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TEMA 23 MÉTODOS DE ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS E INTERÉS
BIOLÓGICO
1.MÉTODOS Y TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
Los trabajos que se realizan en microbiología tienen dos objetivos: el aislamiento de un
microorganismo concreto y el cultivo del mismo en ambientes artificiales bajo condiciones de
laboratorio, para poderlos estudiar.
1.1.Técnicas de cultivo.
Las técnicas de cultivo posibilitan el crecimiento controlado de determinados tipos o cepas de
microorganismos en los medios adecuados.
Un cultivo puro o axénico es un medio de cultivo que contiene un único tipo de
microorganismo.
Un medio de cultivo es una solución nutritiva que permite el crecimiento de los
microorganismos.
Los medios de cultivo contienen:
Macronutrientes: incluyen una fuente de carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y oxígeno (sólo
los aerobios).
Micronutrientes: diversos iones (hierro, etc) y factores de crecimiento (vitaminas) que se
necesitan en cantidades mínimas.
Agua en grandes cantidades.
Según su estado físico, los medios de cultivo pueden ser:
Medios líquidos: Se preparan en matraz o tubo de ensayo.
Medios sólidos: Se preparan en placas de Petri se agrega agar, que da al medio una
consistencia gelatinosa. Los medios sólidos se utilizan para el aislamiento y cultivo de
microorganismo y para la obtención de clones o estirpes puras.
1.2.Cultivo de microorganismos.
Una vez preparados los medios se procede a inocular o sembrar el microorganismo.
Los recipientes y materiales que vayan a ser utilizados deben ser limpiados y esterilizados
cuidadosamente.
Además, después de introducir el microorganismo deseado, debe quedar protegido de la
contaminación externa. Tubos de ensayo y matraces se tapan con algodón o con tapones de
goma y las placas de Petri ya presentan una forma que las preserva de contaminación.
El inóculo o material microbiano, se introduce, generalmente, con un hilo de metal o asa de
siembra, que se esteriliza antes y después de su uso.
La siembra en medio sólido se puede llevar a cabo en profundidad, introduciendo el asa en el
medio de cultivo y realizando estrías paralelas sobre la placa de agar. Este método es
satisfactorio para aislar bacterias de pequeño tamaño y hongos; para protozoos, algas y
bacterias grandes son mejores los medios líquidos.
En el caso de los virus los recipientes suelen ser tubos de ensayo o placas de Petri
1.3.Condiciones de crecimiento.
Aunque se encuentren en el medio todos los nutrientes necesarios, el crecimiento microbiano
depende de otras condiciones:
El pH. Es preciso establecer un pH óptimo para que se inicie el crecimiento y mantenerlo
durante todo el proceso. En la mayoría de los microorganismos pH óptimo de crecimiento esta
próximo a 7, aunque algunos como los Actinomicetes prefieren pH alcalinos y otros toleran
pH ácidos como Acetobacter.
La Temperatura. La mayoría de las bacterias del suelo y del agua son mesófilas, es decir, sus
temperaturas óptimas oscilan entre 20 y 45 ºC, pero, existen algunas cuyo crecimiento óptimo
está a temperaturas superiores (termófilas) o inferiores (psicrófilas).
La presión osmótica. Sólo las bacterias marinas y las halófilas dependen para su existencia
de determinadas condiciones salinas y se lisan cuando se las cambia del medio salino a agua
destilada.
El oxígeno. Todas las bacterias aeróbicas obligadas necesitan oxígeno. En microorganismos
anaerobios estrictos, hay que excluir totalmente el oxígeno atmosférico.
El dióxido de carbono. Este gas es la principal fuente de carbono de organismos
fotoautótrofos y quimioautótrofos, pero además cumple numerosas funciones catalíticas en los
heterótrofos.
La luz. Para el cultivo de microorganismos fotosintéticos la luz es esencial y se debe tener en
cuenta no sólo su cantidad sino también su calidad.
1.4.Crecimiento microbiano.
En un medio favorable las poblaciones de microorganismos experimentan un incremento en
su número, es decir crecen. Se denomina velocidad de crecimiento de la población al
aumento o disminución en el número de individuos por unidad de tiempo.
Para determinar el crecimiento microbiano se utilizan dos parámetros: tiempo de generación,
que es el tiempo que tarda una población en duplicarse y tasa de crecimiento que es el
número de generaciones por hora.
En los laboratorios los microorganismos se cultivan en sistemas cerrados, es decir, no se les
suministran más nutrientes ni se les eliminan los productos tóxicos, de aquí que pase por
distintas fases:
Fase de latencia. Es el periodo comprendido entre la
inoculación del microorganismo en el medio de cultivo y
el comienzo del crecimiento, que puede ser más o menos
largo. En este tiempo el germen adapta su metabolismo
a las condiciones de cultivo
Fase exponencial. En esta etapa las poblaciones
crecen exponencialmente, es decir se duplican cada
cierto tiempo (tiempo de generación que se mantiene
constante). Este tiempo es típico para cada especie y
depende en parte del medio de cultivo.
Fase estacionaria. En un cultivo cerrado, la
población no puede crecer indefinidamente de manera
exponencial, ya que se consumen los nutrientes y se
acumulan productos tóxicos del metabolismo, por ello
en esta fase cesa el crecimiento de la población.
Fase de muerte. En esta etapa el número de individuos disminuye debido a que mueren al
agotarse los nutrientes y acumularse los desechos metabólicos.
1.5.Observación de microorganismos.
Los microorganismos debido a su tamaño sólo se pueden observar mediante técnicas
microscópicas. Las muestras se pueden preparar de dos maneras:
Preparación en fresco. A su vez comprende dos técnicas:
-Preparación en fresco simple. Se pone una gota de la muestra en el portaobjetos y se tapa
con el cubre. Resulta útil para protistas y hongos.
-Preparación en gota pendiente. Se pone una gota de la muestra en el centro de un anillo de
vaselina que se ha dispuesto en el cubre. Sobre él se coloca un porta excavado y al conjunto se
le da la vuelta. Se utiliza para observa la movilidad de los microorganismos.
Tinciones. Existen distintas técnicas de tinción.
-Tinción simple. Se utiliza un único colorante (azul de metileno, etc). Esta tinción se utilizan
para aumentar el contraste.
-Tinción específica. Se utilizan colorantes específicos. Incrementa el contraste y revela
estructuras específicas (cápsulas).
-Tinción diferencial. Se usan al menos dos colorantes: un colorante principal y un colorante
de contraste. La más utilizada es la tinción de Gram que utiliza como colorante principal el
cristal violeta y como colorante de contraste la safranina. El proceso se realiza de la siguiente
manera:
-A una preparación de bacterias se las trata con cristal violeta (colorante principal) y se tiñen de
color violeta. Posteriormente durante un minuto se las trata con una solución de yodo, con el
fin de reforzar el color violeta de las bacterias.
-Después se trata a la preparación con un disolvente orgánico (alcohol) y se lava con agua.
Esto da lugar a que algunas bacterias se decoloren y pierdan el color violeta, otras por el
contrario siguen manteniendo el color violeta.
-Por último se trata la preparación durante un minuto con una solución de safranina (colorante
rojo de contraste), con ello las bacterias no decoloradas siguen manteniendo el color violeta y
las bacterias decoloradas se tiñen de rojo.
Esta tinción permite diferenciar dos grupos de bacterias: las gram positivas, son las que
permanecen teñidas de color violeta cuando se las trata con un disolvente orgánico; y las gram
negativas, que pierden el color violeta cuando se las trata con un disolvente orgánico y se tiñen
de rojo con el colorante de contraste.
1.6.TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN
Es un proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos de los medios de
cultivo, del material y de los utensilios del laboratorio (tubos, placas, pipetas, matraces, etc).
Los métodos pueden ser: físicos y químicos.
Métodos físicos.
El calor. El calor es uno de los métodos más usados, debido a que las temperaturas elevadas
tienen efecto letal sobre los microorganismos. El calor utilizado puede ser:
-Seco. Se usa para esterilizar utensilios de metal y cristal calentándolos en hornos a 170 ºC
durante 90 minutos.
-Húmedo. Posee mayor poder de penetración. Se usa para esterilizar los materiales y los
medios empleados, generalmente mediante autoclaves (aparatos herméticos que alcanzan
presiones y temperaturas elevadas en un ambiente húmedo).
Las radiaciones electromagnéticas se utilizan para esterilizar materiales de laboratorio que
no pueden ser sometidos a altas temperaturas. Se utilizan diferentes tipos de radiaciones:
radiaciones ultravioleta, radiaciones ionizantes ( rayos X, rayos ).
Los filtros se emplean en la esterilización de líquidos y gases sensibles al calor. Los filtros
presentan poros muy pequeños para que no pasen los microorganismos, pero sí permiten el
paso de los líquidos y gases.
Métodos químicos.
Consiste en la utilización de diversos productos químicos naturales o sintéticos que pueden
controlar el crecimiento microbiano. Pueden actuar de dos formas:
Agentes microbicidas, actúan matando los microorganismos y según el tipo sobre el que
actúen se habla de agentes bactericidas, fungicidas o viricidas.
Agentes estáticos, actúan inhibiendo el crecimiento de los microorganismos y se habla de
agentes bacteriostáticos, fungistáticos y viristáticos.
Pasteurización.
La pasteurización es un proceso utilizado en la industria alimentaria y que consiste en reducir la
población microbiana presente en los alimentos. El término se debe a Pasteur que utilizó el
calor para controlar el deterioro del vino. La pasteurización no es un tipo de esterilización, ya
que no se destruyen todos los microorganismos.
Actualmente se utiliza para prolongar el periodo de almacenamiento de la leche y sus
derivados. Se consigue elevando la temperatura a 71 ºC durante un tiempo muy corto, 15
segundos, por lo que se denominó pasteurización en flash.
2.LOS MICROORGANISMOS EN LOS ECOSISTEMAS: Ciclos biogeoquímicos.
Los microorganismos forman parte de los ecosistemas. Han colonizado todos los ambientes:
marinos, terrestres, fuentes termales, etc.
Los microorganismos están representados en todos los niveles tróficos:
-Microorganismos productores. Son organismos autótrofos. Según su forma de captar la
energía pueden ser fotolitótrofos o quimiolitótrofos. Entre los productores fotosintéticos hay
que destacar las cianobacterias y las algas. Entre los quimiolitótrofos los microorganismos
nitrificantes.
-Microorganismos descomponedores. Son organismos heterótrofos y quimioorganótrofos
que se alimentan de detritos orgánicos. Son fundamentalmente hongos y bacterias.
-Microorganismos simbióticos. Destacan los presentes en el rumen que degradan la celulosa
en el estómago de los rumiantes; Rhizobium que vive en los nódulos de las plantas leguminosas
y los líquenes (simbiosis entre alga y hongo).
En los ecosistemas la energía entra como energía luminosa o química y fluye de un nivel
trófico a otro, hasta disiparse en forma de calor.
Por el contrario la materia se mantiene prácticamente constante en la Tierra y los bioelementos
circulan cíclicamente dentro de la biosfera: de los seres vivos a la materia mineral y viceversa,
constituyendo los ciclos biogeoquímicos:
Los microorganismos desempeñan un papel destacado en los ciclos biogeoquímicos.
Ciclo del carbono.
-Los organismos productores autótrofos convierten el CO2 en materia orgánica. En
condiciones aerobias, el CO2 es fijado por la fotosíntesis oxigénica (plantas, algas,
cianobacterias), en ausencia de oxígeno por la fotosíntesis anoxigénica (bacterias
sulfuradas verdes). Las bacterias quimiosintéticas lo hacen mediante la quimiosíntesis.
-Los compuestos orgánicos son utilizados por los consumidores (animales, protistas,
bacterias) como fuente de carbono y energía produciéndose CO2 que vuelve a la atmósfera.
-Los descomponendores (bacterias y hongos) mediante respiración anaerobia y fermentación
descomponen la materia orgánica y se forma CO2 que vuelve a la atmósfera.
-Las bacterias metanógenas (arqueobacterias anaerobias) sintetizan metano a partir de
diversos sustratos (CO2, metanol, etc). Las bacterias metanotrofas en presencia de oxígeno
oxidan el metano al CO2 que es devuelto a la atmósfera.
Ciclo del nitrógeno.
El nitrógeno es un elemento esencial para los seres vivos forma parte de proteínas y ácidos
nucleicos.
En el ciclo del nitrógeno intervienen los siguientes microorganismos:
-Bacterias descomponedoras mediante putrefacciones descomponen los compuestos
orgánicos nitrogenados (proteínas) y producen amoniaco, a este proceso se le llama
amonificación.
-Bacterias nitrificantes del suelo, son bacterias quimiosintéticas realizan el proceso de
nitrificación mediante el cual oxidan el amoniaco a nitratos para obtener energía. Este proceso
ocurre en dos etapas:
En una primera etapa se oxida el amoniaco a nitritos, lo realizan bacterias del género
Nitrosomas.
En una segunda etapa se oxidan los nitritos a nitratos, lo realizan bacterias del género
Nitrobacter.
-Bacterias desnitrificantes como las del género Pseudomonas, transforman los nitratos a
nitrógeno gaseoso que liberan a la atmósfera, a este proceso se le llama desnitrificación. Esto es
debido a que realizan la respiración anaerobia y utilizan como aceptor final de los electrones
los nitratos.
-Bacterias fijadoras del nitrógeno atmosférico. Algunas bacterias (Rhizobium, Azotobacter,
etc) son capaces de reducir el nitrógeno atmosférico a amoniaco.
3.MICROORGANISMOS BENEFICIOSOS Y PERJUDICIALES PARA LA SALUD
Muchos de los microorganismos con los que estamos en contacto son inocuos e incluso
algunos son beneficiosos para la salud, otros por el contrario causan enfermedades.
Se denomina biota normal, al conjunto de microorganismos que se establecen y crecen sobre
las superficies corporales sin producir efectos negativos. Se localiza en la piel, cavidad bucal,
tracto respiratorio, digestivo, etc. Estos gérmenes evitan la proliferación de otros gérmenes
patógenos.
Los microorganismos que ocasionan enfermedades se denominan patógenos. La
patogenicidad o virulencia es la capacidad potencial de un microorganismo de producir una
enfermedad. Hay microorganismos que normalmente no causan enfermedades, pero en ciertas
condiciones (disminución de las defensas) se vuelven patógenos a estos se les denomina
patógenos oportunistas.
Se denomina enfermedad infecciosa a la enfermedad producida por un microorganismo.
Se denomina epidemia cuando la enfermedad infecciosa afecta a muchos individuos de un
área geográfica pequeña; si afecta a una zona muy amplia se denomina pandemia; si afecta de
forma constante a una determinada zona se denomina enfermedad endémica
En la producción de una enfermedad por los gérmenes patógenos se diferencian 4 etapas:
-Entrada en el hospedador. Los patógenos pueden entrar en el organismos por diversas vías:
a través de las superficies corporales (piel, mucosas), heridas, inhalación respiratoria, con la
ingestión de alimentos, con ayuda de otros organismos vectores (insectos, pulgas, etc), etc.
-Adhesión a los tejidos del hospedador. La colonización se ve facilitada si tienen capacidad
de adhesión a las células de los tejidos, en muchos casos esta adhesión es selectiva. En la
adhesión intervienen estructuras de la superficie (cápsula, fimbrias, etc).
-Invasión de las células del organismo. Algunos producen los efectos nocivos cuando están
fijos a las superficies de los tejidos, otros penetran dentro de las células por distintos
mecanismos.
-Desarrollo de la infección. Una vez alcanzado su objetivo el patógeno debe eludir los
mecanismos defensivos del hospedador para crecer y colonizar el tejido infectado.
Si el patógeno alcanza la sangre o la linfa se pueden diseminar por todo el cuerpo y alcanzar los
diferentes órganos produciendo una infección generalizada o septicemia.
Las lesiones en el tejido y, por consiguiente el desarrollo de la enfermedad se produce por
varias causas:
Lesión directa de las células debido a la actividad y multiplicación del germen.
Producción de factores de virulencia. Algunas gérmenes producen enzimas extracelulares
(hialuronidasas, proteasas, etc) que son capaces de degradar los tejidos del hospedador.
Producción de toxinas. Algunos patógenos, principalmente bacterias producen sustancias
que tienen efectos tóxicos para los tejidos del hospedador, a estas sustancias se las llama
toxinas. Las toxinas pueden ser de dos tipos:
Exotoxinas. Son de naturaleza proteica, termolábil es, son liberadas al exterior por el germen
y tienen efectos muy tóxicos. Suelen ser muy específicas en cuanto al tejido que atacan así
puede haber: neurotoxinas, enterotoxinas, etc.
Endotoxinas. Son componentes estructurales de las bacterias, suelen ser lipopolisacáridos,
solo se liberan cuando esta se lisa, tienen menos capacidad toxica que las exotoxinas.
4.VÍAS DE TRANSMISIÓN DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.
Las enfermedades infecciosas pueden ser transmitidas por diferentes vías:
Vía respiratoria. El agente patógeno entra en el huésped por los conductos respiratorios:
difteria, tuberculosis, neumonía. meningitis meningocócica.
Vía digestiva. Se trata de infecciones transmitidas por el agua y los alimentos, el
microorganismo infecta al huésped por vía digestiva. Salmonelosis, cólera, hepatitis A.
Contacto directo. Aquí se incluyen las enfermedades de transmisión sexual (ETS); las
infecciones provocadas por heridas como el tétanos, y las enfermedades que se transmiten por
insectos portadores, como la peste o el tifus exantemático (que lo transmiten los piojos).
Sífilis, SIDA, tétanos.
5.LA QUIMIOTERAPIA.
Los agentes antimicrobianos son productos químicos que matan o inhiben el crecimiento de
los microorganismos. Según el tipo de microorganismo contra el que actúen pueden ser:
antibacterianos, antivíricos, antifúngicos, etc.
Los desinfectantes son agentes antimicrobianos que se utilizan para eliminar los
microorganismos de los objetos, mientras que los antisépticos (agua oxigenada, solución de
yodo) se utilizan con el mismo fin sobre los tejidos de los seres vivos.
Los agentes químicos que se utilizan en el tratamiento de enfermedades producidas por
microorganismos se llaman agentes quimioterapéuticos, al tratamiento quimiterapia. Estos
agentes deben tener toxicidad selectiva, es decir deben atacar a los agentes que causan la
enfermedad y ser inocuos o tener baja toxicidad para las células de los tejidos.
Los agentes quimioterapéuticos son de dos tipos: las sulfamidas y los antibióticos.
Las sulfamidas. Son un conjunto de sustancias de origen sintético, que interfieren en
algunas reacciones importantes de los gérmenes patógenos e inhiben su crecimiento. Hoy día
se utilizan muy poco en infecciones bacterianas debido a los efectos secundarios.
Los antibióticos. Son sustancias químicas producidas de forma natural por la actividad de
otros microorganismos, principalmente hongos y algunas bacterias del grupo de las
actinomicetales. Químicamente son compuestos muy variados. Tienen efecto principalmente
antibacteriano y algunos también antifúngico. Algunos tienen un amplio espectro es decir
actúan sobre una gran variedad de gérmenes, otros por el contrario tienen un espectro
reducido.
El mecanismo de actuación de los antibióticos es variado, algunos inhiben la síntesis de las
paredes celulares bacterianas como la penicilina; otros inhiben la síntesis de proteínas como la
tetraciclina; otros inhiben la síntesis de ácidos nucleicos, etc.
El primer antibiótico, la penicilina fue descubierto por Fleming en 1928 en unos cultivos de
estafilococos que se habían contaminado con Penicillium notatum.