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MICROWELL ELISA
CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN (CEA)
ENZYME IMMUNOASSAYTEST KIT
Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa del antígeno
carcinoembrionario (CEA) en suero humano.
Uso
El kit de prueba CEA de inmunoensayo enzimático es usado para la determinación
cuantitativa de concentración de CEA en suero humano.
Introducción
El antígeno carcinoembrionario (CEA) es una glicoproteína de superficie celular de 200kd. En 1969, se reporto que el CEA en plasma se elevó en 35 de 36 pacientes con
adenocarcinoma de colon y dicho titulo de CEA disminuyó después de una cirugía exitosa.
Niveles normales fueron observados en todos los pacientes con otras formas de cáncer o
enfermedades benignas. Estudios posteriores no han confirmado estos hallazgos iniciales, y
ahora se entiende que niveles elevados de CEA se encuentran en diferentes tipos de cáncer.
Niveles incrementados de CEA se observan en más del 30% de pacientes con cáncer en los
pulmones, hígado, páncreas, pecho, colon, cabeza o cuello, vejiga, cerviz y próstata.
Niveles elevados de plasma están relacionados a la etapa y expansión de la enfermedad, el
grado de diferenciación del tumor y el lugar de la metástasis. El CEA es también
encontrado en tejido normal.
Principio del Análisis
El kit de prueba cuantitativa CEA está basado en un ensayo inmunoabsorbente
enzimático unido a una fase sólida. El sistema de ensayo utiliza un anticuerpo anti-CEA
monoclonal inmovilización en la fase solida (pozos de microtitulación) y otro anticuerpo
anti-CEA monoclonal de ratón en la solución de conjugado de anticuerpo-enzimático
(peroxidasa de rábano picante). Los estándares y las muestras (suero) son añadidos a los
pozos de microtitulación recubiertos con anticuerpo CEA. Luego es añadido el anticuerpo
CEA marcado con peroxidasa de rábano picante (conjugado). Si el CEA humano está
presente en las muestras, se combinara con el anticuerpo presente en el pozo y con el
conjugado enzimático, dando como resultado moléculas de CEA en sandwich entre la fase
sólida y los anticuerpos unidos a la enzima. Después de 1 hora de incubación a temperatura
ambiente, los pozos son lavados con agua para remover los anticuerpos marcados no
unidos. Una solución de TMB es añadida e incubada por 20 minutos, dando como resultado
la formación de una coloración azul. La formación del color es detenida añadiendo HCL
2N. El color cambia a amarillo y es medido espectrofotométricamente a 450nm. La
concentración de CEA es directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra
de prueba.
Materiales y Componentes
Materiales proporcionados con el kit de prueba:
-
Placa de microtitulación de 96 pozos recubierto con anticuerpo.
Estándares de CEA liofilizados con un contenido de: 0, 15, 30, 60 y 120 ng/ml
CEA. 1 set.
Reactivo de conjugado enzimático, 12 ml.
TMB substrato, 12 ml.
Solución de parada, 12 ml.
Materiales requeridos, pero no proporcionados:
-
Pipetas de precisión, 0.05 ml, 0.1 ml, 0.2 ml y 1 ml.
Puntas desechables para pipetas.
Agua destilada.
-
Mezclador vórtice o un equivalente.
Papel absorbente o toallas de papel.
Papel milimetrado.
Lector de placas de microtitulación.
Preparación y Recolección de las Muestras
1- La sangre debería ser obtenida usando técnicas de venopunción estándares y el
suero debería ser separado de los glóbulos rojos lo más rápido posible. Evite
muestras lipémicas, turbias o macroscópicamente hemolíticas.
2- Las muestras de plasma recolectadas en tubos que contengan EDTA, heparina u
oxalato pueden interferir con los procedimientos de la prueba por lo cual deberían
ser evitados.
3- Las muestras deben estar tapadas y pueden ser almacenadas por 48 horas a una
temperatura de 2 a 8 °C antes del análisis. Las muestras almacenadas por un periodo
mayor pueden ser congeladas a -20 °C por seis meses antes del análisis. Las
muestras descongeladas deberían ser invertidas varias veces para mezclar antes del
análisis.
Almacenamiento de los Kits de Prueba e Instrumentación
Kits de prueba no abiertos deberían ser almacenados a una temperatura de 2-8 °C
de acuerdo a la fecha de recepción. La placa de microtitulación debería ser
almacenada a 2-8 °C, en una bolsa sellada con desecantes, para disminuir la
exposición a la humedad del aire. Kits de prueba abiertos permanecerán estables
hasta la fecha de expiración indicada. Debe ser almacenado como se indicó
anteriormente. Un lector de placa de microtitulación con una banda de ancho de
10nm o menos y un rango de densidad óptica de 0-2 o mayor a 450nm de longitud
de onda es aceptable para ser usado en medición de absorbancia.
Preparación del Reactivo
1- Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente (18-22°C) antes de
ser usados. Todos los reactivos deben ser mezclados removiendo o invirtiendo
suavemente antes de su uso. No induzca el espumado.
2- Agregue 1 ml de agua destilada para reconstituir los estándares liofilizados. Permita
que los materiales reconstituidos reposen al menos 20 minutos. Mezcle suavemente.
Los estándares reconstituidos deberían ser almacenados sellados, a una temperatura
de 2-8 °C.
Procedimiento del Análisis
1234-
Asegure el número deseado de pozos recubiertos en el mezclador.
Dispense 50 μl de estándares, muestras y controles en los pozos apropiados.
Dispense 100 μl de reactivo de conjugado enzimático en cada pozo.
Mezcle por 10 segundos. Es muy importante tener una mezcla completa en esta
etapa.
5- Incube a temperatura ambiente (18-22°C) por 60 minutos.
6- Retire la mezcla de incubación vaciando el contenido de la placa en un contenedor
de desperdicios.
7- Enjuague y vacíe la placa de microtitulación 5 veces con agua del grifo o agua
destilada.
8- Golpee la placa de microtitulación sobre el papel absorbente o toallas de papel para
retirar todas las gotas residuales de agua.
9- Dispense 100 μl de solución de TMB en cada pozo. Mezcle suavemente por 5
segundos.
10- Incube a temperatura ambiente por 20 minutos.
11- Detenga la reacción añadiendo 100 μl de solución de parada en cada pozo.
12- Mezcle suavemente por 30 segundos para asegurarse de que el color azul cambie
completamente a amarillo.
13- Lea la densidad óptica a 450nm con un lector de placa de microtitulación dentro de
los siguientes 15 minutos.
Nota Importante:
-
-
El procedimiento de lavado es crítico. Lavado insuficiente resultará en una precisión
pobre y lecturas de absorbancias falsamente elevadas.
Se recomienda no usar más de 32 pozos para cada análisis, si se realiza pipeteado
manual, debido a que el pipeteo de todos los estándares, muestras y controles
debería ser realizado en 3 minutos. Se puede usar una placa con 96 pozos, si se está
realizando pipeteo automático.
Se recomienda montar las muestras por duplicado de todos los estándares y
muestras, aunque no es requerido.
Calculo de los Resultados
Calcule el valor medio de absorbancia (A450) para cada grupo de estándares de
referencia, controles y muestras del paciente. Construya sobre papel milimetrado una curva
de calibración graficando la media de la absorbancia obtenida de cada estándar de
referencia contra su concentración en ng/ml, con los valores de absorbancia en el eje
vertical Y y las concentraciones en el eje vertical X. Use los valores de la media de
absorbancia de cada muestra para determinar la concentración correspondiente de CEA en
ng/ml en la curva de calibración.
Ejemplo de Curva de Calibración
Resultados de los estándares en una corrida típica con lectura de densidad óptica a
450nm reflejados en el eje Y contra concentraciones de CEA reflejados en el eje X.
CEA (ng/ml)
0
3
12
30
60
120
Absorbancia (450 nm)
0.019
0.105
0.362
0.814
1.390
2.032
Esta curva de calibración es solo para propósitos de ilustración y no debería ser usada
para calcular incógnitas. Cada usuario debería obtener sus propios datos y curva de
calibración.
Valores Esperados y Sensibilidad
El estudio más completo de CEA, en una compilación de estudios de colaboración en los
cuales los valores de CEA en 35.000 muestras y controles de más de 10.000 pacientes
fueron analizados. De 1.425 personas normales que no fumaban, 98.7% tuvieron valores
menores a 5.0 ng/ml. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango
normal. La concentración de CEA mínima detectable para este ensayo se estima que sea de
1.0 ng/ml.
Limitaciones del Procedimiento
1- Resultados reproducibles y confiables serán obtenidos cuando el procedimiento del
ensayo sea llevado a cabo con completo entendimiento de las instrucciones del
empaque y acogiéndose a las buenas prácticas de laboratorio.
2- El procedimiento de lavado es crítico. Lavado insuficiente resultará en una precisión
pobre y lecturas de absorbancias falsamente elevadas.
3- Anticuerpos heterofílicos como anticuerpos de humano anti-ratón son
frecuentemente encontrados en suero humano. Esos anticuerpos puede causar severa
interferencia en muchos procedimientos de inmunodiagnóstico. Este análisis ha sido
diseñado para disminuir ese tipo de interferencia. No obstante no puede ser
garantizada, la eliminación completa de esta interferencia en todas las muestras de
paciente. El resultado de una prueba que no es consistente con el cuadro clínico e
historia del paciente debe ser interpretado con precaución.
Referencias
1. Gold P, Freedman S O. Demonstration of tumor specific antigen in human colonic
carcinomata by immunologic tolerance and absorption techniques. J Exp Med
1965;127:439- 462.
2. Thompson D P M, Krupey J, Freedman S O, et al. The radioimmunoassay of circulating
carcinoembryonic antigen of the human digestive system. Proc Natl Acad Sci USA
1969;64:161-167.
3. Schwartz M K. Tumor markers in diagnosis and screening. In: Ting S W, Chen J S,
Schwartz M K, eds. Human tumor markers, Amsterdam: Elsevier Science, 1987;3-16.
4. Zamcheck N. and Martin E.W. Sequential Carcinoembryonic Antigen Levels in
Pancreatic Cancer: Some Clinical Correlations. Cancer 1981;47:1620-1627.
5. Mughal A.W., Hortobagyi G. N., Fritsche H.A., Buzdar A.U. Yap H-Y., and
Blumenschein G.R. Serial Plasma Carcinoembryonic Antigen Measurements During
Treatment of Metastatic Breast Cancer. JAMA 1983; 259:1881-1886.
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ISO 13485-2003
Fecha de Revisión: 6/4/06