Download Resonancia magnética nuclear

09/09/2013
Relación entre la duración del pulso y la intensidad (amplitud) de la señal
M
No hay FID
B0
No hay señal
Pulso de 180 (p)
No hay señal
No hay FID
M
Pulsos entre 0-180 (p)
a M
Mz
a
a = 30
FID
My
Mz
señal
M
Mz
My
a = 60
señal
M
a = 210
señal
M
FID
Mz
FID
My
a = 150
a = 90
M
FID
FID
señal
My
M
a = 270
FID
señal
señal
Calibración del pulso de 13C : Muestra de sacarosa concentrada en abundancia
natural. Se observa el C1-glc para varios valores de la duración del pulso de
13C. J =170 Hz
XH
t (mseg)
p/2
p
3/2p
1
09/09/2013
Determinación de T1. Inversión y recuperación de la magnetización
El tiempo de relajación T1 de los núcleos individuales determina el ancho de línea y la intensidad de las
señales de NMR. Además del desplazamiento químico d y de las constantes de acoplamiento J, el tiempo
de relajación T es específico para cada núcleo y su entorno, y puede proveer información estructural muy
valiosa.
1H muestra solo pequeñas variaciones en el T por lo que no tiene mucha utilidad.
1
13C muestra grandes diferencias en los T de los distintos núcleos, por lo que la medición de T se utiliza
1
1
mucho para elucidaciones estructurales.
Determinación de T2. Ecos de spin
Cuando se aplica un pulso de 90 la magnetización se ubica en el eje y (My). La
relajación tranversal o spin-spin T2 describe el decrecimiento de My.
Las inhomogeneidades del campo magnético Bo provocan que los núcleo equivalentes
de distintas moléculas tengan frecuencias de Larmor ligeramente diferentes. Esto
dispersa a los vectores magnetización individulaes (m) en el plano x,y, y provoca una
disminución en el tiempo T*2 adicional sobre la magnetización total My.
2
09/09/2013
Curvas y Tiempo T2
La recuperación de la magnetización longitudinal es acompañada por el decaimiento de la magnetización
transversal caracterizada por la constante T2. Recibe el nombre de tiempo de relajación espín-espín o
tiempo de relajación transversal(3).
Estos dos procesos se producen en forma independiente. Los fenómenos de relajación espínespín afectan
a la duración natural de la señal de inducción libre, durante la cual los diversos componentes de
magnetización en el plano xy se mantienen más o menos en fase. Cuando acaba el pulso de excitación, los
núcleos no sólo perciben el campo estático externo sino también los campos locales asociados con las
propiedades magnéticas de los núcleos vecinos, de forma que van adquiriendo una frecuencia de precesión
ligeramente diferente, lo que provoca una caída de la magnetización transversal. Si el campo magnético
estático fuese perfectamente uniforme, bastaría medir la velocidad de amortiguación en la señal de
inducción libre para determinar el valor de T2. No obstante, los campos generados por imanes reales casi
nunca son perfectos. Hasta las sutilísimas imperfecciones de los mejores imanes utilizados para
espectroscopía de RM hacen que la señal de inducción libre decaiga con mayor rapidez de lo que
acontecería en presencia de un campo magnético perfectamente homogéneo. La constate de tiempo que
define la velocidad real de la caída de la señal de un campo imperfecto se designa por T2 * para distinguirla
del verdadero tiempo de relajación T2.
A pesar de todo ello, podemos determinar el valor intrínseco de T2 para una muestra aunque esté sometida
a un campo imperfecto, ya que las desigualdades del campo magnético son constantes, lo que permite
identificarlas y cancelarlas. Se recoge la señal en forma de «eco de espín» o de una serie de ecos,
aplicando un perfil especial de pulso de radiofrecuencias, conocido como la secuencia de pulsos CarrPurcell modificada(4). En dicha secuencia, la señal inicial de amortiguación de inducción libre y cada uno
de los ecos de espín individual decaen con una constante de tiempo T2 *, aunque las alturas del pico de los
sucesivos ecos de espín decaen con una
Reenfoque de la magnetización: tiene como objetivo anular los efectos de
inhomogeneidades de campo; en esas condiciones T2 determina los anchos de
banda, y determina la pérdida de la magnetización transversal.
3
09/09/2013
Para la determinación de T2 se utiliza la secuencia de Carr-Purcell-Maiboom-Gill
Para la determinación de T2 se utiliza la secuencia de Carr-Purcell-Maiboom-Gill
El fenómeno se describe mediante la sig. ecuación:
I(t) = I0 e
–t/T2
I(2t)/Io = e
–2t/T2
a t = 2t
I(2t) = I0 e –2t/T2
ln Io/I(2t) = 2t/T2 (1)
T2 = 2t/ ln Io/I(2t)
También se puede sacar T2 de la pendiente de la recta (1)
ln I = ln Io - 2t/T2
ln I
1/T2
Se mide I(2t) en función
de t variable
2t
4
09/09/2013
Determinación del contenido de alcohol (etanol) en un whisky por RMN 1H
Espectro RMN 1H de whisky de
malta sin ningún tratamiento
Área de la señal de CH2 = 11.9 ≡ 2H
Área de la señal de CH3 = 17.9 ≡ 3H
=› 1H ≡ área 6.0
=› 1H ≡ área 6.0
Área del H del EtOH = 6.0
Área del H del H2O = 49.0 – 6.0 = 43.0
Relación H2O (2H) : EtOH (CH2
2H)
43.0 : 11.9
Relación de moles de H2O : moles de EtOH
3.61 : 1.0
Relación de moles de H2O : moles de EtOH
3.61 : 1.0
Si queremos calcular % en masa: multiplicar por el PM
3.61 moles de H2O ≡ mH2O = n de moles x PM H2O = 3.61 x 18 = 65.0 g
mEtOH = n de moles x PM EtOH = 1.0 x 46 = 46.0 g
mH2O + mEtOH = 65 g + 46 g = 111.0 g
% EtOH (m/m) = mEtOH / m total x 100 = 46.0/111.0 x 100 = 41.4 % m/m
Si queremos calcular el % V/V: V = m/d
VH2O = 65.0 g/ 1g/ml = 65 ml
VEtOH = 46.0 g/ 0.96 g/ml = 47.9 ml
% EtOH (V/V) = VEtOH / Vtotal x 100 = 47.9/(65+47.9) x 100 = 42.4 % V/V
suponemos volúmenes aditivos
La etiqueta declaraba 43 %. Este método sirve para detectar adulteraciones con MeOH ( 3.5-5
ppm) y para determinar la graduación alcohólica. En vinos y cervezas, como la concentración es baja
hay que trabajar con mucho cuidado!!!
5
09/09/2013
Determinación de azúcares por RMN
13C
RMN 13C de una mezcla de azúcares
patrón
Bruker 270 MHz (68 MHz para
DIOXANO
13C)
Ampliación de la región
anomérica del espectro
Preparación de la muestra
•cubos de batata o harina preparada por secado
hasta peso constante
•Licuar en 80% H2O, 20% EtOH y centrifugar
(8000 rpm): SOBRENADANTE LIMPIDO, secado
en rotavapor, redisolución, filtración, reevaporación
y solubilización en D2O.
Azúcares simples presentes en el extracto EtOH-H2O de batata
C-1a 92,9 ppm
C-1b 96,7 ppm
C-2 105,4 ppm
C-2 104,5 ppm
C-1a 92,8 ppm
C-1b 96,6 ppm
C-1a 100,4ppm
C-1a 93,0ppm
Métodos clásicos para la determinación de azúcares:
C-1a 99,5ppm
•Azúcares reductores (Fehling)
C-2 104,6 ppm
•Polarimetría
•Colorimetría:
Rafinosa
métodos enzimáticos
fenol-sulfúrico
•Métodos cromatográficos:
C-1a 92,9ppm
CG (derivatización)
HPLC (HPAEC)
TLC (CCD)
6
09/09/2013
RMN 13C de un extracto de EtOH-H2O de batata
Gráfico de HS/HD vs
concentración
El cociente con la señal del dioxano
corrige diferencias de sensibilidad
entre una medición y otra.
7
09/09/2013
Determinación por RMN 13C de ácidos grasos insaturados en triglicéridos del
poroto de soja. Determinaciones sobre granos enteros:
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
ácido oleico
CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
ácido linoleico
CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
ácido linolénico
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
ácido oléico
CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
ácido linoléico
CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
ácido linolénico
Ac. Graso (C-vinílicos)
Contribución a líneas
1 : 2 : 3
X = oléico
2
2
y = linoléico
4
2
2
z = linolénico
6
1
4
Integral determinada en el espectro:
1
0.028
0.528
0.444
Se plantean 3 ecuaciones con 3 incógnitas:
Línea 1:
Línea 2:
Línea 3:
z = 0.028
2x + 2y + z = 0.528
2y + 4z = 0.044
z = 0.028,
x = 0.084, y = 0.016
x: y: z
0.3 : 0.6 : 0.1
Valores determinados por CG (validación del método): 0.33 : 0.57 : 0.10
(implica el procesamiento del grano, extracción de los ác. grasos, derivatización y análisis CG/EM)
8
09/09/2013
Autenticidad de alimentos: Determinación de la relación isotópica por RMN
SNIF – NMR
(Stable Natural Isotope Fractionation)
RMN 2H
provee información sobre la distribución de D (2H) en la molécula
Identificación del origen de alcoholes naturales
Abundancia natural de D: 0.015 %
Preparación Muestra: pesada, medida la densidad,
y destilada
En EtOH (96 %) hay 4 especies monodeuteradas:
CH2DCH2OH
I
CH3CHDOH
II
CH3CH2OD
III
HDO
IV
Espectro de RMN D de EtOH (desacoplado de H)
T1D grande: 1 seg, entonces
tiempo de repetición del pulso: 7 seg
Parámetro R: Relación área del metileno (CH2, SII) con la del metilo (CH3, SI)
R = 3 SII / SI
Por distribución estadística de D en EtOH R = 2
R = 2.20 – 2.70
EtOH de trigo
EtOH de maíz
R = 2.47-2.50
R = 2.18- 2.25
(ciclo C-3: manzana, uva, remolacha)
(ciclo C-4: caña de az., maíz)
Relación isotópica total:
Se relaciona con la relación isotópica de los sitios individuales según:
(D/H) = ∑ Fi (D/H)i
i
Fi: fracción molar del isotópomero monodeuterado i, calculado de la estequiometría
de la molécula (sobre total de H = 6)
Para EtOH la relación isotópica promedio total es:
(D/H) = 1/2 (D/H)I + 1/3 (D/H)II +1/6 (D/H)III
(D/H) se puede obtener por EM o por RMN D y RMN 1H de acuerdo al área de las señales
respecto de un standard (Sd), por ej. Tetrametilurea, con contenido de deuterio certificado
(calculado por EM)
9
09/09/2013
Para una sustancia A (por ej. ETOH) resulta:
(D/H)Ai = pSd/pAi mSd/mA MA/MSd TAi (D/H)Sd
pSd y pAi : n estequiométrico de protones en el Sd y en i (A)
mSdy mA : masas del Sd y de A
MA y MSd : pesos moleculares del Sd y de A
TAi : relación de intensidades de las señales de RMN D en el sitio i de A y en el Sd
Sample/Source
N° of
experiments
Value
Average
Standard
Deviation
Standard Deviation
Synthetic
15
R
2.262
0.027
0.007
C
1.464
0.010
0.003
R
2.552
0.032
0.007
C
1.140
0.016
0.004
R
2.528
0.023
0.007
C
1.173
0.012
0.004
R
2.697
0.043
0.011
C
1.083
0.014
0.004
R
2.312
0.019
0.006
C
1.232
0.012
0.004
R
2.235
0.027
0.001
C
1.203
0.007
0.001
Apple
Grape
Potato
Sugar Cane
Agave
20
10
15
11
20
TABLE 1. Statistical data for the
experimentally determined relative
deuterium concentration in the
alcohol fermented from various
sugar sources.
The R value alone is adequate for
discerning some, but not all, sugar
sources. The relative deuterium
concentration, C, can be used to
provide additional information about
samples.
C-4
C-3
I) and (II) are the peak heights of
the methyl and methylene sites
respectively; (s) is the peak height
of the external standard. To account
for the fact that not all samples have
equal ethanol concentrations, a
correction factor, , must be
employed. For example, a sample of
pure ethanol would have a
correction factor of 1.00, while a
40% ethanol sample would have a
correction factor of 0.40.
(Government regulations require
that the proof listed on the label be
accurate within 1%.)
10
09/09/2013
R = 2.47-2.50
ciclo C-3: manzana, uva, remolacha, trigo, cebada, manzana
R = 2.18- 2.25
ciclo C-4: Caña de azúcar, maíz
Adulteraciones mas frecuentes en vinos:
- Agregado de azúcar en la fermentación para aumentar el grado de alcohol
-Dilución con agua
Otras aplicaciones de SNIF
- Aceties de oliva, detrminación de la distribución isotópica de 2H en los ácidos grasos
-Quesos: idem en ác. Grasos. Información a cerca de la raza y región
-Detección de agregado de azúcar (de caña o de remolacha) en jugos. Se fermenta el
EtOH.
-Autenticidad de vinagres, se monitorea ác. Acético.
-Origen natural o sintético de aromas o flavores
RMN de baja resolución
Decaimiento de la magnetización en una muestra de grasa
Bo = 600 gauss = 2,7 MHz
Pulso de 90 , observación del
contorno de la FID (sin TF)
Alta resolución Bo = 4,7 T, 200 Mhz
T2 líquidos > T2 sólidos
T2 líquidos = 100 mseg 0.1 seg
T2 sólidos = 10 mseg
10-5 seg
Determinación del contenido de grasa sólida en grasas semisólidas y
margarinas (SFC solid fat content) Método clásico: dilatometría mL/kg
11
09/09/2013
Determinación del contenido de agua en pulpa de remolacha azucarera
La pulpa prensada (80 % de agua) se mezcló con la melaza y la mezcla se secó en hornos
de vacío a 105 C durante 3 hs, hasta obtener un contenido de agua del 12 %.
Método clásico: titulación de Karl-Fisher
Requiere extracciones que demandan mucho tiempo
12