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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
PERFIL DEL PROYECTO
INVESTIGADORES:
Sandra López, Ph.D.
Blas Armién, MD, MSc (PH)
Anayansi Valderrama, Ph.D.
Lorenzo Cáceres, Ph.D.
Yamilka, Diaz. Licda.
FEBRERO DE 2014
INSTITUTO CONMEMORATIVO GORGAS DE ESTUDIOS DE LA SALUD
Calle 35 y 36 Ave. Justo Arosemena, Corregimiento de Calidonia
ÍNDICE
I.
INTRODUCCIÓN
2
II.
TÍTULO DE LA INVESTIGACIÓN
3
III.
ANTECEDENTES
3
IV.
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
5
V.
OBJETIVO GENERAL
7
VI.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
7
VII.
JUSTIFICACIÓN
10
VIII.
LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO
10
IX.
METODOLOGÍA
10
X.
RESULTADOS ESPERADOS
19
XI.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
20
XII.
CRONOGRAMA
21
XIII.
PRESUPUESTO
22
I.
INTRODUCCIÓN
El documento que presentamos, constituye un esfuerzo de organizar ideas
relacionadas con una investigación integral del Dengue en Panamá.
En Panamá, el dengue ha sido considerado un problema prioritario en salud
pública debido a múltiples factores entre ellos la reemergencia e intensa
transmisión
viral
con
tendencia
creciente
en
las
últimas
décadas,
el
comportamiento cíclico se ha caracterizado en los últimos años por picos
epidémicos cada vez más frecuentes, relacionados con el reingreso de nuevos
serotipos al país, creando epidemias con cada vez más casos severos.
El dengue es quizás una de las patologías infecciosas con mayor impacto en
Panamá y constituye un evento cuya vigilancia, prevención y control revisten
especial interés en salud pública. En Panamá es un fenómeno primordialmente
urbano, por ello la investigación se enfoca inicialmente hacia las provincias de
Panamá y Colón.
En este documento presentaremos primero, en los antecedentes, los conocimientos
generales del dengue, para luego enfocarse en el problema actual de estas
enfermedades en nuestro país. El objetivo general de este proyecto es fortalecer lo
existente y desarrollar nuevas técnicas de vigilancia, de diagnóstico y de
tratamiento de estas enfermedades, así como obtener conocimientos científicos
integrales y evidencias para tomar decisiones pertinentes que ayuden a prevenir,
controlar y tratar la enfermedad por dengue.
El documento continúa con la justificación de este estudio, y la presentación de los
beneficiarios de este proyecto que serán indirectamente todos los panameños ya
que el dengue es un problema endémico en el país sobre todo en las zonas
urbanas y periurbanas donde se concentra la mayoría de la población. Se
presentará el costo y el financiamiento del proyecto, así como la metodología de
estudio y el enfoque escogido para responder a los objetivos.
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Finalmente el documento presenta los resultados y logros esperados para el primer
año de financiamiento. A largo plazo esperamos con ello desarrollar guías de
intercambio internacional y de información, a su vez obtener recursos sustentables
para mantener la vigilancia, prevenir, controlar y atender las futuras epidemias de
dengue.
2
TITULO DE LA INVESTIGACIÓN:
Estudio de la enfermedad del Dengue en Panamá
II.
ANTECEDENTES:
Dengue es un problema mayor de salud pública en las regiones tropicales y
subtropicales, en las cuales se encuentra Panamá, que es causado por cuatro
serotipos del virus del dengue (DENV-1, -2, -3, -4), un flavivirus transmitido a
humanos por los mosquitos Aedes. La infección por dengue puede ser
asintomática o producir enfermedad que puede ser leve a severa, está última
tradicionalmente conocida como la fiebre hemorrágica de dengue (FHD) o el
síndrome de choque por dengue (SCD), que puede llevar a la muerte.
La implementación de la nueva clasificación clínica de la OMS ha permitido un
mejor manejo clínico del paciente y una disminución de la letalidad en varios
países de América, pero todavía no se ha determinado su impacto en Panamá.
Igualmente ha habido avances importantes en la explicación de la patogénesis del
dengue, pero todavía es difícil determinar si un paciente agudo por dengue va a
desarrollar enfermedad y es todavía más difícil predecir el grado de severidad. Sin
embargo, el desenlace de la enfermedad parece depender del virus así como de la
genética del paciente y su inmunidad previa, lo que indica la importancia de
desarrollar investigaciones en esos temas.
En 1958 Panamá fue declarado libre del Aedes aegypti. Sufrió cuatro reinfestaciones en 27 años las cual fueron controladas hasta la re-infestación
definitiva en 1985, producto de la importación de llantas infestada con huevos de
este mosquito. En 1988 el MINSA formaliza la "Comisión Técnica Nacional para la
Prevención del Dengue y control del Aedes aegypti”. Por ocho años no hubo casos
de fiebre por dengue a pesar de la presencia del vector y el registro de casos de la
enfermedad en la Sub-Región Centroamericana. El primer brote de dengue ocurrió
en 1993 en el distrito de San Miguelito y desde entonces hemos tenido casos de
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forma consecutiva, han circulado todos los serotipos, la detección de casos de
Fiebre Hemorrágica por Dengue ha sido inusualmente baja con una tasa de
letalidad elevada comparado con los países vecinos.
Se destacan los brotes de los años 1997, 2001, 2005, 2009 y 2011. En total se
han acumulado 151 casos de FDH y la letalidad ha variado de 8 a 71%. La nueva
clasificación fue sugerida por la OPS desde el 2009, sin embargo, en Panamá no
se aplicó hasta el 2012, después del brote del 2011 donde hubo varios casos
fatales. Sin duda se ha tenido problemas con la aplicación de la definición de
casos y criterios de clasificación y esto limita su comparabilidad con nuestros
vecinos. Disponemos de dos años de implementación que no ha sido fácil y la
siguiente fase es evaluar su impacto.
El dengue se distribuye en áreas urbanas, la circulación de la enfermedad va
aparejada junto con la distribución geográfica del Ae. aegypti, su principal vector
en las Américas. En ausencia de una vacuna contra el dengue, el control del Ae.
aegypti es considerado como esencial para evitar las epidemias. En 2013
cumplimos 25 años de la vigilancia del vector de los cuales 21 años la enfermedad
ha estado presente a pesar de las inversiones y las estrategias de control y
prevención. En 1992, Panamá fue elogiada por la OPS debido a la estrategia de
control aplicada y en este sentido nos adelantamos a la estrategia EGI-COMBI por
más de una década. Desde el 2005 contamos con la misma y a pesar de sus
similitudes con nuestra experiencia no ha dado los frutos esperados.
La vigilancia de laboratorio estuvo centralizada en el ICGES hasta el 2009 en la
que se dotó desde el nivel primario al terciario de atención de manera estratégica
con el diagnóstico de IgM anti-dengue por ELISA. Sin embargo, es necesario
descentralizar pruebas sensibles y específicas que permitan un diagnóstico en la
fase aguda de la enfermedad. La detección del antígeno viral NS1 por ELISA fue
descrita en el año 2000 e introducida en Panamá entre el 2009 y 2010 en las
instituciones privadas y en el 2011 en algunas instalaciones públicas de salud, sin
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embargo actualmente aproximadamente sólo 17% de estas instalaciones la
utilizan.
III.
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
Durante el 2013, en países vecinos, se han registrado miles de casos de dengue,
en Colombia se han reportado arriba de 100 000 casos y Costa Rica ≈50 000 y se
han asociado a la circulación del serotipo 2. Se decretó una alerta sanitaria
nacional para contener la epidemia en noviembre de 2013 y en el mismo periodo,
en Panamá, se registraron 3115 casos de dengue con una mortalidad del 0.32%
(10/12). De lo que va de la epidemia (octubre 2013 hasta ahora) se han registrado
trece (13) defunciones de los cuales ocho han sido confirmados por biología
molecular en el ICGES, y la alerta aún no ha sido levantada.
El MINSA-ICGES desde el 2009 descentralizó la prueba para la detección de IgM
e IgG anti dengue por ELISA y ha tenido su impacto toda vez que facilitó el
diagnóstico y ello va de la mano con la implementación de la nueva definición de
casos de enfermedad por dengue (con o sin signos de alarma y dengue grave) en
el 2012, sin embargo, no se ha evaluado el impacto en la aplicación. Además se
necesitan capacitaciones para que los médicos puedan interpretar los resultados
de diagnóstico de laboratorio y así facilitar el manejo de los pacientes, y para los
casos fatales capacitar en la toma de muestra de tejidos. Igualmente se necesita
reforzar la vigilancia virológica en varias regiones del país.
En esta última epidemia, todos los casos graves se vieron afectados por el
serotipo de dengue 2. Estudios recientes en Nicaragua muestran que algunas
cepas de dengue 2 pueden ser asociadas a casos severos, por lo cual es crucial
caracterizar a nivel molecular y genético los virus que circulan en todo el territorio
nacional.
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
Aunque las lluvias en la ciudad de Panamá se registraron hasta mediados del mes
de enero de 2014 lo cual es inusual; los vientos Alisios ya están sobre la región y
los casos aún no han disminuido. Las actividades del departamento de control de
vectores es permanente pero el personal es cada vez menor y los recursos para
mantener el control se hacen cada vez más difíciles; entre las actividades que
realiza este equipo es la eliminación de los criaderos con abate y los adultos a
través de la fumigación, sin embargo, existen pocos estudios a nivel nacional que
evalúen la resistencia del vector a los químicos utilizados en el país.
Además persisten los factores de riesgos que favorecen la presencia del Aedes
aegypti a pesar de la campaña de control larvario por parte de la comunidad, el
guardar el agua en depósitos adecuados no ha dado sus frutos, persiste la falta de
dotación de agua potable permanente en gran parte de la población, la basura
sigue siendo un problema patente, la participación comunitaria solo se da en los
lugares en que las personas se ven afectadas, y este problema está amplificado
por la pobreza y la urbanización inadecuada y no planificada. Además no se
conoce el rol del otro vector potencial del virus del dengue Aedes albopictus en
Panamá, por lo cual estudios que determinen la capacidad vectorial de estos dos
mosquitos para dengue van a ser cruciales para desarrollar nuevas estrategias de
control de vectores que se enfoquen en estas dos especies y no sólo, como lo es
actualmente, en Aedes aegypti.
Aunado a esto están los esfuerzos del MINSA que incentiva a la población a la
eliminación de los criaderos a través de una campaña de promoción que no está
produciendo el impacto esperado a pesar del acceso a los medios de información
por parte de la población que se estima arriba del 95%. Se desconoce el modelo
de percepción de salud-enfermedad y muerte en la población al respecto de la
enfermedad por dengue y la misma considera que el MINSA, el Municipio y otros
gobiernos locales deben resolverles sus problemas.
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
El único estudio de costo de la enfermedad del que se dispone data de nueve
años por lo que es necesario realizar una actualización de los datos, y compartirlo
con la sociedad.
IV.
OBJETIVO GENERAL:
Caracterizar la enfermedad por Dengue (costo, manejo clínico, patogénesis,
ecología, tipos de especies de vectores implicados en la trasmisión y virus
circulantes) en Panamá. Además de fortalecer el diagnóstico clínico y de
laboratorio, determinar si el manejo clínico y las intervenciones en salud pública y
control de vectores son las mejores adaptadas en el país. Por otro lado,
pretendemos generar las evidencias a través del sistema de vigilancia
epidemiológica para la toma de decisiones, la prevención y el control de la
enfermedad de Dengue en Panamá.
V.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Comprender el problema de dengue conlleva una estrategia integral:
-
Determinar el impacto económico y social de la enfermedad en Panamá, y
desarrollar nuevas medidas de salud pública.
-
Definir el grado de implementación de la nueva clasificación clínica del
dengue determinado por la OMS, y de su impacto en el manejo clínico de
los pacientes.
-
Capacitar a médicos en el diagnóstico clínico.
-
Capacitar a tecnólogos médicos en el diagnóstico de laboratorio.
-
Mejorar el diagnóstico temprano así como fortalecer la vigilancia virológica y
serológica en todo el territorio nacional:
o Capacitaciones
o Sensibilidad y control de calidad de métodos diagnósticos de
laboratorio
o Innovación tecnológica
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
-
Caracterizar a nivel molecular y genético las variaciones de los virus del
dengue circulantes en el país.
-
Realizar estudios para determinar si las futuras vacunas y drogas contra el
dengue serian efectivas contra las cepas que circulan en el país.
-
En los casos febriles con síntomas similares a dengue que se diagnostican
dengue negativos, se tratará de detectar, identificar y caracterizar el agente
etiológico responsable, que probablemente sea otro agente viral.
-
Implementar estudios de investigación para comprender la patogénesis de
la enfermedad, que permitan a medio/largo plazo detectar los pacientes con
riesgo de desarrollar dengue severo.
-
Determinar la coexistencia de las dos especies transmisoras del dengue, y
comparar la capacidad vectorial entre ambas especies.
-
Determinar la transmisión vertical de Ae. aegypti y Ae. albopictus en las
zonas de alta incidencia de la enfermedad.
-
Desarrollar modelos predictivos de infestación de los vectores, y modelos
predictivos asociados con la apariencia de la enfermedad.
-
Evaluar los mecanismos de control del vector:
o Determinar en el vector la resistencia a los insecticidas que utiliza el
MINSA y sus mecanismos en poblaciones de Ae. aegypti y Ae.
Albopictus en las principales regiones de transmisión de dengue en
el país.
o Evaluar nuevos sistemas de control vectorial (como el uso de
mosquitos genéticamente modificados).
-
Educar y fortalecer la comunicación hacia la comunidad en la eliminación
de criaderos y otras medidas preventivas de control.
VI.
JUSTIFICACIÓN
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
El dengue es una enfermedad endémica en Panamá que desde la reintroducción
del mosquito Aedes aegypti (1985) y la detección de Aedes albopictus (2002),
vectores del virus causante de la enfermedad, no hemos logrado controlar. En
efecto los casos de dengue aumentan anualmente en las Américas y en nuestro
país, y las epidemias cada vez más frecuentes presentan casos más severos. La
falta de interés de la comunidad si no está directamente implicada, la falta de
recursos y de personal en el control de vectores, así como la utilización de
técnicas tradicionales sin estudio de resistencia a los insecticidas de los vectores y
enfocadas sólo en un vector (Ae. Aegypti) y no en los dos vectores probables (Ae.
Aegypti y albopictus) hace que la prevención no haya dado los resultados
esperados. Lo anterior hace necesario el desarrollo integral de intervenciones que
ameritan que el personal de salud esté debidamente capacitado para esas labores
para fortalecer la prevención.
La última epidemia de dengue (2013-2014) causó más de 3000 casos de los
cuales 13 fueron fatales (de estos 8 confirmados por biología molecular en el
ICGES). Indicaciones sugieren que la implementación de la nueva clasificación
clínica de la enfermedad por la OMS, el diagnóstico clínico temprano y el manejo
de los casos fatales no han sido eficientes, por lo cual se requiere de mayor
entrenamiento y capacitación al personal de salud. Igualmente la asistencia tardía
al principio de la epidemia de los pacientes, sobre todo de los casos pediátricos
que son más vulnerables, indican la necesidad de educar a la comunidad antes
del desarrollo de epidemias.
Nos urge la necesidad de generar conocimientos sobre los vectores, el virus y la
misma enfermedad a través de investigaciones con una visión integral de la
enfermedad como lo propone este proyecto, para mejorar la prevención y el
control del dengue, el diagnóstico clínico, el manejo de pacientes y el diagnóstico
de laboratorio, ya que esperamos que todo esto pueda impactar la disminución del
número de casos de dengue, la morbilidad y la letalidad de la enfermedad, así
como los costos económicos y sociales que esta genera a la sociedad panameña.
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
VII.
LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO
Este proyecto se realizará en la República de Panamá.
VIII.
-
METODOLOGÍA
Estudio retrospectivo de los costos de dengue en Panamá, igualmente
estudios prospectivos de los casos sospechosos de dengue captados en
ciertas instituciones para la determinación del costo económico y social de
la enfermedad
-
Encuestas al personal de salud y a la población para evaluar impacto
social, el conocimiento de la enfermedad, el grado de implementación de la
nueva clasificación clínica del dengue determinado por la OMS
-
Comparaciones del manejo clínico de dengue antes y después de la
implementación de la nueva clasificación clínica del dengue determinado
por la OMS.
-
Se desarrollarán cursos de capacitación para mejorar el diagnóstico clínico
y tratamientos a médicos y enfermeras.
-
Capacitaciones del personal de laboratorio y de epidemiologia para el
diagnóstico de laboratorio y la vigilancia virológica/serológica.
-
Se realizarán estudios de comparación de técnicas de diagnósticas
existentes y novedosas para determinar sensibilidad en el laboratorio y en
campo
-
Fortalecimiento del Control de Calidad como parte del aseguramiento en la
calidad de los resultados de los laboratorios, creando entre otros Paneles
de Proficiencia.
-
Se realizarán estudios de comparación de técnicas diagnósticas existentes
y novedosas para determinar su utilidad y eficiencia en el laboratorio y en el
campo (Centros de Salud y Policlínicas).
-
Caracterizar por métodos moleculares los virus que se aíslen en el
laboratorio donde se caracterizará los serotipos. Para los estudios
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
genéticos se secuenciarán virus de cada serotipo, se realizarán estudios
filogenéticos y de identificación de mutaciones asociadas a la virulencia.
-
En los casos febriles con síntomas similares a dengue que se
diagnostiquen dengue negativo, se realizará aislamiento viral, y se
emplearán métodos de biología molecular para describir el agente
etiológico responsable de la enfermedad.
-
Analizar por técnicas de laboratorio muestras de pacientes con dengue para
comprender la patogénesis de la enfermedad y la respuesta inmune contra
el dengue: detección de citocinas, caracterización de la respuesta de
anticuerpos y de la respuesta celular (células T y NK por ejemplo).
-
Determinar la coexistencia de las dos especies transmisoras del dengue, y
comparar la capacidad vectorial entre ambas especies.
-
Determinar la transmisión vertical de Ae. aegypti y Ae. albopictus en las
zonas de alta incidencia de la enfermedad.
-
Desarrollar modelos predictivos de infestación de los vectores, y modelos
predictivos asociados con la apariencia de la enfermedad.
-
Evaluar los mecanismos de control del vector:
o Determinar en el vector la resistencia a los insecticidas que utiliza el
MINSA.
o Evaluar nuevos sistemas de control vectorial (como el uso de
mosquitos genéticamente modificados).
-
Preparación de material didáctico y creación de brigadas comunitarias para
eliminación de criaderos, incorporación de MEDUCA para educación de
niños y docentes.
COMPONENTE: PATOGÉNESIS DE LA ENFERMEDAD
La patogénesis de la enfermedad por dengue y su severidad depende de factores
virales, genéticos y de inmunidad previa del paciente. Las muestras recolectadas en
las instalaciones de salud para la vigilancia y los estudios de investigación se
analizarán en parte en las instalaciones que tienen laboratorios equipados y por
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
otra parte por el personal del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la
Salud (ICGES), a través de técnicas moleculares y de serología para confirmar los
casos sospechosos por dengue y caracterizar a las cepas circulantes del virus en
Panamá, así como nuevas técnicas para describir la respuesta inmune contra este
virus.
Caracterización de los virus del dengue en muestras de pacientes
El suero agudo de pacientes sospechosos por dengue recibidos a través de la
vigilancia virológica serán analizados por la prueba de la reacción en cadena de la
polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR), protocolo CDC-2013, con la que se
detectan los cuatros serotipos del virus Dengue. Este resultado es notificado al
médico y a epidemiología del MINSA. Para aislamiento viral, el suero será
cultivado sobre células Vero y C6/36, incubadas y examinadas diariamente por
evidencia de efecto citopático (ECP). Los virus aislados serán identificados con
pruebas de inmunofluorescencia (IFA) y por biología molecular con el protocolo de
CDC para dengue. Para las muestras amplificadas con los cebadores descritos en
este protocolo se confirmarán con la secuenciación de los mismos.
En muestras aisladas que no amplifiquen con el protocolo CDC se le realizará la
prueba de inhibición de la hemaglutinación HI, la prueba de antígeno VecTest para
los virus de encefalitis equina y fiebre amarilla, también se le realizara una RTPCR para detectar estos u otros virus de los géneros Flavivirus y Alphavirus (Ortiz
A. et al, 2012; Sanchez-Seco MP et al, 2001), aquellas muestras positivas también
serán confirmadas mediante secuenciación.
Una vez el virus identificado por secuenciación, se realizarán estudios
filogenéticos, y de ser necesario se realizará secuenciación de genoma completo
para la identificación de mutaciones asociadas a la virulencia.
Caracterización de la respuesta inmune en muestras de pacientes
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
Para comprender mejor la patogénesis de la enfermedad por dengue es crucial
determinar la respuesta inmune contra la infección y comparar los pacientes con
dengue leve con los pacientes que tienen dengue severo, además de analizar los
casos fatales cuando es posible. Para detectar las citocinas inducidas a diferentes
momentos de la infección, se analizarán los sueros agudos de pacientes
sospechosos por dengue recibidos durante la vigilancia virológica así como los
sueros pareados de serología por técnicas de citokine arrays o, para citocinas
específicas, por ELISA.
La respuesta de anticuerpos también será analizada a partir de estos sueros y los
anticuerpos específicos para dengue podrán ser detectados por ELISA y
caracterizados con la prueba de neutralización (PRNT), igualmente se podrán
realizar experimentos in vitro para determinar exactamente qué antígenos son
reconocidos por estos anticuerpos así como determinar su función protectora
(neutralización, pruebas de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC,
por sus siglas en inglés)) o amplificadora de la infección (amplificación
dependiente de anticuerpos o ADE, por sus siglas en inglés).
Para analizar la respuesta inmune celular contra el dengue se necesitará colectar
muestras de sangre en tubos con anticuagulante con el consentimiento informado
del paciente. Como estas muestras serán colectadas para investigación y no a
través de la vigilancia, el protocolo será sometido al Comité de Etica de la
Investigación correspondiente. Las células de la sangre (células T, B, NK,
monocitos y granulocitos) podrán ser analizadas por citometría de flujo para
expresión de proteínas, por técnicas de biología molecular para transcriptoma o la
caracterización
de
componentes
genéticos
que
puedan
participar
a
la
susceptibilidad de la enfermedad.
COMPONENTE: CICLO DE TRANSMISIÓN Y VECTORES
13
ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
Colectas de artrópodos:
Las colectas de las especies de Aedes aegypti y Aedes albopictus incriminadas en
la transmisión del Dengue, se realizarán mediante el uso de trampas de CDC para
los estadios adultos durante la noche, las cuales se distribuirán aleatoriamente en
las diferentes comunidades. Para este muestreo se considera el área del
peridomicilio.
El diseño experimental será el de estratificación aleatoria, con la ayuda de
imágenes satelitales se determinará el uso del suelo, luego se establecerán
parcelas imaginarias (polígonos de thiessen) procederemos a dividir el área en
cinco sub-parcelas de igual tamaño.
Mediante el uso del GPS, podremos integrar la información generada en cada
parcela estudiada, a través del sistema de información geográfico. Lo cual nos
permitirá realizar sobre posiciones de las variables geográficas y entomológicas de
los sitios estudiados. Así podremos realizar las correlaciones y asociaciones
espaciales necesarias.
Se utilizarán 20 trampas de CDC por área específicamente los patios donde se ha
reportado los casos de dengue. Las mismas se distribuirán en el área
experimental, colocándolas en las plantas a 2 m de altura, con una distancia
aproximada de 50 m.
Las trampas de CDC funcionarán durante 12 horas iniciando a las 6:00 PM y
retirándolas a las 7:00 AM. Los especímenes se colocarán en envases y se
trasladarán a la unidad de investigación. Allí se identificarán las dos especies y se
cuantificará el número de individuos por especie.
Adicionalmente se colectarán larvas en recipientes y huevos con ovitrampas, las
cuales se criarán en el insectario del ICGES, en bandeja con 1 litro de agua
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
reposada y 1 g de levadura como alimento. Se dejarán crecer hasta el estadio
adulto y luego se matan a -20 ºC.
Detección de antígenos virales en muestras de mosquitos
En el caso de los mosquitos, se harán “pool” de 20 mosquitos de la misma
especie. Luego, serán triturados en un pulverizador, y para evitar el deterioro de
la muestra se usará un amortiguador que contendrá PBS, pH7.4 con 30% de
suero fetal y agentes microbicidas.
La suspensión centrifugada será cultivada
sobre células Vero y C6/36, incubadas y examinadas diariamente por evidencia de
efecto citopático (ECP). Los virus aislados serán identificados con pruebas de
inmunofluorescencia (IFA) y por la prueba de la reacción en cadena de la
polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR), protocolo CDC-2013, con la que se
detectan los cuatros serotipos del virus Dengue. Para las muestras amplificadas
con los cebadores descritos en este protocolo se confirmarán con la secuenciación
de los mismos.
En muestras aisladas que no amplifiquen con el protocolo CDC se le realizará la
prueba de inhibición de la hemaglutinación HI, la prueba de antígeno VecTest para
los virus de encefalitis equina y fiebre amarilla, también se le realizara una RTPCR para detectar estos u otros virus de los géneros Flavivirus y Alphavirus,
aquellas muestras positivas también serán confirmadas mediante secuenciación.
Detección de la resistencia a insecticidas y sus mecanismos en poblaciones
de Aedes aegypti
La resistencia a los insecticida se ha generalizado, en especial la resistencia a
piretroides, y el hecho que la resistencia a un insecticida generalmente confiere
resistencia cruzada con otros insecticidas, se convierte en el problemas técnico
más importante que enfrentan los programas de control vectores (. En cuanto a los
insecticidas organofosforados, en la última gran revisión importante sobre la
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
resistencia de los vectores a los insecticidas a nivel global, indica que la
resistencia del Ae. aegypti a los organofosforados esta generalizada en casi toda
América.
Muestreo de poblaciones de mosquitos
Se colectará muestras de Aedes en fase inmadura (larvas y pupas) en criaderos
activos localizados en el domicilio y peridomicilio de las viviendas entre las 8:00 y
16:00 horas. Todo el material biológico de mosquitos colectados será transportado
al Departamento de Entomología Médica del ICGES para su identificación a nivel
de especie. Las cepas de Ae. Aegypti y Ae. albopictus, fueron criadas y
mantenidas en condiciones de laboratorio con una temperatura promedio mínima
de 28.5 0C (DE: 0.5703) y máxima de 30.0 0C (DE: 0.0912) y, humedad relativa de
67.5 % (DE: 0.3939) y con fotoperíodo de 12:12 (día/noche) para posteriormente
realizar los bioensayos de susceptibilidad.
Agentes Químicos
En los bioensayos de susceptibilidad se utilizara los piretroides deltametrina,
ciflutrina, lambdacihalotrina y permetrina.
Los insecticidas organofosforados
temefos, fenitrotión, malatión y fentión. Los carbamato propoxur y bendiocarb.
Bioensayos de susceptibilidad en larvas
Los bioensayos se realizaran siguiendo la metodología estandarizada por la OMS.
Se emplearan cinco réplicas de cada concentración del insecticida, registrándose
entre 2 y 98 % de mortalidad. La lectura de la mortalidad se realizará a las 24
horas, los resultados serán analizados sobre la base de criterios de resistencia a
insecticidas según la OMS. Se utilizará como cepa de referencia o susceptible, la
cepa de Ae. aegypti ROCKEFELLER, una cepa de laboratorio susceptible a
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
insecticidas, de origen caribeño, colonizada a principios de los años 1930’s y
suministrada por el laboratorio del CDC de San Juan, Puerto Rico.
Bioensayos de susceptibilidad en mosquitos adultos
Las muestras de hembras adultas de la primera generación (F 1) de Ae. aegypti
serán expuestas a bioensayos de susceptibilidad mediante papeles impregnados
con los diferentes insecticidas piretroides, con dosis diagnóstica y tiempo de
exposición establecidas por las normas estandarizadas de la OMS. Se utilizarán
lotes de 25 hembras de dos a cuatro días de emergidas y alimentadas con sangre
de Cavia porcellus. Los bioensayos se realizaran una hora después de
alimentados los mosquitos. Cada prueba con los insecticidas evaluados contará
con cuatro réplicas y sus controles respectivos. El tiempo de exposición será de 60
minutos, durante los cuales se registrará el número de mosquitos caídos a los 15,
30, 45 y 60 min. Después del período de exposición, los mosquitos se trasladaran
a las cámaras de recuperación y se colocará algodón humedecido en solución de
sacarosa al 10 % como alimento durante el período de recuperación.
Bioensayos bioquímicos
Se utilizará larvas de cuarto estadio temprano en cada pocillo de una placa de
microtitulación que se completará con tampón fosfato. Detección de EST: de
cada pocillo se tomará 20 L y se adicionaron 200 L del sustrato -naftilacetato.
Se dejará transcurrir la reacción durante 10 minutos y posteriormente se
adicionará 40 L de Fast Blue. La densidad óptica (DO) se leerá a 570 nm con el
empleo de un lector de ELISA. Detección de GST: a 20 l de cada homogenado
de larva, se le adicionará 200 l de la mezcla de 3,4 CDNB + glutatión reducido.
Se dejará transcurrir la reacción por 3 min y se leerá la DO a 340 nm. Detección
de AchEr: Se utilizará 20 l del homogenado para la determinación de la
actividad AchE normal e igualmente para la actividad AchE modificada o inhibida
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ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
con propoxur. La reacción se deja transcurrir durante 30 minutos y se leerá la DO
a 405 nm.
También se determinará la acción de los agentes sinergistas DEF inhibidor de
EST y PB inhibidor de MO, exponiendo durante cuatro horas larvas de cuarto
estadio a las dosis subletales y posteriormente se les aplicará diferentes dosis de
insecticidas y se determinará la mortalidad transcurridas 24 horas de exposición.
Se calculará las concentraciones letales 50 (Cl50) y 90 (CL90) a través del
programa Probit-logaritmo de Raymond, (1985). Se considerará que existe
sinergismo para valores de FS>5.
Determinación de resistencia por métodos moleculares
Se le extraerá el ADN genómico a los mosquitos recolectados. Y se amplificarán y
secuenciarán las regiones génicas implicadas por estudios previos en la
resistencia a diferentes insecticidas para detectar posibles mutaciones asociadas
a resistencia. Esto permitirá identificar si la resistencia a los insecticidas está
asociada a características genéticas de los vectores que circulan en el país.
Igualmente se realizarán estudios de campo de comportamiento de cada uno de
los vectores para determinar si los mosquitos modifican su comportamiento (horas
de salida en zonas que son roseadas con insecticida regularmente) como parte de
la resistencia a los insecticidas. Este cambio de comportamiento se ha
demostrado en estudios previos, pero nunca se han realizado en Panamá.
18
ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
IX.
RESULTADOS ESPERADOS
Para el 2017 esperamos los siguientes logros y resultados:
-
Muestreo del diagnóstico y manejo clínico de los pacientes sospechosos
por dengue, zika y chikungunya.
-
Caracterización de la patología e inmunología del dengue, chikungunya,
zika y otros arbovirus en muestras retrospectivas y prospectivas humanas.
-
Capacitación sobre la nueva clasificación clínica del dengue determinado
por la OMS y sobre manejo de pacientes febriles.
-
Capacitación sobre la toma de muestra de casos fatales para el diagnóstico
de dengue.
-
Capacitación sobre el diagnóstico de laboratorio y la vigilancia virológica y
serológica.
-
Capacitación sobre el control de Calidad en el diagnóstico de laboratorio.
-
Equipamiento de laboratorios.
-
Caracterización a nivel molecular y genético de los virus del dengue
circulantes en el país.
-
Se conocerá el grado de coexistencia de las dos especies transmisoras del
dengue.
-
Capacitaciones del personal de control de vectores sobre los métodos
existentes y la resistencia del vector en estudios previos.
-
Establecimiento
de
programas
de
educación
comunitaria
para
implementarlas en el 2017.
19
ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DEL DENGUE EN PANAMÁ
X.
REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
DE
INVESTIGADORES
DEL
GORGAS
1. Suaya JA, Shepard DS, Siqueira JB, Martelli CT, Lum LC, Tan LH, Kongsin
S, Jiamton S, Garrido F, Montoya R, Armien B, Huy R, Castillo L, Caram M,
Sah BK, Sughayyar R, Tyo KR, Halstead SB. Cost of dengue cases in eight
countries in the Americas and Asia: a prospective study. Am J Trop Med
Hyg. 2009 May;80(5):846-55.
2. Armien B, Suaya JA, Quiroz E, Sah BK, Bayard V, Marchena L, Campos C,
Shepard DS. Clinical characteristics and national economic cost of the 2005
dengue epidemic in Panama. Am J Trop Med Hyg. 2008 Sep;79(3):364-71.
3. Ortiz A, Capitan Z, Mendoza Y, Cisneros J, Moreno B, Zaldívar Y, Garcia M,
Smith RE, Motta J, Pascale JM. Simple, specific molecular typing
of dengue virus isolates using one-step RT-PCR and restriction fragment
length polymorphism. J Virol Methods. 2012 Oct;185(1):129-35.
4. Ramírez JL, Souza-Neto J, Torres Cosme R, Rovira J, Ortiz A, Pascale JM,
Dimopoulos G. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti
midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences
vector competence. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(3):e1561.
20