Download Técnicas de Light Scattering para la caracterización de

Técnicas de Light Scattering
para la caracterización de nanopartículas y moléculas
Oscar Díez Lorenzo
E-mail: [email protected]
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• Zetasizer Nano
Modelos, tecnologías y rangos.
• Principios de Medida
Dynamic Light Scattering (Tamaño de nanopartículas).
Laser Doppler Electrophoresis (Potencial Z).
Static Light Scattering (Peso molecular promedio).
Difusion Barrier Method (Movilidad electroforética de proteínas).
Microrheology (Propiedades visco-elásticas).
• Zetasizer Nano
Células y accesorios.
• Medida experimental
Tamaño de nanopartículas de una muestra ejemplo.
Potencial Z de una muestra ejemplo.
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Zetasizer Nano - Tecnologías
Tamaño de nanopartícula
Dynamic Light Scattering
Non Invasive Back Scattering
(NIBS)
Potencial Z
Laser Doppler Electrophoresis
Mixed Mode Measurement
Phase Analysis Light Scattering
(M3-PALS)
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Zetasizer Nano - Tecnologías
Pesos moleculares promedio
Static Light Scattering
Movilidad electroforética
de proteínas
Diffusion Barrier Method
(DLS+PALS)
Propiedades Visco-elásticas
Microrheology
(DLS+PALS)
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Zetasizer Nano - Otros parámetros
- Melting point de proteínas y polímeros.
- Concentración micelar crítica (CMC).
- Temperatura micelar crítica (TMC).
- Segundo coeficiente virial (A2).
- Índice de polidispersidad (Pdi).
- Movilidad electroforética.
- Punto isoleléctrico.
- Conductividad.
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Zetasizer Nano - Tecnologías
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Tamaño de
Nanopartícula
DLS-NIBS™
Potencial Z
M3-PALS™
Peso Molecular
Promedio
SLS
Tamaño de
Nanopartícula
DLS-NIBS™
Potencial Z
M3-PALS™
Peso Molecular
Promedio
SLS
Tamaño de
Nanopartícula
DLS-NIBS™
-
Peso Molecular
Promedio
SLS
-
Potencial Z
M3-PALS™
-
Tamaño de
Nanopartícula
DLS a 90º
Potencial Z
M3-PALS™
Peso Molecular
Promedio
SLS
Tamaño de
Nanopartícula
DLS a 90º
-
Peso Molecular
Promedio
SLS
Zetasizer Nano - Rangos
[email protected]
0,3-10.000 nm
DLS-NIBS™
3,8nm-100 µm
M3-PALS™
980-2·107 Da
SLS
0,3-10.000 nm
DLS-NIBS™
3,8nm-100 µm
M3-PALS™
980-2·107 Da
SLS
0,3-10.000 nm
DLS-NIBS™
-
980-2·107 Da
SLS
-
3,8nm-100 µm
M3-PALS™
-
0,3-5.000 nm
DLS a 90º
3,8nm-100 µm
M3-PALS™
9.800-2·107 Da
SLS
0,3-5.000 nm
DLS a 90º
-
9.800-2·107 Da
SLS
Zetasizer Nano - Actualizaciones
1. Tamaño Nanopartícula
0,3-10.000 nm
DLS-NIBS™
2. Potencial Z
3,8-100 µm
M3-PALS™
3. Peso Molecular
Promedio
980-2·107 Da
SLS
1. Tamaño Nanopartícula
0,3-5.000 nm
DLS a 90º
2. Potencial Z
3,8-100 µm
M3-PALS™
3. Peso Molecular
Promedio
9.800-2·107 Da
SLS
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Zetasizer Nano - Actualizaciones
1. Tamaño Nanopartícula
0,3-10.000 nm
DLS-NIBS™
2. Potencial Z
3,8-100 µm
M3-PALS™
3. Peso Molecular
Promedio
980-2·107 Da
SLS
4. Movilidad
electroforética de
proteínas
Diffusion Barrier
Method
5. Prop.
Viscoelásticas
Microrreología
6. Conexión SEC
Opción Flow Mode
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Dynamic Light Scattering
Tamaño de nanopartícula
• Dynamic Light Scattering (Difusión de luz dinámica).
• Photon Correlation Spectroscopy (Espectroscopía de
correlación de fotones).
• Quasi-Elastic Light Scattering (Difusión de luz quasielástica).
• Es una técnica para la medida de tamaño a nivel
submicrónico. Mide el movimiento Browniano de las
nanopartículas y lo relaciona con su tamaño
nanométrico.
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Movimiento Browniano
Movimiento aleatorio de las
nanopartículas o moléculas en
suspensión
La velocidad del movimiento
Browniano depende de:
• Tamaño de las nanopartículas.
• Temperatura.
• Viscosidad del medio
dispersante.
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DLS mide las fluctuaciones de
intensidad a lo largo del tiempo,
para determinar el coeficiente
de difusión traslacional (D), y
posteriormente el diámetro
hidrodinámico (DH). Ecuación
de Stokes-Einstein.
D=
kT
3DH
k = Constante Boltzmann
T = Temperatura  = Viscosidad
La fluctuación de intensidad es
dependiente del tamaño de
partícula.
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DLS mide las fluctuaciones de
intensidad a lo largo del tiempo,
para determinar el coeficiente
de difusión traslacional (D), y
posteriormente el diámetro
hidrodinámico (DH). Ecuación
de Stokes-Einstein.
D=
kT
3DH
k = Constante Boltzmann
T = Temperatura  = Viscosidad
La fluctuación de intensidad es
dependiente del tamaño de
partícula.
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Función de correlación
El tiempo en el que la señal de la función de correlación empieza a decaer,
nos da la información sobre el diámetro medio de partícula.
La linea base nos da
información sobre
La presencia de
partículas grandes o
agregados.
La pendiente nos
da información
sobre la
polidispersidad
de la
distribución
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
Intensidad, Volumen y Número
Distribución
en número
Distribución
en volumen
~ 4/3 π r3
Distribución
en intensidad
~ d6
1.000.000
1
1
1000
1
5 10
50 100
Diámetro (nm)
5 10
1
50 100
Diámetro (nm)
5 10
50 100
Diámetro (nm)
Mezcla que contiene igual número de partículas esféricas de 5 y 50 nm.
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Configuración óptica - S90 y ZS90
Configuración óptica DLS tradicional (90 grados).
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Configuración óptica - ZSP, ZS y S
Configuración óptica DLS - Non Invasive Back Scattering™ (173 grados).
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90º Vs. NIBS™
DLS 90º
DLS-NIBS™
Alta
Láser
Concentración
Detector
Detector
Láser
Detector
Láser
Detector
Baja
Láser
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90º Vs. NIBS™
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Laser Doppler Electrophoresis
Potencial Z
• Potencial Z: Es una medida de la magnitud de la
repulsión o atracción entre las partículas, y por lo tanto
puede ser utilizado para predecir su estabilidad.
• Depende tanto de las condiciones químicas de la
superficie de la partícula como del dispersante. Pequeños
cambios de pH o concentración provocan cambios en el
potencial Z.
• Valores altos/bajos de potencial Z se traducen en fuerzas
de repulsión altas/bajas, y por lo tanto las partículas
tienden a repelerse/ataerse entre ellas.
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• Las partículas adquieren
una carga superficial
opuesta a la de la partícula
en sí.
• Esta carga modifica la
distribución de iones del
medio que le rodea.
• El Potencial Z es la carga de
la partícula en un medio
específico y a una cierta
distancia (doble capa).
• El conjunto de partículas
con su capa en movimiento
browniano proporcionan el
potencial Z global de la
dispersión.
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Configuración óptica - ZSP, ZS, ZS90 y Z
Configuración óptica Phase Analysis Light Scattering (13 grados).
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• El Potencial Z se calcula a
través de la movilidad
electroforética que es el
movimiento
de
una
partícula cargada relativa al
líquido, cuando se le aplica
un campo eléctrico.
• La muestra es introducida
en una célula capilar donde
se aplica un campo eléctrico
alterno. Las partículas son
atraídas hacia el electrodo
de carga opuesta.
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v=0
f/Hz
v>0
f/Hz
• El haz de rayo láser incide
sobre las partículas en
movimiento y provocan un
cambio de frecuencia (efecto
Doppler).
• La tecnología Laser Doppler
Electrophoresis es capaz de
medir esa diferencia de
frecuencia
que
es
directamente proporcional a
la movilidad electroforética,
y por lo tanto, proporcional
al valor de Potencial Z a
través de la ecuación de
Henry.
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v=0
f/Hz
v>0
f/Hz
Laser Doppler Electrophoresis
f1
f2
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Phase Analysis Light Scattering
f1
f2
A Interferencia
constructiva
A
B
B Interferencia
destructiva
f1 - f2 = f
Las interferencias producen un haz modulado de frecuencia menor
e igual a la diferencia de f1 y f2
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Phase Analysis Light Scattering
• Laser Doppler Electrophoresis (LDE), tradicionalmente
la diferencia de frecuencia se calcula mediante
Transformada de Fourier (FT).
• Phase Analysis light Scattering (PALS), calcula la
diferencia de fase, en vez de la diferencia de frecuencia
(LDE). Proporciona una sensibilidad de hasta 100 veces
mayor que mediante tecnologías tradicionales (FT).
• Mixed Mode Measurement-Phase Analysis Light
Scattering (M3-PALS™). Permite la medida de muestras
con conductividades muy altas mediante dos modos de
medida (FFR y SFR), evitando el efecto Joule y el efecto
de la electroósmosis.
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M3-PALS™
• Modo FFR (Fast Field
Reversal). Elimina la
electroósmosis aplicando
un campo eléctrico
alterno a muy alta
frecuencia. Proporciona
el valor medio de
Potencial Z (Ep).
• Modo SFR (Slow Field
Reversal). Aplica un
campo eléctrico
invirtiéndolo
lentamente. Proporciona
la distribución de
Potencial Z (Eo+Ep).
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Static Light Scattering
Pesos moleculares promedio
• Static Light Scattering
(Difusión de luz
estática).
• La intensidad de luz
dispersa de una
macromolécula (proteína
o polímero) es
directamente
proporcional al producto
de su peso molecular por
la concentración.
I α Mw · C
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Static Light Scattering
I  (MWt) (C)
Ecuación de
Rayleigh
KC  1


 2 A2C  P
R  MW

K = Optical constant
MW = Molecular weight
A2 = 2nd Virial coefficient
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C = Concentration
R = Rayleigh Ratio of the sample
P() = Shape factor
Pesos moleculares y 2º Coef. Virial
• Para P=1, la ecuación de
Rayleigh queda
simplificada:
• Si se representan los valores
de KC/R frente a la
concentración, por
extrapolación se obtiene el
valor del peso molecular
(intersección con el cero) y
el valor del 2º coef. virial A2
(pendiente).
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Diffusion Barrier Method
Movilidad Electroforética de Proteínas
Las proteínas no se degradan por el hecho de aplicarles
una campo eléctrico, se desnaturalizan o comienzan a
agregarse por el hecho de estar en contacto con los
electrodos de la célula de medida.
La medida de movilidad electroforética de proteínas debe
de combinarse con la técnica de difusión de barrera que
protege a la muestra durante la medida introduciendo una
distancia física entre la proteína y los electrodos.
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Diffusion Barrier Method
Movilidad Electroforética de Proteínas
Se utiliza como barrera física
el mismo tampón en el que
se encuentra la proteína
evitando así el contacto
directo con los electrodos.
Se depositan en el fondo de la
célula
de
potencial
Z
volúmenes
pequeños
de
muestra (20-50 µL) con la
ayuda de pipetas especiales
de gel electroforesis.
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Diffusion Barrier Method
Movilidad Electroforética de Proteínas
Se utiliza como barrera física
el mismo tampón en el que
se encuentra la proteína
evitando así el contacto
directo con los electrodos.
Se depositan en el fondo de la
célula
de
potencial
Z
volúmenes
pequeños
de
muestra (20-50 µL) con la
ayuda de pipetas especiales
de gel electroforesis.
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Las medidas de movilidad
electroforética se realizan a través
de un SOP que combina medidas
de tamaño de partícula
y
potencial Z para asegurar que no
se forman agregados durante la
medida
que
indiquen
la
degradación de la muestra.
Realiza un ajuste automático del
voltaje aplicado para reducir la
degradación.
Las medidas se ejecutan en
grupos con pausas para evitar el
calentamiento y degradación de la
muestra.
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Diffusion Barrier Vs. Full cell
Distribución de tamaño antes y después de las medidas
A.- HSA 10 mg/ml Distribución
de tamaño antes de las medidas
de potencial Z.
B.- HSA 10 mg/ml Distribución
de tamaño después de las
medidas
de
potencial
Z
convencionales (Full cell).
C.- HSA 10 mg/ml Distribución
de tamaño después de las
medidas
de
potencial
Z
(Difussion Barrier).
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Diffusion Barrier Vs. Full cell
Movilidad Electroforética - HSA 10 mg/ml - 10mM NaCl
Buena repetibilidad indica
Poca repetibilidad indica
buena calidad de las medidas.
agregación de la proteína.
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Microrheology
Medida de las propiedades visco-elásticas
Las medidas de microrreología se realizan utilizando
partículas trazables de tamaño conocido para medir la
relación entre el esfuerzo y la deformación.
El esfuerzo es aplicado a través del movimiento Browniano
de las partículas trazables, y la deformación se mide a
través de los cambios de posición de dichas partículas
trazables.
La función de correlación es directamente proporcional al
Mean Square Displacement (MSD ). A través del MSD y
utilizando la ecuación de Stokes-Einstein se pueden
calcular el módulo viscoso G’’, el módulo elástico G’, y la
viscosidad compleja ƞ*.
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[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
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Células de medida
• Célula de potencial Z en base
acuosa.
• Célula de potencial Z en base
solvente “Universal Dip Cell”.
• Célula de potencial Z de alta
concentración.
• Célula de potencial Z en
superficie.
• Célula de tamaño en base acuosa
(Volúmenes 1mL, 100µL, y
40µL).
• Célula de tamaño en base
solvente (Volúmenes 1mL, 12µL,
y 2µL).
• Célula de flujo.
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Autovalorador MPT-2
• Los factores que afectan
el Potencial Z son el pH,
la Conductividad y la
Concentración.
• El autovalorador MPT-2
permite realizar
barridos de pH,
concentración o
conductividad
automáticamente para la
búsqueda del punto
isoeléctrico.
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Autovalorador MPT-2
• Zona de estabilidad
2 < pH < 4
Pot.Z > 30mV
• Zona de inestabilidad
4 < pH < 7,5
-30mV < Pot.Z < 30mV
• Zona de estabilidad
7,5 < pH < 12
Pot.Z < -30mV
• Punto isoeléctrico
pH=5,5
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Vibro-Viscómetro SV-10
• Medida de viscosidad de medios
dispersantes con gran exactitud
(0,3-10.000 mPas).
• Control de temperatura.
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Zetasizer APS y Zetasizer μV
• Proteínas y
biomoléculas.
• Tamaño molecular
0,15-1.000 nm (radio),
pesos moleculares
(342-2·107 Da), melting
point, etc...
• Zetasizer APS (Auto
Plate Sampler).
96 ó 386 muestras.
• Zetasizer μV.
Volumen de muestra
2μL y conexión a sistema
GPC/SEC.
[email protected]
SOLICITUD DE
CERTIFICADO DE ASITENCIA
[email protected]
IESMAT, S.A.
Parque Empresarial Miniparc II
Caléndula, 95
Alcobendas - 28109 (Madrid)
SOLICITUD DE
ESTA PRESENTACIÓN
[email protected]