fe disponible y presencia de
proteínas del suero (203), falta de nutrientes, estrés del pH (204), limitación de
Mg (205) o formación de biofilms (206).
Otros estudios han utilizado sistemas de
cultivo celular para reproducir más estrechamente el ambiente del hospedador.
Un análisis de la expresión de proteínas
de células enteras de Chlamydia pneumoniae durante el crecimiento en la línea
HEp-2 y en respuesta al tratamiento con
interferón, después del marcado radiactivo de las bacterias, puso de manifiesto
la regulación de un pequeño número de
proteínas implicadas en la replicación, metabolismo energético y síntesis de peptidoglicano.
De igual modo, un estudio del perfil antigénico de B. burgdorferi dio como resultado cambios en las proteínas antigénicas
expresadas durante el crecimiento en
ratón cuando se compararon con los cambios acaecidos durante el crecimiento en
medios de laboratorio in vitro. Este análisis permitió la medición semicuantitativa
de la expresión del antígeno de B. burdorgferi en diferentes tejidos del ratón y
mostró la expresión diferencial de algunas
proteínas de superficie. Sin embargo, el
estudio se queda corto comparado con el
estudio de un genoma completo. Cuando
se superen los obstáculos técnicos, el análisis de la expresión de las bacterias patógenas completas creciendo dentro los
hospedadores proporcionará claves importantes para profundizar en el conocimiento de los mecanismos de la patogénesis bacteriana.
Estudios de la respuesta del
hospedador a los agentes patógenos
De igual modo, el conocimiento de la
base molecular de la respuesta inmune a
la infección es un dato necesario para
comprender los mecanismos implicados
en la génesis de la enfermedad, es decir,
en la patogénesis de la misma.
En los últimos años se ha producido gran
cantidad de información en relación con
el uso de microarrays para estudiar las interacciones entre el hospedador y un
agente patógeno particular, la mayoría de
los cuales se refieren al hombre o al ratón,
y entre ellos se incluyen estudios sobre
Bordetella pertussis, Brucella abortus,
Coxiella burnetii, E. coli, Salmonella typhy,
S. aureus, Y. pestis, M. tuberculosis, L.
monocytogenes, Leishmania major,
Toxoplasma gondii, o el virus Ébola, entre
otros (207, 208).
Es conocido que la inmunidad innata desempeña un papel crítico en la respuesta
del hospedador a las enfermedades producidas por microorganismos. Por otra
parte, existe el convencimiento, cada vez
con más argumentos, de que la inmunidad innata influencia y dirige la inmunidad adaptativa. Además de ello, es un
hecho comprobado que la activación de
muchos de los elementos que intervienen
en la respuesta innata están regulados por
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 338
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
338
receptores de reconocimiento de patrones
o perfiles (PRR) que reconocen específicamente puntos estructurales específicos de
las moléculas asociadas a los patógenos.
Destaca, especialmente, la familia de receptores toll-like (TLR), que reconocen
una amplia variedad de moléculas de bacterias, hongos y virus (209).
El conocimiento del papel de los TLR en la
regulación de la inmunidad innata es crítico para la comprensión de la respuesta a
los agentes patógenos. En las células de
los mamíferos se han descrito hasta 12
tipos distintos de TLR (1-13), la mayoría
dispuestos en la superficie de las células
presentadoras de antígenos (macrófagos
y dendríticas, especialmente) y algunos en
compartimentos internos. En algunos de
ellos se desconoce su ligando, mientras
que en el caso de la mayoría son componentes de la superficie de bacterias u
hongos. El análisis, mediante microarrays,
de la expresión diferencial de genes, después de la exposición de células dendríticas a diferentes patógenos y moléculas
asociadas a ellos ha sido una estrategia
práctica eficaz para comprender cómo se
produce la inducción tanto de la respuesta innata como adaptativa (210).
Tanto los LPS como los dinucleótidos de
citosina-guanina (CpG) no metilados en
el ADN de las bacterias, se consideran
moléculas asociadas a patógenos que activan la respuesta innata mediante interacciones con TLR4 y TLR9. El LPS activa
los monocitos uniéndose a una proteína
específica denominada LBP (LPS-binding
protein) y este complejo se asocia a su vez
con el receptor CD14 que se une entonces al TLR4, que inicia una cascada de
señales intracelulares que conducen a la
respuesta inflamatoria (211). Los CpG-
ODN (CpG oligodeoxinucleótidos) sintéticos pueden utilizarse como ligandos de
TLR9 para activar distintos tipos de células
inmunes, incluyendo células NK, monocitos, macrófagos, células dendríticas y células B. Para identificar las rutas por las
que actúan los TLR, que dan lugar a la activación de funciones celulares únicas, se
han utilizado microarrays con el fin de determinar el perfil de expresión de genes
después de la estimulación de/con LPS y
CpG-ODN, comprobando que la mayoría
de los genes que se expresaban de forma
diferencial eran únicos para cada estímulo
aunque aproximadamente unos 30 genes
comunes se sobrerregulaban. En definitiva, estos estudios y otros no descritos
aquí ponen de manifiesto la utilidad de
los microarrays para estudiar las señales
celulares de respuesta a ligandos específicos y para determinar cómo moléculas
relacionadas pueden inducir respuestas
celulares diferentes.
Perspectivas futuras en los estudios
de patogénesis de las enfermedades
Es un hecho constatado que la incorporación de la tecnología de los microarrays
ha revolucionado el análisis de la expresión de genes de la totalidad del genoma
de las células y microorganismos y ha permitido la apertura de una puerta del máximo interés al conocimiento de la patogénesis de las enfermedades (212, 213).
Las técnicas tradicionales de hibridación
en microarrays se basan en la fluorescencia, pero estos métodos presentan limitaciones debido a su baja sensibilidad,
una señal de fondo elevada, extinción y
fotoblanqueo (214, 215). Actualmente
existen, sin embargo, técnicas emergentes, como la RLS (Resonance Light
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 339
Sanidad animal y biotecnología
339
Figura 23. Respuesta innata y adaptativa. Intervención de TLR y NOD frente a distintos ligandos (LPS y GpG).
http://epidemiologiamolecular.com/25/09/2010/defensa-innata-frente-a-patogenos-infecciosos/; http://genemol.org/genemol/pictures/TRL-04.html; http://www.invivogen.com/review-tlr9.
Scattering, resonancia de dispersión de
luz), que están ganando en popularidad
tanto en aplicaciones clínicas como en investigación de detección con microarrays
debido a su mayor sensibilidad. La RLS es
más sensible que la fluorescencia, produce mejor señal, no fotoblanquea (con
lo que los arrays pueden ser escaneados
repetidamente) y no necesita intercambio
de colorantes, por lo que desde todos los
aspectos, y en particular cuando la cantidad de ARN es limitada o escasa, resulta
una opción muy interesante (Wilson et al.,
2005).
Aunque está fuera de duda que los microarrays representan una tecnología importantísima para el estudio de la expresión
de genes en el curso de la patogénesis de
las enfermedades, la calidad de estos análisis depende en gran medida de la anotación precisa, interpretación correcta y
calidad de las sondas utilizadas. La anotación debe incluir tanto la valoración de
la especificidad de una determinada secuencia de la sonda para un transcripto
dado (para detectar casos de hibridación
cruzada) como de la alta calidad de la in-
formación referida a los transcriptos
mismos. Esta anotación es crítica para
poder extraer datos biológicos significativos a partir de la medida de la intensidad
de la señal en los microarrays. Es previsible
que el desarrollo progresivo y continuado
de la bioinformática mejore las anotaciones de los microarrays combinados,
con nuevos datos de instrumentos de
análisis que sean capaces de llevar a cabo
comparaciones cruzadas.
Epidemiología. Aplicaciones
de las nuevas tecnologías en
la identificación microbiana y
en Epidemiología Molecular
Introducción
El progreso de la Epidemiología depende
en buena parte, de los avances en los métodos epidemiológicos y la búsqueda de
información y conocimientos a través de
la investigación. Tanto en un caso como
en otro, las nuevas tecnologías poseen
una importancia extraordinaria.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 340
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
340
¿Cómo podríamos entender en la actualidad la emergencia de un brote de una
enfermedad infecciosa sin la ayuda del ordenador, sin la colaboración de Internet o
sin los avances de la Epidemiología genética o molecular, en suma, sin la Biotecnología? (216). A primera vista, al menos,
parece difícil, si no imposible.
rrelación, por ejemplo, entre los animales
salvajes y los domésticos y el hombre facilita constantemente el tránsito de microorganismos de unas especies a otras, con
la particularidad de que un hospedador
virgen, si es susceptible, puede ser el
origen de un brote explosivo, difícil de
controlar.
Internet, por ejemplo, ha demostrado sus
posibilidades como medio de comunicación en tiempo real, sin precedentes, sin
barreras de espacio ni de tiempo. En la actualidad, el tono del dial de radio se ha
sustituido por el “tono web” (217). Hoy
los datos sobre la presencia o difusión de
las enfermedades infecciosas pueden ser
transmitidos y, en mayor medida, lo serán
en un próximo futuro a una velocidad superior, a través de líneas telefónicas, por
cable o fibra óptica, por satélite, a través
del espectro de radio (inalámbrico) y, posiblemente, la red eléctrica. Los datos y el
software serán almacenados en granjas
de servidores y gestionados de forma profesional por los proveedores de servicios
de aplicación. Con la creciente capacidad
para captar, transmitir, almacenar y recuperar datos, surgirá la necesidad de analizarlos y transformarlos en información
útil. La combinación de información procedente de varias fuentes crea la base de
conocimiento necesaria para la toma de
decisiones (Bernardo, 2000).
Otros factores, como el comercio nacional
y sobre todo internacional de animales,
productos de origen animal, etc., representan siempre un elemento de riesgo. En
general, el movimiento de los animales
domésticos y salvajes es un factor muy importante de difusión de enfermedades.
Los ejemplos de difusión de enfermedades que han estado relacionados con
movimientos internacionales de ganado
doméstico o fauna salvaje son numerosos.
El conocimiento del volumen de estos
movimientos y los riesgos asociados a
ellos constituyen elementos fundamentales en el estudio de la epidemiología de
las enfermedades infecciosas de los animales, algunas de las cuales son importantes zoonosis. El comercio mundial de
animales, tanto legal como, sobre todo,
clandestino, igual que el de productos de
origen animal, es un factor epidemiológico de primer orden y la vigilancia epidemiológica tiene en estos asuntos un reto
de control permanente, difícil de cumplir,
para el que necesita de herramientas cada
vez más precisas y sofisticadas y la colaboración de diferentes tipos de profesionales.
Al principio nos hemos referido al complicado entramado de factores que condicionan la emergencia y reemergencia de
las enfermedades infecciosas, entre los
que se incluyen factores humanos, animales, del medio ambiente y factores dependientes de la propia evolución de la
patogenicidad de los microorganismos,
agentes etiológicos de aquellas. La inte-
La transmisión de los agentes de las enfermedades entre animales y su control es
un concepto clave en la epidemiología de
las enfermedades infecciosas, igual que lo
es definir y prevenir los tipos de contacto
que conducen a la primera transmisión.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 341
Sanidad animal y biotecnología
341
En el ganado doméstico y en otros tipos
de animales, los movimientos pueden
estar sometidos a legislaciones que mantienen controles estrictos, existiendo por
ello la oportunidad (que no se da de igual
modo en el caso del hombre) de reducir
la transmisión de las enfermedades. La
OIE (www.oie.int) se justifica en sí misma
por esta razón, y todo su trabajo, desde
su nacimiento hasta la fecha, ha estado
muy relacionado con el conocimiento y la
difusión de las enfermedades infecciosas
de los animales, y en todo ello, el movimiento es centro neurálgico. Desde su nacimiento, la OIE ha adquirido en este
campo una solvencia extraordiaria y sus
recomendaciones son aplicadas, casi sin
excepción, por todos los países adheridos,
en la confianza de reducir los riesgos. Por
desgracia y pese a todo, los brotes de enfermedades siguen produciendose de
forma regular como resultado de los movimientos de los animales, tanto legales
como ilegales (218).
El comercio internacional de animales domésticos y salvajes, como el de los productos de origen animal es de una gran
complejidad, además de que se presenta
en escalas diferentes (219). Por otra parte,
con excepciones, no existen normas imperativas para el control de estos movimientos y todavía la mayor parte de los
tratados se basan en acuerdos bilaterales
entre países; sin embargo, los países que
son miembros de la Organización Mundial del Comercio (OMC) están obligados
a cumplir los acuerdos sanitarios y fitosanitarios que incluyen disposiciones relativas a la seguridad alimentaria, sanidad
animal y sanidad vegetal (220). Ya nos
hemos referido a la OIE, indicando que
sus recomendaciones internacionales en
materia de sanidad animal y zoonosis,
igual que sus declaraciones relativas a los
códigos de salud de los animales terrestres y acuáticos, son referencia internacional, promoviendo la seguridad sanitaria
del comercio internacional de los animales
terrestres y sus productos en normas y
medidas de salud que son utilizadas en
cada país por las autoridades veterinarias
competentes. De ahí, precisamente, la importancia de una buena infraestructura
veterinaria para minimizar los riesgos de
difusión de los agentes patógenos y sus
correspondientes enfermedades (221).
El volumen del comercio internacional de
animales es de una magnitud impresionante. Tomando simplemente nuestro país
como referencia, en 2008, en el capítulo
de animales vivos y productos de origen
animal se importaron 3,3 milones de Tm,
por un valor estimado de 5.407 millones
de euros, siendo las exportaciones muy similares (3,2 millones de Tm, por un valor
de 5.949 millones de euros) (222). A nivel
mundial, la FAO (www.fao.org) reconoce
la imposibilidad de disponer de una cifra
siquiera aproximada de este comercio,
pues numerosos países carecen de datos.
En relación con enfermedades como la
fiebre aftosa, la tuberculosis bovina o la
tripanosomiasis, los mercados desempeñan un importante papel en la diseminación de los microorganismos, sirven de
contacto entre enfermos y sanos y facilitan el transporte, permitiendo la diseminación de la enfermedad a través de los
animales cuando regresan a los establos.
En relación con los animales salvajes, la situación es aún más complicada e igualmente de valores económicos extraordinarios, aunque en este caso las transacciones
ilegales o clandestinas tienen un peso
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 342
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
342
mayor; por ejemplo, se ha estimado que
cada año son objeto de comercio alrededor de 40.000 primates, 4 millones de
aves, 640.000 reptiles y 350 millones de
peces tropicales (223). En estas condiciones, a pesar del reconocimiento de los
riesgos de transmisión de enfermedades
asociadas a ellos y las regulaciones de
cada país, lo cierto es que continuamente
siguen apareciendo enfermedades nuevas
como resultado directo o indirecto de este
comercio. Buenos ejemplos de estas han
sido el SARS (síndrome respiratorio agudo
grave) y la influenza aviar por el virus
H5N1, que, como otras muchas, mantienen sus hospedadores reservorios en
fauna salvaje.
bién en el caso de la encefalitis del Nilo
Occidental, ya comentado. Desde la descripción, por primera vez en Holanda en
2006, del serotipo 8 del virus de la lengua
azul, se produjo su difusión en el norte de
Europa, afectando a más de 57.000 explotaciones en 2007 (con decenas de
miles de animales muertos) y más de
33.000 en 2008. En los años siguientes
más serotipos llegaron al norte de Europa
(serotipos 1, 11 y 16).
Como en el caso de los animales domésticos, el papel de los mercados se ha revelado en estos casos de gran importancia
al poner en contacto enfermos y sanos, y
estos últimos, en periodo de incubación y
sin síntomas ni evidencia de su colonización por los agentes patógenos, los diseminan a su vuelta, especialmente en el
caso de los no vendidos.
Se impone pues, como elemento crítico
para el control de las enfermedades, especialmente las que hemos denominado
emergentes o reemergentes, la concurrencia del método epidemiológico, asentado en bases científicas, para evitar su
uso indebido como barreras artificiales al
comercio. De este modo, pues, las medidas sanitarias se apoyan en dos elementos clave: la vigilancia y el análisis de
riesgo. En uno y otro la aportación de las
nuevas tecnologías, principalmente moleculares, sobre todos los elementos que
concurren en la emergencia (agentes,
hospedadores y ambiente) es inexcusable.
En la actualidad, además, ha surgido otro
factor al que se está imputando importante responsabilidad en la emergencia y
difusión de enfermedades infecciosas. El
cambio climático está modificando condiciones ambientales que hacen posible
la persistencia de vectores de agentes patógenos que años atrás estaban limitados
por la temperatura, la humedad y otros
condicionantes. Uno de los mejores ejemplos a nuestro alcance está representado
por la lengua azul, cuyo vector ha alcanzado, como consecuencia del aumento de
temperatura, latitudes nunca antes conocidas, difundiendo la enfermedad en los
países europeos. Otro tanto sucede tam-
En el caso de la Epidemiología humana,
D. Raoult (2009) (224) apuesta, para los
próximos años, por el desarrollo de tres
direcciones principales en la investigación
epidemiológica, en las que no está ajena
la Medicina Veterinaria en general y la
Sanidad Animal en particular. Por un lado,
señala la necesidad de identificar las
causas de los dos motivos principales de
mortalidad humana en la actualidad, las
enfermedades digestivas y respiratorias, a
las que define como las grandes desconocidas, especulando con un posible origen
microbiano, por el momento no establecido, para lo que reclama el desarrollo y
mejora de nuevos métodos que permitan
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 343
Sanidad animal y biotecnología
343
la identificación y caracterización rápida y
extensa de los mismos. A este respecto refiere la utilidad de los métodos múltiples
(multiplexing) de detección e identificación.
En relación con las enfermedades respiratorias, en los últimos años se están identificando un número creciente de agentes
patógenos como responsables etiológicos
de las mismas (Metapneumovirus, Coronavirus, etc.), aunque en la mayoría de los
casos su implicación es incierta, igual que
sucede en el caso de las enfermedades
gastroentéricas (Norovirus, etc.), entre
otros motivos porque todavía no se
acierta a comprender el significado epidemiológico de etiologías tan complejas,
tanto en los casos de neumonía, como de
gastroenteritis. En unas y otras, por ejemplo, el conocimiento actual de las rutas de
transmisión es todavía muy incompleto, y
de ello deriva la falta de estrategias preventivas y otros métodos de control,
como sucede en los casos de gripe. En los
próximos años, un objetivo a lograr será
determinar las condiciones que permitan
detener la transmisión interhumana o
animal-humano de estos procesos.
En segundo lugar, se refiere a la posible
implicación de los agentes infecciosos en
las enfermedades crónicas y cáncer, como
ya ocurriera en el caso de H. pylori y su relación con la úlcera gastroduodenal y posterior evolución a cáncer de estómago,
descubrimiento que valió a Marshall y
Warren el Premio Nobel de Medicina de
2006 y que se puede hacer extensivo al
caso del virus del papiloma humano, relacionado también con el cáncer de cuello
uterino, para el que ya se está utilizando
en la actualidad una vacuna.
Por último, en lo que se refiere a la epidemiología de las enfermedades infecciosas,
el próximo desafío será, en opinión de
este autor, relacionar la obesidad y la microbiota intestinal, un hecho para el que
se están produciendo interesantes aportaciones, en las que se implican las variaciones de la microbiota intestinal de los
animales productores de alimentos como
consecuencia del uso indiscriminado de
antibióticos, tanto con carácter preventivo
o terapéutico como en razón de su utilidad como promotores de crecimiento,
circunstancia, como es sabido, ya prohibida.
Extrapolando estos objetivos al campo de
la Sanidad Animal, la conclusión no
puede ser otra que la de que queda
mucho trabajo por recorrer, en el que
nuevamente la Microbiología Molecular
debe venir en auxilio de las necesidades
de conocimiento señaladas antes y que,
al menos en principio, en los animales y
en el hombre, se debe trabajar en desentrañar las complejas etiologías de estos
cuadros clínicos múltiples en los que se
entremezclan signos y etiologías.
Identificación y caracterización
microbianas. Epidemiología Molecular
En la vigilancia epidemiológica, tanto la
capacidad de detección como la disponibilidad de métodos capaces de diferenciar
con rapidez y rigor entre aislados es esencial. En los últimos 30 años, los avances
de la Biología Molecular han permitido redefinir y, en algún caso, reorientar la
forma de investigar las interrelaciones
entre patógenos y hospedadores susceptibles. De hecho, las innovaciones derivadas del conocimiento, cada vez mayor,
del material genético de los microorga-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 344
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
344
nismos (ADN y ARN) están proporcionando la base para el desarrollo de muchos instrumentos utilizados en la moderna Epidemiología, lo que ha permitido
desde 1982, la introducción del concepto
de Epidemiología Molecular (225).
La Epidemiología Molecular permite explorar los mecanismos que gobiernan las
interrelaciones entre patógenos y hospedadores. Desde la culminación del proyecto del Genoma Humano y el comienzo
del Proyecto del Epigenoma, los instrumentos disponibles para el estudio de las
enfermedades todavía se han ampliado
más, proporcionando a los modernos epidemiólogos moleculares técnicas basadas
en nuevos datos de laboratorio que incluyen técnicas epigenéticas y ómicas (genómica, proteómica, metabolómica, etc.),
que ofrecen nuevas oportunidades para
profundizar en los componentes que
rigen la dinámica de las enfermedades, así
como para hacer frente al desafío que supone obtener el máximo rendimiento derivado de su utilización en las investigaciones epidemiológicas actuales. En
muchos aspectos, el aprendizaje necesario
para incorporar las tecnologías emergentes disponibles hoy es muy similar a la
forma en que lo hicieron los epidemiólogos cuando incorporaron los biomarcadores moleculares a la investigación epidemiológica tradicional (226).
En lo que se refiere a los agentes patógenos, productores de enfermedades infecciosas, el análisis filogenético de las secuencias genómicas amplificadas brinda
información inédita sobre ellos y su evolución, y resulta muy útil para llevar a
cabo estudios de caracterización genotípica y epidemiología molecular.
La evidencia de que a lo largo de la escala
evolutiva se han producido intercambios
de ADN entre microorganismos muy diversos, principalmente por transferencia
horizontal de genes, fragmentos genómicos e islas genómicas y de patogenicidad, está permitiendo redefinir el concepto actual del mundo microbiano, así
como su clasificación y sistemática, al
menos en el sentido de cómo se venía realizando hasta ahora.
Desde un punto de vista exclusivamente
práctico, en términos epidemiológicos, el
proceso de tipificación es importante.
Permite reconocer los brotes de infección,
la detección de transmisión cruzada de patógenos, la detección de fuentes de infección o el reconocimiento de cepas virulentas de una especie particular. En
definitiva, es la base de la vigilancia epidemiológica; sobre sus resultados se adoptan decisiones, se modifican criterios o se
suspenden medidas adoptadas sobre
datos poco sólidos.
Los métodos de tipificación tienen interés
en el estudio de la difusión y dinámica de
las poblaciones microbianas, tanto de
bacterias como de otros tipos de microorganismos, tanto en la clínica como en valores ambientales, a niveles que van desde
un simple hospedador a un ecosistema
global. Hasta la fecha, los métodos que
se describen a continuación han sido aplicados a los organismos y microorganismos haploides, pero se está manifestando un interés creciente para la
tipificación de organismos (y microorganismos) diploides, incluyendo levaduras,
hongos y parásitos.
Definitivamente, la Biología Molecular y
la Biotecnología han desplazado en los úl-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 345
Sanidad animal y biotecnología
345
timos años las técnicas tradicionales de tipificación microbiana mediante el estudio
de rasgos fenotípicos (227) y, como se ha
señalado antes, esto no debe ser otra
cosa que el comienzo de una larga carrera
por perfilar cada vez con más precisión las
causas que se sitúan en el origen de las
infecciones, con todas sus variantes.
Métodos fenotípicos de identificación
y tipificación microbianas
Los métodos de identificación y tipificación de microorganismos han rendido en
el pasado reciente servicios del máximo
interés en Microbiología, Parasitología y
Epidemiología. Un breve recorrido por los
mismos se resume a continuación:
Fenotípicamente pueden valorarse datos
como la morfología de las colonias, el
color, el olor y numerosos detalles microscópicos, pero la mayoría de los métodos
fenotípicos se basan en datos que requieren una observación especializada
que pueda documentarse; por ejemplo,
la capacidad de crecimiento en presencia
de determinadas sustancias (metabolitos,
sensibilidad o resistencia a drogas, a toxinas o a bacteriófagos) o la expresión de
moléculas específicas (antígenos, enzimas,
etc.).
Comoquiera que sea, todos los métodos
requieren una estandarización estricta,
dada la posibilidad de cambio de los
rasgos de interés, en función de modificaciones en las condiciones ambientales
en las que se lleva a cabo la prueba. Se incluye, por ejemplo, el biotipado, que se
basa en las características bioquímicas
que ofrecen excelentes resultados de tipabilidad, pero su poder discriminatorio
es variable, siendo necesario para optimizarlas seleccionar un gran número de ca-
racterísticas. Existen arrays de reacciones
fenotípicas útiles de modo complementario a tecnologías de ADN y proteómica.
La tipificación basada en la susceptibilidad
a los antibióticos (antibiotipia), bien mediante un sencillo antibiograma o bien
mediante procedimientos de más profundidad (cálculo de la concentración mínima
inhibitoria 90 o 50%, CMI90-50%), se
aplica más o menos habitualmente, en
función de la necesidad clínica, a muchas
especies; en este caso, la discriminación
depende de la diversidad, de la estabilidad
y de la prevalencia relativa de los mecanismos de resistencia adquiridos por los
aislados en estudio. En cualquier caso, patrones de sensibilidad semejantes pueden
ser debidos a un proceso de evolución
convergente.
El serotipado ha sido, tradicionalmente, el
método fenotípico más importante de tipificación microbiana, con la particularidad de que, prácticamente, fue el primero o uno de los primeros en aplicarse;
por ejemplo, en el caso de las enterobacterias, como las salmonelas o E. coli, el
método o esquema de Kauffmann-White
ha sido una referencia internacional que
ha servido para identificar y agrupar estas
especies en función de los antígenos somático, flagelar y capsular, mediante el uso
de anticuerpos (policlonales, y ahora también monoclonales). La calidad de los anticuerpos y el tipo de antígeno proporciona
problemas en la tipificación en función de
la presencia de reacciones cruzadas y,
además, algunas cepas no son tipificables,
por lo que resulta de gran importancia la
estandarización del método de prueba.
Puede mejorarse la discriminación combinando el serotipado con electroforesis en
gel (SDS-PAGE) en el western-blotting (in-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 346
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
346
munoblotting) (228). Algunos esquemas
de serotipado tradicionales se están reemplazando progresivamente por equivalentes genotípicos, como sucede en el
caso de Clostridium botulinum (229) y
otros.
La tipificación mediante el uso de fagos
(fagotipia), igual que en el caso de las
bacteriocinas (bacteriocinotipia), permite
la obtención de un patrón lítico del microorganismo de prueba cuando se expone
a la acción de virus bacterianos específicos
o la actividad bactericida de las bacteriocinas. Ambos métodos, sin embargo, se
reducen a la aplicación a unas pocas especies, además de que los tipos pueden
cambiar a lo largo del tiempo, con lo que
la capacidad de discriminación es variable,
la tipabilidad es parcial y la reproducibilidad escasa. Además, se requieren controles de calidad continuos de los fagos,
experiencia y tiempo.
La electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de componentes celulares y extracelulares puede proporcionar
alta capacidad discriminatoria, con buenas aplicaciones en la tipificación bacteriana (230), aunque desde la introducción
de los métodos basados en el ADN en la
década de los años 90, su uso se ha reducido de forma sustancial. En el caso de la
electroforesis de enzimas multilocus
(MLEE), se identifican variantes electroforéticas de un set de enzimas constitutivas
(housekeeping) codificadas por diferentes
alelos del mismo gen, lo que da lugar a
pequeñas variaciones, pero detectables,
en el tamaño y la carga eléctrica de la proteína (231). MLEE ha sido utilizada como
método de referencia para definir la estructura filogenética de linajes clonales en
poblaciones bacterianas y, aunque no es
un sistema ni rápido, ni utilizado ampliamente, ha sido muy importante en la configuración de la biología de las poblaciones
bacterianas ambientales. Su continuación
molecular (MLST, ver después) es mucho
más práctico y, consecuentemente, mucho
más utilizada en la actualidad.
La espectrometría de masas (MS) es una
técnica desarrollada originalmente para la
identificación de moléculas, principalmente
orgánicas, de bajo peso molecular en mezclas complejas (232). En la actualidad se
utiliza para caracterizar mezclas de macromoléculas biológicas complejas mediante
la caracterización de sus productos de degradación específicos. La técnica de desorción/ionización láser asistida por matriz,
con ionización suave (Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization-Time-Of-Flight), conocida por sus siglas en inglés MALDI-TOF,
permite el análisis de biomoléculas (biopolímeros como las proteínas, los péptidos y
los azúcares) y moléculas orgánicas grandes (como los polímeros, los dendrímeros
y otras macromoléculas) que tienden a hacerse frágiles y fragmentarse cuando son
ionizadas por métodos más convencionales, con lo que permite el análisis de
huellas moleculares de microorganismos
completos (233). El procedimiento utiliza
un láser que evapora el material biológico
que después es sometido a un campo
eléctrico intenso. Los pequeños iones se
mueven a alta velocidad y alcanzan un detector antes que los más grandes y las señales que se generan se registran y dan
lugar a espectros complejos, característicos
del contenido molecular de una bacteria.
Cuando se comparan informáticamente,
pueden diferenciarse tipos bacterianos
(234). También se puede utilizar para el
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 347
Sanidad animal y biotecnología
347
análisis de moléculas menos complejas,
como sucede con el ADN.
También se han comercializado con éxito
otros métodos espectroscópicos y cromatográficos y pueden proporcionar plataformas útiles para determinados formatos
de identificación bacteriana, como es el
caso de la cromatografía líquido-gas (GLC,
que es utilizada en el sistema MIDI de
identificación bacteriana) y otras. Otros
métodos de fundamento físico para la
identificación bacteriana incluyen, por
ejemplo, el mapeo óptico de moléculas
de ADN, que permite visualizar fragmentos reales de ADN de gran tamaño,
que puede ser utilizado para comparar
bacterias utilizando una sola molécula de
ADN genómico (235).
Finalmente, algunas estrategias “ómicas”
completan el moderno espectro del fenotipado. La proteómica describe, de forma
colectiva, los métodos utilizados para descifrar el contenido proteico de una bacteria. Este rango de tecnologías de electroforesis inteligentes, de alto rendimiento,
automatizadas, facilita la secuenciación de
las proteínas basadas en la espectrometría
de masas.
Métodos de detección, identificación
y tipificación genotípica
Se basan en la variación de los genomas
de los aislados bacterianos respecto de su
composición, estructura (por ejemplo,
perfiles de endonucleasas de restricción,
número y posiciones de elementos repetitivos, etc.) o secuencia de nucleótidos
(de uno o más genes, o de regiones intergénicas). El análisis de la base genética de
eventos moleculares tales como la adquisición, multiplicación, mutación, deleción
o inserción de nucleótidos o genes, aso-
ciada con los patrones de variación, es la
estrategia preferida para evaluar las interrelaciones entre cepas, pero, en general,
no es siempre necesaria ni tampoco factible (236).
En la actualidad se dispone de una amplia
variedad de métodos genotípicos para la
detección, identificación y caracterización
de los microorganismos, todos los cuales
se basan en la detección y estudio de
marcadores genéticos.
Marcadores genéticos de interés en
la identificación y caracterización
microbiana
Los sistemas de identificación y tipificación moleculares representan una de las
aportaciones de la Microbiología que más
difusión ha alcanzado en los últimos años.
Comprenden una amplia variedad de técnicas y métodos que comparan la composición de los ácidos nucleicos de dos o
más microorganismos de prueba, lo que
permite reconocer la posible relación
entre aislados, hecho que posee gran interés desde el punto de vista epidemiológico. Igualmente, estas tecnologías deben
ser capaces de diferenciar entre aislamientos no relacionados, independientemente de su pertenencia a la misma especie, género o familia.
En el genoma de los microorganismos,
como en el de las células eucariotas que
forman parte de los tejidos de los seres
superiores, existen determinadas regiones
o secuencias hipervariables (también denominadas secuencias anónimas, loci
anónimos, loci polimórficos, marcadores
anónimos o polimórficos, polimorfismos,
etc.), de gran interés desde el punto de
vista que nos ocupa, pues permiten uti-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 348
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
348
lizar la información genética con fines de
identificación y discriminación. Tales secuencias se concentran principalmente en
regiones no codificantes (intrones) y se
distribuyen en el genoma de forma más
o menos aleatoria, y su característica singular es que son polimórficas, razón por
la que también reciben el nombre de polimorfismos o secuencias polimórficas.
Las técnicas que estudian los polimorfismos genéticos de los microorganismos
han permitido un avance extraordinario
en el campo de la tipificación microbiana.
La mayor ventaja de estos métodos radica
en la estabilidad de los marcadores genéticos utilizados y en la posibilidad de aplicarlos universalmente a especies o géneros de bacterias, no solamente para la
identificación, caracterización y tipificación, sino también en otros campos de
utilidad, algunos de los cuales ya hemos
estudiado (patogénesis) y, en cualquier
caso, permiten su aplicación a estudios
epidemiológicos (detección de focos,
brotes y epidemias, identificación de reservorios, mecanismos de transmisión,
evolución genética microbiana, diseño de
medidas de control, etc.).
En todos los casos, el objetivo es definir
la relación existente, clonal o no, entre el
grupo de aislamientos de prueba. Un clon
o grupo clonal, en este caso, hace referencia a la relación existente entre varios
aislados o un grupo de los mismos que
descienden de un ancestro común, esto
es, forman parte de la misma cadena de
replicación y transmisión y poseen un
nivel de similitud entre sus genotipos y fenotipos, significativamente superior al de
aislados de la misma especie, no relacionados.
Los métodos moleculares aplicados al estudio epidemiológico pueden incluir diferentes opciones, como el análisis de plásmidos, el estudio de los fragmentos de
restricción y detección de secuencias específicas, la macrorrestricción, la amplificación de secuencias por PCR, el análisis
del ADN por secuenciación, el perfil de hibridación de múltiples secuencias, etc. La
macrorrestricción del ADN incluye la técnica PFGE (ver después), muy versátil,
entre las más utilizadas, que permite conocer la clonalidad de diferentes aislados
en situaciones de brotes epidémicos con
tiempo y espacio definido. Las técnicas de
PCR son más rápidas, con idénticas ventajas, mientras que los estudios de secuenciación permiten el análisis de
grandes grupos clonales y se reservan
para la comparación de aislados de diferentes áreas geográficas y su evolución en
el tiempo (237).
La eficacia de un determinado marcador
molecular está en relación con factores
como la tipabilidad (la proporción, sobre
el total, de cepas tipables), la reproducibilidad (repetición con el mismo resultado
en varios ensayos diferentes; debe ser
> 0,95), la estabilidad (capacidad para reconocer la relación clonal entre cepas que
proceden de un precursor común, pese a
la variación esperable debido a la diseminación, almacenamiento o reproducción
en el laboratorio) y el poder discriminativo
[probabilidad promedio de que un marcador clasifique en dos tipos distintos a
dos aislados no relacionados, obtenidos
aleatoriamente; se cuantifica con el índice
de diversidad de Simpson: ID=1-1/N (N-1)
Σsj = 1nj (nj - 1), donde N es el número de
cepas, S son el número de tipos distintos
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 349
Sanidad animal y biotecnología
349
y nj son el número de cepas pertenecientes al tipo J].
El análisis de ADN extracromosómico incluye el perfil plasmídico, muy utilizado
en epidemiología humana hace algunos
años, pero ahora en desuso a favor de
otros procedimientos de mayor sensibilidad y eficacia, y el de otros elementos de
transmisión horizontal (ETH) o elementos
transponibles, que incluyen secuencias de
inserción (IS) y transposones, además de
los fagos transponibles. En la actualidad,
el interés de los ETH se reserva para estudios de epidemiología molecular relacionados con la resistencia a antibióticos, un
aspecto de gran interés común de la
Sanidad Animal y la Salud Pública.
El análisis del ácido nucleico (ADN) mediante la restricción e hibridación se aprovecha de la particularidad de los microorganismos que, para proteger su genoma
de la contaminación con ADN exógeno,
han desarrollado un sistema de protección basado en la disponibilidad de enzimas que reconocen una secuencia específica de nucleótidos de tan solo 4 a 8
pares de bases (secuencia de restricción),
cortando la molécula en ese punto. Al digerir una molécula de ADN con una enzima de restricción se obtiene un número
de fragmentos equivalente al número de
veces que se encuentra repetido el lugar
de restricción, del número de pares de
bases del mismo y de la proporción relativa de los nucleótidos ATGC del lugar de
restricción en relación con la del ADN digerido. Por otra parte, el tamaño traduce
la separación entre dos lugares de restricción contiguos; cualquier cambio (mutación o recombinación, por ejemplo) en
uno de estos lugares hace que la enzima
no lo reconozca y se traduce en una va-
riación del perfil de fragmentos de restricción, circunstancia que es la responsable
del polimorfismo existente entre las distintas cepas de prueba en un hipotético
estudio de un foco o un brote epidémico.
Métodos basados en la hibridación
Para la hibridación con sondas se han utilizado sondas clonadas al azar o complementarias de un gen o de una secuencia
de inserción. En cualquier caso, este tipo
de sondas para la detección de genes de
virulencia o regiones flanqueantes son
poco discriminativas, aunque la presencia
de elementos repetitivos (como las IS) da
lugar a diversidad y, por ejemplo, en el
caso de M. tuberculosis es una de las
pocas técnicas capaces de diferenciar
entre cepas. En todos los métodos, el
ADN inmovilizado para ser investigado es
probado con moléculas de ADN que son
selectivas y reconocen algunos patrones
y otros no. Las tecnologías disponibles
varían ampliamente, pero la original fue
desarrollada por Southern (1975) (238).
Se han desarrollado sistemas de este tipo
adaptados a la identificación y tipificación de muchas especies, como S. aureus, Clostridium difficile y otras. Esta
metodología puede utilizarse también
para la tipificación del ADN ampliado por
PCR, como sucede en el caso del “spoligotyping” en M. tuberculosis (239), que
incluye la amplificación de un locus que
incluye repeticiones en tandem con alguna variación en las secuencias internas.
Estas variantes se identifican por hibridación utilizando sondas de ADN de fragmentos específicos repetidos. La técnica
se ha utilizado para otras especies de
Mycobacterium, incluyendo M. bovis y
otras (240).
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 350
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
350
El ribotipado es una variante clásica de la
hibridación de Southern que estima el número de loci génicos y su posición en el
cromosoma. Es reproducible y aplicable a
microorganismos de crecimiento rápido,
aunque su capacidad de discriminación es
moderada, más bajo que el de la PFGE
(ver después), sin embargo, puede tener
muchas aplicaciones, tanto taxonómicas
como epidemiológicas. Los genes que codifican para el ARNr y su disposición después del promotor (5’-16S-23S-5S-3’),
aunque están muy conservados, mantienen una región espaciadora que codifica para ARNt y secuencias repetidas, por
lo que el operón permite ser reconocido
por una sonda universal y, a la vez, que se
generen polimorfismos de restricción, algunos de los cuales son específicos de especie y otros permiten discriminar a nivel
infraespecífico. La técnica se ha automatizado (Riboprinter) lo que a la vez que
permite la estandarización, facilita la creación de bases de datos.
El análisis genómico por hibridación mediante microarray se basa en las posibilidades tecnológicas de inmovilizar hasta
varios cientos de miles de sondas de ADN
por centímetro cuadrado en una matriz
sólida, como ya hemos señalado en otras
ocasiones. En la actualidad se han desarrollado microarrays para la mayoría de los
microorganismos de interés clínico en
Medicina Humana, aunque la situación en
Sanidad Animal no es ciertamente la
misma, que se basan en la disponibilidad
de secuencias genómicas y que cubren
todos los genes identificados. Las sondas
pueden ser productos de PCR de tamaño
definido, aunque se utilizan más frecuentemente oligonucleótidos sintéticos. Estas
plataformas facilitan la identificación y ti-
pificación bacteriana con un detalle sin
precedentes hasta ahora. Una comparación reciente sobre los genomas de cepas
de la misma especie ha mostrado la existencia de una considerable variación
dentro de la especie, razón por la que se
ha acuñado el término pangenoma para
definir el genoma acumulativo deducido
de las secuencias individuales (241).
Métodos de análisis basados en el
análisis de fragmentos del genoma
Debe considerarse, en primer lugar, la situación que hace referencia al estudio de
fragmentos genómicos independientes
del cromosoma bacteriano (microbiano),
como es el caso de los plásmidos.
La tipificación por plásmidos (plasmidotipia) evalúa el número, tamaño y perfiles de digestión después de la electroforesis en geles de agarosa de los plásmidos
de las bacterias de prueba. La capacidad
de tipabilidad y discriminación de este recurso es variable, dependiendo de la especie de que se trate (242), siendo alta la
especificidad y moderada la reproducibilidad. Por otra parte, se han descrito dificultades añadidas, relacionadas con patrones múltiples. En resumen, la falta de
estabilidad de los plásmidos no parece
que haga de esta opción la mejor para seleccionarla como marcador clonal, al
menos tal como se desprende de algunos
estudios, como los referidos en el caso de
S. enterica o en S. aureus (243), aunque
puede combinarse con otros métodos de
tipificación genómica y, como habitualmente se hace, con estudios de susceptibilidad antimicrobiana.
Polimorfismos. Cuando se utilizan enzimas de restricción de baja frecuencia de
corte (es decir, que poseen lugares de res-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 351
Sanidad animal y biotecnología
351
tricción raros o escasos a lo largo de la
molécula de ADN) se produce la división
o fragmentación del genoma en unos
pocos fragmentos (entre 10 y 30), lo que
supone un tipo de macrorrestricción.
Entre los métodos de estudio de los polimorfismos de longitud de los fragmentos
de restricción (RFLP), el análisis por endonucleasas de restricción (REA) fue el primero en utilizarse ampliamente.
Habitualmente el cromosoma bacteriano
es digerido por las enzimas de restricción
produciendo cortes que dan lugar a varios cientos de pequeños fragmentos que
después se separan por electroforesis horizontal en gel (SDS-PAGE) (244), en patrones complejos que producen complicadas interrelaciones y enmascaran y
confunden el intercambio de datos entre
laboratorios. Para simplificar los datos obtenidos por este procedimiento se añadieron sucesivas fases de Southern blot e
hibridación. En este sentido, el ribotipado,
al que nos hemos referido antes, es un
método que acopla la digestión del genoma mediante una endonucleasa de restricción que proporciona una “frecuencia
de corte” con una secuencia de reconocimiento de 4 pb y una hibridación con
una sonda complementaria de ADNr.
Algunas de las sondas de restricción utilizadas con este fin están restringidas a una
especie simple, como sucede con la
IS6110 de M. tuberculosis (245).
El PFGE (Pulsed-field gel-electrophoresis) es una nueva técnica de electroforesis que hace posible separar grandes
fragmentos de macrorrestricción del ADN
genómico en geles de agarosa mediante
la alternancia periódica del ángulo de dirección de un campo eléctrico. Estos fragmentos de macrorrestricción del ADN se
generan con endonucleasas de restricción
con seis o más sitios de reconocimiento
de pb (“cortes raros”). Ordinariamente se
obtienen menos de 30 fragmentos de
entre 20 y 800 kb.
En la actualidad, esta técnica es considerada el “gold standard” de los métodos de
tipificación molecular (246). La PFGE posee
una importante capacidad discriminatoria
y reproducibilidad y ha sido un procedimiento muy aplicado para la tipificación
comparada de casi todas las especies bacterianas, aunque en la última década otros
métodos han ganado también terreno. La
PFGE, por ejemplo, se ha aplicado en los
últimos años a la tipificación de numerosos
agentes de interés en Salud Pública y
Sanidad Animal (M. tuberculosis, C. jejuni,
C. coli, Yersinia pseudotuberculosis,
Streptococcus suis, F. tularensis, Salmonella
enterica Enteritidis y Typhimurium, E. coli,
Leptospira monocytogenes, Listeria spp,
Enterococcus faecium, S. aureus, Dichelobacter nodosus, Treponema phagenedis,
Klebsiella pneumoniae, Shigella dysenteriae, Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringens, Shigella dysenteriae,
Neisseria meningitidis, Mannheimia haemolytica, Bartonella henselae, M. tuberculosis, M. avium, etc. (247-255). Se pueden
conseguir niveles aceptables de reproducibilidad interlaboratorios, lo que ha permitido en algunos casos la creación y mantenimiento de bases de datos internacionales.
El sistema, sin embargo, resulta caro, tiene
un consumo de tiempo de alrededor de 4
días y se necesitan equipos costosos.
La PFGE se ha aplicado con frecuencia en
estudios epidemiológicos en Bacteriología.
Se obtienen patrones de restricción sencillos, que representa el ADN cromosómico
bacteriano distribuido en unas pocas
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 352
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
352
bandas, con movilidades electroforéticas
diferentes. Se puede digitalizar para el análisis de las bandas, que se ejecuta con un
software disponible comercialmente. La
PFGE es altamente discriminatoria en la tipificación y caracterización de muchas especies bacterianas y excelente reproducibilidad, aunque en el caso de Salmonella
enterica, Pseudomonas aeruginosa, E. coli,
Clostridium difficile y otros existen inconvenientes derivados, entre otras razones,
de la degradación del ADN cromosómico,
y resultan no tipables o carecen de suficiente capacidad de discriminación.
Tampoco detectan cambios puntuales en
genes ni permiten la observación detallada
de ciertos elementos como plásmidos,
transposones, IS, etc.
La PCR y métodos derivados. La PCR es,
en general, una alternativa menos costosa
que las técnicas anteriores, pero también
menos resolutiva que aquellas. La PCR
permite que determinados loci genéticos
sean amplificados e investigados a la búsqueda de variaciones características de
una cepa en particular o entre cepas utilizables tanto en la tipificación como con
propósitos epidemiológicos.
Por lo general se reconocen tres tipos o
grupos de variantes de la PCR utilizables
con estos fines. En primer lugar, las que
utilizan primers arbitrarios o con cierta especificidad, con los que amplifican regiones situadas entre dos primers adyacentes separados por una distancia
inferior a la máxima que puede amplificar
la Taq polimerasa. Así se obtienen patrones de amplificación que están constituidos por un número variable de bandas.
En segundo lugar, las variantes en las que
antes o después de la amplificación por
PCR se somete el genoma o el amplicón
a la acción de enzimas de restricción y, finalmente, en tercer lugar, las variantes
que amplifican por PCR regiones internas
de ciertos genes y después secuencian.
En el primer grupo, sin digestión con enzimas de restricción, se lleva a cabo la amplificación de los fragmentos genómicos
flanqueados por una o dos secuencias de
oligonucleótidos utilizadas como primers.
Se diferencian los métodos de amplificación múltiple arbitraria (utilizan primers
arbitrarios, que no van dirigidos a ninguna
región específica), como la AP-PCR
(Arbitrary Primed-PCR) o RAPD-PCR
(Random Amplified Polymorphic DNA)
(que permiten amplificar regiones que se
localizan entre dos primers consecutivos)
y los de amplificación múltiple definida,
que utilizan primers de secuencias repetidas, cortas (< 200 pb), situadas a lo
largo del genoma, como REP-PCR
(Repetitive Extragenic Palindromic), ERICPCR (Enterobacterial Repetitive Intragenic
Consensus), ARNt-PCR, Box-PCR, ISPCR… En todas ellas, la reproducibilidad
es baja y la interpretación de las diferencias entre bandas en ocasiones es complicada. Por otra parte, son procedimientos
flexibles, técnicamente simples, no son
complicados en lo que a disponibilidad de
equipos y reactivos se refiere y son rápidos. En conjunto, estos métodos constituyen la denominada “huella genética
de PCR” (PCR fingerprinting) y no son
muy aceptados para intercambio de datos
entre laboratorios (256).
Los RAPD-PCR se basan en la utilización
de pequeños primers, de apenas 10 pb,
cuya secuencia es inespecífica, no dirigiéndose hacia un locus genético determinado sino que, a bajas temperaturas de
alineamiento, híbrida al azar (arbitraria-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 353
Sanidad animal y biotecnología
353
mente) en ciertos sitios cromosómicos con
suficiente afinidad para permitir la iniciación de la polimerización, con lo que la
presencia de tales lugares en dos puntos
concretos de las cadenas complementarias de ADN, en direcciones opuestas una
a la otra, permite la amplificación del
fragmento entre estos dos puntos. El número de tales localizaciones de dos
puntos varía según la cepa, por lo que
sirve para la tipificación de cualquier microorganismo y presenta un alto poder de
discriminación, aunque posee baja reproducibilidad y es de difícil interpretación.
La REP-PCR se basa en la presencia de secuencias repetitivas, que están presentes
en casi todas las bacterias y que pueden
ser utilizadas como secuencias consenso
para la hibridación de primers que inician
la amplificación en estos sitios. Estas secuencias se localizan habitualmente en
varios sitios del genoma bacteriano, y
cuando dos secuencias se localizan próximas una de otra, puede amplificarse la
región flanqueada. Para este efecto se
han utilizado principalmente secuencias
repetitivas extragénicas palindrómicas,
que se han identificado en muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae
(ERIC-PCR).
La misma estrategia se ha utilizado también con otras secuencias repetitivas,
como es el caso de las secuencias de inserción (IS), secuencias ribosomales y secuencias Shine Dalgarno (el sitio de fijación del ribosoma). El método, que ha
mostrado buena reproducibilidad y bajo
coste y complejidad, tiene un poder discriminatorio que depende de la secuencia
repetitiva analizada.
En general, las técnicas de tipificación basadas en la secuenciación del ADN se han
visto favorecidas por la aparición de tecnologías de secuenciación automática.
En el segundo grupo se incluyen variantes
de PCR con digestión posterior con enzimas de restricción y comparación de los
fragmentos por RFLP (Restriction
Fragment Length Polimorphisms; polimorfismos de restricción de los fragmentos de
longitud). En una primera fase se amplifican los loci con primers específicos y se
analizan por RFLP, visualizando por electroforesis. El inconveniente de estos análisis reside en la limitada región del genoma que puede ser examinada, lo que
proporciona un poder de discriminación
menor que en el PFGE.
Si la digestión con enzimas de restricción
se lleva a cabo antes de la amplificación,
pueden utilizarse métodos que amplifican
las secuencias flanqueantes a los lugares
de restricción (IRS, baja frecuencia de
corte) o el estudio de los polimorfismos
de longitud de los fragmentos de restricción amplificados (AFLP, alta frecuencia de
corte).
La AFLP (Amplification Fragment
Length Polymorphism) es un marcador
molecular basado en la PCR, en el que se
combinan dos estrategias diferentes: por
un lado, la digestión del ADN con enzimas de restricción y, por otro, la amplificación selectiva por PCR. Utiliza adaptadores que reparan los fragmentos de ADN
procedentes de la digestión, con una amplificación posterior mediante primers
complementarios de la secuencia de
aquellos. En el caso de las bacterias
(porque el sistema se describió y se utiliza
en sistemas eucariotas, más complejos) se
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 354
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
354
han desarrollado variantes que solo utilizan una digestión inicial y una resolución
final en geles de agarosa. En el caso de algunas especies bacterianas se han organizado bases de datos y evaluado la reproducibilidad ínter-laboratorios, en M.
tuberculosis, Legionella pneumophila, E.
coli, F. tularensis, B. anthracis, Y. pestis,
Burkholderia mallei, B. abortus y micoplasmas aviares (258-262).
El análisis Multilocus Variable (MLVA)
se ha aplicado a repeticiones en tándem
(Multilocus Variable Number Tandem
Repeat) (VNTR). Es también un método de
tipificación basado en la PCR que aprovecha la variabilidad inherente encontrada
en muchas regiones de ADN repetitivo. El
ADN repetitivo se copia incorrectamente
con frecuencia, en muchas especies bacterianas, como consecuencia de un mal
emparejamiento de la cadena, por deslizamiento, lo que da lugar a un acortamiento o alargamiento de la región de repeticiones debido a la deleción o inserción
de unidades repetidas. Este tipo de variaciones del ADN puede evaluarse simplemente llevando a cabo una PCR que
abarca repeticiones y determinando la
longitud del producto. En el caso de repeticiones de grandes unidades, el sistema de análisis puede ser simple mediante electroforesis en gel, pero en
repeticiones cortas o más cortas se requieren tipos de electroforesis más complejos.
En el diagnóstico genético se utilizan dos
tipos de VNTR, los denominados VNTRminisatélites y los VNTR-microsatélites
(también denominados STR –Short
Tandem Repeats–). Cada uno de estos loci
o segmentos de ADN polimórfico constituye un marcador genético, y la principal
diferencia entre ambos reside en la longitud (o tamaño) total del segmento de
ADN, que a su vez viene determinada por
el número de nucleótidos de la unidad de
repetición que lo componen. Un VNTRminisatélite puede oscilar entre 500 y
10.000 nucleótidos, mientras que un
VNTR-microsatélite oscila entre 2 y 500
nucleótidos. Los diferentes alelos de un
VNTR se diferencian por su tamaño, que
en realidad viene determinado por el número total de repeticiones en tándem. Los
VNTR-microsatélites son por excelencia los
polimorfismos utilizados en el diagnóstico
genético y corresponden a la repetición
en tándem de secuencias entre 2 y 5 nucleótidos.
La combinación de varios loci VNTR en un
ensayo (Multiple-locus Variant-repeat
Assay, MLVA) ha demostrado en varias especies bacterianas que genera perfiles específicos de cepa que pueden ser comparados, intercambiados y reproducidos en
diferentes laboratorios. La técnica ha sido
utilizada con éxito para la tipificación de
un número creciente de especies bacterianas (263).
Los VNTR se utilizaron, por primera vez,
para identificar en M. tuberculosis las denominadas Mycobacterial Interspersed
Repeat Units (MIRU), unidades repetidas
intercaladas. En la actualidad, los VNTR se
han aplicado a la identificación y tipificación de otros muchos microorganismos,
como Bacillus anthracis, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella enterica o Escherichia coli
0157 (264) y, recientemente, también, en
Francisella tularensis (265).
Finalmente, entre las técnicas basadas en
la amplificación de locus específicos se in-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 355
Sanidad animal y biotecnología
355
cluyen, por ejemplo, la región espaciadora
16S-23S del locus rRNA (RS-PCR,
Ribosoma Spacer PCR), que presenta múltiples polimorfismos en secuencia y longitud, los cuales, una vez amplificados
con primers específicos, generan patrones
de bandas propios de cada clon de cepas
idénticas.
En tercer término, se situan métodos que
llevan a cabo la secuenciación de los amplicones obtenidos por PCR. En este caso
puede llevarse a cabo la amplificación de
varios loci genéticos (Multilocus).
La MLST (Multilocus Sequence Typing)
es una técnica desarrollada y diseñada para
identificar clones a partir de poblaciones
bacterianas. Es un marcador molecular de
aplicación en epidemiología que ha sido utilizado en Medicina Humana para la caracterización de brotes, estudio de reinfecciones, fallos terapéuticos, etc. El método
se basa, inicialmente, en el MLEE
(Multilocus Enzyme Electrophoresis), al que
ya nos hemos referido antes, análisis de isoenzimas, en el que se estudia la movilidad
electroforética de un grupo de enzimas metabólicas (entre 15 y 20) en geles de poliacrilamida, relacionando las movilidades con
las variaciones en el gen que codifica para
cada enzima, confirmando un perfil que define el tipo electroforético (266). MLEE mide
de forma indirecta el polimorfismo genético, mientras que MLST lo hace directamente, pues el análisis se basa en la secuencia de ADN de fragmentos internos de
genes constitutivos (housekeeping) que codifican para enzimas metabólicas. El sistema
permite detectar variaciones neutras, que
definen líneas clonales relativamente estables.
MLST se basa en la amplificación y secuenciación del material genético, y en el
caso de algunos microorganismos se ha
podido adaptar al estudio directo de
muestras biológicas, sin necesidad de cultivo.
Una variante de la MLST que no requiere
secuenciación y que consiste en la amplificación inicial de los mismos fragmentos
que se utilizan en esta, utilizando los
mismos primers, es la MLRT (Multilocus
Restriction Type), en la que los fragmentos
son digeridos después con enzimas de
restricción y resueltos por electroforesis en
geles de agarosa. Se ha considerado de
utilidad en Medicina Humana, en el caso
de ondas epidémicas.
La MLST también se ha acoplado al uso
de micromatrices (microarrays) (267) mediante el diseño de sondas a partir de los
alelos conocidos de los fragmentos seleccionados en los siete genes housekeeping, las cuales después se inmovilizan en
la matriz.
MLST está indicada para el seguimiento
epidemiológico de clones bacterianos (o
de líneas clonales), permitiendo establecer
el proceso de dispersión del microorganismo, identificando con precisión grupos
de hospedadores específicos, con independencia de variaciones que afecten al
espacio o al tiempo (epidemiología
global). Permite identificar líneas clonales
hipervirulentas de un patógeno concreto,
prediciendo la llegada de ondas epidémicas. También se ha utilizado para el seguimiento de resistencias antibióticas.
El polimorfismo de un solo nucleótido, SNP
(Single Nucleotide Polymorphism) es una
variacion en la secuencia del genoma de
ADN que afecta solo a una base nitroge-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 356
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
356
nada (A, T, C o G). Algunos autores se refieren también con igual denominación a
“polimorfismo de nucléotido simple” y
aceptan en ello cambios en unos pocos nucleótidos, incluyendo inserciones y deleciones que deben afectar al menos a un
1% de la población (por debajo se considera mutación puntual). En esencia, MLST
es también un metodo de genotipado SNP,
aunque solo se aplica a especies heterogéneas genéticamente en las que muchos
SNP están localizados dentro del gen.
La SLST (Single-Locus Sequence Typing)
es una denominación muy general que
acoge una amplia variedad de métodos en
los que la secuenciacion de un locus genético simple ha mostrado que proporciona
resultados válidos para la tipificación. El
análisis de un locus simple hace que la cantidad de ADN a secuenciar sea limitada,
por lo que es imperativo seleccionar secuencias génicas que sean altamente variables. Un ejemplo de un esquema SLST
es el que corresponde a la tipificación de
Str. pyogenes (268).
Los microarrays, solos o combinados con
MLST, como hemos visto, también representan una opción alternativa, aunque limitada (269), en el campo de la
Epidemiología Molecular (solamente se ha
descrito su uso en el caso del estudio de la
evolución de M. tuberculosis con microarrays que contienen la totalidad del genoma del microorganismo). No obstante,
algunos autores justifican su uso en el caso
del seguimiento de cepas microbianas a
nivel internacional.
Secuenciación de genomas
La secuenciación de genomas, en sus diferentes opciones, permite “leer” el có-
digo genético de un microorganismo,
cualquiera que sea su carácter. La secuenciación permite identificar nuevos patógenos, caracterizarles, establecer su relación con la aparición de casos, brotes y
epidemias y la identificación de patrones
que determinan la resistencia frente a antimicrobianos (particularmente antibióticos), incluyendo también antivirales. La
secuenciación ha permitido conocer el genoma completo de numerosos microorganismos, representando después una
ventana abierta para el estudio de la presencia de genes relacionados con factores
de virulencia, el estudio de sus interacciones con los hospedadores susceptibles
y el desarrollo de métodos diagnósticos y
de fármacos y vacunas.
Aplicaciones de la
Biotecnología al desarrollo
de vacunas. Vacunología
Introducción
La vacunación ha sido durante siglos,
desde su descubrimiento aplicando los
principios de la variolización de Jenner
(270), un poderoso instrumento (en algunos casos el único) en la lucha contra las
enfermedades infecciosas, de los animales
y el hombre. En Medicina Veterinaria, las
vacunas han representado un valiosísimo
papel en el desarrollo de la ganadería moderna, permitiendo el control frente a enfermedades producidas por bacterias y,
sobre todo, por virus, en los que, como es
conocido, los antibióticos carecen de
efecto. En el mundo de los animales salvajes los éxitos logrados, por ejemplo, mediante la vacunación de zorros frente a la
rabia en Europa, han permitido práctica-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 357
Sanidad animal y biotecnología
357
mente lograr su erradicación entre la fauna
silvestre y con ello salvado de la enfermedad a otros animales domésticos y al
hombre.
Desde hace apenas 20-30 años, los
nuevos descubrimientos ligados a la
Microbiología, Biología Molecular y la
Inmunología han impulsado nuevas
formas de entender esta ciencia, cambiando progresivamente los métodos originales de los primeros especialistas, particularmente Pasteur y otros, hace ya más
de 100 años. A ello han contribuido también conocimientos nuevos acerca de la
patogénesis de las infecciones, datos procedentes del conocimiento del genoma,
tanto de los agentes patógenos como de
los hospedadores animales, nuevos sistemas de preparación de antígenos y un
desarrollo importante de los adyuvantes
de inmunidad, que exaltan y modulan la
inmunogenicidad de los primeros.
En su conjunto se puede afirmar, como
sucede en el campo del diagnóstico, que
la Biotecnología está propiciando contribuciones muy trascendentes, abriendo
nuevas vías para la fabricación de vacunas, incluyendo nuevos métodos de
atenuación, sistemas de marcaje genético,
definición y uso particular de fracciones
microbianas o moléculas purificadas como
dianas vacunales, uso directo del ADN
como inmunógeno, nuevas estrategias
para la mejor presentación del antígeno
al sistema inmune, etc., además de otras
herramientas de distinto tipo, todo ello
con el propósito de lograr una inmunización más segura y eficaz contra las enfermedades infecciosas, tanto en el caso de
los animales como del hombre. En la actualidad, en la práctica, se dispone de
productos que son utilizables de forma
compatible en programas de erradicación,
en las políticas de comercio internacional,
así como en los balances coste-beneficio
en los esquemas de producción animal, y
todo ello respetando los principios de seguridad más rigurosos y exigentes.
La Biotecnología proporciona los medios
para desarrollar instrumentos nuevos y más
eficaces destinados al control y la erradicación de las enfermedades, naturales o provocadas. Los últimos avances del desarrollo
de vacunas mediante la Ingeniería
Genética, particularmente en lo que se refiere a las vacunas recombinantes, son muy
prometedores. Las autorizaciones oficiales,
sin embargo, tropiezan en algunos países
con el temor a los riesgos, debido, por lo
general, a la ignorancia o a una comunicación insuficiente sobre las bases científicas
de su desarrollo. Las primeras vacunas recombinantes fueron introducidas en la
práctica a finales de los años 80 para el
control de la enfermedad de Aujeszky (vacuna marcada) y la rabia, en este caso, en
animales salvajes (271).
En cualquier caso, debe precisarse que los
criterios que condicionan el éxito de las
vacunas veterinarias (en Sanidad Animal,
principalmente) pueden ser muy distintos
a los que rigen la vacunología humana,
dependiendo del grupo o tipo de animales que se considere, pues mientras
que en el caso de los animales de compañía los criterios son aproximadamente
los mismos que los de las vacunas humanas, primando el concepto de individuo enfermo, en el caso de los animales
de renta, la línea de intervención fundamental seguida por la industria en todas
sus fases es el balance coste/beneficio, y
su destino poblaciones muy numerosas
de animales de forma simultánea, en pro-
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 358
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
358
gramas de vacunación sistemáticos y muy
ajustados. En el caso de las zoonosis e infecciones transmitidas por alimentos, el
objetivo principal es la eliminación del
riesgo para el consumidor (y en algunos
casos mejorar la productividad). Por último, la vacunación de los animales salvajes solamente mantiene una consideración secundaria, ligada a la posible
transmisión de enfermedades al hombre
(por ejemplo, el caso de la rabia), aunque
en los últimos años está siendo objeto de
interés creciente, en relación con otros
motivos, incluyendo razones ecológicas,
de diversidad o epidemiológicas, o en la
concienciación, cada vez más importante,
del papel que estos animales representan
en el origen de infecciones (y zoonosis)
emergentes. En esta última población
animal resulta de especial importancia
cuanto se refiere a la forma de administración, principalmente mediante el uso
de cebos vacunales (vacunas orales).
Los dos factores clave del éxito de la industria de la Sanidad Animal incluyen el
tiempo necesario para la comercialización
y el coste derivado del desarrollo. Tanto
en el que se refiere a vacunas como a fármacos terapéuticos, se han puesto de manifiesto inconvenientes derivados de los
elevados costes de desarrollo y el de su
distribución y comercialización. La OIE ha
prestado su apoyo a la estrategia de
“Cooperación Internacional para la
Armonización de los Requisitos Técnicos
relativos al Registro de Medicamentos
Veterinarios”, un programa trilateral firmado por los EE.UU., Japón y la UE. Esta
última, por su parte, ha reconocido la necesidad de revisar y mejorar los procedimientos de control en todos sus países
miembros, en lo que se está trabajando
(272).
Situación actual
Las vacunas veterinarias suponen aproximadamente el 23% del mercado global
de la industria de Sanidad Animal, con
una tendencia creciente debido sobre
todo a los nuevos avanc es tecnológicos
en el desarrollo de vacunas, la creciente
descripción de resistencias frente a los antibióticos y otros antimicrobianos y a la
constante emergencia de enfermedades
nuevas, unido a la reemergencia de otras
que se consideraban controladas. Aparte
de la mejora en salud y productividad, en
el caso de los animales a los que van dirigidas, las vacunas veterinarias poseen un
impacto significativo en términos de Salud
Pública, toda vez que su uso reduce el de
fármacos y hormonas, así como el de los
correspondientes residuos en la cadena
alimentaria, aspecto este, de gran interés
actual, como es conocido. Las vacunas
también contribuyen al bienestar animal
y su uso está favorecido por todas las organizaciones internacionales de defensa
de los animales.
El valor de las vacunas en la lucha contra
las enfermedades infecciosas del hombre y
los animales es una cuestión de reconocimiento unánime. En el diseño de una vacuna eficaz, la elección del antígeno constituye el elemento central. El antígeno
elegido, que puede ser un microorganismo
completo inactivado o atenuado o una
mezcla de varias cepas bacterianas, por
ejemplo, o de proteínas aisladas y purificadas, o glicoproteínas y carbohidratos, o
proteínas recombinantes y glicoproteínas,
que de todas estas posibilidades y aún más
se dispone para la preparación del producto
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 359
Sanidad animal y biotecnología
359
vacunal, debe estimular una respuesta inmune específica y de memoria, aunque en
la actualidad se sabe también de la importancia que posee el estímulo de la inmunidad innata, pues juega un importatísimo
papel en relación con la adaptativa, con la
que está intimamente relacionada (figura
24) (273). Para la selección del antígeno,
particularmente cuando es posible elegir
entre varias opciones, por ejemplo, en el
caso de las bacterias patógenas, y para su
presentación a las células competentes del
sistema inmune, deben considerarse numerosas cuestiones desde su estructura terciaria, a su tamaño, complejidad molecular,
composición química, etc.
En la actualidad, la mayor parte de las vacunas autorizadas destinadas a los animales, tanto en el caso de enfermedades
producidas por bacterias como por virus,
son vacunas vivas, atenuadas, o vacunas
muertas o inactivadas. Las primeras son
muy eficientes en el propósito de estimular
una inmunidad de larga duración basada
tanto en la respuesta inmune humoral
como celular; sin embargo, este tipo de
productos presenta un riesgo potencial
para los animales gestantes e inmunodeprimidos en general, además de su potencial capacidad de revertir a la forma virulenta. Las vacunas inactivadas carecen de
infectividad y, desde ese punto de vista, carecen del riesgo de las primeras, aunque su
capacidad de inducir una respuesta inmune eficaz es mucho menor, especialmente en lo que se refiere a la respuesta
de base celular y, en conjunto, son menos
inmunógenas que las vacunas vivas.
La inmunidad adquirida como consecuencia del padecimiento de la enfermedad natural puede adoptar diferentes
formas, dependiendo del tipo de patógeno (bacterias, virus, hongos, parásitos,
etc.), y las vacunas pueden ser utilizadas
para prevenir los signos clínicos de la enfermedad, después de la infección, o para
ayudar al control, eliminar o incluso erradicar una infección a nivel de poblaciones
animales. Tanto la eficacia como el mecanismo de acción de las vacunas puede variar, dependiendo del resultado requerido.
Figura 24. La respuesta innata y adaptativa. http://people.eku.edu/ritchisong/301notes4b.html.
6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd
17/12/12
13:06
Página 360
Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria
360
Las autoridades competentes, tanto en el
caso humano como veterinario, vienen requiriendo de forma sistemática a las industrias dedicadas a la producción de vacunas, a definir de forma específica los
antígenos protectores y a producir vacunas libres de toxinas asociadas a la presencia de patógenos y de componentes
inmunosupresores (274) representando
todo ello un reto muy importante para la
Ciencia Veterinaria de la Sanidad Animal
y las industrias que la desarrollan.
Vacunas convencionales
A lo largo del siglo pasado y aún en el
presente se han venido utilizando en la
prevención de enfermedades bacterianas
y víricas en Sanidad Animal, diferentes
tipos de vacunas vivas atenuadas e inactivadas (bacterinas), como hemos señalado. En el caso de las primeras, la atenuación se obtuvo de forma espontánea,
como un hallazgo científico, las más de
las veces, en el que se desconocía la naturaleza de la atenuación y aún así permanece en la mayor parte de los casos,
con escasos esfuerzos por lograr su caracterización desde el punto de vista genético. Se obtuvieron cepas atenuadas que,
en ocasiones, inducían niveles de protección buenos y en otras no tanto, razón
que sigue estimulando por parte de los
científicos su mejora. Las bacterinas